JPS59102139A

JPS59102139A - 血球カウンタ

Info

Publication number: JPS59102139A
Application number: JP21132882A
Authority: JP
Inventors: Gosuke Anno; 案野　剛輔; Yoshinori Suzuki; 義規鈴木
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1982-12-03
Filing date: 1982-12-03
Publication date: 1984-06-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の技術分野〕この発明は、血液検査装置に係わシ、特に血球を計数す
る血球カウンタに関する。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

一般に、血球は、赤血球、白血球、血小板に大別される
が、これらの血球を分類計数することにより、各種の病
気の診断が可能となる。血球の大きさ薬品に対する血球
膜の溶解性から、赤血球。

白血球、血小板を自動的に分類計数する装置が作られ、
現在床（使われている。しかし医療の高度化に伴ない、
赤血球、白血球、血小板に分類計数するだけでは、不十
分になシ、血球そより評しく分類し計数しなければなら
な（なった。すなわち、正常赤血球、網状赤血球、好酸
状、好中球、好塩基球、単球、リンパ球、血小板等に細
分類しなければならなくなった。

このような血球の細分類計数は、血球を染色し、染色さ
れた血球の邑及び形を基にして人間が分類計数している
。しかし人間の処理速度には限界があり、機械化による
高速化、高精度化が望まれている。血液を自動的に染色
し、パターン認識で分類計数する装置が作らｎているが
、血球の染色に時間がかかる。パターン認識に要する時
間が、長い９重なった血球に、分類できないといった欠
点があシ、高速、高精度な自動化装置は、作られていな
い。

〔発明の目的〕

この発明は、従来人手で行なっていた、正常赤血球、別
状赤血球、好酸球、好中球、好塩基球。

単球、リンパ球、血小板といった血球の細分類計数が自
動的に行なえる高速、高精度な血球カウンタを提供する
ことを目的とする。

〔発明の概要〕

この発明は、透光性材料によシ形成され金堂光染色され
た血球を流すフローセルと、このフローセルに直線偏光
した光を照射する光学系と、前記蛍光染色された血球か
ら放射される蛍光の異方性比を測定する手段とを備えて
なることを特徴とする血球カウンタである。

〔発明の効果〕

この発明によれば、短かい測定時間で、正確に血球の細
分類計数が自動的にできる。

〔発明の実施例〕

近年発達して来た生物化学の技術を使うことによシ、特
定の種類の血球と特異的に反応結合する抗体を作シ、そ
の抗体に蛍光物質を付着させ、蛍光標識抗体を大量に作
ることが可能である。この蛍光標識抗体を血液に加える
と、特定の種類の血球のみが、蛍光標識抗体と特異的に
瞬時に反応結合することになる。すなわち、特定の血球
のみが蛍光染色されることになる。この蛍光染色さｎｆ
ｃ血辰を透光性材料からなるフルーセルに流し、励起光
をセルに照射すると、蛍光染色された血球が通過する時
、第１図のように蛍光が放射される。

蛍光強度を測定し、第１図のようなパルスを計数すると
、特定の種類の血球の計数が可能となる。

しかし血球と反応結合しない蛍光標識抗体もあシ、これ
も第１図のような蛍光を発するので、蛍光の光景を単に
測定するだけでは、血球の個数は、誤って計数されるこ
とになる。

−の誤計数を無くすには、血球と結合した蛍光標識抗体
の蛍光と、結合していないものの蛍光とを区別する必要
がある。本発明による装置では、蛍光異方性比を測定す
ることによって、蛍光標識抗体が血球と結合しているか
、いないかを区別して、誤計数なく特定の種類の血球の
計数を行なう。

図を用いて原理を説明する。第２図のように、セル（１
１）の管壁に固定した蛍光物質（１２）に直線偏光した
光（励起光）（イ）が照射されている場合を考える。蛍
光物質が仮に理想的に固定されていると、蛍光物質から
は、励起光と同じ方向に偏光された蛍光（ロ）が放射さ
する。しかし蛍光物質（１２）が溶液（Ｉ３）中に浮遊
していると、蛍光物質に、ブラウン運動などで回転運動
することになり、蛍光物質から放射される蛍光は、一方
向に偏光された光ではなくなる。蛍光の偏光度を表わす
のに、下式によシ示される異方性比γというものがある
。

成分工エニ励起光の偏光方向と直交する方向の蛍光成分蛍光物質の回転運動が激しい程、異方性比γは、小さく
なる。一方、蛍光物質の質量が小さい柱、回転運動は、
激しくなるので、この異方性比を調べることによって、
蛍光物質の質量の大小を判別する事が可能となる。血球
と結合した蛍光標識抗体に、蛍光標識抗体の質量に較べ
て太き（なるので、異方性比は、結合していないものに
較べ太き（なる。実際の異方性比は、血球の膜の柔軟性
。

熱分子運動などの影響によって、今まで述べて来た程、
単純に説明できないが、蛍光標識抗体の異方性比が血球
との結合によって大きくなるという現象に変わ〕はない
。

このように異方性比の大きな蛍光が出る回数を計数する
ことによシ、特定の種類の血球の計数が正確に行なえる
。

第３図に、本発明の一実施例の構成を示す。図示しない
吸引装置で、吸引された血液は、蛍光標識抗体と混合さ
れ、蛍光染色が行なわれる。蛍光染色され、ＰＣ血液は
、図示しない希釈装置で希釈され、フローセルＣ２３）
に送られる。フローセル（２３）は、図のように二重管
構造になっていて、染色希釈された血液（２５）は、フ
ローセルの中心を流れることになる。この血液（２５）
の周囲は、図示しない液送装置から送られて来た透明な
液体（シース液）（２４）が包み込むように流れている
。フローセル（２３）は、徐々に狭（なっているので、
流体的な作用によって、染色希釈さ才ムた血液（２５）
は、絞シ込まれ、直径２０μｍ８度の細い管となって流
れる。第３図のように二重管構造のフローセルによって
試料液体を絞り込むものけ、ウォーターシースと呼ばれ
るが、このような構造によって、血球ニ、１１固１個離
れて流れるようになシ、血球１個１個について蛍光を調
べることが可能になるとともに、血球によるセルの目詰
まりもなくなる。

ウォーターシースによって、１ｉｆｉｌａ分離されて流
れる血球は、直線偏光レーザー発振器（２１）から出て
、シリンドリカルレンズ（２２）で絞り込まれた光が照
射される。レーザー発振器（２１）は、蛍光物質の励起
の点で、アルゴンガスレーザ、チッ素ガスレーザ等の短
波長のレーザーが適している。

シリンドリカルレンズ（２２）により、レーザー光は、
血液の流れの直角方向に雅長い光束になる力５、これに
よシ血球に照射するレーザー光の照度が上がり、放射さ
れる蛍光強度が強（なるとともに、血球１個、１個の蛍
光測定が容易となる。さらに血液が流れる位置が多少す
れても、照射されるレーザー光の照度Ｖコ、大きく変ら
ないので、光学系とウォーターシース（２３）の精確な
位置合わせが不要に々る。

蛍光染色さｆした血球から出て来た蛍光は、２つの受光
系で測定されることになる。この２つの受光系は、偏光
板の向きを除いて全く同じものである。すなわち、放射
さ牡た蛍光に、まず干渉フィルタ（２６）　、　（３０
）を通フ、励起光、散乱光、外光などの迷光がカントさ
れる。更に偏光板（２７）　、　（３１）を通力、特定
方向の蛍光の偏光成分のみが、集光レンズ（２８）　、
　（３２）に達し、フォトダイオード（２９）　、　（
３３）に集光される事になる。一方の受光系の偏光板（
３７）は、励起光の偏光方向と同じ方向を向き、もう一
つの受光系の偏光板（３１）は、励起光の偏光方向と直
行する方向に向けられているので、フォトダイオード（
２９）　、　（３３）の出力定流をＩｕｓＩ土とすると
蛍光の異方性比γは、以下のように求められることにな
る。

Ｉｎ＋２Ｉ工計数部４４汀、フォトダイオード（２９）　、　（３３
）の出カ尾ａ　ハルスＯ内、Ｊ４　方性比がスレッショ
ルドレベル以上のものを計数するようになっているので
、蛍光染色された特定の種類の血球の計数が可能となる
。

血液中の正常赤血球、網状赤血球、好酸球、好中球、好
塩基球、単球、リンパ球、血小板の開数を求めたい時に
は、正常赤血球と特異的に反応する標識抗体で血液を蛍
光染色して、正常赤血球数を計測し、次に網状赤血球と
特異的に反応する標識抗体を加えて計測するというよう
に、順次各種の血球の計数を行なって求める。

血球の蛍光染色の際、温度、か（はんを正確に制御する
と、血球に有情する蛍光物質の量がほぼ一定となり、蛍
光染色された血球からの蛍光強度も一定となる。このよ
うな場合には、１つの受光系の出力信号だけで、蛍光染
色された血球からの蛍光なのか、血球と結合していない
標識抗体からの蛍光なのかを判断することやｉできる。

すなわち、蛍光染色された血球からの蛍光は、異方性比
が高く、励起光の偏光方向の成分の蛍光が多いので、フ
ォトダイオード（２９）からの出力パルス高さは高く、
血球と結合していない蛍光標識抗体は、異方性比が低い
ので、フォトダイオード（２９）からの出力パルス高さ
は、低くなる。計数部（３４）がフォトダイオード（２
９）からの出力パルスの内、パルス高さの高いものだけ
を計数すれば、蛍光染色された血球の個数を計数できる
ことになる。勿論第３図において、１つの受光系を用い
てもよい。

ところで、上記実施例は特定種類の血球と特異的に結合
する蛍光標識抗体を用いて血液を蛍光染色し、染色した
血球の蛍光異方性を測定して特定の種類の血球の計数を
行なうものであるが、この方法によれば血液中の何種類
かの血球を計数するには血球の種類毎に計数を行なわな
ければならない。しかし、次に説明するように波長選択
性のフィルタそ用いれば、波長別に蛍光の異方性比を測
定することにより同時に多種類の計数を行なうことがで
きる。

血球に、前述したように、正常赤血球、網状赤血球、好
酸球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球、血小板等に
細分類されるが、各々の血球と特異的に反応する抗体を
作ｐ１それらの抗体に種明の異なる蛍光物質を付着させ
、蛍光標識抗体を作る。こ几らの蛍光標識抗体を血液に
加えると、血球は、蛍光染色され、血球の種類ごとに異
なる波長の蛍光を放射することになる。この蛍光染色さ
れた血液を透光性材料からなるフローセルに流し、励起
光をフローセルに照射すると蛍光染色さｎた血球が通過
すると、血球の種類に応じた波長の蛍光が放射される。

放射される蛍光とその波長を測定することによ勺、血液
中の血球の種類別計数が一回の計数によシ可能となる。

しかしフローセルには、血球と結合しない蛍光標識抗体
も流れてお少、蛍光強度と蛍光の波長を測定するだけで
は、血球の個数は、誤計数されることになる。血球と結
合した蛍光標識抗体の蛍光は、結合していないものの蛍
光に較べて、異方性比γが大きいので、Ｉ、、＋２Ｉ土
　　　　同じ方向の蛍光成分工上：励起光の偏光方向と直角方向の蛍光成分放射される蛍光のうち、異方性比が大きいものだけを計
数することによシ、血球の計数が正確に行なえることに
なる。

第４図に、不発明の一実施例の構成を示す。図示しない
吸引装置で吸引された血液は、蛍光標識抗体と混合され
、血球は、種類ごとに異なる蛍光物質で蛍光染色される
。蛍光染色された血液は、図示しない希釈装置で希釈さ
ｎ１フローセル（１１３）に送られる。フローセル（１
１３）　Ｕ　、二重管構造になっていて、染色希釈血液
（１１５）Ｕ、フローセル（１１３）の中心を流れるこ
とになる。この血液（１２５）　　の周囲は、希釈液な
どの透明な液体（シース液）（１１４）力５包み込むよ
うに流れている。フローセル（１１３）は。

徐々に狭くなっているので、流体的な作用によって、血
液（１１５）は、絞り込まれ、直径２０μｍ程の細い管
となって流れる。＠１図のように二重管構造のフローセ
ルによって試料液を絞り込むものは、クォーターシース
と呼ば扛るが、このような構造によって血球は、１個１
個離れて流ｎることになり、血球１個１個について蛍光
を調べることが可能になるとともに、血球によるセルの
目詰まりもなくなる。セルを流詐る血球は、直線偏光レ
ーザー発振器（１１１）から出て、シリンドリカルレン
ズ（１１２）で血液の流れと直交する方向に細長い光束
に絞られた光が照射される。放射された蛍光は、二つの
受光系によって測光される。この二つの受光系は、偏光
板の向きを除いて全く同じものである。染色された血球
から放射された蛍光は、偏光板（１１６）　、　（１２
０）で一方向の成分のみになる。更に集光レンズ（１１
７）、（１２１）で集光された蛍光は、グレーティング
（１１Ｂ）、（１２２，）で波長ごとに分解され、フォ
トダイオードアレイ（１１９）、　（１２３）によって
検出？ｌ’Ｌる。フォトダイオードアレイからの出力信
号は、蛍光の波長成分に対応する。偏光板（１１，６）
の偏光方向を直線偏光レーザー発振器の偏光方向と同じ
向きにし、偏光板（１２０）の偏光方向を直交する方向
とし、波長λｉに対応するフォトダイオ−［゛アレイ（
１１９）、（１２３）の出力蹴流をそれぞれＩＩ。

（λｉ）、　■上（λｉ）とすると、波長λｉの蛍光の
異方性比γ（λｉ）は、となる。今仮に波長λｉの異方性比が高い蛍光が測定さ
れたとすると、その蛍光を放射したのは、波長λｉの蛍
光を発する蛍光物質で染色された血球ということになる
。このように、波長別の蛍光異方性比を測定することに
より、血球の種類別計数が可能となる。

尚、先に説明した実施例と同じように、染色された血球
に付着した蛍光物質の量が常に一定なら。

第１図の２つの受光系に、一つでも拘わない。このよう
な場合には、ある波長λＩに対応する異方性比が大きい
時、当然その波長λｉに対応するフォトダイオードプレ
イ（１１９）の出力信号１＋＋（λｉ）モ大きくなるの
で、フォトダイオードアレイ（１１９）　（Ｄ出力信号
■１１（λｉ）の大きさを調べることにより、異方性比
γ（λｉ）を間接的に測定していることになる。

【図面の簡単な説明】

第１図は蛍光染色した血球を流した時の蛍光量の変化を
示す図、第２図は蛍光の異方性比についての説明図、第
３図は本発明の一実施例の構成図、第４図は本発明の他
の実施例の構成図である。１１・・・セル、１２・・・蛍光物質、１３・・・溶液
、２１　、１１１・・・直線偏光レーザー発振器、　２
２　、１１２・−・シリンドリカルレンズ＆２３　、１
１３・・・フローセル、２４　、１１４・・・シース液
、２５．１１５・・・染色希釈血液、１２６．１３０・
・・干渉フィルタ、２７　、３１　、１１６　、１２０
・・・偏光板。２８　、３２　、１１７　、１２１・・・集光レンズ、
２９　、３３．１１９゜１２３・・・フォトダイオード
、３４・・・計数部、　　１１８．１２２・・・グレー
ティング。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）透光性材料により形成され蛍光染色された血球を
流すフローセルと、このフローセルに直線偏光した光を
照射する光学系と、前記蛍光染色された血球から放射さ
れる蛍光の異方性比を測定する手段と７ｉｌ−備えてな
ることを特徴とする血球カウンタ。
（２）蛍光の異方性比を測定する手段は、波長選択性の
フィルタを含み波長別の蛍光の異方性比を測定すること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の血球カウンタ
。