CN101843606B - 大黄素作为急性白血病化疗药物的增敏剂和多药耐药逆转剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开大黄素在抗急性白血病及逆转急性白血病多药耐药中的应用。大黄素是提取自我国传统中药的一种纯天然单体化合物，与急性白血病一线化疗药物阿霉素、柔红霉素一样，具有蒽环结构。体外生物活性实验表明，大黄素和白血病化疗药物联合应用，具有协同抗白血病细胞增殖作用，部分逆转急性白血病多药耐药。大黄素能够促进ATRA对其敏感和耐药的急性早幼粒白血病细胞诱导分化作用。在急性白血病细胞移植瘤鼠体内，大黄素与Ara-C联合应用，可以提高移植瘤细胞对Ara-C的敏感性，有效抑制急性白血病移植瘤生长，提高荷瘤鼠生存率，延长存活时间。

Description

大黄素作为急性白血病化疗药物的增敏剂和多药耐药逆转剂的应用

技术领域：

本发明属于医药领域，尤其涉及大黄素与急性白血病化疗药物组合在制备治疗急性白血病和急性白血病耐药细胞的药物中的应用。

背景技术：

白血病是一组异质性恶性克隆性疾病，主要表现为骨髓或其他造血组织中白血病细胞进行性、失控性异常增生，浸润各组织，正常血细胞生成减少，产生发热、感染、出血、贫血等临床表现，白血病是威胁人类健康和生命的主要恶性肿瘤之一，近年来在世界范围内发病率有逐年递增趋势，白血病在我国的发病率为3-4人/10万人，在各型白血病的构成比中，以急性白血病多于慢性白血病。上世纪八十年代以来，随着抗癌新药的出现、支持疗法的改善、造血干细胞移植的开展等，白血病的疗效有了一定的提高。白血病的治疗方法很多，早期、联合、大剂量化学药物治疗目前仍然是治疗白血病的最主要手段，其中，柔红霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)联合，即DA3-7方案为经典的急性白血病诱导缓解方案，此外，还有米托蒽醌(MIT)和Ara-C组成的MA方案，去甲氧柔红霉素(IDA)和Ara-C的IA方案，DNR、Ara-C和依托泊苷(VP-16)的DAE方案等。根据化疗药物的来源和化学结构不同，分为烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素、植物类、激素类和杂类等，烷化剂按化学结构可分为：氮芥类、乙烯亚胺类、磺酸酯及多元醇类、亚硝基脲类、三氮烯咪唑类和肼类。其中烷化剂的典型代表如氮芥和环磷酰胺等；抗代谢药的典型代表如阿糖胞苷，氨甲喋呤，羟基脲和亚硝脲类；抗癌抗生素的典型代表如：柔红霉素、阿霉素、吡柔比星、放线菌素、博来霉素等；植物类的典型代表如：长春碱类、鬼臼碱类、三尖杉酯碱类、紫杉醇等；激素类的典型代表如：包括性激素，黄体激素和肾上腺皮质激素等；杂类的典型代表如：左旋门冬酰胺酶，铂类(顺铂，卡铂)等。典型的治疗急性白血病的药物有烷化剂如：环磷酰胺；抗代谢药如：阿糖胞苷；抗癌抗生素如：柔红霉素、阿霉素、吡柔比星；植物类如：高三尖杉酯碱、长春新碱；激素类如：肾上腺皮质激素；杂类如：米托蒽醌。由于化疗药物治疗过程肝、肾、胃肠道等毒副反应严重，并且有抑制骨髓造血功能的不良反应，白血病患者尤其是年老患者常常不能耐受。患者对化疗药物产生多药耐药(multidrug resistance，MDR)是临床化疗失败，白血病难治复发的一个重要原因，也是导致患者死亡的主要原因。MDR，也称交叉耐药性，是指肿瘤细胞对某一抗癌药物产生耐药性的同时，对其它结构和功能不同的抗癌药物也产生耐药性。研究MDR产生机制、寻求高效低毒的新药治疗白血病，克服MDR现象是当今亟需解决的问题，也是当前研究热点。临床上，对难治、复发性急性白血病的治疗策略，首先选择与原用药物无交叉耐药的药物，组成新的化疗方案。

许多中药及其活性提取物制剂具有确切的抗白血病疗效，并且有一些已经成功应用于临床，成为抗白血病治疗药物的重要组成部分，如紫杉醇、长春新碱、高三尖杉酯碱、三氧化二砷等。全反式维甲酸(ATRA)应用于急性早幼粒细胞白血病(APL)诱导分化治疗是急性白血病治疗上的一个突破，而三氧化二砷对于ATRA耐药的难治、复发APL具有确切的疗效，可以有效诱导该类型耐药的白血病细胞分化，而且还能够促进其凋亡，使APL患者总体缓解率显著提高。随着中药及其天然活性提取物抗肿瘤研究的不断深入，人们发现，天然药物对人体毒副作用小，不易产生耐药性，具有注重整体、攻补兼施的优点，这是一些化疗药物所不能比拟的，而且还兼具有安全有效和价格低廉优势。从传统中草药提取天然有效成份作为白血病多药耐药MDR逆转剂可以直接下调MDR1 mRNA表达，进而影响P-糖蛋白P-gp的表达，达到逆转多药耐药MDR作用。作为钙拮抗剂，与细胞膜上的P-gp结合，阻断其药物泵作用，提高细胞内化疗药物浓度，有效杀伤白血病耐药细胞，还可作用于凋亡调控基因，诱导耐药细胞凋亡。与化疗药物联合应用，提高白血病耐药细胞对化疗药物的敏感性，降低化疗药物的使用剂量，减少毒副反应的同时，起到协同抗白血病作用。我国拥有丰富的传统中药宝库资源，中药及其活性提取物制剂作为白血病化疗药物增敏剂、多药耐药MDR逆转剂目前正备受国内外研究者关注，具有广泛的临床应用价值。

发明内容：

本发明的其一目的是提供大黄素作为化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂在抗急性白血病中的应用。

本发明的其二目的是提供一种大黄素与急性白血病化疗药物组合在制备治疗急性白血病的药物中的应用。

本发明的其三目的是提供一种大黄素与阿糖胞苷(Ara-C)组合在制备治疗高致瘤急性白血病移植瘤细胞的药物中的应用。

本发明的其四目的是提供一种大黄素与全反式维甲酸(ATRA)组合在制备治疗急性早幼粒白血病的药物中的应用。低细胞毒性剂量(＜IC10)作为增敏剂在急性早幼粒白血病全反式维甲酸(ATRA)耐药细胞MR2及其相应的敏感细胞NB4中的应用。

本发明的其五目的是提供一种低细胞毒性剂量(＜IC20)大黄素与化疗药物阿霉素(ADR)或阿糖胞苷(Ara-C)组合在制备抗HL-60/ADR多药耐药细胞增殖的药物中的作用。

急性白血病化疗药物选自抗代谢药类的急性白血病化疗药物、抗癌抗生素类的急性白血病化疗药物、植物类的急性白血病化疗药物和杂类的急性白血病化疗药物中的一种或两种以上的组合。抗代谢药类的急性白血病化疗药包括阿糖胞苷(Ara-C)、依托泊苷(VP16)；抗癌抗生素类的急性白血病化疗药物包括阿霉素(ADR)、柔红霉素(DNR)、吡柔比星(THP)；植物类的急性白血病化疗药物包括高三尖杉酯碱(HHT)、长春新碱(VCR)；杂类的急性白血病化疗药物包括米托蒽醌(MTZ)，全反式维甲酸(ATRA)。

本发明所述的大黄素(emodin)是从传统中药大黄中提取的一种蒽醌类单体化合物，其化学名称为1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌(1，3，8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)，分子式为C₁₅H₁₀O₅，分子量为270.2369，为现有技术；与阿霉素(ADR)、柔红霉素(DNR)等急性白血病一线治疗药物一样具有蒽环类结构，具有抗炎、抑制血管生成、免疫调节、肝保护、解痉、止咳、降压、利尿、抗肿瘤等多种生物学活性，未见应用该化合物作为急性白血病化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂的国内外研究文献报道。

本发明所述的大黄素可以依据需要(如下述的本发明应用实施例等)而制成合适的药物学上的剂型，可以单独给药或者与化疗药物联合给药。

本发明的使用剂量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等做出调整，可以一次或多次给药。

本发明应用(如临床或试验等)时，大黄素可以与急性白血病化疗药物阿霉素(ADR)、依托泊苷(VP16)、高三尖杉酯碱(HHT)、柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ara-C)、吡柔比星(THP)、米托蒽醌(MTZ)，长春新碱(VCR)组合，组合方式为本领域一般技术人员能实现的技术，其组合成的药物可以是药物学上的通用剂型。大黄素作为本发明的HL-60/ADR细胞多药耐药逆转剂，与急性白血病化疗药物阿霉素(ADR)、依托泊苷(VP16)、高三尖杉酯碱(HHT)、柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ara-C)、吡柔比星(THP)、米托蒽醌(MTZ)和长春新碱(VCR)的组合物，其组合的摩尔配比优选范围依次分别为：1∶(0.5-8)，1∶(0.8-12.8)，1∶(0.001-0.016)，1∶(0.04-0.64)，1∶(0.063-1)，1∶(0.08-1.28)，1∶(0.08-1.28)，1∶(0.0063-0.1)。所述的大黄素优选细胞抑制率小于20％的低细胞毒性剂量(＜IC20)大黄素。大黄素作为本发明的急性白血病化疗药物增敏剂，与急性早幼粒白血病一线化疗药物全反式维甲酸(ATRA)的组合物，其组合的摩尔配比优选范围为10∶1，大黄素作为作为本发明的阿糖胞苷(Ara-C)增敏剂，在急性白血病细胞裸鼠异种移植瘤体内应用中与Ara-C的质量配比优选范围为10∶1。

本发明所述的大黄素应用于急性白血病的研究方案实施过程分为：(1)大黄素与8种临床常用化疗药物{8种化疗药物具体为：阿霉素(ADR)、依托泊苷(VP16)、高三尖杉酯碱(HHT)、柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ara-C)、吡柔比星(THP)、米托蒽醌(MTZ)、长春新碱(VCR)}联合应用，MTF法检测大黄素对ADR诱导的急性白血病多药耐药细胞HL-60/ADR耐药逆转效果。(2)金氏公式评价大黄素分别与阿霉素(ADR)、阿糖胞苷(Ara-C)两药联合应用后对急性白血病多药耐药细胞HL-60/ADR细胞协同效果。(3)大黄素与阿霉素(ADR)联合应用，流式细胞仪和DNA片段化分析检测细胞凋亡改变，RT-PCR和Real-timePCR检测耐药相关基因MRP1、LRP、GSTα、bcl-2、GSTπ、TOPOⅠ、TOPOⅡα、TOPOⅡβmRNA表达变化，Western Blot检测耐药相关蛋白MRP1、GSTπ、TOPOⅡβ和Bcl-2表达改变。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测大黄素处理后急性白血病多药耐药细胞HL-60/ADR对阿霉素(ADR)、柔红霉素(DNR)的摄取蓄积水平。(4)MTT法检测大黄素与全反式维甲酸(ATRA)联合应用后，对急性早幼粒白血病全反式维甲酸(ATRA)耐药细胞MR2及急性早幼粒白血病全反式维甲酸(ATRA)敏感细胞NB4的增敏效果，Wright-Giemsa染色形态学观察、流式细胞仪CD11b分化抗原检测和NBT还原实验分析大黄素与ATRA联用后对MR2、NB4细胞分化的影响。(5)构建高致瘤急性白血病HL-60细胞裸鼠异种移植瘤动物模型，将大黄素及其与急性白血病一线化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)联合应用，研究二者联用后对急性白血病细胞移植瘤的动物体内抑瘤效果，以及对荷瘤鼠生存期的影响。

本发明的优点是：本发明采用大黄素作为急性白血病化疗药物增敏剂以及作为急性白血病多药耐药逆转剂的应用。(1)低剂量大黄素和8种化疗药物联合应用后，与未加大黄素组比较，能够增加HL-60/ADR细胞对化疗药物的敏感性，有效降低化疗药物IC50，发挥较单药组更强的抑制细胞增殖作用，从而部分逆转HL-60/ADR细胞多药耐药，逆转倍数介于1.58-4.12之间，大黄素对ADR耐药逆转效果最好，逆转倍数为4.12，由此可见，低剂量大黄素能够提高白血病MDR细胞对化疗药物的敏感性，部分逆转HL-60/ADR细胞多药耐药，与ADR、Ara-C联合应用，有效降低药物使用剂量的同时，发挥协同抗HL-60/ADR细胞增殖作用，在转录和翻译水平多环节阻断耐药相关基因表达，增加细胞内药物滞留量，诱导MDR细胞凋亡，提示大黄素是一种高效低毒的急性白血病化疗药物增敏剂和MDR逆转剂。低细胞毒性剂量(＜IC20)大黄素，与不同浓度梯度化疗药物阿霉素(ADR)和阿糖胞苷(Ara-C)联合应用，具有协同抗HL-60/ADR多药耐药细胞增殖作用(Q值＞1.15)。该作用可能与下调多药耐药相关基因MRP1、LRP、GSTα、bcl-2、GSTπ、TOPOⅡβ和多药耐药相关蛋白MRP1、TOPOⅡβ、Bcl-2和GSTπ，上调TOPOⅡα基因表达，增加细胞内化疗药物的分布和蓄积水平，以及促进细胞凋亡有关。(2)在急性早幼粒白血病的应用中，对急性早幼粒白血病全反式维甲酸(ATRA)耐药细胞MR2和相应维甲酸敏感细胞NB4低细胞毒性剂量(＜IC10)大黄素，与ATRA联合应用，大黄素能够提高MR2和NB4细胞对ATRA的敏感性。低细胞毒性剂量大黄素(10μmol/L)和低剂量ATRA(0.2μmol/L)联合应用可以发挥优于ATRA单药组的细胞增殖抑制效应(P＜0.05)，而且该效应与高剂量ATRA(1μmol/L)单药作用效果无显著差异(P＞0.05)。有效诱导NB4细胞分化浓度组ATRA(1μmol/L)与大黄素联合应用后，ATRA耐药的MR2增殖受到明显抑制(P＜0.05)，与单药组比较，联合用药组NB4和MR2细胞NBT还原能力增强，CD11b分化抗原表达增加(P＜0.05)，Wright-Giemsa染色可见MR2细胞分化成熟形态学改变。实验证明，低细胞毒性剂量大黄素(10μmol/L)和低剂量ATRA(0.2μmol/L)联合应用可以发挥优于0.2μmol/L ATRA单药组的细胞增殖抑制效应，而且该效应与1μmol/LATRA组作用效果相当。(3)在高致瘤急性白血病细胞裸鼠异种移植瘤体内的应用，将大黄素单药以及与急性白血病一线化疗药物小剂量Ara-C联合应用，给药后14天，大黄素明显抑制急性白血病移植瘤细胞生长，呈剂量依赖性，Ara-C联合应用组抑瘤效果更佳。大黄素单药组和联合用药组均能够诱导移植瘤细胞凋亡。裸鼠一般状况观察、血常规和重要脏器组织病理检测显示，大黄素对裸鼠无明显毒副作用。大黄素与Ara-C联用组明显提高荷瘤鼠存活率，显著延长荷瘤鼠生存时间。本发明实验证实大黄素和传统抗白血病化疗药物联合应用，既能够降低化疗药物使用剂量，减少毒副反应，部分逆转白血病多药耐药，又能够发挥协同抗白血病细胞作用，取得最佳的治疗效果，提示大黄素是一种新型的白血病化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂，对临床急性白血病的治疗具有潜在的应用价值，并且其作用机制具有多靶点、多环节、多效应等特点。

总之，本发明通过大黄素和白血病化疗药物联合应用，具有协同抗白血病细胞增殖作用，部分逆转急性白血病多药耐药。大黄素能够促进全反式维甲酸(ATRA)对其敏感和耐药的急性早幼粒白血病细胞诱导分化作用。在急性白血病细胞移植瘤鼠体内，大黄素与Ara-C联合应用，可以提高移植瘤细胞对Ara-C的敏感性，有效抑制急性白血病裸鼠移植瘤生长，提高荷瘤鼠生存率，延长存活时间。

附图说明：

图1-1为本发明的流式细胞仪检测大黄素与阿霉素联合应用后对HL-60/ADR细胞凋亡诱导效应图，图中A：对照组；B：10μmol/L ADR组；C：10μmol/L大黄素组；D：10μmol/L ADR+10μmol/L大黄素组，箭头↓表示亚二倍体峰(凋亡峰)；

图1-2为本发明的DNA片段化分析检测大黄素与阿霉素联合应用后对HL-60/ADR细胞凋亡诱导作用图；

图1-3为本发明的(A)总RNA电泳图(B)大黄素和ADR单药及联合用药对HL-60/ADR细胞bcl-2、MRP1、GSTα、GSTπ、LRP、TOPOⅠ、TOPOⅡα和TOPOⅡβ基因mRNA表达影响(c)Launch SensiAnsys.exe软件条带灰度扫描结果图；图中：M：PUC 8 Marker；Lane1：对照；Lane 2：10μmol/L ADR；Lane 3：10μmol/L大黄素；Lane 4：10μmol/L ADR+10μmol/L大黄素；Con：对照组。与对照组比较，^*P＜0.01，^#P＞0.05。

图1-4为本发明的Real-time PCR检测MRP1和bcl-2基因mRNA表达改变图；

图1-5为本发明的Western Blot检测HL-60/ADR细胞Bcl-2，MRP1，TOPOⅡβ和GSTπ蛋白表达改变图；

图1-6为本发明的流式细胞仪检测大黄素处理后HL-60和HL-60/ADR细胞ADR蓄积水平改变图，图中：A：HL-60/ADR对照；B：HL-60/ADR+2.5μmol/L大黄素；C：HL-60/ADR+5μmol/L大黄素；D：HL-60/ADR+10μmol/L大黄素；E：HL-60对照；F：HL-60+10μmol/L大黄素；

图1-7为本发明的流式细胞仪检测大黄素处理后HL-60和HL-60/ADR细胞内DNR荧光强度变化图，图中：1：HL-60对照；2：HL-60+10μmol/L大黄素；3：HL-60/ADR对照；4：HL-60/ADR+2.5μmol/L大黄素；5：HL-60/ADR+5μmol/L大黄素；6：HL-60/ADR+10μmol/L大黄素；

图1-8为本发明的大黄素处理后HL-60和HL-60/ADR细胞内DNR平均荧光强度值变化图；图中1：HL-60对照；2：HL-60+10μmol/L大黄素；3：HL-60/ADR对照；4：HL-60/ADR+2.5μmol/L大黄素；5：HL-60/ADR+5μmol/L大黄素；6：HL-60/ADR+10μmol/L大黄素；与HL-60对照组比较，^▲P＞0.05，与HL-60/ADR对照组比较，^△P＞0.05，^#P＜0.05。

图1-9为本发明的激光共聚焦显微镜检测大黄素处理后DNR在HL-60(A)和HL-60/ADR(B)细胞内的分布变化图；图中1：对照；2：2.5μmol/L大黄素；3：5μmol/L大黄素；4：10μmol/L大黄素；

图2-1为本发明的大黄素增强ATRA对NB4和MR2细胞的增殖抑制作用图，与NB4和MR2细胞0.2μmol/L ATRA单药组比较，^#P＜0.05。与NB4和MR2细胞1μmol/LATRA单药组比较，^△P＞0.05，^*P＜0.05。

图2-2为本发明的大黄素促进ATRA对NB4(A)和MR2(B)细胞的诱导分化作用图，图中1：对照；2：10μmol/L大黄素；3：1μmol/L ATRA；4：10μmol/L大黄素+1μmol/L ATRA；

图2-3为本发明的流式细胞仪检测大黄素联合ATRA后提高NB4(A)和MR2(B)细胞CD11b表达水平图；图中1：对照；2：10μmol/L大黄素；3：1μmol/LATRA；4：10μmol/L大黄素+1μmol/L ATRA；

图3-1为本发明的大黄素、Ara-C和联合用药组给药14天HL-60细胞移植瘤体积生长曲线变化图；

图3-2为本发明的给药14天后各组荷瘤鼠离体瘤块大小图，图中A：对照；B：20mg/kg大黄素；C：40mg/kg大黄素；D：2mg/kg Ara-C；E：20mg/kg大黄素+2mg/kg Ara-C；

图3-3为本发明的给药14天后各组肿瘤细胞超微结构改变图，图中：1：对照(×6300)；2：20mg/kg大黄素(×6300)；3：40mg/kg大黄素(×6300)；4：2mg/kg Ara-C(×8000)；5：20mg/kg大黄素+2mg/kg Ara-C(×8000)；

图3-4为本发明的给药14天后各组瘤块病理形态(HE染色，×200)图，图中：1：对照；2：20mg/kg大黄素；3：40mg/kg大黄素；4：2mg/kg Ara-C；5：20mg/kg大黄素+2mg/kg Ara-C；

图3-5为本发明的给药14天后对照组HL-60细胞荷瘤鼠重要脏器病理形态(HE染色，×100)图，图中：A：心；B：肝；C：脾；D：肺；E：肾；F：肠；

图3-6为本发明的20mg/kg大黄素给药组14天后HL-60细胞荷瘤鼠重要脏器病理形态(HE染色，×100)图，图中：A：心；B：肝；C：脾；D：肺；E：肾；F：肠；

图3-7为本发明的40mg/kg大黄素给药组14天后HL-60细胞荷瘤鼠重要脏器病理形态(HE染色，×100)图，图中：A：心；B：肝；C：脾；D：肺；E：肾；F：肠；

图3-8为本发明的2mg/kg Ara-C给药组14天后HL-60细胞荷瘤鼠重要脏器病理形态(HE染色，×100)图，图中：A：心；B：肝；C：脾；D：肺；E：肾；F：肠；

图3-9为本发明的大黄素和Ara-C联合给药组14天后HL-60细胞荷瘤鼠重要脏器病理形态(HE染色，×100)图，图中：A：心；B：肝；C：脾；D：肺；E：肾；F：肠；

图3-10为本发明的HL-60细胞荷瘤鼠70天Kaplan-Meier生存曲线图；

图3-11为本发明的各组HL-60细胞荷瘤鼠治疗前图，图中1：对照组.2：20mg/kg大黄素给药组.3：40mg/kg大黄素给药组.4：2mg/kg Ara-C给药组.5：20mg/kg大黄素+2mg/kg Ara-C联合给药组；

图3-12为本发明的各组HL-60细胞荷瘤鼠给药后第35天图，图中1：对照组.2：20mg/kg大黄素给药组.3：40mg/kg大黄素给药组.4：2mg/kg Ara-C给药组.5：20mg/kg大黄素+2mg/kg Ara-C联合给药组；

图3-13为本发明的各组HL-60细胞荷瘤鼠给药后第70天图，图中1：对照组.2：20mg/kg大黄素给药组.3：40mg/kg大黄素给药组.4：2mg/kg Ara-C给药组.5：20mg/kg大黄素+2mg/kg Ara-C联合给药组；

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明进行详细说明：

应用实例Ⅰ  大黄素在体外提高急性白血病多药耐药细胞对化疗药物敏感性，逆转细胞多药耐药作用

材料和方法

1 细胞来源和主要试剂

阿霉素(ADR)诱导的人急性白血病多药耐药细胞株HL-60/ADR及其相应的敏感株HL-60，引自中国医学科学院血液学研究所，HL-60/ADR细胞用含0.2-0.4μg/ml阿霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培养液(HyClone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)培养，维持其耐药性，实验前两周换用无阿霉素RPMI1640培养液。HL-60细胞培养体系为10％胎牛血清的RPMI1640培养液。

大黄素为南京青泽医药科技开发有限公司产品，HPLC测定其纯度大于98.0％，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司，将大黄素溶解于DMSO中配制成50mmol/L母液，-20℃保存备用。阿霉素(ADR)购自Sigma公司，依托泊苷(VP16)购自江苏恒瑞医药股份有限公司，高三尖杉酯碱(HHT)购自杭州民生药业集团有限公司，柔红霉素(DNR)购自PharmaciaItalia S.P.A公司，阿糖胞苷(Ara-C)和吡柔比星(THP)购自浙江海正药业股份有限公司，米托蒽醌(MTZ)购自江苏奥赛康药业有限公司，长春新碱(VCR)购自深圳万乐药业有限公司。

2 HL-60/ADR细胞耐药性检测

取对数生长期的HL-60和HL-60/ADR细胞，调整细胞初始浓度为2.0×10⁵/ml，接种于96孔板，再加入依次对倍稀释的不同浓度梯度临床常用化疗药物(ADR、VP16、HHT、DNR、Ara-C、THP、MTZ、VCR)，每孔药物和细胞悬液总体积为100μl，细胞终浓度为1.0×10⁵/ml，每组重复3个平行孔，继续培养72小时后，加入5mg/ml MTT，4小时后吸弃上清，加DMSO100μl，振荡混匀后双波长比色。计算耐药倍数＝耐药株IC50/敏感株IC50。实验重复3次。

3 大黄素与化疗药物联合应用对HL-60/ADR细胞耐药性的影响

根据大黄素作用于HL-60/ADR细胞的量效关系曲线(详见第一部分研究结果)，选用细胞抑制率低于20％的低细胞毒性剂量(＜IC20)大黄素与不同浓度梯度化疗药物进行联合用药实验。MTT法比色，计算耐药逆转倍数，逆转倍数(RF)＝耐药株IC50/加逆转剂耐药株IC50，联合用药药效评价参照文献^[33，34]金氏公式：Q＝E_a+b/(E_a+E_b-E_a×E_b)来评价两种药物在体外联合作用的效果。其中，E_a+b为合并用药抑制率，E_a和E_b分别为A药和B药的抑制率。公式中分子代表“实测合并效应”，分母为“期望合并效应”，Q是两者之比。Q值0.85～1.15表示两药合用效果为相加(+)，1.15～2.0表明两药合用具有协同作用，效果为增强(++)，＞2.0为明显增强(+++)，＜0.85～0.55为拮抗(-)，＜0.55为明显拮抗。实验重复3次。

4 细胞凋亡检测

4.1 DNA倍体分析

将HL-60/ADR细胞分为以下分4组进行实验：(1)对照组；(2)10μmol/L阿霉素组；(3)10μmol/L大黄素组；(4)10μmol/L阿霉素+10μmol/L大黄素联合用药组。48小时候收集细胞，按照DNA倍体分析试剂盒说明操作，先用1ml Buffer Solution重悬细胞，重复3次，调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml，加250μl Solution A混匀后室温孵育10min，再加入Solution B 200μl，室温孵育10分钟，最后加200μl Solution C，混匀，冰上孵育10分钟，流式细胞仪分析结果，实验重复3次。

4.2 DNA片段化分析

实验分组同4.1，按照碧云天Beyotime DNA Ladder抽提试剂盒操作说明进行。主要步骤如下：(1)收集各组HL-60/ADR细胞，每组细胞数为1.0×10⁶，离心沉淀，弃上清，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤两次，轻柔重悬每管细胞于200μl PBS中。(2)加入4μl RNase A，涡旋混匀，室温放置2分钟。(3)加20μl蛋白酶K，涡旋混匀。(4)加200μl裂解液，涡旋混匀，70℃孵育10分钟。(5)加200μl无水乙醇，涡旋混匀。(6)将以上每管混合液加入到DNA纯化柱内，≥8000rpm离心1分钟，弃废液。(7)加500μl洗涤液Ⅰ，≥8000rpm离心1分钟，弃废液。(8)加600μl洗涤液Ⅱ，≥12000rpm离心1分钟，弃废液，再离心1次以去除残留液体。(9)DNA纯化柱置于洁净EP管中，每管加50μl洗脱液，室温放置1-3分钟，≥12000rpm离心1分钟，所得液体即为纯化后得到的总DNA。(10)35V，1％琼脂糖凝胶电泳近3小时。凝胶图像分析仪(上海培清，JS-380A型)上分析结果并拍照。

5 耐药相关基因表达水平检测

5.1 RT-PCR检测耐药相关基因mRNA表达变化

实验分组同4.1，药物作用时间为24小时，总RNA提取后逆转录为cDNA，再进行PCR扩增，比较HL-60/ADR细胞大黄素和阿霉素联合用药组与单药组、对照组耐药相关基因表达水平变化。结果以目的基因和β-actin灰度比值表示。MRP1、GSTπ引物委托TaKaRa宝生物工程有限公司合成，其余为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列及反应条件如下表：

5.2 SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测MRP1、bcl-2基因表达水平

cDNA和MRP1上下游引物来源与方法5.1半定量RT-PCR相同，以β-actin为内参照，β-actin上游序列5’-CGCACCACTGGCATTGTCAT-3’，下游序列5’-TTCTCCTTGATGTCGCGCAC-3’，bcl-2上游引物序列CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC，下游引物序列为CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC，应用Real Master Mix试剂盒(Tiangen，北京)配制反应混合液，包括2.5×Real Master Mix/20×SYBR solution 9μl，0.3mmol/L上下游引物，1.5μlcDNA，无RNase H₂O，每管总反应体积为20μl，每组样本均设3个重复管，同时设无模板试剂阴性对照。ABI 7700型定量PCR仪上95℃ 1min变性后进行40个循环扩增反应。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时的反应循环数称为Ct(threshold cycle)值，用相对定量公式2^-ΔΔCt计算实验组与对照组目的基因的相对表达水平改变，其中ΔΔCt＝ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)，ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，实验组与对照组基因差异表达的倍数即为2^-ΔΔCt。

5.3 Western Blot检测耐药相关蛋白表达变化

按照3.1方案进行分组，各组作用时间为48小时。MRP1兔源单抗购自博士德生物工程有限公司，GSTπ鼠源单抗购自BD Biosciences公司，Bcl-2和TOPOⅡ-β(C-12)鼠源单抗均为Santa Cruz公司产品。MRP1和TOPOⅡ-β的检测应用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，一抗孵育时间为48小时，其余在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行。

6 细胞内化疗药物蓄积水平测定

ADR和DNR为临床上常用的两种化疗药物，具有自发荧光的特性，从而可以应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜进行以下实验，观察HL-60耐药和敏感细胞株经大黄素处理后对两种药物的摄取水平变化。

6.1流式细胞仪测定细胞ADR荧光阳性率

将HL-60和HL-60/ADR细胞接种6孔培养板，HL-60/ADR细胞分别加入终浓度为2.5、5、10μmol/L的大黄素，HL-60细胞加入终浓度为10μmol/L的大黄素，两种细胞均另设一组不加大黄素处理的对照组，实验共6组，每组均设3个重复孔，置于37℃培养箱孵育48h，收集细胞，PBS洗涤细胞两次弃上清，再加入7μmol/L的阿霉素500μl，，混匀后37℃振摇2h，收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，500μl PBS重悬浮细胞，流式细胞仪(COULTER EPICSXL)上检测细胞内ADR激发的荧光阳性率，即为摄取有ADR的细胞百分率。

6.2 流式细胞仪测定细胞内DNR平均荧光强度

分组方案同6.1，置37℃培养48h后，各组分别加入终浓度为5μmol/L的DNR，混匀后继续培养2h，收集细胞，PBS洗涤并重悬浮细胞后流式细胞仪测定两种细胞内DNR平均荧光强度(MFI)变化，以MFI表示细胞内摄取的DNR平均含量。

6.3 激光共聚焦显微镜观察DNR在细胞内的分布

HL-60和HL-60/ADR细胞均分别加入终浓度为2.5、5、10μmol/L的大黄素，两种细胞均另设一组不加大黄素处理的对照组，置于37℃培养箱孵育1h，再加入终浓度为4μmol/L的DNR，混匀后继续孵育1h，收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，重悬浮细胞，滴加于载玻片上，盖上盖玻片，置于激光共聚焦显微镜(Leica SP5)观察DNR在细胞内的分布变化(激发光波长488nm，发射光波长为515nm)。

7 统计学处理

采用SPSS14.0软件包进行统计学处理。结果以均数±标准差

表示。实验组和对照组、实验组和实验组之间比较采用方差分析(ANOVA)和t检验。

结果

1 HL-60/ADR细胞对常用化疗药物耐药性检测结果

HL-60与HL-60/ADR细胞分别与8种临床常用化疗药物培养72小时后进行MTT法比色，计算每一种药物的IC50。与HL-60敏感细胞比较，HL-60/ADR细胞除了对蒽环类药物具有耐药性，还对包括长春新碱(VCR)、依托泊苷(VP16)等多种临床常用化疗药物具有耐药性，对阿霉素(ADR)的耐药性最强，超过了250倍，对阿糖胞苷(Ara-C)耐药性最弱(表1-1)。

表1-1  MTT法检测HL-60/ADR细胞对常用化疗药物的耐药性

2 大黄素对HL-60/ADR细胞的耐药逆转作用

在培养体系中加入低细胞毒性剂量(＜IC20)大黄素，即10μmol/L，与不同浓度倍比稀释的化疗药物(ADR：5，10，20，40，80μmol/L；VP16：8，16，32，64，128μmol/L；MTZ：0.8，1.6，3.2，6.4，12.8μmol/L；VCR：0.063，0.125，0.25，0.5，1μmol/L；DNR：0.4，0.8，1.6，3.2，6.4μmol/L；HHT：0.01，0.02，0.04，0.08，0.16μmol/L；THP：0.8，1.6，3.2，6.4，12.8μmol/L；Ara-C：0.63，1.25，2.5，5，10μmol/L)，大黄素能够提高HL-60/ADR细胞对不同化疗药物的敏感性，8种药物对HL-60/ADR细胞的IC50均有不同程度下降，与未加大黄素组比较，差异具有显著性(P＜0.001)，提示大黄素能够逆转HL-60/ADR细胞多药耐药，大黄素对ADR耐药逆转效果最好，逆转倍数为4.12(表1-2)。

表1-2  10μmol/L大黄素对HL-60/ADR细胞的多药耐药逆转作用

与未加大黄素处理组比较，^#P＜0.001。

3 大黄素与化疗药物联合应用效果评价

HL-60/ADR细胞高度耐药和基本不耐药的两种临床常用化疗药物阿霉素(ADR)、阿糖胞苷(Ara-C)按照一定浓度倍比稀释后(倍比浓度详见表1-3和表1-4)，分别与5μmol/L和10μmol/L两种低毒性剂量的大黄素共培养72小时，ADR联合用药组细胞增殖抑制率均较单独用药组明显提高(P＜0.05)。低浓度大黄素(5μmol/L)和低浓度ADR(5μmol/L)联合应用具有相加作用，随着大黄素和ADR浓度的增加，两药联合应用表现为协同作用(Q值均＞1.15)，其中10μmol/L大黄素和10μmol/LADR合用协同作用明显增强(Q值＞2.0)。各联合用药组与ADR单药组比较，细胞增殖抑制率均具有显著性差异(P＜0.05)。HL-60/ADR细胞耐药性较弱的Ara-C和大黄素联合应用后，也具有相加或者协同作用，低浓度Ara-C(0.63μmol/L，1.25μmol/L)分别和低浓度大黄素(5μmol/L，10μmol/L)合用，协同抑制作用加强或者明显加强(Q值均＞1.15)，与Ara-C单药组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。随着Ara-C浓度的增高，两药联合应用效果则表现为单纯相加作用(表1-3、表1-4)。

表1-3  大黄素联合ADR对HL-60/ADR细胞的增殖抑制作用

与ADR单药组比较，^*P＜0.05

表1-4  大黄素联合Ara-C对HL-60/ADR细胞的增殖抑制作用

与Ara-C单药组比较，^*P＜0.05，^#P＞0.05。

4 细胞凋亡检测结果

4.1 DNA倍体分析检测

10μmol/L大黄素与10μmol/L阿霉素联合作用于HL-60/ADR细胞48小时后，流式细胞仪分析到典型的亚二倍体凋亡峰，相应浓度的大黄素与阿霉素单药组以及对照组则未检测到。联合用药组细胞凋亡率为(28.82±4.12)％(图1-1)。

4.2 DNA片段化分析检测结果

10μmol/L大黄素和10μmol/L阿霉素联合应用于HL-60/ADR细胞72小时后，如图1-2所示，与大黄素、阿霉素单药组以及对照组比较，联合用药组可见到明显的DNA裂解梯状带形成。

5 耐药相关基因表达水平检测

5.1 RT-PCR检测bcl-2、MRP1、GSTπ、TOP0Ⅱβ、LRP、GSTα、TOP0Ⅰ和TOP0Ⅱα基因表达变化

大黄素和阿霉素联合应用24小时后，与对照组比较，联合用药组能够显著降低MRP1、LRP、GSTα、bcl-2、GSTπ、TOPOⅡβ耐药相关基因mRNA表达水平(P＜0.01)，对TOPOⅠ基因的表达不产生显著影响(P＞0.05)，TOPOⅡα基因表达上调。单药组与对照组比较结果显示，ADR作用组HL-60/ADR细胞以上几种基因表达未见明显改变，10μmol/L大黄素组能够降低MRP1、LRP、GSTα表达水平(P＜0.01)，对bcl-2、GSTπ、TOPOⅠ、TOPOⅡα、TOPOⅡβ表达水平没有明显影响(图1-3，表1-5)。

表1-5  大黄素和ADR单药及联合用药后RT-PCR检测HL-60/ADR细胞多药耐药相关基因与β-actin灰度比值改变

与对照组比较，^*P＜0.01，^#P＞0.05。

5.2 SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测结果

根据实时荧光定量PCR的相对定量公式，与未加药组比较，计算各组药物作用后基因差异表达的倍数2^-ΔΔCt，结果显示，10μmol/L大黄素组作用24小时后MRP1基因2^-ΔΔCt为0.58，ADR组为0.81，二者联合用药组为0.04，ADR和大黄素单药组bcl-2基因2^-ΔΔCt值分别为0.96、0.95，联合用药组为0.37，提示大黄素和ADR联合应用能够明显下调HL-60/ADR细胞MRP1和bcl-2基因表达水平(图1-4，表1-6，表1-7)。

表1-6  Real-time PCR检测各药物组HL-60/ADR细胞MRP1基因表达改变

表1-7  Real-time PCR检测各药物组HL-60/ADR细胞bcl-2基因表达改变

5.3 Western Blot检测耐药相关蛋白表达变化

对照组、阿霉素和大黄素单药组、联合用药组HL-60/ADR细胞，孵育48小时后，几种检测到的耐药相关蛋白MRP1、TOPOⅡβ、Bcl-2和GSTπ在联合用药组中的表达水平下调最明显(图1-5)。

6 细胞内ADR和DNR蓄积水平测定

6.1 流式细胞仪检测细胞内ADR荧光阳性率

HL-60/ADR细胞ADR荧光阳性率为(1.16±0.10)％，明显低于HL-60细胞的阳性率(36.37±5.19)％。不同浓度大黄素处理组HL-60/ADR细胞与未处理组比较，细胞ADR荧光阳性率随着大黄素处理组浓度(2.5-10μmol/L)的增加而增加，波峰逐渐右移，5μmol/L和10μmol/L大黄素处理组荧光阳性率均明显高于未加大黄素对照组(P＜0.01)，2.5μmol/L处理组则未见显著改变(P＞0.05)。HL-60细胞大黄素未处理组的ADR荧光阳性率与10μmol/L大黄素处理组荧光阳性率接近(P＞0.05)，波形相似，结果提示，未加入大黄素作为逆转剂HL-60/ADR细胞ADR蓄积水平远小于敏感株HL-60细胞，加入不同浓度大黄素后，HL-60/ADR细胞内ADR蓄积含量均有不同程度增加，部分逆转HL-60/ADR细胞对ADR的耐药性，逆转效率随着大黄素浓度的增加而增加。见表1-8，图1-6。

表1-8  流式细胞仪检测大黄素处理后HL-60和HL-60/ADR细胞ADR蓄积水平改变

与HL-60/ADR细胞对照组比较，^△P＜0.01，^*P＞0.05，与HL-60细胞对照组比较，^▲P＞0.05。

6.2 流式细胞仪检测细胞DNR荧光强度

未加大黄素对照组HL-60细胞和10μmol/L大黄素处理组HL-60细胞胞内DNR平均荧光强度(MFI)分别为193.33±29.38和215.85±36.32，两组荧光强度未见明显差异(P＞0.05)，未加大黄素作为逆转剂HL-60/ADR耐药细胞内DNR MFI值为37.68±1.47，仅约为HL-60敏感株MFI值的19.49％。HL-60/ADR细胞经2.5、5和10μmol/L大黄素作用48小时后，细胞内DNR MFI值逐渐增高，分别为48.94±0.18、72.32±8.50和139.19±9.55，为敏感株的25.31％、37.41％和72.00％，其中5μmol/L和10μmol/L大黄素处理组MFI与相应对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)，DNR MFI值是通过流式细胞仪检测细胞内DNR蓄积水平一个重要指标，以上检测结果表明，大黄素能够部分逆转HL-60/ADR细胞对DNR的耐药性，并且该作用具有一定的剂量依赖性(图1-7，图1-8，表1-9)。

表1-9  大黄素处理后HL-60和HL-60/ADR细胞内DNR平均荧光强度值变化

与HL-60对照组比较，^▲P＞0.05，与HL-60/ADR对照组比较，^△P＞0.05，^#P＜0.05。

6.3 激光共聚焦显微镜观察DNR在细胞内的分布

激光共聚焦显微镜进一步观察到DNR在细胞中蓄积和分布变化，HL-60细胞DNR荧光均匀分布于细胞核、胞浆以及细胞膜上，荧光呈均匀弥漫分布，胞核中的荧光强度更强。不同浓度(0-10μmol/L)大黄素处理组对HL-60细胞DNR荧光强度无明显影响，细胞内荧光分布未见有明显区别。HL-60/ADR细胞对照组DNR荧光强度较弱，荧光主要分布胞膜和胞浆外围，分布不均，呈颗粒状，随着大黄素处理组作用浓度的增加，胞浆与胞核中的DNR荧光逐渐增强，但强度仍低于HL-60细胞(图1-9)。

讨论

多药耐药(MDR)是影响肿瘤化疗效果的主要因素，目前已经明确的MDR发生主要有以下因素参与：(1)肿瘤细胞膜表面ATP结合膜蛋白表达增加，活性增强，将抗肿瘤药物排出细胞膜外，从而降低细胞内药物浓度，使细胞产生耐药，主要有P-糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等。(2)酶介导的耐药机制，如谷胱甘肽转移酶(GST)、拓扑异构酶(TOPO)、蛋白激酶C(PKC)等活性增强；(3)肿瘤细胞抗凋亡能力增强。这些耐药相关因素可能单独或联合在多药耐药MDR的形成中起作用。针对MDR不同的发生机制，积极寻找高效、低毒、特异性强且作用靶点广泛的肿瘤耐药逆转剂成为当务之急。多种传统中药提取的天然成分在逆转多药耐药MDR的研究及实际应用中显示了高效低毒的优势。白血病是最常见的造血系统恶性肿瘤，临床上联合化疗仍是白血病治疗的主要手段，但是多药耐药MDR的产生、大剂量化疗药物导致的毒副反应常常是白血病患者死亡的主要原因。虽然大黄素与髓系白血病一线治疗药物阿霉素、柔红霉素等同样具有蒽环类结构，但我们的研究结果显示，耐蒽环类药物的HL-60/ADR细胞对大黄素仍然敏感，并且大黄素对HL-60/ADR、HL-60细胞的IC50值接近，提示大黄素对白血病耐药细胞仍然有效，具有独特的抗白血病作用优势，有必要在原有研究基础上展开进一步研究。因此，我们以低毒性剂量大黄素(＜IC20)与HL-60/ADR耐药的8种化疗药物联合应用，判断耐药逆转效果，并对涉及的耐药相关基因和蛋白表达、细胞凋亡、细胞内药物含量及分布等经典和非经典MDR相关机制展开探讨。

应用8种临床化疗药物对HL-60敏感株和HL-60/ADR耐药株药物敏感性检测结果显示，HL-60/ADR细胞除了对ADR、DNR等常用蒽环类药物具有耐药性，对表鬼臼素类药物VP16、长春碱类药物VCR、植物碱类药物HHT具有不同程度的耐药性，对抗嘧啶药物Ara-C耐药性较弱。低剂量大黄素和8种化疗药物联合应用后，能够增加HL-60/ADR细胞对化疗药物的敏感性，有效降低化疗药物IC50，发挥较单药组更强的抑制细胞增殖作用，从而部分逆转HL-60/ADR细胞多药耐药，逆转倍数介于1.58-4.12之间，对ADR的耐药逆转效果最好。为了评估两药联合应用效果，我们选择5、10μmol/L(＜IC20)大黄素分别与不同浓度依次倍比稀释的HL-60/ADR细胞高度耐药和基本不耐药的两种化疗药物ADR、Ara-C联合应用，结果表明，绝大多数大黄素与ADR联合用药组Q值均大于1.15，表明二者的协同作用结果主要表现为增强，其中10μmol/L大黄素和10μmol/L ADR(＜IC10)联合用药组使ADR对HL-60/ADR的抑制率从单独用药时的9.71％提高到联合用药时的57.01％，Q值为2.33，两药合用表现为明显增强。大黄素和HL-60/ADR细胞基本不耐药的Ara-C低剂量组(0.63、1.25μmol/L)联合应用后，细胞增殖抑制效果明显，5μmol/L大黄素和Ara-C(0.63、1.25μmol/L)联用细胞抑制率从Ara-C单用时的5.63％、40.96％提高到35.29％、59.17％，10μmol/L大黄素和Ara-C(0.63、1.25μmol/L)联用抑制率分别提高到45.12％、68.33％，具有很好的协同效果，Q值评价结果为增强或明显增强，随着Ara-C浓度的提高，Q值表现单纯相加作用。综合以上提示，大黄素作为急性髓系白血病MDR逆转剂具有潜在优势，低剂量即可发挥协同作用，达到较佳耐药逆转效果，和化疗药物联用，既可以发挥较显著的抑制白血病细胞增殖效应，又能有效降低化疗药物剂量，减少不良副反应的发生，从而可能提高患者的疗效，具有实际的应用价值。

MDR经典途径涉及的膜转运蛋白主要有P-gp、MRP和LRP，三者均具有能量依赖性药物排出泵的功能，能通过主动转运将被动扩散进入细胞的药物泵出细胞，造成化疗药物外流，从而降低药物在细胞内的有效浓度，是白血病产生耐药的主要机制之一。多药耐药相关蛋白1(MRP1)是Cole等在1992年研究P-gp表达阴性的ADR耐药细胞株H69/AR过程中发现的^[37]，MRP1蛋白与P-gp同属ABC膜转运蛋白超家族成员，在结构上二者有15％的同源性，耐药谱也有一定重叠。ADR诱导的HL-60/ADR耐药细胞主要高表达MRP1。我们的研究表明，10μmol/L大黄素和10μmol/L ADR联合应用于HL-60/ADR细胞后，Q值为2.33，具有协同作用，作用效果表现为明显增强，进一步通过半定量RT-PCR、SYBR GreenⅠ定量PCR及WesternBlot检测发现，与对照组、单药组比较，大黄素和ADR联合用药组中MRP1表达水平均见明显下调，同时利用ADR、DNR具有自发荧光性质，流式细胞仪检测结果显示经过低细胞毒性浓度(2.5-10μmol/L)大黄素处理过的HL-60/ADR细胞胞内原本耐药的化疗药物(ADR、DNR)蓄积水平逐渐增加，激光共聚焦显微镜观察到HL-60/ADR细胞胞浆和胞核中的DNR荧光信号随着大黄素处理浓度的增加而增强，敏感株HL-60细胞荧光信号在对照组和各大黄素处理组中均较强，因此，我们认为，大黄素联合蒽环类化疗药物可能通过抑制膜转运蛋白MRP1的表达水平，抑制MRP1药物外排泵功能，逐渐恢复化疗药物在细胞内的正常含量和分布，从而部分逆转HL-60/ADR细胞多药耐药。引起白血病MDR的机制复杂多样，除了MRP1过度表达所致的耐药外，其它膜蛋白、酶类、抗凋亡基因等异常表达亦参与了白血病MDR产生过程。综合以上因素结合我们的研究结果，进一步作如下分析：

(1)肺耐药相关蛋白(LRP)：几乎所有肿瘤细胞株均不同程度表达有肺耐药相关蛋白(LRP)，位于核膜表面的LRP可以阻止以胞核为作用靶点的药物进入胞核，胞浆囊泡膜表面LRP把药物泵入囊泡，通过胞吐作用把药物排出细胞外。LRP高表达使肿瘤细胞对蒽环类、长春碱类、烷化剂等化疗药物产生耐药，LRP和MRP同时高表达的髓系白血病患者预后往往更差。我们的研究发现，LRP在急性髓系白血病耐药细胞HL-60/ADR中也存在高表达，其表达水平经10μmol/L ADR组作用后未见显著改变，10μmol/L大黄素组已检测到表达下调，联合用药组则下调更加显著，该结果提示大黄素是一种作用靶点广泛的抗白血病MDR药物。

(2)谷胱甘肽转移酶(GST)：包括GSTα、GSTμ、GSTπ、GSTθ四种同工酶，是体内重要的解毒酶，其表达升高、活性增强将对不同类抗肿瘤药物解毒作用加强，从而导致肿瘤细胞产生耐药。GSTπ催化谷胱甘肽的巯基和化疗药物的亲电中心结合，形成巯醚连接的谷胱甘肽结合物，还可以通过发挥自身的过氧化物酶活性，阻止化疗药物代谢过程产生的活性氧对膜磷脂的损伤，或者作为Ⅱ相代谢酶直接与药物的亲电性中间产物结合，降低化疗药物的毒性作用。Ascione等研究发现，GST抑制剂NBDHEX对过表达P-gp和MRP1的急性髓系白血病耐药细胞HL-60/DNR和HL-60/ADR均有效。一般认为，GSTα表达升高对氮芥类药物耐药，GSTπ表达升高将对蒽环类、表鬼臼类药物产生耐药，我们通过RT-PCR和Western Blot检测显示，HL-60/ADR细胞GSTα和GSTπ在对照组中均高表达，大黄素和ADR处理组GSTπ表达水平基本相同，但在联合用药组中表达明显减少，与对照组比较，GSTα在ADR单药组中仍是高表达，但经大黄素单药组处理后，表达开始下调，ADR和大黄素联合应用后，下调更加明显，提示大黄素不仅主要对治疗白血病蒽环类药物耐药有效，对氮芥类药物耐药的治疗可能也有潜在优势。

(3)DNA拓扑异构酶(Topo)：Topo参与了DNA复制、转录、重组和修复等过程，已知拓扑异构酶主要有2大类：TopoⅠ与TopoⅡ，其中TopoⅡ与MDR有关，又分为TopoⅡα和TopoⅡβ。TopoⅡβ是细胞生存的关键酶，它与烷化剂损伤的DNA结合，改变受损DNA的拓扑构象，修复受损的DNA，导致白血病细胞烷化剂耐药的产生。在我们的研究结果中，联合用药组TopoⅡβ显著下调，与前述的GSTα结果相吻合，进一步显示大黄素对烷化剂耐药白血病细胞的治疗具有前景。与其它耐药基因检测结果相反，联合用药组TopoⅡα基因较对照组和单药组表达水平增加。TopoⅡα的表达水平与耐药性之间的关系还存在争议，我们的研究结果更倾向于有学者报道的二者之间存在负相关关系，TopoⅡα是蒽环类、蒽酮类、表鬼臼类等抗肿瘤药物作用靶点之一，其表达水平升高，抗肿瘤药物作用靶点增加，干扰TopoⅡα催化的DNA断裂-重接反应，导致DNA断裂，靶细胞死亡。TopoⅠ在S期肿瘤细胞中活性增强，随着TopoⅠ特异性抑制剂喜树碱及其类似物在临床中广泛应用，作用于TopoⅠ的抑制剂受到人们的广泛重视。HL-60/ADR细胞存在TopoⅠ高表达，但经单药组以及联合用药组处理后，表达水平未见明显改变，我们认为TopoⅠ表达不受大黄素作用的影响。

(4)抗凋亡基因bcl-2：多数化疗药物是通过诱导肿瘤细胞发生程序性死亡(PCD)即凋亡来达到治疗目的，反之，肿瘤细胞也可通过逃逸凋亡或拮抗凋亡获得生存，即产生MDR。bcl-2家族是细胞凋亡关键调控物质，bcl-2基因过表达导致肿瘤细胞凋亡受抑制，同时对多种药物产生耐药。本研究应用RT-PCR、real-time PCR、Western Blot检测证实，HL-60/ADR耐药细胞经10μmol/LADR和10μmol/L大黄素单药以及两者联合用药处理后，对照组和单药组bcl-2表达水平未见明显改变，联合用药组则显著下调，同时DNA倍体分析和DNA Ladder检测发现联合用药组较单药组HL-60/ADR耐药细胞凋亡现象明显，提示抗凋亡基因bcl-2表达受阻，启动细胞凋亡是大黄素逆转HL-60/ADR细胞MDR的又一关键环节。

肿瘤MDR是多种因素、多种机制共同参与的过程，克服MDR应从多角度、全方位考虑。低剂量大黄素能够提高白血病MDR细胞对化疗药物的敏感性，部分逆转HL-60/ADR细胞多药耐药，与ADR、Ara-C联合应用，有效降低药物使用剂量的同时，发挥协同抗HL-60/ADR细胞增殖作用，在转录和翻译水平多环节阻断耐药相关基因表达，增加细胞内药物滞留量，诱导MDR细胞凋亡，提示大黄素是一种高效低毒的急性白血病化疗药物增敏剂和MDR逆转剂。

由上可见，本发明大黄素与急性白血病化疗药物的组合能够作为化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂在抗急性白血病中的应用。本发明的一种低细胞毒性剂量(＜IC20)大黄素与化疗药物阿霉素(ADR)或阿糖胞苷(Ara-C)组合具有抗HL-60/ADR多药耐药细胞增殖的作用。

应用实例Ⅱ  大黄素在体外提高急性早幼粒白血病细胞对维甲酸的敏感性，促进细胞分化作用

材料和方法

1 细胞株及药物来源

NB4为全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)敏感的人急性早幼粒白血病(APL)细胞株，MR2细胞株来源于对ATRA耐药的NB4细胞亚克隆，由上海瑞金医院血液研究所惠赠。全反式维甲酸ATRA购自美国Sigma公司，溶解于DMSO配制成50mmol/L的母液，-20℃保存备用。

2 大黄素联合ATRA对NB4、MR2细胞增殖和分化的影响

2.1 MTT法检测细胞增殖变化

NB4和MR2细胞接种终浓度为5.0×10⁴/ml，接种于96孔板，实验分为：对照组，10μmol/L大黄素单药组，ATRA(0.2、1.0μmol/L)单药组，10μmol/L大黄素与两种不同浓度ATRA联合用药组，每孔药物和细胞悬液总体积为100μl，每组均设3个平行孔，37℃、含5％CO₂培养箱培养第4天进行MTT比色。

2.2 大黄素对ATRA诱导NB4、MR2细胞分化的影响

NB4和MR2细胞分别接种于6孔培养板中，接种浓度为5.0×10⁴/ml，每孔5ml，根据5.1部分MTT实验结果，并根据文献报道的较常用诱导APL细胞分化的ATRA浓度，分为4组进行实验：(1)对照组；(2)10μmol/L大黄素组；(3)1μmol/LATRA组；(4)10μmol/L大黄素+1μmol/L ATRA组。各组药物与细胞共培养第4天进行以下实验，所有实验均重复3次。

2.2.1 细胞形态学观察

收集各组细胞，PBS洗涤后涂片，待干，甲醇固定，Wright-Giemsa染色，油镜下观察各组细胞形态变化。

2.2.2 NBT还原实验

取各组细胞数1×10⁵，用新鲜培养液500μl重悬，加入含佛波酯(TPA，100μg/ml)(FlukaBiochemika)10μl的2mg/ml NBT(Amresco)500μl，混匀后置于37℃温箱中孵育30-60min。离心弃上清，沉淀物涂片，Wright-Giemsa染色，胞浆内含有蓝灰色颗粒的细胞为阳性细胞，每组计数200个细胞，计算NBT阳性率。

2.2.3 细胞表面分化抗原CD11b表达水平检测

收集各组细胞，用PBS调整细胞数为1×10⁶/ml，取各组200μl细胞悬液，每组加入20μlFITC-CD11b(Biolegend)抗体，轻轻混匀后置室温孵育20min，再加入PBS 300μl，流式细胞仪(Beckman Coulter FC500)上分析结果。实验重复进行3次。

3 统计学处理

采用SPSS14.0软件包进行统计学处理，结果以均数±标准差表示。实验组和对照组、实验组和实验组之间比较采用方差分析(ANOVA)和t检验。

结果

1 大黄素增强ATRA对NB4、MR2细胞增殖抑制作用

10μmol/L大黄素对NB4和MR2细胞抑制率均小于10％，0.2μmol/L ATRA和10μmol/L大黄素联合应用后，NB4和MR2细胞增殖抑制率分别为64.32％和33.60％，0.2μmol/L ATRA单药组两种细胞抑制率分别为24.00％和17.93％，联合用药组与ATRA单药组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。0.2μmol/LATRA和10μmol/L大黄素联合应用与1μmol/LATRA单药组比较，对NB4和MR2细胞抑制效果差异无显著性(P＞0.05)。1μmol/L ATRA与10μmol/L大黄素联合应用组对NB4和MR2细胞均具有较明显的增殖抑制作用，抑制率从ATRA单药组的54.29％和26.58％分别提高到85.77％和43.95％，差别均具有统计学意义(P＜0.05)(图2-1)。

2 形态学观察大黄素促进ATRA诱导NB4和MR2细胞分化作用

各组药物作用第4天，对照组NB4细胞呈团状生长，细胞数量明显增多，1μmol/L ATRA组、10μmol/L大黄素与1μmol/LATRA联合用药组NB4细胞生长呈分散状，细胞数量减少，Wright-Giemsa染色可见较明显的细胞分化成熟现象，表现为染色质粗糙、浓缩，核偏于细胞一侧，并可见核凹陷、扭曲，核仁消失，胞浆量增多，核浆比例减小，细胞出现中性中幼粒、晚幼粒、杆状核和分叶核样形态改变。大黄素+ATRA组NB4细胞分化现象较ATRA单用组更为明显，大黄素单药组可见部分NB4细胞分化形态学改变。ATRA组MR2细胞仅见极少量分化细胞，大黄素与ATRA联合作用后，ATRA耐药的MR2细胞则出现部分较为明显的似中性晚幼粒，杆状核样细胞分化改变。大黄素单用组和对照组MR2细胞均未见细胞形态学改变(见图2-2)。

3 大黄素促进ATRA诱导NB4和MR2细胞分化作用NBT还原实验结果

各组药物作用第4天，1μmol/L ATRA组NB4细胞NBT阳性率为70.67％，10μmol/L大黄素单药组为17.33％，ATRA与大黄素联合应用后NBT阳性率最高，达到89.17％，与对照组比较，各组NBT阳性率均显著高于对照组(P＜0.01)。大黄素和ATRA联合应用组MR2细胞NBT阳性率为35.50％，分别与对照组及ATRA、大黄素单药组相比较，差异具有显著性(P＜0.05)，均高于对照组及单药组。(表2-1)

4 大黄素提高ATRA诱导NB4和MR2细胞表面分化抗原CD11b表达水平

各组药物作用于两种细胞第4天，流式细胞仪检测结果提示，与对照组相比，10μmol/L大黄素和1μmol/L ATRA单用组均能够明显促进NB4及部分MR2细胞表面分化抗原CD11b的表达，与大黄素、ATRA单独用药组比较，两者联合应用后，CD11b表达水平升高更加明显(P＜0.01)(图2-3，表2-1)。

表2-1  大黄素联合ATRA后NB4和MR2细胞CD11b和NBT检测结果

与对照组比较，^*P＜0.01。分别与ATRA和大黄素单药组比较，^△P＜0.05。

讨论

全反式维甲酸(ATRA)作为急性早幼粒白血病(APL)细胞强有效的诱导分化剂，通过诱导急性早幼粒白血病APL细胞分化为正常或接近正常细胞，达到抑制急性早幼粒白血病APL细胞生长作用，可使约90％的急性早幼粒白血病APL患者达到完全缓解，但快速发生的维甲酸耐药及维甲酸综合征成为全反式维甲酸(ATRA)治疗APL的一大缺憾，APL的复发与难治仍是目前临床面临的一大难题，克服ATRA耐药成为许多学者关注的热点。MR2细胞是通过ATRA诱导APL细胞NB4耐药而获得的，我们以ATRA敏感细胞株NB4和ATRA耐药细胞株MR2同时作为研究对象，探讨大黄素单药或与ATRA联合应用后对NB4、MR2细胞增殖、分化和凋亡的影响。

伊马替尼(imatinib，STI571)作为特异性酪氨酸激酶抑制剂，已成功应用于治疗BCR-ABL阳性的白血病。体外ATRA和STI571联合应用研究发现，STI571通过抑制C-Abl而非C-Kit的磷酸化，和ATRA发挥协同作用，下调PML-RARα和/或RARα蛋白表达水平，抑制NB4及其部分ATRA耐药株细胞增殖，诱导细胞分化，并且对其它急性髓系白血病细胞HL-60、U937同样有效。大黄素同样具有酪氨酸激酶活性抑制剂作用，该作用提示我们尝试大黄素联合ATRA进行NB4和MR2细胞诱导分化的研究。结果发现，对NB4和MR2两种细胞而言，低细胞毒性剂量大黄素(10μmol/L)和低剂量ATRA(0.2μmol/L)联合应用可以发挥优于0.2μmol/LATRA单药组的细胞增殖抑制效应，而且该效应与1μmol/LATRA组作用效果相当。当ATRA浓度提高到有效诱导NB4细胞分化浓度1μmol/L时，与10μmol/L大黄素联合应用后，ATRA耐药的MR2细胞增殖同时受到明显抑制，进一步的研究结果显示，该联合用药组NB4和MR2细胞白细胞表面分化抗原CD11b表达水平明显升高，NBT还原能力显著增强，与对照组和单药组比较，差异具有显著性，而CD11b被认为是白细胞分化成熟的直接证据，NBT还原实验则从功能和生物化学变化反应早幼粒细胞分化成熟。联合用药组NB4细胞通过形态学观察可见较单药组更明显的分化成熟阶段细胞，MR2细胞则出现部分似中性晚幼粒样、杆状核样细胞，MR2细胞大黄素和ATRA单药组未见或仅见极少量成熟分化细胞。综合以上，说明大黄素具有提高ATRA耐药的MR2细胞对ATRA的敏感性作用，促进ATRA诱导的急性早幼粒白血病(APL)细胞分化。早在1995年Zhang等就已经报道，大黄素能够诱导过表达HER-2/neu-乳腺癌细胞分化，该作用与其抑制p185^neu酪氨酸激酶活性有密切关系。Yi等报道低剂量(0.5-10μmol/L)大黄素和As₂O₃联合应用具有协同效应，可以提高活性氧释放水平，抑制NF-κB和AP-1活性增加Hela细胞、U937细胞对As₂O₃的敏感性。Harris等报道至少有59种蛋白参与了ATRA诱导APL细胞分化过程。因此，大黄素促进ATRA敏感和耐药APL细胞分化机制有待进一步深入探讨。

总之，通过对ATRA敏感和耐药的两种急性早幼粒白血病细胞株NB4和MR2的体外研究，我们认为，低浓度大黄素和ATRA联合应用，不仅能够增强ATRA对NB4细胞和MR2细胞的增殖抑制作用，而且能够诱导对ATRA耐药的MR2细胞发生分化，对其作用机理的深入研究对克服急性早幼粒白血病维甲酸耐药具有重要意义。

由上可知，本发明的大黄素与全反式维甲酸(ATRA)组合作为ATRA增敏剂在制备治疗在急性早幼粒白血病的药物中的应用。低细胞毒性剂量(＜IC10)大黄素作为急性早幼粒白血病全反式维甲酸(ATRA)耐药细胞MR2和急性早幼粒白血病ATRA敏感细胞NB4的增殖抑制剂的应用，以及作为急性早幼粒白血病全反式维甲酸(ATRA)耐药细胞MR2及其相应的敏感细胞NB4的增敏剂的应用。本发明的低细胞毒性剂量(＜IC20)大黄素与化疗药物阿霉素(ADR)或阿糖胞苷(Ara-C)组合在制备抗HL-60/ADR多药耐药细胞增殖的药物中的作用。

应用实例Ⅲ  大黄素在体内增强急性白血病裸鼠移植瘤细胞对Ara-C的敏感性

材料和方法

1 细胞培养和药物来源

高致瘤急性髓系白血病细胞(HL-60)引自本所细胞库，培养体系为含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，置37℃、5％CO₂的饱和湿度培养箱培养。大黄素来源同前，阿糖胞苷(Ara-C)为浙江海正药业股份有限公司产品，环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有限公司产品。

2 动物来源及接种

4-6周龄BALB/C裸鼠，平均体重16g左右，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK(沪)2007-0005。饲养环境：福建医科大学实验动物中心，许可证号为SYXK(闽)2008-0001，SPF级无菌层流柜，所用垫木、饮水、饲料以及其它动物实验接触的物品均经高压灭菌处理或紫外线消毒。进入SPF级无菌层流柜后的所有裸鼠于第三天开始，每只腹腔注射100mg/kg(10mg/ml环磷酰胺0.2ml)，连续两天，隔天后，收集处于对数生长期高致瘤HL-60细胞，接种于裸鼠右前肢背侧皮下，每只细胞接种数量为1.5×10⁷，约2周接种部位可以触及移植瘤生长。

3 动物分组及给药方案

随机挑选荷瘤鼠30只，分成5组，每组6只，雌雄各半，将荷瘤鼠分为：阴性(溶媒)对照组，2mg/kg小剂量Ara-c组，20mg/kg大黄素组，40mg/kg大黄素组，以及2mg/kg Ara-c和20mg/kg大黄素联合用药组，每日腹腔注射给药1次，连续14天。

4 大黄素对急性髓系白血病裸鼠异种移植瘤生长的影响

4.1 肿瘤体积测定

每周测量肿瘤大小，按照公式V＝L×W²×0.5计算肿瘤体积相对大小，公式中V表示肿瘤体积(cm³)，L、W分别代表肿瘤长径和短径(cm)。绘制各组瘤体生长曲线。

4.2 血常规检测

给药结束后摘取眼球采集血液，抗凝管中混匀后，在HEMAVET 950型动物血液分析仪上进行血常规项目WBC、RBC、Hb、Plt检测。

4.3 瘤块重量测定

给药结束后断颈处死裸鼠，立即剥离瘤块，称取重量，计算各组平均瘤块重量及抑瘤率(IR)，IR＝(1-治疗组瘤重/对照组瘤重)。

4.4 瘤组织透射电镜检查

迅速剪取尚未完全离体的新鲜瘤块，体积大小约为1mm³，4℃预冷的3％戊二醛-1.5％多聚甲醛前固定，1％锇酸-1.5％亚铁氰化钾后固定，脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，日立Hu-12A型透射电镜下观察瘤组织超微结构。

4.5 瘤组织和重要脏器病理检查

裸鼠心、肝、脾、肺、肾、肠、瘤块取材，10％甲醛固定后，常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下阅片并拍照。

5 荷瘤鼠生存期观察

实验分组及治疗方案同上。给药开始后逐日观察不同治疗组荷瘤鼠生存状况，包括饮食、活动、排泄、精神状态、肿瘤体积变化等。记录动物从给药开始后至死亡时间，计算各组生存时间，绘制生存曲线，比较各组给药后生存率的改变，观察截止至用药起始后第70天。

6 统计学处理

采用SPSS14.0软件包进行统计学处理。样本均数以表示。实验组和对照组、实验组和实验组之间比较采用方差分析(ANOVA)和t检验。应用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，不同组间生存时间的比较采用对数秩检验(Log-rank test)。

结果

1 大黄素对HL-60细胞裸鼠异种移植瘤生长的影响

1.1 大黄素对HL-60细胞裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用

给药前各组荷瘤鼠平均肿瘤体积与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。给药过程中，阴性对照组瘤块进行性增大，各给药组肿瘤生长相对缓慢，腹腔给药后第7天、第14天测量各组肿瘤体积，各给药组肿瘤体积与对照组比较均具有明显差异(P＜0.05)。其中20mg/kg大黄素与Ara-C联合用药组在给药后第7天平均肿瘤体积与小剂量Ara-C单药组比较尚无明显差别(P＞0.05)，给药后第14天则差异具有显著性(P＜0.05)，各给药组瘤体积从小到大顺序依次为：联合用药组＜2mg/kg Ara-C组＜40mg/kg大黄素组＜20mg/kg大黄素组＜阴性对照组，联合用药组肿瘤生长最慢，肿瘤体积最小(表3-1，图3-1)。

表3-1  大黄素、Ara-C和联合用药组给药14天HL-60细胞移植瘤体积变化

与对照组比较，^#P＞0.05，^*P＜0.05。与Ara-C单药组比较，^△P＞0.05，^△△P＜0.05。

1.2 给药14天后各组裸鼠血常规检测结果

表3-2可见，30只HL-60细胞荷瘤鼠腹腔给药14天后，阴性对照组白细胞总数高于小鼠血常规正常值上限，小剂量Ara-C给药组白细胞总数低于正常值下限，其余各给药组荷瘤鼠各项血常规指标检测结果均在正常值范围内。

表3-2  给药14天各组荷瘤鼠血常规检测结果

1.3 给药14天后各组裸鼠离体瘤块重量及抑瘤率

给药14天后解剖裸鼠，可见瘤块有完整的包膜，周围组织脏器肉眼未见肿瘤浸润转移灶，各药物组瘤块重量与对照组比较，差异均具有显著性(P＜0.01)，20mg/kg大黄素和Ara-C联合用药组瘤块重量低于Ara-C单药组，在各治疗组中瘤块平均重量最轻，抑瘤率最高，抑瘤作用强弱顺序依次为：大黄素和Ara-C联合用药组＞Ara-C组＞40mg/kg大黄素组＞20mg/kg大黄素组＞阴性对照组(图3-2，表3-3)。

表3-3  给药14天后各组离体瘤块重量和抑瘤率

与对照组比较，^*P＜0.01。与Ara-C单药组比较，^△P＜0.05。

2 给药14天后各组裸鼠瘤块透射电镜检测结果

各组给药14天后，瘤组织在透射电镜观察下可见以下超微结构改变：(1)阴性对照组：瘤细胞呈圆形或椭圆形，分布密集，细胞结构完整，核染色质丰富，可见大量的线粒体、粗面内质网、糖原颗粒等。(2)20mg/kg大黄素组：肿瘤细胞坏死、凋亡均较常见。前者主要表现为细胞结构不完整，细胞器肿胀，空泡化，后者主要表现为胞体变小，核染色质边集，部分聚集于核膜下呈半月形，或凝集成团块状，线粒体、细胞膜等仍保持较完整。(3)40mg/kg大黄素组：肿瘤细胞凋亡现象较常见，可见少部分坏死细胞。(4)2mg/kg Ara-C组：核膜不完整，细胞器肿胀的坏死肿瘤细胞较常见。(5)2mh/kg Ara-C和20mg/kg大黄素联合应用组：正常瘤细胞少见，凋亡细胞多见，可见部分变性、坏死肿瘤细胞碎片，见图3-3。

3 给药14天后各组裸鼠病理组织学检查结果

3.1 瘤块病理组织学检查结果

腹腔给药14后如图3-4所示，对照组中瘤细胞排列紧密，瘤细胞圆形或椭圆形，核大浆少，弥漫性浸润生长，而大黄素组、Ara-C组及两者联合用药组瘤组织中瘤细胞数目逐渐减少，排列疏松，细胞体积变小，核固缩，或仅剩裸核，细胞间隙可见不规则出血，呈片状嗜伊红结构，40mg/kg大黄素组可见局灶性细胞坏死区域，联合用药组瘤组织变性坏死后结缔组织增生明显，成纤维细胞较常见。

3.2 心、肝、脾、肺、肾、肠组织病理学检查结果

在实验剂量范围内，各药物组经腹腔注射荷瘤鼠14天后，从图3-5至图3-9可见，每天40mg/kg大黄素腹腔给药组的个别裸鼠肠组织间质有轻微充血，少量淋巴细胞浸润，肝细胞轻度水样变性，其余各给药组荷瘤鼠心、肝、脾、肺、肾、肠重要脏器均未见明显病理改变。

5 荷瘤鼠生存期观察结果

荷瘤鼠给药过程未见明显异常表现，40mg/kg大黄素给药组腹腔注射后可观察到荷瘤鼠有轻微弓背现象，10分钟左右恢复正常体位，其余各组活动状况、步履姿势、精神状态、饮食、排泄、皮毛等均正常。腹腔给药两周结束后，阴性对照组荷瘤鼠瘤体增长迅速，每周测量的瘤块体积均显著高于其它各治疗组(P＜0.001)。Ara-C组给药第4周以后瘤块生长速度加快，第4周和第5周肿瘤体积分别为7.76±2.45cm³和11.36±5.51cm³，与20mg/kg大黄素给药组第4周瘤体积8.43±3.05cm³和第5周11.18±4.21cm³接近，两组之间肿瘤体积差异不具有显著性(P＞0.05)，联合用药组和40mg/kg大黄素组在两周给药结束后肿瘤生长速度相对缓慢，第5周肿瘤平均体积分别为7.47±2.69cm³和8.12±2.19cm³，大黄素与Ara-C联合用药组抑瘤效果最佳。

表3-4，图3-10至图3-13可见，给药后第5周各组荷瘤鼠全部存活，生存率为100.0％，给药后第10周即第70天终止观察，阴性对照组、20mg/kg大黄素组、Ara-C组荷瘤鼠死亡数均超过期初每组荷瘤鼠观察总数的一半(3/6)，生存率分别为16.7％(1/6)、33.3％(2/6)和33.3％(2/6)。阴性对照组中位生存时间为41.0天(36.2～45.8天)，位居各组统计数据中最低值。其次为20mg/kg大黄素组和Ara-C组，中位生存时间分别为49.0天(34.6～63.4)天和50.0天(40.4～59.6)天。40mg/kg大黄素组和联合用药组第70天分别有4只和5只荷瘤鼠存活，存活数均超过期初每组荷瘤鼠观察总数的一半，生存率分别为66.7％和83.3％。图3-11所示，以上5组之间经Kaplan-Meier法Log-rank检验，各组之间生存时间具有显著性差异(x²＝12.987，P＝0.011)，各组随着观察时间的延长，生存率逐渐下降，各组累积生存率高低顺序依次为：联合用药组＞40mg/kg大黄素组＞Ara-C组＞20mg/kg大黄素组＞阴性对照组，联合用药组荷瘤鼠累积生存率位居各组统计数据中最高值，阴性对照组位居最低值。

表3-4  各给药组荷瘤鼠生存时间和生存率

#如果产生截尾值，以观察到的最长存活时间为准，中位生存时间后跟[  ]内的数值表示95％可信区间。

讨论

大黄素为天然植物中提取的蒽醌类单体化合物，药性温和，2001年美国NationalToxicology Program(NTP)已经在大小鼠体内对大黄素进行了详尽的毒理学研究，随后又有在孕期鼠体内进行大黄素给药的研究报道，结果均证实该药具有较高安全性。本课题在前期体外细胞株水平研究得到确切疗效基础上，以高致瘤急性髓系白血病细胞HL-60建立白血病裸鼠异种移植瘤模型，进行了大黄素以及大黄素联合小剂量(2mg/kg)Ara-C体内抗白血病作用的研究。大黄素给药方式和给药剂量范围参照了关于大黄素在小鼠体内急性毒性实验结果以及大黄素治疗其它肿瘤的国内外相关文献报道，并在预实验证实有效基础上开始实施的。Cancer and Leukemia Group B(CALGB)在20多年前首次提出由柔红霉素(DNR)和Ara-C组成的DA方案用于AML诱导缓解治疗，一直沿用至今，为现今较为肯定的AML经典标准诱导缓解方案，但仍有近20％左右AML患者给予DA方案治疗不能达到完全缓解。对DA方案进行改进包括了用其它蒽环类药物取代DNR，以及对Ara-C剂量的调整。本课题通过体外研究证实，大黄素对急性白血病细胞以及急性白血病细胞耐药细胞均有抑制增殖作用，并且大黄素和小剂量Ara-C联合应用具有协同抗白血病细胞增殖作用，因此在我们的课题设计中应用了同样具有蒽环结构的传统中药活性成分大黄素替代DNR，并联合小剂量Ara-C进行荷瘤鼠体内抗急性白血病细胞作用的研究。

传统中医认为，大黄具有泻下作用，其主要成分蒽苷在体内被还原为蒽酮发挥致泻作用。大黄素是从大黄等中药中提纯的蒽醌类衍生物之一，其泻下作用相对较弱，大黄素保肝、利胆、强心、降压、利尿、抗菌、消炎、抗肿瘤等作用近年来相继被国内外学者研究证实。M.D.Anderson癌症中心研究人员以前列腺癌细胞PC3-AR移植瘤小鼠和雄性C3(1)/SV40转基因鼠作为动物模型，腹腔注射与我们设定的高剂量组相同剂量(40mg/kg)大黄素，结果荷瘤鼠肿瘤体积明显缩小，大黄素治疗组C3(1)/SV40转基因小鼠生存时间明显长于DMSO对照组^[5]。本课题体内研究近期(治疗14天)疗效显示，各给药组均能够有效抑制AML裸鼠异种移植瘤生长，按照肿瘤体积大小、瘤体重量和抑瘤率判断疗效顺序为：2mg/kg Ara-C联合20mg/kg大黄素组＞2mg/kg Ara-C组＞40mg/kg大黄素组＞20mg/kg大黄素组＞对照组，联合用药组抑瘤率高达90.88％，低剂量大黄素组抑瘤率为32.18％，按照我国新药研究抗肿瘤药物药效学评价标准，对白血病抑瘤率大于30％为有效，可以判断腹腔注射以上各组药物治疗AML裸鼠移植瘤均有较明显疗效。同时给药期间观察裸鼠一般状况，各治疗组药物未发现有明显毒副作用，未见荷瘤鼠饮食、活动、排泄、精神等异常，裸鼠心、肝、脾、肺、肾、肠等重要脏器病理检查，未发现各给药组对以上重要脏器有明显的损害，并且未见瘤细胞向周围组织浸润，裸鼠血常规检测结果，除阴性对照组白细胞总数偏高、Ara-C组略低以外，其余各组白细胞、红细胞总数，血红蛋白和血小板检测结果均较正常，说明在我们设定的实验剂量范围内各治疗组对AML移植瘤疗效显著，且对裸鼠毒副作用较小。

瘤组织病理检查和电镜超微结构观察显示，与阴性对照组、20mg/kg大黄素和Ara-C单药组比较，联合用药组和40mg/kg大黄素组结构完整瘤细胞数量更加稀少，凋亡细胞数量较多，同时伴有细胞坏死改变，成纤维细胞增生。Western Blot检测发现，肿瘤细胞最重要的抗凋亡基因Bcl-2在各治疗组中均表达下调，其中40mg/kg大黄素组和联合用药组降低最明显。提示细胞凋亡途径在大黄素以及大黄素联合Ara-C体内治疗髓系白血病裸鼠移植瘤过程中发挥重要作用。

生存期分析也是评价抗肿瘤药物疗效最可靠的指标之一，大黄素不仅在体内能够抑制AML裸鼠异种移植瘤生长，而且能够提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高疗效，延长荷瘤鼠生存期。我们通过分析生存期观察结果得到以下几点启示：(1)40mg/kg大黄素治疗组裸鼠生存期延长，AML荷瘤鼠生存率明显提高，疗效优于20mg/kg大黄素组；(2)20mg/kg大黄素和2mg/kg Ara-C联合用药组疗效优于各自单药组，与对照组比较，延长荷瘤鼠生存期近1.5倍，在进行生存期观察的所有研究组中，累积生存率最高；(3)2mg/kg小剂量Ara-C组2周近期疗效优于40mg/kg大黄素组，但停药后瘤体生长迅速，第4、5周瘤体积与20mg/kg低剂量大黄素组差异无显著性，联合用药组瘤体生长则一直保持相对缓慢状态，提示小剂量Ara-C和低剂量大黄素联合应用，可以发挥中西药结合，相辅相成优势，既能够降低各自使用剂量，又可以达到最好的抗肿瘤效果。

综上所述，我们通过体内研究证明，大黄素具有明显抑制高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤作用，并且有效诱导HL-60移植瘤细胞凋亡，大黄素与Ara-C联合具有协同抗HL-60细胞裸鼠异种移植瘤作用，显著提高荷瘤鼠生存率，明显延长荷瘤鼠生存期。本发明的大黄素与阿糖胞苷(Ara-C)组合在制备治疗高致瘤急性白血病移植瘤细胞的药物中的应用。

结论

1.大黄素与化疗药物联合应用，能够提高急性白血病HL-60/ADR耐药细胞对化疗药物的敏感性，发挥协同抑制HL-60/ADR耐药细胞增殖效应，部分逆转HL-60/ADR细胞多药耐药。该效应与下调多药耐药相关基因表达、增加细胞内化疗药物蓄积水平以及促进细胞凋亡作用有关。

2.大黄素和ATRA联合应用，能够增强ATRA对急性早幼粒白血病NB4细胞和ATRA耐药急性早幼粒白血病MR2细胞的增殖抑制作用，而且能够促进ATRA对NB4和MR2细胞的诱导分化作用。

3.大黄素在体内与Ara-C联合应用，可以提高急性白血病HL-60裸鼠异种移植瘤细胞对Ara-C的敏感性，有效抑制移植瘤细胞生长，诱导细胞凋亡，提高荷瘤鼠生存率，进一步延长荷瘤鼠生存期。

总之，通过我们从体外及体内、单药及联合用药多角度、全方位深入的研究，证实大黄素和传统抗白血病化疗药物联合应用，既能够降低化疗药物使用剂量，减少毒副反应，部分逆转白血病多药耐药，又能够发挥协同抗白血病细胞作用，取得最佳的治疗效果，提示大黄素是一种新型的白血病化疗药物增敏剂和多药耐药逆转剂，对临床急性白血病的治疗具有潜在的应用价值，并且其作用机制具有多靶点、多环节、多效应等特点，本研究结果将为大黄素将来应用于临床研究提供充分的理论和实验依据。

Claims (2)

1.一种大黄素与全反式维甲酸(ATRA)组合在制备治疗在急性早幼粒白血病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的大黄素采用细胞抑制率小于10％的低细胞毒性剂量(＜IC10)大黄素。

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