BR112015022201B1 - Método para projetar um painel de sonda para um citômetro de fluxo - Google Patents
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Abstract
sistemas e métodos para projeto de painel em citometria de fluxo. as modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos para a determinação dos limites de detecção para vários conjugados de anticorpo-corante para citometria de fluxo. os exemplos de técnicas envolvem uma abordagem de sobre posicionamento linear de transbordamento induzido por alargamentos de erros de medição tipicamente distribuídos
Description
[0001] A presente revelação reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório US N°. 61/791.492 depositado em 15 de março de 2013, que está incorporado no presente a título de referência.
[0002] As modalidades da presente invenção referem-se, de modo geral, a sistemas e métodos para avaliar células de uma amostra biológica e, em particular, a técnicas para selecionar diferentes combinações de conjugado de anticorpo-corante para uso em citometria de fluxo. Outras modalidades referem-se, de modo geral, a sistemas e métodos automatizados para a análise de positividade em citometria de fluxo multicolor.
[0003] A imunofenotipagem de superfície celular com o uso de citometria de fluxo fluorescente tornou-se um processo relativamente rotineiro para a diferenciação e contagem de células de interesse em uma amostra de células contendo muitos tipos de células diferentes. Tipicamente, as sondas de superfície celular, por exemplo, anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo (MAbs) ou outros ligantes adequadamente marcados, específicos para antígenos na superfície externa das células de interesse, são usados para marcar ou "corar" seletivamente tais células para a detecção subsequente. A citometria de fluxo opera para detectar as células coradas por irradiação de células individuais na amostra, uma por uma, com radiação especialmente adaptada para excitar as marcações de fluorocromo. Quando irradiadas, as marcações fluorescem e as suas células associadas dispersam a radiação incidente em um padrão determinado pelas características físicas e ópticas da célula irradiada. Os fotodetectores adequados dentro do citômetro de fluxo detectam a fluorescência e a radiação dispersa, e os seus respectivos sinais de saída são usados para diferenciar os diferentes tipos de células com base nas suas respectivas assinaturas de fluorescência e dispersão da luz.
[0004] A imunofenotipagem por citometria de fluxo envolve, tipicamente, a seleção de um conjunto de sondas ou reagentes fisiologicamente apropriados para o procedimento de avaliação ou de monitoramento desejado. De um modo semelhante, devido ao fato de certas condições de doença poderem ser caracterizadas pela expressão de vários antígenos na superfície das células ou dentro das células do paciente, os painéis de reagentes de sonda de anticorpo que correspondem a esses perfis de antígeno podem ser selecionados. Por exemplo, o painel de reagentes Solastra™ 5-Color é um painel de coquetéis conjugados de anticorpo para uso na caracterização de neoplasia hematolinfoide por citometria de fluxo. O painel pode ser usado para identificação e enumeração das moléculas de superfície de leucócitos relevantes, e como auxiliar no diagnóstico diferencial de pacientes com determinados resultados hematológicos anormais e/ou presença de blastos no sangue, medula óssea e/ou tecidos linfoides. Os reagentes de Solastra™ 5-Color são compostos de anticorpos dirigidos a antígenos de linhagem B, T e mielomonocítica. Tais painéis podem ser usados em análises de citometria de fluxo para aplicações de hematopatologia.
[0005] A medição de amostras através de um dispositivo de citometria de fluxo produz uma assinatura fotônica característica de luz dispersa, luz de fluorescência ou uma combinação das mesmas. Ao analisar a assinatura, é possível inferir as características físicas e químicas da partícula. Frequentemente, a expressão de proteína, uma característica biológica de uma partícula exemplificadora, está sujeita à interrogação. As assinaturas de partículas a partir de uma amostra de sangue podem ser apresentadas em um gráfico de pontos, e o chaveamento pode ser usado para interpretar essas assinaturas. Geralmente, o chaveamento é usado para classificar uma assinatura como positiva ou negativa. Por exemplo, o chaveamento pode ser usado para determinar se uma partícula é uma célula de sangue ou um pedaço de detrito, ou se a célula de sangue contém um marcador para a doença. Assim, o chaveamento é importante para aplicações de hematologia de diagnóstico e clínicas. Entretanto, pode ser difícil determinar se uma partícula pertence a uma população positiva ou negativa, como quando as assinaturas positivas e negativas têm uma aparência semelhante. Uma variedade de técnicas de chaveamento ou de controle de especificidade, como controles isotípicos, modelos que aplicam algoritmos de análise de agrupamento, como análise de componentes principais, e fluorescência menos um (FMO) foi proposta para ajudar a determinar se uma partícula deve ser classificada como positiva ou negativa.
[0006] Embora as técnicas de seleção do painel de anticorpos conhecidas atualmente forneçam muitos benefícios para aqueles que realizam procedimentos de avaliação e monitoramento celular, melhorias adicionais ainda são desejadas. Além disso, as técnicas de controle de chaveamento para avaliar as amostras podem ser melhoradas. As modalidades da presente invenção fornecem soluções para, pelo menos, algumas dessas necessidades pendentes.
[0007] As modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos de seleção e simulação de painéis de conjugado de anticorpo- corante para uso em citometria de fluxo, e outras técnicas de avaliação e monitoramento celular relacionadas. Frequentemente, tais painéis podem ser usados ou projetados para avaliar células de uma amostra biológica. Tais células podem ser obtidas a partir de uma única pessoa, a partir de uma cultura de células, a partir de um conjunto de doadores humanos ou não humanos, ou similares. De acordo com algumas modalidades, as técnicas aqui reveladas podem ser usadas para avaliar qualquer material que inclui partículas (por exemplo, células biológicas) que se encontram presentes em uma suspensão, e que têm estruturas na sua superfície ou no seu interior que podem ser reconhecidas por sondas biológicas específicas marcadas com fluorocromo que se ligam de forma não covalente a essas estruturas, como anticorpos, toxinas, ligantes de receptor, ou seus derivados ou compostos similares. Conforme discutido em outra parte deste documento, as sondas exemplificadoras, que podem incluir anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo (MAbs) ou outros ligantes adequadamente marcados, podem ser específicas para antígenos na superfície externa de, ou no interior de, células de interesse. Embora diferentes procedimentos de preparação da amostra possam ser usados, dependendo de a análise envolver antígenos externos ou internos, as técnicas de aquisição de dados aqui discutidas são igualmente aplicáveis a qualquer tipo de análise. Os fotodetectores adequados dentro do citômetro de fluxo detectam a fluorescência e radiação dispersa, e os seus respectivos sinais de saída são usados para diferenciar os diferentes tipos de células (ou subtipos de um certo tipo de célula ou diferentes estados funcionais entre um certo tipo de células) com base nas suas respectivas assinaturas de fluorescência e dispersão da luz. Essas assinaturas de fluorescência podem ser resolvidas por meio de computador através de um procedimento chamado de compensação de fluorescência, transmitindo, assim, informações quantitativas sobre a presença de cada antígeno único interrogado sobre a superfície ou no interior da célula/partícula.
[0008] A análise imunofenotípica de múltiplas cores por citometria de fluxo envolve, tipicamente, o uso de painéis ou coquetéis de conjugados de anticorpo-corante. Os painéis podem ser configurados de modo que as sondas individuais, tendo respectivos corantes individuais, correspondam aos canais de detecção de cores individuais de um dispositivo de citometria de fluxo. Conforme discutido aqui, a seleção de painéis de sondas pode ser automatizada, racionalizando, assim, o processo de análise de citometria de fluxo multicolor. O uso de tais painéis de sondas em citometria de fluxo pode fornecer a aquisição eficiente de dados de qualidade excelente com o uso de múltiplos canais de detecção. Assim, o tempo de inatividade pode ser reduzido e a produtividade do laboratório pode ser maximizada. De um modo semelhante, as modalidades da presente invenção fornecem uma melhoria da sensibilidade para a detecção de antígenos priorizados, e uma facilitação acentuada de análise de dados.
[0009] Os dispositivos de citometria de fluxo exemplificadores podem incluir diversas configurações de laser (por exemplo, vários lasers de estado sólido), fornecendo espectros de excitação correspondentes a vermelho, azul, violeta, amarelo e similares. Os filtros ópticos intercambiáveis podem ser usados para facilitar a detecção de uma variedade de corantes e comprimentos de onda. Os sistemas exemplificadores podem ser usados para a análise de múltiplos marcadores fluorescentes simultaneamente. Por exemplo, sistemas que têm seis detectores de fluorescência podem fornecer aquisição simultânea de até seis sinais de fluorescência. Os detectores de fluorescência e/ou lasers adicionais podem ser adicionados a um sistema, permitindo a leitura simultânea de até dez ou mais cores. As modalidades da presente invenção fornecem técnicas de exibição gráfica para dotar um usuário de plotagens, gráficos e outras características visuais que podem facilitar a análise de dados complexos de citometria de fluxo.
[0010] Em um aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos para determinar um painel de sonda para análise de uma amostra biológica em um procedimento de citometria de fluxo. Os métodos exemplificadores incluem a introdução de uma configuração de hardware de citômetro de fluxo, introdução de uma lista que compreende uma pluralidade de sondas, em que as sondas individuais da lista estão associadas com os respectivos limites de detecção específicos de canais individuais, introdução de um padrão de coexpressão antigênica, e determinação do painel de sonda com base na configuração de hardware de citômetro de fluxo, nos limites de detecção específica para canais individuais e no padrão de coexpressão antigênica. O painel de sonda pode incluir um subconjunto de sondas da lista.
[0011] As modalidades adicionais da presente invenção abrangem sistemas e métodos para avaliar a positividade em citometria de fluxo multicolor. As técnicas de especificidade ou de controle de chaveamento exemplificadoras podem ser usadas para avaliar uma assinatura de partículas individuais, por exemplo, para determinar se uma célula de sangue é positiva ou negativa para uma determinada expressão de proteína, como um marcador de doença. Em alguns casos, essas técnicas de controle podem ser usadas para posicionar uma região gráfica ou porta em relação a dados adquiridos, de modo a classificar as células a partir das quais os dados são obtidos. As técnicas de controle exemplificadoras podem ser usadas em procedimentos multicolor após a compensação. Em alguns casos, os métodos descritos aqui fornecem um nível de padronização que não está presente nas técnicas atualmente usadas. Além disso, as técnicas de controle aqui reveladas são rápidas, econômicas e eficazes para os padrões de expressão heterogênea, e possibilitam a quantificação de positivos.
[0012] Outras características descritas acima e muitas outras e vantagens concomitantes das modalidades da presente invenção serão evidentes e mais bem compreendidas por referência à descrição detalhada a seguir quando consideradas em conjunto com os desenhos anexos.
[0013] Os aspectos de sistemas e métodos de acordo com modalidades da presente revelação são descritos pelas ilustrações e figuras apresentadas abaixo.
[0014] A Figura 1 representa aspectos de sistemas de citometria de fluxo e métodos de acordo com algumas modalidades.
[0015] A Figura 1A representa uma ilustração de hardware exemplificadora de um dispositivo de citometria de fluxo, tendo uma configuração de bloco de filtro de dez cores, com três lasers, de acordo com algumas modalidades.
[0016] A Figura 1B representa aspectos de uma técnica de seleção de painel de sonda de acordo com algumas modalidades.
[0017] A Figura 1C representa aspectos da expressão de conjugados de anticorpo-corante que podem referir-se a um conjunto de conjugados de anticorpo-corante dentro de uma base de dados contendo informação sobre as sondas de citometria de fluxo, de acordo com algumas modalidades.
[0018] A Figura 1D representa aspectos de consultas de base de dados para os anticorpos específicos para o antígeno selecionado por um usuário para retornar informações associadas com as respectivas sondas, de acordo com algumas modalidades.
[0019] As Figuras 1E a 1M representam aspectos de uma técnica de avaliação de painel de acordo com as modalidades da presente invenção, de acordo com algumas modalidades.
[0020] As Figuras 1N a 1O representam exemplos para associações e cálculos para três conjugados, para associar dado CD com um determinado corante, de acordo com algumas modalidades.
[0021] As Figuras 1P a 1U representam aspectos adicionais de uma técnica de avaliação de painel, de acordo com modalidades da presente invenção, de acordo com algumas modalidades.
[0022] As Figuras 1V a 1W representam aspectos de monitores para resultados para painéis de sondas com dez cores exemplificadores, de acordo com algumas modalidades.
[0023] A Figura 2 representa aspectos de um processo de seleção de operador, de acordo com algumas modalidades.
[0024] As Figuras 2A a 2C representam recursos de seleção de operação para alvejar o fenótipo, a exclusão do fenótipo, e esquemas de pai/descendente, respectivamente, de acordo com algumas modalidades.
[0025] A Figura 2D representa características de seleção de operação para parâmetros de densidade de antígeno, de acordo com algumas modalidades.
[0026] A Figura 3 representa aspectos de uma técnica de seleção de painel de sonda, de acordo com algumas modalidades.
[0027] A Figura 4 representa certos aspectos de sinalização de isotipo e sensibilidade de resolução, de acordo com algumas modalidades.
[0028] A Figura 5 representa uma comparação entre coeficiência de variância e desvio padrão para eventos de expressão, de acordo com algumas modalidades.
[0029] As Figuras 6A a 6B mostram aspectos de uma distribuição bimodal para determinar eventos de sinal negativo, de acordo com algumas modalidades.
[0030] A Figura 7 representa aspectos de uma distribuição ampliada de eventos de sinal, de acordo com algumas modalidades.
[0031] A Figura 8 representa aspectos de resultados de dados reais de um protocolo de coloração com o uso de um único conjugado de anticorpo-corante, de acordo com algumas modalidades.
[0032] A Figura 9 representa aspectos de limites de detecção que podem ser independentes de, ou ser ajustados para, fatores de compensação, de acordo com algumas modalidades.
[0033] A Figura 10 representa aspectos de uma matriz de distorção de padrão de transbordamento exemplificadora para determinados corantes, de acordo com algumas modalidades.
[0034] A Figura 11 representa aspectos de uma matriz de coexpressão, de acordo com algumas modalidades.
[0035] As Figuras 12A a 12I representam esquemas de padrões de coloração estimados, de acordo com algumas modalidades.
[0036] A Figura 13 representa aspectos de avaliação de painel de sonda, incluindo a categorização de padrões de expressão, de acordo com algumas modalidades.
[0037] A Figura 14 representa aspectos de avaliação de painel de sonda, incluindo relativa contribuição de fluoróforo, de acordo com algumas modalidades.
[0038] A Figura 15 representa aspectos de avaliação de painel de sonda, incluindo relativo brilho de expressão de corantes, de acordo com algumas modalidades.
[0039] A Figura 16A descreve um esquema exemplificador para um sistema de painel de sonda, de acordo com algumas modalidades.
[0040] As Figuras 16B a 16C representam aspectos de um módulo de entrada de usuário para um painel de sonda, de acordo com algumas modalidades.
[0041] As Figuras 16D a 16E representam aspectos de módulos gráficos simuladores para relações de expressão em forma de tabela, de acordo com algumas modalidades.
[0042] As Figuras 16F a 16G representam aspectos de módulos gráficos simuladores para perfis de resultados previstos, de acordo com algumas modalidades.
[0043] As Figuras 16H a 16J representam aspectos de um módulo de valores numéricos simulador para cálculos de distorção, de acordo com algumas modalidades.
[0044] As Figuras 16K a 16L representam aspectos de módulos de padrão de transbordamento, de acordo com algumas modalidades.
[0045] As Figuras 16M a 16O representam aspectos de um módulo de base de dados de anticorpo, de acordo com algumas modalidades.
[0046] A Figura 17 representa aspectos de uma abordagem numérica para modelar padrões de transbordamento incluindo gráficos de radar de detecção para análise multivariada, de acordo com algumas modalidades.
[0047] As Figuras 18A a 18B representam aspectos adicionais de uma abordagem numérica para modelar padrões de transbordamento incluindo gráficos de radar de detecção para análise multivariada, de acordo com algumas modalidades.
[0048] As Figuras 19A a 19B representam aspectos adicionais de uma abordagem numérica para modelar padrões de transbordamento incluindo gráficos de radar de detecção para análise multivariada, de acordo com algumas modalidades.
[0049] As Figuras 20A a 20G representam aspectos de uma interface computadorizada para a concepção e simulação de um painel de sonda, de acordo com algumas modalidades.
[0050] As Figuras 21A a 21B representam aspectos adicionais de uma interface computadorizada para a concepção e simulação de um painel de sonda, de acordo com algumas modalidades.
[0051] As Figuras 22A a 22B representam aspectos, de acordo com algumas modalidades.
[0052] As Figuras 23 a 26 representam aspectos de uma interface computadorizada para a concepção e simulação de um painel de sonda, de acordo com algumas modalidades.
[0053] A Figura 27 representa uma distorção de modelagem de gráfico tridimensional em um canal de PMT, causada pela intensidade de sinal de dois corantes os quais o PMT não é dirigido para detectar, de acordo com modalidades.
[0054] A Figura 28 representa uma tabela de distorção exemplificadora, de acordo com algumas modalidades.
[0055] As Figuras 29 a 29E representam aspectos de dados reais, dados de evento de plotagem adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo aplicando chaveamento aos dados onde for aplicável, de acordo com algumas modalidades.
[0056] As Figuras 30 a 30A retratam aspectos de dados reais, dados de evento de plotagem adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo sem aplicar chaveamento aos dados, de acordo com algumas modalidades.
[0057] A citometria de fluxo, frequentemente, envolve a marcação de uma amostra de partículas com corantes fluorocromos, e, depois, avaliação das propriedades das partículas individuais da amostra com o uso de vários detectores de fluorescência específicos para vários comprimentos de onda. Dessa forma, é possível obter dados qualitativos e quantitativos sobre a amostra de partículas. Por exemplo, diferentes receptores de superfície celular em uma célula de sangue podem ser marcados com diferentes corantes fluorocromos, e um citômetro de fluxo pode usar canais de fluorescência separados para detectar a luz emitida resultante. Em modalidades exemplificadoras, múltiplos comprimentos de onda de luz de excitação podem ser usados em conjunto com vários corantes fluorocromos e vários detectores de fluorescência, de modo a se obter simultaneamente vários parâmetros de uma amostra. Em modalidades particulares, os fatores de distorção resultantes do uso conjunto de vários corantes fluorocromos e vários detectores de fluorescência podem ser quantificados.
[0058] O termo "evento", como usado aqui, pode se referir a uma partícula que passa através de um feixe de luz, ou a dados ou assinatura que representam a partícula. Um evento pode ser avaliado com o uso de vários detectores, e cada detector pode fornecer respectivo parâmetro de intensidade ou de sinal. De um modo semelhante, cada detector pode estar associado com um respectivo canal do citômetro de fluxo. Por exemplo, uma medição de um detector individual pode ser chamada de um parâmetro (por exemplo, dispersão frontal, dispersão lateral, ou fluorescência medida), e os dados obtidos em cada parâmetro para uma partícula podem ser chamados de um evento.
[0059] Em alguns casos, um parâmetro medido pode não atingir um limiar específico para o canal detector, e, portanto, pode não se registrar como um evento. Nesse sentido, a interação entre um feixe de luz e uma partícula que flui através do citômetro pode ou não produzir um evento de partícula. Opcionalmente, tal limiar pode ser usado para reduzir ou eliminar os sinais causados por ruído, detritos e similares.
[0060] As modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos que envolvem a determinação de limite de detecção de sinais de fluorescência em fotomultiplicadores para uso em aplicações de citometria de fluxo. Em alguns casos, a determinação de um limite de detecção pode ser baseada em um padrão de expressão esperado de uma célula alvo (que pode ser marcada com conjugados de anticorpos- fluorocromo), nas intensidades de sinal de fluorescência esperadas para marcadores fluorescentes individuais que surgem da marcação fluorescente dos antígenos compreendidos pelo padrão de expressão, e em uma matriz de transbordamento esperada para os fluorocromos nos diferentes fotomultiplicadores.
[0061] De acordo com algumas modalidades, pode haver uma entrada adicional que abrange a disseminação de dados que é específica para uma dada faixa de detecção de comprimento de onda (conforme determinado pelo filtro passa-banda em frente a um fotomultiplicador), já que o último pode determinar a respectiva sensibilidade do fotomultiplicador e, portanto, o erro de medição (disseminação de dados). A relação entre transbordamento e disseminação de dados resultante pode ser avaliada experimentalmente.
[0062] As modalidades exemplificadoras permitem que um usuário do dispositivo de citometria selecione uma combinação de anticorpos de fluorocromo desejada (por exemplo, painel de sonda), que pode ser usada para construir experimentos de citometria de fluxo incluindo uma previsão dos limites de detecção para os conjugados de fluorocromo; isso também pode ser chamado de um painel de simulação. Além disso, um usuário do dispositivo de citometria pode selecionar uma combinação de anticorpos sem atribuir marcações fluorescentes para cada um dos mesmos, respectivamente, a fim de obter uma proposta para um painel de sonda com limites de detecção minimizados para sondas individuais desejadas dentro desse painel de sonda. Em alguns casos, as técnicas de projeto ou de avaliação de painel podem envolver o uso de um modelo de sobreposicionamento linear de alargamentos induzidos por transbordamento de erros de medição normalmente distribuídos.
[0063] As técnicas de avaliação e de projeto de painel de sonda, conforme revelado no presente documento, podem usar dados de medições de fluorocromo de referência com um único corante para cálculos de um transbordamento (que pode ser alternativamente chamado de excesso/alastramento, derramamento ou interferência). Em alguns casos, um fator de distorção pode ser caracterizado pela seguinte fórmula:
[0064] Em outras palavras, a determinação de um fator de distorção pode quantificar o efeito de transbordamento de um primeiro marcador (que é parte de um conjugado de sonda-marcador), em que a primeira marcação é destinada ou configurada para ser medida em um primeiro canal (por exemplo, um detector de PMT) em pelo menos um segundo canal, em que o segundo canal (ou outros canais adicionais) é destinado e configurado para medir uma marcação diferente. Em alguns aspectos, o fator de distorção pode ser uma estimativa de um aumento no limite de detecção do segundo canal como uma função de uma intensidade de emissão de uma primeira combinação de sonda-marcador. Em outros aspectos, o fator de distorção pode ser uma função linear da intensidade de emissão de uma primeira combinação de sonda- marcador. Em outros aspectos, o fator de distorção pode ser calculado com o uso de um índice de interferência. Em alguns aspectos, o fator de distorção é matematicamente modificado por um coeficiente que representa o padrão de coexpressão de antígenos correspondente a uma primeira combinação de sonda-marcador e uma segunda combinação de sonda-marcador, sendo que a segunda combinação de sonda-marcador é destinada ou configurada para ser medida em um segundo canal. Em aspectos adicionais, a determinação de um fator de distorção para cada marcador em um primeiro painel de sonda potencial pode ser feita para calcular um aumento total no limite de detecção em um segundo canal.
[0065] Em alguns casos, uma técnica de avaliação ou de projeto de painel de sonda pode envolver o uso de um padrão de expressão de antígenos esperado em diferentes células alvos, como exclusão, subpopulação (por exemplo, pai-descendente, conforme representado na Figura 1D), características de coexpressão não exclusiva, ou características de expressão de antígenos esperadas, como distinta ou modulada. Em alguns casos, uma técnica de avaliação ou de projeto de painel de sonda pode envolver a previsão, estimativa ou, de outro modo, a determinação dos limites de detecção para os canais de detecção individuais, opcionalmente, para uma variedade de diferentes tipos de células ou de padrões de expressão de antígeno.
[0066] Conforme usado aqui, na descrição de antígenos, os termos genealógicos "pai", "filho", "irmão", "tia", e "primo" são usados para identificar e descrever as relações entre os agrupamentos de diferenciação ("CD") para antígenos específicos, ou o anticorpo correspondente. Nota-se, entretanto, que no contexto da presente revelação, esses termos não se referem a gerações de reprodução celular, mas, em vez disso, referem-se a etapas de desenvolvimento de uma determinada célula como antígenos sobre dada alteração da superfície celular devido à diferenciação ou especialização. Por exemplo, um antígeno, como o CD45, pode estar presente em uma célula T nativa; se a célula T nativa se especializa para se tornar uma célula T matadora, o antígeno CD45 pode atuar como um precursor a, e se tornar um antígeno CD2 (filho), ao passo que se a célula T nativa se especializa para se tornar uma célula T auxiliar, o antígeno CD45 pode atuar como um precursor a, e se tornar um antígeno CD4 (filho). Em tal situação, o antígeno CD45 pode ser chamado de o antígeno pai para ambos os antígenos CD4 e CD2 irmãos.
[0067] As relações de desenvolvimento possíveis entre os antígenos são, em geral, apresentadas da seguinte forma. Em algumas células, dois antígenos diferentes podem ocorrer na mesma superfície celular, cada um deles com a sua densidade média e faixa de expressão típicas, resultando em um caso chamado de "coexpressão". A presença de um antígeno na superfície celular pode excluir a presença de um outro antígeno específico na mesma superfície celular, resultando em um caso chamado "exclusão". Os antígenos com um "pai" idêntico são chamados de "irmãos". Em algumas células, um primeiro antígeno pode ocorrer em uma superfície celular, onde um segundo antígeno é também expresso, entretanto, o segundo antígeno pode também ocorrer em uma superfície celular sem o primeiro antígeno estar presente. Em tais casos, o segundo antígeno é chamado de antígeno "pai", enquanto o primeiro antígeno é chamado de "descendente" ou antígeno "filho", resultando em um caso chamado de "pai-descendente" ou "pai-filho". O "irmão" de um "pai" de um determinado antígeno é chamado de "tio" desse antígeno. Ao considerar um antígeno específico, seus "irmãos" não excluídos, seus filhos, seus filhos adicionais (ou "netos"), outros antígenos descendentes, seu "pai", seus "pais" adicionais (ou "avós") e todos os outros antígenos ascendentes e seus "tios" não excluídos podem ser chamados de genealogia de desenvolvimento (ou árvore desenvolvimental) do antígeno específico. Pode ocorrer que uma única proteína seja expressa em diferentes tipos de células que pertencem a diferentes genealogias desenvolvimentais, possivelmente também tendo diferentes características de densidade, faixa e distribuição média de expressão desse antígeno. As múltiplas entidades celulares desse antígeno que expressa multiplicidade podem ser chamadas de "múltiplas". Além disso, dois antígenos coexpressos podem ter densidades de expressão inversamente correlacionadas, resultando em um processo chamado de "correlação inversa".
[0068] Um conjunto de diretivas para a criação de genealogias desenvolvimentais para um determinado antígeno pode incluir as seguintes regras: (1) cada antígeno deve ser atribuído a pelo menos um "pai", se o "pai" não é conhecido, "desconhecido" é atribuído como "pai"; (2) se existente, para cada antígeno, "exclusões", "correlações" ou "correlações inversas" com "irmãos" devem ser identificadas, em aspectos, a ordem da consideração dos irmãos pode ser com base em qual antígeno tem o nome em ordem alfabética anterior; (3), se existente, para cada antígeno, "exclusões", "correlações" ou "correlações inversas" com "tios" devem ser identificadas, a menos que os tios sejam excluídos pelo pai do respectivo antígeno; (4) "múltiplos" devem ser manuseados como se os mesmos fossem múltiplos antígenos diferentes, a fim de manter a consistência das genealogias do antígeno individual, isso é feito através da atribuição de diferentes "pais", "irmãos" e "tios" excluídos ou inversamente correlacionados, e (5) antígenos correlacionados compartilham as mesmas exclusões e correlações inversas, mas não têm necessariamente os mesmos múltiplos. Por esse conjunto de regras, o conjunto completo de genealogias desenvolvimentais de antígeno para uma determinada espécie e compartimento do corpo podem ser criados, estabelecendo todas as relações possíveis entre todos os antígenos.
[0069] De acordo com algumas modalidades, os limites de detecção podem ser usados para classificar, comparar ou, de outro modo, avaliar painéis de fluorocromo-anticorpo, com base em padrões de expressão de antígeno (que podem envolver densidades de expressão de antígenos e brilho de fluorocromo), opcionalmente em combinação com os dados experimentais. Em alguns aspectos, os cálculos relacionados com a determinação dos limites detecção podem incluir a introdução, ou recebimento, de informações sobre um sinal máximo esperado de uma primeira combinação de sonda-marcador, com base nas características de uma primeira sonda e primeiro marcador. Em um instrumento ou sistema em que o sinal de uma primeira combinação de sonda- marcador pode criar transbordamento para pelo menos um segundo canal de detecção (isto é, um canal não configurado para detectar especificamente o primeiro conjugado de sonda-marcador), o cálculo do aumento nos limites de detecção de um segundo canal pode ser baseado em um fato de distorção e no sinal máximo esperado da primeira combinação de sonda-marcador. Consequentemente, uma combinação de sonda-marcador pode ser selecionada ou escolhida para incluir o painel de sonda com base no(s) aumento(s) calculado(s) no(s) limite(s) de detecção. Em aspectos adicionais, o aumento em um limite de detecção em pelo menos um segundo canal pode ser causado por um aumento no erro de medição, como uma função de intensidade de emissão, de uma primeira combinação de sonda-marcador.
[0070] Os sistemas e métodos de painéis de sonda exemplificadores, conforme descrito no presente documento, são adequados para uso na avaliação de várias combinações de conjugado (por exemplo, combinações de painel-marcador, anticorpos marcados com fluorocromo, etc.) tendo padrões de transbordamento complexos. Tais sistemas e métodos podem envolver o uso de canal de detecção e determinação de padrão de expressão específico de uma intensidade de sinal típica e um aumento no limite de detecção relacionado com uma intensidade de sinal típica. Consequentemente, os sistemas e métodos podem funcionar com base em parâmetros específicos, como as densidades de expressão, as intensidades de fluorocromo, os padrões de coexpressão, e fatores de distorção. Em alguns casos, a avaliação de um painel de sonda pode incluir a determinação de uma diferença máxima para uma intensidade de sinal típica e para um aumento no limite de detecção. Em alguns casos, a avaliação de um painel de sonda pode incluir a determinação da razão de uma intensidade de sinal típica para um limite de detecção, para um ou mais conjugados de anticorpo- corante específicos. Os sistemas e métodos de avaliação de painel de sonda exemplificadores podem ser baseados na consideração de padrões de coexpressão e na simulação dos resultados experimentais. A seleção de combinações de sonda-marcador pode, adicionalmente, ser baseada em uma comparação do aumento total calculado do limite de detecção com um aumento mínimo esperado em pelo menos um segundo canal. Além disso, um aumento total nos limites de detecção, para todos os canais, pode ser calculado para cada sonda em um ou mais painéis de sonda potenciais. Em alguns aspectos, os sistemas e métodos para avaliar diversas combinações de conjugado podem ainda incluir o cálculo de um aumento total no limite de detecção para cada sonda em um segundo painel de sonda potencial e seleção do painel de sonda, com base em uma comparação do aumento total calculado no limite de detecção para cada sonda no primeiro painel de sonda potencial com o aumento total calculado no limite de detecção para cada sonda no segundo painel de sonda potencial. Em alguns aspectos, tais sistemas e métodos podem incluir o cálculo de um aumento total no limite de detecção para cada sonda em um segundo painel de sonda potencial e seleção do painel de sonda, com base no aumento total calculado no limite de detecção para uma sonda de prioridade no primeiro painel de sonda potencial e no segundo painel de sonda potencial. Em outros aspectos, um primeiro canal e um segundo canal podem ser canais adjacentes.
[0071] Além disso, em algumas modalidades, os métodos para projetar um painel de sonda para um citômetro de fluxo podem incluir: identificar uma primeira sonda e uma segunda sonda; identificar um sinal mínimo esperado da primeira sonda; determinar um primeiro limite de detecção da primeira sonda com base em um marcador potencial associado com a segunda sonda; determinar um segundo limite de detecção da primeira sonda com base em um marcador potencial diferente associado com a segunda sonda; e selecionar qual marcador associar com a segunda sonda para o painel de sonda, com base no primeiro limite de detecção, no segundo limite de detecção e no sinal mínimo esperado da primeira sonda. Em aspectos, a determinação de um primeiro limite de detecção pode incluir a multiplicação de um fator de distorção de um sinal máximo esperado em um canal de detecção destinado a medir o marcador potencial associado com a segunda sonda. Em outros aspectos, a determinação do primeiro limite de detecção pode incluir a multiplicação do fator de distorção por um coeficiente que representa um padrão de coexpressão antigênico, onde, em alguns casos, o coeficiente é ou um ou zero. Em aspectos adicionais, um sinal máximo esperado pode ser baseado, em parte, em qualquer um ou todos dentre uma densidade de antígeno esperada em uma célula alvo, o marcador potencial associado com a segunda sonda e um padrão de coexpressão antigênica. Algumas modalidades de tais métodos ou sistemas incluem uma primeira sonda, que é destinada a ser detectada em um primeiro canal, e em que a determinação de um primeiro limite de detecção da primeira sonda inclui multiplicar um fator de distorção por um sinal máximo esperado para cada canal do citômetro de fluxo que não seja o primeiro canal. Nesses aspectos, a determinação do primeiro limite de detecção da primeira sonda é baseada em um modelo de sobreposicionamento linear de alargamentos de CV. Em alguns aspectos, o fator de distorção pode ser uma medida do alargamento de CV causado por compensação de cor.
[0072] Em algumas modalidades, um método para projetar um painel de sonda para um citômetro de fluxo pode incluir: identificar uma primeira sonda, uma segunda sonda e uma terceira sonda; identificar uma pluralidade de possíveis painéis de sondas, sendo que cada painel de sonda possível inclui uma combinação da primeira sonda, da segunda sonda ou da terceira sonda, sendo que cada sonda tem um marcador possível associado à mesma; avaliar um primeiro painel de sonda possível através da determinação do limite de detecção da primeira sonda com base em efeitos de transbordamento de espectro da combinação da segunda sonda e seu marcador possível associado; avaliar um segundo painel de sonda possível através da determinação do limite de detecção da segunda sonda com base em efeitos de transbordamento de espectro da combinação da terceira sonda e seu marcador possível associado; e selecionar o painel de sonda a partir da pluralidade de possíveis painéis de sonda com base nos limites de detecção determinados. Nesses aspectos, pelo menos uma dentre a primeira sonda, a segunda sonda e a terceira sonda pode se ligar especificamente a um antígeno. Em aspectos semelhantes, pelo menos uma dentre a primeira sonda, a segunda sonda e a terceira sonda pode se ligar especificamente a um analito. Em aspectos adicionais, a avaliação de um primeiro painel de sonda possível inclui a determinação do limite de detecção de uma primeira sonda com base, em parte, em um padrão de coexpressão de antígenos associados com a primeira sonda e uma segunda sonda. Em alguns aspectos, o padrão de coexpressão de antígenos pode incluir informações sobre as relações de coexpressão entre os antígenos para um tipo de célula específico. Em aspectos, os efeitos de transbordamento de espectro de combinações de uma segunda sonda e seu marcador associado podem ser determinados para que sejam zero, se o padrão de coexpressão de antígenos associados com uma primeira sonda e a segunda sonda indica que as sondas são mutuamente exclusivas. Em aspectos adicionais, os efeitos de transbordamento de espectro de combinação de uma segunda sonda e seu marcador associado podem ser determinados como sendo zero, se o antígeno associado com a segunda sonda é um descendente do antígeno associado com uma primeira sonda. Em aspectos, os efeitos de transbordamento de espectro de combinação da segunda sonda e seu marcador associado podem ser quantificados como uma função de um fator de distorção e um padrão de coexpressão antigênica. Em conjunto, ou alternativamente, os efeitos de transbordamento de espectro da combinação da segunda sonda e seu marcador associado podem ser quantificados, como uma função da densidade de antígeno esperada em uma célula alvo. Em alguns aspectos, tais métodos ou sistemas podem incluir a exibição de uma representação gráfica de uma distribuição da população de sinais esperados para um par de sondas em um painel de sonda selecionado, onde a exibição da representação gráfica da distribuição da população pode incluir a exibição do limite de detecção determinado da primeira sonda e da segunda sonda.
[0073] As técnicas do painel de sonda, conforme revelado no presente documento, são adequadas para uso com vários dispositivos automatizados, incluindo os sistemas de Citometria de Fluxo Navios™ e Gallios™ (Beckman Coulter, Brea, Califórnia, EUA). Em alguns casos, os cálculos de distorção podem ser baseados em propriedades específicas ou características de desempenho de conjuntos de filtros e/ou fotodetectores (por exemplo, PMTs). Além disso, as técnicas do painel de sonda podem ser baseadas em propriedades espectrais dos corantes, opcionalmente, que estão disponíveis dentro de uma biblioteca ou repositório específico de corantes ou conjugados de anticorpo-corante.
[0074] Em alguns casos, a avaliação ou a simulação de painéis de sonda podem ser determinadas com base em certos padrões ou perfis de expressão de antígeno. Tais perfis ou padrões podem ou não estar associados com um tipo específico de célula. Em operação, um usuário pode selecionar conjugados de anticorpo-corante de acordo com um padrão de expressão específico, que pode ser um padrão de expressão alvo selecionado através de um experimento planejado. Em alguns casos, um instrumento, como um citômetro de fluxo, pode ser configurado para aceitar múltiplas cores (por exemplo, dez cores), e o usuário pode desejar escolher um menor número de sondas. Assim, o usuário pode atribuir expressamente um primeiro número de sondas, enquanto deixa um segundo número de sondas como uma variável fictícia, de modo que a soma total das sondas seja equivalente ao número de canais de cor no citômetro de fluxo. Em alguns casos, diferentes corantes (por exemplo, PC5 e PC5.5) podem ser detectados no mesmo canal e, portanto, podem não envolver aplicação simultânea.
[0075] Conforme revelado aqui em outra seção, uma vez que um usuário seleciona ou introduz determinados parâmetros de um painel de sonda, o sistema pode operar para recuperar ou transferir por upload os números de peça ou outros indícios de identificação de um módulo de base de dados do anticorpo. Se, por exemplo, um conjugado desejado (isto é, sonda) não está contido na biblioteca, o número da peça (PN) pode ser indicado como uma sonda de serviço de projeto do cliente (CDS). Em alguns casos, os sistemas e métodos envolvem a avaliação de um painel de uma sonda com base em uma respectiva propriedade do fluorocromo e uma intensidade de sinal (por exemplo, presumido) que poderia ser esperada com base em uma densidade de expressão do antígeno alvo, e tais parâmetros podem ser recuperados ou lidos a partir de um módulo de base de dados de anticorpos. Em alguns casos, um módulo de base de dados de anticorpos pode incluir dados relativos a vários parâmetros para uso na avaliação painéis de sonda, incluindo a intensidade do sinal da sonda, que pode se basear em uma densidade de antígeno para a especificidade da sonda em conjunto com o fluorocromo conjugado. Os dados de intensidade do conjugado podem ser baseados em estimativas, ou podem ser baseados em dados experimentais, por exemplo, que podem ser obtidos como parte de um processo de controle de qualidade de fabricação.
[0076] Outras modalidades da presente revelação abrangem sistemas e métodos para avaliar a positividade em citometria de fluxo multicolor. As técnicas de especificidade ou de controle de chaveamento exemplificadoras podem ser usadas para avaliar uma assinatura de partículas individuais, por exemplo, para determinar se uma célula de sangue é positiva ou negativa para uma determinada expressão da proteína, como um marcador da doença. Em alguns casos, essas técnicas de controle podem ser usadas para posicionar uma região gráfica ou porta em relação a dados adquiridos, de modo a classificar as células a partir das quais os dados são obtidos. As técnicas de controle exemplificadoras podem ser usadas em procedimentos multicolor após a compensação. Em alguns casos, os métodos descritos aqui fornecem um nível de padronização que não está presente nas técnicas atualmente usadas. Além disso, as técnicas de controle aqui reveladas são rápidas, econômicas e eficazes para os padrões de expressão heterogênea, e fornecem a quantificação dos aspectos positivos.
[0077] Em alguns casos, os espectros de emissão medidos a partir de diferentes corantes fluorescentes podem sobrepor-se, e podem ser úteis para compensar os sinais obtidos pelos detectores. Por exemplo, uma técnica de compensação de fluorescência pode ser aplicada durante a análise de dados de modo a determinar a quantidade de interferência que o Fluorocromo A está tendo no canal B (que é atribuído para medir especificamente o Fluorocromo B). Como resultado, é possível obter a fluorescência medida no total no Canal B, e subtrair a contribuição do Fluorocromo A, de modo a determinar a fluorescência do Fluorocromo B no Canal B. De acordo com algumas modalidades, é possível obter a fluorescência total medida no Canal B e eliminar a contribuição do Fluorocromo A, de modo a determinar a fluorescência do Fluorocromo B no Canal B, por exemplo, que pode ser realizada com o uso de uma abordagem de compensação à base de matriz que envolve compensação digital.
[0078] Os dados de eventos podem ser visualmente representados em uma variedade de formas. Por exemplo, um histograma pode ser usado para exibir um único parâmetro de medição (por exemplo, fluorescência) sobre o eixo X horizontal e o número de eventos (por exemplo, contagem de células) no eixo Y vertical. Dessa forma, é possível determinar o número de células em uma amostra tendo determinadas características. Por exemplo, um pico curto no lado esquerdo do gráfico pode representar um grupo pequeno de células tendo uma fluorescência obscura (eventos dentro de uma população negativa), e pico alto no lado direito do gráfico pode representar um grupo grande de células tendo uma fluorescência brilhante (eventos dentro de uma população positiva).
[0079] Conforme usado aqui, uma "porta" pode ser usada como um limite para diferenciar entre uma população positiva e uma população negativa. Do mesmo modo, uma porta pode ser usada como uma fronteira para definir uma subpopulação de eventos. Uma porta pode ser definida, por exemplo, delineando-se uma fronteira em torno de um subconjunto de eventos em uma plotagem de dados, como uma plotagem de pontos ou histograma. Uma porta pode ser inclusiva, de modo a selecionar eventos que ficam dentro de uma fronteira, ou exclusiva, de modo a selecionar eventos que ficam fora das fronteiras. Consequentemente, o número de eventos positivos (em um lado específico da fronteira) pode se referir ao número de células que exibem uma característica física ou marcador de interesse. De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o chaveamento pode ser usado para distinguir sinais que correspondem a objetos fluorescentes dos sinais correspondentes a objetos não fluorescentes. De acordo com algumas modalidades, qualquer evento detectado com um tubo fotomultiplicador (PMT) pode emitir um sinal de fluorescência. Assim, uma fluorescência emitida pode ser associada com um marcador específico.
[0080] Os protocolos de chaveamento específicos estão disponíveis para propósitos diagnósticos e clínicos no campo da hematologia. Por exemplo, as portas podem ser usadas em dados de citometria de fluxo para visualizar seletivamente certas células de interesse, como as células brancas do sangue (leucócitos), eliminando os resultados de partículas indesejáveis, como células mortas e detritos. Em algumas situações, pode ser difícil determinar onde colocar uma porta, de modo a classificar de forma eficaz um evento como positivo ou negativo. Com o uso de um controle apropriado, é possível ajudar a identificar a diferença entre uma população positiva e uma população negativa. As modalidades da presente invenção podem ser usadas em conjunto com técnicas de citometria multicolor em geral, incluindo, sem limitação, o campo hematológico. Em alguns casos, as modalidades da presente invenção podem ser aplicadas a qualquer medição em que um controle de Fluorescência Menos Um (FMO) é útil ou necessário.
[0081] As modalidades da presente invenção fornecem sistemas e métodos para a realização de análise positiva automatizada em citometria de fluxo multicolor, que se caracteriza pelo alargamento induzido por transbordamento de erros de medição. As modalidades abrangem, adicionalmente, técnicas para calcular erros de medição de acordo com cada padrão de expressão do evento individual com base em um modelo de sobreposicionamento linear de transbordamento de fluorocromo, como também aplicadas para aplicações de simulação e projeto de painel, com o uso das mesmas técnicas ou técnicas similares para determinar os limites de predição para citometria de fluxo multicolor, tendo em conta o padrão de coexpressão de antígenos de uma partícula detectada, de modo a permitir a determinação de uma taxa de transbordamento para um fluorocromo em todos os outros canais de detecção por um cálculo de sobreposição.
[0082] De um modo semelhante, as modalidades da presente invenção abrangem técnicas de correção pós-aquisição para citometria de fluxo, de modo que os erros de compensação associados com os resultados das amostras adquiridas possam ser minimizados. Por exemplo, o uso de abordagens de compensação padrão em experimentos de canal multicolor com valores de correção fixos pode tender a compensar ou pouco ou muito pouco os resultados do experimento em uma fronteira do chaveamento. As modalidades da presente invenção abrangem o uso de dados corretamente compensados, ou evitam tal sobrecompensação ou subcompensação.
[0083] Em alguns casos, as técnicas de correção automática aqui reveladas podem operar para melhorar os resultados compensados de um dispositivo de citometria de fluxo, de modo a acentuar a identificação dos resultados positivos específicos após a aquisição de dados. Em algumas modalidades, os sistemas e métodos aqui revelados podem operar para calcular um limite de detecção corrigido ou fronteiras corrigidas entre duas seções de resultados ou limites corrigidos entre positividade específica e negatividade específica para cada canal de sinal de fluorescência (por exemplo, fotomultiplicador), com base em um modelo de sobreposicionamento do transbordamento de todos os outros corantes detectados em todos os outros canais. Com o uso desses limites corrigidos entre a positividade e negatividade específicas, é possível prosseguir automaticamente sem o chaveamento manual dos conjuntos de resultados, e os resultados críticos na área de fronteira entre as duas seções de resultados são observados como sendo inequivocamente atribuídos à seção apropriada.
[0084] Voltando agora aos desenhos, a Figura 1 representa os aspectos de sistemas de citometria de fluxo e métodos de acordo com algumas modalidades. A configuração 100 de um dispositivo de citometria de fluxo inclui, tipicamente, certos parâmetros de conjunto de detector de sinal de fluorescência 110, bem como parâmetros de comprimento de onda de excitação de laser 120.
[0085] Os dispositivos de citometria de fluxo podem ser configurados com qualquer uma dentre uma variedade de parâmetros de excitação de laser. Por exemplo, os conjuntos de laser podem ser configurados para produzir espectros de excitação a 355 nm (ultravioleta), 405 nm (violeta), 488 nm (azul), 532 nm (verde), 561 (amarelo), 633 nm (vermelho), 638 nm (vermelho), e similares. De um modo semelhante, os conjuntos de laser podem incluir qualquer número de dispositivos de excitação de laser. Por exemplo, um conjunto de laser duplo pode incluir um primeiro laser para fornecimento de energia de excitação a 488 nm e um segundo laser para fornecimento de energia a 638 nm.
[0086] Conforme mostrado na Figura 1, a energia de excitação de laser pode ser impingida mediante um corante de uma sonda de conjugado de anticorpo-corante. Tipicamente, um corante específico será excitado com um comprimento de onda característico, e, subsequentemente, fluoresce espectros de emissão característicos. Pode haver um ou vários máximos de emissão de fluorescência. Os espectros de emissão podem cobrir uma faixa de comprimentos de onda. Por exemplo, o isotiocianato de fluoresceína (FITC) é um fluorocromo que é excitado por luz de 488 nm e que produz um máximo de emissão de fluorescência em torno de 520 nm. Em pelo menos um comprimento de onda, PC5 e PC5.5, por exemplo, são excitados por dois comprimentos de onda de 488 e 638 nm, que adicionam complexidade aos padrões de transbordamento.
[0087] Os conjuntos de detector de sinal 110 podem incluir várias combinações de filtros e detectores. Conforme mostrado aqui, um conjunto detector pode incluir um filtro passa-banda de 525/40 para uso com um dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT1, que é designado para a detecção de emissão de corante FITC. Tais configurações podem ser projetadas para fornecer os parâmetros de detecção desejados para um fluorocromo específico. As configurações adicionais, conforme mostrado, podem incluir: um filtro passa-banda de 575/30 para uso com um dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT2, que é designado para a detecção de emissão de corante PE; um filtro passa- banda de 620/30 para uso com um dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT3, que é designado para a detecção de emissão de corante ECD; um filtro passa-banda de 675/20 para uso com um dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT4, que é designado para a detecção de emissão de corante PC5; um filtro passa-banda de 695/30 para uso com um dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT5, que é designado para a detecção de emissão de corante PE-Cy7; e um filtro passa-banda de 660/20 para uso com um dispositivo de tubo fotomultiplicador PMT6, que é designado para a detecção de emissão de corante APC. Os detectores individuais (por exemplo, PMT1, PMT2, PMT4) podem ser designados para detectar comprimentos de onda de luz a partir de respectivos corantes primários (por exemplo, FITC, PE, PC5), conforme indicado pelo gráfico de emissão de espectros 130. Os filtros passa- banda podem ser usados para permitir que uma certa quantidade de luz emitida passe através do mesmo, e em direção a um tubo fotomultiplicador (PMT). O PMT específico com seus filtros passa-banda associados podem ser dedicados a detectar a emissão de conjugados excitados por comprimentos de onda de luz específicos.
[0088] Uma ilustração de hardware exemplificadora de um dispositivo de citometria de fluxo, tendo uma configuração de bloco de filtro de dez cores, com três lasers, é representada na Figura 1A. Conforme mostrado aqui, um dispositivo de citometria de fluxo pode incluir uma variedade de filtros passa-banda (BP), bem como filtros de passagem curta (SP) e de passagem longa (LP) dicroicos (DC).
[0089] Com referência novamente à Figura 1 pode-se ver que as técnicas exemplificadoras podem envolver um usuário ou operador executando certas ações. Por exemplo, as ações de usuário 140 podem incluir a determinação ou seleção de uma configuração de um dispositivo de citometria de fluxo, conforme indicado na etapa 142, e determinação ou seleção de um padrão de expressão antigênica de interesse, conforme indicado na etapa 144. No que diz respeito à etapa de seleção de um dispositivo de configuração, uma tal seleção pode ser feita com o uso de um botão suspenso (dropdown) (base de dados), para escolher dentre uma variedade de configurações de hardware predefinidas (por exemplo, como a configuração de hardware representada na Figura 1A).
[0090] De acordo com algumas modalidades, a seleção de várias configurações de hardware e a seleção dos padrões de expressão de antígeno de interesse podem ser implementadas em uma versão baseada na web. De acordo com algumas modalidades, os sistemas e métodos podem envolver meios de base de dados que podem fornecer uma indicação a respeito de haver potencialmente mais antígenos fora do painel de sonda que são incluídos no padrão de expressão do que o usuário atribuiu a um certo padrão. Se assim for, isso pode resultar em apontar para o usuário que há mais antígenos incluindo essas influências de sondas sobre os limites de detecção.
[0091] De acordo com algumas modalidades, a configuração de hardware pode representar qualquer uma de uma variedade de conjunto de lasers, conjunto de filtros e combinações de canais de detecção. Por exemplo, uma configuração de hardware específica pode incluir um ou mais lasers que emitem em diferentes comprimentos de onda. Em alguns casos, uma configuração de hardware pode incluir seis canais de detecção e duas cores de laser (por exemplo, 488 nm e 638 nm). Em alguns casos, uma configuração de hardware pode incluir oito canais de detecção e duas cores de laser (por exemplo, 488 nm e 638 nm). Em alguns casos, uma configuração de hardware pode incluir dez canais de detecção e três cores de laser (por exemplo, 405 nm, 488 nm, e 638 nm). Em alguns casos, uma configuração de hardware pode incluir dez canais de detecção e quatro cores de laser (por exemplo, 405 nm, 488 nm, 561 nm, e 638 nm).
[0092] Os procedimentos de monitoramento de células exemplificadores envolvem avaliação de células individuais para a presença ou ausência quantitativa relativa de certa superfície celular ou antígenos internos. Conforme mostrado na Figura 1, uma célula específica em um certo estágio de desenvolvimento ou em um certo estado de doença pode apresentar um padrão de expressão antigênica distinto 150 caracterizado pela presença de certos antígenos (por exemplo, CD28, CD26, CD3, CD15, CD59, CD71) na superfície celular ou no interior da célula. Assim, um painel de conjugado de anticorpo- corante contendo sondas específicas para esses antígenos (por exemplo, conjugado específico para CD28, conjugado específico para CD26, respectivamente) que produzem espectros de emissão específicos após excitação, pode ser usado para analisar uma amostra biológica para determinar a extensão a qual a amostra contém células que expressam tais antígenos, e também a quantidade relativa de expressão de antígeno na expressão de células. Desse modo, o painel de sonda pode ser usado para avaliar ou monitorar o estado fisiológico de um paciente. As Figuras 1B a 1H fornecem detalhes adicionais sobre o processamento de entrada de usuário, o retorno de entradas de base de dados e cálculos subsequentes, e a interpretação dos monitores.
[0093] A Figura 1B representa aspectos de uma técnica de seleção de painel de sonda de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, um usuário pode introduzir um conjunto de anticorpos correspondentes a um padrão de expressão antigênica específico de interesse (por exemplo, CD57, CD45, e outros marcadores de células). Em alguns casos, os anticorpos selecionados podem ser atribuídos a, ou associados com, os respectivos corantes predefinidos. De acordo com algumas modalidades, um usuário pode atribuir cada especificidade a um corante predefinido. De acordo com algumas modalidades, um usuário pode ter a oportunidade de introduzir apenas a especificidade e permitir que o software proponha as atribuições de corante de anticorpo ótimas. A seleção de painéis de sonda pode ainda incluir canais "fictícios", em que um canal específico e corante relacionado não são destinados a serem usados, a designação fictícia e o projeto do painel podem ser usados como um canal "silencioso" e controle negativo. Conforme usado aqui, um canal "silencioso" indica um canal detector que não causa nenhum transbordamento de sinal em qualquer outro canal e pode ser chamado de uma "coluna limpa", quando visto como parte de uma tabela de distorção. Conforme usado aqui, um canal "não tocado" indica um canal detector que não recebe nenhum transbordamento de sinal dos corantes que o canal não está configurado para detectar, e pode ser chamado de uma "linha limpa", quando visto como parte de uma tabela de distorção.
[0094] Conforme mostrado na Figura 1B, o uso de PC5.5 como um corante para a detecção do antígeno CD33 no canal de detecção FL4 seria complicado pelo uso de PC5 ou pela detecção por tentativa de PC5 no canal de detecção FL4. Consequentemente, o PC5 é atribuído como fictício nesse painel de sonda. A Figura 1B, mostra adicionalmente que um usuário pode atribuir um antígeno específico a um corante desejado em um canal de detecção específico, particularmente, no exemplo mostrado,o corante Pacific Blue conjugado com CD57, que vai ser excitado por luz a 405 nm e detectado em canal de detecção PMT FL9. Nesse contexto, o FL9 é o canal primário para a detecção do corante Pacific Blue excitado (e, portanto, a detecção de CD57), e, consequentemente, FL1-8 e FL- 10 são canais secundários que podem detectar o sinal de fluorescência de transbordamento indesejável a partir do corante Pacific Blue.
[0095] Conforme ilustrado na Figura 1C, um painel de sonda, que pode se referir a um conjunto de conjugados de anticorpo-corante, pode ser ligado com uma base de dados contendo informação sobre as sondas. Por exemplo, a base de dados pode conter informação sobre a intensidade de fluorescência para cada sonda no painel. Em algumas modalidades, o termo "painel" o pode também se referir a uma sequência ou um grupo de várias combinações de conjugado. Conforme mostrado (e discutido com mais detalhe com respeito à Figura 8 abaixo), a base de dados pode fornecer informações sobre um conjunto de conjugados (também chamado de painel), que permite o cálculo da intensidade média de fluorescência típica de uma população positiva brilhante, conforme indicado por eventos de população em décadas acima de 10A0, conforme mostrado nos gráficos, identificado como seção (A) na Figura 1C. A base de dados pode também permitir o cálculo da intensidade de fluorescência mínima de uma população positiva fraca. Em uma avaliação característica da expressão de antígeno distinta, conforme visto com o gráfico de CD4-PE, as populações positivas e negativas são claramente separadas, e a intensidade de fluorescência mínima da população positiva fraca é idêntica a 1. Em uma avaliação de característica de expressão de antígeno modulada, como visto no gráfico de CD184-PE versus CD57- PacB, entretanto, as populações positivas e negativas não são claramente separadas, já que as densidades do antígeno podem variar entre as células positivas, e a intensidade de fluorescência mínima é presumida que esteja dentro da década zero (isto é, menos que 10A0). Além disso, a base de dados pode permitir o cálculo do aumento de um limite de detecção para um conjugado (e a perda de sensibilidade correspondente) em décadas para cada conjugado resultante dos efeitos combinados de todas as contribuições de transbordamento que ocorrem, identificado como (B) na Figura 1C. Em alguns aspectos, o fator de distorção de um conjugado para outro pode ser caracterizado como a razão de (B) sobre (A).
[0096] De modo semelhante, conforme mostrado na Figura 1D, com base no conjunto de anticorpos específicos para antígeno selecionados pelo usuário, que pode ser chamado de entrada 160, é possível consultar uma base de dados 162 por informações associadas com as respectivas sondas. Conforme discutido aqui em outra seção, os cálculos 164 discutidos em relação à Figura 1D podem ser usados para referência, por exemplo, em relação às técnicas descritas na Figura 8. A consulta da base de dados 162 na entrada do usuário 160 de um conjugado pode incluir, por exemplo: (C) a intensidade (em décadas acima de 10A0) de um conjugado de PE (ou outro corante de referência) para cada conjugado; (D) o brilho do fluorocromo em relação a PE para cada conjugado, em que PE (ou outro corante de referência) é igual a 1 ou 100%; (E) o aumento típico do limite de detecção causado por canais secundários por décadas de intensidade de sinal em um canal primário para cada uso de fluorocromo, isto é, um fator de distorção; (F) características de expressão típicas de cada antígeno, avaliadas como distintas ou moduladas; (G) os padrões de coexpressão de antígeno típicos para cada antígeno individual com todos os outros antígenos, isto é, as coexpressões de interesse, em que os códigos "1" são para coexpressão e os códigos "0" são para uma ausência ou exclusão de coexpressão; e (H) os padrões de coexpressão de antígeno de pai-descendente típicos para cada antígeno individual com todos os outros antígenos, em que os códigos "0" são para uma propriedade de descendente e os códigos "1" são para uma ausência de uma propriedade de descendente.
[0097] A saída 166 de uma base de dados, conforme descrito na Figura 1D, depende da área da sua aplicação. Particularmente, o tipo de célula considerado de interesse é diferente para distúrbios de células do sangue e imunomonitoramento e, portanto, os padrões de coexpressão típicos e as características de expressão típicas relacionados aos mesmos variam dependendo do tipo celular de interesse. Os cálculos 164 baseados em dados recuperados da base de dados devido a consultas de pesquisa podem fornecer a seguinte saída. Um valor para (I), a intensidade de fluorescência média típica acima de 10A0 para cada conjugado para as populações positivas brilhantes (dessa forma, dirigido a plotagens distintas), pode ser calculado como:
onde a adição e a subtração de 10^0 fornecem consistência em uma escala de plotagem. Um valor para (J), a intensidade de fluorescência típica de cada conjugado para populações positivas fracas (dessa forma, dirigido para plotagens moduladas) com base nas características de expressão, é semelhante à equação para (I) acima, mas com o valor para (C) definido para 0 décadas acima de 10A0.
[0098] O valor para (K), o aumento do limite de detecção (DL) em um canal de detecção secundário por meio de transbordamento de um conjugado individual de um canal principal, pode ser determinado como: (K) = (I) * DF * (G) * (H) onde o valor de (K) é calculado para cada conjugado individual detectado em um canal primário, que, por exemplo, pode ser de nove (9) valores para (K), calculado para canais secundários em um painel de dez (10) cores. Além disso, um valor (L) para o aumento global de DL em um canal de detecção secundário através do transbordamento combinado de todos os conjugados detectados nos seus respectivos canais primários pode ser dado por:
onde, novamente, a adição e a subtração de 10A0 fornecem consistência em uma escala de plotagem. Um valor de (L) pode ser calculado para cada canal secundário. Os resultados desses cálculos 164 podem subsequentemente ser emitidos166 para qualquer um ou ambos dentre um monitor e processamento adicional.
[0099] A Figura 1E representa aspectos de uma técnica de avaliação de painel de acordo com algumas modalidades. Os gráficos de exibição gráfica mostrados aqui podem ser úteis na análise ou classificação de determinados projetos de painel. Conforme mostrado aqui, uma determinada sonda, ou corante, é fornecida tendo um anticorpo específico para o antígeno CD45, conjugado com um corante de fluoróforo PE. O corante PE pode ser excitado por um laser de 488 nm, e pode emitir espectros que são detectados em um canal FL2 (por exemplo, a aproximadamente 575 nm). O antígeno CD45 é, tipicamente, fortemente expresso em células de leucócitos, e PE é um fluoróforo brilhante. Assim, é possível observar uma forte intensidade de sinal quando se aplica uma sonda de CD45-PE para uma amostra de laboratório de origem humana. Conforme mostrado aqui, o resultado é uma intensidade de escala completa. As linhas tracejadas (separação mínima, símbolos de dados quadrados) e pontilhadas (separação máxima, símbolos de pontos de dados triangulares) coincidem, indicando uma expressão distinta. Ou seja, as populações positivas e negativas estão claramente separadas.
[0100] A Figura 1F representa a adição de uma sonda de CD25- ECD. O corante ECD também pode ser excitado por um laser de 488 nm, e pode emitir espectros que são detectados em um canal FL3 (por exemplo, a aproximadamente 625 nm). Conforme mostrado aqui, CD25 é um antígeno modulado. Ou seja, há uma diferença entre o tracejado (separação mínima) e o pontilhado (separação máxima). Dependendo do estado de ativação das células, as células podem ter uma expressão de CD25 elevada, até uma expressão negativa de CD25. Aqui, a linha tracejada (separação mínima) coincide com o limite entre as primeira e segunda décadas. Isso corresponde a um limite de detecção desejado, pelo qual as células com uma expressão muito baixa (sinal fraco) podem ser detectadas, assim como as células com uma expressão mais elevada (sinal brilhante). Conforme representado aqui, as células com uma expressão mais alta (separação máxima; linha pontilhada) são cerca de 0,75 décadas mais elevadas do que as células com uma expressão mais baixa (separação mínima; linha tracejada). A diferença (A) entre o mínimo (tracejado) e o máximo (pontilhado) representa a faixa de expressão de CD25 de acordo com essa modalidade. Note que esses dados podem também levar em consideração os parâmetros associados com o corante ECD em si. A menor plotagem de bolhas do painel da Figura 1F indica que o espectro de emissão do corante PE está transbordando para o canal de detecção de ECD e causa um aumento estimado do limite de detecção de acordo com a posição do centro do círculo quando projetado para o eixo y (em décadas) (FL3).
[0101] Conforme discutido aqui em outra seção, essas plotagens podem incluir diferentes linhas correspondentes a diferentes configurações de laser (por exemplo, 405 nm, 488 nm e 638 nm) O limiar entre as primeira e segunda décadas pode ser usado para avaliar certos dados do sinal. Em alguns casos, um fundo específico pode ser presumido por um tipo de célula ou padrão de coexpressão específico. Por exemplo, uma célula T pode ter um certo padrão em comparação com uma célula B. Assim, um usuário pode selecionar um fenótipo (e padrão de coexpressão correspondente) que os mesmo pode desejar ver em uma saída de simulação. Em alguns casos, para um dado padrão de expressão, os limites de detecção para um tipo de células específico pode ser diferente dos limites de detecção para um outro tipo de célula específico, por exemplo, dependendo da presença ou ausência e características quantitativas do dado padrão de expressão.
[0102] Conforme mostrado na Figura 1F, um limite de detecção pode ser representado por uma linha tracejada (símbolos de pontos de dados quadrados). Nos casos em que as características de expressão são distintas, pode haver ou uma população negativa ou população positiva, mas sem intermediárias. Ou seja, não haverá células com diferentes graus de densidades de antígeno na população específica. Assim, as linhas tracejadas e pontilhadas coincidirão (como com CD45- PE a cerca de 575 nm). Nesse ponto, a maior densidade de expressão é igual à menor densidade de expressão. Em contraste, com uma expressão modulada, um antígeno pode ser encontrado em um tipo específico de célula a uma densidade de expressão muito baixa, até uma densidade de expressão muito alta. Conforme mostrado aqui, uma expressão modulada pode ser representada por uma linha pontilhada. Por exemplo, em um tipo de célula CD3+ específica, CD4 pode estar presente (CD4+, CD8) ou ausente (CD4-, CD8+). Isto representa uma forte positividade, e corresponde a uma característica de expressão distinta. Conforme discutido aqui em outra seção, o painel de avaliação da sonda também pode ser baseado em fenótipos específicos (por exemplo, presumindo-se um fenótipo padrão, como células T ou monócitos). Assim, os usuários podem avaliar as características do painel de sonda de acordo com diferentes tipos de células e padrões de expressão, e determinar como os padrões de expressão podem afetar os limites de detecção para antígenos específicos.
[0103] Em contraste com a Figura 1F, em que a sonda de CD25 tem um marcador ECD, a Figura 1G representa os resultados de uma sonda de CD25 tendo um fluorocromo mais forte, PC5.5. O limite de detecção desejado da Figura 1G é o mesmo que o mostrado na Figura 1F. Entretanto, a faixa (A) entre o pontilhado (máximo) e o tracejado (mínimo), que a modalidade presume, para a dinâmica da intensidade do sinal é muito maior na Figura 1G. Conforme mostrado aqui, a faixa é de cerca de 1 década. A plotagem de bolhas inferior do painel da Figura 1G indica que espectros de emissão do corante PE estão transbordando para o canal de detecção PC5.5 (FL4).
[0104] Na Figura 1H, a sonda de CD25-ECD é reintroduzida. Assim, é possível comparar a expressão mais elevada (intensidade de sinal) que poderia ser esperada para um marcador CD25-ECD com a maior densidade de expressão que pode ser esperada para o marcador CD25-PC5.5. Presumindo, novamente, em uma escala logarítmica, o último é consideravelmente maior.
[0105] Também é útil considerar o plano de fundo (linha sólida). Por exemplo, conforme ilustrado na Figura 1H, um certo teor de fundo BG pode ocorrer devido aos níveis elevados de expressão de linfócitos de CD45, que é marcado com o marcador CD45-PE. Conforme mostrado aqui, aquele sinal de fundo BG do PE no canal de ECD é maior do que o sinal de ECD no canal de ECD. Assim, há uma perda significativa de informações, e tal projeto de painel pode não ser favorável.
[0106] Na Figura 1I, a sonda de CD25-PC5.5 é removida e uma sonda de CD25-PC7 é adicionada. Há transbordamentos de PE e PC7 para o canal FL3. Na Figura 1J, a sonda de CD45-PE é removida, e há transferência de PC7 para o canal FL3. Um resultado favorável é fornecido quando a linha sólida (fundo, BG) coincide com o, ou se aproxima do, limiar entre as primeira e segunda décadas logarítmicas, conforme mostrado na Figura 1J. Conforme mostrado aqui, não há uma enorme quantidade de fundo que é causada por transbordamento no canal de ECD. Em vez disso, há uma pequena quantidade de transbordamento a partir da emissão de sonda de CD45-PC7 para o canal de detecção de ECD FL3. Assim, existe um vão entre o fundo (BG) e a densidade de expressão mais alta (máximo; linha pontilhada). Consequentemente, o esquema de detecção perde apenas aquelas células que têm níveis muito baixos de expressão de CD25.
[0107] A Figura 1K representa a substituição da sonda de CD25- ECD da Figura 1J com uma sonda de CD25-PE. O fluorocromo PE é mais forte do que o fluorocromo ECD. Conforme mostrado na Figura 1K, existe um fundo BG semelhante fornecido pela sonda de CD45-PC7 no canal de detecção de PE FL2. Entretanto, a distância entre o fundo e o máximo é maior na Figura 1K, em comparação com a Figura 1J, devido ao fluorocromo PE mais forte sobre a sonda de CD25.
[0108] Na Figura 1L, a sonda de CD25-ECD é novamente incluída no painel. Aqui, pode ser visto que a distância entre o fundo (sólido) e o sinal máximo (pontilhado) é maior para CD25-PE do que para CD25- ECD. Assim, a sensibilidade geral é maior. Esse resultado leva em consideração a intensidade do fluorocromo usado na sonda de CD25 (por exemplo, intensidade de PE > intensidade de ECD), e também o padrão de transbordamento que se origina de outros antígenos (por exemplo, CD45), que também são expressos nas células. Tanto a intensidade do fluorocromo quanto o padrão de transbordamento de coexpressão podem contribuir para a sensibilidade.
[0109] Na Figura 1M, um anticorpo CD45 é conjugado com um fluoróforo APC-AF750 e pode ser visto que não há um transbordamento. Aqui, a linha sólida (BG) coincide com o limiar entre as primeira e segunda décadas e, portanto, não há fundo adicionado. Aqui, não há sensibilidade completa, portanto, os sinais podem ser detectados mesmo quando há células com baixas densidades de expressão para CD25. Conforme discutido aqui em outra seção, à medida que mais sondas são adicionadas ao painel, resultados mais complexos serão observados. Tais resultados podem levar em consideração as várias contribuições (por exemplo, intensidade de fluoróforo), em que o padrão de coexpressão é relevante para o transbordamento.
[0110] As Figuras 1N e 1O fornecem um exemplo para três conjugados, em que um dado CD pode ser associado a um dado corante. Conforme mostrado na Figura 1N, cada conjugado de corante de CD tem um MFI para a conjugação de PE acima de 10A0 décadas (PE sendo o corante de referência); conforme mostrado, CD-X tem um MFI de 0,5, CD-Y tem um MFI de 1, e CD-Z tem um MFI de 2,5. Em algumas modalidades, a matriz descendente do pai pode ser simétrica. Em algumas modalidades, a matriz descendente do pai pode ser assimétrica. Conforme mostrado aqui, a matriz de coexpressão pode ser simétrica, embora em outros aspectos, a matriz de coexpressão possa ser assimétrica. Adicionalmente, conforme mostrado na Figura 1O, cada corante dos conjugados de corante de CD tem uma intensidade relativa em comparação com PE; o corante-A tem uma intensidade de 0,2, o corante-B tem uma intensidade de 0,45, e o corante-C tem uma intensidade de 0,85. Esses valores de dados conjugados de CD-corante permitem o cálculo de uma tabela de fator de distorção, como visto na Figura 1O, em que, em parte, o corante-B tem um valor de distorção de 0,25 resultando no PMT FL1 que é dirigido para a detecção do corante-A, e tem um valor de distorção de 0,75 resultando no PMT FL3 que é dirigido para a detecção do corante-C. Em contraste, o corante-C não tem nenhum efeito de distorção sobre o PMT FL1, e de modo similar, o corante-A não tem efeito de distorção sobre o PMT FL3 que é dirigido para a detecção do corante-C. Em contraste adicional, o corante-A tem um valor de distorção de 0,65 e o corante-C tem um valor de distorção de 0,1 no PMT FL2 que é dirigido para a detecção do corante-B. Os cálculos mostrados na Figura 1O são aplicações das equações conforme determinado pela Figura 1D, com o uso dos valores relevantes fornecidos nas Figuras 1N e 1O.
[0111] Quando o padrão de coexpressão tem um certo esquema de pai/descendente, ou um esquema de exclusão, então o transbordamento calculado pode não adicionar à distorção global. Por exemplo, a Figura 1P representa o resultado calculado para um único corante (sonda CD25-PE). Quando um segundo corante (CD45-FITC) é adicionado ao painel, conforme mostrado na Figura 1Q, pode ser visto que a emissão de corante FITC exerce transbordamento para o canal de detecção de PE FL2. O círculo na plotagem de bolhas correspondente ao transbordamento de FITC tem uma certa interceptação no eixo Y, e um certo diâmetro. Conforme mostrado aqui, a sonda CD45-FITC pode tirar cerca da metade de uma década de sensibilidade no canal de FL2 PE. Por exemplo, a distância entre o fundo e o máximo na Figura 1Q é cerca de metade da distância conforme representado na Figura 1P.
[0112] Na Figura 1R, a sonda de CD45-FITC da Figura 1Q é substituída com uma sonda de CD15-FITC. O antígeno CD15 é menos altamente expresso e, portanto, o sinal no canal de detecção de FITC é menor na Figura 1R em comparação com a Figura 1Q. Por exemplo, pode ser visto que o máximo (linha pontilhada) não está mais entre as terceira e quarta décadas. Entretanto, CD45 é coexpresso com CD25, enquanto CD15 não é coexpresso com CD25 (por exemplo, de acordo com as configurações padrões na base de dados). Assim, não há distorção eficaz causada pelo transbordamento da sonda de CD15- FITC no canal de FL2 PE. De um modo semelhante, não há adição ao fundo no canal de PE. Em outras palavras, o transbordamento ainda está presente, mas não afeta as células CD15 negativas com respeito à análise do seu potencial de expressão de CD25. As células CD15+, nesse exemplo, não expressam CD25. Assim, com base na biologia das células, a expressão de CD25 não seria analisada em células CD15+. Esses dois antígenos diferentes poderiam, assim, ser avaliados com o uso de diferentes portas.
[0113] Em uma outra ilustração de um esquema de coexpressão, a Figura 1S representa resultados em que tanto uma sonda de CD3-FITC quanto uma sonda de CD45-ECD estão gerando emissão espectral de transbordamento ao canal de detecção de PE FL2. A distorção global é um pouco maior do que a metade de uma década. Tal resultado pode ser consistente com um padrão de coexpressão observável em uma célula T. Também pode ser visto que existe uma quantidade menor de transbordamento para o canal de detecção de FL1 FITC. A plotagem de bolhas é útil na resolução das contribuições. Por exemplo, quando se considera os valores de interceptação-Y correspondentes ao transbordamento no canal de FL2, pode ser visto que o transbordamento de CD45-ECD é maior do que o transbordamento de CD3-FITC. Os respectivos diâmetros das bolhas no canal de FL2 indicam que ECD fornece uma maior contribuição para a distorção global.
[0114] Assim, para melhorar o sinal no canal de FL2 (por exemplo, aumentar a sensibilidade), pode ser mais desejável remover o transbordamento de ECD em FL2 (por exemplo, mantendo o transbordamento de FITC). A Figura 1T descreve um tal resultado, em que a sonda de CD45-ECD da Figura 1S é substituída com uma sonda de CD45-APC. Assim, há uma melhoria considerável no canal de FL2 PE para o limite de detecção. Ou seja, existe uma maior distância entre as linhas de fundo (sólidas) e de máximo (pontilhadas).
[0115] Na Figura 1U, as sondas de CD3-FITC e CD45-APC da Figura 1T são substituídas com as sondas de CD3-APC e CD45-ECD, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 1U, ainda há cerca de uma metade de décadas de perda de sinal no canal de FL2 PE.
[0116] As plotagens de bolhas fornecem uma indicação útil de como uma configuração da sonda (por exemplo, especificidade de antígeno, fluoróforo) pode contribuir para o limite de detecção para um canal de detecção.
[0117] A exibição dos resultados para uma sonda de painel de dez cores exemplificadora é representada na Figura 1V. Conforme mostrado na Seção A, para dar prioridade aos conjugados que detectam antígenos tendo uma característica de expressão modulada, uma grande distância entre uma intensidade de fluorescência média estimada (triângulo) e um aumento global do DL (círculo) pode ser desejável, e pode servir como um critério para a classificação de diferentes combinações de conjugados para conjuntos idênticos de antígenos. Conforme mostrado na Seção B, as estimativas sobre brilhante (triângulo) e fraca (caixa) significam que as intensidades de fluorescência podem ser baseadas em densidades de expressão de antígeno típicas e intensidade relativa do fluorocromo (por exemplo, = (I) & (J) conforme representado na Figura 1D), e, por exemplo, pode coincidir devido às características de expressão distintas para o conjugado-CDxy-APCA750 detectado no respectivo canal primário de FL8, atribuído a um laser vermelho. Conforme mostrado na Seção C, pode haver um aumento global de DL = (L) para FL8, atribuído a um laser vermelho. Conforme mostrado na Seção D, devido às características de expressão modulada de CDqw-ECD a densidade de expressão típica fraca (triângulo) pode ser ajustada para décadas de zero acima de 10A0.
[0118] Uma outra exibição dos resultados para uma sonda de painel de dez cores exemplificadora é representada na Figura 1W. Conforme mostrado na Seção A, um conjugado-PE (ver legenda) nesse painel causa um aumento de 0,6 da década no limite de detecção (DL) acima de 10A0 no terceiro canal de detecção de FL3 (por exemplo, quando se refere à intercepção no eixo Y), e o diâmetro do círculo de bolha corresponde à contribuição do conjugado-PE com o aumento global do limite de detecção em FL3. Assim, pode ser visto que o conjugado de PE fornece a maior contribuição para o aumento do limite de detecção em FL3. Conforme mostrado na Seção B, o conjugado PC5/PC5.5 (ver legenda) nesse painel causa um aumento de baixo a moderado de 0,2 décadas acima de 10A0. Em muitos casos, um tal aumento será aceitável. A Seção B também indica que, com base na magnitude do diâmetro da bolha, o conjugado PC5/PC5.5 pode ser considerado como o principal contribuinte para o aumento global de DL no canal de detecção 6.
[0119] Assim, em um procedimento típico, o usuário pode selecionar uma configuração de hardware específica, que pode envolver certos filtros (por exemplo, filtros passa-banda) associados com vários detectores. Em algumas modalidades, uma configuração de hardware específica pode ser atribuída ou predeterminada, sem permitir tal seleção. Várias configurações de hardware podem ter valores do fator de distorção associados. Em alguns casos, as configurações de hardware ou dados de distorção podem ser recuperados a partir de uma base de dados. Por exemplo, uma base de dados pode incluir dados que indicam que um fator de distorção de uma configuração do detector passa-banda específico (exemplo por, infravermelho) é maior do que alguma outra configuração do detector. Consequentemente, o erro de sensibilidade e/ou de medição pode variar com base na configuração de hardware. Em algumas modalidades, uma base de dados pode incluir um número predefinido de configurações de hardware, e o usuário pode selecionar dentre os mesmos. Por exemplo, uma configuração de hardware específica pode incluir dados relacionados com o sistema de Citometria de fluxo Navios™ ou o sistema de Citometria de Fluxo Gallios™ (ambos disponíveis junto à Beckman Coulter, Brea, Califórnia, EUA). Em alguns casos, uma configuração de hardware específica vai ter um perfil de fator de distorção associado. O número de lasers e/ou o número de canais de detecção contidos na configuração de hardware pode ter uma influência sobre o número de fluorocromos usados em um painel de sonda específico. Em alguns casos, as características dos filtros passa-banda influenciam os fatores de distorção. De um modo semelhante, a qualidade de um PMT ou outros detectores, como um fotodiodo de avalanche pode influenciar a taxa de distorção.
[0120] A Figura 2 representa aspectos de um procedimento de seleção do operador 200, pelo qual o operador introduz certas informações de seleção de anticorpo e corante para uso na seleção de um painel de anticorpos. Por exemplo, conforme mostrado na etapa 210a, o operador pode selecionar um anticorpo específico para o antígeno 1 (por exemplo, CD28), opcionalmente juntamente com um corante correspondente (por exemplo, FITC), conforme indicado na etapa 210b. Além disso, o operador pode selecionar anticorpos adicionais específicos para antígenos respectivos de um perfil de expressão (por exemplo, as etapas 220a, 230a, e 240a), opcionalmente, juntamente com os respectivos corantes correspondentes (por exemplo, as etapas 220b, 220c, 220d). Conforme mostrado aqui, os parâmetros de anticorpos específicos para antígeno podem ser selecionados a partir de um menu suspenso de uma base de dados, e os corantes também podem ser selecionados a partir de um menu suspenso de uma base de dados. Em alguns casos, o processo de seleção de corante pode ser configurado de modo que nenhum corante seja expressamente selecionado pelo operador. Em vez disso, um corante associado com o anticorpo selecionado pode ser fornecido pela base de dados. De acordo com algumas modalidades, se o usuário não atribuir corantes aos anticorpos, então o sistema pode identificar os corantes mais adequados para todos os anticorpos não atribuídos com base na consideração de todo o painel de sonda (sensibilidade, etc.) fora da base de dados que vai fornecer todas as conjugações disponíveis para o respectivo anticorpo. Os fluorocromos escolhidos pelo sistema não podem ser exibidos até que o sistema tenha realizado as iterações e cálculos necessários, isto é, quando ocorre a saída de dados simulados.
[0121] Sistemas e métodos como aqui revelados podem incorporar características de interface do usuário e base de dados suspensa mostradas aqui. Assim, o usuário pode designar os antígenos de interesse, e a designação do antígeno, por sua vez, influenciará o anticorpo selecionado. De acordo com algumas modalidades, o usuário irá escolher diretamente os anticorpos na interface. Em alguns casos, os antígenos de interesse podem corresponder a um tipo de célula específico, como uma célula T. Assim, um usuário pode selecionar uma coleção de anticorpos que corresponde a um painel de células T.
[0122] O menu mostrado na Figura 2 inclui duas colunas que podem ser apresentadas ao usuário. A coluna da esquerda corresponde à especificidade do anticorpo, e a coluna da direita corresponde à seleção ou atribuição do corante. Nesse estágio do processo, o usuário pode ou não ter um padrão de expressão específico em mente. Por exemplo, o usuário pode ter apenas uma lista de antígenos que podem ser de interesse. Em alguns casos, um usuário pode saber quando selecionar certos antígenos se é desejável ser mais sensível quando se seleciona um corante ou, alternativamente, menos sensível. De um modo semelhante, uma base de dados inclui, frequentemente, dados relacionados com a densidade de expressão de um antígeno específico, e esses dados podem ser levados em consideração quando o corante é selecionado ou atribuído pelo sistema. Em alguns casos, a densidade de expressão pode depender de um tipo de célula específica. Por exemplo, a base de dados pode incluir a informação de que um marcador específico é minimamente expresso para um dado tipo de célula, ao passo que o mesmo marcador é altamente expresso em outro tipo de célula. Se um usuário não selecionar um corante para ir juntamente com um anticorpo selecionado, o sistema pode levar em consideração outras características, como o tipo de célula, ao recomendar ou a atribuir um corante para esse anticorpo. De acordo com algumas modalidades, nesse estágio do processo, o sistema ainda não atribuirá um corante no caso do usuário não selecionar um.
[0123] Tipicamente, diferentes corantes terão diferentes brilhos quantificados pelo rendimento quântico e coeficiente de absorção do corante, indicando a quanto da passagem de luz é absorvida e quanto da luz absorvida pelo corante irá traduzir a emissão de fluorescência, respectivamente. Em muitos casos, o coeficiente de absorção e o rendimento quântico correspondem um ao outro. Por exemplo, um corante de PE é considerado como tendo um alto rendimento quântico e de absorção, e uma alta porcentagem da luz absorvida é convertida para emissão de fluorescência. Em contraste, FITC tem um menor coeficiente de absorção e rendimento quântico, e uma menor porcentagem de luz absorvida é traduzida para emissão de fluorescência. Como resultado, a seleção de um corante específico pode determinar a sensibilidade que pode ser obtida Assim, o uso de PE pode conferir a capacidade para obter uma sensibilidade maior, em comparação com o uso de FITC (por exemplo, mesmo levando em consideração que uma única molécula de anticorpo pode ser ligada covalentemente a várias moléculas de FITC devido ao pequeno tamanho da molécula de FITC (<1 kD), que não pode ser realizado para a molécula de PE grande (> 200 kD)).
[0124] Em alguns casos, o usuário pode escolher aceitar uma ou mais das seleções de corante padrão fornecidas pela base de dados do sistema. Opcionalmente, o usuário pode escolher por modificar as seleções padrões. De acordo com algumas modalidades, nesse estágio do processo o sistema pode não recomendar que corantes sejam usados com anticorpos já que toda a faixa de informações fornecidas por todas as entradas de interfaces de usuário pode ser necessária para selecionar os corantes adequados para os anticorpos. De um modo semelhante, uma base de dados do sistema pode incluir uma certa densidade de expressão assumida para um antígeno de células T típico/específico (por exemplo, antígeno CD3). Ao selecionar uma especificidade de antígeno específico, o sistema pode obter uma densidade de expressão específica que é típica para um antígeno de um certo tipo de célula. Por exemplo, quando se seleciona um anticorpo específico para um antígeno CD3, a base de dados pode incluir informação de relação da associação do antígeno CD3 com uma célula T. Como um outro exemplo, um usuário pode selecionar a especificidade do anticorpo para CD16, CD38, e similares. Alguns antígenos têm várias densidades de expressão, presentes em vários tipos de células. Assim, as densidades de expressão podem variar entre células T, células B e monócitos, por exemplo. Por exemplo, quando se seleciona uma especificidade de antígeno, a base de dados pode ter três densidades de expressão típicas, para três tipos diferentes de células. Em algumas modalidades, o usuário pode optar por modificar uma densidade assumida ou padrão, se for desejado.
[0125] As Figuras 2A, 2B e 2C ilustram características de seleção de operação semelhantes para esquemas de fenótipo alvo, exclusão de fenótipo, e pai/descendente, respectivamente. A Figura 2D representa as características de seleção de operação para os parâmetros de densidade de antígeno.
[0126] Conforme mostrado na Figura 2A, o usuário tem a opção de definir vários fenótipos, se desejado, com base na seleção de anticorpos que podem estar contidos em uma base de dados. Em algumas modalidades, a informação sobre os padrões de coexpressão de antígeno típicos que se correlacionam com os fenótipos definidos pode ser incluída em uma base de dados como padrões de coexpressão de antígeno típicos pré-selecionados ou predefinidos. A base de dados pode incluir informações padrões sobre os padrões de coexpressão dos antígenos que normalmente ocorrem. Isso é menos específico do que os fenótipos celulares predefinidos e permite combinações de antígenos que não ocorrem na mesma porta. Como um exemplo, a célula T é um tipo proeminente de fenótipo de células que é usado em citometria. Opcionalmente, o usuário pode definir o seu próprio fenótipo. Em alguns casos, um usuário pode atribuir um certo padrão de expressão para um fenótipo. Conforme mostrado aqui, o usuário também tem a opção de ignorar essa etapa, e não especificar um fenótipo. Ao selecionar um fenótipo específico, a base de dados pode fornecer um conjunto associado de anticorpos específicos de antígeno. De acordo com algumas modalidades, o usuário pode definir o fenótipo escolhendo diretamente os anticorpos. Por exemplo, se um corante tiver sido atribuído a um anticorpo na Figura 2, então a fórmula pode exibir essa pré-seleção na coluna da direita em resposta a escolha do anticorpo respectivo na coluna da esquerda da Figura 2A. A coluna do lado direito pode permitir que o usuário pré-selecione corantes em uma forma de preenchimento automático. De acordo com algumas modalidades, nesse estágio do processo, o usuário pode não ser mais capaz de atribuir corantes a anticorpos (por exemplo, como foi feito na Figura 2). Entretanto, se o usuário tiver atribuído corantes para anticorpos na Figura 2, então esses corantes serão exibidos na coluna da direita mediante a escolha dos respectivos anticorpos na coluna da esquerda. Em alguns casos, é possível a seleção entre diferentes fenótipos, ou dar prioridade aos fenótipos. Por exemplo, os fenótipos podem ser priorizados com base em uma população alvo, ou com base em um antígeno específico que deve ser detectado em um fenótipo específico. Em alguns casos, o sistema pode dar prioridade a um antígeno com base na densidade de expressão. Por exemplo, uma elevada prioridade pode ser dada a um antígeno com uma baixa densidade de expressão.
[0127] Conforme mostrado na Figura 2B, o usuário tem a opção de selecionar várias exclusões de fenótipo, se for desejado, que podem estar contidas em uma base de dados. Por exemplo, uma base de dados pode conter informação indicando que um certo antígeno nunca ocorre na mesma superfície celular com um outro certo antígeno. Opcionalmente, o usuário pode definir certas exclusões. Como descrito aqui na coluna da esquerda, o usuário pode definir uma primeira exclusão, que corresponde a um anticorpo que foi selecionado anteriormente como discutido em relação à Figura 2 e é exibida na seção de cabeçalho da coluna da esquerda. O usuário pode selecionar várias exclusões dessa maneira, para vários anticorpos do painel. Por exemplo, o usuário pode indicar que um antígeno CD-X deve ser exclusivo dos antígenos CD-Y e CD-Z. Essas seleções podem ter um impacto sobre uma exibição gráfica para um painel de sonda, como discutido aqui em outro local. De acordo com algumas modalidades, a exclusão de um antígeno específico pode não influenciar um respectivo limite de detecção, porque apenas os marcadores que estão na mesma superfície celular podem influenciar os limites de detecção de canal um do outro. Ou seja, uma vez que os antígenos não estão na mesma superfície celular, os corantes de marcação também não estarão na mesma superfície celular e, portanto, não pode haver interferência entre os respectivos espectros de emissão. Conforme mostrado na Figura 2B, o usuário também tem a opção de não especificar exclusões.
[0128] Em alguns casos, um usuário pode selecionar dois antígenos que nunca são expressos em conjunto. Opcionalmente, a base de dados pode fazer certas suposições sobre as exclusões. Por exemplo, o sistema pode assumir que um marcador de células T específico e um marcador de células B específico são exclusivos um do outro. Em alguns casos, um sistema pode permitir que um usuário indique que não há exclusões. Consequentemente, o usuário pode ser apresentado com várias opções, incluindo (a) aceitar exclusões fornecidas pela base de dados, (b) atribuir ativamente exclusões, e/ou (c) não atribuir nenhuma exclusão, de modo que qualquer antígeno pode ocorrer com um outro antígeno, em qualquer célula.
[0129] Conforme mostrado na Figura 2C, o usuário tem a opção de selecionar várias relações de pai-descendente, se for desejado, que podem estar contidas em uma base de dados. Por exemplo, uma base de dados pode conter informação indicando que um certo antígeno tem uma relação de pai ou descendente com um outro antígeno. Opcionalmente, o usuário pode optar por não especificar essa relação. Como descrito aqui na coluna da esquerda, o usuário pode definir um primeiro pai e quaisquer descendentes relacionados, que podem corresponder a anticorpos que foram selecionados anteriormente como discutido em relação à Figura 2. Como um exemplo de um esquema de pai-descendente, uma relação de pai-descendente pode significar que um marcador pai se expressou em células-pai, e que a célula A expressa uma proteína pai além da proteína A de subpopulação/descendente, e que a célula B expressa a proteína pai além de uma proteína B de subpopulação/descendente. Por exemplo, uma célula T pai pode incluir um antígeno CD3, e alguns dependentes de células T podem expressar o antígeno CD3, juntamente com um antígeno de células T CD4 filhas, e alguns dependentes de células T podem expressar o antígeno CD3, juntamente com um antígeno de células T CD8 filhas. A expressão de CD4 e CD8 nas células filhas pode ser mutuamente exclusiva. Por exemplo, as células filhas podem ser CD4+/CD8- ou CD4/CD8+. Em alguns casos, cada célula CD4+ filha é CD3+, cada célula CD8+ filha é CD3+. Dessa forma, as relações de pai- descendente podem ser consideradas como tendo um efeito sobre os padrões de expressão. De um modo semelhante, as relações de pai- descendente podem ser consideradas como tendo um impacto sobre a relevância da distorção associada. Como um exemplo, se um antígeno descendente é marcado com um corante que pode causar uma distorção no canal quando o antígeno pai marcado é detectado, então pode não ser necessário levar em consideração a essa distorção. Por exemplo, quando todas as células CD4+ também são positivas para CD3, pode não haver nenhuma CD4+ que pode estar no fundo (por exemplo, não há nenhuma CD4+ que também é CD3-). Em alguns casos, um marcador CD3 pai pode causar uma distorção em um canal de CD4 filha.
[0130] Assim, as relações de pai-descendente podem ter um efeito sobre a distorção de fundo. Quando a distorção é aplicada a uma população positiva, essa pode ser descrita como uma população que está em uma faixa maior da escala logarítmica. Em alguns casos relacionados, tal erro de medição pode não ser substancialmente relevante com respeito ao limite de detecção do canal no qual a população positiva é detectada. De acordo com algumas modalidades, não há nenhum efeito causado por uma relação de pai-descendente diferente da produção de um transbordamento e distorção relacionada irrelevante se o transbordamento ocorre a partir do canal do descendente para o canal do pai. Se o transbordamento ocorre do canal pai para o descendente a distorção "normal" se aplica.
[0131] Conforme discutido aqui em outra seção, o canal de detecção primário para um fluorocromo específico é o canal em que o usuário pretende detectar o sinal associado com o fluorocromo. Em relação a um único canal primário, pode haver um ou mais canais secundários (por exemplo, onde um fluorocromo para o canal primário tem espectros de emissão que se espalham para os outros canais). Por exemplo, um sistema pode ser configurado para detectar principalmente o corante PE em um canal FL2, entretanto, o espectro de emissão de PE pode ainda transbordar para outros canais, como FL3, FL4, FL5, e similares. Nesse sentido, os canais secundários podem indicar onde são detectadas as intensidades de sinal indesejáveis. Tais características de transbordamento podem ser usadas junto com as relações de pai- descendente para avaliar ou configurar os projetos do painel de sonda. Em alguns casos, uma sonda pode ser atribuída a um canal primário, enquanto tendo forte transbordamento para um canal secundário, em que o canal secundário representa um canal primário. Como também descrito em outro local deste documento, os sistemas de pai/descendente para populações típicas podem ser representados em uma base de dados. Em alguns casos, o usuário pode optar por prosseguir com um esquema predefinido de pai-descendente. Em alguns casos, um usuário pode optar por definir o seu próprio esquema de pai-descendente. Em alguns casos, um usuário pode optar por especificar que não há nenhum esquema de pai-descendente. Por exemplo, com respeito à análise de distúrbios das células do sangue, certos padrões de expressão podem ser surpreendentemente aberrantes. Em tais casos, pode ser desejável que o usuário indique que não há relações de pai-descendente.
[0132] Conforme mostrado na Figura 2D, o usuário tem a opção de selecionar certos parâmetros de densidade de antígeno, se for desejado, que podem estar contidos em uma base de dados. Por exemplo, as densidades de antígeno padrão podem estar contidas na base de dados. Tais padrões podem se referir a populações típicas que estão presentes no sangue periférico humano. Outros tipos de padrões podem ser implementados. Assim, dependendo de se um usuário está interessado na avaliação do material associado com células de cultura celular, ou material associado com medula óssea, por exemplo, diferentes densidades de expressão e/ou padrões podem estar disponíveis.
[0133] Conforme representado na Figura 2D, para os anticorpos individuais, é possível selecionar um fenótipo como indexado de acordo com a Figura 2A. Cada anticorpo selecionado para um fenótipo específico pode ser representado em um histograma. Além disso, um usuário pode ter a opção de aceitar ou modificar o que é considerada uma densidade de expressão típica. Com referência à barra abaixo do histograma, um botão pode ser movido para deslocar a população positiva versus a população negativa. Dessa forma, é possível influenciar a razão de sinal para ruído que pode ser assumida para uma dada população. Alterações na razão de sinal para ruído podem influenciar a interferência ou transbordamento que pode ser esperado estar presente em outros canais. De acordo com algumas modalidades, os termos interferência e transbordamento podem ser usados de forma intercambiável. Assim, quando o sinal mais brilhante é presumido, ou quando um sinal mais brilhante é selecionado ou ajustado, uma maior quantidade de interferência ou transbordamento pode ser assumida como estando presente em outros canais. Em alguns casos, um usuário pode optar por prosseguir com um padrão (por exemplo, densidade de antígeno e/ou intensidade de sinal). Em alguns casos, um usuário pode modificar as intensidades de sinal de acordo com as características esperadas de um fenótipo específico desejado, como uma população de células T ou uma população de monócitos ou uma população de células não humanas ou uma população não relacionada com o sangue periférico humano ou medula óssea ou outros.
[0134] A Figura 3 representa aspectos de uma técnica de seleção de painel de sonda 300 de acordo com as modalidades. Conforme mostrado aqui, dados como parâmetros de anticorpo selecionado pelo usuário 310 (por exemplo, conforme descrito na Figura 2), uma configuração do dispositivo de citometria de fluxo 320 (por exemplo, conforme descrito na Figura 1), e uma base de dados 330 de anticorpo, podem ser introduzidos ou acessados por um módulo de simulador 340, que opera para as combinações ótimas propostas de acordo com fenótipos priorizados e/ou expressões de antígeno, e para a produção de gráficos (por exemplo, A, B, e C) mostrando os limites de detecção e separações da população com base em painéis de sonda simulados. Como ilustrado pela etapa 350, é possível selecionar um painel de sonda com base nas simulações. Na modalidade aqui representada, o painel de sonda selecionado é para a configuração do dispositivo de citometria de fluxo tendo três lasers e dez canais de detecção de cor (PC5 e PC5.5 podem ser detectados pelo mesmo canal). O painel inclui conjugados de anticorpo-corantes específicos para dez antígenos de CD.
[0135] A Tabela 1 abaixo representa aspectos de uma lista de sonda exemplificadora que pode ser associada com as, ou parte das, sondas da base de dados. Conforme representado aqui, as sondas individuais podem incluir um anticorpo ou outro agente de ligação específica para um antígeno específico, conjugado com um corante. Tabela 1
[0136] Entende-se que uma estrutura de superfície ou celular como um agrupamento de diferenciação (CD) e o anticorpo dirigido contra a estrutura ou agrupamento pode ser referida de forma intercambiável. Por exemplo, um anticorpo que reconhece o agrupamento de diferenciação 3 (CD3) também pode ser chamado de anticorpo CD3 ou CD3. Em alguns casos, o anticorpo anti-CD3 termo pode ser usado. Em alguns casos, existem estruturas celulares que não foram atribuídas a um número de CD. Em tais casos, o nome da própria estrutura pode também ser usado para denominar o anticorpo. Em alguns casos, pode ser usada a nomenclatura de um anticorpo anti-"estrutura".
[0137] Conforme discutido aqui em outra seção, de acordo com um padrão de expressão que é recuperado de uma base de dados (ou presumido ou atribuído por um usuário), um padrão de expressão específico pode corresponder a um esquema de coexpressão, um esquema de exclusão específica, ou um esquema de pai-descendente. Em alguns casos, os antígenos selecionados poderão ser atribuídos a um certo fenótipo. Com base nessas categorias de informações, é possível exibir graficamente dados em representações de plotagem de pontos bidimensionais, como as mostradas nos painéis A, B, e C. Em alguns casos, as representações podem também incorporar estimativas de distorções de fundo.
[0138] Conforme mostrado aqui, a população X pode refletir casos em que a intenção é a de detectar o antígeno X em uma população específica. No painel A, existe um ponto crítico agudo da linha reta que delimita o quadrante superior esquerdo do quadrante superior direito, indicando um forte aumento em um limite de detecção para o antígeno Y para a população que expressa o antígeno Y, dependendo da densidade de antígeno Y. Essas características de limite de detecção são muito diferentes daquelas para o antígeno X para a população que expressa antígeno Y. A linha que delimita o quadrante inferior direito do quadrante superior direito não tem nenhum ponto crítico mas é paralela com o contorno do diagrama indicando, assim, que não há nenhuma dependência do limite de detecção para o antígeno Y da densidade de expressão do antígeno X nas respectivas células. Assim, essa produção gráfica pode indicar para o usuário que essa escolha específica pode não ser ótima.
[0139] Sendo assim, quando o usuário seleciona ou introduz um certo padrão de expressão do antígeno (por exemplo, como associado com parâmetros de anticorpo 310), o sistema pode recuperar certos conjugados de anticorpo-corante de uma base de dados com base na seleção ou entrada do usuário. O usuário pode então observar as várias saídas gráficas associadas com o padrão de expressão do antígeno. De acordo com algumas modalidades, o sistema pode gerar uma proposta de painel de sondas otimizado de acordo com as seleções de antígeno feitas pelo usuário. De acordo com algumas modalidades, um usuário pode selecionar um perfil de especificidade de anticorpo específico ou padrão de expressão de antígeno, e o sistema pode retornar uma permutação de todas as combinações possíveis do conjugado para o perfil ou padrão. Em alguns casos, o sistema pode exibir combinações de conjugado selecionadas de acordo com antígenos prioritários. Assim, pode haver uma classificação de prioridade para certos antígenos, e a classificação pode ser usada para determinar quais combinações de conjugado são esperadas para fornecer os resultados ótimos com respeito à sensibilidade e quais combinações de conjugado exibir em uma produção gráfica. De acordo com algumas modalidades, o sistema pode retornar as combinações de conjugado otimizadas de acordo com o fenótipo/conjugados priorizados relacionado com padrões de expressão de brilho do fluorocromos e similares. Em alguns casos, os antígenos podem ser priorizados em função da sensibilidade. Por exemplo, pode ser desejável ter uma sensibilidade mais alta para um antígeno, enquanto uma menor especificidade para um segundo antígeno é considerada como suficiente.
[0141] Conforme discutido aqui em outra seção, a produção gráfica pode ser influenciada por vários fatores. Por exemplo, a exibição pode depender do padrão de expressão, da configuração do dispositivo de citometria de fluxo, e/ou das características das sondas (por exemplo, se corantes são considerados como ótimos para uma dada especificidade dentro de uma dada combinação de anticorpo, ou os corantes são selecionados especificamente).
[0142] De acordo com algumas modalidades, algumas ou todas as entradas recuperadas a partir da base de dados podem ser predefinidas. De um modo semelhante, algumas ou todas as propostas para painéis de sondas como recomendado pelo sistema podem ser calculadas com base em um conjunto inteiro de antígenos, inclusive de padrões de expressão. Por exemplo, dez conjuntos padrões para dez antígenos podem resultar em uma recomendação diferente de painéis de sondas quando, por exemplo, diferentes padrões de expressão esperados são escolhidos pelo usuário. A modificação de determinados parâmetros, como um padrão de expressão ou uma intensidade de sinal, pode resultar em uma mudança no monitor. Em alguns casos, um monitor de simulação pode indicar uma recomendação específica do sistema. Em alguns casos, um monitor de simulação pode mostrar a saída de acordo com corantes pré-estabelecidos. Em alguns casos, um monitor de simulação pode mostrar a saída de acordo com um caso misto, em que alguns corantes são selecionados pelo usuário e alguns corantes são selecionados pelo sistema. De acordo com algumas modalidades, os sistemas podem retornar as combinações de conjugado otimizadas de acordo com o fenótipo/conjugados priorizados relacionado com padrões de expressão de brilho do fluorocromos e similares. Antígenos relevantes para um certo fenótipo podem ser mostrados em plotagens de pontos bivariadas ou outras representações. Na Figura 3, existem três plotagens mostradas. As modalidades da presente invenção abrangem a exibição de qualquer número de plotagens. Por exemplo, quando cinco antígenos são selecionados, pode haver dez plotagens, conforme representado na Tabela 2.
[0143] De acordo com algumas modalidades, o usuário pode rever a plotagem de saída de exibição, e levar em consideração quaisquer antígenos que foram priorizados, qualquer conhecimento das populações alvos, e/ou qualquer conhecimento de antígenos de coexpressão alvos e, em seguida, avaliar os limites de detecção e determinar se uma grande distorção é esperada ou não. Em alguns casos, um sistema poderá recomendar um painel de sonda específico, e o usuário pode selecionar o painel recomendado, sem levar em consideração o que é mostrado em uma exibição gráfica.
[0144] Por exemplo, no caso em que CD3 é coexpresso com um antígeno específico, e não há uma distorção significativa sobre a população porque existem muitos antígenos se alastrando para o canal de detecção, o usuário pode decidir não continuar com um tal painel de sonda. O usuário pode, em seguida, voltar a qualquer etapa como se vê nas Figuras 2-2D e modificar as suas entradas e/ou as entradas padrões como recuperado da base de dados.
[0145] Um objetivo na citometria de fluxo, por exemplo, em que as células são coradas com os corantes de imunofluorescência, é analisar as proteínas ou marcadores que são expressas na superfície ou no interior da célula. Dessa forma, é possível classificar as células (ou subconjuntos de células) como sendo positivas ou negativas para um antígeno ou marcador específico. Assim, por exemplo, algumas células podem ser consideradas "negativas" para um marcador ou antígeno específico, e outras células podem ser consideradas "positivas" para um marcador ou antígeno específico. Para determinar se uma célula é negativa ou positiva, pode ser útil definir um limiar de intensidade de sinal, através do qual as células que expressam níveis mínimos ou inexistentes de antígenos, de modo a produzir uma intensidade de sinal abaixo do limiar são consideradas "negativas" e células que expressam níveis de antígeno suficiente de modo a produzir um sinal de intensidade acima do limiar são consideradas "positivas". Tal limiar de intensidade de sinal pode também ser chamado de um limite de detecção.
[0146] Assim, em alguns casos, um limite de detecção pode se referir a um limiar entre um evento negativo e um evento positivo sobre uma escala específica. Ou seja, pode haver um corte positivo /negativo, através do qual um nível indetectável ou baixo do sinal ou fluorescência corresponde a um evento negativo. Em alguns casos, a fluorescência inespecífica pode corresponder a um evento negativo. Em contraste, um nível suficientemente elevado de sinal ou fluorescência pode ser considerado como um evento positivo.
[0147] Conforme discutido aqui em outra seção, um limite de detecção específico pode ser com base em uma formulação que envolve dados de isotipo, intensidades de fluorescência, fatores de distorção, e similares.
[0148] Um protocolo de imunofenotipagem típico envolve a marcação de células de uma amostra biológica com conjugados de anticorpo-corante que se ligam especificamente a proteínas na superfície das células. Dessa forma, as proteínas expressas pelas células podem ser analisadas. Devido à natureza das sondas de conjugados, entretanto, a ligação não específica indesejável pode ocorrer entre as sondas e células. Ou seja, uma sonda pode ligar-se a uma certa célula, apesar da sonda não ser projetada para se ligar à célula.
[0149] Os anticorpos de controle de isotipo podem ser usados para fornecer um controle negativo para tal fluorescência ou ligação não específica. Tipicamente, o controle de isotipo é gerado a partir do mesmo hospedeiro do qual a sonda de anticorpo é gerada. Por exemplo, se um anticorpo de uma sonda de conjugado é gerado a partir de um camundongo, então o isotipo do anticorpo usado para controlar a sonda também é gerado a partir de um camundongo. Além disso, o isotipo pode ser gerado de modo que se tem uma especificidade para um antígeno que não é conhecido por ocorrer na amostra (ou caso contrário, que não ocorre em uma célula alvo).
[0150] Ao colorir uma amostra com um controle de isotipo, o sinal resultante pode ser uma indicação de ligação não específica de um conjugado de anticorpo-corante a uma superfície celular. Dessa maneira, um controle de isotipo pode ser usado para avaliar o nível de intensidade de fundo que poderá ocorrer em um procedimento de coloração com conjugado. Por exemplo, o controle de isotipo pode significar que o nível sobre o qual a intensidade de fluorescência obtida com uma sonda pode ser considerada específica. Ou seja, quando se colore com a sonda projetada, um sinal detectado excede o nível de intensidade de fundo fornecido pelo controle do isotipo, então é possível deduzir que o sinal detectado corresponde a um evento positivo.
[0151] Na prática, um controle de isotipo pode ser usado para distinguir a ligação específica de uma ligação não específica, para definir a especificidade ou controles de chaveamento, para designar o local das portas ou de regiões ou fronteiras gráficas usadas para classificar as células, para determinar a positividade ou negatividade para antígenos específicos, para atribuir fronteiras positivas/negativas nos dados, e similares. Os controles do isotipo de anticorpo podem ser usados em procedimentos de citometria de fluxo. Pode ser especificamente útil usar controles de isotipo de anticorpos quando se emprega várias colorações em um procedimento de citometria de fluxo.
[0152] Em alguns casos, por exemplo, quando um antígeno tem uma expressão bimodal distinta, sem sobreposição entre população positiva e negativa (por exemplo, CD4 e CD8 nas células T), pode ser possível proceder sem o uso de um controle.
[0153] Os controles de isotipo podem ajudar a resolver o sinal para as questões do ruído em um protocolo de análise celular. Ao determinar se um padrão de expressão ou célula de interesse pode ser positivo para um determinado marcador, um controle de isotipo pode ajudar a otimizar a sensibilidade da resolução sem sacrificar indevidamente a especificidade. Quando se usa um controle de isotipo, é possível avaliar se um sinal detectado pode corresponder apenas à ligação não específica, ou a alguma combinação de ligação não específica e específica. Conforme discutido aqui em outra seção, os controles de isotipo podem ser úteis para determinar um limite de detecção. Os isotipos podem contribuir para o fundo, e a sobreposição ou transbordamento espectrais pode contribuir para o espalhamento do fundo, sendo que ambos podem desempenhar uma função na sensibilidade.
[0154] A Figura 4 descreve certos aspectos de sinalização de isotipo e sensibilidade de resolução. Por exemplo, conforme mostrado no painel A, o sinal de isotipo do lado esquerdo corresponde a um evento negativo, e o sinal detectado na direita corresponde a um evento positivo. Aqui, a população negativa tem um fundo baixo em relação à população positiva, e as populações podem ser resolvidas facilmente (por exemplo, com um limite de detecção bem definido). Em contraste, o painel B mostra uma situação em que a população negativa tem um fundo elevado em relação à população positiva e, consequentemente, pode ser difícil resolver as populações. De um modo semelhante, o painel C mostra uma situação em que a população negativa tem um fundo baixo (em relação à população positiva) e um alto coeficiente de variação (CV) e, portanto, pode ser difícil resolver as populações. Tal situação pode estar presente quando um controle de isotipo apresenta transbordamento significativo. Assim, para ser capaz de resolver as populações positivas e negativas, é útil ter um sinal negativo com baixo fundo em relação ao sinal positivo, e ter um sinal negativo com um baixo espalhamento ou variância.
[0155] Conforme discutido aqui em outra seção, um corante em uma sonda pode apresentar uma emissão que transborda para um canal específico destinado a detectar a emissão de um corante de outra sonda. Em tais casos, o transbordamento pode ser análogo ao espalhamento de dados da população negativa conforme descrito acima.
[0156] Em alguns casos, a amplitude da população em um canal secundário pode aumentar devido a dados espalhados como causado por transbordamento de um outro marcador fluorescente na mesma população detectada em um canal primário, que pode contribuir para um aumento do limite de detecção no canal secundário. Por exemplo, à medida que o erro de medição para uma população negativa aumenta, a amplitude de distribuição pode também aumentar. Em alguns casos, pode haver um grande erro de medição, e um sinal detectado em um canal secundário na presença de transbordamento a partir de um canal primário pode estar além de um sinal de controle de isotipo em um canal secundário na ausência de um transbordamento de um canal primário, mas ainda pode corresponder a um evento negativo. Em alguns casos, o transbordamento pode contribuir para um aumento do limite de detecção. Por exemplo, um aumento na quantidade de transbordamento para um canal de detecção específico pode operar para aumentar o limite de detecção para esse canal. Isto pode ser associado com um maior erro de medição que é causado por uma forma mais intensa de detecção de fluorescência no canal específico.
[0157] Em alguns casos, um anticorpo de isotipo pode ser usado para obter uma linha de base. Em alguns casos, uma célula não corada pode ser usada para obter uma linha de base. Quanto maior o número de etapas de lavagem aplicadas após a coloração durante o processo, mais provavelmente a funcionalidade de isotipo se aproxima da funcionalidade da população de células não coradas, com respeito à fluorescência de fundo. Ou seja, a lavagem extensiva pode operar para equalizar o fundo, de tal modo que mesmo que o corante de isotipo tenha sido adicionado, a lavagem atua para remover todo o isotipo ligado não especificamente.
[0158] Seguindo um protocolo de coloração com um painel de sonda multicolor, pode haver vários fluorocromos associados com a superfície celular. Para avaliar a positividade específica para um antígeno como detectado por um único certo conjugado sobre essas células, pode ser útil levar em consideração a emissão de todos os outros fluorocromos nessas células, o que pode contribuir para aumentar o limite de detecção para o respectivo único fluorocromo.
[0159] Tipicamente, a citometria de fluxo envolve o uso de corantes ou fluorocromos que têm certas propriedades, como valores de brilho ou intensidade de fluorescência. Por exemplo, o corante PE pode ter uma intensidade de brilho de 3420000, ao passo que FITC pode ter uma intensidade de brilho de 39000. Essas intensidades podem ser medidas como em relação uma à outra, com um corante sendo escolhido como uma referência para a intensidade máxima. Conforme discutido aqui em outra seção, a intensidade dos fluorocromos individuais pode ser considerada na avaliação dos painéis de sonda.
[0160] Uma distorção de uma população de fundo e, consequentemente, um aumento do limite de detecção podem corresponder ao número de fluorocromos que se alastram na superfície celular ou no interior da célula ou à intensidade do sinal de transbordamento relacionado para o respectivo canal de detecção. Assim, por exemplo, uma maior quantidade de transbordamento pode corresponder a uma distorção de fundo mais amplo. Em alguns casos, é possível considerar o número de anticorpos ligados à superfície celular, considera-se que esse número maior de anticorpos marcados com o fluorocromo de alastramento específico contribui mais para a distorção de fundo. Em alguns casos, uma base de dados pode conter estimativas da distorção do fundo, por exemplo, com base em intensidades assumidas que são típicas para um certo tipo de célula. Em outras palavras, a distorção pode ser baseada no número de anticorpos marcados com fluorocromos de alastramento que estão ligados a esse tipo de célula.
[0161] Como um exemplo, é possível considerar uma célula T que expressa o antígeno CD3 juntamente com alguns outros antígenos Z coexpressão. Tipicamente, as células T têm uma expressão muito forte de CD3 na superfície. Assim, quando se colore com uma sonda anti- CD3, que se destina a fornecer o sinal de emissão para um canal específico, é possível que a sonda do conjugado de corante - anticorpo CD3, na realidade, interfira fala com o canal que se destina a detectar a sonda Z, então o limite de detecção para a sonda Z pode ser aumentado. Ao realizar um experimento multicolor, padrões de transbordamento complexos podem ocorrer. Por exemplo, para um experimento de dez cores, pode ser necessário levar em consideração o transbordamento de outras nove cores quando se considera um canal de detecção específico. Ou seja, cada uma das outras nove cores pode contribuir para um aumento do limite de detecção para esse canal específico. Em alguns casos, a distorção pode ser dependente do tipo de célula e dos padrões de expressão relacionados sendo analisados. Em alguns casos, a distorção pode ser dependente do número de anticorpos ligados no tipo de célula que transporta um fluorocromo de alastramento.
[0162] Voltando ao exemplo da sonda anti-CD3, é possível considerar uma célula T (densidade alta de antígeno CD3) e uma célula B (ausência de antígeno CD3), em que tanto a célula T quanto B expressam um antígeno de célula Z. Quando se colore uma célula T com a sonda CD3, o corante pode fornecer um transbordamento para o detector de canal Z, aumentando, assim, o limite de detecção do canal Z. Em contraste, quando se colore de uma célula B com aquela mesma sonda de CD3, não existe nenhuma ligação (específico) porque CD3 está ausente na célula B, e, portanto, não há transbordamento do corante da sonda de CD3, e não se considera que a sonda de CD3 causa um aumento do limite de detecção no canal Z. Assim, pode ser visto que os fatores de distorção podem variar dependendo do tipo de célula e padrões de expressão de antígenos relacionados. Por exemplo, um canal de sonda específico pode resultar em um conjunto de limites de detecção para um tipo de célula, e um outro conjunto de limites de detecção para um outro tipo de célula. De um modo semelhante, o conjunto de limites de detecção para uma determinada sonda de canal pode depender de quais tipos de antígenos são expressos nas células sendo analisadas.
[0163] Por exemplo, quando um tipo de célula é isento do antígeno A (e, portanto, nenhuma ligação com uma sonda específica para o antígeno), um aumento no limite de detecção pode não ser observado em um canal de detecção que é específico para o antígeno de B. Em contraste, quando um tipo de célula expressa abundantemente o antígeno A (que é ligado por uma sonda para o antígeno A, que também fornece transbordamento para o canal de detecção para o antígeno B), então pode haver um aumento no limite de detecção no canal de detecção que é específico para o antígeno B. Dessa forma, o aumento do limite de detecção (ou a falta de aumento) pode ser com base no padrão de expressão das células coradas.
[0164] O fator de deformação pode, dessa forma, ter um impacto sobre o limite de detecção. Por exemplo, quando há um aumento no limite de detecção (por exemplo, um aumento de uma década, devido ao transbordamento), pode ser necessário observar ou detectar um maior sinal no canal para concluir que há um evento positivo.
[0165] Conforme discutido com referência à Figura 8, pode-se ver que há um forte transbordamento do corante PE (da sonda CD4-PE) para o canal FL3 que detecta ECD. Devido ao transbordamento, o sinal de ECD descompensado da população especificamente marcada com PE é algumas centenas de vezes mais brilhante do que o sinal de ECD descompensado da população de fundo não especificamente marcada com PE em comparação com um corante do isotipo não específico.
[0166] Em alguns casos, com um aumento no sinal, há um aumento no espalhamento da população de CD4+. Assim, pode haver um sinal de PE maior nessa população. Consequentemente, para o marcador FL3 (eixo y) pode haver um aumento no limite de detecção. Compensação
[0167] Tipicamente, um sinal de fluorescência mais alto pode ser acompanhado por um erro de medição absoluto mais alto. Por exemplo, com referência à Figura 5, a população positiva de PE causa um sinal no canal de detecção de FL3 para ECD, devido ao transbordamento da emissão corante PE para o canal de detecção de FL3 para ECD e, portanto, os erros absolutos podem ser muito mais altos para essa população. Isto pode ser representado como um desvio padrão. Em alguns casos, os erros de medição podem ser afetados de acordo com características de distribuição de Poisson e não podem ser reduzidos por processos de compensação, uma vez que os mesmos podem apenas corrigir a intensidade média de uma população especificamente marcada com conjugados de alastramento versus uma população não marcada especificamente com conjugados de alastramento. Se a comparação dos erros de medição relativos (conforme representado pelos respectivos coeficientes de variação CV) indica um grau de semelhança suficiente, isso pode ser um sinal de linearidade da detecção.
[0168] Em alguns casos, pode haver um fator de dois entre os coeficientes de variação, de modo a que os CVs são relativamente similares e da mesma ordem de grandeza, e ainda o desvio padrão pode ser mais que 100 vezes diferente, ou mais.
[0169] Conforme representado nas Figuras 6A e 6B, os valores de fluorescência negativa, para os eventos de sinal expressão medidos por um PMT de detecção de PE e por um PMT de detecção de ECD, plotados uns contra os outros, podem ser artificialmente gerados em uma distribuição bimodal através da compensação computacional. O cálculo bimodal conforme mostrado pode operar para distinguir eventos que são negativos para o primeiro dos dois conjugados de anticorpo- corante medidos, o segundo dos dois conjugados de anticorpo-corante medidos, ou ambos dos dois conjugados de anticorpo-corante medidas. A Figura 7 mostra um aumento na amplitude de distribuição para os eventos de sinal de expressão medidos por um PMT de detecção de ECD e por um PMT de detecção de PC5, plotados uns contra os outros. A Figura 7, em parte, reflete o fato de que a coexpressão pode afetar a proliferação de uma população negativa para um canal de transbordamento. Embora não esteja representado nessas figuras, o espalhamento para os eventos positivos é igual ao espalhamento para os eventos artificialmente negativos.
[0170] Conforme mostrado na Figura 8, pode haver um aumento no limite de detecção devido ao forte transbordamento. Em alguns casos, os cálculos implementados através de software e/ou hardware podem funcionar para corrigir o transbordamento, em um procedimento de compensação. Em um certo ponto de compensação, o PE negativo e o PE positivo pode ter a mesma média no eixo de DPI, que pode se referir a uma compensação correta (ver, por exemplo, a Figura 5). Conforme representado na Figura 5, a população positiva de PE compensada pode ter um maior erro de medição, de tal forma que há uma maior disseminação de dados, em comparação com a população negativa de PE. Portanto, pode haver uma certa faixa de sinal ECD que é menos intensa do que o aumento do erro de medição. Tais sinais podem não ser mais detectáveis como eventos positivos. Em alguns casos, pode haver também uma bifurcação da população compensada.
[0171] Quando se transforma uma certa porção da escala Y para uma escala linear (ver, por exemplo, Figura 7), é possível comprimir a extremidade mais baixa da escala logarítmica. Tal transformação pode indicar que o erro de medição (por exemplo, amplitude, ou espalhamento) da população positiva de ECD é maior do que a população negativa de ECD. Em alguns casos, um transbordamento a partir de uma população positiva de FL3 (ECD) para um canal de detecção de FL4 (PC5) pode ser traduzido para uma medição de erro maior após a correção computacional das intensidades médias referidas como compensação. Em alguns casos em que há fluoróforos ligados às células que têm um transbordamento para um canal de detecção de FL4 (PC5), tais corantes como ECD e PE que podem ser fixos a anticorpos que detectam estruturas celulares nas mesmas células resultando em células duplamente positivas de FL3 (ECD) e FL2 (PE), podem ser sobrepostos por transbordamento para o canal de FL4. Isso pode se traduzir em um erro de medição sobreposto. Pode ser possível levar em consideração tal erro. Por exemplo, cada uma das contribuições para o espalhamento de dados globais pode ser estimada como um valor linear, e os valores lineares podem ser somados. O resultado pode então ser transformado em valor de log novamente. Além disso, uma base de dados pode conter informações sobre quais antígenos podem ser expressos na mesma superfície celular. Tais informações podem ser usadas para uma base para a seleção de quais dos sinais de transbordamento devem ser combinados para essa população que é positiva para FL3. Assim, pode haver corantes que também têm um transbordamento para o canal de FL4 como o PE, entretanto, os antígenos associados a tais corantes não podem ser expressos no mesmo tipo de célula que é FL3+, e assim não contribuem para o erro de medição global nesse canal.
[0172] De acordo com algumas modalidades, o tipo de célula ou padrão de expressão ou perfil pode ter um impacto sobre os resultados. Por exemplo, os resultados podem depender do padrão de antígenos que é expresso na célula, e que é reconhecido pelas sondas de conjugado de corante anticorpo. Por causa do transbordamento potencial de alguns corantes para canais secundários, os limites de detecção para cada um dos fluorocromos pode ser influenciado. Em alguns casos onde há transbordamento, a população na faixa negativa da escala pode ser espalhada ou distorcida, e os limites de detecção podem aumentar. Tipicamente, um padrão de expressão específico será exclusivo para um tipo de célula. Por exemplo, é improvável que dois tipos diferentes de células possam ter padrões de expressão idênticos. Para fornecer uma estimativa sobre o aumento do limite de detecção, pode ser útil identificar quais os sinais de fluorescência irão estar presentes nas células. Consequentemente, as técnicas, como aqui discutidas abrangem identificar um padrão de expressão para uso na avaliação de painéis de sondas.
[0173] O gráfico da Figura 8 representa os resultados de um protocolo de coloração com o uso de um anticorpo específico para o antígeno CD4, conjugado com um corante PE. Conforme mostrado aqui, o canal de detecção de FL3 (sensível à emissão do corante ECD) está registrando transbordamento e, portanto, a distorção de fundo do fluorocromo de PE.
[0174] Como um exemplo, é útil considerar uma célula T auxiliar, que é positiva para CD3 e CD4. Em alguns casos, pode ser desejável avaliar a célula para ver se um receptor de citocina, como CD25 (receptor de IL-2) ou CD184 (CXCR4) está presente. Frequentemente, um receptor de citocina irá ter um número de cópias baixo e, assim, será fracamente colorido na superfície das células T auxiliares. Assim, quando é desejável avaliar a coloração do receptor de citocina no canal de FL3 (DPI), pode não ser desejável atribuir um marcador de célula T auxiliar (por exemplo, células CD4) no canal de PE. Isto é porque as células CD4+ que são coradas com o marcador PE vão apresentar um aumento no limite de detecção em FL3 (ECD) onde a detecção de citocinas é desejada.
[0175] Conforme representado na Figura 8, há um aumento no limite de detecção, associado com a diferença entre o limite de detecção para a população de CD4- e a população de CD4+. +. A linha na parte inferior do eixo y delimita a população de CD através da limitação da população negativa. Esse gráfico específico descreve uma quantidade significativa de transbordamento e, portanto, a distorção do fundo a partir do espectro de emissão de PE para o canal de detecção de ECD. Assim, o aumento do limite de detecção é considerável. Comparando esse resultado com a população negativa no lado esquerdo do gráfico, pode-se ver que uma quantidade substancial de sensibilidade (por exemplo, cerca da metade de uma década) é perdida. Consequentemente, o número de cópias que seria detectado com o marcador ECD necessitaria ser várias vezes (por exemplo, 6x) mais alto (por exemplo, sinal mais brilhante) em uma população de CD4+, em comparação com uma população CD4-, para ser detectado ou registrado como um evento positivo.
[0176] Em um exemplo relacionado, é útil considerar um canal de detecção diferente, como o canal de FL5 que se destina a detectar o espectro de emissão do corante PC7. Nesse exemplo, o canal de FL5 detecta um determinado comprimento de onda que é mais distante para a emissão do fluorocromo de PE. Assim, haverá menos transbordamento do espectro de emissão de PE no canal de FL5 e, assim, do coeficiente angular da linha de ponto crítico (por exemplo, conforme mostrado na Figura 8) seria menos acentuado. Dito de outra forma, quanto mais baixa a quantidade de transbordamento para um canal específico, menor o coeficiente angular da linha de ponto crítico (por exemplo, conforme mostrado na Figura 8) associado com aquele canal.
[0177] O valor de comprimento de onda específico é outro parâmetro que pode impactar o resultado. Frequentemente, a faixa de comprimento de onda associada com um detector ou PMT específico é pelo menos em parte determinada por um filtro passa-banda que está na frente do filtro. Tipicamente, quanto maior for o comprimento de onda a ser detectado por um PMT específico, menos sensível o PMT será, e consequentemente o PMT terá um maior erro intrínseco. Por exemplo, um canal de detecção de PC7 pode ser configurado para detectar a luz de comprimento de onda maior que 755 nm, enquanto que um canal de detecção de PE pode ser configurado para detectar a luz a um comprimento de onda de 575 nm+/- 15. Consequentemente, pode haver mais distorção associada com o canal de PC7. Esses efeitos podem ser levados em consideração na base de dados ou tabela. Um outro fator que pode ser considerado envolve a quantidade de luz transbordando para um canal secundário. Por exemplo, pode ser útil levar em consideração a quantidade de luz que um corante específico tipicamente transbordaria sobre um outro canal secundário. As propriedades do canal secundário, com respeito a um erro de medição intrínseco, que podem depender do comprimento de onda, podem ser consideradas.
[0178] Conforme representado na Figura 8, o fator de distorção é fornecido pelo coeficiente angular da linha de ponto crítico (limite de detecção). O fator de deformação pode ser baseado em um parâmetro de intensidade (por exemplo, intensidade de sinal de coloração de PE). Além disso, um comprimento de onda maior no canal secundário no eixo y pode corresponder a um maior coeficiente angular. Assim, o fator de distorção pode aumentar com o comprimento de onda. Em alguns casos, isso pode ser aplicado para a intensidade do sinal de PE. Por exemplo, o fator de distorção de transbordamento de PE para um canal de ECD pode ser diferente do fator de distorção de transbordamento de PE para um canal de infravermelho, em que o fator de distorção para o canal de infravermelho será maior. De um modo semelhante, devido ao canal de infravermelho poder estar a uma distância espectral maior do canal de PE, a quantidade de luz de transbordamento pode ser menor. Tipicamente, os detectores de PMT podem fornecer uma boa faixa de linearidade e, portanto, uma abordagem linear é útil. O fator global de distorção pode ser aproximado ou se correlacionar com o aumento do limite de detecção. Conforme mostrado na Figura 8, o fator de distorção pode ser o coeficiente angular da linha de ponto crítico no quadrante, e, assim, o limite de detecção pode ser determinado de uma forma linear.
[0179] Em uma modalidade de um cálculo do limite de detecção, é possível obter (i) o valor de X no eixo X e (ii) o fator de distorção ou coeficiente angular e, assim, gerar o valor de Y ou limite de detecção.
[0180] Por exemplo, é possível fornecer a densidade de expressão relativa FL(x) de um sinal que pode transbordar (por exemplo, com base na densidade de antígeno CD4), e esse valor pode ser obtido a partir de dados empíricos. É também possível fornecer a intensidade do fluorocromo de expressão relativa FL(x), por exemplo, do marcador PE, correspondendo ao brilho do fluorocromo.
[0181] Uma abordagem empírica exemplificadora pode envolver a coloração de uma população de células T com uma sonda de CD4-PE, e a avaliação da população positiva (por exemplo, separada por 2,5 décadas a partir de uma população negativa). Uma tabela de resultados pode ser gerada com base nos dados.
[0182] Assim, ao introduzir um valor de X (por exemplo, uma estimativa de acordo com uma densidade de expressão típica e brilho do corante) juntamente com um coeficiente angular ou uma relação linear, é possível determinar o valor de Y ou limite de detecção. Considerando-se um painel de sonda que inclui vários conjugados de anticorpo-corante, é possível obter um fator de distorção para cada um dos marcadores que fornecem um transbordamento para o canal de FL3. Os resultados podem variar de acordo com o corante selecionado. Por exemplo, uma sonda de CD4-PE pode fornecer um maior grau de separação, e uma sonda de CD4-FITC pode fornecer um menor grau de separação.
[0183] Em alguns casos, os valores podem ser linearizados, adicionados, e a soma dos valores linearizados subsequentemente transformada para um valor de log, de modo a obter uma distância de log. Para cada um dos corantes, diferentes fatores de distorção podem ser aplicados. Além do mais, pode haver diferentes razões de sinal/ruído entre as populações positivas e negativas.
[0184] De acordo com algumas modalidades, para uma dada combinação de conjugado, para uma população de CD-Y, em que CD- Y é um antígeno específico de interesse sendo medido por um único canal, uma estimativa das distâncias da razão de sinal-para-ruído "não tocado" (S/N) pode ser dada por: FL(y) = densidade relativa de expressão FL(y) * intensidade relativa do fluorocromo FL(y) onde no caso de um marcador modulado, a distância de S/N FL(y) pode ser ajustada para zero (0). Para a dada combinação de conjugado, uma estimativa de transbordamento de uma ou mais populações de CD-X causando distorções para a medição de canal para CD-Y para cada indivíduo da população de CD-X pode ser dada por: Distorção FL(x) -> FL(y) = Fator de distorção FL(x) -> FL(y) * densidade relativa de expressão FL(x) * intensidade relativa do fluorocromo FL(x) onde no caso em que DC-X é uma subpopulação de CD-Y, ou CD-Y é um conjunto de marcadores de exclusão para o CD-X, a distorção S/N de FL (x) para FL (y) pode ser ajustada para zero (0). As distorções de cada canal em um sistema que tem uma pluralidade de canais (por exemplo, 10 canais no total e, consequentemente, nove canais de CDX) podem ser acumuladas como dado por:
[0185] O conjunto de estimativas e agregação pode ser realizado para cada canal em um sistema, para cada antígeno de interesse de forma individual, permitindo o cálculo de uma distância S/N eficaz para cada antígeno como dado por:
onde a distância S/N eficaz para cada antígeno em cada canal pode ser usada para determinar os limites de detecção para o painel e o sistema global.
[0186] De acordo com algumas modalidades, o limite de detecção (DL) para a positividade específica de um membro fluorescente de CD- Y, representado por FL(y), é uma função quase linear do transbordamento positivo de fluorescência a partir de um membro de CD-X, representado por FL(x) de acordo com as equações:
onde DLIC(FL y)) é definido como o limite de detecção da fluorescência de CD-Y para uma coloração de controle de isotipo indicada como coordenadas entre 0 e 1023; onde RI(FL(x)) é definido como a intensidade de fluorescência de um CD-X acima de seu DLIC(FL(x)) indicado nas décadas de FL(x); e onde DF(FL(x) -> FL (y) é definido como o fator distorção, medido como o aumento de DL(FL(y)) por RI(FL(x)), indicado em décadas de FL(y) dividido por décadas de FL(x).
[0187] Em alguns aspectos, DF(FL(x)->FL(y)) pode ser calculado a partir dos procedimentos de compensação positiva/negativa e correlacionado de acordo com a equação:
onde FL(y, x) é definido como a intensidade FL(y) dos eventos positivos de FL(x), e onde FLIC(x) e FLIC(y) são definidos como a intensidade das colorações de controle de isotipo para os seus antígenos respectivos. Os efeitos de acumulação do alastramento das intensidades compensados a partir de membros de CD-X, FL(x1, x2, ... x(n-1)) para CD-Y podem ser dados por: 
Esses cálculos são também descritos no segundo parágrafo da Figura 1D.
[0188] De acordo com algumas modalidades, os dados de controle de isotipo podem ser fornecidos por paciente fechado em uma população (leucócitos) corada "silenciosa" ou dispersão. Em outras modalidades, os dados de compensação podem ser gerados por aplicação (ou por painel) por um algoritmo positivo/negativo, onde pode ser estabelecido um procedimento matemático ou um experimental para o cálculo de um fator de distorção. Em outras modalidades, a matriz de distorção pode ser gerada com base em um ou ambos dentre o isotipo e os dados compensados. Após a compensação, uma matriz de distorção pode ser aplicada em cada evento. Em algumas modalidades, o conhecimento dos fatores de compensação pode não ser suficiente para completar os cálculos, como aqui descrito. Em outras modalidades, o conhecimento de uma matriz de distorção, que pode ser determinada experimentalmente em um determinado instrumento ou uma configuração do instrumento e um conjunto de corante, podem ser suficientes para completar os cálculos, como aqui descrito. Em ainda outras modalidades, os valores fechados especificamente positivos podem ser apresentados em uma forma de prisma, uma árvore, uma sobreposição tridimensional, uma plotagem de comparação, um plotagem de perfil, ou semelhantes.
[0189] Com referência à Figura 8, pode-se ver que as técnicas podem envolver a introdução ou seleção de um valor para o eixo X, que corresponde a uma densidade de expressão multiplicada pela intensidade de fluorescência. Tais dados podem ser implementados em um módulo de tabela de anticorpo (e lidos ou recuperados do mesmo), como discutido em outras seções deste documento. Em alguns casos, os valores podem ser estimados. Em alguns casos, os valores podem ser baseados em dados experimentais. Por exemplo, é possível analisar os experimentos de coloração de CD4-PE para obter tais dados. Além disso, os métodos podem envolver multiplicação do fator de distorção pela intensidade (real ou estimada) do marcador. Em alguns casos, as densidades de expressão ou padrões de marcadores (por exemplo, para células alvos) podem ter parâmetros ou valores predefinidos. Tal informação pode ser implementada em um módulo de base de dados de anticorpos. Como aqui descrito, o segundo parágrafo da Figura 1D fornece detalhes adicionais para os cálculos do limite de detecção de exemplificadores.
[0190] Conforme representado na Figura 9, um aumento dos limites de detecção pode ser independente de fatores de compensação e/ou tensões de PMT. Em vez disso, o limite de detecção e/ou aumento do mesmo pode depender de espectros de emissão e da configuração do filtro. Tal como ilustrado, as configurações para como os resultados estão representados podem ser adaptadas para remover a distorção (ou, em outras palavras, a aplicação de um fator de compensação) que pode ser causada por leituras de sensores a partir de um PMT desejado sendo medido de forma incorreta em combinação com as leituras do sensor a partir de um canal de PMT separado. Especificamente, a Figura 9 exibe resultados de detecção, procurados a partir de um canal de ECD, com uma porcentagem de leituras dos sensores a partir de um canal de PE subtraído dos resultados de detecção. Três variações de subtração de canal de PE exemplificadoras são mostradas: uma com 34% do sinal do canal de PE subtraído, uma com 46% do sinal do canal de PE subtraído, e uma com 62% do sinal do canal de PE subtraído. Em cada plotagem de resultados do limite de detecção, o número de eventos identificados como alterações positivas ou negativas muda, mas a linha de ponto crítico de detecção entre as duas populações comparadas permanece a mesma. A remoção da distorção fornece um conjunto de resultados mais precisos e sensíveis.
[0191] A Figura 10 mostra aspectos de uma matriz de distorção de padrão de transbordamento exemplificadora para determinados corantes, de acordo com algumas modalidades. O transbordamento pode ser independente das configurações de PMT e fatores de compensação, e pode ser dependente dos fluorocromos, filtros, e da precisão do alinhamento. Em aspectos como ilustrado, a matriz de transbordamento pode ser qualitativa, para exibir rapidamente a um operador o efeito na interface de corantes específicos ou detectores de PMT.
[0192] A Figura 11 mostra aspectos de uma matriz de coexpressão, de acordo com algumas modalidades. Em aspectos como ilustrado, a matriz de coexpressão pode ser qualitativa, para exibir rapidamente a um operador o efeito na interface de antígenos específicos, corantes, ou detectores de PMT. Conforme ilustrado na Figura 11, uma matriz de coexpressão pode indicar interações em que: uma coluna é expressa não exclusivamente com uma linha, uma coluna é uma subpopulação exclusiva de uma linha, ou em que uma coluna é mutuamente exclusiva de uma linha (que fornece uma plotagem simétrica de eventos de expressão).
[0193] A Figura 12A representa estimativas de padrões de coloração esquemáticos, de acordo com algumas modalidades. Quando há positividade para um determinado marcador se alastrando para outro canal, um ponto crítico pode ser observado, conforme mostrado no gráfico à direita. O usuário pode mudar certas entradas para uma simulação, de modo a variar a saída mostrada. Por exemplo, um usuário pode selecionar ou mudar vários corantes ou anticorpos contidos em um painel de sonda, de modo a obter uma sensibilidade melhorada para um certo antígeno coexpresso. A situação mostrada no gráfico do meio da Figura 12A é especificamente desejável, já que o limite de detecção da população positiva FL(x) não é influenciado pela FL(x) positividade, em comparação com a negativa.
[0194] A Figura 12B representa um sinal de limite de detecção de PE variável de acordo com algumas modalidades. O sinal de PE da Figura 12B pode corresponder à direção horizontal representada no gráfico da Figura 12C. Ou seja, o transbordamento que se manifesta na Figura 12B pode também ser manifestado na Figura 12C, resultando em um limite de detecção de PE variável que depende da intensidade de fluorescência do corante de alastramento cuja intensidade é dimensionada ao longo do eixo y. Em comparação, na Figura 12D o antígeno de alastramento foi movido para uma posição em que ele não exerce qualquer transbordamento para o canal de PE (por exemplo, CD45 movido de ECD excitou o laser azul para APC excitado pelo laser vermelho com um sinal muito forte), de modo que o sinal de CD45-APC não impacta o fundo no canal de PE. Além disso, os fluoróforos PE e APC são excitados com diferentes comprimentos de onda do laser. Tais situações de não transbordamento podem ser raras, especificamente em configurações de painel multicolor (por exemplo, 10), porque haverá tipicamente marcadores fluorescentes nas células que influenciam os limites de detecção em vários canais.
[0195] Na Figura 12E, há uma alta sensibilidade para a expressão do antígeno Y em células que são positivas para o antígeno X. Isto pode ser uma situação desejável em que a expressão do Y é priorizada. Ao comparar as populações positivas e negativas, o limite de detecção não é alterado. Há um limite de detecção baixo para FLy, sobre a população de FLx. De acordo com algumas modalidades, a Figura 12E pode se referir a uma situação especial envolvendo alta expressão de células de um antígeno coexpresso não exclusivo que estão em risco de ser especificamente detectadas. Em alguns casos, pode ser útil se referir a uma duplicata sem comentário da Figura 12C.
[0196] Em comparação, na Figura 12F, pode ser visto que a detecção do marcador do antígeno X na célula envolve uma emissão de fluorocromo que influencia o limite de detecção em FLy. Uma sobreposição das populações também é mostrada. Em contraste, não há uma tal sobreposição na Figura 12E (ou uma duplicata não comentada da Figura 12C). Assim, um usuário que obtém os resultados como os representados na Figura 12E pode decidir prosseguir com o painel de sonda específico. Em contraste, se essa coexpressão é priorizada, um usuário que obtém resultados, como aqueles representados na Figura 12F pode decidir não prosseguir com o painel de sonda específico.
[0197] A Figura 12G (ou uma duplicata não comentada da Figura 12C) representa uma plotagem de pontos bivariados mostrando um evento positivo duplo. A Figura 12H representa uma plotagem de pontos bivariados, em que não há um evento positivo duplo A plotagem da Figura 12H é representativa de um resultado de uma exclusão.
[0198] A Figura 12I representa outra situação de exclusão, em que não existem eventos positivos duplo, que podem apresentar um resultado aceitável para o usuário. Considerando-se o negativo para o Antígeno 1, que exclui o Antígeno 2, pode-se ver que esses dois antígenos não ocorrem no mesmo tipo de célula. Assim, um usuário que está interessado na avaliação para Antígeno 2 em uma célula caracterizada pelo fato de que o quadrante inferior esquerdo pode observar um limite de detecção sem inclinação. O usuário não buscaria uma célula que expressa o Antígeno 2, porque devido à característica biológica da célula, uma população positiva dupla não ocorre. Assim, um duplo positivo pode não ser uma população alvo na análise. A discriminação entre o Antígeno 2 positivo (AG2-POS) e o Antígeno 2 negativo (AG2-NEG) pode, entretanto, ser um alvo da análise. Da mesma forma, a discriminação entre o Antígeno 1 positivo (AG1-POS) e o Antígeno 1 negativo (AG1-NEG) podem também ser um alvo da análise. Em cada uma dessas situações, os limites de detecção são inalterados.
[0199] Porque não há nenhuma expressão do antígeno Y em células positivas X, nem qualquer expressão do antígeno X em células positivas Y, o quadrante superior direito não está preenchido.
[0200] A Figura 13 representa aspectos dos sistemas e métodos de avaliação do painel de sonda de acordo com algumas modalidades. Em alguns casos, os padrões de expressão podem ser classificados com base em vários critérios. Por exemplo, em algumas modalidades, os padrões de expressão podem ser categorizados como normais, linfoproliferativos, ou distúrbios das células sanguíneas imaturas. Conforme mostrado aqui, diversos fatores podem ser levados em consideração para os padrões de expressão, como a intensidade fluorescente e similares. Em alguns casos, as células da tabela superior da Figura 13 que identificam características de expressão podem ser anotadas com um "1" para representar a coexpressão do marcador, e com um "0" para representar a ausência do marcador de coexpressão. Em alguns casos, as células da tabela inferior da Figura 13 que também identificam características de expressão podem ser anotadas com um "0" para representar a coexpressão do marcador de descendente para pai, e com um "1" para representar a ausência de coexpressão de marcador de descendente para pai. Consequentemente, esses dados podem ser usados para indicar se um marcador de fluorocromo pode ou não resultar em um aumento do limite de detecção para um marcador de fluoróforo secundário. Por exemplo, quando não existe coexpressão, então pode ser possível a não levar em consideração o marcador fluorescente na célula. Ou seja, não haverá produção de um sinal de transbordamento, devido à ausência na mesma célula e, assim, não haverá aumento do limite de detecção. Conforme discutido aqui em outra seção, as modalidades da presente revelação abrangem aspectos de outros padrões de expressão, como padrões de pai-descendentes. A informação do padrão de expressão pode ser usada para determinar se um erro de medição de um certo canal para uma certa população com um certo padrão de expressão irá efetivamente ser aumentado ou não. De um modo semelhante, a informação de padrão de expressão pode ser usada para estimar ou determinar a distorção, e/ou para sobreposicionamento. Em alguns casos, as tabelas exemplificadoras são responsáveis por transbordamento que ocorre de modo a fornecer um resultado de distorção combinado.
[0201] A Figura 14 representa aspectos de técnicas de avaliação do painel de sonda, técnicas de simulação especificamente numéricas, de acordo com algumas modalidades. As tabelas fornecidas como Figura 14 exibem, em parte, as contribuições relativas dos vários fluorocromos, excitados por um ou mais lasers de excitação e detectados nos canais-FL (isto é, canais de PMT). As contribuições relativas fornecem uma base para a correção, a remoção de parâmetros ou eventos indesejavelmente medidos por um dado PMT em relação a fluorocromos a serem medidos por um outro detector e canal de PMT. Uma matriz de distorção eficaz pode ser calculada para determinar tais contribuições relativas para qualquer combinação dada de lasers de excitação, fluorocromos e detectores de PMT.
[0202] A Figura 15 representa aspectos de técnicas de avaliação do painel de sonda, especificamente técnicas de padrão de transbordamento, de acordo com algumas modalidades. As tabelas fornecidas como Figura 15 exibem, em parte, o brilho relativo dos dados de fluorocromo em relação a um único fluorocromo do conjunto, escolhido como referência para 100% de brilho ou intensidade naquele painel de corantes. O padrão de transbordamento e brilho relativo podem ser classificados como a criação de um nível específico de distorção, indicando a relevância de um membro do fluorocromo especial em afetar a detecção de outros fluorocromos pelos detectores de PMT relacionados. Esses valores podem ser usados para calcular um aumento dos limites de detecção, por décadas de distorção da intensidade do sinal, para cada dada combinação de canal ou corante.
[0203] A Figura 16A ilustra um esquema exemplificador para um sistema de painel de sonda de acordo com algumas modalidades. Conforme representado aqui, o sistema inclui um módulo de gráficos de simulador, um módulo numérico de simulador, um módulo padrão de transbordamento, e um módulo de base de dados de anticorpos. O módulo de gráficos de simulador pode ser usado para a entrada de usuário de aspectos de um painel de anticorpos desejado, para a saída gráfica de resultados de simulação, e para a modificação de parâmetros de simulação padrões. O módulo numérico de simulador pode ser usado para a produção numérica de resultados de simulação. O módulo de padrões de transbordamento pode ser usado para parâmetros de simulação padrões para propriedades de fluorocromos e fatores de distorção de acordo com conjuntos de filtros ópticos convencionais. O módulo de base de dados do anticorpo pode ser usado para parâmetros de simulação padrões para as densidades de expressão do antígeno, padrões de coexpressão, e esquemas de pai-descendente.
[0204] Em alguns casos, por exemplo, conforme mostrado na Figura 13, o módulo de gráficos de simulador pode ser configurado para implementar a entrada do usuário relacionado com um painel de anticorpos, a exibição dos dados padrões na coexpressão de antígenos (por exemplo, "pode ser coexpresso com / a coexpressão pode ser de interesse"), a exibição dos dados padrões na coexpressão da subpopulação (por exemplo, "células (que expressam brilho) não são uma subpopulação (exclusiva) de"), a exibição de dados estimados em décadas de conjugados da intensidade de sinal média acima do limiar positivo-negativo, e a saída gráfica de resultados de simulação.
[0205] As Figuras 16B e 16C representam aspectos de um módulo de entrada de usuário para um painel de sonda, de acordo com algumas modalidades. Após a entrada do usuário da especificidade do antígeno, os respectivos números de peça (PN) podem ser recuperados a partir do módulo de Base de Dados do Anticorpo e exibidos nos campos abaixo dos campos de entrada do usuário. Para os canais desocupados, o usuário pode introduzir uma designação fictícia. Quando os anticorpos conjugados não estão disponíveis no repertório da Base de Dados do Anticorpo, e quando a especificidade do antígeno está disponível embora conjugada com marcadores corantes diferentes dos marcadores desejados, é possível designar como Serviço de Designação do Cliente (CDS).
[0206] A Figura 16D representa aspectos de um módulo gráfico de simulador de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, o sistema pode fornecer uma exibição de dados padrões na coexpressão de antígenos (por exemplo, "pode ser coexpresso com / a coexpressão pode ser de interesse"). Em alguns casos, a faixa da fonte (por exemplo, normal, linfoproliferativa, ou doença leucêmica, correspondente ao padrão de expressão, pode ser mudada ou selecionada introduzindo 0, 1 ou 2). As especificidades, como fornecidas por um usuário podem ser exibidas, por exemplo, como cabeçalhos de colunas e linhas. Em algumas modalidades, o sistema pode ser configurado para receber a entrada do usuário de modo a substituir os dados padrões. Em algumas modalidades, as entradas da tabela podem ser substituídas por um usuário, se necessário ou desejado. Em alguns casos, os dados de coexpressão (por exemplo, entradas padrões) podem ser recuperados a partir do módulo de Base de Dados de Anticorpos Como aqui indicado, um valor de "1" pode representar um caso Verdadeiro, de modo que a coexpressão ocorre e é de interesse. De um modo semelhante, um valor de "0" pode representar um caso Falso, de modo que os antígenos não são coexpressos, ou a sua coexpressão não é de interesse. Tais dados de coexpressão podem ser armazenados no módulo de Base de Dados de Anticorpos e recuperados do mesmo. Há simetria ao longo do eixo diagonal dos campos em branco.
[0207] A Figura 16E representa aspectos de um módulo gráfico de simulador de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, o sistema pode fornecer uma exibição de dados padrões na coexpressão de antígenos (por exemplo, "pode ser coexpresso com / a coexpressão pode ser de interesse"). Novamente, uma faixa de origem pode ser mudada por inserção do valor 0, 1 ou 2. Como ainda mostrado aqui, especificidades de antígenos de acordo com a entrada do usuário podem ser exibidas como cabeçalhos de colunas e linhas da tabela. Em alguns casos, as entradas podem ser sobrescritas por um usuário, se necessário ou desejado. Em alguns casos, os dados de pai- descendente (por exemplo, padrões) podem ser recuperados a partir de um módulo de Base de Dados de Anticorpos. Um valor de "1" pode representar um caso verdadeiro, em que as células positivas (antígeno da coluna) não são uma população descendente e, portanto, causam a distorção no canal do antígeno da fila. Um valor de "0" pode representar um caso falso, em que as células positivas ao (antígeno da coluna) são uma população descendente e, portanto, não causam a distorção no canal do antígeno da fila. Por exemplo, de acordo com a tabela mostrada aqui, lambda não é um descendente de kappa, enquanto FMC7 é um descendente de CD19. De acordo com algumas modalidades, FMC7 também pode ser negativo para kappa.
[0208] A Figura 16F representa aspectos de um módulo gráfico de simulador de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, diferentes linhas ou curvas podem corresponder a diferentes comprimentos de onda de excitação. Aqui, os comprimentos de onda são 488 nm, 638 nm e 405 nm. Os círculos, conectados por linhas sólidas, correspondem ao fundo para a maioria dos padrões de expressão complexos. Os quadrados, conectados por linhas tracejadas, correspondem à menor intensidade de fluorescência esperada para um conjugado. Os triângulos, conectados por linhas pontilhadas, correspondem à intensidade de fluorescência mais brilhante esperada para um conjugado. Cada indicador individual (isto é, círculo, quadrado, ou triângulo) está posicionado acima de um valor do eixo X que corresponde a um comprimento de onda central para uma faixa de canal de detecção ou filtro passa-banda específico. O eixo Y representa superiores quatro décadas de log superiores de intensidade de fluorescência, com uma população negativa centrada na menor década. Conforme discutido aqui em outra seção, para um antígeno tendo características de expressão distintas, as linhas tracejadas e pontilhadas vão coincidir para uma localização do eixo X respectiva (comprimento de onda de passa-banda). Além disso, como discutido em outras seções desse documento, é possível classificar diferentes projetos de painel de sonda com base nas distâncias entre vários indicadores. Por exemplo, os projetos do painel de sonda podem ser classificados com base em uma distância máxima entre um triângulo (linha tracejada) e um círculo (linha sólida) e podem, também, ser baseados em uma distância mínima entre um quadrado (linha tracejada) e um círculo (linha sólida).
[0209] Em alguns casos, a classificação pode envolver a prioridade de painéis de sonda que correspondem aos padrões de transbordamento complexos e que estão associados com antígenos expressos fracamente.
[0210] A Figura 16G representa aspectos de um módulo gráfico de simulador de acordo com algumas modalidades. Aqui, uma exibição de todas as contribuições de distorção para um canal de detecção específico é posicionada acima de cada canal individual. Os círculos ou bolhas podem ser codificados (por exemplo, codificados com cor) de acordo com o respectivo fluorocromo de alastramento. O valor ou interceptação no eixo dos Y indica um aumento absoluto do limite de detecção em décadas causado por um conjugado em um respectivo canal. Por exemplo, o eixo Y pode representar um aumento do fundo, nas décadas, em que 0,00 é um limiar entre as primeira e segunda décadas (por exemplo, população negativa centrada na primeira década). O diâmetro do círculo pode representar a contribuição relativa de um conjugado para a distorção global do fundo de um canal respectivo. Conforme discutido aqui em outra seção, para reduzir a distorção do fundo para um dado canal, pode ser útil abordar, por exemplo, o maior círculo posicionado acima do canal específico. Em alguns casos, pode ser útil minimizar ou reduzir o número de círculos para canais usados para a detecção de antígenos modulados.
[0211] A Figura 16H representa aspectos de um módulo numérico de simulador de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, a tabela inclui valores para todas as distorções absolutas resolvidas por alastramento do conjugado (títulos das colunas) e canal distorcido, e também ilustra um aumento nos fundos em décadas por década de intensidade de sinal do transbordamento do fluorocromo em seu canal primário. Ainda incluídas estão colunas para o tamanho das contribuições máximas à distorção de fundo total e distorções de fundo totais. A coluna sobreposta indica uma posição da região ou quadrante uma escala gráfica de 1024 unidades de um limiar positivo-negativo de acordo com um parâmetro de posição. Também são mostrados dados de origem para a representação gráfica de distorção de fundo.
[0212] De acordo com algumas modalidades, é possível determinar uma distorção absoluta causada por um único conjugado de transbordamento com base na seguinte fórmula: (Intensidade do conjugado)*(fator de distorção)*(índice de coexpressão)*(índice de pai-descendente)
[0213] De acordo com algumas modalidades, a intensidade do conjugado pode ser representada em décadas, e pode ser determinada como uma estimativa com base na densidade do antígeno e brilho do fluorocromo ou por uso de dados empíricos sobre a intensidade do conjugado.
[0214] De acordo com algumas modalidades, é possível determinar uma distorção total em um dado canal com base na seguinte fórmula: LOG10(soma de distorções absolutas linearizadas causadas por cada conjugado)
[0215] De acordo com algumas modalidades, uma posição do quadrante/região do limiar positivo-negativo pode ser determinada com base na seguinte fórmula: (décadas de distorção total)*(256)+256 onde 256 representa o limiar gráfico entre as primeira e segunda década assumindo que a população negativa é delineada por esse limiar gráfico.
[0216] A Figura 16I representa aspectos de um módulo numérico de simulador de acordo com algumas modalidades. A tabela mostrada aqui inclui contribuições de distorções relativas lineares resolvidas por interferência do conjugado (títulos da coluna) e o canal distorcido em décadas. Essa tabela pode fornecer dados de origem para a representação gráfica da distorção de fundo (por exemplo, gráficos, "contribuições de distorção"). Os valores das tabelas podem ser com base na seguinte fórmula:
[0217] A Figura 16J representa aspectos de um módulo de padrão de transbordamento, de acordo com algumas modalidades. A tabela mostrada aqui inclui fatores de distorção, que podem ser aplicados por década de intensidade de fluorescência de interferência (isto é, alastramento) e podem ser determinados experimentalmente ou com base na seguinte equação aproximada: fator de distorção = [índice de interferência]*[fator de temperatura de passa-banda]
[0218] A Figura 16K representa aspectos de um módulo de padrão de transbordamento, de acordo com algumas modalidades. Uma definição do índice de interferência pode ser vista aqui como: Índice de interferência = LOG(SNR(sinal secundário) / LOG(SNR(sinal primário); onde: SNR = razão de sinal-ruído = MFI (população positiva) / MFI (população negativa); e com MFI = intensidade média de fluorescência.
[0219] A Figura 16L representa aspectos de um módulo de padrão de transbordamento, de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, para 525 nm (FITC) a distorção absoluta pode ser calculada de acordo com a seguinte fórmula em que a razão de DF (fator de distorção) para CI (índice de interferência) é de 0,15: distorção absoluta = 0,15 x LOG(SNR(secundário)
[0220] Ou seja, há 0,15 décadas de distorção por década de intensidade de sinal secundário. Como também é mostrado aqui, para 660 nm (APC) a distorção absoluta pode ser calculada de acordo com a seguinte fórmula em que a razão de DF para Cl é de 0,42: distorção absoluta = 0,42 x LOG(SNR(secundário)
[0221] Ou seja, há 0,42 décadas de distorção por década de intensidade de sinal secundário no canal de APC(660/20 passa-banda).
[0222] As Figuras 16M e 16N representam aspectos de um módulo de base de dados de anticorpo, de acordo com algumas modalidades. A tabela na Figura 16M inclui dados para as densidades de expressão de antígeno (por exemplo, dimensionado de acordo com CD8-PE = 2,5 décadas de intensidade acima do limiar de pos-neg), números de peças e características de expressão (por exemplo, 0 = modulada, 1 = distinta). A tabela na Figura 16N inclui dados para padrões de coexpressão (por exemplo, "pode ser coexpresso com / a coexpressão pode ser de interesse"). Conforme mostrado aqui, existe uma simetria na tabela ao longo das células da tabela diagonal.
[0223] A Figura 16O representa aspectos de um módulo de base de dados de anticorpo, de acordo com algumas modalidades. Em algumas modalidades, os módulos de base de dados de anticorpos podem incluir informações sobre padrões de pai-descendente (por exemplo, "células (que expressam brilho) não são uma população descendente de"), e podem ser assimétricos. De acordo com algumas modalidades, tal informação de base de dados pode incluir valores estimados. De acordo com algumas modalidades, tal informação de base de dados pode incluir valores empíricos.
[0224] A Figura 17 representa aspectos de uma abordagem numérica para modelar padrões de transbordamento, de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, a avaliação de padrões de transbordamento pode envolver uma abordagem de radar de detecção para processar um conjunto de dados multivariados. Conforme mostrado na Figura 17, a representação de radar multivariada pode exibir limites de detecção para antígenos de acordo com os seus canais de detecção à medida que os mesmos estão dispostos na configuração de painel 1702. Conforme mostrado em uma primeira camada de imagem 1704, cada eixo radial do radar de detecção representa um canal de fluorescência a partir da terceira à sexta década de sinal medido, cada década sendo um segmento de 20 bits. A primeira porção sombreada interior 1706 representa limites de detecção não tocados, dentro e abaixo daquela década, assumindo que o controle de isotipo está centrado na terceira década. Conforme mostrado em uma segunda camada de imagem 1708, uma segunda porção sombreada interior 1710 fica sob à primeira porção sombreada interior 1706, em que a segunda camada de imagem 1708 representa a distorção de fundo estimada para cada canal de fluorescência. Os valores para a distorção estimados que geram a segunda porção sombreada interior 1710 são baseados nos dados conjugados de acordo com a sua combinação: padrão de transbordamento, intensidades relativas de fluorocromo, densidades de antígeno, matriz de coexpressão, e matriz de distorção.
[0225] Uma terceira camada da imagem 1712 inclui ainda um limite inferior 1714 que representa o limite inferior da intensidade de fluorescência esperado para cada conjugado. Todas as expressões moduladas ou indiscretas estão definidas para zero como parte do limite inferior 1714 de intensidade de fluorescência esperado. Uma quarta camada de imagem 1716 inclui ainda um limite superior 1718 representando o limite superior de fluorescência esperado para cada conjugado. Expressões distintas de um antígeno e corante específico têm iguais valores de limite inferior 1714 e de limite superior 1718 para a intensidade de fluorescência esperada.
[0226] As Figuras 18A e 18B representam aspectos de uma abordagem numérica para modelar padrões de transbordamento, de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, a avaliação de padrões de transbordamento pode envolver uma abordagem de radar de detecção e/ou uma abordagem de indicador de distorção. Em tais representações de indicador de distorção, cada DL pode ter uma cor que representa um corante de distorção. O eixo Y pode representar a quantidade de distorção, em décadas, enquanto o eixo X pode representar cada canal de FL distorcido. O diâmetro de um ponto de dados (isto é, o tamanho de um DL) pode representar a contribuição relativa de um único conjugado à distorção global.
[0227] As Figuras 19A e 19B representam aspectos de uma abordagem numérica para modelar padrões de transbordamento, de acordo com algumas modalidades. Conforme mostrado aqui, a avaliação de padrões de transbordamento pode envolver uma abordagem de tela de clonalidade, que pode ainda ser representada com uma abordagem de radar multivariada.
[0228] Após a simulação de um projeto de painel de sonda como estabelecido aqui, um dispositivo de citometria de fluxo pode ser configurado e operado com o uso do referido projeto de painel de sonda. Em particular, um processador ou sistema, que pode ser um meio legível por computador não temporário, pode receber informação sobre uma configuração de hardware de citômetro de fluxo de, a informação sobre uma lista que compreende uma pluralidade de sondas, as sondas individuais da lista sendo associadas com os respectivos limites de detecção específicos do canal individual e informações sobre um padrão de coexpressão antigênica. O processador, ou um ou mais, processadores ligados de modo informativo, pode avaliar as combinações de sondas individuais como o painel de sonda, com base na configuração de hardware de citômetro de fluxo, nos limites de detecção específica de canais individuais, e no padrão de coexpressão antigênica, as combinações sendo subconjuntos de sondas da lista, e podem determinar, adicionalmente, o painel de sonda para uso com a configuração de hardware de citômetro de fluxo, os limites de detecção específicos de canais individuais, e padrão de coexpressão antigênica. Finalmente, um painel de sonda para uso em um procedimento de citometria de fluxo pode ser emitido, e usado por um operador para o projeto do painel de sonda para um instrumento e experimento de citometria de fluxo.
[0229] A determinação de um painel de sonda pode ser apresentada em uma interface com base na Web, que permite a um usuário projetar um painel de sonda para um experimento de citometria de fluxo com o uso de ferramentas e bases de dados on line. As modalidades específicas de sistemas e métodos (conforme descrito acima nas Figuras 2-2D) podem ser fornecidas a um operador conforme mostrado nas Figuras 20A-20F. Os aspectos do sistema ou método podem ser fornecidos para um operador como uma forma única, uma forma transitória, ou como múltiplas formas que representam as etapas do método.
[0230] A Figura 20A é uma imagem exemplificadora de uma tela de interface que permite a seleção de uma configuração de hardware 2000 (também chamada de uma tela de configuração de hardware 2000). Uma seleção de abas 2002 permite o movimento entre vários campos em que os dados podem ser inseridos, que, conforme mostrado são abas para as etapas de um método de simular um painel. O campo de título da aba 2004 pode indicar qual etapa de um método um usuário está visualizando ou editando, que na Figura 20A é "Configuração de Hardware", indicado como o "Etapa 1" na seleção de abas 2002. O campo suspenso 2006 permite a um operador selecionar uma configuração de hardware que fornece informações a partir de uma base de dados para estabelecer os parâmetros para a realização de uma simulação de painel. A exibição gráfica da configuração de hardware 2008 pode mostrar a um operador detalhes de uma configuração de hardware, incluindo, mas não se limitando a, um ou mais lasers de excitação, os comprimentos de onda de excitação de um ou mais lasers de excitação, tensão ou outros valores de energia para o um ou mais lasers de excitação, um ou mais detectores de PMT, tensões ou outros valores de energia para um ou mais detectores de PMT, ou filtros passa- banda para cada um dos um ou mais detectores de PMT. Em alguns aspectos, a seleção de uma configuração de hardware pode ser determinada automaticamente pela base de dados e sistema. A configuração de hardware selecionada pode definir parâmetros e valores para um projeto e simulação de painel aqui descrito. Um campo "Next>"selecionável 2010 é fornecido para avançar uma etapa posterior no método, Um campo "Back>" geralmente selecionável 2012 é fornecido para avançar para uma etapa anterior no método, entretanto, na tela de Configuração de Hardware mostrada 2000, não há nenhuma etapa anterior, e, dessa forma, o campo “<Back" 2012 não é selecionável na tela de Configuração de Hardware mostrada 2000.
[0231] A Figura 20B é uma imagem exemplificadora de uma interface que permite a seleção de anticorpos 2014 (também chamado de uma tela de Seleção de Anticorpos de 2014). O campo de título da aba 2004 na Figura 20B é intitulado "Seleção de Anticorpo", e está indicado como "Etapa 2" no interior da seleção de abas 2002. Uma pluralidade de campos suspensos de especificidade 2016 permite a um operador selecionar uma especificidade, e uma pluralidade de campos suspensos de corante 2018 permite a um operador selecionar um corante. Em algumas modalidades, a especificidade a ser selecionada nos campos suspensos de especificidade 2016 pode ser uma seleção de antígenos ou anticorpos. Para cada especificidade selecionada nos campos suspensos de especificidade 2016, um corante correspondente pode ser selecionado dentre a pluralidade de campos suspensos de corante 2018. Em alguns aspectos, a seleção de campos suspensos de especificidade 2016 e campos suspensos de corante 2018 pode ser determinada automaticamente pela base de dados do sistema. Os anticorpos selecionados podem definir parâmetros e valores para um projeto e simulação de painel aqui descrito. Um campo "Next>" selecionável 2010 é fornecido para avançar para uma etapa posterior no método. Um campo "Back>" selecionável 2012 é fornecido para avançar para uma etapa anterior no método.
[0232] A Figura 20C é uma imagem exemplificadora de uma interface que permite a seleção de fenótipo alvo 2020 (também chamada de uma tela de Fenótipos Alvos 2020). O campo de título da aba 2004 na Figura 20C é intitulado "Fenótipos Alvos", e é indicado como "Etapa 3" dentro da seleção de abas 2002. Um campo suspenso de população alvo 2022 permite a um operador selecionar uma população alvo em relação aos antígenos específicos que expressam ou devem expressar um fenótipo alvo. Uma pluralidade de "Antígenos Não Relacionados" 2024 é fornecida, listando uma seleção de anticorpos e conjugados de corante que não são, ou não podem ser, em relação a uma população alvo selecionada. Cada par de anticorpo e corante na pluralidade de Antígenos Não Relacionados 2024 inclui uma caixa de verificação selecionável para indicar que o par de anticorpo e corante é um antígeno de interesse. Uma pluralidade de "Antígenos de Interesse" 2026 é fornecida, listando uma seleção de conjugados de anticorpos e corantes que são, ou se acredita ser, relacionados para uma população alvo selecionada. Os membros da pluralidade de Antígenos de Interesse 2026 podem ser preenchidos por pares de anticorpos e corantes originalmente fornecidos na pluralidade de Antígenos Não Relacionados 2024, ou podem ser autopreenchidos de acordo com relações de dados armazenados na base de dados e sistema. A indicação de que um par de anticorpo e corante específico é um membro da pluralidade de Antígenos de Interesse 2026 pode ser removida por exclusão de uma caixa de verificação selecionável para o par de anticorpo e corante. Em alguns aspectos, a seleção de uma pluralidade de Antígenos Não Relacionados 2024 e da pluralidade de Antígenos de Interesse 2026 pode ser determinada automaticamente pela base de dados e sistema. Em alguns aspectos, um campo de seleção global de Antígeno de Interesse 2028 pode ser fornecido, tendo um campo ativável para selecionar todos os pares de anticorpos e corantes como membros da pluralidade de Antígenos de Interesse e um campo ativável 2026 para todos os pares de anticorpos e corantes indicados como membros da pluralidade de Antígenos Não Relacionados 2024. Os fenótipos alvos, antígenos não relacionados, e antígenos de interesse selecionados podem definir parâmetros e valores para um projeto e simulação do painel aqui descrito. Embora não expressamente mostrado na Figura 20C, um campo "Next>" selecionável é fornecido para avançar para uma etapa posterior no método e um campo "<Back" selecionável é fornecido para avançar para uma etapa anterior no processo.
[0233] A Figura 20D é uma imagem exemplificadora de uma interface que permite a identificação de antígenos de exclusão mutuamente 2030 (também chamada de tela de Antígeno de Exclusão Mutuamente 2030). O campo de título da aba 2004 na Figura 20D é intitulado "Antígeno de Exclusão Mutuamente", e é indicado como "Etapa 4" dentro da seleção de abas 2002. Uma seleção de campos de emparelhamento de antígeno-anticorpo expansíveis 2032 é fornecida, em que, quando expandido, o campo de emparelhamento de antígeno- anticorpo fornece uma listagem de antígenos para excluir 2034; essa pode ser uma lista de antígenos potenciais que podem ser de exclusão mutuamente com o emparelhamento de antígeno-anticorpo para um campo individual. A listagem de antígenos a excluir 2034 pode ter uma caixa de verificação por cada antígeno listado para selecionar um antígeno específico para indicar como excluído, o que é uma indicação de que o antígeno, ou antígenos, selecionado não é coexpresso com o antígeno identificado como a parte do emparelhamento de antígeno- anticorpo para esse campo. A listagem de antígenos para excluir 2034 pode ainda incluir um ou mais links de seleção que podem fazer com que todos os antígenos na listagem 2034 sejam selecionados, ou exclui todos os antígenos na listagem 2034. Antígenos que são indicados como excluídos podem ser listados em uma lista de antígenos excluídos identificados 2036. A listagem de antígenos excluídos identificados 2036 pode ter uma caixa de verificação selecionada por cada antígeno listado, que pode ser excluída para indicar que o antígeno específico não é mutuamente excluído para um dado campo de emparelhamento de antígeno-anticorpo. Em aspectos, a listagem de antígenos para excluir 2034 pode ser selecionada por um operador que seleciona um ou mais antígenos listados com base em uma lógica gerada por operador. Em outros aspectos, a listagem de antígenos excluídos identificados 2036 pode ser especificada pela base de dados e sistema; um campo de "Autoespecifique Exclusões" selecionável 2038 é fornecido para permitir que um operador indique antígenos excluídos mutuamente de acordo com os dados armazenados na base de dados e sistema. Por outro lado, um campo de "Descartar Todas as Exclusões" selecionável 2040 é fornecido para permitir que um operador exclua todas as exclusões mútuas previamente indicadas para um ou mais campos de emparelhamento de antígeno-anticorpo. Os antígenos de exclusão selecionados podem definir parâmetros e valores para um projeto e simulação de painel aqui descrito. Embora não expressamente mostrado na Figura 20D, um campo "Next>" selecionável é fornecido para avançar para uma etapa posterior no método e um campo "<Back" selecionável é fornecido para avançar para uma etapa anterior no processo.
[0234] A Figura 20E é uma imagem exemplificadora de uma interface que permite a identificação de antígenos de pai e descendente 2042 (também chamada de tela de Antígenos de Pai & Descendente 2042). O campo de título da aba 2004 na Figura 20E é intitulado "Pais & descendentes", e está indicado como "Etapa 5" na seleção de abas 2002. Uma seleção de campos de emparelhamento de antígeno- anticorpo expansíveis 2044 é fornecida, em que, quando expandido, o campo de emparelhamento de antígeno-anticorpo fornece uma listagem de antígenos descendentes 2046; essa pode ser uma lista de antígenos descendentes, sendo descendentes um antígeno pai indicado como o antígeno do emparelhamento de antígeno-anticorpo para um campo individual. A listagem de antígenos descendentes 2046 pode ter uma caixa de verificação por cada antígeno listado para selecionar um antígeno específico para indicar como um descendente, que é uma indicação de que o antígeno, ou antígenos, selecionado é um agrupamento de diferenciação mais posterior em uma etapa ou progressão desenvolvimental do que o agrupamento de diferenciação indicado como o antígeno selecionado do emparelhamento de antígeno- anticorpo para aquele campo. A listagem de antígenos descendentes 2046 pode ainda incluir um ou mais links de seleção que podem fazer com todos os antígenos na listagem 2046 sejam selecionados, ou exclui todos os antígenos na listagem 2046. Antígenos que são indicados como descendentes podem ser listados em uma lista de antígenos descendentes identificados 2048. A listagem de antígenos descendentes identificados 2048 pode ter uma caixa de verificação selecionada por cada antígeno listado, que pode ser excluída para indicar que o antígeno específico não é um descendente para um dado campo de emparelhamento de antígeno-anticorpo. Em aspectos, a listagem de antígenos descendentes 2046 pode ser selecionada por um operador que seleciona um ou mais antígenos listados com base em uma lógica gerada por operador. Em outros aspectos, a listagem de antígenos descendentes 2046 pode ser especificada pela base de dados e sistema; um campo de "Autoespecifique Padrões Familiares" selecionável 2050 é fornecido para permitir que um operador indique as relações do antígeno pai e descendente de acordo com os dados armazenados na base de dados e sistema. Por outro lado, um campo de "Descartar Todos os Padrões Familiares" selecionável 2052 é fornecido para permitir que um operador exclua todas as relações de antígeno pai e descendente anteriormente indicadas para um ou mais campos de emparelhamento de antígeno-anticorpo. As relações de antígeno pai e descendente selecionadas podem definir parâmetros e valores para um projeto e simulação de painel aqui descrito. Embora não expressamente mostrado na Figura 20E, um campo "Next>" selecionável é fornecido para avançar para uma etapa posterior no método e um campo "<Back" selecionável é fornecido para avançar para uma etapa anterior no processo.
[0235] A Figura 20F é uma imagem exemplificadora de uma interface que permite a identificação de densidades de antígenos 2052 (também chamada de tela de Densidade de Antígeno 2052). O campo de título da aba 2004 na Figura 20F é intitulado "Densidades Antígeno", e é indicado como "Etapa 6" dentro da seleção de abas 2002. Um campo suspenso de população alvo 2056 permite a um operador selecionar uma população alvo em relação aos antígenos específicos, e particularmente a densidade do antígeno específico para uma população alvo ou tipo de célula específica. A densidade de antígenos em uma região de uma célula, ou para um tipo de célula ou população alvo, corresponde à força de expressão daquele antígeno, e como ele pode interagir ou ser medido com populações de outros antígenos. Uma exibição de sinal-para-ruído 2058 pode indicar ao longo das décadas de expressão a razão de sinal esperado a partir de uma população alvo e antígeno correspondente sobre o ruído de fundo. Um campo de seleção modulada/distinta 2060 pode ser fornecido, que em aspectos pode ser um campo de seleção de botão de rádio, para configurar a exibição de sinal-para-ruído 2058 para exibir a expressão da população alvo, quando avaliada de acordo com os parâmetros discretos ou modulados, conforme descrito acima. Da mesma forma, o campo de seleção de discriminação 2062 pode ser fornecido, que em aspectos pode ser um campo de seleção de botão de rádio, para configurar a exibição de sinal- para-ruído 2058 para discriminar os resultados da população alvo, como qualquer entre a expressão positiva e negativa ou como entre a expressão positiva brilhante e positiva fraca, conforme descrito acima. Uma configuração deslizante pode ser definida para a exibição do sinal- para-ruído 2058, para ajustar a escala e o escopo da região da exibição de sinal-para-ruído 2058 exibida. Em alguns aspectos, a configuração deslizante pode ser escolhida com um campo de "Autoconfiguração do Deslizante" selecionável 2064, com o uso de dados de exibição da população alvo e antígeno para configurar automaticamente a faixa de exibição de sinal-para-ruído 2058. Em outros aspectos, um operador pode dirigir a exibição de sinal-para-ruído 2058 para ter uma escala específica ajustando manualmente uma interface deslizante 2066, que pode ser uma interface deslizante de rádio. As populações alvos, seleção de exibição distinta versus modulada, seleção de discriminação, configuração de deslizante, e densidades de antígenos selecionadas podem definir parâmetros e valores para um projeto e simulação de painel aqui descrito. Embora não expressamente mostrado na Figura 20F, um campo "Next>" selecionável é fornecido para avançar para uma etapa posterior no método e um campo "<Back" selecionável é fornecido para avançar para uma etapa anterior no processo.
[0236] A Figura 20G é uma imagem exemplificadora de uma interface que exibe uma estimativa de simulação de expressão do painel para um dado projeto do painel de antígeno 2068 (também chamada de tela de Simulação do Painel 2068). As informações obtidas a partir da entrada para a tela de Configuração Hardware 2000, tela de Seleção de Anticorpos 2014, tela de Fenótipos Alvos 2020, tela de Antígeno de Exclusão Mutuamente 2030, tela de Antígenos de Pai & Descendente 2042, e tela de Densidade de Antígeno 2052 podem ser coletadas e usadas para calcular uma expressão esperada ou padrão de coloração. O campo de título da aba 2004 na Figura 20G é intitulado "Padrões de Coloração Estimados", e está indicado como "Etapa 7" na seleção de abas 2002. Um campo de exibição 2070 pode fornecer qualquer uma ou ambas das representações numéricas e gráficas da expressão de antígeno estimada para um dado projeto do painel, incluindo mas não se limitando às representações gráficas aqui discutidas. O campo "Next>" geralmente selecionável 2010 mostrou que não é selecionável na tela de Simulação de Painel 2068 porque não há nenhuma etapa posterior no método ou avaliação correspondente para avançar. O campo "<Back" selecionável 2012 é fornecido para avançar para uma etapa anterior no método.
[0237] Em algumas modalidades, uma interface com base na Web pode apresentar a informação para um operador detalhar ainda mais as relações entre vários antígenos para um fenótipo celular. A Figura 21A é uma árvore desenvolvimental exemplificadora (semelhante em forma a uma árvore geológica) que ilustra as relações entre os membros de CD (isto é, antígenos) para um fenótipo de células. Essa árvore desenvolvimental pode ilustrar as relações de pai-filho entre antígenos e, assim, ilustrar ainda as relações de irmãos, relações de primos, e relações de tios entre antígenos. Em alguns aspectos, os antígenos podem ser identificados como desenvolvendo ao longo de mais do que uma trajetória desenvolvimental, e pode ser identificado como um "antígeno gêmeo", juntamente com as ocorrências do mesmo antígeno na árvore desenvolvimental. Em modalidades adicionais, a seleção ou realce temporário (por exemplo, que paira sobre um campo definido pelo software para representar um membro de CD ou antígeno) de um campo de antígeno específico pode ser usada como um estímulo para outras relações de expressão de exibição com outros antígenos na árvore desenvolvimental. Por exemplo, a seleção ou realce temporário de um campo de antígeno pode indicar, para o antígeno indicado, que outros antígenos na árvore desenvolvimental são mutuamente excluídos da expressão com o antígeno selecionado, que outros antígenos na árvore desenvolvimental têm a expressão de correlação com o antígeno selecionado, que outros antígenos na árvore desenvolvimental têm expressão correlacionada inversamente com o antígeno selecionado, que outros antígenos na árvore desenvolvimental são gêmeos do antígeno selecionado, ou que outros antígenos na árvore desenvolvimental, de outro modo, coexpressam com o antígeno selecionado. Em outros aspectos, a relação desenvolvimental entre antígenos pode ser fornecida em uma forma de listagem ou tabular, como ilustrado na Figura 21B, como uma modalidade exemplificadora.
[0238] Como observado acima, a metodologia para prever e simular a expressão do painel também pode ser aplicada para derivar ou extrapolar as grandezas e fontes de sinal do painel medido e antígenos em uma amostra. As matrizes de distorção e coexpressão podem ser calculadas e usadas para compensar a coexpressão mútua ou transbordamento de pai-descendente, que em aspectos pode ser executada por meio de parâmetros de chaveamento adequados. Em alguns aspectos, os lasers usados para excitar corantes acoplados a anticorpos podem excitar mais do que um corante alvo pretendido, e tabelas ou matrizes de compensação podem ser usadas para acomodar e corrigir tal transbordamento. A Figura 22A representa aspectos de compensação intralaser de acordo com algumas modalidades. Da mesma forma, a Figura 22B representa aspectos de compensação intralaser de acordo com as modalidades. Ambas as Figuras 22A e 22B representam a mesma tabela de compensação 2200, que apresenta uma configuração de fluorocromos nas colunas 2202 e um conjunto de PMT nas linhas 2204. A tabela de compensação 2200 é determinada pelas identidades individuais dos fluorocromos nas colunas 2212 e do PMT nas linhas 2204, que é específica para cada configuração de hardware e projeto do painel escolhido. A Figura 22A foca sobre os valores de compensação intralaser, valores para os quais o transbordamento de um fluorocromo desencadeado por um dado comprimento de onda do laser de excitação pode afetar um PMT para um fluorocromo separado também desencadeado pelo mesmo comprimento de onda do laser de excitação. Em contraste, a Figura 22B foca sobre os valores de compensação interlaser, valores para os quais o transbordamento de um fluorocromo desencadeado por um dado comprimento de onda de excitação do laser pode afetar um PMT para um fluorocromo separado desencadeado por um comprimento de onda de excitação do laser diferente.
[0239] Conforme ilustrado na Figura 22A, os fluorocromos desencadeados pela luz de excitação tendo um comprimento de onda (À) de 405 nm estão localizados nas colunas FL9 e FL10, com os correspondentes canais de detecção nas linhas FL9 e FL10. Conforme mostrado, a detecção de FL9 e FL10 é para os fluorocromos Pacific Blue e Laranja do Pacífico, respectivamente. A plotagem de comparação a 405 nm 2206 reflete a região de sobreposição de cada fluorocromo, e é representada na tabela de compensação 2200 pela região de interseção das colunas e linhas de FL9 e FL10. A região de interseção das colunas e linhas de FL9 e FL10 é preenchida com valores ou fatores usados para corrigir a distorção, como discutido acima. Da mesma forma, os fluorocromos desencadeados pela luz de excitação tendo um comprimento de onda (À) de 638 nm estão localizados nas colunas FL6, FL7, e FL8, com correspondentes canais de detecção nas linhas FL6, FL7, e FL8. Conforme mostrado, a detecção de FL6, FL7, e FL8 é para os fluorocromos APC, APC-Cy5 ou APC-A700, e APC-Cy7 ou APC- A750, respectivamente. A plotagem de comparação a 638 nm 2208 reflete a região de sobreposição de cada fluorocromo, e é representada na tabela de compensação 2200 pela região de interseção das colunas e linhas de FL6, FL7, e FL8. A região de interseção das colunas e linhas FL6, FL7, e FL8 é preenchida com valores ou fatores usados para corrigir a distorção, como discutido acima. Além disso, os fluorocromos desencadeados pela luz de excitação tendo um comprimento de onda (À) de 488 nm, estão localizados nas colunas FL1, FL2, FL3, FL4, e FL5, com os correspondentes canais de detecção nas linhas FL1, FL2, FL3, FL4, e FL5. Conforme mostrado, a detecção de FL1, FL2, FL3, FL4, e FL5 é para os fluorocromos FITC, PE, ECD, PC5 ou PC5.5, e PC7, respectivamente. A plotagem de comparação a 488 nm 2210 reflete a região de sobreposição de cada fluorocromo, e é representada na tabela de compensação 2200 pela região de interseção das colunas e linhas de FL1, FL2, FL3, FL4, e FL5. A região de interseção das colunas e linhas FL1, FL2, FL3, FL4, e FL5 é preenchida com valores ou fatores usados para corrigir a distorção, como discutido acima.
[0240] Como seria de esperar, a interseção entre um dado fluorocromo e o canal que está configurado para detectar aquele fluorocromo não requer qualquer valor ou fator de compensação, e é indicado na tabela de compensação 2200 como a diagonal sem quaisquer valores numéricos que preenchem as células da tabela de compensação de 2200.
[0241] Conforme ilustrado na Figura 22B, os fluorocromos também podem ser desencadeados por uma luz de excitação em um comprimento de onda não configurado ou destinado a excitar o fluorocromo. A região de compensação interlaser 2212 pode incluir as duas seções da tabela de compensação 2200 fora das regiões de compensação intralaser. As duas seções da região de compensação interlaser 2212 indicam valores ou fatores de compensação para: fluorocromos FL1-FL5, afetando os canais de detecção para FL6-FL8 e FL9-FL10; fluorocromos FL6-FL8, afetando os canais de detecção para FL1-FL5 e FL9-FL10; e fluorocromos FL9-FL10, afetando os canais de detecção para FL1-FL5 e FL6-FL8. As duas seções da região de compensação interlaser 2212 são preenchidas com valores ou fatores usados para corrigir a distorção, como discutido acima.
[0242] A Figura 23 representa uma abordagem para a determinação de um cálculo distorção de acordo com algumas modalidades. Em particular, a Figura 23 exibe seis plotagens de resultados de expressão de fluorocromo medida com o uso de dez (10) corantes para um fenótipo celular [LEUKO]. A tabela 2301 fornece uma listagem de conjugados de anticorpo-corante que pode ser detectada e usada para desenvolver parâmetros de chaveamento e plotagens relacionadas, onde a Figura 23 fornece uma seleção exemplificadora de plotagens e técnicas de chaveamento com base na listagem de conjugados de anticorpo-corante na tabela 2301. A plotagem 2302 exibe o sinal de um conjugado de anticorpo-corante CD45-KRO contra a luz difusa lateral geral (SSC) medido a partir de um sistema de citometria de fluxo. Na plotagem 2302, o sinal de expressão na primeira década é identificado como [LEUKO], em relação a esse fenótipo. As cinco plotagens restantes são extrapolações em detalhe, aplicando técnicas de chaveamento, do sinal na primeira década do sinal [LEUKO]. A plotagem 2304 exibe o sinal SSC contra CD13-PC5.5 (o sinal de CD13 medido no PMT para PC5.5) e identifica a região de expressão e densidade para CD13 no mesmo. A plotagem 2306 exibe o sinal SSC contra HLADR-PC7 (o sinal de HLADR medido no PMT para PC7) e identifica a região de expressão e densidade para HLADR no mesmo. A plotagem 2308 exibe o sinal SSC contra CD117-APC (o sinal de CD117 medido no PMT para APC) e identifica a região de expressão e densidade para CD117 no mesmo. A plotagem 2310 exibe o sinal SSC contra CD34-APCA700 (o sinal de CD34 medido no PMT para APCA700) e identifica a região de expressão e densidade para CD34 no mesmo. A plotagem 2312 exibe o sinal SSC contra CD33-APCA750 (o sinal de CD33 medido no PMT para APCA750) e identifica a região de expressão e densidade para CD33 no mesmo. Como evidente a partir dos seis lotes da Figura 23, o perfil do resultado pode parecer diferente para qualquer dado conjugado de anticorpo-corante medido para, e a densidade de qualquer dado conjugado de anticorpo-corante pode ser isolada a partir do sinal para, outras combinações de conjugado de anticorpo-corante presentes na célula ou fenótipo.
[0243] A Figura 24 representa uma abordagem para a determinação de um cálculo distorção de acordo com algumas modalidades. Em particular, a Figura 24 exibe seis plotagens de resultados de expressão do fluorocromo medida com o uso de dez (10) corantes para um fenótipo celular [LEUKO], indicando quadrantes para níveis de detecção previstos para diferentes parâmetros de chaveamento. A tabela 2401 fornece uma listagem de conjugados de anticorpo-corante que pode ser detectada e usada para desenvolver parâmetros de chaveamento e plotagens relacionadas, onde a Figura 24 fornece uma seleção exemplificadora de plotagens e técnicas de chaveamento com base na listagem de conjugados de anticorpo- corante na tabela 2401. A primeira plotagem 2402 exibe o sinal SSC global contra o sinal medido a partir de um conjugado de anticorpo- corante CD34-APCA700 para um fenótipo celular [LEUKO]. O sinal que indica a população de eventos positivos de CD34 é identificado como a região 2414. As cinco plotagens restantes refletem a aplicação de técnicas de chaveamento para identificar a positividade ou negatividade do sinal em comparação com o sinal medido pelo sistema a partir de outros conjugados de fluorocromo. A plotagem 2404 exibe o sinal medido a partir de CD34-APCA700 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD13, mantendo-se negativo para os antígenos CD33 e CD117. A plotagem 2406 exibe o sinal medido a partir de CD34- APCA700 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD17, mantendo-se negativo para os antígenos CD13 e CD33. A plotagem 2408 exibe o sinal medido a partir de CD34-APCA700 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD33, mantendo-se negativo para os antígenos CD13 e CD117. A plotagem 2410 exibe o sinal medido a partir de CD34- APCA700 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD13 e CD33, mantendo-se negativo para os antígenos CD117. A plotagem 2412 exibe o sinal medido a partir de CD34-APCA700 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir dos antígenos CD13, CD33 e CD117.
[0244] A Figura 25 representa uma abordagem para a determinação de um cálculo distorção de acordo com algumas modalidades. Em particular, a Figura 25 exibe seis plotagens de resultados de expressão do fluorocromo medida com o uso de dez (10) corantes para um fenótipo celular [LEUKO], indicando quadrantes para níveis de detecção previstos para diferentes parâmetros de chaveamento. A tabela 2501 fornece uma listagem de conjugados de anticorpo-corante que pode ser detectada e usada para desenvolver parâmetros de chaveamento e plotagens relacionadas, onde a Figura 25 fornece uma seleção exemplificadora de plotagens e técnicas de chaveamento com base na listagem de conjugados de anticorpo- corante na tabela 2501. A plotagem 2502 exibe o sinal SSC global contra o sinal medido a partir de um conjugado de anticorpo-corante CD117-APC para um fenótipo celular [LEUKO]. O sinal que indica a população de eventos positivos de CD117 é identificado como a região 2514. As cinco plotagens restantes refletem a aplicação de técnicas de chaveamento para identificar a positividade ou negatividade do sinal em comparação com o sinal medido pelo sistema a partir de outros conjugados de fluorocromo. A plotagem 2504 exibe o sinal medido a partir de CD117-APC com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD13, mantendo-se negativo para os antígenos CD33 e CD34. A plotagem 2506 exibe o sinal medido a partir de CD117-APC com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD33, mantendo-se negativo para os antígenos CD13 e CD34. A plotagem 2508 exibe o sinal medido a partir de CD117- APC com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD34, mantendo-se negativo para os antígenos CD13 e CD33. A plotagem 2510 exibe o sinal medido a partir de CD117-APC com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD13 e CD33, mantendo-se negativo para os antígenos CD34. A plotagem 2512 exibe o sinal medido a partir de CD117-APC com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir dos antígenos CD13, CD33 e CD43.
[0245] A Figura 26 representa uma abordagem para a determinação de um cálculo de distorção de acordo com algumas modalidades. Em particular, a Figura 26 exibe sete plotagens de resultados de expressão do fluorocromo medida com o uso de dez (10) corantes para um fenótipo celular [LEUKO], indicando quadrantes para níveis de detecção previstos para diferentes parâmetros de chaveamento. A tabela 2601 fornece uma listagem de conjugados de anticorpo-corante que pode ser detectada e usada para desenvolver parâmetros de chaveamento e plotagens relacionadas, onde a Figura 26 fornece uma seleção exemplificadora de plotagens e técnicas de chaveamento com base na listagem de conjugados de anticorpo- corante na tabela 2601. A plotagem 2602 exibe o sinal SSC global contra o sinal medido a partir de um conjugado de anticorpo-corante CD33-APCA750 para um fenótipo celular [LEUKO]. O sinal que indica a população de eventos positivos de CD33 é identificado como a região 2616. As seis plotagens restantes refletem a aplicação de técnicas de chaveamento para identificar a positividade ou negatividade do sinal em comparação com o sinal medido pelo sistema a partir de outros conjugados de fluorocromo. A plotagem 2604 exibe o sinal medido a partir de CD33-APCA750 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD13, mantendo-se negativo para os antígenos CD34, CD117, e HLADR. A plotagem 2606 exibe o sinal medido a partir de CD33-APCA750 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD34, mantendo-se negativo para os antígenos CD13, CD117, e HLADR. A plotagem 2608 exibe o sinal medido a partir de CD33-APCA750 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD117, mantendo-se negativo para os antígenos CD13, CD34, e HLADR. A plotagem 2610 exibe o sinal medido a partir de CD33-APCA750 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos HLADR, mantendo-se negativo para os antígenos CD13, CD34, e CD117. A plotagem 2612 exibe o sinal medido a partir de CD33-APCA750 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD13, mantendo-se negativo para os antígenos CD34, e CD117. A plotagem 2614 exibe o sinal medido a partir de CD33-APCA750 com parâmetros de chaveamento aplicados para indicar, ainda, o sinal positivo medido a partir de antígenos CD34, CD117, e HLADR mantendo-se negativo para os antígenos CD13.
[0246] A Figura 27 representa aspectos de um modelo de distorção APCA700/A750 em um canal de APC, de acordo com as modalidades. O gráfico tridimensional plota o aumento da intensidade de sinal de APCA750 detectado por um canal de APC do PMT, contra o aumento da intensidade de sinal de APCA700 detectada pelo canal de APC do PMT, ambos plotados contra o nível de detecção global medido pelo canal de APC para PMT. No ponto de referência selecionado, por exemplo, acima de 1,00, como detectado pelo canal de APC, os sinais de eventos são previstos ou calculado como sendo eventos positivos. Por outro lado, abaixo do ponto de referência selecionado, os sinais de eventos são previstos ou calculados como sendo eventos negativos. Em um ponto de intensidade máxima de APCA750 e intensidade zero de APCA700, o sinal de evento como medido pelo canal de APC é sujeito a distorção de APCA750 unicamente ou "pura". Em um ponto de intensidade máxima de APCA700 e intensidade zero de APCA750, o sinal de evento como medido pelo canal de APC é sujeito a distorção de APCA700 unicamente ou "pura". Tais modelos, conforme mostrados na Figura 27 podem ser expandidos em outras dimensões para um número arbitrário de distorção de fluorocromos. Tais modelos, conforme mostrados na Figura 27 podem ser usados nos cálculos para remover o efeito do sinal do evento de distorção dos fluorocromos sobre as medições registradas por um canal e PMT para um fluoróforo desejado.
[0247] A Figura 28 representa uma tabela de distorção exemplificadora 2800, semelhante à tabela de distorção 2200 discutida em relação à Figura 22A e Figura 22B. Como pode ser visto na tabela distorção 2800, os corantes específicos usados por um painel (ou, alternativamente, usados em uma simulação de projeto do painel) podem ser especificamente identificados. De modo similar, as propriedades do filtro passa-banda dos detectores do canal de PMT do hardware usados por um instrumento de medição de emissão (ou, alternativamente, usados em uma simulação de projeto do painel) podem ser especificamente identificadas. Em aspectos, o grupamento de corantes de canais de PMT pode ser baseado no comprimento de onda do laser de excitação para um dado corante, entretanto, a exibição de uma tabela de distorção pode apresentar os grupamentos de valores de distorção em qualquer ordem que seja útil ou apropriada para um operador. Como é evidente na comparação das duas tabelas de distorção, a tabela de distorção 2200 e a tabela de distorção 2800, a identidade dos detectores de PMT e corantes usados para qualquer configuração de hardware específica ou projeto do painel pode alterar os valores de distorção usados para fazer os cálculos de correção.
[0248] A Figura 29 é uma tabela 2900 de identificação de uma disposição exemplificadora de antígenos alvos 2902, corantes 2904, e lasers de excitação 2906 para ativar os corantes identificados. Como indicado, os lasers de excitação 2906 são operativos para excitar os respectivos corantes 2904, que, por sua vez, são conjugados com os seus antígenos alvos 2902. Em aspectos, os dados compensados que são adquiridos com o uso dessas medidas podem ser exportados para um processador e sistema operável ou programa, como uma tabela de 20 bits para o Excel, via software, como Kaluza 1.2 beta. A classificação do evento positivo e negativo pode ser calculada para cada evento individualmente, particularmente no contexto de conjugados de anticorpo-corante especificamente avaliados. As Figuras 29A-29E representam aspectos de dados reais de acordo com as modalidades, com o uso da disposição de antígenos alvos 2902, corantes 2904, e lasers de excitação 2906 como apresentado na Figura 29.
[0249] A Figura 29A descreve aspectos de dados reais de acordo com uma modalidade da presente invenção, particularmente a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo, aplicando técnicas de chaveamento para sinal de evento CD62L-FITC contra CD4-PacBlue 2902. A plotagem doe sinal de evento CD62L-FITC contra CD4-PacBlue (azul do Pacífico) 2902 mostra a diferenciação que avaliados. Assim, classificada como negativo para ambos CD62L-FITC e população de CD4-PacBlue 2904, um positivo para CD62L-FITC e negativo para população de CD4- PacBlue 2906, um negativo para ambos CD62L-FITC e um positivo para a população de CD4-PacBlue 2908, e um positivo para ambos CD62L- FITC e população de CD4-PacBlue 2910.
[0250] A Figura 29B representa aspectos de dados reais de acordo com as modalidades da presente revelação, particularmente a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo, aplicando técnicas de chaveamento para sinal de evento CD117-PE contra CD45RA-ECD 2912. Assim, a população de todos os eventos pode ser classificada como populações de eventos que são: um negativo para ambos CD117-PE e população de CD45RA-ECD 2914, um positivo para CD117-PE e negativo para população de CD45RA- ECD 2916, um negativo para ambos CD117-PE e um positivo para a população de CD45RA-ECD 2918, e um positivo para ambos CD117- PE contra a população de CD45RA-ECD 2920. A plotagem de CD117- PE contra o sinal de evento CD45RA-ECD 2912 indica pelo menos um "ponto crítico" que afeta a classificação de eventos individuais como positiva ou negativa, reflexivo dos canais avaliados. Um primeiro ponto crítico pode ser identificado como na região entre a população de eventos 2914 e a população de eventos 2920, enquanto um segundo ponto crítico pode ser identificado na região entre a população de eventos 2916 e a população de eventos 2920. Esses resultados podem refletir ainda mais várias sobreposições de coeficientes de variação (CV) entre as diversas populações.
[0251] A Figura 29C representa aspectos de dados reais de acordo com as modalidades da presente revelação, particularmente a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo, aplicando técnicas de chaveamento para sinal de evento CD69-PC5 contra CD45RA-ECD 2922. Assim, a população de todos os eventos pode ser classificada como populações de eventos que são: um negativo para ambos CD69-PC5 e população de CD45RA-ECD 2924, um positivo para CD69-PC5 e negativo para população de CD45RA- ECD 2926, um negativo para ambos CD69-PC5 e um positivo para a população de CD45RA-ECD 2928, e um positivo para ambos CD69- PC5 contra a população de CD45RA-ECD 2930. A plotagem de CD69- PC5 contra o sinal de evento CD45RA-ECD 2922 indica pelo menos um "ponto crítico" que afeta a classificação de eventos individuais como positiva ou negativa, reflexivo dos canais avaliados. Um primeiro ponto crítico pode ser identificado como na região entre a população de eventos 2924 e a população de eventos 2930, enquanto um segundo ponto crítico pode ser identificado na região entre a população de eventos 2926 e a população de eventos 2930. Esses resultados podem refletir ainda mais várias sobreposições de coeficientes de variação (CV) entre as diversas populações.
[0252] A Figura 29D representa aspectos de dados reais de acordo com as modalidades da presente revelação, particularmente a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo, quando a aplicação de técnicas de chaveamento pode não ser útil ou possível. Em particular, a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo para o sinal de evento CD69-PC5 contra CD16-APCA750 2932 é mostrada. Assim, a população de todos os eventos pode ser classificada como populações de eventos que são: um negativo para ambos CD69-PC5 e população de CD16-APCA750 2934, um positivo para CD69-PC5 e negativo para população de CD16-APCA750 2936, um negativo para ambos CD69-PC5 e um positivo para a população de CD16-APCA750 2938, e um positivo para ambos CD69-PC5 contra a população de CD16-APCA750 2940. A plotagem do sinal de evento CD69-PC5 contra CD16-APCA750 2932, entretanto, não indica uma região clara que pode definir um "ponto crítico" para classificar de forma confiável eventos individuais como positivos ou negativos em relação aos canais avaliados. Esses resultados podem refletir várias sobreposições de coeficientes de variação (CV) entre as diversas populações. Assim, em alguns aspectos, a análise de CD69-PC5 contra CD16-APCA750 em combinação pode ser considerada como não podendo ser submetida a técnicas de chaveamento, e pode ser evitada em análise posterior ou projeto do painel.
[0253] A Figura 29E representa aspectos de dados reais de acordo com as modalidades da presente revelação, particularmente a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo, quando a aplicação de técnicas de chaveamento pode não ser útil ou possível. Em particular, a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo para o sinal de evento CD69-PC5 contra CD56-APC 2942 é mostrada. Assim, a população de todos os eventos pode ser classificada como populações de eventos que são: um negativo para ambos CD69-PC5 e população de CD56-APC 2944, um positivo para CD69-PC5 e negativo para população de CD56-APC 2946, um negativo para ambos CD69-PC5 e um positivo para a população de CD56-APC 2948, e um positivo para ambos CD69-PC5 contra a população de CD56-APC 2950. A plotagem do sinal de evento CD69-PC5 contra CD56-APC 2942, entretanto, não indica uma região clara que pode definir um "ponto crítico" para classificar de forma confiável eventos individuais como positivos ou negativos em relação aos canais avaliados. Esses resultados podem refletir várias sobreposições de coeficientes de variação (CV) entre as diversas populações. Assim, em alguns aspectos, a análise de CD69- PC5 contra CD56-APC em combinação pode ser considerada como não podendo ser submetida a técnicas de chaveamento, e pode ser evitada em análise posterior ou projeto do painel.
[0254] A Figura 30 é uma tabela 3000 de identificação de uma disposição exemplificadora de antígenos alvos 3002, corantes 3004, e lasers de excitação 3006 para ativar os corantes identificados. Como indicado, os lasers de excitação 3006 são operativos para excitar os respectivos corantes 3004, que, por sua vez, são conjugados com os seus antígenos alvos 3002.
[0255] A Figura 30A representa aspectos de dados reais de acordo com as modalidades da presente revelação, com o uso da disposição de antígenos alvos 3002, corantes 3004, e lasers de excitação 3006 como apresentado na Figura 30, particularmente a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo. Na Figura 30A, as técnicas de chaveamento ou algoritmos não são aplicadas, permitindo uma avaliação holística da classificação de positivo e negativo com base nos canais de detecção de PMT usados para avaliar os sinais do evento. Em particular, a plotagem de dados de eventos adquiridos a partir de um instrumento de citometria de fluxo para o sinal de evento CD27-PC7 contra CD3-PacO (Laranja do Pacífico) 3008 é mostrada. Assim, a população de todos os eventos pode ser classificada como populações de eventos que são: um negativo para ambos CD27-PC7 e população de CD3-PacO 3010, um positivo para CD27-PC7 e negativo para população de CD3-PacO 3012, um negativo para ambos CD27-PC7 e um positivo para a população de CD3-PacO 3014, e um positivo para ambos CD27-PC7 contra a população de CD3-PacO 3016. Entretanto, sem a aplicação de uma técnica de chaveamento, como apresentado na presente revelação, uma população de sinais de eventos a partir de um conjugado de antígeno-anticorpo diferente pode ser incorretamente agrupada como positiva para a outra população de sinal de evento. Por exemplo, na Figura 30A, uma população de sinal de evento positivo para CD19- PC5.5 3018 pode ser equivocadamente agrupada com o sinal de evento positivo para CD27-PC7 e negativo para CD3-PacO 3012. Esses resultados podem, novamente, refletir várias sobreposições de coeficientes de variação (CV) entre as várias populações, e refletir ainda mais os erros que podem ocorrer sem a aplicação de técnicas de chaveamento.
[0256] Vários princípios podem ser usados e aplicados ao prever ou determinar os limites de detecção. Por exemplo, de acordo com algumas modalidades, os corantes brilhantes podem funcionar bem com antígenos expressos fracamente, enquanto que ambos os corantes fracos e brilhantes podem funcionar bem com antígenos fortemente expressos. Além disso, os canais não tocados podem funcionar bem com antígenos expressos fracamente, enquanto os canais silenciosos podem funcionar bem com antígenos fortemente expressos. Em alguns casos, pode ser desejável para permitir o transbordamento entre os antígenos de exclusão. Em alguns casos, pode ser desejável evitar o transbordamento entre marcadores coexpressos não exclusivamente. Em alguns casos, pode ser desejável permitir o transbordamento a partir de marcadores de subpopulações para marcadores pais. Em alguns casos, pode ser desejável evitar o transbordamento de marcadores pais para marcadores de subpopulações ou marcadores coexpressos para a subpopulação ou outros marcadores coexpressos, se o objetivo é a discriminação dentro da faixa positiva, isto é, discriminar eventos positivos proeminentes contra os positivos fracos. Em alguns casos, pode ser desejável minimizar o número de distorção dos fluorocromos por canal de detecção.
[0257] Várias modalidades da presente revelação são consideradas como a seguir. Em aspectos, a presente revelação é dirigida a um método de determinação de um painel de sonda para análise de uma amostra biológica em um procedimento de citometria de fluxo, em que o método inclui: receber informações sobre uma lista que compreende uma pluralidade de sondas, as sondas individuais da lista sendo associadas com os respectivos limites de detecção específica de canal individual; receber informações sobre um padrão de coexpressão antigênica; avaliar as combinações de sondas individuais como o painel de sonda, com base na configuração de hardware de citômetro de fluxo, nos limites de detecção específica de canal individual, e no padrão de coexpressão antigênica, as combinações sendo subconjuntos de sondas da lista; determinar o painel de sonda para uso com a configuração de hardware de citômetro de fluxo, os limites de detecção específica de canal individual, e o padrão de coexpressão antigênica; e produzir um painel de sonda para uso em um processo de citometria de fluxo. Em alguns aspectos, o método pode incluir, ainda, receber informações sobre uma configuração de hardware de citômetro de fluxo. Em outros aspectos, as informações recebidas sobre a configuração de hardware de citômetro de fluxo podem incluir qualquer uma ou todas as informações sobre pelo menos uma intensidade de laser de excitação, pelo menos um comprimento de onda de laser de excitação, e pelo menos uma faixa de canal de detecção de tubo fotomultiplicador. Em outros aspectos, a informação recebida sobre a lista que compreende uma pluralidade de sondas pode envolver, ainda, qualquer um ou todos dentre acessar um meio legível por computador não temporário tendo uma biblioteca de limites de detecção específicos do canal para a pluralidade de sondas, um operador selecionando um anticorpo e um corante correspondente, como pelo menos um membro do painel de sonda, selecionar automaticamente um anticorpo e um corante correspondente a partir de uma biblioteca, como pelo menos um membro do painel de sonda, e selecionar automaticamente um anticorpo e um corante correspondente a partir de uma biblioteca para cada membro do painel de sonda. Em algumas modalidades, a lista pode incluir um ou mais membros fictícios. Em alguns aspectos, o recebimento de informações sobre o padrão de coexpressão antigênica pode incluir o acesso a um meio legível por computador não temporário tendo uma biblioteca de relações de coexpressão. Ainda em outros aspectos, a avaliação de combinações de sondas individuais como o painel de sonda pode incluir o cálculo de qualquer sobreposição ou distorção entre os limites de detecção específicos do canal de duas ou mais sondas individuais. Em alguns aspectos, o padrão de coexpressão de antígenos pode incluir relações de coexpressão entre os antígenos para um tipo de célula específico.
[0258] Modalidades adicionais da presente revelação podem ser dirigidas a um sistema para determinação de um painel de sonda para análise de uma amostra biológica em um procedimento de citometria de fluxo, em que o sistema pode incluir: um dispositivo de entrada de informações; um citômetro de fluxo com uma configuração de hardware tendo pelo menos um laser de excitação e pelo menos um detector de tubo fotomultiplicador; uma biblioteca sonda armazenada em uma base de dados, em que as sondas individuais da biblioteca estão associadas com os respectivos limites de detecção específicos de canal individual; um padrão de coexpressão antigênica armazenado na base de dados; um processador configurado para avaliar uma lista de sondas individuais selecionadas a partir da biblioteca de sonda com base na configuração de hardware do citômetro de fluxo, os limites de detecção específicos do canal de sondas individuais, e o padrão de coexpressão antigênica; e um dispositivo de saída que fornece uma determinação de limites de detecção para o painel de sonda, o painel de sonda compreendendo um subconjunto de sondas individuais a partir da lista. Em aspectos, a configuração de hardware do citômetro de fluxo do sistema pode incluir até dez detectores de tubo fotomultiplicador, embora em outras modalidades, a configuração de hardware do citômetro de fluxo possa ter mais que dez detectores de tubo fotomultiplicador. Em outros aspectos, a configuração de hardware do citômetro de fluxo do sistema também pode incluir até quatro lasers de excitação, embora em outras modalidades, o configuração de hardware do citômetro de fluxo possa ter mais que quatro lasers de excitação. Em alguns aspectos, sendo que o dispositivo de entrada de informações pode ser configurado para permitir qualquer um ou todos dos seguintes: um operador para selecionar sondas individuais da biblioteca de sonda para a avaliação na lista, um operador para introduzir limites de detecção específicos do canal para sondas individuais na biblioteca de sonda, o processador para selecionar automaticamente um anticorpo e um corante correspondente da biblioteca de sonda para cada membro do painel de sonda. Em aspectos adicionais, o processador de avaliação de combinações pode calcular qualquer sobreposição ou distorção entre os limites de detecção específicos do canal de duas ou mais sondas individuais.
[0259] Outras modalidades da presente invenção são dirigidas a um método de análise de uma amostra biológica em um procedimento de citometria de fluxo, em que o método inclui: medir a saída de luz de uma multiplicidade de sondas em uma amostra biológica com um citômetro de fluxo; receber informações sobre uma configuração de hardware do citômetro de fluxo; receber informações sobre uma lista que compreende uma pluralidade de sondas usadas na amostra biológica, as sondas individuais da lista sendo associadas com os respectivos limites de detecção específicos de canal individual; receber informações sobre um padrão de coexpressão antigênica; determinar um critério de positividade e um critério de negatividade para cada sonda individual na lista e determinar os parâmetros de chaveamento para a lista com base na configuração de hardware do citômetro de fluxo, nos limites de detecção específicos de canal individual, e no padrão de coexpressão antigênica; e avaliar a saída de luz da pluralidade de sondas na amostra biológica de acordo com os critérios de positividade, critérios de negatividade, e os parâmetros de chaveamento. Em aspectos, o recebimento de informações sobre a configuração de hardware de citômetro de fluxo incluir, ainda, receber informações sobre pelo menos uma intensidade de laser de excitação, pelo menos um comprimento de onda de laser de excitação, e pelo menos uma faixa de canal de detecção de tubo fotomultiplicador. Em alguns aspectos, o recebimento de informações sobre a lista que compreende uma pluralidade de sondas pode incluir, ainda, qualquer um ou ambos dentre o acesso um meio legível por computador não temporário tendo uma biblioteca de limites de detecção específicos do canal para a pluralidade de sondas e seleção pelo operador de um anticorpo e um corante correspondente para a pluralidade de sondas. Em aspectos adicionais, a lista pode incluir um ou mais membros fictícios. Em alguns aspectos, o recebimento de informações sobre o padrão de coexpressão antigênica pode incluir o acesso a um meio legível por computador não temporário tendo uma biblioteca de relações de coexpressão. Em outros aspectos, a avaliação de combinações de sondas individuais como o painel de sonda pode incluir o cálculo de qualquer sobreposição ou distorção entre os limites de detecção específicos do canal de duas ou mais sondas individuais. Em ainda outros aspectos, o padrão de coexpressão antigênica pode incluir relações de coexpressão entre os antígenos para um tipo de célula específico.
[0260] Outras modalidades da presente revelação podem ser dirigidas a um sistema para analisar uma amostra biológica em um procedimento de citometria de fluxo, em que o sistema pode incluir: um dispositivo de entrada do operador, através do qual uma lista que compreende uma pluralidade de sondas usadas em uma amostra biológica pode ser introduzida; uma configuração de hardware de citômetro de fluxo tendo pelo menos um laser de excitação e pelo menos um detector de tubo fotomultiplicador; uma biblioteca de sonda armazenada em uma base de dados, em que as sondas individuais da biblioteca estão associadas com os respectivos limites de detecção específicos de canal individual; um padrão de coexpressão antigênica armazenado na base de dados; um processador configurado para avaliar a luz emitida por uma pluralidade de sondas e detectada por pelo menos um detector de tubo de fotomultiplicador, calcular qualquer sobreposição e distorção entre os limites de detecção específicos de canal da pluralidade de sondas; e um dispositivo de saída que fornece uma determinação da presença ou ausência de uma sonda na amostra biológica. Em alguns aspectos, o sistema pode ter uma configuração de hardware de citômetro de fluxo que inclui até dez detectores de tubo fotomultiplicador. Em outros aspectos, o sistema pode ter uma configuração de hardware de citômetro de fluxo que inclui até quatro lasers de excitação. Em outros aspectos, o sistema pode incluir um dispositivo de entrada de operador que pode ser configurado para permitir a um operador selecionar sondas individuais da biblioteca de sonda para a avaliação na lista, ou que pode ser configurado para permitir que um operador introduza limites de detecção específicos do canal para sondas individuais na biblioteca de sonda.
[0261] Modalidades adicionais da presente revelação podem ser dirigidas a um método para a determinação de um painel de sonda para análise de uma amostra biológica em um procedimento de citometria de fluxo, incluindo: fornecer uma seleção de configurações de hardware de citometria de fluxo; fornecer uma pluralidade de seleções de emparelhamentos de anticorpos; fornecer uma seleção de pelo menos uma população alvo; fornecer uma seleção para uma pluralidade de anticorpos, e fornecer pelo menos uma seleção para indicar se um anticorpo da pluralidade de anticorpos é um antígeno de interesse ou um antígeno não relacionado; fornecer uma pluralidade de uma seleção de emparelhamentos de antígeno-anticorpo, e para um emparelhamento de antígeno-anticorpo individual, fornecer uma seleção de antígenos aos quais o emparelhamento de antígeno- anticorpo individual está excluindo mutuamente; fornecer uma pluralidade de uma seleção de emparelhamento de antígeno-anticorpo, e para um emparelhamento de antígeno-anticorpo individual, fornecer uma seleção de antígenos que são descendentes desenvolvimentais do emparelhamento de antígeno-anticorpo individual; fornecer uma seleção de parâmetros de densidade de antígeno ajustáveis; e responsivo para a seleção de uma variedade de configurações de hardware de citometria de fluxo, uma pluralidade de seleções de emparelhamento de anticorpos, uma seleção de pelo menos uma população alvo, uma seleção para uma pluralidade de anticorpos, uma seleção de antígenos, aos quais pelo menos um emparelhamento de antígeno-anticorpo está excluindo mutuamente, uma seleção de antígenos que são descendentes desenvolvimentais de pelo menos um emparelhamento de antígeno-anticorpo, e uma seleção de parâmetros de densidade de antígeno ajustáveis, fornecer uma exibição de estimativas do limite de detecção para o painel de sonda. Nas modalidades, o fornecimento de uma pluralidade de seleções de emparelhamentos de anticorpos pode incluir, adicionalmente, o fornecimento uma seleção de seletividade para cada emparelhamento de anticorpo e o fornecimento de uma seção de corante para cada emparelhamento de anticorpo. Em aspectos, o fornecimento de uma seleção de pelo menos uma população alvo pode incluir o fornecimento de uma seleção correspondente a um fenótipo da população alvo. Em alguns aspectos, o fornecimento de uma seleção de pelo menos uma população alvo é configurável para permitir a adição ou remoção de populações alvos. Em alguns aspectos, a seleção de antígenos para os quais um emparelhamento de antígeno-anticorpo individual está excluindo mutuamente pode ser determinada automaticamente por uma base de dados de exclusão mútua, e a seleção de antígenos aos quais um emparelhamento de antígeno-anticorpo individual está excluindo mutuamente é automaticamente selecionada. Em outros aspectos, uma seleção de antígenos que são descendentes desenvolvimentais de emparelhamento de antígeno-anticorpo individual pode ser determinada automaticamente por uma base de dados de padrões familiares desenvolvimentais, e a seleção de antígenos que são descendentes desenvolvimentais de emparelhamento de antígeno-anticorpo individual é selecionada automaticamente. Em alguns aspectos, os parâmetros de densidade de antígeno ajustáveis fornecidos podem incluir uma seleção para discriminação, no monitor, entre as estimativas do limite de detecção positivas e negativas, enquanto que em outros aspectos, os parâmetros de densidade de antígeno ajustáveis fornecidos podem incluir uma seleção para discriminação, no monitor, entre estimativas de limite de detecção positivas brilhante e positivas fracas. Em outros aspectos, os parâmetros de densidade de antígenos ajustáveis fornecidos incluem uma seleção para exibir tanto estimativas de limite de detecção distintas quanto moduladas, enquanto ainda em outros aspectos, os parâmetros de densidade de antígenos ajustáveis fornecidos incluem uma seleção para dimensionar o monitor de acordo com um limite de detecção estimado do painel de sonda.
[0262] Cada um dos cálculos ou operações aqui descritos pode ser feito com o uso de um computador, rede de comunicação, ou outro processador que tenha hardware, software e/ou firmware. Um sistema exemplificador com computador atendente, rede de comunicação, ou outro processador tendo hardware, software e/ou firmware pode ser encontrado no pedido de Patente US n°. 13/935.154, que é aqui incorporado por referência. As várias etapas do método podem ser realizadas por módulos, e os módulos podem compreender qualquer uma dentre uma ampla variedade de hardware e/ou software de processamento de dados digitais e/ou analógicos dispostos para executar as etapas do método aqui descritas. Os módulos compreendem opcionalmente hardware de processamento de dados adaptado para executar uma ou mais dessas etapas tendo código de programação de máquina adequado associado ao mesmo, os módulos de duas ou mais etapas (ou porções de duas ou mais etapas) sendo integrados a uma única placa de processador ou separados em diferentes placas de processador em qualquer uma dentre uma ampla variedade de arquiteturas de processamento integrado e/ou distribuído. Esses métodos e sistemas com frequência usarão um meio tangível incluindo código legível por máquina com instruções para executar as etapas do método descrito acima. A mídia adequada tangível pode compreender uma memória (incluindo uma memória volátil e/ou uma memória não volátil), uma mídia de armazenamento (tal como um gravador magnético em um disquete, disco rígido, uma fita, ou similares; em uma memória óptica como um CD, um CD-R/W, um CD-ROM, um DVD, ou similares; ou qualquer outra mídia de armazenamento digital ou analógica)
[0263] É apreciado que um sistema de citometria de fluxo, como aqui descrito pode ser configurado para realizar vários aspectos dos métodos da presente invenção. Por exemplo, um componente ou módulo de processador de um sistema pode ser um módulo de controle de microprocessador, configurado para receber sinais de parâmetros celulares a partir de um dispositivo ou módulo de entrada de sensor, a partir de um dispositivo ou módulo de entrada de interface de usuário, e/ou a partir de um sistema analisador, opcionalmente, através uma interface de sistema analisador e/ou uma interface de rede e uma rede de comunicação. Em alguns casos, o(s) dispositivo(s) de entrada de sensor pode incluir ou ser parte de um sistema de análise celular, como um citômetro de fluxo. Em alguns casos, o(s) dispositivo(s) de entrada de interface de usuário(s) e/ou interface de rede pode ser configurado para receber sinais de parâmetros celulares gerados por um sistema de análise celular, como um citômetro de fluxo. Em alguns casos, o sistema analisador pode incluir ou ser parte de um sistema de análise celular, como um citômetro de fluxo.
[0264] Componente ou módulo do processador também pode ser configurado para transmitir sinais de parâmetros celulares, opcionalmente, processados de acordo com qualquer uma das técnicas aqui descritas, para um dispositivo ou módulo de saída do sensor, para um dispositivo ou módulo de saída de interface de usuário, para um dispositivo ou módulo de interface de rede, para uma interface do sistema de analisador, ou qualquer combinação dos mesmos. Cada um dos dispositivos ou módulos, de acordo com modalidades da presente invenção, pode incluir um ou mais módulos de software em um meio legível por computador que é processado por um processador, ou módulos de hardware, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer uma de uma variedade de plataformas comumente usadas, como Windows, Macintosh e Unix, juntamente com qualquer uma de uma variedade de linguagens de programação comumente usadas, pode ser usada para implantar as modalidades da presente invenção.
[0265] Os dispositivos de entrada de interface de usuário podem incluir, por exemplo, um touchpad, um teclado, dispositivos apontadores, como um mouse, um trackball, uma tabuleta de gráficos, um digitalizador, um joystick, uma tela de toque incorporada a um monitor, dispositivos de entrada de áudio, como sistemas de reconhecimento de voz, microfones, e outros tipos de dispositivos de entrada. Os dispositivos de entrada de usuário também podem baixar um código executável por computador a partir de um meio de armazenamento tangível ou da rede de comunicação, o código incorporando qualquer um dos métodos ou aspectos dos mesmos aqui divulgados. Será apreciado que o software terminal pode ser atualizado de tempos em tempos e transferido para o terminal, conforme apropriado. Em geral, o uso do termo "dispositivo de entrada" destina- se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e de propriedade e formas para introduzir informações para o sistema de módulo.
[0266] Os dispositivos de saída de interface de usuário podem incluir, por exemplo, um subsistema de exibição, uma impressora, um aparelho de fax, ou monitores não visuais, como os dispositivos de saída de áudio. O subsistema de exibição pode ser um tubo de raios catódicos (CRT), um dispositivo de painel plano como uma tela de cristal líquido (LCD), um dispositivo de projeção, ou similares. O subsistema de exibição pode também fornecer uma tela não visual como por meio de dispositivos de saída de áudio. Em geral, o uso do termo "dispositivo de saída" destina-se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e de propriedade e formas para produzir informações a partir do sistema de módulo para um usuário.
[0267] O subsistema de barramento pode fornecer um mecanismo para permitir que os vários componentes e subsistemas do sistema de módulo se comuniquem uns com os outros como previsto ou desejado. Os vários componentes e subsistemas do sistema de módulo não precisam estar no mesmo local físico, mas podem ser distribuídos em vários locais dentro de uma rede distribuída. Um subsistema de barramento pode ser um único barramento ou pode utilizar vários barramentos.
[0268] A interface de rede pode fornecer uma interface para uma rede externa ou outros dispositivos. A rede de comunicação externa pode ser configurada para efetuar comunicações, conforme necessário ou desejado com outras partes. Em muitas modalidades, a rede de comunicação pode ser um sistema de processamento baseado em nuvem ou baseado na web, permitindo o acesso e processamento remoto. Esse pode, assim, receber um pacote eletrônico do sistema de módulo 600 e transmitir qualquer informação conforme necessário ou desejado de volta para o sistema de módulo. Além de fornecer tais links de comunicações de infraestrutura internos ao sistema, o sistema de rede de comunicações pode também fornecer uma conexão com outras redes, como a Internet e pode compreender uma conexão de interface com fios, sem fios, modem e/ou outro tipo de conexão de interface.
[0269] Todas as patentes, publicações de patente, pedidos de patente, artigos de jornal, livros, referências técnicas e similares discutidos na presente revelação estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[0270] Deve-se entender que as figuras e descrições da invenção foram simplificadas para ilustrar os elementos que são relevantes para uma compreensão clara da invenção. Deve-se entender que as figuras são apresentadas para propósitos ilustrativos e não como desenhos de construção. Detalhes e modificações omitidos ou modalidades alternativas estão dentro do escopo das pessoas com conhecimento básico da técnica.
[0271] Pode ser entendido que, em determinados aspectos da invenção, um único componente pode ser substituído por múltiplos componentes, e múltiplos componentes podem ser substituídos por um único componente, para fornecer um elemento ou estrutura ou para executar uma determinada função ou funções. Exceto onde essa substituição não é operacional para praticar certas modalidades da invenção, essa substituição é considerada dentro do escopo da invenção.
[0272] Os exemplos apresentados na presente invenção destinam- se a ilustrar implementações possíveis e específicas da invenção. Pode- se entender que os exemplos são concebidos principalmente para propósitos ilustrativos da invenção para os versados na técnica. Pode haver variações desses diagramas ou das operações aqui descritas sem que se afaste do espírito da invenção. Por exemplo, em certos casos, as etapas do método ou operações podem ser realizadas ou executadas em diferentes ordens, ou as operações podem ser incluídas, deletadas ou modificadas.
[0273] As diferentes disposições dos componentes representados nos desenhos e descritos acima, bem como os componentes e etapas não mostrados ou descritos são possíveis. De modo similar, algumas características e subcombinações são úteis e podem ser usadas sem referência a outras características e subcombinações. As modalidades da invenção foram descritas para fins ilustrativos e não restritivos, e as modalidades alternativas serão evidentes para os leitores dessa patente. Consequentemente, a presente invenção não está limitada às modalidades acima descritas ou representadas nos desenhos, e várias modalidades e modificações podem ser feitas sem que se afaste do escopo das reivindicações abaixo.
Claims (15)
1. Método para projetar um painel de sonda para um citômetro de fluxo compreendendo: determinar um fator de distorção que quantifica o efeito de transbordamento causado pela emissão de um primeiro marcador, destinada a ser medida em um primeiro canal, para um segundo canal; e introduzir um sinal máximo esperado de uma primeira combinação de sonda-marcador incluindo o primeiro marcador e uma primeira sonda, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: calcular um aumento no limite de detecção no segundo canal com base no fator de distorção e no sinal máximo esperado da primeira combinação de sonda-marcador; e selecionar uma combinação de sonda-marcador para incluir o painel de sonda com base no aumento calculado no limite de detecção.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fator de distorção é um aumento no limite de detecção do segundo canal como uma função de uma intensidade de emissão de uma primeira combinação de sonda-marcador.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fator de distorção é uma função linear da intensidade de emissão da primeira combinação de sonda-marcador.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o aumento do limite de detecção no segundo canal é causado por um aumento em um erro de medição como uma função da intensidade de emissão da primeira combinação de sonda-marcador.
5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fator de distorção é calculado com o uso de um índice de interferência.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fator de distorção é matematicamente modificado por um coeficiente que representa o padrão de coexpressão de antígenos correspondente à primeira combinação de sonda-marcador e uma segunda combinação de sonda-marcador, sendo que a segunda combinação de sonda-marcador é destinada a ser medida no segundo canal.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: determinar um fator de distorção para cada marcador em um primeiro painel de sonda potencial para calcular um aumento total no limite de detecção no segundo canal.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a seleção da combinação de sonda-marcador é baseada em uma comparação do aumento total calculado no limite de detecção com um sinal mínimo esperado no segundo canal.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, o cálculo de um aumento total no limite de detecção para cada sonda no primeiro painel de sonda potencial.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: calcular um aumento total no limite de detecção para cada sonda em um segundo painel de sonda potencial; e selecionar o painel de sonda com base em uma comparação do aumento total calculado no limite de detecção para cada sonda no primeiro painel de sonda potencial com o aumento total calculado no limite de detecção para cada sonda no segundo painel de sonda potencial.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: calcular um aumento total no limite de detecção para cada sonda em um segundo painel de sonda potencial; e selecionar o painel de sonda com base no aumento total calculado no limite de detecção para uma sonda de prioridade no primeiro painel de sonda potencial e no segundo painel de sonda potencial.
12. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o coeficiente é um ou zero.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito sinal máximo esperado baseia-se, em parte, em uma densidade de antígeno esperada em uma célula alvo.
14. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o coeficiente é determinado para que seja zero se o padrão de coexpressão de antígenos correspondente à primeira combinação sonda-marcador e à segunda combinação sonda-marcador for mutuamente exclusivo.
15. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o coeficiente é determinado como sendo zero se o antígeno correspondente à segunda combinação sonda-marcador é um descendente do antígeno correspondente à primeira combinação sonda-marcador.
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