ES2859398T3 - Métodos para diseño de panel en citometría de flujo - Google Patents
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Abstract
Un método para diseñar un panel de sonda para un citómetro de flujo, el método comprende: determinar un factor de distorsión que cuantifica el efecto de desbordamiento provocado por emisión de fluorescencia de una primera etiqueta, pretendida para ser medida en un primer canal, a un segundo canal; caracterizado por aportar una señal esperada máxima de una primera combinación sonda-etiqueta que incluye la primera etiqueta y una primera sonda; calcular un aumento en el límite de detección en el segundo canal, en donde calcular un aumento en el límite de detección comprende multiplicar el factor de distorsión por la señal esperada máxima de la primera combinación sonda-etiqueta; y seleccionar una combinación sonda-etiqueta para incluir en el panel de sonda sobre la base del aumento calculado en el límite de detección.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para diseño de panel en citometría de flujo
REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Realizaciones de la presente invención están relacionadas generalmente con métodos para evaluar células de una muestra biológica, y en particular con técnicas para seleccionar combinaciones de conjugado anticuerpo-tinte para usar en citometría de flujo. Realizaciones adicionales están relacionadas generalmente con métodos para analizar la positividad en citometría de flujo multicolor.
La inmunofenotipificación de superficie celular usando citometría de flujo fluorescente se ha convertido en un proceso relativamente rutinario para diferenciar y contar células de interés en una muestra celular que contiene muchos tipos diferentes de células. Típicamente, se usan sondas de superficie celular, p. ej., anticuerpos monoclonales (MAB) etiquetados con fluorocromo u otros ligandos adecuadamente etiquetados, específicos para antígenos en la superficie exterior de las células de interés, para etiquetar selectivamente o "tintar" tales células para una subsiguiente detección. El citómetro de flujo funciona para detectar las células tintadas al irradiar células individuales en la muestra, de una en una, con radiación especialmente adaptada para excitar las etiquetas de fluorocromo. Cuando son irradiadas, las etiquetas fluorescen y sus células asociadas dispersan la radiación incidente en un patrón determinado por las características físicas y ópticas de la célula irradiada. Fotodetectores adecuados dentro del citómetro de flujo detectan la radiación dispersada y fluorescencia, y sus respectivas señales de salida se usan para diferenciar los tipos de células diferentes sobre la base de sus respectivas firmas de dispersión de luz y fluorescencia.
La inmunofenotipificación por citometría de flujo típicamente implica la selección de un conjunto de sondas o reactivos fisiológicamente apropiados para el procedimiento deseado de evaluación o monitorización. De manera relacionada, debido a que ciertas condiciones de enfermedad se pueden caracterizar por la expresión de diversos antígenos en la superficie de células o dentro de las células del paciente, se pueden seleccionar paneles de reactivos de sonda de anticuerpos que corresponden a tales perfiles de antígenos. Por ejemplo, el Panel de Reactivo de 5 Colores Solastra™ es un panel de cócteles de anticuerpos conjugados para usar en caracterización de neoplasia hematolinfoide mediante citometría de flujo. El panel se puede usar para identificación y enumerar moléculas relevantes de superficie de leucocito, y como ayuda en la diagnosis diferencial de pacientes con ciertos resultados anormales de hematología y/o presencia de blastos en el torrente sanguíneo, médula ósea, y/o tejidos linfoides. Los Reactivos de 5 colores Solastra™ se componen de anticuerpos dirigidos a antígenos de linaje mielomonocíticos, B y T. Tales paneles se pueden usar en análisis citométrico de flujo para aplicaciones de hematopatología.
La medición de muestras discurre a través de un dispositivo de citometría de flujo produce una firma fotónica característica de luz dispersada, luz fluorescida, o una combinación de las mismas. Al analizar la firma, es posible inferir características físicas y químicas de la partícula. A menudo la expresión de proteína, un rasgo biológico de una partícula ejemplar, se somete a interrogación. La firma de partículas de una muestra de sangre se puede exponer en un trazado de puntos, y se puede usar catalogación por compuerta para interpretar esas firmas. Generalmente, se usa catalogación por compuerta para clasificar una firma ya sea como positiva o negativa. Por ejemplo, se puede usar catalogación por compuerta para determinar si una partícula es una célula sanguínea o un pedazo de restos, o si la célula sanguínea contiene un marcador de enfermedad. Por tanto, la catalogación por compuerta es importante para aplicaciones de diagnóstico y hematología clínica. Sin embargo, puede ser difícil determinar si una partícula pertenece a una población de positivos o de negativos, tal como cuando las firmas positivas y negativas tienen una apariencia similar. Para ayudar a determinar si una partícula se debe clasificar como positiva o negativa se ha propuesto una variedad de técnicas de control de catalogación por compuerta o especificidad, tales como controles de isotipos, modelos que aplican algoritmos de análisis de grupos tales como análisis de componente principal, y fluorescencia menos uno (FMO, del inglés fluorescence minus one).
El documento WO 2012/178166 A1 describe un método para procesar rastro forense o tocar la evidencia de ADN a fin de etiquetar células diferencialmente, y luego aislarlas en fracciones distintas que se pueden procesar usando métodos estándar de caracterización de ADN aguas abajo ADN. Una mezcla de células y/o componentes celulares en suspensión fluida se etiquetan primero con uno o más marcadores que se unen específicamente a secuencias genéticas de interés, y que se pueden detectar ópticamente.
El documento US 2008/194508 A1 describe métodos y kits para determinar los recuentos absolutos de células por unidad de volumen de una muestra.
El documento US 2004/119974 A1 describe instrumentos para analizar una multiplicidad de tintes fluorescentes usando una multiplicidad de fotodetectores amplificadores, métodos para usar los instrumentos, métodos para establecer los parámetros de instrumento, y métodos para restablecer los parámetros de instrumento tras un cambio en la amplificación de fotodetector.
El documento US 2006/269970 A1 describe métodos para identificar diferencialmente células en un instrumento que emplea composiciones que contienen una combinación de anticuerpos y tintes fluorescentes seleccionados que tienen diferentes patrones de distribución celular y especificidades, así como anticuerpos y tintes fluorescentes caracterizados por solapamiento de espectros de emisión que forman patrones espectrales no compensables.
El documento US 2011/312511 A1 está relacionado con detección por citometría de flujo de una célula cancerígena o elemento de célula cancerígena al unir dos o más agentes a marcadores extracelulares, en donde al menos un agente es específico de cáncer.
Aunque técnicas actualmente conocidas de selección de panel de anticuerpo proporcionan muchos beneficios a aquellos que realizan procedimientos de evaluación y monitorización celular, todavía se desean mejoras adicionales. Además, se pueden mejorar las técnicas de control por catalogación por compuerta para evaluar muestras. Así, según un aspecto, el problema está relacionado con diseñar un panel de sonda que minimice los efectos de un aumento en el límite de detección provocado por desbordamiento de fluorescencia y realizaciones de la presente invención proporcionan soluciones a al menos algunas de estas necesidades destacadas.
BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Realizaciones de la presente invención abarcan métodos para seleccionar y simular paneles conjugados anticuerpo-tinte para usar en citometría de flujo, y otras técnicas relacionadas de evaluación y monitorización celulares. A menudo, tales paneles se pueden usar o se diseñan para evaluar células de una muestra biológica. Tales células se pueden obtener de una persona individual, de un cultivo celular, de una congregación de donantes humanos o no humanos, o algo semejante. Según algunas realizaciones, las técnicas descritas en esta memoria se pueden usar para evaluar cualquier material que incluya partículas (p. ej. células biológicas) que están presentes en una suspensión y que tienen estructuras en su superficie o su interior que pueden ser reconocidas por sondas etiquetadas con fluorocromo biológico específico que puede unirse covalentemente a estas estructuras, tales como anticuerpos, toxinas, ligandos receptores, o derivados de los mismos o compuestos similares. Como se trata en otra parte en esta memoria, sondas ejemplares, que pueden incluir anticuerpos monoclonales (MAB, del inglés monoclonal antibodies) etiquetados con fluorocromo u otros ligandos etiquetados adecuadamente, pueden ser específicos para antígenos en la superficie exterior o en el interior de las células de interés. Aunque se pueden usar diferentes procedimientos de preparación de muestras dependiendo de si el análisis implica antígenos externos o internos, las técnicas de adquisición de datos tratadas aquí se aplican igualmente a cualquier tipo de análisis. Fotodetectores adecuados dentro del citómetro de flujo detectan la radiación dispersada y fluorescencia, y sus respectivas señales de salida se usan para diferenciar los tipos de células diferentes (o subtipos de cierto tipo de célula o diferentes estados funcionales entre cierto tipo de células) sobre la base de sus respectivas firmas de dispersión de luz y fluorescencia. Estas firmas de fluorescencia pueden ser resueltas computacionalmente por un procedimiento referido como compensación de fluorescencia, entregando así información cuantitativa sobre la presencia de cada único antígeno interrogado en la superficie o dentro de la célula/partícula.
El análisis inmunofenotípico multicolor usando citometría de flujo típicamente implica usar paneles o cócteles de conjugados anticuerpo-tinte. Los paneles se pueden configurar de modo que sondas individuales, que tienen respectivos tintes individuales, corresponden a canales individuales de detección de color de un dispositivo de citometría de flujo. Como se trata en esta memoria, la selección de paneles de sonda puede ser automatizada, optimizando así el proceso de análisis por citometría de flujo multicolor. El uso de tales paneles de sonda en citometría de flujo puede permitir la adquisición eficiente de datos de calidad excelente usando múltiples canales de detección. Por tanto, se puede reducir el tiempo de parada y se puede maximizar la productividad del laboratorio. De manera relacionada, realizaciones de la presente invención proporcionan una mejora de sensibilidad para la detección de antígenos priorizados, y una facilitación mejorada de análisis de datos.
Dispositivos ejemplares de citometría de flujo pueden incluir diversas configuraciones de láser (p. ej. múltiples láseres de estado sólido) proporcionan espectros de excitación correspondientes a rojo, azul, violeta, amarillo, y similares. Se pueden usar filtros ópticos intercambiables para facilitar la detección de una variedad de tintes y longitudes de onda. Se pueden usar sistemas ejemplares para analizar múltiples marcadores fluorescentes simultáneamente. Por ejemplo, sistemas que tienen seis detectores de fluorescencia pueden proporcionar adquisición simultánea de hasta seis señales de fluorescencia. Se pueden añadir detectores de fluorescencia y/o láseres adicionales a un sistema, que permite lectura simultánea de hasta diez colores o más. Realizaciones de la presente invención proporcionan técnicas de exposición gráfica para proporcionar a un usuario trazados, cuadros, y otros rasgos visuales que pueden facilitar el análisis de datos complejos de citometría de flujo.
La presente invención se refiere a un método para diseñar un panel de sonda para un citómetro de flujo según la reivindicación 1. En las reivindicaciones dependientes se describen opciones ventajosas. Métodos ejemplares que no forman parte de la presente invención incluyen aportar una configuración de hardware de citómetro de flujo, aportar un listado que comprende una pluralidad de sondas, donde sondas individuales del listado se asocian con respectivos límites de detección específicos de canal individual, aportar un patrón de coexpresión antigénico, y determinar el panel de sonda sobre la base de la configuración de hardware de citómetro de flujo, los límites de detección específicos de canal individual, y el patrón de coexpresión antigénico. El panel de sonda puede incluir un subconjunto de sondas del listado.
Ejemplos adicionales que no forman parte de la presente invención abarcan sistemas y métodos para valorar la positividad en citometría de flujo multicolor. Se pueden usar técnicas ejemplares de control de especificidad o catalogación por compuerta para evaluar una firma de partícula individual, por ejemplo para determinar si una célula sanguínea es positiva o negativa para cierta expresión de proteína, tal como un marcador de enfermedad. En algunos casos, estas técnicas de control se pueden usar para posicionar una compuerta o región gráfica respecto a datos adquiridos, para clasificar las células de las que se obtienen los datos. Se pueden usar técnicas de control ejemplares en procedimientos multicolor tras la compensación. En algunos casos, los métodos descritos en esta memoria permiten un nivel de estandarización que no está presente en técnicas usadas actualmente. Además, las técnicas de control descritas en esta memoria son eficientes en el tiempo, económicas, eficaces para patrones de expresión heterogéneos, y permiten la cuantificación de positivos.
Los rasgos descritos anteriormente y muchos otros y las ventajas presentes de realizaciones de la presente invención se harán más evidentes y se entenderán aún más por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considere conjuntamente con los dibujos adjuntos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Aspectos de métodos según realizaciones de la presente divulgación se describen mediante las ilustraciones y figuras presentadas a continuación.
La figura 1 representa aspectos de métodos de citometría de flujo según algunas realizaciones.
La figura 1A representa una ilustración de hardware ejemplar de un dispositivo de citometría de flujo, que tiene una configuración en bloque de tres láseres y diez filtros de color, según algunos ejemplos que no forman parte de la presente invención.
La figura 1B representa aspectos de una técnica de selección de panel de sonda, según algunas realizaciones. La figura 1C representa aspectos de la expresión de conjugados anticuerpo-tinte, que pueden referirse a un conjunto de conjugados anticuerpo-tinte dentro de una base de datos que contiene información en relación con sondas de citometría de flujo, según algunas realizaciones.
La figura 1D representa aspectos de consultas de base de datos para anticuerpos específicos de antígeno seleccionados por un usuario para devolver información asociada con las respectivas sondas, según algunas realizaciones.
Las figuras 1E-1M representan aspectos de una técnica de evaluación de panel, según realizaciones de la presente invención, según algunas realizaciones.
Las figuras 1N-1O representan ejemplos para asociaciones y cálculos para tres conjugados, para asociar CD dada con un tinte dado, según algunas realizaciones.
Las figuras 1P-1U representan aún más aspectos de una técnica de evaluación de panel, según realizaciones de la presente invención, según algunas realizaciones.
Las figuras 1V-1W representan aspectos de exposiciones para resultados para paneles ejemplares de sonda de diez colores, según algunas realizaciones.
La figura 2 representa aspectos de un procedimiento de selección de operario, según algunas realizaciones. Las figuras 2A-2C representan rasgos de selección de operación para objetivo de fenotipo, exclusión de fenotipo, y esquemas de progenitor/descendiente, respectivamente, según algunas realizaciones.
La figura 2D representa rasgos de selección de operación para parámetros de densidad de antígeno, según algunas realizaciones.
La figura 3 representa aspectos de una técnica de selección de panel de sonda, según algunas realizaciones. La figura 4 representa ciertos aspectos de señalización de isotipo y sensibilidad de resolución, según algunas realizaciones.
La figura 5 representa una comparación entre coeficiente de varianza y desviación típica para acontecimientos de expresión, según algunas realizaciones.
Las figuras 6A-6B representan aspectos de una distribución bimodal para determinar acontecimientos de señal negativa, según algunas realizaciones.
La figura 7 representa aspectos de una distribución ampliada de acontecimientos de señal, según algunas realizaciones.
La figura 8 representa aspectos de resultados de datos reales a partir de un protocolo de tinción usando un único conjugado anticuerpo-tinte, según algunas realizaciones.
La figura 9 representa aspectos de límites de detección que pueden ser independientes de factores de compensación, o ajustarse para estos, según algunas realizaciones.
La figura 10 representa aspectos de una matriz ejemplar de distorsión de patrón de desbordamiento ciertos tintes, según algunas realizaciones.
La figura 11 representa aspectos de una matriz de coexpresión, según algunas realizaciones.
Las figuras 12A-12I representan esquemas de patrones de tinción estimada, según algunas realizaciones. La figura 13 representa aspectos de evaluación de panel de sonda que incluye la categorización de patrones de expresión, según algunas realizaciones.
La figura 14 representa aspectos de evaluación de panel de sonda que incluye contribución relativa de fluoroforo, según algunas realizaciones.
La figura 15 representa aspectos de evaluación de panel de sonda que incluye brillo relativo de expresión de los
tintes, según algunas realizaciones.
La figura 16A representa un esquema ejemplar para un sistema de panel de sonda que no forma parte de la presente invención.
Las figuras 16B-16C representan aspectos de un módulo de aporte de usuario para un panel de sonda, según algunas realizaciones.
Las figuras 16D-16E representan aspectos de módulos de gráficos de simulador para relaciones de expresión en forma tabular, según algunas realizaciones.
Las figuras 16F-16G representan aspectos de módulos de gráficos de simulador para perfiles de resultados pronosticados, según algunas realizaciones.
Las figuras 16H-16J representan aspectos de un módulo numérico de simulador para cálculos de distorsión, según algunas realizaciones.
Las figuras 16K-16L representan aspectos de módulos de patrón de desbordamiento, según algunas realizaciones.
Las figuras 16M-16O representan aspectos de un módulo de base de datos de anticuerpos, según algunas realizaciones.
La figura 17 representa aspectos de un planteamiento numérico para modelar patrones de desbordamiento que incluyen gráficos de radar de detección para análisis multivariante, según algunas realizaciones.
Las figuras 18A-18B representan aún más aspectos de un planteamiento numérico para modelar patrones de desbordamiento que incluyen gráficos de radar de detección para análisis multivariante, según algunas realizaciones.
Las figuras 19A-19B representan aún más aspectos de un planteamiento numérico para modelar patrones de desbordamiento que incluyen gráficos de radar de detección para análisis multivariante, según algunas realizaciones.
Las figuras 20A-20G representan aspectos de una interfaz informatizada para diseñar y simular un panel de sonda, según algunas realizaciones.
Las figuras 21A-21B representan aún más aspectos de una interfaz informatizada para diseñar y simular un panel de sonda, según algunas realizaciones.
Las figuras 22A-22B representan aspectos, según algunas realizaciones.
Las figuras 23-26 representan aspectos de una interfaz informatizada para diseñar y simular un panel de sonda, según algunas realizaciones.
La figura 27 representa una distorsión de modelado gráfico tridimensional en un canal PMT provocada por la intensidad de señal de dos tintes a los que no se dirige el PMT para detección, según realizaciones.
La figura 28 representa una tabla de distorsión ejemplar, según algunas realizaciones.
Las figuras 29-29E representan aspectos de datos reales, que trazan datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo que aplica catalogación por compuerta a los datos donde es aplicable, según algunas realizaciones.
Las figuras 30-30A representan aspectos de datos reales, que trazan datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo sin aplicar catalogación por compuerta a los datos, según algunas realizaciones.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La citometría de flujo a menudo implica etiquetar una muestra de partículas con tintes de fluorocromo, y luego evaluar propiedades de partículas individuales de la muestra usando diversos detectores de fluorescencia específicos para diversas longitudes de onda. De esta manera, es posible obtener datos cuantitativos y cualitativos acerca de la muestra de partículas. Por ejemplo, diferentes receptores de superficie celular en una célula sanguínea se pueden etiquetar con diferentes tintes de fluorocromo, y un citómetro de flujo puede usar canales de fluorescencia separados para detectar la luz resultante emitida. En realizaciones ejemplares, se pueden usar múltiples longitudes de onda de luz de excitación conjuntamente con múltiples tintes de fluorocromo y múltiples detectores de fluorescencia, para obtener simultáneamente varios parámetros de una muestra. En realizaciones particulares, se pueden cuantificar factores de distorsión resultantes del uso conjunto de múltiples tintes de fluorocromo y múltiples detectores de fluorescencia.
El término "acontecimiento" como se emplea en esta memoria se puede referir a una partícula conforme pasa a través un haz de luz, o los datos o firma que representan la partícula. Un acontecimiento puede ser evaluado usando múltiples detectores, y cada detector puede proporcionar un parámetro respectivo de intensidad o señal. De manera relacionada, cada detector se puede asociar con un respectivo canal del citómetro de flujo. Por ejemplo, a una medición de un detector individual se le puede hacer referencia como parámetro (p. ej. dispersión hacia delante, dispersión lateral, o fluorescencia medida) y a los datos adquiridos en cada parámetro para una partícula se le puede hacer referencia como acontecimiento.
En algunos casos, un parámetro medido puede no alcanzar un umbral particular para el canal de detector, y por tanto puede no registrarse como acontecimiento. En este sentido, la interacción entre un haz de luz y una partícula que fluye a través del citómetro puede producir o no un acontecimiento de partícula. Opcionalmente, este tipo de umbral se puede usar para reducir o eliminar señales provocadas por ruido, restos, y similares.
Realizaciones de la presente invención abarcan métodos que implican determinar límites de detección de señales de fluorescencia en fotomultiplicadores para usar en aplicaciones de citómetro de flujo. En algunos casos, la determinación de un límite de detección se puede basar en un patrón de expresión esperado de un objetivo de célula (que se puede
etiquetar con conjugados anticuerpo-fluorocromo), las intensidades esperadas de señal de fluorescencia para etiquetas fluorescentes individuales que surgen del etiquetado fluorescente de los antígenos comprendidos por el patrón de expresión, y en una matriz de desbordamiento esperadas para los fluorocromos en los diferentes fotomultiplicadores.
Según algunas realizaciones, puede haber un aporte adicional que abarca la dispersión de datos que es específica para un intervalo dado de detección de longitudes de onda (según lo determinado por el filtro pasobanda delante de un fotomultiplicador) ya que el último puede determinar la respectiva sensibilidad de fotomultiplicador y por tanto el error de medición (dispersión de datos). La relación entre desbordamiento y dispersión de datos resultante se puede valorar experimentalmente.
Realizaciones ejemplares permiten a un usuario de dispositivo de citometría seleccionar una combinación deseada de fluorocromo-anticuerpo (p. ej. panel de sonda) que se puede usar para construir experimentos de citómetro de flujo que incluyen una predicción de límites de detección para los conjugados de fluorocromo; a esto también puede se le hace referencia como simulación de panel. Es más, un usuario de dispositivo de citometría puede seleccionar una combinación de anticuerpos sin asignar etiquetas fluorescentes a cada uno de estos, respectivamente, a fin de obtener una propuesta para un panel de sonda con límites de detección minimizados para sondas individuales deseadas dentro de este panel de sondas. En algunos casos, técnicas de evaluación o diseño de panel pueden implicar el uso de un modelo de superposición lineal de agrandamientos inducidos por desbordamiento de errores de medición distribuidos normalmente.
Técnicas de diseño y evaluación de panel de sonda como se describe en esta memoria pueden usar datos de mediciones de fluorocromo de referencia con un único tinte para cálculos de un desbordamiento (que como alternativa se le puede hacer referencia como derramamiento/derramar, derrame, o diafonía). En algunos casos, un factor de distorsión se puede caracterizar por la siguiente fórmula:
[aumento del límite de detección en un canal no primariolfdecenasi
[intensidad en el canal primario][decenas]
En otras palabras, la determinación de un factor de distorsión puede cuantificar el efecto de desbordamiento de una primera etiqueta (que es parte de una sonda de conjugado-etiqueta), donde la primera etiqueta está pensada o configurada para ser medida en un primer canal (p. ej. un detector PMT), a al menos un segundo canal, donde el segundo canal (u otros canales adicionales) está pensado y configurado para medir una etiqueta diferente. En algunos aspectos, el factor de distorsión puede ser una estimación de un aumento en el límite de detección en el segundo canal como función de una intensidad de emisión de una primera combinación sonda-etiqueta. En otros aspectos, el factor de distorsión puede ser una función lineal de la intensidad de emisión de una primera combinación sonda-etiqueta. En aspectos adicionales, el factor de distorsión se puede calcular usando un índice de diafonía. En algunos aspectos, el factor de distorsión es modificado matemáticamente por un coeficiente que representa el patrón de coexpresión de antígenos correspondiente a una primera combinación sonda-etiqueta y una segunda combinación sonda-etiqueta, estando pensada o configurada la segunda combinación sonda-etiqueta para ser medida en un segundo canal. En aspectos adicionales, se puede hacer determinación de un factor de distorsión para cada etiqueta en un primer panel de sonda potencial para calcular un aumento total en el límite de detección en un segundo canal.
En algunos casos, una técnica de diseño o evaluación de panel de sonda puede implicar el uso de un patrón de expresión esperado de antígenos en diferentes objetivos de células, tales como exclusión, subpoblación (p. ej. progenitordescendiente como se representa en la figura 1D), coexpresión no exclusiva, o características de expresión de antígeno esperada tal como discreta o modulada. En algunos casos, una técnica de diseño o evaluación de panel de sonda puede implicar predecir, estimar o determinar de otro modo límites de detección para canales de detección individuales, opcionalmente para una variedad de tipos de células diferentes o patrones de expresión de antígeno.
Como se emplea en esta memoria, en la descripción de antígenos, los términos genealógicos "progenitor", "hijo", "hermano", "tío" y "primo" se usan para identificar y describir relaciones entre grupos de diferenciación ("CD") para antígenos específicos, o el correspondiente anticuerpo. Sin embargo, cabe señalar que en el contexto de la presente divulgación, estos términos no se refieren a generaciones de reproducción celular, sino en cambio se refieren a etapas de desarrollo de una célula dada conforme cambian los antígenos en la superficie celular dada debido a diferenciación o especialización. Por ejemplo, un antígeno tal como CD45 puede estar presente en una célula T nativa; si la célula T nativa es especializa para convertirse en una célula T killer, el antígeno CD45 puede actuar como precursor a antígeno CD2 (hijo) y convertirse en este, mientras que si la célula T nativa se especializa para convertirse en una célula T "helper", el antígeno CD45 puede actuar como precursor a antígeno CD4 (hijo) y convertirse en este. En este tipo de situación, al antígeno CD45 se le puede hacer referencia como el antígeno progenitor tanto para los antígenos hermanos CD2 y CD4.
Posibles relaciones de desarrollo entre antígenos generalmente se presentan de la siguiente manera. En algunas células, dos antígenos diferentes pueden ocurrir en la misma superficie celular, cada uno de ellos con su densidad media típica e intervalo de expresión, dando como resultado un caso llamado "coexpresión". La presencia de un antígeno en la superficie celular puede excluir la presencia de otro antígeno específico en la misma superficie celular, dando como resultado un caso llamado "exclusión". Antígenos con un "progenitor" idéntico se llaman "hermanos". En algunas células un primer antígeno puede ocurrir en una superficie celular donde un segundo antígeno también está expresado, sin embargo, el segundo antígeno también puede ocurrir en una superficie celular sin que esté presente el primer antígeno. En tales
casos, el segundo antígeno se llama antígeno "progenitor" mientras que el primer antígeno se llama antígeno "descendiente" o "hijo", dando como resultado un caso llamado "progenitor-descendiente" o "progenitor-hijo". El "hermano" de un "progenitor" de un antígeno dado se llama el "tío" de ese antígeno. Cuando se considera un antígeno específico, sus "hermanos" no excluidos, sus hijos, sus hijos adicionales (o "nietos"), antígenos descendientes adicionales, su "progenitor", sus "progenitores" (o "abuelos") adicionales y todos los antígenos ascendientes adicionales y sus "tíos" no excluidos se les puede hacer referencia como la genealogía de desarrollo (o árbol de desarrollo) del antígeno específico. Puede ocurrir que una única proteína se expresa en tipos de células diferentes pertenecientes a diferentes genealogías de desarrollo, posiblemente también soportan diferente densidad media, intervalo y características de distribución de la expresión de este antígeno. A las múltiples entidades celulares de este antígeno que expresa multiplicidad se les puede hacer referencia como "múltiples". Además, dos antígenos coexpresados pueden tener densidades de expresión inversamente correlacionadas, dando como resultado un caso llamado "correlación inversa".
Un conjunto de pautas para crear genealogías de desarrollo para cualquier antígeno dado puede incluir las siguientes reglas:
(1) cada antígeno debe ser asignado a al menos un "progenitor", si no se conoce el "progenitor" como "progenitor" se asigna "desconocido";
(2) si existe, para cada antígeno se deben identificar "exclusiones", "correlaciones" o "correlaciones inversas" con "hermanos", en aspectos, el orden de consideración de hermanos se puede basar en qué antígeno tiene el nombre alfabéticamente anterior;
(3) si existe, para cada antígeno se deben identificar "exclusiones", "correlaciones" o "correlaciones inversas" con "tíos", a menos que los tíos sean excluidos por el progenitor del antígeno respectivo; (4) "múltiples" se deben manejar como si fueran múltiples antígenos diferentes a fin de mantener consistencia de genealogías de antígenos individuales, esto se hace al asignar "progenitores" diferentes, "hermanos" y "tíos" excluidos o inversamente correlacionados, y (5) antígenos correlacionados comparten las mismas exclusiones y correlaciones inversas pero no necesariamente tienen los mismos múltiples. Mediante este conjunto de reglas, el conjunto completo de genealogías de desarrollo de antígeno se puede crear para cierta especie y compartimento corporal, estableciendo todas relaciones posibles entre todos los antígenos.
Según algunas realizaciones, se pueden usar límites de detección para jerarquizar, comparar, o evaluar de otro modo paneles fluorocromo-anticuerpo, sobre la base de patrones de expresión de antígeno (que pueden implicar densidades de expresión de antígeno y brillo de fluorocromo), opcionalmente en combinación con datos experimentales. En algunos aspectos, cálculos relacionados con determinar límites de detección pueden incluir aportar o recibir información en relación con una señal esperada máxima de una primera combinación sonda-etiqueta, sobre la base de las características de una primera sonda y una primera etiqueta. En un instrumento o sistema donde la señal desde una primera combinación sonda-etiqueta puede crear desbordamiento a al menos un segundo canal de detección (es decir, un canal no configurado para detectar específicamente el primer sonda de conjugado-etiqueta), calcular el aumento en los límites de detección de un segundo canal se puede basar en un hecho de distorsión y la señal esperada máxima de la primera combinación sonda-etiqueta. Por consiguiente, se puede seleccionar o elegir una combinación sonda-etiqueta para incluir un panel de sonda sobre la base del aumento(s) calculado en el límite(s) de detección. En aspectos adicionales, el aumento en un límite de detección en al menos un segundo canal puede ser provocado por un aumento en el error de medición, como función de la intensidad de emisión, de una primera combinación sonda-etiqueta.
Métodos y sistemas ejemplares de panel de sonda descritos en esta memoria son muy idóneos para uso en evaluar diversas combinaciones de conjugados (p. ej. fluorocromo-anticuerpo etiquetado, combinaciones panel-etiqueta, etc.) que tienen patrones de desbordamiento complejos. Tales sistemas y métodos pueden implicar el uso de determinación específica de canal de detección y patrón de expresión de una intensidad de señal típica y un aumento en el límite de detección relacionado con una intensidad de señal típica. Por consiguiente, sistemas y métodos pueden funcionar sobre la base de parámetros particulares tales como densidades de expresión, intensidades de fluorocromo, patrones de coexpresión, y factores de distorsión. En algunos casos, la evaluación de un panel de sonda puede incluir determinar una diferencia máxima para una intensidad de señal típica y para un aumento en el límite de detección. En algunos casos, la evaluación de un panel de sonda puede implicar determinar la ratio de una intensidad de señal típica a un límite de detección, para uno o más conjugados anticuerpo-tinte particulares. Métodos y sistemas ejemplares de evaluación de panel de sonda se pueden basar en la consideración de patrones de coexpresión y en la simulación de resultados experimentales. La selección de combinaciones sonda-etiqueta se puede basar además en una comparación del aumento total calculado del límite de detección, con un aumento mínimo esperado en al menos un segundo canal. Además, se puede calcular un aumento total en los límites de detección, para todos los canales, para cada sonda en uno o más paneles de sonda potenciales. En algunos aspectos, sistemas y métodos para evaluar diversas combinaciones de conjugados pueden incluir además calcular un aumento total en el límite de detección para cada sonda en un segundo panel de sonda potencial y seleccionar el panel de sonda sobre la base de una comparación del aumento total calculado en el límite de detección para cada sonda en el primer panel de sonda potencial, con el aumento total calculado en el límite de detección para cada sonda en el segundo panel de sonda potencial. En otros aspectos, tales métodos o sistemas pueden incluir calcular un aumento total en el límite de detección para cada sonda en un segundo panel de sonda potencial y seleccionar el panel de sonda sobre la base del aumento total calculado en el límite de detección para una sonda priorizada en el primer panel de sonda potencial y el segundo panel de sonda potencial. En otros aspectos, un primer canal y un segundo canal pueden ser canales adyacentes.
Además, en algunos ejemplos que no forman parte de la presente invención, métodos para diseñar un panel de sonda para un citómetro de flujo pueden incluir: identificar una primera sonda y una segunda sonda; identificar una señal mínima esperada de la primera sonda; determinar un primer límite de detección de la primera sonda sobre la base de una etiqueta potencial asociada con la segunda sonda; determinar un segundo límite de detección de la primera sonda sobre la base de una etiqueta potencial diferente asociada con la segunda sonda; y seleccionar qué etiqueta asociar con la segunda sonda para el panel de sonda sobre la base del primer límite de detección, el segundo límite de detección, y la señal mínima esperada de la primera sonda. En aspectos, determinar un primer límite de detección puede incluir multiplicar un factor de distorsión por una señal esperada máxima en un canal de detección pretendido para medir la etiqueta potencial asociada con la segunda sonda. En otros aspectos, determinar el primer límite de detección puede incluir multiplicar el factor de distorsión por un coeficiente que representa un patrón de coexpresión antigénico, donde en algunos casos, el coeficiente es uno o cero. En aspectos adicionales, una señal esperada máxima se puede basar en parte en cualquiera o todos de una densidad de antígeno esperada en un objetivo de célula, la etiqueta potencial asociada con la segunda sonda, y un patrón de coexpresión antigénico. Algunas realizaciones de tales métodos incluyen una primera sonda que está pensada para ser detectada en un primer canal, y donde determinar un primer límite de detección de la primera sonda incluye multiplicar un factor de distorsión por una señal esperada máxima para cada canal del citómetro de flujo distinto al primer canal. En tales aspectos, determinar el primer límite de detección de la primera sonda se basa en un modelo de superposición lineal de agrandamientos CV. En algunos aspectos, el factor de distorsión puede ser una medida de agrandamiento CV provocado por compensación de color.
En algunos ejemplos que no forman parte de la presente invención, un método para diseñar un panel de sonda para un citómetro de flujo puede incluir: identificar una primera sonda, una segunda sonda, y una tercera sonda; identificar una pluralidad de posibles paneles de sonda, cada posible panel de sonda incluye una combinación de la primera sonda, la segunda sonda o la tercera sonda, cada sonda tiene una posible etiqueta asociada a la misma; evaluar un primer posible panel de sonda al determinar el límite de detección de la primera sonda sobre la base de efectos de desbordamiento de espectro de la combinación de la segunda sonda y su posible etiqueta asociada; evaluar un segundo posible panel de sonda al determinar el límite de detección de la segunda sonda sobre la base de efectos de desbordamiento de espectro de la combinación de la tercera sonda y su posible etiqueta asociada; y seleccionar el panel de sonda de la pluralidad de posibles paneles de sonda sobre la base de los límites de detección determinados. En tales aspectos, al menos una de la primera sonda, la segunda sonda y la tercera sonda se puede unir específicamente a un antígeno. En aspectos similares, al menos una de la primera sonda, la segunda sonda y la tercera sonda se puede unir específicamente a un analito. En aspectos adicionales, evaluar un primer posible panel de sonda incluye determinar el límite de detección de una primera sonda basado en parte en un patrón de coexpresión de antígenos asociado con la primera sonda y una segunda sonda. En algunos aspectos, el patrón de coexpresión de antígenos puede incluir información en relación con relaciones de coexpresión entre antígenos para un tipo particular de célula. En aspectos, efectos de desbordamiento de espectro de combinaciones de una segunda sonda y su etiqueta asociada se pueden determinar para que sean cero si el patrón de coexpresión de antígenos asociado con una primera sonda y la segunda sonda indica que las sondas son mutuamente exclusivas. En aspectos adicionales, se pueden determinar efectos de desbordamiento de espectro de la combinación de una segunda sonda y su etiqueta asociada para que sean cero si el antígeno asociado con la segunda sonda es un descendiente del antígeno asociado con una primera sonda. En aspectos, efectos de desbordamiento de espectro de la combinación de la segunda sonda y su etiqueta asociada se pueden cuantificar como función de un factor de distorsión y un patrón de coexpresión antigénico. Conjuntamente o como alternativa, efectos de desbordamiento de espectro de la combinación de la segunda sonda y su etiqueta asociada se pueden cuantificar como función de una densidad de antígeno esperada en un objetivo de célula. En algunos aspectos, tales métodos o sistemas pueden incluir exponer una representación gráfica de una distribución de población de señales esperadas para una pareja de sondas en un panel de sonda seleccionado, donde exponer la representación gráfica de la distribución de población puede incluir exponer el límite de detección determinado de la primera sonda y la segunda sonda.
Las técnicas de panel de sonda descritas en esta memoria son muy idóneas para usar con diversos dispositivos automatizados, incluidos los sistemas de citometría de flujo Navios™ y Gallios™ (Beckman Coulter, Brea, California, EE. UU.). En algunos casos, cálculos de distorsión se pueden basar en características específicas de propiedades o prestaciones de conjuntos de filtros y/o fotodetectores (p. ej. PMT). Además, técnicas de panel de sonda se pueden basar en propiedades espectrales de tintes, que opcionalmente están disponibles dentro de una biblioteca o repositorio particulares de tintes o conjugados anticuerpo-tinte.
En algunos casos, la evaluación o la simulación de paneles de sonda se pueden basar en ciertos perfiles o patrones de expresión de antígeno. Tales perfiles o patrones se pueden asociar o no con un tipo particular de célula. En funcionamiento, un usuario puede seleccionar conjugados anticuerpo-tinte según un patrón de expresión particular, que puede ser un objetivo de patrón de expresión seleccionado en un experimento planificado. En algunos casos, un instrumento tal como un citómetro de flujo se puede configurar para aceptar múltiples colores (p. ej. diez colores) y el usuario puede querer elegir un menor número de sondas. Por tanto, el usuario puede asignar expresamente un primer número de sondas, mientras deja un segundo número de sondas como variable ficticia, de modo que la suma total de sondas es equivalente al número de canales de color en el citómetro de flujo. En algunos casos, se pueden detectar tintes diferentes (p. ej. PC5 y PC5.5) en el mismo canal y por lo tanto puede no implicar aplicación simultánea.
Como se describe en otra parte en esta memoria, una vez un usuario selecciona o aporta ciertos parámetros de un panel
de sonda, el sistema puede funcionar para recuperar o subir números de pieza u otras indicaciones de identificación desde un módulo de base de datos de anticuerpos. Si, por ejemplo, un conjugado deseado (es decir, sonda) no está contenido en la biblioteca, el número de pieza (PN) se puede indicar como sonda de servicio de diseño de cliente (CDS). En algunos casos, sistemas y métodos implican la evaluación de un panel de sonda sobre la base de una respectiva propiedad de fluorocromo y una intensidad de señal (p. ej. supuesta) que se podría esperar sobre la base de una densidad de expresión del antígeno pretendido, y tales parámetros se pueden recuperar o leer de un módulo de base de datos de anticuerpos. En algunos casos, un módulo de base de datos de anticuerpos puede incluir datos concernientes a diversos parámetros para usar en evaluación de paneles de sonda, incluida la intensidad de señal de sonda, que se puede basar en una densidad de antígeno para la especificidad de sonda conjuntamente con fluorocromo conjugado. Datos de intensidad de conjugado se pueden basar en estimaciones, o se pueden basar en datos experimentales, por ejemplo que se pueden obtener como parte de un proceso de control de calidad de fabricación.
Realizaciones adicionales de la presente divulgación abarcan métodos para valorar la positividad en citometría de flujo multicolor. Se pueden usar técnicas ejemplares de control de especificidad o catalogación por compuerta para evaluar una firma de partícula individual, por ejemplo para determinar si una célula sanguínea es positiva o negativa para cierta expresión de proteína, tal como un marcador de enfermedad. En algunos casos, estas técnicas de control se pueden usar para posicionar una compuerta o región gráfica respecto a datos adquiridos, para clasificar las células de las que se obtienen los datos. Se pueden usar técnicas de control ejemplares en procedimientos multicolor tras la compensación. En algunos casos, los métodos descritos en esta memoria permiten un nivel de estandarización que no está presente en técnicas usadas actualmente. Además, las técnicas de control descritas en esta memoria son eficientes en el tiempo, económicas, eficaces para patrones de expresión heterogéneos, y permiten la cuantificación de positivos.
En algunos casos, los espectros de emisión medidos de tintes diferentes fluorescentes pueden solaparse, y puede ser útil compensar las señales obtenidas por los detectores. Por ejemplo, durante el análisis de datos se puede aplicar una técnica de compensación de fluorescencia para determinar cuánta interferencia está teniendo ese Fluorocromo A en el Canal B (que se asigna para medir específicamente el Fluorocromo B). Como resultado, es posible obtener la fluorescencia medida total en el Canal B, y sustraer la contribución del Fluorocromo A, para determinar la fluorescencia del Fluorocromo B en el Canal B. Según algunas realizaciones, es posible obtener la fluorescencia medida total en el Canal B, y eliminar la contribución del Fluorocromo A, para determinar la fluorescencia del Fluorocromo B en el Canal B, por ejemplo que se puede conseguir usando un planteamiento de compensación basado en matriz que implica compensación digital.
Datos de acontecimientos se pueden representar visualmente de varias maneras. Por ejemplo, se puede usar un histograma para exponer un único parámetro de medición (p. ej. fluorescencia) en el eje horizontal X y el número de acontecimientos (p. ej. recuento celular) en el eje vertical Y. De esta manera, es posible determinar el número de células en una muestra que tiene ciertas características. Por ejemplo, un pico corto en el lado izquierdo de la gráfica puede representar un pequeño grupo de células que tienen una fluorescencia tenue (acontecimientos dentro de una población de negativos) y un pico alto en el lado derecho de la gráfica puede representar un gran grupo de células que tienen una fluorescencia brillante (acontecimientos dentro de una población de positivos).
Como se emplea en esta memoria, se puede usar una "compuerta" como frontera para diferenciar entre una población de positivos y una población de negativos. De manera similar, se puede usar una compuerta como frontera para definir una subpoblación de acontecimientos. Una compuerta se puede establecer, por ejemplo, al delinear una frontera alrededor de un subconjunto de acontecimientos en un trazado de datos tal como un trazado de puntos o un histograma. Una compuerta puede ser inclusiva para seleccionar acontecimientos que caen dentro de una frontera, o exclusiva para seleccionar acontecimientos que caen fuera de la frontera. Por consiguiente, el número de acontecimientos positivos (en un lado particular de la frontera) puede referirse al número de células que exponen un rasgo físico o marcador de interés. Según algunas realizaciones de la presente invención, se puede usar catalogación por compuerta para distinguir señales correspondientes a objetos fluorescentes de señales correspondientes a objetos no fluorescentes. Según algunas realizaciones, cualquier acontecimiento detectado con un tubo fotomultiplicador (PMT, del inglés photomultiplier tube) puede emitir una señal de fluorescencia. Por tanto, una fluorescencia emitida se puede asociar con una etiqueta específica.
Hay disponibles protocolos específicos de catalogación por compuerta para finalidades de diagnóstico y clínicas en el campo de hematología. Por ejemplo, se pueden usar compuertas en datos de citometría de flujo para visualizar selectivamente ciertas células de interés tales como glóbulos blancos, mientras se eliminan resultados de partículas no deseadas tales como células muertas y restos. En algunas situaciones, puede ser difícil determinar dónde colocar una compuerta para clasificar eficazmente un acontecimiento como positivo o negativo. Al usar un control apropiado, es posible ayudar a identificar la diferencia entre una población de positivos y una población de negativos. Realizaciones de la presente invención se pueden usar conjuntamente con técnicas de citometría multicolor en general, que incluye sin limitación el campo hematológico. En algunos casos, realizaciones de la presente invención se pueden aplicar a cualquier medición donde es útil o necesario un control de Fluorescencia Menos Uno (FMO).
Realizaciones de la presente divulgación proporcionan métodos para realizar análisis de positivos automatizados en citometría de flujo multicolor que se caracterizan por agrandamiento inducido por desbordamiento de los errores de medición. Unas realizaciones además abarcan técnicas para calcular errores de medición según cada patrón de
expresión del acontecimiento individual sobre la base de un modelo de superposición lineal de desbordamiento de fluorocromo, como también se aplica para aplicaciones de diseño y simulación de paneles, uso de los mismos o técnicas similares para determinar límites de predicción para citometría de flujo multicolor, teniendo en cuenta el patrón de coexpresión de antígenos en una partícula detectada para permitir la determinación de una ratio de desbordamiento para un fluorocromo a todos los otros canales de detección mediante un cálculo de superposición.
De manera relacionada, realizaciones de la presente invención abarcan técnicas de corrección posadquisición para citometría de flujo, de manera que se pueden minimizar errores de compensación asociados con resultados de muestra adquirida. Por ejemplo, el uso de planteamientos de compensación estándar en experimentos de canal multicolor con valores fijos de corrección puede tender a exceso o defecto de compensación de los resultados de experimento en una frontera de catalogación por compuerta. Realizaciones de la presente invención abarcan el uso de datos compensados correctamente, o evitar tal exceso o defecto de compensación.
En algunos casos, las técnicas de corrección automática descritas en esta memoria pueden funcionar para mejorar resultados compensados en un dispositivo de citometría de flujo, para mejorar la identificación de resultados positivos específicos después de adquisición de datos. En algunas realizaciones, métodos descritos en esta memoria pueden funcionar para calcular un límite de detección corregido o fronteras corregidas entre dos secciones de resultados o límites corregidos entre positividad específica y negatividad específica para cada canal de señal de fluorescencia (p. ej. fotomultiplicador), sobre la base de un modelo de superposición del desbordamiento desde todos los otros tintes detectados en todos los otros canales. Usando tales límites corregidos entre positividad y negatividad específicas, es posible proceder automáticamente sin la catalogación por compuerta manual de conjuntos de resultados, y resultados críticos en el área de frontera entre dos secciones de resultados se observan como que están asignados sin ambigüedad a la sección apropiada.
Descripción general
Cambiando ahora a los dibujos, la figura 1 representa aspectos de métodos de citometría de flujo según algunas realizaciones. La configuración 100 de un dispositivo de citometría de flujo típicamente incluye ciertos parámetros de conjunto de detector de señal de fluorescencia 110, así como parámetros de longitud de onda de láser de excitación 120.
Los dispositivos de citometría de flujo se pueden configurar con cualquiera de una variedad de parámetros de láser de excitación. Por ejemplo, se pueden configurar conjuntos de láser para producir espectros de excitación a 355 nm (ultravioleta), 405 nm (violeta), 488 nm (azul), 532 nm (verde), 561 (amarillo), 633 nm (rojo), 638 nm (rojo), y similares. De manera relacionada, conjuntos de láser pueden incluir cualquier número de dispositivos de láser de excitación. Por ejemplo, un conjunto de doble láser puede incluir un primer láser para entregar energía de excitación a 488 nm y un segundo láser para entregar energía a 638 nm.
Como se muestra en la figura 1, la energía de láser de excitación puede impactar en un tinte de una sonda de conjugado anticuerpo-tinte. Típicamente, un tinte particular será excitado en una longitud de onda característica, y posteriormente fluorescer espectros de emisión característicos. Puede haber uno o varios máximos de emisión de fluorescencia. Los espectros de emisión pueden cubrir un intervalo de longitudes de onda. Por ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína (FITC) es un fluorocromo que es excitado por luz a 488 nm y que produce un máximo de emisión de fluorescencia de alrededor de 520 nm. Al menos una longitud de onda, PC5 y PC5.5 por ejemplo son excitados por dos longitudes de onda 488 y 638 nm, lo que añade complejidad a los patrones de desbordamiento.
Los conjuntos de detector de señal 110 pueden incluir diversas combinaciones de filtros y detectores. Como se muestra aquí, un conjunto de detector puede incluir un filtro pasobanda 525/40 para usar con un dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT1 que se designa para detectar emisión de tinte FITC. Tales configuraciones se pueden diseñar para proporcionar parámetros de detección deseados para un fluorocromo particular. Configuraciones adicionales como se muestran pueden incluir: un filtro pasobanda 575/30 para usar con un dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT2 que se designa para detectar emisión de tinte PE; un filtro pasobanda 620/30 para usar con un dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT3 que se diseña para detectar emisión de tinte ECD; un filtro pasobanda 675/20 para usar con un dispositivo de tubo fotomultiplicador p MT4 que se diseña para detectar emisión de tinte PC5; un filtro pasobanda 695/30 para usar con un dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT5 que se diseña para detectar emisión de tinte PE-Cy7; y un filtro pasobanda 660/20 para usar con un dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT6 que se diseña para detectar emisión de tinte APC. Se pueden designar detectores individuales (p. ej. PMT1, PMT2, PMT4) para detectar longitudes de onda de luz desde respectivos tintes primarios (p. ej. FITC, PE, PC5) como indican la gráfica de espectros de emisión 130. Se puede usar filtros pasobanda para permitir que ciertas cantidades de luz emitida pasen a través de los mismos, y hacia un tubo fotomultiplicador (PMT). p Mt específico con sus filtros pasobanda asociados puede estar dedicado a detectar la emisión de conjugados excitados por longitudes de onda de luz específicas.
Una ilustración de hardware ejemplar de un dispositivo de citometría de flujo, que tiene una configuración en bloque de filtro de diez colores y tres láser se representa en la figura 1A. Como se muestra aquí, un dispositivo de citometría de flujo puede incluir una variedad de filtros pasobanda (BP), así como filtros dicroicos (DC) de paso corto (SP) y paso largo (LP).
Volviendo la referencia a la figura 1, se puede ver que técnicas ejemplares pueden implicar que un usuario u operario
realiza ciertas acciones. Por ejemplo, acciones de usuario 140 pueden incluir determinar o seleccionar una configuración de un dispositivo de citometría de flujo, como se indica en la etapa 142, y determinar o seleccionar un patrón de expresión antigénica de interés, como se indica en la etapa 144. Con relación a la etapa de seleccionar una configuración de dispositivo, este tipo de selección se pueden hacer usando un botón desplegable (base de datos), para escoger de una variedad de configuraciones de hardware preestablecidas (p. ej. tal como la configuración de hardware representada en la figura 1A).
Según algunas realizaciones, la selección de diversas configuraciones de hardware y la selección de patrones de expresión de antígeno de interés se pueden implementar en una versión basada en web. Según algunas realizaciones, métodos pueden implicar medios de base de datos que pueden proporcionar una indicación de si hay potencialmente más antígenos del panel de sondas que los incluidos en el patrón de expresión que el usuario asignó a cierto patrón. Si es así, esto puede tener como resultado señalar al usuario que hay más antígenos que incluyen influencia de estas sondas en los límites de detección.
Según algunas realizaciones, la configuración de hardware puede representar cualquiera de una variedad de combinaciones de conjunto láser, conjunto de filtros y canal de detección. Por ejemplo, una configuración de hardware particular puede incluir uno o más láseres que emiten a diversas longitudes de onda. En algunos casos, una configuración de hardware puede incluir seis canales de detección y dos colores de láser (p. ej. 488 nm y 638 nm). En algunos casos, una configuración de hardware puede incluir ocho canales de detección y dos colores de láser (p. ej. 488 nm y 638 nm). En algunos casos, una configuración de hardware puede incluir diez canales de detección y tres colores de láser (p. ej.
405 nm, 488 nm, y 638 nm). En algunos casos, una configuración de hardware puede incluir diez canales de detección y cuatro colores de láser (p. ej. 405 nm, 488 nm, 561 nm, y 638 nm).
Procedimientos ejemplares de monitorización celular implican evaluar células individuales en cuanto a la presencia o ausencia cuantitativa relativa de ciertos antígenos de superficie celular o internos. Como se muestra en la figura 1, una célula particular en cierta fase de desarrollo o en cierto estado de enfermedad puede presentar un patrón de expresión antigénica distintivo 150 caracterizado por la presencia de ciertos antígenos (p. ej. CD28, CD26, CD3, CD15, CD59, CD71) en la superficie de la célula o dentro de la célula. Por tanto, un panel de conjugado anticuerpo-tinte que contiene sondas específicas para tales antígenos (p. ej. conjugado específico para CD28, conjugado específico para CD26) que producen respectivamente espectros de emisión específicos en la excitación, se puede usar para analizar una muestra biológica para determinar la medida en la que la muestra contiene células que expresan tales antígenos, y también la cantidad relativa de expresión de antígeno en células expresivas. De esta manera, el panel de sonda se puede usar para evaluar o monitorizar el estado fisiológico de un paciente. Las figuras 1B a 1H proporcionan detalles adicionales concernientes al procesamiento del aporte de usuario, el retorno de entradas de base de datos y cálculos subsiguientes, y la interpretación de las exposiciones.
La figura 1B representa aspectos de una técnica de selección de panel de sonda según realizaciones. Como se muestra aquí, un usuario puede aportar un conjunto de anticuerpos correspondiente a un patrón de expresión antigénica particular de interés (p. ej. CD57, CD45, y otros marcadores celulares). En algunos casos, los anticuerpos seleccionados se pueden asignar o asociar con respectivos tintes predefinidos. Según algunas realizaciones, un usuario puede asignar cada especificidad a un tinte predefinido. Según algunas realizaciones, un usuario puede tener la oportunidad de introducir la especificidad únicamente y permitir que el software proponga las asignaciones anticuerpo-tinte óptimas. La selección de paneles de sonda puede incluir además canales "ficticios", donde un canal particular y el tinte relacionado no están pensados para ser usados, la designación ficticia y el diseño de panel se pueden usar como canal "silencioso" y control de negativos. Como se emplea en esta memoria, un canal "silencioso" indica un canal de detector que no provoca desbordamiento de señal a cualquier otro canal, y se le puede hacer referencia como "columna limpia" cuando se ve como parte de una tabla de distorsión. De manera similar, como se emplea en esta memoria, un canal "inalterado" indica un canal de detector que no recibe ningún desbordamiento de señal desde los tintes que ese canal no está configurado para detectar, y se le puede hacer referencia como "fila limpia" cuando se ve como parte de una tabla de distorsión.
Como se muestra en la figura 1B, el uso de PC5.5 como tinte para detección del antígeno CD33 en el canal de detección FL4 sería complicado por el uso de PC5 o la detección intentada de PC5 en el canal de detección FL4. Por consiguiente, PC5 se asigna como ficticio en este panel de sonda. La figura 1B muestra además que un usuario puede asignar un antígeno específico a un tinte deseado en un canal de detección particular, particularmente en el ejemplo mostrado, tinte Pacific Blue conjugado a CD57, que será excitado por luz a 405 nm y detectado en canal de detección PMT FL9. En este contexto, la FL9 es el canal primario para detección de tinte excitado Pacific Blue (y por lo tanto detección de CD57), y por consiguiente, FL1-8 y FL 10 son canales secundarios que podrían detectar señal de fluorescencia de desbordamiento no deseado desde el tinte Pacific Blue.
Como se ilustra en la figura 1C, un panel de sonda, que puede referirse a un conjunto de conjugados anticuerpo-tinte, se puede vincular con una base de datos que contiene información en relación con las sondas. Por ejemplo, la base de datos puede contener información concerniente a la intensidad de fluorescencia para cada sonda en el panel. En algunas realizaciones, el término "panel" también se puede referir a una secuencia o grupo de varias combinaciones de conjugados. Como se muestra, (y se trata en detalle adicional con relación a la figura 8 siguiente) la base de datos puede proporcionar información en relación con un conjunto de conjugados (también se le hace referencia como panel), que permite el cálculo de la intensidad de fluorescencia media típica de una población de positivos brillantes, como se indica
por acontecimientos de población en decenas por encima de 10A0 como se muestra en la gráficas, identificado como sección (A) en la figura 1C. La base de datos también puede permitir el cálculo de la intensidad de fluorescencia mínima de una población de positivos tenues. En una evaluación de características de expresión de antígeno discreta, como se ve con la gráfica CD4-PE, las poblaciones de positivos y negativos están claramente separadas, y la intensidad de fluorescencia mínima de la población de positivos tenues es idéntica a 1. En una evaluación de características de expresión de antígeno modulado como se ve en la gráfica CD184-PE versus CD57-PacB, sin embargo, poblaciones de positivos y negativos no están claramente separadas, ya que las densidades de antígenos pueden variar entre las células positivas, y se supone que la intensidad de fluorescencia mínima está dentro de la decena de ceros (es decir, menos de 10A0). Además, la base de datos puede permitir el cálculo del aumento de un límite de detección para un conjugado (y la correspondiente pérdida de sensibilidad) en decenas para cada conjugado resultante de los efectos combinados de todas las contribuciones de desbordamiento que ocurren, identificadas como (B) en la figura 1C. En algunos aspectos, el factor de distorsión de un conjugado sobre otro se puede caracterizar como la ratio de (B) sobre (A).
De manera relacionada, como se muestra en la figura 1D, sobre la base del conjunto de anticuerpos específicos de antígeno seleccionados por el usuario, que se le puede hacer referencia como el aporte 160, es posible consultar una base de datos 162 para información asociada con las sondas respectivas. Como se trata en otra parte en esta memoria, los cálculos 164 tratados en relación a la figura 1D se pueden usar por referencia por ejemplo con respecto a las técnicas representadas en la figura 8. Consultas de base de datos 162 en el aporte de usuario 160 de un conjugado pueden incluir, por ejemplo: (C) la intensidad (en decenas sobre 10A0) de un conjugado-PE (u otro tinte de referencia) para cada conjugado; (D) el brillo de fluorocromo respecto a PE para cada conjugado, donde PE (u otro tinte de referencia) es igual a 1 o 100 %; (E) el aumento típico del límite de detección provocado por canales secundarios por decena de intensidad de señal en un canal primario para cada uso de fluorocromo, es decir, un factor de distorsión; (F) características típicas de expresión de cada antígeno, evaluadas como discretas o moduladas; (G) los patrones típicos de coexpresión de antígeno para cada único antígeno con todos los otros antígenos, es decir, las coexpresiones de interés, donde "1" es el código para coexpresión y "0" es el código para ausencia de coexpresión o exclusión; y (H) los patrones típicos de coexpresión de antígenos progenitor-descendiente para cada único antígeno con todos los otros antígenos, donde "0" es el código para un propiedad de descendiente y "1" es el código para ausencia de una propiedad de descendiente.
La salida 166 de una base de datos como se describe en la figura 1D depende del área de su aplicación. Particularmente, el supuesto tipo de célula de interés es diferente para inmunomonitorización y trastornos de células sanguíneas, por lo tanto patrones típicos de coexpresión y características típicas de expresión relacionadas con los mismos varían dependiendo del tipo de célula de interés. Los cálculos 164 basados en datos recuperados de la base de datos debido a consultas de búsqueda pueden proporcionar la siguiente salida. Un valor para (I), la intensidad de fluorescencia media típica por encima de 10A0 para cada conjugado para poblaciones de positivos brillantes (así dirigido a trazados discretos), se puede calcular como:
(I) = log(((10A(C)-10A0* (D)) 10A0)
donde la suma y la resta de 10A0 permite consistencia en un escalado de trazado. Un valor para (J), la intensidad de fluorescencia típica de cada conjugado para poblaciones positivas tenues (así dirigida a trazados modulados) sobre la base de características de expresión, es similar a la ecuación para (I) arriba, pero con el valor para (C) establecido a 0 decenas por encima de 10A0.
El valor para (K), el aumento de límite de detección (DL) en un canal de detección secundario a través de desbordamiento de un único conjugado en un canal primario, se puede determinar como:
(K) = (I) * DF * (G) * (H)
donde el valor de (K) se calcula para cada único conjugado detectado en un canal primario, que por ejemplo puede ser nueve (9) valores para (K) calculados para canales secundarios en un panel de diez (10) colores. Además, un valor (L) para el aumento global de DL en un canal de detección secundario a través de desbordamiento combinado de todos los conjugados detectados en sus respectivos canales primarios se puede dar por:
(L) = log((10A(K1)-10A0) log((10A(K2)-10A0) log((10A(Kn)-10A0)
donde, de nuevo, la suma y la resta de 10A0 permite consistencia en un escalado de trazado. Se puede calcular un valor (L) para cada canal secundario. Los resultados de tales cálculos 164 pueden ser sacados posteriormente 166 ya sea para uno o ambos de exposición y procesamiento adicional.
La figura 1E representa aspectos de una técnica de evaluación de panel, según realizaciones. Los cuadros de exposición de gráficos mostrados aquí pueden ser útiles para analizar o jerarquizar ciertos diseños de panel. Como se muestra aquí, se proporciona cierta sonda o tinción, que tiene un anticuerpo específico para el antígeno CD45, conjugado con un tinte de fluoroforo PE. El tinte PE puede ser excitado por un láser de 488 nm, y puede emitir espectros que se detectan en un canal FL2 (p. ej. a aproximadamente 575 nm). El antígeno CD45 típicamente se expresa fuertemente en leucocitos, y PE es un fluoroforo brillante. Por tanto, es posible observar una fuerte intensidad de señal cuando se aplica una sonda CD45-PE a una muestra de laboratorio de origen humano. Como se muestra aquí, el resultado es una intensidad de escala
completa. Las líneas de trazos (separación mínima, símbolos de datos cuadrados) y puntos (separación máxima, símbolos de puntos de datos de triángulo) coinciden, indicando una expresión discreta. Esto es, las poblaciones de positivos y negativos están claramente separadas.
La figura 1F representa la adición de una sonda CD25-ECD. El tinte ECD también puede ser excitado por un láser de 488 nm, y puede emitir espectros que se detectan en un canal FL3 (p. ej. a aproximadamente 625 nm). Como se muestra aquí, CD25 es un antígeno modulado. Esto es, hay una diferencia entre trazos (separación mínima) y puntos (separación máxima). Dependiendo del estado de activación de la célula, células pueden tener una alta expresión de CD25, bajando a una expresión negativa de CD25. Aquí, la línea de trazos (separación mínima) coincide con el límite entre las decenas primera y segunda. Esto corresponde a un límite de detección deseado, por lo que se pueden detectar células con una expresión muy baja (señal tenue), así como células con una expresión más alta (señal brillante). Como se representa aquí, las células con una expresión más alta (separación máxima; línea de puntos) son aproximadamente 0.75 decenas más altas que las células con una expresión más baja (separación mínima; línea de trazos). La diferencia (a) entre el mínimo (trazos) y el máximo (puntos) representa el intervalo de expresión para CD25 según esta realización. Obsérvese que estos datos también pueden tener en cuenta parámetros asociados con el propio tinte ECD. El trazado de burbujas de panel inferior de la figura 1F indica que espectros de emisión desde el tinte PE se desbordan sobre el canal de detección ECD y provocan un aumento estimado del límite de detección según la posición del centro circular cuando se proyecta al eje-y (en decenas) (FL3).
Como se trata en otra parte en esta memoria, tales trazados pueden incluir diferentes líneas correspondientes a diferentes configuraciones de láser (p. ej. 405 nm, 488 nm, y 638 nm). El umbral entre las decenas primera y segunda se puede usar para evaluar ciertos datos de señal. En algunos casos, se pueden suponer unos fondo particulares para un patrón de coexpresión o tipo de célula particulares. Por ejemplo, una célula T puede tener cierto patrón en comparación con una célula B. Por tanto, un usuario puede seleccionar un fenotipo (y el correspondiente patrón de coexpresión) que desea ver en una salida de simulación. En algunos casos, para un patrón de expresión dado, límites de detección para un tipo particular de célula pueden ser diferentes a límites de detección para otro tipo particular de célula, por ejemplo dependiendo de la presencia o ausencia y características cuantitativas del patrón de expresión dado.
Como se muestra en la figura 1F, un límite de detección puede ser representado por una línea de trazos (símbolos de punto de datos cuadrado). En casos donde características de expresión son discretas, puede haber ya sea una población de negativos o una población de positivos, pero ninguna entremedio. Esto es, no habrá células con grados variables de densidades de antígenos en esa población particular. Por tanto, las líneas de trazos y de puntos coincidirán (como con CD45-PE a aproximadamente 575 nm). En ese punto, la densidad de expresión más alta es igual a la densidad de expresión más baja. En contraste, con una expresión modulada, un antígeno se puede encontrar en un tipo particular de célula en una densidad de expresión muy baja, hasta una densidad de expresión muy alta. Como se muestra aquí, una expresión modulada puede ser representada por una línea de puntos. Por ejemplo, en un tipo de célula particular CD3+, c D4 puede estar presente (CD4+, CD8-), o ausente (CD4-, CD8+). Esto representa una fuerte positividad, y corresponde a una característica de expresión discreta. Como se trata en otra parte en esta memoria, la evaluación de panel de sonda también puede basarse en fenotipos particulares (p. ej. al suponer un fenotipo predeterminado tal como célula T o monocito). Por tanto, los usuarios pueden evaluar características de panel de sonda según tipos de células diferentes y patrones de expresión, y determinar cómo pueden afectar los patrones de expresión a los límites de detección para antígenos particulares.
A diferencia de la figura 1F donde la sonda CD25 tiene una etiqueta ECD, la figura 1G representa resultados de una sonda CD25 que tiene un fluorocromo más fuerte, PC5.5. El límite de detección deseado de la figura 1G es el mismo que el mostrado en la figura 1F. Sin embargo, el intervalo (A) entre puntos (máximo) y trazos (mínimo) que la realización supone, para la dinámica de la intensidad de señal, es mucho más alto en la figura 1G. Como se muestra aquí, el intervalo es aproximadamente 1 decena. El trazado de burbujas de panel inferior de la figura 1G indica que espectros de emisión desde el tinte PE se desbordan sobre el canal de detección PC5.5 (FL4).
En la figura 1H, la sonda CD25-ECD es reintroducida. Por tanto, es posible comparar la expresión más alta (intensidad de señal) que se podría esperar para una etiqueta CD25-ECD con densidad de expresión más alta que se puede esperar para etiqueta CD25-PC5.5. Suponiendo de nuevo, una escala logarítmica, el último es considerablemente más grande.
También es útil considerar el fondo (línea continua). Por ejemplo, como se muestra en la figura 1H, puede ocurrir cierto nivel de fondo BG debido a altos niveles de expresión de linfocito de CD45, que se etiqueta con la etiqueta CD45-PE. Como se muestra aquí, esa señal BG de fondo desde PE en el canal ECD es mayor que la señal desde ECD en el canal ECD. Por tanto, hay una pérdida significativa de información, y este tipo de diseño de panel puede no ser favorable.
En la figura 11, se ha retirado la sonda CD25-PC5.5 y se ha añadido una sonda CD25-PC7. Hay desbordamiento desde PE y PC7 al canal FL3. En la figura 1J, se ha retirado la sonda CD45-PE, y hay desbordamiento desde PC7 al canal FL3. Un resultado favorable se proporciona cuando la línea continua (fondo, Bg ) coincide o se aproxima al umbral entre las decenas logarítmicas primera y segunda, como se muestra en la figura 1J. Como se muestra aquí, no hay una inmensa cantidad de fondo que son provocados por desbordamiento al canal ECD. En cambio, hay una pequeña cantidad de desbordamiento desde la emisión de sonda CD45-PC7 sobre el canal de detección ECD FL3. Por tanto, hay una holgura entre el fondo (BG) y la densidad de expresión más alta (máximo; línea de puntos). Por consiguiente, el esquema de
detección únicamente pierde aquellas células que tienen niveles muy bajos de expresión de CD25.
La figura 1K representa la sustitución de la sonda CD25-ECD de la figura 1J por una sonda CD25-PE. El fluorocromo PE es más fuerte que el fluorocromo ECD. Como se muestra en la figura 1K, hay fondo BG similares proporcionados por la sonda CD45-PC7 en el canal de detección de PE FL2. Sin embargo, la distancia entre el fondo y el máximo es mayor en la figura 1K, en comparación con la figura 1J, debido a fluorocromo PE más fuerte en la sonda CD25.
En la figura 1L, la sonda CD25-ECD se incluye de nuevo en el panel. Aquí, se puede ver que la distancia entre la señal de fondo (continua) y el máximo (puntos) es mayor para CD25-PE que lo es para CD25-ECD. Por tanto, la sensibilidad global es mayor. Este resultado tiene en cuenta la intensidad del fluorocromo usado en la sonda CD25 (p. ej. intensidad PE > intensidad ECD), y también el patrón de desbordamiento que emana de otros antígenos (p. ej. CD45) que también se expresan en las células. Tanto la intensidad de fluorocromo como el patrón de desbordamiento de coexpresión pueden contribuir a la sensibilidad.
En la figura 1M, un anticuerpo CD45 se conjuga con un fluoroforo APC-AF750 y se puede ver que no hay desbordamiento. Aquí, la línea continua (BG) coincide con el umbral entre las decenas primera y segunda, y por tanto no hay fondo añadido. Aquí, hay sensibilidad plena, por lo que se pueden detectar señales incluso donde hay células con bajas densidades de expresión para CD25. Como se trata en otra parte en esta memoria, conforme se añaden más sondas al panel, se observarán resultados más complejos. Tales resultados pueden tener en cuenta diversas contribuciones (p. ej. intensidad de fluoroforo) donde el patrón de coexpresión es relevante para el desbordamiento.
Las figuras 1N y 1O proporcionan un ejemplo para tres conjugados, donde un CD dado se puede asociar con un tinte dado. Como se muestra en la figura 1N, cada conjugado CD-tinte tiene un MFI para conjugación PE por encima de decenas 10A0 (siendo PE el tinte de referencia); como se muestra CD-X tiene un MFI de 0.5, CD-Y tiene un MFI de 1, y CD-Z tiene un MFI de 2.5. En algunas realizaciones, la matriz progenitor descendiente puede ser simétrica. En algunas realizaciones, la matriz progenitor descendiente puede ser asimétrica. Como se muestra aquí, la matriz de coexpresión puede ser simétrica, aunque en otros aspectos, la matriz de coexpresión puede ser asimétrica. Además, como se muestra en la figura 1O, cada tinte de los conjugados CD-tinte tiene una intensidad relativa comparada con PE; el tinte-A tiene una intensidad de 0.2, el tinte-B tiene una intensidad de 0.45, y el tinte-C tiene una intensidad de 0.85. Estos valores de los conjugados dados CD-tinte permiten el cálculo de una tabla de factor de distorsión como se ve en la figura 10, donde, en parte, el tinte-B tiene un valor de distorsión de 0.25 que afecta al PMT FL1 que se dirige a detectar tinte-A, y tiene un valor de distorsión de 0.75 que afecta al PMT FL3 que se dirige a detectar tinte-C. Por contraste, el tinte-C no tiene efecto de distorsión en el PMT FL1, y de manera similar, el tinte-A no tiene efecto de distorsión en el PMT FL3 que se dirige a detectar tinte-C. En contraste adicional, el tinte-A tiene un valor de distorsión de 0.65 y el tinte-C tiene un valor de distorsión de 0.1 en el PMT FL2 que se dirige a detectar el tinte-B. Cálculos mostrados en la figura 1O son aplicaciones de las ecuaciones dadas por la figura 1D, usando los valores relevantes proporcionados en las figuras 1N y 1O.
Donde el patrón de coexpresión tiene cierto esquema progenitor/descendiente, o un esquema de exclusión, entonces el desbordamiento calculado no se puede añadir a la distorsión global. Por ejemplo, la figura 1P representa el resultado calculado para una única tinción (sonda CD25-PE). Cuando se añade una segunda tinción (CD45-FITC) al panel, como se muestra en la figura 1Q, se puede ver que la emisión de tinte FITC ejerce desbordamiento sobre el canal de detección PE FL2. El círculo en el trazado de burbujas correspondiente al desbordamiento FITC tiene cierta intercepción en el eje Y, y cierto diámetro. Como se muestra aquí, la sonda CD45-FITC puede escaparse aproximadamente la mitad de un decena de la sensibilidad en el canal PE FL2. Por ejemplo, la distancia entre el fondo y el máximo en la figura 1Q es aproximadamente la mitad de esa distancia como se representa en la figura 1P.
En la figura 1R, la sonda CD45-FITC de la figura 1Q se ha sustituido por una sonda CD15-FITC. El antígeno CD 15 se expresa menos altamente, y por tanto la señal en el canal de detección FITC es menor en la figura 1R en comparación con la figura 1Q. Por ejemplo, se puede ver que el máximo (línea de puntos) ya no está entre las decenas tercera y cuarta. Sin embargo, CD45 se coexpresa con CD25, mientras que CD15 no se coexpresa con CD25 (p. ej. según ajustes predeterminados en la base de datos). Por tanto, no hay distorsión efectiva provocada por el desbordamiento de sonda CD15-FITC sobre el canal FL2 PE. De manera relacionada, no hay suma al fondo en el canal PE. En otras palabras, el desbordamiento todavía está presente pero no afecta a células negativas CD15 con relación a análisis de su expresión de CD25 potencial. Células CD15+, en este ejemplo, no expresan CD25. Por tanto, sobre la base de la biología de las células, no se analizaría la expresión de c D25 en células CD15+. Estos dos antígenos diferentes podrían así ser evaluados usando diferente compuertas.
En otra ilustración de un esquema de coexpresión, la figura 1S representa resultados en los que ambas de una sonda CD3-FITC y una sonda CD45-ECD están generando emisión espectral de desbordamiento al canal de detección PE FL2. La distorsión global es un poco mayor que la mitad de una decena. Este tipo de resultado puede ser coherente con un patrón de coexpresión observable en una célula T. También se puede ver que hay una cantidad minúscula de desbordamiento al canal de detección FL1 FITC. El trazado de burbujas es útil para resolver las contribuciones. Por ejemplo, cuando se consideran los valores de intercepción Y correspondientes al desbordamiento en el canal FL2, se puede ver que el desbordamiento CD45-ECD es mayor que el desbordamiento CD3-FITC. Los respectivos diámetros de burbuja en el canal FL2 indican que ECD proporciona una mayor contribución a la distorsión global.
Por tanto, para mejorar la señal en el canal FL2 (p. ej. aumentar sensibilidad), puede ser más deseable retirar ese desbordamiento ECD en FL2 (p. ej. mientras se retiene ese desbordamiento FITC). La figura 1T representa este tipo de resultado, donde la sonda CD45-ECD de la figura 1S está sustituida por una sonda CD45-APC. Por tanto, hay una mejora considerable en el canal FL2 PE para el límite de detección. Esto es, hay una mayor distancia entre las líneas de fondo (continua) y de máximo (puntos).
En la figura 1U, las sondas CD3-FITC y CD45-APC de la figura 1T están sustituidas por sondas CD3-APC y CD45-ECD, respectivamente. Como se muestra en la figura 1U, todavía hay aproximadamente media decena de pérdida de señal en el canal FL2 PE.
Los trazados de burbujas proporcionan una indicación útil de cómo puede contribuir una configuración de sonda (p. ej. especificidad de antígeno, fluoroforo) al límite de detección para un canal de detección.
La exposición de resultados parar una sonda de panel ejemplar de diez colores se representa en la figura 1V. Como se muestra en la Sección A, para priorizar conjugados que detectan antígenos que tienen una característica de expresión modulada, puede ser deseable una gran distancia entre una intensidad de fluorescencia media estimada (triángulo) y un aumento global de DL (círculo), y puede servir como criterio para jerarquizar diferentes combinaciones de conjugados para conjuntos de antígenos idénticos. Como se muestra en la Sección B, la estimación sobre intensidades de fluorescencia brillante (triángulo) y tenue (caja) media se puede basar en densidades típicas de expresión de antígeno e intensidad de fluorocromo relativa (p. ej. = (I) y (J) como se representa en la figura 1D), y por ejemplo pueden coincidir debido a características de expresión discreta para conjugado CDxy-APCA750 detectado en canal primario respectivo FL8, asignado a un láser rojo. Como se muestra en la Sección C, puede haber un aumento global de DL = (L) para FL8, asignado a un láser rojo. Como se muestra en la Sección D, debido a características de expresión modulada de CDqw-ECD la densidad típica de expresión tenue (triángulo) se puede establecer a cero decenas por encima de 10A0.
Otra exposición de resultados para una sonda de panel ejemplar de diez colores se representa en la figura 1W. Como se muestra en la Sección A, el conjugado-PE (véase la leyenda) en este panel provoca un aumento de 0.6 decena en el límite de detección (DL) por encima de 10A0 en el tercer canal de detección FL3 (p. ej. cuando se hace referencia a la intercepción en el eje Y), y diámetro del círculo de burbujas corresponde a la contribución del conjugado-PE al aumento global del límite de detección en FL3. Por tanto, se puede ver que el conjugado PE proporciona la contribución más grande al aumento en el límite de detección en FL3. Como se muestra en la Sección B, el conjugado PC5/PC5.5 (véase la leyenda) en este panel provoca un aumento de bajo a moderado de 0.2 decenas por encima de 10A0. En muchos casos, este tipo de aumento será aceptable. La Sección B también indica que sobre la base de la magnitud del diámetro de burbuja, el conjugado PC5/PC5.5 se puede considerar como el principal contribuidor al aumento global de DL en el canal de detección 6.
Por tanto, en un procedimiento típico el usuario puede seleccionar una configuración de hardware particular, que puede implicar ciertos filtros (p. ej. filtros pasobanda) asociados con diversos detectores. En algunas realizaciones, una configuración de hardware particular puede ser asignada o predeterminada, sin permitir este tipo de selección. Diversas configuraciones de hardware pueden tener valores asociados de factor de distorsión. En algunos casos, las configuraciones de hardware o datos de distorsión pueden ser recuperados de una base de datos. Por ejemplo, una base de datos puede incluir datos que indican que un factor de distorsión para una configuración particular de detector pasobanda (p. ej. infrarrojos) es mayor que alguna otra configuración de detector. Por consiguiente, la sensibilidad y/o el error de medición puede variar sobre la base de la configuración de hardware. En algunas realizaciones, una base de datos puede incluir un número preestablecido de configuraciones de hardware, y el usuario puede seleccionar entre ellas. Por ejemplo, una configuración de hardware particular puede incluir datos relacionados con el sistema de citometría de flujo Navios™ o el sistema de citometría de flujo Gallios™ (ambos disponibles de Beckman Coulter, Brea, California, e E . UU.). En algunos casos, una configuración de hardware particular tendrá un perfil asociado de factor de distorsión. El número de láseres y/o el número de canales de detección contenidos en la configuración de hardware puede tener una influencia en el número de fluorocromos usados en un panel de sonda particular. En algunos casos, las características de los filtros pasobanda influyen en los factores de distorsión. De manera relacionada, la calidad de un PMT u otros detectores tales como un fotodiodo de avalancha pueden influir en los factores de distorsión.
Selección de anticuerpos para diseño y simulación de paneles
La figura 2 representa aspectos de un procedimiento de selección de operario 200, por lo que el operario aporta cierta información de selección de anticuerpo y tinte para usar para seleccionar un panel de anticuerpo. Por ejemplo, como se muestra en la etapa 210a, el operario puede seleccionar un anticuerpo específico para antígeno 1 (p. ej. CD28), opcionalmente junto con un tinte correspondiente (p. ej. FITC) como se indica en la etapa 210b. Además, el operario puede seleccionar anticuerpos adicionales específicos para antígenos respectivos de un perfil de expresión (p. ej. etapas 220a, 230a y 240a), opcionalmente junto con respectivos tintes correspondientes (p. ej. etapas 220b, 220c, 220d). Como se muestra aquí, los parámetros de anticuerpo específicos de antígeno se pueden seleccionar de un menú desplegable de una base de datos, y los tintes también se pueden seleccionar de un menú desplegable de una base de datos. En algunos casos, el proceso de selección de tinte se puede configurar de modo que el operario no selecciona expresamente tinte. En cambio, un tinte asociado con el anticuerpo seleccionado puede ser proporcionado por la base de datos. Según algunas realizaciones, si el usuario no asigna tintes a anticuerpos, entonces el sistema puede identificar los tintes más
apropiados para anticuerpos no asignados sobre la base de consideración del panel de sondas global (sensibilidad, etc.) de la base de datos que proporcionarán todas las conjugaciones disponibles para el respectivo anticuerpo. Los fluorocromos elegidos por el sistema pueden no exponerse hasta que el sistema ha realizado el cálculo e iteraciones necesarios, es decir, cuando ocurre la salida de datos simulados.
Métodos como los descritos en esta memoria pueden plasmar los rasgos de base de datos de desplegables e interfaz de usuario mostrados aquí. Por tanto, el usuario puede designar los antígenos de interés, y la designación de antígeno a su vez influirá en el anticuerpo seleccionado. Según algunas realizaciones, el usuario escogerá directamente anticuerpos en la interfaz. En algunos casos, los antígenos de interés pueden corresponder a un tipo particular de célula, tal como una célula T. Por tanto, un usuario puede seleccionar una colección de anticuerpos que corresponden a un panel de célula T.
El menú mostrado en la figura 2 incluye dos columnas que se pueden presentar al usuario. La columna izquierda corresponde a especificidad de anticuerpo, y la columna derecha corresponde a selección o asignación de tinte. En esta fase en el proceso, el usuario puede tener o no en mente un patrón de expresión particular. Por ejemplo, el usuario puede tener únicamente una lista de antígenos que pueden ser de interés. En algunos casos, un usuario puede saber cuando seleccionar ciertos antígenos si es deseable ser más sensible cuando se selecciona un tinte o como alternativa, menos sensible. De manera relacionada, una base de datos a menudo incluirá datos relacionados con la densidad de expresión de un antígeno particular, y estos datos se pueden tener en cuenta cuando el sistema selecciona o asigna el tinte. En algunos casos, la densidad de expresión puede depender de un tipo particular de célula. Por ejemplo, la base de datos puede incluir información que un marcador particular se expresa mínimamente en un tipo de célula, mientas que el mismo marcador se expresa altamente en otro tipo de célula. Si un usuario no selecciona un tinte para ir junto con un anticuerpo seleccionado, el sistema puede tener en cuenta otros rasgos, tales como el tipo de célula, cuando se recomienda o asigna un tinte para ese anticuerpo. Según algunas realizaciones, en esta fase en el proceso el sistema incluso no asignará un tinte en caso de que el usuario no seleccione uno.
Típicamente, tintes diferentes tendrán brillos diferentes cuantificados por el rendimiento cuántico y el coeficiente de absorción del tinte, que indican cuánto de la luz que pasa es absorbida y cuánto de la luz absorbida por el tinte se traducirá en emisión de fluorescencia, respectivamente. En muchos casos el coeficiente de absorción y el rendimiento cuántico se corresponden entre sí. Por ejemplo, un tinte PE se considera que tiene una alta absorción y rendimiento cuántico, y un alto porcentaje de la luz absorbida se traducen en emisión de fluorescencia. En contraste, FITC tiene un menor coeficiente de absorción y rendimiento cuántico, y un menor porcentaje de la luz absorbida se traduce en emisión de fluorescencia. Como resultado, la selección de un tinte particular puede determinar la sensibilidad que se puede lograr. Por tanto, usar PE puede conferir la capacidad de lograr una sensibilidad más alta, en comparación con el uso de FITC (p. ej. incluso teniendo en cuenta que una única molécula de anticuerpo se puede unir covalentemente a varias moléculas de FITC debido al pequeño tamaño de la molécula de FITC (< 1 kD) que no se puede realizar la gran molécula de PE (>200 kD)).
En algunos casos, el usuario puede elegir si aceptar una o más de las selecciones de tinte predeterminadas proporcionadas por el sistema base de datos. Opcionalmente, el usuario puede elegir modificar las selecciones predeterminadas. Según algunas realizaciones, en esta fase en el proceso el sistema puede no recomendar tintes para usar con anticuerpos ya que el intervalo de información completo proporcionado por todas las interfaces de usuario aportadas puede ser necesario seleccionar tintes apropiados para los anticuerpos. De manera relacionada, un sistema base de datos puede incluir cierta densidad de expresión supuesta para un antígeno típico/particular de célula T (p. ej. antígeno CD3). Cuando se selecciona una especificidad de antígeno particular, el sistema puede recuperar una densidad de expresión particular que es típica para un antígeno en cierto tipo de célula. Por ejemplo, cuando se selecciona un anticuerpo específico para un antígeno CD3, la base de datos puede incluir información de relación que asocia el antígeno CD3 con una célula T. Como otro ejemplo, un usuario puede seleccionar especificidad de anticuerpo para CD16, CD38, y similares. Algunos antígenos tienen diversas densidades de expresión, presentes en diversos tipos de células. Por tanto, densidades de expresión pueden variar entre células T, células B, y monocitos, por ejemplo. Por ejemplo, cuando se selecciona una especificidad de antígeno, la base de datos puede tener tres densidades de expresión típicas, para tres tipos de célula diferentes. En algunas realizaciones, el usuario puede optar por modificar una densidad supuesta o predeterminada, si se desea.
Las figuras 2A, 2B y 2C ilustran rasgos similares de selección de operación para objetivo de fenotipo, exclusión de fenotipo, y esquemas progenitor/descendiente, respectivamente. La figura 2D representa rasgos de selección de operación para parámetros de densidad de antígeno.
Como se muestra en la figura 2A, el usuario tiene la opción de definir diversos fenotipos, si se desea, sobre la base de la selección de anticuerpos que pueden estar contenidos en una base de datos. En algunas realizaciones, información sobre patrones típicos de coexpresión de antígeno que coinciden con los fenotipos definidos se pueden incluir en una base de datos como patrones típicos preseleccionados o predefinidos de coexpresión de antígeno. La base de datos puede incluir información predeterminada sobre los patrones de coexpresión de antígenos que ocurrirán usualmente. Esto es menos específico que fenotipos celulares predefinidos y permite combinaciones de antígenos que no ocurren en la misma compuerta. Como un ejemplo, la célula T es un tipo prominente de fenotipo de célula que se usa en citometría. Opcionalmente, un usuario puede definir su propio fenotipo. En algunos casos, un usuario puede asignar cierto patrón de expresión a un fenotipo. Como se muestra aquí, el usuario también tiene la opción de omitir esta etapa, y no especificar
un fenotipo. Cuando se selecciona un fenotipo particular, la base de datos puede proporcionar un conjunto asociado de anticuerpos específicos de antígeno. Según algunas realizaciones, el usuario puede definir el fenotipo al escoger directamente anticuerpos. Por ejemplo, si un tinte se ha asignado a un anticuerpo en la figura 2, entonces la fórmula puede exponer esta preselección en la columna derecha en respuesta a escoger el anticuerpo respectivo en la columna izquierda de la figura 2A. La columna en el lado derecho puede permitir al usuario preseleccionar tintes, a modo de autollenado. Según algunas realizaciones, en esta fase en el proceso el usuario puede no ser capaz ya de asignar tintes a anticuerpos (p. ej. como se ha hecho en la figura 2). Sin embargo, si el usuario ha asignado tintes a anticuerpos en la figura 2 entonces estos tintes se expondrán en la columna derecha al escoger los anticuerpos respectivos en la columna izquierda. En algunos casos, es posible seleccionar entre diferentes fenotipos, o priorizar fenotipos. Por ejemplo, se pueden priorizar fenotipos sobre la base de un objetivo de población, o sobre la base de un antígeno particular que debe ser detectado en un fenotipo particular. En algunos casos, el sistema puede priorizar un antígeno sobre la base de densidad de expresión. Por ejemplo, a un antígeno con una baja densidad de expresión se le puede dar una prioridad alta.
Como se muestra en la figura 2B, el usuario tiene la opción de seleccionar diversos exclusiones de fenotipo, si se desea, que pueden estar contenidas en una base de datos. Por ejemplo, una base de datos puede contener información que indica que cierto antígeno nunca ocurre en la misma superficie celular con otro cierto antígeno. Opcionalmente, el usuario puede definir ciertas exclusiones. Como se representa aquí en la columna izquierda, el usuario puede definir una primera exclusión, que corresponde a un anticuerpo que fue seleccionado antes como se trata en relación a la figura 2 y se expone en la sección de encabezado de la columna izquierda. El usuario puede seleccionar múltiples exclusiones de esta manera, para múltiples anticuerpos del panel. Por ejemplo, el usuario puede indicar que un antígeno CDX va a ser exclusivo de antígenos CD-Y y CD-Z. Tales selecciones pueden tener un impacto en una exposición gráfica para un panel de sonda, como se trata en otra parte en esta memoria. Según algunas realizaciones, la exclusión de un antígeno particular puede no influir en un respectivo límite de detección, porque únicamente etiquetas que están en la misma superficie celular pueden influir en los límites de detección de canal de las otras. Esto es, una vez los antígenos no están en la misma superficie celular, los tintes de etiqueta tampoco estarán en la misma superficie celular, y por tanto puede no haber interferencia entre sus respectivos espectros de emisión. Como se muestra en la figura 2B, el usuario también tiene la opción de no especificar exclusiones.
En algunos casos, un usuario puede seleccionar dos antígenos que nunca se expresan juntos. Opcionalmente, la base de datos puede hacer ciertas suposiciones en relación con exclusiones. Por ejemplo, el sistema puede suponer que un marcador de célula T particular y un marcador de célula B particular son exclusivos entre sí. En algunos casos, un sistema puede permitir a un usuario indicar que no hay exclusiones. Por consiguiente, se pueden presentar al usuario diversas opciones, incluidas (a) aceptar exclusiones proporcionadas por la base de datos, (b) asignar activamente exclusiones, y/o (c) no asignar exclusiones, de manera que cualquier antígeno puede ocurrir con otro antígeno, en cualquier célula.
Como se muestra en la figura 2C, el usuario tiene la opción de seleccionar diversas relaciones progenitor-descendiente, si se desea, que pueden estar contenidas en una base de datos. Por ejemplo, una base de datos puede contener información que indica que cierto antígeno tiene una relación de progenitor o descendiente con otro antígeno. Opcionalmente, el usuario puede optar por no especificar este tipo de relación. Como se representa aquí en la columna izquierda, el usuario puede definir un primer progenitor y cualquier descendiente relacionado, que pueden corresponder a anticuerpos que fueron seleccionados antes como se trata en relación a la figura 2. Como ejemplo de un esquema progenitor-descendiente, una relación progenitor-descendiente puede significar que un marcador de progenitor expresado en célula de progenitor, y que la célula A expresa la proteína de progenitor además de proteína de subpoblación/descendiente A, y que la célula B expresa la proteína de progenitor proteína además de una proteína de subpoblación/descendiente B. Por ejemplo, una célula T progenitor puede incluir un antígeno CD3, y algunos dependientes de célula T pueden expresar antígeno CD3 junto con un antígeno CD4 de célula hijo, y algunos dependientes de célula T pueden expresar antígeno CD3 junto con un antígeno CD8 de célula hijo. La expresión de CD4 y CD8 en las células hijas puede ser mutuamente exclusiva. Por ejemplo, las células hijas pueden ser ya sea CD4+/CD8-o CD4-/CD8+. En algunos casos, cada célula hija CD4+ es CD3+, cada célula hija CD8+ es CD3+. De esta manera, relaciones progenitor-descendiente se pueden considerar que tienen un efecto en patrones de expresión. De manera relacionada, relaciones progenitor-descendiente se pueden considerar que tienen un impacto en la relevancia de distorsión asociada. Como ejemplo, si un descendiente antígeno se etiqueta con un tinte provocará una distorsión en el canal donde se detecta el progenitor etiquetado antígeno, entonces puede no ser necesario tener en cuenta esta distorsión. Por ejemplo, donde todas las células CD4+ también son positivas para CD3, puede no haber CD4+ que esté en el fondo (p. ej. no hay CD4+ que también es CD3-). En algunos casos, una etiqueta de progenitor CD3 puede provocar distorsión en un canal CD4 hijo.
Por tanto, las relaciones progenitor-descendiente pueden tener un efecto en distorsión de fondo. Donde se aplica distorsión a una población de positivos, se podría describir como población que están en un intervalo más alto de la escala logarítmica. En algunos casos relacionados, este tipo de error de medición puede no ser sustancialmente relevante con relación al límite de detección del canal en el que se detecta la población de positivos. Según algunas realizaciones, no hay efecto provocado por una relación progenitor-descendiente distinta a hacer un desbordamiento y distorsión relacionada independiente de si el desbordamiento ocurre desde canal de descendiente a canal de progenitor. Si el desbordamiento ocurre de progenitor al canal de descendiente se aplica la distorsión "normal".
Como se trata en otra parte en esta memoria, el canal primario de detección para un fluorocromo particular es el canal donde el usuario pretende detectar la señal asociada con ese fluorocromo. Respecto a un único canal primario, puede haber uno o más canales secundarios (p. ej. donde un fluorocromo para el canal primario tiene espectros de emisión que desbordan a los otros canales). Por ejemplo, un sistema se puede configurar para detectar principalmente tinte PE en un canal FL2, incluso los espectros de emisión PE pueden desbordar a otros canales, tales como FL3, FL4, FL5, y similares. En este sentido, los canales secundarios pueden indicar donde se detectan intensidades de señal no deseadas. Tales características de desbordamiento se pueden usar junto con relaciones progenitor-descendiente para evaluar o configurar diseños de panel de sonda. En algunos casos, una sonda se puede asignar a un canal primario, mientras que tiene fuerte desbordamiento a un canal secundario, donde el canal secundario representa un canal de progenitor. Como también se describe en otra parte en esta memoria, esquemas progenitor/descendiente para poblaciones típicas se pueden representado en una base de datos. En algunos casos, el usuario puede optar por proceder con un esquema progenitordescendiente predeterminado. En algunos casos, un usuario puede optar por definir su propio esquema progenitordescendiente. En algunos casos, un usuario puede optar por especificar que no hay esquemas progenitor-descendiente. Por ejemplo, con relación a análisis de trastornos de células sanguíneas, ciertos patrones de expresión pueden ser inusualmente aberrantes. En tales casos, puede ser deseable que el usuario indique que no hay relaciones progenitordescendiente.
Como se muestra en la figura 2D, el usuario tiene la opción de seleccionar ciertos parámetros de densidad de antígeno, si se desea, que pueden estar contenidos en una base de datos. Por ejemplo, densidades de antígenos predeterminadas pueden estar contenidas en la base de datos. Tales valores predeterminados pueden referirse a poblaciones típicas que están presentes en sangre periférica humana. Se pueden implementar otros tipos de valores predeterminados. Por tanto, dependiendo de si un usuario está interesado en evaluar material asociado con cultivo celular, o material asociado con médula ósea, por ejemplo, puede haber disponibles diferentes valores predeterminados y/o densidades de expresión.
Como también se representa en la figura 2D, para anticuerpos individuales, es posible seleccionar un fenotipo como indexado según la figura 2A. Cada anticuerpo seleccionado para un fenotipo particular se puede representar en un histograma. Además, un usuario puede tener la opción de aceptar o modificar lo que se considera una densidad de expresión típica. Con referencia a la barra debajo de la histograma, se puede mover un botón para desplazar la población de positivos vs. la población de negativos. Así, es posible influir en la ratio señal a ruido que se puede suponer para una población particular. Cambios en la ratio señal-a-ruido pueden influir en la diafonía o desbordamiento que se puede esperar que esté presente en otros canales. Según algunas realizaciones, los términos diafonía y desbordamiento se pueden usar de manera intercambiable. Por tanto, donde se supone que hay señal más brillante, o donde se selecciona o ajusta una señal más brillante, se puede suponer que hay mayor cantidad de diafonía o desbordamiento en otros canales. En algunos casos, un usuario puede optar por proceder con un valor predeterminado (p. ej. densidad de antígeno y/o intensidad de señal). En algunos casos, un usuario puede modificar intensidades de señal según las características esperadas de un fenotipo deseado particular, tal como una población de células T o una población de monocito o una población de célula no humanas o una población no relacionada con sangre periférica humana o médula ósea u otros.
La figura 3 representa aspectos de una técnica de selección de panel de sonda 300 según realizaciones. Como se muestra aquí, datos tales como parámetros de anticuerpo seleccionados por usuario 310 (p. ej. como se describe en la figura 2), una configuración de dispositivo de citometría de flujo 320 (p. ej. como se describe en la figura 1), y una base de datos de anticuerpos 330, se pueden aportar a un módulo de simulador 340 o este puede acceder a ellas, que funciona para combinaciones óptimas propuestas según fenotipos y/o expresiones de antígeno priorizados, y para producir gráficas (p. ej. A, B, y C) que muestra límites de detección y separaciones de población sobre la base de paneles de sonda simulados. Como se ilustra mediante la etapa 350, es posible seleccionar un panel de sonda sobre la base de las simulaciones. En la realización representada aquí, el panel de sonda seleccionado es para configuración de dispositivo de citometría de flujo que tiene canales de detección de tres láseres y diez colores (PC5 y PC5.5 pueden ser detectados por el mismo canal). El panel incluye conjugados anticuerpo-tinte específicos para diez antígenos CD.
La siguiente Tabla 1 representa aspectos de un listado ejemplar de sondas que se pueden asociar con las sondas de base de datos o se parte de estas. Como se representa aquí, sondas individuales pueden incluir un anticuerpo u otro agente de unión específico a un antígeno particular, conjugado con un tinte.
Se entiende que una estructura celular o superficial tal como un grupo de diferenciación (CD) y el anticuerpo dirigido contra la estructura o grupo pueden ser referidos de manera intercambiable. Por ejemplo, a un anticuerpo que reconoce grupo de diferenciación 3 (CD3) también se puede le hace referencia como CD3 o anticuerpo CD3. En algunos casos, se puede usar el término anticuerpo anti-CD3. En algunos casos, hay estructuras celulares a las que no se ha asignado un número CD. En tales casos, el nombre de la propia estructura también se puede usar para nombrar el anticuerpo. En algunos casos, se puede usar la nomenclatura de un anticuerpo anti-"estructura".
Como se trata en otra parte en esta memoria, según un patrón de expresión que se recupera de una base de datos (o supuesto o asignado por un usuario), un patrón de expresión particular puede corresponder a un esquema de coexpresión, un esquema de exclusión específico, o un esquema progenitor-descendiente. En algunos casos, antígenos seleccionados se pueden asignar a cierto fenotipo. Sobre la base de estas categorías de información, es posible exponer gráficamente datos en representaciones de trazados bivariados de puntos tales como los mostrados en los Paneles A, B, y C. En algunos casos, las representaciones también pueden incorporar estimaciones de distorsión de fondo.
Como se muestra aquí, la población X puede reflejar casos donde la intención es detectar antígeno X en una población particular. En el panel A, hay una bisagra abrupta de la línea recta que delimita el cuadrante superior izquierdo del cuadrante superior derecho, que indica un fuerte aumento en un límite de detección para antígeno Y para la población que expresa antígeno Y dependiendo de la densidad de antígeno Y. Estas características de límite de detección son muy diferentes de las del antígeno X para la población que expresa antígeno Y. La línea que delimita el cuadrante inferior derecho del cuadrante superior derecho no tiene bisagra pero está paralelo con el esbozo del diagrama que indica así que no hay dependencia del límite de detección para antígeno Y de la densidad de expresión del antígeno X en células respectivas. Por tanto, esta salida gráfica puede indicar al usuario que esta opción particular puede no ser óptima.
Por tanto, donde el usuario selecciona o aporta un patrón de expresión de antígeno particular (p. ej. como asociado con parámetros de anticuerpo 310), el sistema puede recuperar ciertos conjugados anticuerpo-tinte de una base de datos sobre la base de la selección o aporte de usuario. El usuario puede entonces observar las diversas salidas gráficas asociadas con el patrón de expresión de antígeno. Según algunas realizaciones, el sistema puede generar una propuesta optimizada de panel de sondas según selecciones de antígeno hechas por el usuario. Según algunas realizaciones, un usuario puede seleccionar un perfil de especificidad de anticuerpo o patrón de expresión de antígeno particulares, y el sistema puede retornar una permutación de todas las combinaciones de conjugados posibles para el perfil o el patrón. En algunos casos, el sistema puede exponer combinaciones de conjugados seleccionadas según antígenos priorizados. Por tanto, puede haber una jerarquía de prioridad para ciertos antígenos, y la jerarquía se puede usar para determinar qué combinaciones de conjugados se espera que entreguen resultados óptimos con relación a sensibilidad y qué combinaciones de conjugados exponer en una salida gráfica. Según algunas realizaciones, el sistema puede retornar combinaciones de conjugados optimizadas según conjugados/fenotipo priorizados relacionados con patrones de expresión de brillo de fluorocromo y similares. En algunos casos, se pueden priorizar antígenos sobre la base de sensibilidad. Por ejemplo, puede ser deseable tener una sensibilidad más alta para un antígeno, mientras que una especificidad más baja para un segundo antígeno se considera suficiente.
Como se trata en otra parte en esta memoria, la salida gráfica puede ser influenciada por diversos factores. Por ejemplo, la exposición puede depender del patrón de expresión, la configuración de dispositivo de citometría de flujo, y/o las sondas características (p. ej. si tintes considerados como óptimos para una especificidad dada dentro de una combinación dada de anticuerpos, o tintes específicamente seleccionados).
Según algunas realizaciones, algunas o todas las entradas recuperadas de la base de datos puede ser predeterminada. De manera relacionada, algunas o todas las propuestas para paneles de sonda recomendadas por el sistema se pueden calcular sobre la base de un conjunto global de antígenos inclusivo de patrones de expresión. Por ejemplo, diez conjuntos predeterminados para diez antígenos puede tener como resultado una recomendación diferente de panel de sondas cuando, por ejemplo, el usuario elige diferentes patrones de expresión esperada. La modificación de ciertos parámetros, tales como un patrón de expresión o una intensidad de señal, puede tener como resultado un cambio en la exposición. En algunos casos, una exposición de simulación puede indicar una recomendación particular del sistema. En algunos casos, una exposición de simulación puede mostrar salida según tintes preestablecidos. En algunos casos, una exposición de simulación puede mostrar salida según un caso mixto, donde algunos tintes son seleccionados por el
usuario y algunos tintes son seleccionados por el sistema. Según algunas realizaciones, sistemas pueden retornar combinaciones de conjugados optimizadas según conjugados/fenotipo priorizados relacionados con patrones de expresión de brillo de fluorocromo y similares. Antígenos relevantes para cierto fenotipo se pueden mostrar en trazados bivariados de puntos u otras representaciones. En la figura 3, se muestran tres trazados. Realizaciones de la presente invención abarcan la exposición de cualquier número de trazados. Por ejemplo, donde se seleccionan cinco antígenos, puede haber diez trazados, como se representa en la Tabla 2.
Según algunas realizaciones, el usuario puede revisar el trazado de salida de exposición, y tener en cuenta cualquier antígeno que se haya priorizado, cualquier conocimiento de objetivos de poblaciones, y/o cualquier conocimiento de objetivo de antígenos de coexpresión, y entonces evaluar los límites de detección y determinar si se espera o no una gran distorsión. En algunos casos, un sistema puede recomendar un panel de sonda particular, y el usuario puede seleccionar el panel recomendado sin tener en cuenta lo que se muestra en una exposición gráfica.
Por ejemplo, en el caso donde CD3 se coexpresa con un antígeno particular, y hay una distorsión significativa en la población porque hay muchos antígenos que se desbordan al canal de detección, el usuario puede decidir no proceder con este tipo de panel de sonda. El usuario puede entonces volver a cualquier etapa como se ve en las figuras 2-2D y modificar sus aportes y/o los aportes predeterminados recuperados de la base de datos.
Límites de detección
Un objetivo en citometría de flujo, por ejemplo donde se tintan células con tintes inmunofluorescentes, es analizar proteínas o marcadores que se expresan en la superficie o dentro de la célula. De esta manera, es posible categorizar células (o subconjuntos de células) ya sea como positivas o negativas en cuanto a un antígeno o un marcador particulares. Por tanto, por ejemplo, algunas células pueden ser consideradas "negativo" para un marcador o antígeno particulares, y otras células pueden ser consideradas "positivo" para un marcador o antígeno particulares. A fin de determinar si una célula es negativo o positivo, puede ser útil definir un umbral de intensidad de señal, por lo que células que expresan niveles de antígeno mínimo o inexistentes para producir una intensidad de señal por debajo del umbral se consideran "negativo" y células que expresan suficientes niveles de antígeno para producir una intensidad de señal por encima del umbral se consideran "positivo". Este tipo de umbral de intensidad de señal también puede ser referido como límite de detección.
Por tanto, en algunos casos, un límite de detección puede referirse a un umbral entre un acontecimiento negativo y un acontecimiento positivo en una escala particular. Esto es, puede haber un corte positivo/negativo, por lo que un nivel indetectable o bajo de señal o fluorescencia corresponde a un acontecimiento negativo. En algunos casos, fluorescencia no específica puede corresponder a un acontecimiento negativo. En contraste, un nivel suficientemente alto de señal o fluorescencia se puede considerar como acontecimiento positivo.
Como se trata en otra parte en esta memoria, un límite de detección particular se puede basar en una formulación que implica datos de isotipo, intensidades de fluorescencia, factores de distorsión, y similares.
Tinción de control de isotipo
Un protocolo típico de inmunofenotipificación implica etiquetar células de una muestra biológica con conjugados anticuerpo-tinte que se une específicamente a proteínas en la superficie de las células. De esta manera, se pueden analizar proteínas expresadas por las células. Debido a la naturaleza de las sondas de conjugado sin embargo, puede ocurrir unión no deseada no específica entre sondas y células. Esto es, una sonda particular puede unirse a cierta célula, aunque esa sonda no esté diseñada para unirse a la célula.
Se pueden usar anticuerpos de control de isotipo para proporcionar un control negativo para tal unión no específica o fluorescencia. Típicamente, el control de isotipo se genera del mismo anfitrión del que se genera el anticuerpo de sonda. Por ejemplo, si un anticuerpo de una sonda de conjugado se genera de un ratón, entonces el anticuerpo de isotipo usado para controlar esa sonda también se genera de un ratón. Además, el isotipo se puede generar de modo que tenga una especificidad para un antígeno que se conozca que no ocurre en la muestra (o que de otro modo no ocurre en un objetivo de célula).
Cuando se entinta una muestra con un control de isotipo, la señal resultante puede ser una indicación de unión no
específica de un conjugado anticuerpo-tinte a una superficie celular. De esta manera, se puede usar control de isotipo para evaluar el nivel de intensidad de fondo que puede ocurrir en un procedimiento de tinción de conjugado. Por ejemplo, el control de isotipo puede significar el nivel alrededor del cual la intensidad de fluorescencia obtenida con una sonda se puede considerar específica. Esto es, si cuando se realiza la tinción con la sonda diseñada, una señal detectada supera el nivel de intensidad de fondo proporcionado por el control de isotipo, entonces es posible inferir que la señal detectada corresponde a un acontecimiento positivo.
En la práctica, se puede usar un control de isotipo para distinguir unión específica de unión no específica, para establecer especificidad o controles de catalogación por compuerta, para designar la ubicación de compuertas o regiones gráficas o fronteras usadas para clasificar células, para determinar positividad o negatividad para antígenos particulares, para asignar fronteras positivo/negativo en los datos, y similares. En procedimientos de citometría de flujo se pueden usar controles de anticuerpo de isotipo. Puede ser particularmente útil usar controles de anticuerpo de isotipo cuando se emplean múltiples tinciones en un procedimiento de citometría de flujo.
En algunos casos, por ejemplo donde un antígeno tiene una expresión bimodal distinta, sin solapamiento entre población de positivos y de negativos (p. ej. CD4 y CD8 en células T), puede ser posible proceder sin uso de un control.
Los controles de isotipos pueden ayudar a dirigir cuestiones de señal a ruido en un protocolo de análisis celular. Cuando se determina si un patrón de expresión o célula de interés puede ser positivo para un marcador dado, un control de isotipo puede ayudar a optimizar la sensibilidad de resolución sin sacrificar indebidamente la especificidad. Cuando se usa un control de isotipo, es posible evaluar si una señal detectada puede corresponder a únicamente unión no específica, o a alguna combinación de unión no específica y específica. Como se trata en otra parte en esta memoria, los controles de isotipos pueden ser útiles para determinar un límite de detección. Los isotipos pueden contribuir al fondo, y el solapamiento espectral o el desbordamiento pueden contribuir al dispersión de fondo, ambos de ellos pueden jugar un rol en la sensibilidad.
La figura 4 representa ciertos aspectos de señalización de isotipo y sensibilidad de resolución. Por ejemplo, como se muestra en el panel A, la señal de isotipo en la izquierda corresponde a un acontecimiento negativo, y la señal detectada en la derecha corresponde a un acontecimiento positivo. Aquí, la población de negativos tiene bajo fondo respecto a la población de positivos, y las poblaciones se puede resolver fácilmente (p. ej. con un límite de detección bien definido). En contraste, el panel B muestra una situación donde la población de negativos tiene alto fondo respecto a la población de positivos, y por lo tanto puede ser difícil resolver las poblaciones. De manera relacionada, el panel C muestra una situación donde la población de negativos tiene bajo fondo (respecto a la población de positivos) y un alto coeficiente de variación (CV), y por lo tanto puede ser difícil resolver las poblaciones. Este tipo de situación puede estar presente donde un control de isotipo presenta desbordamiento significativo. Por tanto, a fin de poder resolver poblaciones de negativos y de positivos, es útil tener una señal negativa con bajo fondo respecto a la señal positiva, y tener una señal negativa con una baja dispersión o varianza.
Como se trata en otra parte en esta memoria, un tinte en una sonda puede presentar una emisión que desborda a un canal específico pretendido para detectar emisión desde un tinte de otra sonda. En tales casos, el desbordamiento puede ser análogo a la dispersión de datos de la población de negativos como se ha descrito anteriormente.
En algunos casos, la amplitud de la población en un canal secundario puede aumentar debido a dispersión de datos provocados por desbordamiento de otra etiqueta fluorescente en la misma población detectada en un canal primario, lo que puede contribuir a un aumento en un límite de detección en el canal secundario. Por ejemplo, conforme aumenta el error de medición para una población de negativos, la amplitud de distribución también puede aumentar. En algunos casos, puede haber un gran error de medición, y una señal detectada en un canal secundario en presencia de desbordamiento desde un canal primario puede estar más allá de un control de señal de isotipo en un canal secundario en ausencia de un desbordamiento desde un canal primario, incluso todavía puede corresponder a un acontecimiento negativo. En algunos casos, el desbordamiento puede contribuir a un aumento en el límite de detección.
Por ejemplo, un aumento en la cantidad de desbordamiento a un canal de detección particular puede funcionar para aumentar el límite de detección para ese canal. Esto se puede asociar con un error de medición más grande que es provocado por una detección de fluorescencia más intensa en ese canal particular.
En algunos casos, se puede usar un anticuerpo de isotipo para obtener una línea de referencia. En algunos casos, se puede usar una célula no tintada para obtener una línea de referencia. Cuanto mayor es el número de etapas de lavado aplicadas tras la tinción durante el proceso más probable es que la funcionalidad de isotipo se aproxime a la funcionalidad de la población de células sin tintar, con respecto a la fluorescencia de fondo. Esto es, un lavado extenso puede funcionar para igualar el fondo, de manera que aunque se ha añadido tinción de isotipo, la lavado actúa para retirar todo el isotipo unido no específicamente.
Tras un protocolo de tinción con un panel de sonda multicolor, puede haber diversos fluorocromos asociados con la superficie celular. A fin de valorar la positividad específica para un antígeno detectado por un único cierto conjugado en esas células, puede ser útil tener en cuenta la emisión de todos los otros fluorocromos en esas células, que pueden funcionar para aumentar el límite de detección para ese único fluorocromo particular.
Intensidad de fluorescencia
Típicamente, la citometría de flujo implica el uso de tintes o fluorocromos que tienen ciertas propiedades, tales como intensidad de fluorescencia o valores de brillo. Por ejemplo, el tinte PE puede tener una intensidad de brillo de 3420000, mientras que FITC puede tener una intensidad de brillo de 39000. Estas intensidades pueden ser medidas relativamente entre sí, habiéndose elegido un tinte como referencia para máxima intensidad. Como se trata en otra parte en esta memoria, la intensidad de fluorocromos individuales se puede considerar cuando se evalúan paneles de sonda.
Distorsión
Una distorsión de una población de fondo y por tanto un aumento de un límite de detección puede corresponder al número de fluorocromos de desbordamiento en la superficie celular o dentro de la célula o a la intensidad de la señal de desbordamiento relacionada al respectivo canal de detección. Por tanto, por ejemplo, una mayor cantidad de desbordamiento puede corresponder a una distorsión de fondo más amplia. En algunos casos, es posible considerar el número de anticuerpos unidos a la superficie celular, este tipo de mayor número de anticuerpos etiquetados con ese fluorocromo de desbordamiento particular se considera que contribuye más a la distorsión de fondo. En algunos casos, una base de datos puede contener estimaciones de la distorsión del fondo, por ejemplo sobre la base de intensidades supuestas que son típicas para cierto tipo de célula. En otras palabras, la distorsión se puede basar en el número de anticuerpos etiquetados con fluorocromos de desbordamiento que se unen a este tipo de célula.
Como ejemplo, es posible considerar una célula T que expresa antígeno CD3 junto con algún otro antígeno Z coexpresado. Típicamente, las células T tienen una expresión muy fuerte de CD3 en la superficie. Por tanto, cuando se tinta con una sonda anti-CD3 que está pensada para proporcionar señal de emisión a un canal particular, es posible que la sonda de conjugado de tinte de anticuerpo CD3 de hecho cree diafonía con el canal que se pretende que detecte para la sonda Z, entonces se puede aumentar el límite de detección para la sonda Z. Cuando se lleva a cabo un experimento multicolor, pueden ocurrir patrones de desbordamiento complejos. Por ejemplo, para un experimento de diez colores, puede ser necesario tener en cuenta desbordamiento desde otros nueve colores cuando se considera un canal de detección particular. Esto es, cada uno de los otros nueve colores puede contribuir a un aumento del límite de detección para ese canal particular. En algunos casos, la distorsión puede ser dependiente del tipo de célula y los patrones de expresión relacionados que se están analizando. En algunos casos, la distorsión puede ser dependiente del número de anticuerpos unidos en el tipo de célula que lleva fluorocromo de desbordamiento.
Volviendo al ejemplo de la sonda anti-CD3, es posible considerar una célula T (alta densidad de antígeno de CD3) y una célula B (ausencia de antígeno CD3), donde ambas de la célula T y la célula B expresan un antígeno Z. Cuando se tinta una célula T con la sonda CD3, ese tinte puede proporcionar un desbordamiento al detector de canal Z, aumentando así el límite de detección del canal Z. En contraste, cuando se tinta una célula B con esa misma sonda CD3, no hay unión (específica) porque CD3 está ausente en la célula B, y por tanto no hay desbordamiento desde el tinte de sonda CD3, y la sonda CD3 no se considera que provoque un aumento en el límite de detección en el canal Z. Por tanto, se puede ver que factores de distorsión pueden variar dependiendo del tipo de célula y patrones de expresión de antígeno relacionados. Por ejemplo, un canal de sonda particular puede tener como resultado un conjunto de límites de detección para un tipo de célula, y otro conjunto de límites de detección para otro tipo de célula. De manera relacionada, el conjunto de límites de detección para un canal de sonda particular puede depender de qué tipos de antígenos se expresan en las células que se están analizando.
Por ejemplo, donde un tipo de célula está libre de antígeno A (y por tanto no unión por una sonda específica para ese antígeno), puede no observarse un aumento en el límite de detección en un canal de detección que es específico para el antígeno B. En contraste, donde un tipo de célula abundante expresa el antígeno A (que se une por una sonda para el antígeno A, que también proporciona desbordamiento al canal de detección para antígeno B), entonces puede haber un aumento en el límite de detección en el canal de detección que es específico para el antígeno B. De esta manera, el aumento en el límite de detección (o carencia de aumento) se puede basar en el patrón de expresión de las células tintadas.
El factor de distorsión puede así tener un impacto en el límite de detección. Por ejemplo, donde hay un aumento en el límite de detección (p. ej. un aumento de decena debido a desbordamiento), puede ser necesario observar o detectar una mayor señal en ese canal a fin de concluir que hay un acontecimiento positivo.
Por ejemplo, con referencia a la figura 8, se puede ver que hay fuerte desbordamiento desde el tinte PE (de la sonda CD4-PE) al canal FL3 que detecta ECD. Debido al desbordamiento, la señal ECD no compensada de la población etiquetada PE específicamente es unos pocos cientos de veces más brillante que la de señal ECD no compensada de la población de fondo etiquetada PE no específicamente, en comparación con una tinción de isotipo no específica.
En algunos casos, con un aumento en la señal, hay un aumento en la dispersión de la población CD4+. Por tanto, puede haber una señal PE más grande en esta población. Por consiguiente, para la etiqueta FL3 (eje-y) puede haber un aumento en el límite de detección.
Compensación
Típicamente, una señal de fluorescencia más alta puede ser acompañada por un mayor error de medición absoluto. Por ejemplo, con referencia a la figura 5, la población de positivos PE provoca una señal en el canal de detección FL3 para ECD, debido a desbordamiento de la emisión de tinte PE al canal de detección FL3 ECD, y por tanto los errores absolutos pueden ser mucho más altos para esta población. Esto se puede representar como desviación típica. En algunos casos, los errores de medición pueden ser afectados según características de distribución de Poisson y no se pueden reducir mediante procedimientos de compensación, ya que estos únicamente pueden corregir la intensidad media de una población específicamente etiquetada con conjugados de desbordamiento versus una población etiquetada no específicamente con conjugados de desbordamiento. Si una comparación de errores de medición relativos (como se representa mediante respectivos coeficientes de variación CV) indica un suficiente grado de similitud, esto puede ser un signo de linealidad de detección.
En algunos casos, puede haber un factor de dos entre coeficientes de variación, de manera que los CV son relativamente similares y de la misma magnitud, e incluso la desviación típica puede ser mayor de 100 veces diferente, o más.
Como se representa en las figuras 6A y 6B, valores negativos de fluorescencia, para los acontecimientos de señal de expresión medidos por un PMT de detección PE y por un PMT de detección ECD, trazados entre sí, se pueden generar artificialmente en una distribución bimodal a través de compensación computacional. El cálculo bimodal como se muestra puede funcionar para distinguir acontecimientos que son negativos para el primero de los dos conjugados anticuerpotinte medidos, el segundo de los dos conjugado anticuerpo-tinte medidos, o ambos los dos conjugados anticuerpo-tinte medidos. La figura 7 muestra un aumento en la amplitud de distribución para los acontecimientos de señal de expresión medidos por un PMT de detección ECD y por un PMT de detección PC5, trazados entre sí. La figura 7, en parte, refleja el hecho de que la coexpresión puede afectar a la dispersión de una población de negativos a un canal de desbordamiento. Aunque no se muestra en estas figuras, la dispersión para los acontecimientos positivos es igual a la dispersión para los acontecimientos artificialmente negativos.
Como se muestra en la figura 8, puede haber un aumento en el límite de detección debido a fuerte desbordamiento. En algunos casos, cálculos implementados por medio de software y/o hardware pueden funcionar para corregir el desbordamiento, en un procedimiento de compensación. En cierto punto de compensación, el negativo PE y el positivo PE pueden tener la misma media en el eje ECD, que puede referirse a una compensación correcta (véase, p. ej. la figura 5). Como se representa en la figura 5, la población de positivos PE compensada puede tener un mayor error de medición, de manera que hay una mayor dispersión de datos en comparación con la población de negativos PE. Por tanto, puede haber cierto intervalo de señal ECD que es menos intenso que el aumento de error de medición. Tales señales pueden ya no ser detectable como acontecimientos positivos. En algunos casos, también puede haber una bifurcación de la población compensada.
Cuando se trasforma cierta zona de la escala Y a escalado lineal (véase, p. ej. la figura 7), es posible comprimir el extremo inferior de la escala logarítmica. Tal trasformación puede indicar que el error de medición (p. ej. amplitud, o dispersión) de la población de positivos ECD es mayor que el de la población de negativos ECD. En algunos casos, el desbordamiento desde una población de positivos FL3 (ECD) a un canal de detección FL4 (PC5) se puede traducir en un mayor error de medición tras corrección computacional de intensidades medias referidas como compensación. En algunos casos donde hay fluoroforos de unión a célula que tienen desbordamiento a un canal de detección FL4 (PC5), tales tintes como ECD y PE que se pueden conectar a anticuerpos que detectan estructuras celulares en las mismas células dando como resultado dobles células positivas FL3 (ECD) y FL2 (PE), puede haber desbordamiento superpuesto al canal FL4. Esto puede traducirse en un error de medición superpuesto. Puede ser posible tener en cuenta tal error. Por ejemplo, cada una de las contribuciones a la dispersión de datos global se puede estimar como valor lineal, y los valores lineales se pueden sumar. El resultado puede entonces ser transformado de nuevo a valor logarítmico. Además, una base de datos puede contener información en relación con qué antígenos se pueden expresar en la misma superficie celular. Tal información se puede usar como base para la selección de cuál de las señales de desbordamiento se van combinar para esta población que es FL3 positivo. Por tanto, puede haber tintes que también tienen un desbordamiento al canal FL4 tal como PE, sin embargo los antígenos asociados con tales tintes pueden no expresarse en el mismo tipo de célula que es FL3+, y así no contribuir al error de medición global en este canal.
Según algunas realizaciones, el tipo de célula, o el perfil o patrón de expresión pueden tener un impacto en los resultados. Por ejemplo, los resultados pueden depender del patrón de antígenos que se expresa en la célula, y que es reconocido por las sondas de conjugado de tinte de anticuerpo. Debido al potencial desbordamiento de algunos tintes a canales secundarios, los límites de detección para cada uno de los fluorocromos puede ser influenciado. En algunos casos donde hay desbordamiento, la población en el intervalo negativo de la escala puede ser dispersada o distorsionada, y los límites de detección pueden aumentar. Típicamente, un patrón de expresión particular será único para un tipo de célula. Por ejemplo, es improbable que dos tipos de células diferentes tengan patrones de expresión idénticos. A fin de proporcionar una estimación sobre el aumento en un límite de detección, puede ser útil identificar qué señales de fluorescencia estarán presentes en las células. Por consiguiente, técnicas como se trata en esta memoria abarcan identificar un patrón de expresión para usar para evaluar paneles de sonda.
La gráfica en la figura 8 representa resultados de un protocolo de tinción que usa un anticuerpo específico para antígeno
CD4, conjugado con un tinte PE. Como se muestra aquí, el canal de detección FL3 (sensible a emisión de tinte ECD) está registrando desbordamiento y por tanto distorsión de fondo del fluorocromo PE.
Como ejemplo, es útil considerar una célula T helper que es positiva para CD3 y CD4. En algunos casos, puede ser deseable evaluar la célula para ver si está presente un receptor de citoquina, tal como CD25 (IL-2 receptor) o CD184 (CXCR4). A menudo, un receptor de citoquina tendrá un número de copia menor, y así estar tenuemente tintada, en la superficie de célula T helper. Por tanto, cuando es deseable valorar la tinción de receptor de citoquina en el canal FL3 (ECD), puede no ser deseable asignar un marcador de célula T helper (p. ej. CD4) en el canal PE. Esto es porque las células CD4+ que se tintan con la etiqueta PE presentarán un aumento en el límite de detección en FL3 (ECD) donde se desea la detección de citoquina.
Como se representa en la figura 8, hay un aumento en el límite de detección, asociado con la diferencia entre el límite de detección para la población CD4- y la población CD4+. La línea en la parte inferior del eje-y delimita la población CD al limitar la población de negativos. Esta gráfica particular representa una cantidad significativa de desbordamiento y por tanto distorsión de fondo del espectro de emisión PE al canal de detección ECD. Por tanto, el aumento en el límite de detección es considerable. Comparando este resultado con la población de negativos en el lado izquierdo de la gráfica, se puede ver que se pierde una cantidad sustancial de sensibilidad (p. ej. aproximadamente media decena). Por consiguiente, el número de copias que serían detectadas con la etiqueta ECD tendría que ser múltiples veces (p. ej. 6x) más alto (p. ej. señal más brillante) en una población CD4+, en comparación con una población CD4-, a fin de ser detectadas o registradas como acontecimiento positivo.
En un ejemplo relacionado, es útil considerar un canal de detección diferente, tal como el canal FL5 que está pensado para detectar espectros de emisión del tinte PC7. En este ejemplo, el canal FL5 detecta cierta longitud de onda que es más distante a la emisión del fluorocromo PE. Por tanto, habrá menos desbordamiento de los espectros de emisión PE al canal FL5, y así la pendiente de la línea abisagrada (p. ej. como se muestra en la figura 8) será menos pronunciada. Dicho de otro modo, cuanto menor sea la cantidad de desbordamiento a un canal particular, menor será la pendiente de la línea abisagrada (p. ej. como se muestra en la figura 8) asociada con ese canal.
El valor particular de longitud de onda es otro parámetro que puede impactar en el resultado. A menudo, el intervalo de longitud de onda asociado con un PMT o un detector particulares es al menos en parte determinado por un filtro pasobanda que está delante del filtro. Típicamente, cuanto más grande es la longitud de onda que es detectada por un PMT particular, menos sensible será el PMT, y por tanto el PMT tendrá un mayor error intrínseco. Por ejemplo, un canal de detección PC7 se puede configurar para detectar luz de longitud de onda de más de 755 nm, mientras que un canal de detección PE se puede configurar para detectar luz a una longitud de onda de 575 /- 15 nm. Por consiguiente, puede haber más distorsión asociada con el canal PC7. Estos efectos se pueden factorizar en la base de datos o la tabla. Otro factor que se puede considerar implica la cantidad de luz desbordada a un canal secundario. Por ejemplo, puede ser útil tener en cuenta la cantidad de luz que un tinte particular típicamente desbordaría a otro canal secundario. Se pueden considerar las propiedades del canal secundario, con respecto a error de medición intrínseco, que puede depender de la longitud de onda.
Como se representa en la figura 8, el factor de distorsión es proporcionado por la pendiente de la línea abisagrada (límite de detección). El factor de distorsión se pueden basar en un parámetro de intensidad (p. ej. intensidad de la señal de tinte PE). Además, una mayor longitud de onda en el canal secundario en el eje-y puede corresponder a una mayor pendiente. Por tanto, el factor de distorsión puede aumentar con la longitud de onda. En algunos casos, esto se puede aplicar a la intensidad de la señal PE. Por ejemplo, el factor de distorsión de desbordamiento PE a un canal ECD puede ser diferente del factor de distorsión de desbordamiento PE a un canal de infrarrojos, en que el factor de distorsión para el canal de infrarrojos será mayor. De manera relacionada, como el canal de infrarrojos puede estar a una mayor distancia espectral del canal PE, la cantidad de desbordamiento luz puede ser menor. Típicamente, detectores PMT pueden proporcionar un buen intervalo de linealidad, y por tanto un planteamiento lineal es útil. El factor de distorsión global se puede aproximar o correlacionar con el aumento en el límite de detección. Como se muestra en la figura 8, el factor de distorsión puede ser la pendiente de la línea abisagrada el cuadrante, y por tanto el límite de detección se puede determinar de manera lineal.
En una realización de un cálculo de límite de detección, es posible obtener (i) el valor X en el eje X y (ii) el factor de distorsión o pendiente, y de ese modo generar el valor Y o límite de detección.
Por ejemplo, es posible proporcionar la densidad de expresión relativa FL(x) de una señal que desbordaría (p. ej. sobre la base de densidad de antígeno CD4), y este valor se puede obtener de datos empíricos. También es posible proporcionar la intensidad relativa de fluorocromo de expresión FL(x), por ejemplo de la etiqueta PE, correspondiente al brillo del fluorocromo.
Un planteamiento empírico ejemplar puede implicar tintar una población de células T con una sonda CD4-PE, y evaluar la población de positivos (p. ej. separados por 2.5 decenas de una población de negativos). Se puede generar una tabla de resultados basada en los datos.
Por tanto, al aportar un valor X (p. ej. una estimación según una densidad de expresión típica y brillo de tinte) junto con
una pendiente o relación lineal, es posible determinar el valor Y o límite de detección. Considerando un panel de sonda que incluye múltiples conjugados anticuerpo-tinte, es posible obtener un factor de distorsión para cada una de las etiquetas que proporcionan un desbordamiento al canal FL3. Los resultados pueden variar según el tinte seleccionado. Por ejemplo, una sonda CD4-PE puede proporcionar un mayor grado de separación, y una sonda CD4-FITC puede proporcionar un menor grado de separación.
En algunos casos, los valores pueden ser linealizados, añadidos y la suma de los valores linealizados posteriormente transformada a un valor logarítmico, para obtener una distancia logarítmica. Para cada uno de los tintes se puede aplicar diferentes factores de distorsión. Lo que es más, puede haber diferentes ratios señal/ruido entre poblaciones de positivos y negativos.
Según algunas realizaciones, para una combinación dada de conjugado, para una población de CD-Y, donde CD-Y es un antígeno específico de interés que es medido por un único canal, una estimación de las distancias "inalteradas" de ratio señal-a-ruido (S/N) puede ser dada por:
FL(y) = densidad de expresión relativa FL(y) * intensidad de fluorocromo relativa FL(y) donde en caso de un marcador modulado, la distancia S/N FL(y) se puede establecer a cero (0). Para la combinación dada de conjugado, una estimación de desbordamiento de una o más poblaciones de CD-X que provoca distorsión al canal que mide CD-Y para cada población CD-X individual puede ser dada por:
Distorsión FL(x) -> FL(y) = Factor de distorsión FL(x) --> FL(y) * densidad de expresión rel. FL(x) * intensidad de fluorocromo rel. FL(x)
donde en el caso de que CD-X sea una subpoblación de CD-Y, o CD-Y sea un marcador de exclusión establecido para CD-X, la distorsión S/N de FL(x) a FL(y) se puede establecer a cero (0). Las distorsiones desde cada canal en un sistema que tiene una pluralidad de canales (por ejemplo, 10 canales en total y así 9 canales CD-X) se puede acumular como se da por:
FL(x) -> FL(y)_tot = log 1 10A(FL(x; 1... 9) -> FL(y))
El conjunto de estimaciones y la agregación se pueden realizar para cada canal en un sistema, para cada antígeno de interés individualmente, permitiendo el cálculo de una distancia S/N efectiva para cada antígeno dada por:
Distancia S/N efectiva = FL(y) - FL(x) -> FL(y)_tot
donde la distancia S/N efectiva para cada antígeno en cada canal se puede usar para determinar además límites de detección para el sistema y el panel globales.
Según algunas realizaciones, el límite de detección (DL) para la positividad específica de un miembro fluorescente de CD-Y, representado por FL(y), es una función casi lineal de desbordamiento positivo de fluorescencia de un miembro de CD-X, representado por FL(x) según las ecuaciones:
DL(y)) = DLIC(FL(y)) 256 * (DF(FL(x)->FL(y)) * RI(FL(x)))
donde DLIC(FL(y)) se define como el límite de detección de la fluorescencia de CD-Y para una tinción de control de isotipo indicada como coordenadas entre 0 y 1023; donde RI(FL(x)) definido como la intensidad de la fluorescencia de un CD-X por encima de su DLIC(FL(x)) indicado en decenas de FL(x); y donde DF(FL(x)->FL(y) se define como el factor de distorsión, medido como el aumento de DL(FL(y)) por RI(FL(x)), indicado en decenas FL(y) divididas por decenas FL(x). En algunos aspectos, DF(FL(x)->FL(y)) se puede calcular a partir de los procedimientos de compensación positivo/negativo y se correlaciona según la ecuación:
DF(FL(x)->FL(y)) = (FL(y,x) * FLIC(x)) / (FL(x) * FLIC(y))
donde FL(y,x) se define como la intensidad FL(y) de acontecimientos positivos FL(x), y donde FLIC(x) y FLIC(y) se definen como la intensidad de las tinciones de control de isotipo para sus antígenos respectivos. Los efectos de acumulación de las intensidades compensadas por desbordamiento desde miembros CD-X, FL(x1, x2,... x(n-1)) a CD-Y pueden ser dados por:
DL(FL(y))total = DLIC(FL(y)) 256 log 1 10A((DF(FL(x1, x2,... x(n-1))-> FL(y) * R1(FL(x1, x2,... x(n-1))))) Tales cálculos también se describen en el segundo párrafo de la figura 1D.
Según algunas realizaciones, datos de control de isotipo se puede proporcionar por paciente catalogado por compuertas en una población (de leucocitos) tintada "silenciosamente" o dispersada. En otras realizaciones, se pueden generar datos
de compensación por aplicación (o por panel) mediante un algoritmo positivo/negativo, donde se puede establecer un procedimiento matemático o uno experimental para el cálculo de un factor de distorsión. En realizaciones adicionales, se puede generar una matriz de distorsión sobre la base de datos de uno o ambos de isotipo y compensados. Tras la compensación, se puede aplicar una matriz de distorsión en cada único acontecimiento. En algunas realizaciones, el conocimiento de factores de compensación puede no ser suficiente para completar cálculos como se describe en la presente memoria. En otras realizaciones, el conocimiento de una matriz de distorsión, que se puede determinar experimentalmente en un instrumento dado o una configuración de instrumento y un conjunto de tinte, puede ser suficiente para completar cálculos como se describe en la presente memoria. En incluso realizaciones adicionales, específicamente valores catalogados por compuertas positivo se pueden expuesto de una manera tal como prisma, un árbol, un revestimiento tridimensional, un trazado de comparación, un trazado de perfil, o algo semejante.
Con referencia a la figura 8, se puede ver que técnicas pueden implicar aportar o seleccionar un valor para el eje X, correspondiente a la densidad de expresión multiplicada por la intensidad de fluorescencia. Tales datos se pueden implementar en un módulo de tabla de anticuerpos (y leerse o recuperarse del mismo) como se trata en otra parte en esta memoria. En algunos casos, los valores pueden ser estimados. En algunos casos, los valores se pueden basar en datos experimentales. Por ejemplo, es posible analizar experimentos de tinción CD4-PE para obtener tales datos. Además, métodos pueden implicar multiplicar el factor de distorsión por la intensidad (real o estimado) del marcador. En algunos casos, las densidades de expresión o patrones de marcador (p. ej. para objetivos de células) pueden tener parámetros o valores predeterminados. Tal información se puede implementar en un módulo de base de datos de anticuerpos. Como se describe en otra parte en esta memoria, el segundo párrafo de la figura 1D proporciona detalles adicionales para cálculos ejemplares de límites de detección.
Como se representa en la figura 9, un aumento de los límites de detección puede ser independiente de factores de compensación y/o tensiones de PMT. En cambio, el límite de detección y/o el aumento del mismo puede depender de espectros de emisión y configuración de filtro. Como se ilustra, configuraciones para cómo se representan resultados se pueden adaptar para eliminar la distorsión (o en otras palabras, para aplicar un factor de compensación) que puede ser provocado por lecturas de sensor de un PMT deseado es que medido incorrectamente en combinación con lecturas de sensor de un canal PMT separado. Específicamente, la figura 9 expone resultados de detección, buscados de un canal ECD, con un porcentaje de lecturas de sensor de un canal PE restado de los resultados de detección. Se muestran tres variaciones ejemplares de sustracción de canal PE: una con un 34 % de la señal de canal PE restada, una con un 46 % de la señal de canal PE restada, y una con un 62 % de la señal de canal PE restada. En cada trazado de resultados de límite de detección, el número de acontecimientos identificados como positivos o negativos cambia, pero la línea de bisagra de detección entre los dos poblaciones comparadas permanece igual. La retirada de la distorsión permite un conjunto de resultados más preciso y sensible.
La figura 10 muestra aspectos de un ejemplar matriz de distorsión de patrón de desbordamiento ciertos tintes, según algunas realizaciones. El desbordamiento puede ser independiente de ajustes de PMT y factores de compensación, y puede ser dependiente de fluorocromos, filtros y precisión de la alineación. En aspectos que se ilustran, la matriz de desbordamiento puede ser cualitativa, para exponer rápidamente a un operario el efecto en la interfaz de tintes o detectores PMT particulares.
La figura 11 muestra aspectos de una matriz de coexpresión según algunas realizaciones. En aspectos que se ilustran, la matriz de coexpresión puede ser cualitativa, para exponer rápidamente a un operario el efecto en la interfaz de antígenos, tintes o detectores PMT particulares. Como se ilustra en la figura 11, una matriz de coexpresión puede indicar interacciones donde: una columna se expresa no exclusivamente con una fila, una columna es una subpoblación exclusiva de una fila, o donde una columna es mutuamente exclusiva de una fila (proporcionando un trazado simétrico de los acontecimientos de expresión).
La figura 12A representa estimaciones de patrones de tinción esquemáticos según algunas realizaciones. Donde hay positividad para cierto desbordamiento de marcador a otro canal, se puede observar un bisagra, como se muestra en la gráfica derecha. El usuario puede cambiar ciertos aportes a una simulación, para variar la salida mostrada. Por ejemplo, un usuario puede seleccionar o cambiar diversos tintes o anticuerpos contenidos en un panel de sonda, para obtener una sensibilidad mejorada para cierto antígeno coexpresado. La situación mostrada en la gráfica media de la figura 12A es particularmente deseable, ya que el límite de detección de la población de positivos FL(x) no se ve influenciada por la positividad de FL(x), en comparación con los negativos.
La figura 12B representa una señal de límite de detección PE variable según algunas realizaciones. La señal PE de la figura 12B puede corresponder a la dirección horizontal representada en la gráfica de la figura 12C. Esto es, el desbordamiento que se manifiesta en la figura 12B también se puede manifestar en la figura 12C dando como resultado un límite de detección PE variable que depende de la intensidad de fluorescencia del tinte de desbordamiento cuya intensidad se escala a lo largo del eje-y. En comparación, en la figura 12D el antígeno de desbordamiento se ha movido a una posición donde no ejerce desbordamiento al canal PE (p. ej. CD45 movido desde ECD ha excitado el láser azul a APC excitados por el láser rojo con una señal muy fuerte), de manera que la señal CD45-APC no impacta en el fondo en el canal PE.
Además, los fluoroforos PE y APC son excitados por diferentes longitudes de onda de láser. Tales situaciones de no
desbordamiento pueden ser raras, particularmente en configuraciones de panel multicolor (p. ej. 10), porque típicamente habrá etiquetas fluorescentes en las células que influyen en los límites de detección en diversos canales.
En la figura 12E, hay una alta sensibilidad para la expresión de antígeno Y en células que son positivas para antígeno X. Esto puede ser una situación deseable donde se prioriza la expresión de Y. Cuando se comparan las poblaciones de negativos y de positivos, el límite de detección no se altera. Hay un límite de detección bajo para FLy, en la población FLx. Según algunas realizaciones, la figura 12E puede referirse a una situación especial que implica células muy expresivas de un antígeno no exclusivo coexpresado que están en riesgo de ser detectadas específicamente. En algunos casos, puede ser útil para referirse a un doblete no comentado de la figura 12C.
En comparación, en la figura 12F se puede ver que la detección de etiquetado de antígeno X en la célula implica una emisión de fluorocromo que influye en el límite de detección en FLy. También se muestra un solapamiento de poblaciones. En contraste, no hay tal solapamiento en la figura 12E (o un doblete no comentado de la figura 12C). Por tanto, un usuario que obtiene resultados tales como los representados en la figura 12E puede decidir proceder con ese panel de sonda particular. En contraste, si se prioriza esta coexpresión, un usuario que obtiene resultados tales como los representados en la figura 12F puede decidir no proceder con ese panel de sonda particular.
La figura 12G (también como doblete no comentado de la figura 12C) representa un trazado de puntos bivariados que muestra un doble acontecimiento positivo. La figura 12H representa un trazado de puntos bivariado similar, donde no hay doble acontecimiento positivo. El trazado de la figura 12H es representativo de un resultado para una exclusión.
La figura 12I representa otra situación de exclusión, donde no hay dobles acontecimientos positivos, que puede presentar un resultado aceptable para el usuario. Considerando el negativo para Antígeno 1, que excluye Antígeno 2, se puede ver que estos dos antígenos no ocurren en el mismo tipo de célula. Por tanto, un usuario que está interesado en evaluar Antígeno 2 en una célula caracterizada por el cuadrante inferior izquierdo puede observar un límite de detección no polarizado. El usuario no miraría a una célula que expresa Antígeno 2, porque debido a la característica biológica de la célula, no ocurre una población de dobles positivos. Por tanto, un doble positivo puede no ser un objetivo de población en el análisis. La discriminación entre el antígeno 2 positivo (AG2-POS) y el antígeno 2 negativo (AG2-NEG), sin embargo, puede ser un objetivo del análisis. De manera similar, la discriminación entre el antígeno 1 positivo (AG1-POS) y el antígeno 1 negativo (AG1-NEG) también puede ser un objetivo del análisis. En cada una de estas situaciones, los límites de detección no han cambiado.
Como no hay expresión de Y antígeno en células positivas X, ni ninguna expresión de antígeno X en células positivas Y, el cuadrante superior derecho no está poblado.
La figura 13 representa aspectos de métodos de evaluación de panel de sonda según algunas realizaciones. En algunos casos, se pueden categorizar patrones de expresión sobre la base de diversos criterios. Por ejemplo, en algunas realizaciones, patrones de expresión se pueden categorizar como normales, linfoproliferativos o trastornos de células sanguíneas inmaduras. Como se muestra aquí, se pueden tener en cuenta diversos factores para patrones de expresión, tales como intensidad fluorescente y similares. En algunos casos, las células en la tabla superior de la figura 13 identifican características de expresión se puede anotar con un "1" para representar coexpresión de marcador, y con un "0" para representar la ausencia de coexpresión de marcador. En algunos casos, las células en la tabla inferior de la figura 13, también identifican características de expresión, se pueden anotar con un "0" para representar coexpresión de marcador descendiente-a-progenitor, y con un "1" para representar la ausencia de coexpresión de marcador descendiente-aprogenitor. Por consiguiente, estos datos se pueden usar para indicar si una etiqueta de fluorocromo puede o no dar como resultado un aumento de límite de detección para una etiqueta de fluoroforo secundaria. Por ejemplo, donde no hay coexpresión, entonces puede ser posible no tener en cuenta la etiqueta fluorescente en la célula. Esto es, no habrá producción de una señal de desbordamiento, debido a ausencia en la misma célula, y por tanto no habrá aumento en el límite de detección. Como se trata en otra parte en esta memoria, realizaciones de la presente divulgación abarcan aspectos de otros patrones de expresión, tales como patrones progenitor-descendiente. Se puede usar información de patrón de expresión para determinar si un error de medición en cierto canal para cierta población con cierto patrón de expresión se aumentará eficazmente o no. De manera relacionada, se puede usar información de patrón de expresión para estimar o determinar distorsión, y/o para superposición. En algunos casos, tablas ejemplares consideran el desbordamiento que ocurre para proporcionar un resultado combinado de distorsión.
La figura 14 representa aspectos de técnicas de evaluación de panel de sonda, particularmente técnicas de simulación numérica, según algunas realizaciones. Las tablas proporcionadas como figura 14 exponen, en parte, las contribuciones relativas de diversos fluorocromos, que salen de uno o más láseres de excitación y son detectados en canales FL (es decir, canales PMT). Las contribuciones relativas proporcionan una base para corrección, la retirada de parámetros o acontecimientos medidos de manera no deseable por un PMT dado relacionado con fluorocromos para ser medidos por otro detector PMT y canal. Se puede calcular una matriz de distorsión efectiva para determinar tales contribuciones relativas para cualquier combinación dada de láseres de excitación, fluorocromos y detectores PMT.
La figura 15 representa aspectos de técnicas de evaluación de panel de sonda, particularmente técnicas de patrón de desbordamiento, según algunas realizaciones. Las tablas proporcionadas como figura 15 exponen, en parte, el brillo relativo de los fluorocromos dados en relación a un único fluorocromo del conjunto, elegido como referencia para el 100 %
de brillo o intensidad en ese panel de tintes. El patrón de desbordamiento y el brillo relativo se pueden clasificar además como que crean un nivel de distorsión particular, que indica la relevancia de un miembro de fluorocromo particular para afectar a la detección de otro fluorocromos por detectores PMT relacionados. Estos valores se pueden usar para calcular un aumento de los límites de detección, por decena de intensidad de señal de distorsión, para cada combinación dada de canal o tinte.
La figura 16A ilustra un esquema ejemplar para un sistema de panel de sonda que no forma parte de la presente invención. Como se representa aquí, el sistema incluye un módulo de gráficos de simulador, un módulo numérico de simulador, un módulo de patrón de desbordamiento, y un módulo de base de datos de anticuerpos. El módulo de gráficos de simulador se puede usar para aporte de usuario de aspectos de un panel de anticuerpo deseado, para la salida gráfica de resultados de simulación, y para la modificación de parámetros de simulación predeterminados. El módulo numérico de simulador se puede usar para la salida numérica de resultados de simulación. El módulo de patrones de desbordamiento se puede usar para parámetros de simulación predeterminados para propiedades de fluorocromo y factores de distorsión según conjuntos de filtros ópticos estándar. El módulo de base de datos de anticuerpos se puede usar para parámetros de simulación predeterminados para densidades de expresión de antígeno, patrones de coexpresión, y esquemas progenitor-descendiente.
En algunos casos, por ejemplo como se muestra en la figura 13, el módulo de gráficos de simulador se puede configurar para implementar aporte de usuario relacionado con un panel de anticuerpo, la exposición de datos predeterminados en la coexpresión de antígenos (p. ej. "puede ser coexpresado con / coexpresión puede ser de interés"), la exposición de datos predeterminados en coexpresión de subpoblación de (p. ej. "(expresión brillante) células no están en una subpoblación (exclusiva) de"), la exposición de datos estimados en decenas de conjugados de la intensidad media de señal por encima del umbral positivo-negativo, y la gráfica salida de resultados de simulación.
Las figuras 16B y 16C representan aspectos de un módulo de aporte de usuario para una sonda que no forma parte de la presente invención. Tras el aporte de usuario de especificidad de antígeno los respectivos números de pieza (PN) se pueden recuperar del módulo de base de datos de anticuerpos y exponerse en los campos por debajo de los campos de aporte de usuario. Para canales no ocupados, el usuario puede aportar una designación ficticia. Donde conjugados de anticuerpo no están disponibles en el repertorio de la base de datos de anticuerpos, y donde la especificidad de antígeno está disponible no obstante conjugado a etiquetas de tinte distintas a las deseadas, es posible designar tales como servicio de diseño de cliente (CDS).
La figura 16D representa aspectos de un módulo de gráficos de simulador que no forman parte de la presente invención. Como se muestra aquí, el sistema puede proporcionar una exposición de datos predeterminados en la coexpresión de antígenos (p. ej. "se puede coexpresar con / coexpresión puede ser de interés"). En algunos casos, el intervalo de fuente (p. ej. normal, linfoproliferativo, o leucemia, correspondiente a patrón de expresión, se puede conmutar o seleccionar introduciendo 0, 1 o 2). Las especificidades proporcionadas por un usuario se pueden exponer, por ejemplo como encabezados de columna y fila. El sistema se puede configurar para recibir el aporte de usuario para evitar los datos predeterminados. Las entradas de tabla pueden ser sobrescritas por un usuario si es necesario o si se desea. En algunos casos, datos de coexpresión (p. ej. entradas predeterminadas) se pueden recuperar del módulo de base de datos de anticuerpos. Como se indica aquí, un valor de "1" puede representar un caso Verdadero, de manera que ocurre coexpresión y es de interés. De manera relacionada, un valor de "0" puede representar un caso Falso, de manera que no se coexpresan antígenos, o su coexpresión no es de interés. Tales datos de coexpresión se pueden almacenar en el módulo de base de datos de anticuerpos y recuperarse del mismo. Hay simetría a lo largo del eje diagonal de los campos en blanco.
La figura 16E representa aspectos de un módulo de simulador que no forma parte de la presente invención. Como se muestra aquí, el sistema puede proporcionar una exposición de datos predeterminados sobre las relaciones progenitordescendiente de antígenos (p. ej. células "(que expresan brillante) no son una población de descendientes de'). De nuevo, un intervalo de fuente se puede conmutar introduciendo 0, 1 o 2. Como se muestra además aquí, especificidades de antígeno según aporte de usuario se pueden exponer como encabezados de columna y fila en la tabla. En algunos casos, las entradas pueden ser sobrescritas por un usuario si es necesario o si se desea. En algunos casos, datos de progenitordescendiente (p. ej. predeterminado) se pueden recuperar de un módulo de base de datos de anticuerpos. Un valor de "1" puede representar un caso verdadero, donde células positivas (columna antígeno) no son una población de descendientes, y por lo tanto provocan distorsión en el canal de fila antígeno. Un valor de "0" puede representar un caso falso, donde células positivas (columna antígeno) son una población de descendientes, y por lo tanto no provocan distorsión en el canal de fila antígeno. Por ejemplo, según la tabla mostrada aquí, lambda no es un descendiente de kappa, mientras que FMC7 es un descendiente de CD19. Según algunas realizaciones, FMC7 también puede be kappa negativo.
La figura 16F representa aspectos de un módulo de gráficos de simulador según algunas realizaciones. Como se muestra aquí, diferentes curvas o líneas pueden corresponder a diferentes longitudes de onda de excitación. Aquí, las longitudes de onda son 488 nm, 638 nm y 405 nm. La círculos, conectados por líneas continuas, corresponden al fondo para los patrones de expresión más complejos. Los cuadrados, conectados por líneas de trazos, corresponden a la intensidad de fluorescencia esperada más baja para un conjugado. Los triángulos, conectados por líneas de puntos, corresponden a la intensidad de fluorescencia esperada más brillantes para un conjugado. Cada indicador individual (es decir, círculo,
cuadrado, o triángulo) se posiciona por encima de un valor de eje X correspondiente a una longitud de onda central para un intervalo particular de filtro pasobanda o canal de detección. El eje Y representa cuatro decenas logarítmicas superiores de intensidad fluorescente, con una población de negativos centrada en la decena más baja. Como se trata en otra parte en esta memoria, para un antígeno que tiene características de expresión discreta, las líneas de trazos y de puntos coincidirán para una ubicación respectiva de eje X (longitud de onda pasobanda). Además, como se trata en otra parte en esta memoria, es posible jerarquizar diversos diseños de panel de sonda sobre la base de distancias entre diversos indicadores. Por ejemplo, diseños de panel de sonda se pueden jerarquizar sobre la base de una distancia máxima entre un triángulo (línea de puntos) y un círculo (línea continua) y también se puede basar en una distancia mínimo entre un cuadrado (línea de trazos) y un círculo (línea continua).
En algunos casos, jerarquizar puede implicar priorizar paneles de sonda que corresponden a patrones de desbordamiento complejos y que se asocian con antígenos expresados tenuemente.
La figura 16G representa aspectos de un módulo de gráficos de simulador según algunas realizaciones. Aquí, una exposición de todas las contribuciones de distorsión para un canal de detección particular se posicionan por encima de cada canal individual. Los círculos o burbujas se pueden codificar (p. ej. codificar por color) según el respectivo fluorocromo de desbordamiento. El valor o intercepción en el eje Y indica un aumento absoluto del límite de detección en decenas provocado por un conjugado en un respectivo canal. Por ejemplo, el eje Y puede representar un aumento de fondo, en decenas, donde 0.00 es un umbral entre las decenas primera y segunda (p. ej. población de negativos centrada en primera decena). El diámetro del círculo puede representar la contribución relativa de un conjugado a la distorsión de fondo global en un respectivo canal. Como se trata en otra parte en esta memoria, a fin de bajar la distorsión de fondo para un canal dado, puede ser útil abordar por ejemplo el círculo más grande posicionado por encima de ese canal particular. En algunos casos, puede ser útil minimizar o reducir el número de círculos para canales usados para la detección de antígeno modulados.
La figura 16H representa aspectos de un módulo numérico de simulador según algunas realizaciones. Como se muestra aquí, la tabla incluye valores para todas distorsiones absolutas resueltas por conjugado de desbordamiento (títulos de columna) y canal distorsionado, y también ilustra un aumento en el fondo en decenas por decena de intensidad de señal del fluorocromo de desbordamiento en su canal primario. Además se incluyen columnas para el tamaño de contribuciones máximas a la distorsión de fondo total y distorsiones totales del fondo. La columna superpuesta indica una posición de cuadrante o región en una escala gráfica de 1024 unidades de un umbral positivo-negativo según un parámetro de posición. También se muestran datos de fuente para la representación gráfica de distorsión de fondo.
Según algunas realizaciones, es posible determinar una distorsión absoluta provocada por un único conjugado de desbordamiento sobre la base de la siguiente fórmula:
(intensidad de conjugado)*(factor de distorsión)*(índice de coexpresión)*(índice progenitor-descendiente) Según algunas realizaciones, la intensidad de conjugado puede ser representada en decenas, y se puede determinar como estimación sobre la base de densidad de antígeno y brillo de fluorocromo o mediante el uso de datos empíricos sobre la intensidad de conjugado.
Según algunas realizaciones, es posible determinar una distorsión total en un canal dado sobre la base de la siguiente fórmula:
LOG10(suma de distorsiones absolutas linealizadas provocadas por cada conjugado) Según algunas realizaciones, una posición de región/cuadrante de umbral positivo-negativo se puede determinar sobre la base de la siguiente fórmula:
(decenas de distorsión total)*(256) 256
donde 256 es el umbral gráfico entre la primera y la segunda decena suponiendo que la población de negativos es delineada por este umbral gráfico.
La figura 16I representa aspectos de un módulo numérico de simulador según algunas realizaciones. La tabla mostrada aquí incluye contribuciones de distorsión relativa lineal resueltas por conjugado de diafonía (títulos de columna) y el canal distorsionado en las decenas. Esta tabla puede proporcionar datos de fuente para la representación gráfica de distorsión de fondo (p. ej. gráficos, "contribuciones de distorsión"). Los valores de tabla se pueden basar en la siguiente fórmula:
[distorsión absoluta lineal]
contribuciones relativas para la distorsión ——------ —-------- —-----[distorsión total lineal-—]
[La figura 16J representa aspectos de un módulo de patrón de desbordamiento según algunas realizaciones. La tabla mostrada aquí incluye factores de distorsión, que se pueden aplicar por decena de intensidad de fluorescencia de diafonía (es decir, desbordamiento) y se puede determinar experimentalmente o sobre la base de la siguiente ecuación
aproximativa:
factor de distorsión = [índice de diafonía]*[factor de temperatura pasobanda] La figura 16K representa aspectos de un módulo de patrón de desbordamiento según algunas realizaciones. Una definición de índice de diafonía se puede ver en esta memoria como:
Índice de diafonía :::: LOG(SNR(señal secundaria) / LOG(8NR(señal primaria);
donde, SNR = ratio señal-a-ruido = MFI (población de positivos) / MFI (población de negativos);
y con MFI = intensidad de fluorescencia media.
La figura 16L representa aspectos de un módulo de patrón de desbordamiento según algunas realizaciones. Como se muestra aquí, para 525 nm (FITC) la distorsión absoluta se puede calcular según la siguiente fórmula donde la ratio de DF (factor de distorsión) a CI (índice de diafonía) es 0.15:
distorsión absoluta = 0.15 x LOG(SNR(secundaria))
Esto es, hay 0.15 decenas de distorsión por decena de intensidad de señal secundaria. Como también se muestra aquí, para 660 nm (APC) la distorsión absoluta se puede calcular según la siguiente fórmula donde la ratio de DF a CI es 0.42:
distorsión absoluta = 0.42 x LOG(SNR(secundaria)
Esto es, hay 0.42 decenas de distorsión por decena de intensidad de señal secundaria en el canal APC (pasobanda 660/20).
Las figuras 16M y 16N representan aspectos de un módulo de base de datos de anticuerpos según algunas realizaciones. La tabla en la figura 16M incluye datos para densidades de expresión de antígeno (p. ej. escalados según CD8-PE = 2.5 decenas de intensidad por encima de umbral pos-neg), números de pieza, y características de expresión (p. ej. 0 = modulado, 1 = discreto). La tabla en la figura 16N incluye datos para patrones de coexpresión (p. ej. "puede ser coexpresado con / coexpresión puede ser de interés"). Como se muestra aquí, hay una simetría en la tabla a lo largo de las células de tabla de diagonal.
La figura 16O representa aspectos de un módulo de base de datos de anticuerpos según algunas realizaciones. En algunas realizaciones, módulos de base de datos de anticuerpos pueden incluir información concerniente a patrones progenitor-descendiente (p. ej. "células (que expresan brillante) no son una población de descendientes de"), y puede ser asimétrico. Según algunas realizaciones, tal información de base de datos puede incluir valores estimados. Según algunas realizaciones, tal información de base de datos puede incluir valores empíricos.
La figura 17 representa aspectos de un planteamiento numérico para modelar patrones de desbordamiento, según algunas realizaciones. Como se muestra aquí, la evaluación de patrones de desbordamiento puede implicar un planteamiento de radar de detección para procesar un conjunto de datos multivariados. Como se muestra en la figura 17, la representación de radar multivariado puede exponer límites de detección para antígenos según sus canales de detección conforme se disponen en su configuración de panel 1702. Como se muestra en una primera capa de imagen 1704, cada eje radial del radar de detección representa un canal de fluorescencia desde la tercera a la sexta decena de la señal medida, siendo cada decena un segmento de 20 bits. La primera zona sombreada interior 1706 representa límites de detección inalterados, dentro y por debajo de esa decena, suponiendo que el control de isotipo está centrado en la tercera decena. Como se muestra en una segunda capa de imagen 1708, una segunda zona sombreada interior 1710 subyace a la primera zona sombreada interior 1706, donde la segunda capa de imagen 1708 representa la distorsión de fondo estimada para cada canal de fluorescencia. Valores para la distorsión estimada que generan la segunda zona sombreada interior 1710 se basan en los conjugados de combinación dada según su: patrón de desbordamiento, intensidades relativas de fluorocromo, densidades de antígenos, matriz de coexpresión, y matriz de distorsión.
Una tercera capa de imagen 1712 incluye además un límite inferior 1714 que representa el límite inferior de la intensidad de fluorescencia esperada para cada conjugado. Todas las expresiones moduladas o indiscretas se establecen a cero como parte del límite inferior 1714 de la intensidad de fluorescencia esperada. Una cuarta capa de imagen 1716 incluye además un límite superior 1718 que representa el límite superior de la fluorescencia esperada para cada conjugado. Expresiones discretas de un antígeno y un tinte particulares tienen valores iguales de límite inferior 1714 y límite superior 1718 para intensidad de fluorescencia esperada.
Las figuras 18A y 18B representan aspectos de un planteamiento numérico para modelar patrones de desbordamiento, según algunas realizaciones. Como se muestra aquí, la evaluación de patrones de desbordamiento puede implicar un planteamiento de radar de detección y/o un planteamiento de indicador de distorsión. En tales representaciones de indicador de distorsión, cada DL puede tener un color que representa un tinte de distorsión. El eje Y puede representar la cantidad de distorsión, en decenas, mientras el eje X puede representar cada canal FL distorsionado. El diámetro de
un punto de datos (es decir, el tamaño de un DL) puede representar la contribución relativa de un único conjugado a la distorsión global.
Las figuras 19A y 19B representan aspectos de un planteamiento numérico para modelar patrones de desbordamiento, según algunas realizaciones. Como se muestra aquí, la evaluación de patrones de desbordamiento puede implicar un planteamiento de pantalla de clonicidad, que además se puede representar con un planteamiento de radar multivariado.
Al simular un diseño de panel de sonda como se representa en esta memoria, un dispositivo de citometría de flujo se puede configurar y operar usando dicho diseño de panel de sonda. En particular, un procesador o sistema, que puede ser un medio no transitorio legible por ordenador, puede recibir información en relación con una configuración de hardware de citómetro de flujo, información en relación con un listado que comprende una pluralidad de sondas, estando asociadas las sondas individuales del listado con respectivos límites de detección específicos de canal individual, e información en relación con un patrón de coexpresión antigénico. El procesador, o uno o más procesadores adicionales vinculados informáticamente, puede evaluar combinaciones de sondas individuales como el panel de sonda, sobre la base de la configuración de hardware de citómetro de flujo, los límites de detección específicos de canal individual, y el patrón de coexpresión antigénico, las combinaciones son subconjuntos de sondas del listado, y puede además determinar el panel de sonda para usar con la configuración de hardware de citómetro de flujo, límites de detección específicos de canal individual, y patrón de coexpresión antigénico. Finalmente, un panel de sonda para usar en un procedimiento de citometría de flujo se puede sacar y ser usado por un operario para diseño de panel de sonda para un instrumento de citometría de flujo y un experimento.
Interfaz y selección de parámetros para diseño y simulación de panel
La determinación de un panel de sonda se puede presentar en una interfaz basada en web, permitiendo a un usuario diseñar un panel de sonda para un experimento de citometría de flujo usando bases de datos y herramientas online. Realizaciones particulares de métodos (como se ha descrito anteriormente en las figuras 2-2D) se puede proporcionar a un operario como se muestra en las figuras 20A-20F. Aspectos del método se pueden proporcionar a un operario como única forma, una forma transitoria, o como formas múltiples que representan etapas en el método.
La figura 20A es una imagen ejemplar de una pantalla de interfaz que permite la selección de una configuración de hardware 2000 (también se le hace referencia como una pantalla de configuración de hardware 2000). Una selección de las pestañas 2002 permite el movimiento entre diversos campos en los que se pueden introducir datos, que como se muestra son pestañas para etapas de un método para simular un panel. El campo título de pestaña 2004 puede indicar qué etapa de un método está viendo o editando un usuario, que en la figura 20A es "configuración de hardware", indicada como "Etapa 1" dentro de la selección de las pestañas 2002. El campo desplegable 2006 permite a un operario seleccionar una configuración de hardware que proporciona información de una base de datos para establecer parámetros para realizar una simulación de panel. La exposición gráfica de configuración de hardware 2008 puede mostrar a un operario detalles de una configuración de hardware, que incluye pero sin limitación a esto, uno o más láseres de excitación, las longitudes de onda de excitación del uno o más láseres de excitación, tensiones u otros valores de energía para el uno o más láseres de excitación, uno o más detectores PMT, tensiones u otros valores de energía para el uno o más detectores PMT, o filtros pasobanda para cada uno del uno o más detectores PMT. En algunos aspectos, la selección de una configuración de hardware puede ser determinada automáticamente por la base de datos y el sistema. La configuración de hardware seleccionado puede establecer parámetros y valores para un diseño y una simulación de panel descritos en esta memoria. Se proporciona un campo seleccionable "Siguiente >" 2010 para avanzar a una etapa posterior en el método. Se proporciona un campo generalmente seleccionable "< Atrás" 2012 para avanzar a una etapa anterior en el método, sin embargo, en la pantalla mostrada de configuración de hardware 2000, no hay etapa anterior, y así el campo "< Atrás" 2012 no es seleccionable en la pantalla de configuración de hardware 2000.
La figura 20B es una imagen ejemplar de una interfaz que permite la selección de anticuerpos 2014 (también se le hace referencia como pantalla de selección de anticuerpos 2014). El campo título de pestaña 2004 en la figura 20B se titula "selección de anticuerpos", y se indica como "Etapa 2" dentro de la selección de las pestañas 2002. Una pluralidad de campos desplegables de especificidad 2016 permite a un operario seleccionar una especificidad, y una pluralidad de campo desplegable de tinte 2018 permite a un operario seleccionar un tinte. En algunas realizaciones, la especificidad a seleccionar en los campos desplegables de especificidad 2016 puede ser una selección de antígenos o anticuerpos. Para cada especificidad seleccionada en los campos desplegables de especificidad 2016, se puede seleccionar un tinte correspondiente de la pluralidad de campos desplegables de tinte 2018. En algunos aspectos, la selección de campos desplegables de especificidad 2016 y los campos desplegables de tinte 2018 pueden ser determinados automáticamente por la base de datos y el sistema. Los anticuerpos seleccionados pueden establecer parámetros y valores para un diseño y una simulación de panel descritos en esta memoria. Se proporciona un campo seleccionable "Siguiente >" 2010 para avanzar a una etapa posterior en el método. Se proporciona un campo seleccionable "< Atrás" 2012 para avanzar a una etapa anterior en el método.
La figura 20C es una imagen ejemplar de una interfaz que permite selección de objetivo de fenotipo 2020 (también se le hace referencia como pantalla de Objetivo de Fenotipos 2020). El campo título de pestaña 2004 en la figura 20C se titula "Objetivo de Fenotipos", y se indica como "Etapa 3" dentro de la selección de las pestañas 2002. Un campo desplegable de objetivo de población 2022 permite a un operario seleccionar un objetivo de población relacionado con antígenos
específicos que expresan o deben expresar un objetivo de fenotipo. Se proporciona una pluralidad de "Antígenos No Relacionados" 2024, que enumera una selección de conjugados de anticuerpo y tinte que no están o pueden no estar relacionados con un objetivo de población seleccionado. Cada pareja de anticuerpo y tinte en la pluralidad de Antígenos No Relacionados 2024 incluye una casilla seleccionable para indicar que la pareja de anticuerpo y tinte es un antígeno de interés. Se proporciona una pluralidad de "Antígenos de Interés" 2026, que enumera una selección de conjugados de anticuerpo y tinte que están o se cree que están relacionados con un objetivo de población seleccionado. Los miembros de la pluralidad de Antígenos de Interés 2026 se pueden poblar con parejas de anticuerpo y tinte originalmente proporcionadas en la pluralidad de Antígenos No Relacionados 2024, o se puede poblar automáticamente según datos de relaciones almacenados en la base de datos y el sistema. La indicación de que una pareja particular de anticuerpo y tinte es un miembro de la pluralidad de Antígenos de Interés 2026 se puede retirar anulando la selección de una casilla seleccionable para la pareja de anticuerpo y tinte. En algunos aspectos, la selección de la pluralidad de Antígenos No Relacionados 2024 y la pluralidad de Antígenos de Interés 2026 puede ser determinada automáticamente por la base de datos y el sistema. En algunos aspectos, se puede proporcionar un campo de selección global de Antígeno de Interés 2028, que tiene un campo activable para seleccionar todas las parejas de anticuerpo y tinte como miembros de la pluralidad de Antígenos de Interés 2026 y un campo activable para indicar todas las parejas de anticuerpo y tinte como miembros de la pluralidad de Antígenos No Relacionados 2024. El objetivo de fenotipos, antígenos no relacionados, y antígenos de interés seleccionados puede establecer parámetros y valores para un diseño y una simulación de panel descritos en esta memoria. Aunque no se muestra expresamente en la figura 20C, se proporciona un campo seleccionable "Siguiente >" para avanzar a una etapa posterior en el método y se proporciona un campo seleccionable "< Atrás" para avanzar a una etapa anterior en el método.
La figura 20D es una imagen ejemplar de una interfaz que permite identificación de antígenos mutuamente excluyentes 2030 (también se le hace referencia como pantalla de Antígenos Mutuamente Excluyentes 2030). El campo título de pestaña 2004 en la figura 20D se titula "Antígenos Mutuamente Excluyentes", y se indica como "Etapa 4" dentro de la selección de las pestañas 2002. Se proporciona una selección de campos expandibles de emparejamiento antígenoanticuerpo 2032, donde cuando están expandidos, un campo de emparejamiento antígeno-anticuerpo proporciona una lista de antígenos para excluir 2034; esta puede ser una lista de antígenos potenciales que pueden ser mutuamente excluyentes con el emparejamiento antígeno-anticuerpo para un campo individual. La lista de antígenos para excluir 2034 puede tener una casilla por cada antígeno enumerado para seleccionar un antígeno particular para indicar como excluido, lo que es una indicación de que el antígeno o antígenos seleccionados no coexpresan con el antígeno identificado como parte del emparejamiento antígeno-anticuerpo para ese campo. La lista de antígenos para excluir 2034 puede incluir además uno o más vínculos de selección que puede provocar que todos los antígenos en la lista 2034 sean seleccionados, o se anule la selección de todos los antígenos en la lista 2034. Antígenos que se indican como excluidos se pueden enumerar en una lista de antígenos identificados excluidos 2036. La lista de antígenos identificados excluidos 2036 puede tener una casilla seleccionada por cada antígeno enumerado, que se puede anular su selección para indicar que el antígeno particular no está mutuamente excluido para un campo dado de emparejamiento antígeno-anticuerpo. En aspectos, la lista de antígenos para excluir 2034 puede ser seleccionada por un operario que selecciona uno o más antígenos enumerados sobre la base de la lógica generada por el operario. En otros aspectos, la lista de antígenos identificados excluidos 2036 puede ser especificada por la base de datos y el sistema; se proporciona un campo seleccionable "Especificar Exclusiones Automáticamente" 2038 para permitir a un operario indicar antígenos mutuamente excluidos según datos almacenados en la base de datos y el sistema. Por el contrario, se proporciona un campo seleccionable "Descartar Todas las Exclusiones" 2040 para permitir a un operario anular la selección de todas exclusiones mutuas indicadas previamente para uno o más campos de emparejamiento anticuerpo-antígeno. Los antígenos mutuamente excluyentes seleccionados pueden establecer parámetros y valores para un diseño y una simulación de panel descritos en esta memoria. Aunque no se muestra expresamente en la figura 20D, se proporciona un campo seleccionable "Siguiente >" para avanzar a una etapa posterior en el método y se proporciona un campo seleccionable "< Atrás" para avanzar a una etapa anterior en el método.
La figura 20E es una imagen ejemplar de una interfaz que permite identificación de antígenos progenitor y descendiente 2042 (también se le hace referencia como pantalla de Antígenos Progenitor y Descendiente 2042). El campo título de pestaña 2004 en la figura 20E se titula "Progenitores y Descendientes", y se indica como "Etapa 5" dentro de la selección de las pestañas 2002. Se proporciona una selección de campos expandibles de emparejamiento antígeno-anticuerpo 2044, donde cuando está expandido, un campo de emparejamiento antígeno-anticuerpo proporciona una lista de antígenos descendientes 2046; esto puede ser una lista de antígenos descendientes, que son descendientes de un antígeno progenitor indicado como el antígeno del emparejamiento antígeno-anticuerpo para un campo individual. La lista de antígenos descendientes 2046 puede tener una casilla por cada antígeno enumerado para seleccionar un antígeno particular para indicar como descendiente, lo que es una indicación de que el antígeno o antígenos seleccionados es un grupo de la diferenciación más tarde en una progresión o etapa de desarrollo de que el grupo de diferenciación indicado como el antígeno seleccionado del emparejamiento antígeno-anticuerpo para ese campo. La lista de antígenos descendiente 2046 puede incluir además uno o más vínculos de selección que puede provocar que todos los antígenos en la lista 2046 sean seleccionados, o se anule la selección de todos los antígenos en la lista 2046. Antígenos que se indican como descendientes se pueden enumerar en una lista de antígenos descendiente identificados 2048. La lista de antígenos descendiente identificados 2048 puede tener una casilla seleccionada por cada antígeno enumerado, que se puede anular su selección para indicar que el antígeno particular no es un descendiente para un campo dado de emparejamiento antígeno-anticuerpo. En aspectos, la lista de antígenos descendiente 2046 puede ser seleccionada por un operario que selecciona uno o más antígenos enumerados sobre la base de la lógica generada por el operario. En
otros aspectos, la lista de antígenos descendientes 2046 puede ser especificada por la base de datos y el sistema; se proporciona un campo seleccionable "Especificar Automáticamente Patrones de Familia" 2050 para permitir a un operario indicar relaciones de antígeno progenitor y descendiente según datos almacenados en la base de datos y el sistema. Por el contrario, se proporciona un campo seleccionable "Descartar todos los Patrones de Familia" 2052 para permitir a un operario anular la selección de todas relaciones de antígeno progenitor y descendiente previamente indicadas para uno o más campos de emparejamiento anticuerpo-antígeno. Las relaciones de antígeno progenitor y descendiente seleccionadas pueden establecer parámetros y valores para un diseño y una simulación de panel descritos en esta memoria. Aunque no se muestra expresamente en la figura 20E, se proporciona un campo seleccionable "Siguiente >" para avanzar a una etapa posterior en el método y se proporciona un campo seleccionable "< Atrás" para avanzar a una etapa anterior en el método.
La figura 20F es una imagen ejemplar de una interfaz que permite identificación de densidades de antígenos 2052 (también se le hace referencia como pantalla de densidad de antígeno 2052). El campo título de pestaña 2004 en la figura 20F se titula "densidades de antígenos", y se indica como "Etapa 6" dentro de la selección de las pestañas 2002. Un campo desplegable de objetivo de población 2056 permite a un operario seleccionar un objetivo de población relacionado con antígenos específicos, y particularmente la densidad del antígeno específico para un tipo de célula u objetivo de población particulares. La densidad de antígenos en una región de una célula, o para un tipo de célula u objetivo de población, corresponde a la fortaleza de expresión de ese antígeno, y cómo puede interactuar o ser medido con poblaciones de otros antígenos. Una exposición señal-a-ruido 2058 puede indicar a través de decenas de expresión la ratio de señal esperada de un objetivo de población y ruido correspondiente de antígeno sobre fondo. Se puede proporcionar un campo de selección discreto/modulado 2060, que en aspectos puede ser un campo de selección de botón de opción, para configurar la exposición señal-a-ruido 2058 para exponer la expresión del objetivo de población cuando se evalúa según parámetros discretos o modulados, como se ha descrito anteriormente. De manera similar, se puede proporcionar un campo de selección de discriminación 2062, que en aspectos puede ser un campo de selección de botón de opción, para configurar la exposición señal-a-ruido 2058 para discriminar los resultados del objetivo de población ya sea entre expresión positiva y negativa o entre expresión brillante positivo y tenue positivo, como se ha descrito anteriormente. Para la exposición la señal-a-ruido 2058 se puede establecer una configuración por control deslizante, para ajustar la escala y el alcance de la región de la exposición señal-a-ruido 2058 expuesta. En algunos aspectos, la configuración por control deslizante se puede elegir con un campo seleccionable "Configuración Por Control Deslizante Automático" 2064, usando los datos de la exposición de antígeno y objetivo de población para establecer automáticamente el intervalo de la exposición señal-a-ruido 2058. En otros aspectos, un operario puede dirigir la exposición señal-a-ruido 2058 para tener una escala específica al ajustar manualmente una interfaz de control deslizante 2066, que puede ser una interfaz de control deslizante de opción. Los objetivos de poblaciones, selección de exposición discreta versus modulada, selección de discriminación, configuración por control deslizante y densidades de antígenos seleccionados pueden establecer parámetros y valores para un diseño y una simulación de panel descritos en esta memoria. Aunque no se muestra expresamente en la figura 20F, se proporciona un campo seleccionable "Siguiente >" para avanzar a una etapa posterior en el método y se proporciona un campo seleccionable "< Atrás" para avanzar a una etapa anterior en el método.
La figura 20G es una imagen ejemplar de una interfaz que expone una estimación de simulación de expresión de panel para un diseño de panel de antígeno dado 2068 (también se le hace referencia como pantalla de simulación de panel 2068). Información tomada del aporte a la pantalla de configuración de hardware 2000, pantalla de selección de anticuerpos 2014, pantalla de Objetivo de Fenotipos 2020, pantalla de Antígenos Mutuamente Excluyentes 2030, pantalla de Antígenos Progenitor y Descendiente 2042, y pantalla de Densidad de Antígeno 2052 se pueden recoger y usar para calcular un patrón esperado de expresión o tinción. El campo título de pestaña 2004 en la figura 20G se titula "Patrones de Tinción estimados", y se indica como "Etapa 7" dentro de la selección de las pestañas 2002. Un campo de exposición 2070 puede proporcionar ya sea una o ambas representaciones numérica y gráfica de expresión de antígeno estimada para un diseño de panel dado, que incluye, pero sin limitación a esto, representaciones gráficas tratadas en esta memoria. El campo generalmente seleccionable "Siguiente >" 2010 mostrado no es seleccionable en la pantalla de Simulación de Panel 2068 porque no hay etapa posterior en la correspondiente método o evaluación a la que avanzar. El campo seleccionable "< Atrás" 2012 se proporciona para avanzar a una etapa anterior en el método.
En algunas realizaciones, una interfaz basada en web puede presentar información a un operario para detallar adicionalmente las relaciones entre diversos antígenos para un fenotipo de célula. La figura 21A es un árbol de desarrollo ejemplar (similar en forma a un árbol genealógico) que ilustra relaciones entre miembros CD (es decir, antígenos) para un fenotipo de célula. Este tipo de árbol de desarrollo puede ilustrar las relaciones progenitor-hijo entre antígenos, y de ese modo ilustrar además relaciones de hermano, relaciones de primo, y relaciones de tío entre antígenos. En algunos aspectos, se pueden identificar antígenos como que se desarrollan a lo largo de más de un camino de desarrollo, y se puede identificar como "antígeno gemelo" junto con apariciones del mismo antígeno en el árbol de desarrollo. En realizaciones adicionales, la selección o el resaltado transitorio (p. ej. pasando encima de un campo definido por software para representar un miembro CD o antígeno) de un campo de antígeno particular se puede usar como estímulo para exponer además relaciones de expresión con otros antígenos en el árbol de desarrollo. Por ejemplo, la selección o el resaltado transitorio de un campo de antígeno puede indicar, para el antígeno indicado, que otros antígenos en el árbol de desarrollo se excluyen mutuamente de la expresión con el antígeno seleccionado, que otros antígenos en el árbol de desarrollo tienen expresión correlativa con el antígeno seleccionado, que otros antígenos en el árbol de desarrollo tienen expresión inversamente correlacionada con el antígeno seleccionado, que otros antígenos en el árbol de desarrollo son
gemelos al antígeno seleccionado, o que otros antígenos en el árbol de desarrollo de otro modo se coexpresan con el antígeno seleccionado. En otros aspectos, la relación de desarrollo entre antígenos se puede proporcionar en una lista o forma tabular, como se ilustra en la figura 21B, como realización ejemplar.
Compensación multicolor con panel medido
Como se señala anteriormente, la metodología para predecir y simular expresión de panel también se puede aplicar para derivar o extrapolar las magnitudes y fuentes de señal de panel medido y antígenos en una muestra. Se pueden calcular y usar matrices de distorsión y coexpresión para compensar coexpresión mutua o desbordamiento progenitordescendiente, que en aspectos puede ser impuesto al establecer parámetros de catalogación por compuerta apropiados. En algunos aspectos, los láseres usados para excitar tintes acoplados a anticuerpos pueden excitar más de un objetivo de tinte pretendido, y se pueden usar tablas o matrices de compensación para acomodar y corregir tal desbordamiento. La figura 22A representa aspectos de compensación intralaser según algunas realizaciones. De manera similar, la figura 22B representa aspectos de compensación interlaser según realizaciones. Ambas de la figura 22A y la figura 22B representan la misma tabla de compensación 2200, que presenta una configuración de fluorocromos en las columnas 2202 y un conjunto de PMT en las filas 2204. La tabla de compensación 2200 es determinada por las identidades individuales de los fluorocromos en las columnas 2212 y el p Mt en las filas 2204, que es específico para cada configuración de hardware y diseño de panel elegidos. La figura 22A se enfoca en los valores de compensación intralaser, valores para los que desbordamiento de un fluorocromo desencadenado por una longitud de onda dada de láser de excitación puede afectar a un PMT para un fluorocromo separado también desencadenado por la misma longitud de onda de láser de excitación. En contraste, la figura 22B se enfoca en los valores de compensación interlaser, valores para los que el desbordamiento desde un fluorocromo desencadenado por un dado longitud de onda de láser de excitación puede afectar a un PMT para un fluorocromo separado desencadenado por una longitud de onda diferente de láser de excitación.
Como se ilustra en la figura 22A, fluorocromos desencadenados por luz de excitación que tiene una longitud de onda (X) de 405 nm se ubican en las columnas FL9 y FL10, con canales de detección correspondientes en las filas FL9 y FL10. Como se muestra, la detección FL9 y FL10 son para fluorocromos Pacific Blue y Pacific Orange, respectivamente. El trazado de comparación a 405 nm 2206 refleja la región de solapamiento de cada fluorocromo, y se representa en la tabla de compensación 2200 por la región de intersección de columnas y filas FL9 y FL10. La región de intersección de columnas y filas FL9 y FL10 se puebla con valores o factores usados para corregir distorsión, como se ha tratado anteriormente. De manera similar, fluorocromos desencadenados por luz de excitación que tienen una longitud de onda (X) de 638 nm se ubican en las columnas FL6, FL7 y FL8, con correspondientes canales de detección en las filas FL6, FL7 y FL8. Como se muestra, la detección FL6, FL7 y FL8 son para fluorocromos APC, APC-Cy5 o APC-A700, y APC-Cy7 o APC-A750, respectivamente. El trazado de comparación a 638 nm 2208 refleja la región de solapamiento de cada fluorocromo, y se representa en la tabla de compensación 2200 por la región de intersección de columnas y filas FL6, FL7 y FL8. La región de intersección de columnas y filas FL6, FL7 y FL8 se puebla con valores o factores usados para corregir distorsión, como se ha tratado anteriormente. Además, fluorocromos desencadenados por luz de excitación que tiene una longitud de onda (X) de 488 nm se ubican en las columnas FL1, FL2, FL3, FL4 y FL5, con correspondientes canales de detección en las filas FL1, FL2, FL3, FL4 y FL5. Como se muestra, la detección FL1, FL2, FL3, FL4, y FL5 son para fluorocromos FITC, PE, ECD, PC5 o PC5.5 y PC7, respectivamente. El trazado de comparación a 488 nm 2210 refleja la región de solapamiento de cada fluorocromo, y se representa en la tabla de compensación 2200 por la región de intersección de columnas y filas FL1, FL2, FL3, FL4 y FL5. La región de intersección de columnas y filas FL1, FL2, FL3, FL4 y FL5 se puebla con valores o factores usados para corregir distorsión, como se ha tratado anteriormente.
Como era de esperar, la intersección entre un fluorocromo dado y el canal que se configura para detectar ese fluorocromo no requiere ningún valor o factor de compensación, y se indica en la tabla de compensación 2200 como la diagonal sin valores numéricos poblando las celdas de la tabla de compensación 2200.
Como se ilustra en la figura 22B, también se pueden desencadenar fluorocromos puede por luz de excitación a una longitud de onda no configura o pretendida para excitar el fluorocromo. La región de compensación interlaser 2212 puede incluir las dos secciones de la tabla de compensación 2200 fuera de las regiones de compensación interlaser. Las dos secciones de región de compensación interlaser 2212 indican valores o factores de compensación para: fluorocromos FL1-FL5, que afectan a los canales de detección para FL6-FL8 y FL9-FL10; fluorocromos FL6-FL8, que afectan a los canales de detección para FL1-FL5 y FL9-FL10; y fluorocromos FL9-FL10, que afectan a los canales de detección para FL1-FL5 y FL6-FL8. Las dos secciones de la región de compensación interlaser 2212 se pueblan con valores o factores usados para corregir distorsión, como se ha tratado anteriormente.
La figura 23 representa un planteamiento para determinar un cálculo de distorsión según algunas realizaciones. En particular, la figura 23 expone seis trazados de resultados de expresión de fluorocromo medida usando diez (10) tintes para un fenotipo de célula [LEUCO]. La tabla 2301 proporciona una lista de conjugados anticuerpo-tinte que pueden ser detectados y usados para desarrollar parámetros de catalogación por compuerta y trazados relacionados, donde la figura 23 proporciona una selección ejemplar de trazados y técnicas de catalogación por compuerta sobre la base de la lista de conjugados anticuerpo-tinte en la tabla 2301. El trazado 2302 expone la señal de un conjugado anticuerpo-tinte CD45-KrO contra la luz dispersada lateral general (SSC) medida desde un sistema de citometría de flujo. En el trazado 2302, la señal de expresión en la primera decena se identifica como [LEUCO], relacionado con ese fenotipo. Los restantes cinco trazados son extrapolaciones de detalle, aplicando técnicas de catalogación por compuerta, de señal en la primera
decena de señal [LEUCO]. El trazado 2304 expone la señal SSC contra CD13-PC5.5 (la señal de CD13 medida en el PMT para PC5.5) e identifica la región de expresión y la densidad para CD13 en el mismo. El trazado 2306 expone la señal SSC contra HLADR-PC7 (la señal de HLADR medida en el PMT para PC7) e identifica la región de expresión y la densidad para HLADR en el mismo. El trazado 2308 expone la señal SSC contra CD117-APC (la señal de CD117 medida en el PMT para APC) e identifica la región de expresión y densidad para CD117 en el mismo. El trazado 2310 expone la señal SSC contra CD34-APCA700 (la señal de CD34 medida en el PMT para APCA700) e identifica la región de expresión y la densidad para CD34 en el mismo. El trazado 2312 expone la señal SSC contra CD33-APCA750 (la señal de CD33 medida en el PMT para APCA750) e identifica la región de expresión y la densidad para CD33 en el mismo. Como es evidente de los seis trazados de la figura 23, el perfil de resultados puede aparecer diferente para cualquier conjugado dado anticuerpo-tinte medido y la densidad de cualquier conjugado dado anticuerpo-tinte se puede aislar de señal para otras combinaciones de conjugado anticuerpo-tinte presentes en la célula o fenotipo.
La figura 24 representa un planteamiento para determinar un cálculo de distorsión según algunas realizaciones. En particular, la figura 24 expone seis trazados de resultados de expresión de fluorocromo medida usando diez (10) tintes para un fenotipo de célula [LEUCO], que indica cuadrantes para niveles de detección pronosticados para diferentes parámetros de catalogación por compuerta. La tabla 2401 proporciona una lista de conjugados anticuerpo-tinte que pueden ser detectados y usados para desarrollar parámetros de catalogación por compuerta y trazados relacionados, donde la figura 24 proporciona una selección ejemplar de trazados y técnicas de catalogación por compuerta sobre la base de la lista de conjugados anticuerpo-tinte en la tabla 2401. El primer trazado 2402 expone la señal SSC global contra señal medida de un conjugados anticuerpo-tinteCD34-APCA700 para un fenotipo de célula [LEUCO]. La señal que indica la población de acontecimientos positivos CD34 se identifica como región 2414.
Los cinco trazados restantes reflejan la aplicación de técnicas de catalogación por compuerta para identificar positividad o negatividad de señal en comparación con señal medida por el sistema de otros conjugados de fluorocromo. El trazado 2404 expone la señal medida de CD34-APCA700 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD13, mientas que permanece negativo para antígenos CD33 y CD117. El trazado 2406 expone la señal medida de CD34-APCA700 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD17, mientas que permanece negativo para antígenos CD13 y CD33. El trazado 2408 expone la señal medida de CD34-APCA700 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD33, mientas que permanece negativo para antígenos CD13 y CD117. El trazado 2410 expone la señal medida de CD34-APCA700 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD13 y CD33 mientas que permanece negativo para antígenos CD117. El trazado 2412 expone la señal medida de CD34-APCA700 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD13, c D33 y CD117.
La figura 25 representa un planteamiento para determinar un cálculo de distorsión según algunas realizaciones. En particular, la figura 25 expone seis trazados de resultados de expresión de fluorocromo medida usando diez (10) tintes para un fenotipo de célula [LEUCO], que indica cuadrantes para niveles de detección pronosticados para diferentes parámetros de catalogación por compuerta. La tabla 2501 proporciona una lista de conjugados anticuerpo-tinte que pueden ser detectados y usados para desarrollar parámetros de catalogación por compuerta y trazados relacionados, donde la figura 25 proporciona una selección ejemplar de trazados y técnicas de catalogación por compuerta sobre la base de la lista de conjugados anticuerpo-tinte en la tabla 2501. El trazado 2502 expone la señal SSC global contra señal medida de un conjugado anticuerpo-tinte CD117-APC para un fenotipo de célula [LEUCO]. La señal que indica la población de acontecimientos positivos CD117 se identifica como región 2514. Los cinco trazados restantes reflejan la aplicación de técnicas de catalogación por compuerta para identificar positividad o negatividad de señal en comparación con señal medida por el sistema de otros conjugados de fluorocromo. El trazado 2504 expone la señal medida de CD117-APC con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD13, mientas que permanece negativo para antígenos CD33 y CD34. El trazado 2506 expone la señal medida de CD117-APC con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD33, mientas que permanece negativo para antígenos CD13 y CD34. El trazado 2508 expone la señal medida de CD117-APC con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD34, mientas que permanece negativo para antígenos CD13 y CD33. El trazado 2510 expone la señal medida de CD117-APC con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD13 y c D33, mientas que permanece negativo para antígenos CD34. El trazado 2512 expone la señal medida de CD117-APC con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD13, CD33 y CD43.
La figura 26 representa un planteamiento para determinar un cálculo de distorsión según algunas realizaciones. En particular, la figura 26 expone siete trazados de resultados de expresión de fluorocromo medida usando diez (10) tintes para un fenotipo de célula [LEUCO], que indica cuadrantes para niveles de detección pronosticados para diferentes parámetros de catalogación por compuerta. La tabla 2601 proporciona una lista de conjugados anticuerpo-tinte que pueden ser detectados y usados para desarrollar parámetros de catalogación por compuerta y trazados relacionados, donde la figura 26 proporciona una selección ejemplar de trazados y técnicas de catalogación por compuerta sobre la base de la lista de conjugados anticuerpo-tinte en la tabla 2601. El trazado 2602 expone la señal SSC global contra señal medida de un conjugado anticuerpo-tinte CD33-APCA750 para un fenotipo de célula [LEUCO]. La señal que indica la población de acontecimientos positivos CD33 se identifica como región 2616. Los seis trazados restantes reflejan la
aplicación de técnicas de catalogación por compuerta para identificar positividad o negatividad de señal en comparación con señal medida por el sistema de otros conjugados de fluorocromo. El trazado 2604 expone la señal medida de CD33-APCA750 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD13, mientas que permanece negativo para antígenos CD34, CD117 y HLADR. El trazado 2606 expone la señal medida de CD33-APCA750 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD34, mientas que permanece negativo para antígenos CD13, CD117 y HLADR. El trazado 2608 expone la señal medida de CD33-APCA750 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD117, mientas que permanece negativo para antígenos CD13, CD34 y HLADR. El trazado 2610 expone la señal medida de CD33-APCA750 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD117, mientas que permanece negativo para antígenos CD13, CD34 y HLADR. El trazado 2612 expone la señal medida de CD33-APCA750 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD13, mientas que permanece negativo para antígenos CD34 y CD117. El trazado 2614 expone la señal medida de CD33-APCA750 con parámetros de catalogación por compuerta aplicados para indicar además señal positiva medida de antígenos CD34, CD117 y HLADR, mientras que permanece negativo para CD13.
La figura 27 representa aspectos de un modelo de distorsión APCA700/A750 en un canal APC, según realizaciones. La gráfica tridimensional traza la intensidad creciente de la señal APCA750 detectada por un canal APC PMT, versus la intensidad creciente de la señal APCA700 detectada por el canal APC PMT, ambas trazadas contra el nivel de detección global medido por el canal APC PMT. En un punto de referencia seleccionado, por ejemplo, por encima de 1.00 como detecta el canal APC, las señales de acontecimiento se pronostican o calculan para ser acontecimientos positivos. Por el contrario, por debajo del punto de referencia seleccionado, las señales de acontecimiento se pronostican o calculan para ser acontecimientos negativos. En un punto de máxima intensidad APCA750 y cero intensidad APCA700, la señal de acontecimiento medida por el canal APC se somete a distorsión "pura" o solamente APCA750. Por el contrario, en un punto de máxima intensidad APCA700 y cero intensidad APCA750, la señal de acontecimiento medida por el canal APC se somete a distorsión "pura" o solamente APCA700. El modelo que se muestra en la figura 27 se puede expandir en dimensiones adicionales para un número arbitrario de fluorocromos de distorsión. Tales modelos que se muestran en la figura 27 se pueden usar en cálculos para retirar el efecto de señal de acontecimiento de fluorocromos de distorsión sobre las mediciones registradas por un canal y PMT para un fluoroforo deseado.
La figura 28 representa una tabla de distorsión ejemplar 2800, similar a la tabla de distorsión 2200 tratada en relación a la figura 22A y la figura 22B. Como se puede ver en la tabla de distorsión 2800, los tintes específicos usados por un panel (o, como alternativa, usados en una simulación de diseño de panel) se pueden identificar específicamente. De manera similar, las propiedades de filtro pasobanda de los detectores de canal PMT del hardware usado por un instrumento que mide emisión (o, como alternativa, usado en una simulación de diseño de panel) se puede identificar específicamente. En aspectos, la agrupación de tintes de canales PMT se puede basar en la longitud de onda del láser de excitación para un tinte dado, sin embargo, la exposición de una tabla de distorsión puede presentar las agrupaciones de valores de distorsión en cualquier orden que sea útil o apropiado para un operario. Como es evidente al comparar las dos tablas de distorsión, tabla de distorsión 2200 y tabla de distorsión 2800, la identidad de los detectores PMT y tintes usados para cualquier configuración de hardware o diseño de panel particulares puede cambiar los valores de distorsión usados para hacer cálculos de corrección.
La figura 29 es una tabla 2900 que identifica una disposición ejemplar del objetivo de antígenos 2902, tintes 2904 y láseres de excitación 2906 para activar los tintes identificados. Como se indica, los láseres de excitación 2906 son operativos para excitar sus respectivos tintes 2904, que a su vez son conjugados con su objetivo de antígenos 2902. En aspectos, datos compensados que se adquieren usando tales disposiciones se pueden exportar a un procesador y sistema operativo o programa, tal como una tabla de 20 bits a Excel, por medio de software tal como Kaluza 1.2 beta. La clasificación de acontecimiento positivo y negativo se puede calcular para cada acontecimiento individualmente, particularmente en el contexto de conjugados anticuerpo-tinte específicamente evaluados. Las figuras 29A-29E representan aspectos de datos reales según realizaciones, usando la disposición del objetivo de antígenos 2902, tintes 2904 y láseres de excitación 2906 como se representa en la figura 29.
La figura 29A representa aspectos de datos reales según una realización de la presente divulgación, particularmente el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo, aplicando técnicas de catalogación por compuerta para señal de acontecimiento CD62L-FITC versus CD4-PacBlue 2902. El trazado de señal de acontecimiento CD62L-FITC versus CD4-PacBlue (Pacific Blue) 2902 muestra diferenciación que es ortogonal, reflectante de los canales inalterados evaluados. Por consiguiente, la población de todos los acontecimientos se puede clasificar como distintas poblaciones de acontecimientos que son: un negativo para ambos CD62L-FITC y población CD4-PacBlue 2904, un positivo para CD62L-FITC y negativo para población CD4-PacBlue 2906, un negativo para ambos CD62L-FITC y un positivo para población CD4-PacBlue 2908, y un positivo para ambos CD62L-FITC y población CD4-PacBlue 2910.
La figura 29B representa aspectos de datos reales según realizaciones de la presente divulgación, particularmente el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo, aplicando técnicas de catalogación por compuerta para señal de acontecimiento CD117-PE versus CD45RA-ECD 2912. Por consiguiente, la población de todos los acontecimientos se puede clasificar como poblaciones de acontecimientos que son: una población
negativa para ambos CD117-PE y CD45RA-ECD 2914, una población positiva para CD117-PE y negativa para CD45RA-ECD 2916, una población negativa para ambos CD117-PE y un positiva para CD45RA-ECD 2918, y una población positiva para ambos CD117-PE versus CD45RA-ECD 2920. El trazado de señal de acontecimiento CD117-PE versus CD45RA-ECD 2912 indica al menos una "bisagra" que afecta a la clasificación de acontecimientos individuales como positivo o negativo, reflectante de los canales evaluados. Una primera bisagra se puede identificar en la región entre la población de acontecimientos 2914 y la población de acontecimientos 2920, mientras una segunda bisagra se puede identificar en la región entre la población de acontecimientos 2916 y la población de acontecimientos 2920. Estos resultados pueden reflejar además múltiples superposiciones de coeficientes de variación (CV) entre diversas poblaciones.
La figura 29C representa aspectos de datos reales según realizaciones de la presente divulgación, particularmente el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo, aplicando técnicas de catalogación por compuerta para señal de acontecimiento CD69-PC5 versus CD45RA-ECD 2922. Por consiguiente, la población de todos los acontecimientos se puede clasificar como poblaciones de acontecimientos que son: una población negativa para ambos CD69-PC5 y CD45RA-ECD 2924, una población positiva para CD69-PC5 y negativa para CD45RA-ECD 2926, una población negativa para ambos CD69-PC5 y un positiva para CD45RA-ECD 2928, y una población positiva para ambos CD69-PC5 versus CD45RA-ECD 2930. El trazado de señal de acontecimiento CD69-PC5 versus CD45RA-ECD 2922 indica al menos un "bisagra" que afecta a la clasificación de acontecimientos individuales como positivo o negativo, reflectante de los canales evaluados. Una primera bisagra se puede identificar en la región entre la población de acontecimientos 2924 y la población de acontecimientos 2930, mientras una segunda bisagra se puede identificar en la región entre la población de acontecimientos 2926 y la población de acontecimientos 2930. Estos resultados pueden reflejar además múltiples superposiciones de coeficientes de variación (CV) entre diversas poblaciones.
La figura 29D representa aspectos de datos reales según realizaciones de la presente divulgación particularmente el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo, donde la aplicación de técnicas de catalogación por compuerta puede no ser útil o posible. En particular, se muestra el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo para señal de acontecimiento CD69-PC5 versus CD16-APCA7502932. Por consiguiente, la población de todos los acontecimientos se puede clasificar como poblaciones de acontecimientos que son: una población negativa para ambos CD69-PC5 y CD16-APCA750 2934, una población positiva para CD69-PC5 y negativa para CD16-APCA750 2936, una población negativa para ambos CD69-PC5 y un positiva para CD16-APCA750 2938, y una población positiva para ambos CD69-PC5 versus CD16-APCA750 2940. El trazado de señal de acontecimiento CD69-PC5 versus CD16-APCA7502932, sin embargo, no indica una región clara que puede definir una "bisagra" para clasificar de manera fiable acontecimientos individuales como positivo o negativo respecto a los canales evaluados. Estos resultados pueden reflejar múltiples superposiciones de coeficientes de variación (CV) entre las diversas poblaciones. Así, en algunos aspectos, análisis de CD69-PC5 versus CD16-APCA750 en combinación se puede considerar que no se puede catalogar por compuerta, y se puede evitar análisis o diseño de panel adicionales.
La figura 29E representa aspectos de datos reales según realizaciones de la presente divulgación particularmente el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo, donde la aplicación de técnicas de catalogación por compuerta puede no ser útil o posible. En particular, se muestra el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo para señal de acontecimiento CD69-PC5 versus CD56-APC 2942. Por consiguiente, la población de todos los acontecimientos se puede clasificar como poblaciones de acontecimientos que son: una población negativa para ambos CD69-PC5 y CD56-APC 2944, una población positiva para CD69-PC5 y negativa para CD56-APC 2946, una población negativa para ambos CD69-PC5 y un positiva para c D56-APC 2948, y una población positiva para ambos CD69-PC5 versus CD56-APC 2950. El trazado de señal de acontecimiento CD69-PC5 versus CD56-APC 2942, sin embargo, no indica una región clara que puede definir un "bisagra" para clasificar de manera fiable acontecimientos individuales como positivo o negativo respecto a los canales evaluados. Estos resultados pueden reflejar múltiples superposiciones de coeficientes de variación (CV) entre las diversas poblaciones. Así, en algunos aspectos, análisis de CD69-PC5 versus CD56-APC en combinación puede considerar que no se puede catalogar y se puede evitar análisis o diseño de panel adicionales.
La figura 30 es una tabla 3000 que identifica una disposición ejemplar del objetivo de antígenos 3002, tintes 3004 y láseres de excitación 3006 para activar los tintes identificados. Como se indica, los láseres de excitación 3006 son operativos para excitar sus respectivos tintes 3004, que a su vez son conjugados con su objetivo de antígenos 3002.
La figura 30A representa aspectos de datos reales según realizaciones de la presente divulgación, usando la disposición de objetivo de antígenos 3002, tintes 3004 y láseres de excitación 3006 como se representa en la figura 30, particularmente el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo. En la figura 30A, no se aplican técnicas de catalogación por compuerta o algoritmos, permitiendo una evaluación holística de clasificación positivo y negativo sobre la base de los canales PMT de detección usados para evaluar las señales de acontecimiento. Específicamente, se muestra el trazado de datos de acontecimientos adquiridos de un instrumento de citometría de flujo para señal de acontecimiento CD27-PC7 versus CD3-PacO (Pacific Orange) 3008. La población de todos los acontecimientos se puede clasificar como poblaciones de acontecimientos que son: una población negativa para ambos CD27-PC7 y CD3-PacO 3010, una población positiva para CD27-PC7 y negativa para cD3-PacO 3012, una
población negativa para ambos CD27-PC7 y un positiva para CD3-PacO 3014, y una población positiva para ambos CD27-PC7 versus CD3-PacO 3016. Sin embargo, sin aplicación de una técnica de catalogación por compuerta como se representa en la presente divulgación, una población de señales de acontecimiento de un conjugado antígeno-anticuerpo diferente se puede agrupar incorrectamente como positivo para otra población de señales de acontecimiento. Por ejemplo, en la figura 30A, una población positiva de señales de acontecimiento para CD19-PC5.53018 se puede agrupar erróneamente con la señal de acontecimiento positiva para CD27-PC7 y negativa para CD3-PacO 3012. Estos resultados de nuevo pueden reflejar múltiples superposiciones de coeficientes de variación (CV) entre las diversas poblaciones, y además reflejar los errores que pueden surgir sin la aplicación de técnicas de catalogación por compuerta.
Se pueden usar y aplicar diversos principios cuando se pronostican o determinan límites de detección. Por ejemplo, según algunas realizaciones, tintes brillantes pueden trabajar bien con antígenos débilmente expresados, mientras que tintes tanto tenues como brillantes pueden trabajar bien con antígenos fuertemente expresados. Además, canales inalterados pueden trabajar bien con antígenos débilmente expresados, mientras que canales silenciosos pueden trabajar bien con antígenos fuertemente expresados. En algunos casos, puede ser deseable permitir desbordamiento entre antígenos excluyentes. En algunos casos, puede ser deseable evitar desbordamiento entre marcadores no exclusivamente coexpresados. En algunos casos, puede ser deseable permitir desbordamiento desde marcadores de subpoblación a marcadores de progenitor. En algunos casos, puede ser deseable evitar desbordamiento desde marcadores de progenitor a marcadores de subpoblación o marcadores coexpresados a subpoblación u otros marcadores coexpresados si la intención es discriminar dentro del intervalo de positivos, es decir, para discriminar acontecimientos de positivos prominentes versus positivos tenues. En algunos casos, puede ser deseable minimizar el número de fluorocromos de distorsión por canal de detección.
Diversas realizaciones de la presente divulgación se consideran de la siguiente manera. En aspectos, la presente divulgación se dirige hacia un método para determinar un panel de sonda para analizar una muestra biológica en un procedimiento de citometría de flujo, donde el método incluye: recibir información en relación con un listado que comprende una pluralidad de sondas, las sondas individuales del listado se asocian con respectivos límites de detección específicos de canal individual; recibir información en relación con un patrón de coexpresión antigénico; evaluar combinaciones de sondas individuales como panel de sonda, sobre la base de la configuración de hardware de citómetro de flujo, los límites de detección específicos de canal individual, y el patrón de coexpresión antigénico, las combinaciones son subconjuntos de sondas del listado; determinar el panel de sonda para usar con la configuración de hardware de citómetro de flujo, límites de detección específicos de canal individual, y patrón de coexpresión antigénico; y sacar un panel de sonda para usar en un procedimiento de citometría de flujo. En algunos aspectos, el método puede incluir además recibir información en relación con una configuración de hardware de citómetro de flujo. En otros aspectos, información recibida en relación con la configuración de hardware de citómetro de flujo puede incluir cualquiera o toda la información en relación con al menos una intensidad de láser de excitación, al menos una longitud de onda de láser de excitación, y al menos un intervalo de canal de detección de tubo fotomultiplicador. En aspectos adicionales, información recibida en relación con el listado que comprende una pluralidad de sondas además puede implicar cualquiera o todos de acceder a un medio no transitorio legible por ordenador que tiene una biblioteca de límites de detección específicos de canal para la pluralidad de sondas, un operario selecciona un anticuerpo y un tinte correspondiente como al menos un miembro del panel de sonda, seleccionar automáticamente un anticuerpo y un correspondiente tinte de una biblioteca como al menos un miembro del panel de sonda, y seleccionar automáticamente un anticuerpo y un tinte correspondiente de una biblioteca para cada miembro del panel de sonda. En algunas realizaciones, el listado puede incluir uno o más miembros ficticios. En algunos aspectos, recibir información en relación con el patrón de coexpresión antigénico puede incluir acceder a un medio no transitorio legible por ordenador que tiene una biblioteca de relaciones de coexpresión. En incluso aspectos adicionales, evaluar combinaciones de sondas individuales como panel de sonda puede incluir calcular cualquier solapamiento o distorsión entre límites de detección específicos de canal de dos o más sondas individuales. En algunos aspectos, el patrón de coexpresión antigénico puede incluir relaciones de coexpresión entre antígenos para un tipo particular de célula.
Cada uno de los cálculos u operaciones descritos en esta memoria se puede realizar usando un ordenador, red de comunicación, u otro procesador que tiene hardware, software y/o firmware. Un sistema ejemplar con ordenador, red de comunicación u otro procesador, presentes, que tiene hardware, software y/o firmware se puede encontrar en el n.° de solicitud de patente de EE. UU. 13/935.154. Las diversas etapas de método pueden ser realizadas por módulos, y los módulos pueden comprender cualquiera de una gran variedad de hardware y/o software de procesamiento de datos digitales y/o analógicos dispuestos para realizar las etapas de método descritas en esta memoria. Los módulos comprenden opcionalmente datos hardware de procesamiento adaptado para realizar una o más de estas etapas al tener código de programación máquina apropiado asociado con el mismo, los módulos para dos o más etapas (o zonas de dos o más etapas) se integran en una única placa de procesador o separado en diferentes placas de procesador en cualquiera de una gran variedad de arquitecturas de procesamiento integradas y/o distribuidas. Estos métodos y sistemas a menudo emplearán medios tangibles que incorporan código legible por máquina con instrucciones para realizar las etapas de método descritas anteriormente. Medios tangibles adecuados pueden comprender una memoria (incluida una memoria volátil y/o una memoria no volátil), medios almacenamiento (tales como grabación magnética en un disco flexible, un disco duro, una cinta, o algo semejante; en una memoria óptica tal como un CD, un CD-R/W, un CD-ROM, un DVD, o algo semejante; o cualquier otro medio de almacenamiento digital o analógico), o algo semejante.
Se aprecia que un sistema de citometría de flujo como se describe en la presente memoria se puede configurar para
llevar a cabo diversos aspectos de métodos de la presente invención. Por ejemplo, un componente de procesador o módulo de un sistema puede ser un módulo de control de microprocesador configurado para recibir señales de parámetro celular de un módulo o dispositivo de entrada de sensor, de un módulo o dispositivo de entrada de interfaz de usuario, y/o de un sistema analizador, opcionalmente por medio de una interfaz de sistema analizador y/o una interfaz de red y una red de comunicación. En algunos casos, dispositivo(s) de entrada de sensor puede incluir o ser parte de un sistema de análisis celular tal como un citómetro de flujo. En algunos casos, se pueden configurar dispositivos de entrada de interfaz de usuario y/o interfaz de red para recibir señales de parámetro celular generadas por un sistema de análisis celular tal como un citómetro de flujo. En algunos casos, el sistema analizador puede incluir o ser parte de un sistema de análisis celular tal como un citómetro de flujo.
Un componente de procesador o módulo también se puede configurar para trasmitir señales de parámetro celular, opcionalmente procesadas según cualquiera de las técnicas descritas en esta memoria, a un dispositivo o módulo de salida de sensor, a un dispositivo o módulo de salida de interfaz de usuario, a un dispositivo o módulo de interfaz de red, a una interfaz de sistema analizador, o cualquier combinación de los mismos. Cada uno de los dispositivos o módulos puede incluir uno o más módulos de software en un medio legible por ordenador que es procesado por un procesador, o módulos de hardware, o cualquier combinación de los mismos. Se puede usar cualquiera de una variedad de plataformas usadas comúnmente, tales como Windows, Macintosh y Unix, junto con cualquiera de una variedad de lenguajes de programación usados comúnmente, para implementar realizaciones de la presente invención.
Dispositivos de entrada de interfaz de usuario pueden incluir, por ejemplo, una plaquita táctil, un teclado, dispositivos se señalización tales como un ratón, un ratón de bola, una tableta de gráficos, un escáner, un joystick, una pantalla táctil incorporada en una pantalla, dispositivos de entrada de audio tales como sistemas de reconocimiento de voz, micrófonos, y otros tipos de dispositivos de entrada. Dispositivos de aporte de usuario también pueden descargar un código ejecutable por ordenador de un medio de almacenamiento tangible o de red de comunicación, el código incorpora cualquiera de los métodos o aspectos del mismo descritos en esta memoria. Se apreciará que software de terminal puede ser actualizado de vez en cuando y descargado al terminal según sea apropiado. En general, el uso del término "dispositivo de entrada" pretende incluir una variedad de dispositivos convencionales y en propiedad y maneras para aportar información al sistema de módulo.
Dispositivos de salida de interfaz de usuario pueden incluir, por ejemplo, un subsistema de exposición, una impresora, una máquina de fax, o exposiciones no visuales tales como dispositivos de salida de audio. El subsistema de exposición puede ser un tubo de rayos catódicos (CRT), un dispositivo de panel plano tales como una pantalla de cristal líquido (LCD), un dispositivo de proyección, o algo semejante. El subsistema de exposición también puede proporcionar una exposición no visual tal como por medio de dispositivos de salida de audio. En general, el uso del término "dispositivo de salida" pretende incluir una variedad de dispositivos convencionales y en propiedad y maneras para tener como salida información desde sistema de módulo a un usuario.
Un subsistema de bus puede proporcionar un mecanismo para permitir a los diversos componentes y subsistemas del sistema de módulo se comunican entre sí como se pretende o se desea. Los diversos subsistemas y componentes del sistema de módulo no tienen que estar en la misma ubicación física sino que puede ser distribuidos en diversas ubicaciones dentro de una red distribuida. Un subsistema de bus puede ser un único bus o puede utilizar múltiples buses.
Una interfaz de red puede proporcionar una interfaz a una red exterior u otros dispositivos. La red de comunicación exterior se puede configurar para efectuar comunicaciones según sea necesario o deseado con otras partes. En muchas realizaciones, la red de comunicación puede ser un sistema de procesamiento basado en web o basado en la nube, permitiendo acceso y procesamiento remoto. Así puede recibir un paquete electrónico de sistema de módulo y trasmitir cualquier información según sea necesario o deseado de regreso al sistema de módulo. Además de proporcionar tales vínculos de comunicaciones de infraestructura internos al sistema, un sistema de red de comunicaciones también puede proporcionar una conexión a otras redes tales como internet y puede comprender una conexión cableada, inalámbrica, por módem y/u otro tipo de interfaz.
Se tiene que entender que las figuras y las descripciones de la invención se ha simplificado para ilustrar elementos que son relevantes para un claro entendimiento de la invención. Se debe apreciar que las figuras se presentan para fines ilustrativos y no como dibujos de construcción. Detalles y modificaciones omitidos o realizaciones alternativas están dentro del ámbito de expertos en la técnica.
Se puede apreciar que, en ciertos aspectos de la invención, un único componente puede ser sustituido por múltiples componentes, y múltiples componentes pueden ser sustituidos por un único componente, para proporcionar un elemento o una estructura o para realizar una función o funciones dados. Excepto donde tal sustitución no sería operativa para practicar ciertas realizaciones de la invención, tal sustitución se considera dentro del alcance de la invención.
Los ejemplos presentados en esta memoria pretenden ilustrar implementaciones potenciales y específicas de la invención. Se puede apreciar que los ejemplos están pensados principalmente a modo de ilustración de la invención para los expertos en la técnica.
Son posibles diferentes disposiciones de los componentes representados en los dibujos o descritos anteriormente, así
como componentes y etapas no mostrados o descritos. De manera similar, algunos rasgos y subcombinaciones son útiles y se pueden emplear sin referencia a otros rasgos y subcombinaciones. Se han descrito realizaciones de la invención por motivos ilustrativos y no restrictivos, y realizaciones alternativas serán evidentes para los lectores de esta patente. Por consiguiente, la presente invención no se limita a las realizaciones descritas anteriormente o representadas en los dibujos, y se pueden hacer diversas realizaciones y modificaciones sin salir del alcance de las reivindicaciones siguientes.
Claims (15)
1. Un método para diseñar un panel de sonda para un citómetro de flujo, el método comprende:
determinar un factor de distorsión que cuantifica el efecto de desbordamiento provocado por emisión de fluorescencia de una primera etiqueta, pretendida para ser medida en un primer canal, a un segundo canal; caracterizado por
aportar una señal esperada máxima de una primera combinación sonda-etiqueta que incluye la primera etiqueta y una primera sonda;
calcular un aumento en el límite de detección en el segundo canal, en donde calcular un aumento en el límite de detección comprende multiplicar el factor de distorsión por la señal esperada máxima de la primera combinación sonda-etiqueta; y
seleccionar una combinación sonda-etiqueta para incluir en el panel de sonda sobre la base del aumento calculado en el límite de detección.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el factor de distorsión es una estimación de un aumento en el límite de detección en el segundo canal como función de una intensidad de emisión de la primera combinación sonda-etiqueta.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el factor de distorsión es una función lineal de la intensidad de emisión de la primera combinación sonda-etiqueta.
4. El método de la reivindicación 2, en donde el aumento en el límite de detección en el segundo canal es provocado por un aumento en un error de medición como función de la intensidad de emisión de la primera combinación sondaetiqueta.
5. El método de la reivindicación 2, en donde el factor de distorsión se calcula usando un índice de diafonía.
6. El método de la reivindicación 1 en donde el factor de distorsión es modificado matemáticamente por un coeficiente que representa el patrón de coexpresión de antígenos correspondiente a la primera combinación sonda-etiqueta y una segunda combinación sonda-etiqueta, la segunda combinación sonda-etiqueta pretendida para ser medida en el segundo canal.
7. El método de la reivindicación 1, que comprende además:
determinar un factor de distorsión para cada etiqueta en un primer panel de sonda potencial para calcular un aumento total en el límite de detección en el segundo canal.
8. El método de la reivindicación 7, en donde seleccionar la combinación sonda-etiqueta se basa en una comparación del aumento total calculado en el límite de detección con una señal mínima esperada en el segundo canal.
9. El método de la reivindicación 7, que comprende además calcular un aumento total en el límite de detección para cada sonda en el primer panel de sonda potencial.
10. El método de la reivindicación 9, que comprende además:
calcular un aumento total en el límite de detección para cada sonda en un segundo panel de sonda potencial; y seleccionar el panel de sonda sobre la base de una comparación del aumento total calculado en el límite de detección para cada sonda en el primer panel de sonda potencial con el aumento total calculado en el límite de detección para cada sonda en el segundo panel de sonda potencial.
11. El método de la reivindicación 9, que comprende además:
calcular un aumento total en el límite de detección para cada sonda en un segundo panel de sonda potencial; y seleccionar el panel de sonda sobre la base del aumento total calculado en el límite de detección para una sonda priorizada en el primer panel de sonda potencial y el segundo panel de sonda potencial.
12. El método de la reivindicación 6, en donde el coeficiente es uno o cero.
13. El método de la reivindicación 1, en donde dicha señal esperada máxima se basa en parte en una densidad de antígeno esperada en un objetivo de célula.
14. El método de la reivindicación 6, en donde el coeficiente se determina para ser cero si el patrón de coexpresión de antígenos correspondiente a la primera combinación sonda-etiqueta y la segunda combinación sonda-etiqueta es mutuamente exclusiva.
15. El método de la reivindicación 6, en donde el coeficiente se determina para ser cero si el antígeno correspondiente a
la segunda combinación sonda-etiqueta es un descendiente del antígeno correspondiente a la primera combinación sonda-etiqueta.
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