FI104585B - Menetelmä bioaffiniteettimäärityksen dynamiikan laajentamiseksi - Google Patents

Description

104585

MENETELMÄ BIOAFFINITEETTIMÄÄRITYKSEN DYNAMIIKAN LAAJENTAMISEKSI

Immunomääritys on vakiintunut biospesifinen määritysmenetelmä ja sen eri sovellutuksia käytetään laajalti rutiini-diagnostiikassa ja tutkimuslaboratorioissa. Toinen bio-spesifisten määritysten on DNA- ja RNA-hybridisaatio-5 määritys. Tämän keksinnön kohteena oleva biospesifisen määritysmenetelmän parannus koskee erityisesti sellaisten analyyttimolekyylien määritysmenetelmiä, joilla on vähintäin kaksi spesifistä determinanttia. Näissä menetelmissä käytetään kahta biospesifistä reagenssia, 10 primäärireagenssia ja sekundäärireagenssia. Primääri- ja sekundäärireagenssit voivat kumpikin olla esim. vasta-aineita tai DNA- tai RNA-koettimia, jotka kumpikin sitoutuvat analyyttimolekyylin spesifisiin determinantteihin muodostaen reaktiotuotteen, joka on kolmen 15 molekyylin kompleksi (kerrosrakenne). Sovelluksesta riippuen joko toinen tai molemmat näistä reagensseista on leimattu. Nykyisin käytettyjä leimoja ovat radioisotoopit, entsyymit, luminoivat leimat ja fluoresoivat leimat.

Yleisin näytemateriaali, josta määritykset tehdään, on 20 veren seerumi.

Yleisimmin käytetään menetelmiä, joissa analyytti Ag reagoi kiinteään reaktioalustaan kiinnitetyn spesifisen primäärireagenssin Ab kanssa ja toisaalta liuoksessa olevan leimatun reagenssin Ab* kanssa muodostaen reaktiotuotteena 25 komplekseja AbAgAb*. Kiinteänä reaktioalustana käytetään ^ ., esimerkiksi reaktiokyvetin sisäpintaa tai latex- ’ mikropartikkeleita. Määrityksen vaste on lineaarinen kun . näissä määrityksissä käytetään analyyttiin Ag nähden ylimäärää primääri- ja sekundäärireagenssia. Immunologiassa 30 tällaisia määrityksiä nimitetään immunometrisiksi määrityksiksi. Myös DNA- ja RNA-määrityksiä voidaan suorittaa tämän saman periaatteen mukaisesti.

2 104585 Tämän keksinnön mukainen menetelmä liittyy erityisesti kansainvälisissä patenttihakemusjulkaisuissa WO 96/22531 ja WO 96/27798 esitettyjen menetelmien parantamiseen.

Kummassakin julkaisussa on esitetty biospesifinen 5 määritysmenetelmä, jolla saadaan signaali hyvin pienestä ja valon diffraktion rajoittamasta lasersäteen kohdistustilavuudesta, kun tässä kohdistustilavuudessa on fluoresoivalla väriaineella leimattu molekyyli tai mikropartikkeli, jonka pintaan on liittynyt edellä mainittu 10 molekyyli. Kumpikin menetelmä soveltuu bioaffiniteettireaktion kineettiseen seurantaan, sillä näiden menetelmien erityinen ominaisuus on se, että ne pystyvät erottamaan kompleksien AbAgAb* antaman fluoresenssisignaalin liuoksessa vapaana olevien 15 leimattujen reagenssien antamasta fluoresenssisignaalista eikä vapaan ja sitoutuneen leiman erotusta silloin tarvita.

Hakemus julkaisussa WO 96/22531 esitetty menetelmä perustuu latex-mikropartikkelien käyttämiseen kiinteänä reaktioalustana. Tällöin kompleksien AbAgAb* antaman 20 fluoresenssisignaalin selektiivinen mittaus perustuu esimerkiksi siihen, että kohdistustilavuuteen ajautunut mikropartikkeli havaitaan sen antaman valon sironnan tai sisäisen fluoresenssin perusteella ja samanaikaisesti ' mitataan siihen liittyneiden fluoresoivien leimojen Ab* 25 antama signaali.

Hakemus julkaisussa WO 96/27798 esitetyssä biospesifisessä määritysmenetelmässä primäärireagenssi ja sekundääri-reagenssi on leimattu erilaisilla fluoresoivilla *> väriaineilla D ja F. Bioaffiniteettireaktiossa muodostuu 30 reaktiotuotteeksi komplekseja AbDAgAbr . Tässä menetelmässä % yksittäisten kompleksien fluoresenssisignaalin selektiivinen mittaus perustuu siihen, että kohdistustilavuuteen ajautunut molekyyli havaitaan leimoista D ja F saatujen fluoresenssisignaalien ajallisen korrelaation perusteella. 1 Näissä edellä mainituissa menetelmissä 3 104585 kohdistustilavuudesta saadut signaalit ovat heti reaktion alkuhetkestä alkaen suoraan verrannollisia mikropartikkelien pinnalle tai reaktioliokseen muodostuneiden kompleksien AbAgAb1 tai AbDAgAbF 5 pitoisuuteen. Näitä reaktiotuotteita merkitään jäljempänä yksinkertaisuuden vuoksi myös symbolilla AbAgAb, jossa ensimmäinen Ab tarkoittaa primäärireagenssia ja toinen Ab tarkoittaa sekundäärireagenssia. Kumpikin tai vain toinen näistä reagensseista voi olla leimattu. Tässä tekstissä 10 käytetyt symbolit Ag, Ab, AbD, AbF, ja Ab1 tarkoittavat yleisesti biospesifisiä molekyylejä, eivätkä ne rajoitu immunologisiin vasta-aineisiin ja antigeeneihin.

Määrityksen signaalivasteella R tarkoitetaan leimasta saadun signaali-intensiteetin I arvoa analyytin pitoisuuden 15 P funktiona. Signaali-intensiteetillä I tarkoitetaan leimasta saadun signaalin intensiteetin arvoa määrätyllä hetkellä t. Signaalivasteen huippupisteellä tarkoitetaan pistettä, jossa määrityksen signaalivaste eli standardikäyrä saa suurimman arvonsa (piste H kuvassa 5).

20

Tavanomaisten määritysmenetelmien ongelmana on niiden monivaiheisuus ja dynamiikan rajautuminen reagenssien pitoisuutta alempiin arvoihin. Esimerkiksi hormonin ’ määritys verestä fluorometrisellä immunometrisellä määri- 25 tyksellä edellyttää monta työvaihetta: solujen erottaminen seerumista, seeruminäytteen annostelu ja laimennus, inkubointi kiinteän faasin kanssa, seerumin poistaminen kyvetistä pesulla, inkubointi leimatun reagenssin kanssa, vapaan leiman erottaminen pesulla, mittausliuoksen 30 lisääminen ja signaalin mittaaminen.

Edellisessä esimerkissä reagenssit on lisättävä reaktiokyvettiin kahdessa eri vaiheessa ja välillä on suorittava kyvetin pesu. Kaksivaiheisuuden ja ensimmäisen pesun tarkoituksena on ensisijaisesti rajoittaa määrityksen 35 signaalivaste kiinteän faasin sitomiskapasiteettiä 4 104585 vastaavaan arvoon. Tämä on tarpeellista, koska yksivaiheisessa määrityksessä signaalivaste R kääntyisi laskusuuntaan analyytin pitoisuuden P ylittäessä primäärireagenssin sitomiskyvyn. Kun mitattavan analyytin 5 Ag pitoisuus ylittää reagenssien sitomiskapasiteetin, muodostuu reaktiotuotteeksi kompleksin AbAgAb lisäksi myös kompleksia AgAb sekundäärireagenssin Ab ja ylimääräksi jääneen analyytin Ag pitoisuuksien suhteessa. Mitä suurempi ylimäärä analyyttiä Ag on primäärireagenssin sitomiskykyyn 10 verrattuna, sitä pienemmäksi määrityksen signaalivaste R jää. Tätä haitallista ilmiötä, joka on mahdollinen ainoastaan silloin, kun kaikki reaktiokomponentit lisätään samanaikaisesti, nimitetään kirjallisuudessa "hook-efektik-si". Hook-efektistä johtuen järjestelmän vaste ei ole 15 yksiselitteinen ja sen vuoksi on ollut tavanmukaista rajoittaa järjestelmän mitta-alue (dynamiikka) primääri- ja sekundäärireagenssien kapasiteettia vastaavaksi sekä varmistaa mahdollisten väärien tulosten syntyminen siten, että kun analyytti on reagoinut primäärireagenssin kanssa, 20 mahdollinen ylimäärä erotetaan reaktioliuoksesta jollakin sopivalla tavalla. Silloin kun toinen reagensseista on kytketty kiinteään faasiin kuten esimerkiksi kyvetin pintaan, on yleisin erotusmenetelmä kyvetin pesu.

Hook-efektistä johtuva väärien tulosten mahdollisuus on 25 estänyt yksivaiheisten määritysten laajamittaisen käytön, vaikka rutiinidiagnostiikassa on tarve yksinkertaisemmasta ja käyttökustannuksiltaan halvemmasta analytiikasta.

Tämän keksinnön mukaisella uudella menetelmällä voidaan toteuttaa yksivaiheinen määritysmenetelmä, jolla 30 yksivaiheisuuden lisäksi on paljon laajempi mitta-alue kuin * tavanomaisilla monivaiheisilla määrityksillä ilman, että hook-efektistä aiheutuisi väärien tulosten vaaraa.

Keksinnölle on luonteenomaista, että käytettävä 35 mittausmenetelmä pystyy optisesti erottamaan reaktiossa muodostuneiden kompleksien AbAgAb antaman signaalin vapaana olevan leimatun reagenssin antamasta signaalista. Lisäksi 5 104585 tälle keksinnölle on luonteenomaista, että näyte ja primääri- ja sekundäärireagenssit lisätään samanaikaisesti reaktiokyvettiin ja reaktiotuotteen antamaa signaali-intensiteettiä seurataan reaktion alkuhetkestä lähtien ajan 5 funktiona. Tätä kutsutaan jäljempänä kineettiseksi mittaukseksi. Kineettisellä mittauksella voidaan saada tietoa analyytin pitoisuudesta, ennenkuin reaktio on edennyt lähellekään tasapainotilaa. Signaali-intensiteetin kasvunopeus dl/dt on verrannollinen analyytin pitoisuuteen 10 P ja siitä voidaan jo reaktion alkuvaiheessa ennustaa likimääräisesti analyytin pitoisuus ja erityisesti se, onko analyytin pitoisuus korkeampi kuin reagenssien sidontakyky. Kineettinen mittaus antaa siis tiedon siitä, muodostuuko reaktiotasapaino standardikäyrän huippupisteen H vasemmalle 15 vai oikealle puolelle (kuva 5). Kun tämä tieto saadaan reaktiokinetiikasta, voidaan sallia myös kiinteän faasin sidontakykyä suuremmat analyyttipitoisuudet ja mitata korkeampia analyytin pitoisuuksia kuin tavanomaisilla määritysmenetelmillä ilman väärien tulosten mahdollisuutta. 20 Järjestelmän mitta-aluetta voidaan siis kasvattaa näin huomattavasti. Esimerkiksi normaali 3 kertaluvun dynamiikka on keksinnön mukaisella menetelmällä kasvatettavissa jopa 5-6 kertaluvun dynamiikaksi. Mikäli dynamiikan laajentamisen tarvetta ei ole, tarjoaa tämä menetelmä . 25 mahdollisuuden reagenssien pitoisuuksia alentamalla optimoida määrityksen mitta-aluetta halutulla tavalla.

Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksesta 1. Keksinnön mukaiselle menetelmälle ovat luonteenomaista seuraavat vaiheet: - v 30 - Tunnettuja standardinäytteitä käyttämällä määritetään kaksi standardikäyrää määrityksen kalibroimiseksi.

< Ensimmäinen standardikäyrä g = g(P) ilmaisee määrityksen signaali-intensiteetin I kasvunopeuden dl/dt määrättynä aikavälinä ti + At analyytin pitoisuuden P funktiona. Toinen 35 standardikäyrä ilmaisee määrityksen signaalivasteen R(t2,P) arvon tietyn reaktioajan t2 päätyttyä analyytin pitoisuuden 6 104585 P funktiona.

- Tuntemattomia näytteitä mitattaessa rekisteröidään määrityksen signaali-intensiteetti I ajan funktiona ja määritetään signaali-intensiteetin I kasvunopeutta kuvaava 5 parametri g. Tämän lisäksi rekisteröidään signaalivaste R(P) tietyn reaktioajan päätyttyä.

- Kun reaktio on edistynyt lähelle tasapainoa, määritetään standardikäyrän g = g(P) käänteisfunktiosta P = P(g), onko tuntemattoman näytteen pitoisuus P pienempi, likimain 10 yhtäsuuri vai suurempi kuin kiinteän faasin pitoisuus q.

Jos P < q , luetaan näytteen pitoisuus P standardikäyrältä P = P(R), jos P = q , luetaan näytteen pitoisuus P standardikäyrältä P = P(g) ja jos P > q, luetaan näytteen pitoisuus P jommaltakummalta standardikäyrältä.

15

Esimerkki 1

Keksintöä kuvataan seuraavassa lähemmin sovellus-esimerkillä, jota varten on tuotettu kuvissa 1-6 esitetyt 20 reaktiokaaviot, reaktioyhtälöt, standardikäyrät ja signaali-intensiteettikäyrät matemaattisella mallinnuksella.

Esimerkkinä keksinnön soveltamisesta esitämme määrityksen, jossa käytetään kiinteään faasiin sidottua biospesifistä 25 reagenssia. Kuvassa 1 on esitetty määrityksen reaktio-kaavio. Reaktion lähtökomponentit ovat kiinteään faasiin kiinnitetty biospesifinen reagenssi Ab, analyytti Ag ja leimattu reagenssi Ab*. Komponentit Ab, Ag ja Ab* lisätään samanaikaisesti. Kuvassa 2 on esitetty reaktioyhtälöt /· 30 (kaavat 1-4), josta käy ilmi kaikki mahdolliset reaktiot ja tuotteet. Kirjaimilla k on merkitty reaktioiden assosiaatio- ja dissosiaationopeusvakioita. Näiden reaktioiden reaktionopeudet ovat luonnollisesti hyvin erilaiset. Nestefaasissa tapahtuvat reaktiot ovat nopeita 35 ja kiinteän faasin yhteydessä tapahtuvat reaktiot ovat hitaampia. Tätä esimerkkiä varten on reaktiovakioille valittu arvot, jotka ovat tyypillisiä näissä määrityksissä.

7 104585

Biospesifisten reagenssien Ab ja Ab* tasapaiiiovakioksi (affiniteetiksi) on valittu K = 1-1010 L/mol.

Eri reaktioiden assosiaationopeuksiksi on valittu kj = 1*107 L mol'1 s'1 5 k3 = 1*109 L mol"1 s'1 k3 * 1·107 L mol"1 s"1 k7 = 1*107 L mol'1 s'1

Koska kdi„ = kass / K , saadaan dissosiaatiovakioille vastaavasti seuraavat arvot 10 k2 = 1*10'3 mol"1 s"1 k4 = 1Ί0'1 mol"1 s'1 k6 = 1*1 O'3 mol"1 s'1 k8 = 1*10"3 mol"1 s'1

Lisäksi on oletettu, että kiinteässä faasissa A olevan 15 reagenssin Ab pitoisuus q = 1·10*9 mol/L ja leimatun reagenssin Ab* pitoisuus q* = 1·10"9 mol/L.

Nämä reaktioyhtälöt on kirjoitettu yksinkertaisuuden vuoksi vastaamaan liuoksessa tapahtuvia reaktioita eikä kiinteän faasin kanssa tapahtuvan reaktion edellyttämää . 20 diffuusioaikaa ole erikseen huomioitu. Diffuusiosta johtuvien konsentraatiogradienttien vaikutus esitettävän mallin lopputulokseen ei ole merkittävä, koska kiinteä faasi on suspensiossa tasaisesti jakautuvien mikropartikkeleiden muodossa ja keskimääräiset 25 diffuusioetäisyydet ovat lyhyitä. Pelkistäen on vain ” oletettu, että kiinteän faasin kanssa tapahtuvien reaktioiden assosiaationopeudet ja dissosiaationopeudet ovat kaksi kertalukua pienemmät kuin liuoksessa tapahtuvien reaktioiden vastaavat nopeudet. Tämä olettamus sisältää 30 diffuusiosta aiheutuvan hitauden kiinteän faasin kanssa tapahtuvissa reaktioissa.

Kuvassa 2 on esitetty reaktioyhtälöistä johdetut differen-

• I

8 104585 tiaaliyhtälöt (kaavat 5 - 10), joiden ratkaisu kuvaa reaktiokinetiikan. Muuttujien xL merkitys on annettu kaava-ryhmässä 11 ja termien yksiköt kohdassa 12. Näiden differentiaaliyhtälöiden ratkaisu on mahdollista ainoastaan 5 numeerisesti, ja olemme käyttäneet niiden ratkaisemiseen Mathcad 6.0+ matematiikkaohjelman (Matsoft Inc., Cambridge,

Mass, USA). Tämän matemaattisen mallin avulla voidaan reaktiokinetiikkaa ja eri reaktiokomponenttien kulumista ja muodostumista mallintaa kaikilla mahdollisilla reaktioon 10 vaikuttavilla lähtöarvoilla.

Kuvat 3 ja 4 esittävät määrityksen reaktiokinetiikkaa eli signaali-intensiteettien arvoa ajan funktiona. Koska tässä mallissa käyttöön otetut reaktionopeusvakiot ovat esimerkin luonteisia, on myös aika-akseli ymmärrettävä suhteellisena 15 aika-akselina. Signaali-intensiteetti on suoraan verrannollinen reaktiossa syntyneen tuotteen AbAgAb* pitoisuuteen. Kuva 3 esittää hetkellistä signaali-intensiteettiä ajan t funktiona. Kuva 4 esittää aikavälillä 0 - t integroitua signaali-intensiteettiä ajan t funktiona.

20 Integraalin käyttö parantaa mittauksen signaali- kohinasuhdetta. Kuvissa 3 ja 4 on esitetty signaali-intensiteettikäyrät erilaisille analyytin pitoisuuksille: a) 10"11 mol/L, b) 10'10 mol/L, c) 10~9 mol/L, d) 10’8 mol/L ja : e) 10'7 mol/L. Kuva 5 esittää määrityksen 25 signaalivastekäyrän eli standardikäyrän, joka ilmaisee reaktiossa syntyneen tuotteen AbAgAb* pitoisuuden R analyytin Ag pitoisuuden P funktiona. Määrityksen vastekäyrän huippupiste on merkitty kuvaan merkillä H.

* w

Kuvasta 3 ilmenee, että signaali-intensiteetin nousunopeus 30 on suoraan verrannollinen analyytin Ag pitoisuuteen P eli korkeammilla analyytin pitoisuuksilla saavutetaan korkeampi signaali-intensiteetti määrätyssä ajassa. Kun reaktio lähestyy tasapainoa, kaareutuvat signaali-intensiteettikäyrät asymptoottisesti tasapainoarvoa kohti 35 (käyrät a, b ja c). Kun analyytin pitoisuus P ylittää 104585 .

9 kiinteän faasin sitomiskyvyn q eli tässä esimerkkitapauksessa pitoisuuden 10'9 mol/L, nousee signaali-intensiteetti alussa hyvin nopeasti (käyrät d ja e), mutta hakeutuu sitten tasapainoarvoon, joka vastaa 5 signaali-intensiteettiä alemmalla analyyttipitoisuudella.

Kuvan 4 käyräparvi esittää aikavälillä 0 - t integroitua kokonaisignaali-intensiteettiä ajan t funktiona eri analyytin pitoisuuksilla. Tässä tapauksessa käyrien a, b, c, d ja e kaareutuminen on loivempaa.

10

Kuvissa 3 ja 4 esitetyissä käyrissä ilmenee edellä mainittu hook-efekti siten, että kiinteän faasin sitomiskykyä suuremmilla analyytin pitoisuuksilla signaali-intensiteetti jää määrätylle tasolle, joka on sitä alempi mitä korkeampi 15 analyytin pitoisuus on. Lisäksi reaktiotasapaino saavutetaan nopeasti.

Signaali-intensiteetin kasvu ja mahdollinen hook-efekti voidaan ennustaa rekisteröimällä signaali-intensiteetin kasvunopeus dl/dt eri ajan hetkillä t. Kun reaktio 20 saavuttaa tasapainon, signaali-intensiteetin kasvunopeus alenee nollaksi. Sitomiskykyä suuremmilla analyytin pitoisuuksilla tämä reaktiotasapainon tila saavutetaan aikaisemmin kuin sitomiskykyä pienemmillä analyytin .- pitoisuuksilla. Sovittamalla kasvunopeuden käyrään 25 ensimmäisen tai korkeamman asteen polynomifunktio tai jokin muu funktio tietyllä aikavälillä, voidaan sovituksen parametreistä määrittää analyytin pitoisuusalue. Signaali-intensiteetin kasvunopeuden tarkastelu on yksinkertainen ja kohinasietoinen menetelmä. Sovitus voidaan luonnollisesti - .’ 30 tehdä joko lineaarisella tai logaritmisella asteikolla.

Lineaarisella asteikolla signaali-intensiteetin kasvunopeudesta dl/dt voidaan päätellä analyytin pitoisuus suoraan.

Esimerkkiluonteisesti on kuvissa 3 ja 4 käyriin a ja d ·; 35 sovitettu logaritmisella asteikolla ja aikavälillä t = 0 - 300 s ensimmäisen asteen funktiot eli suorat, joita on 10 104585 merkitty vastaavasti aa ja dd. Näitä regressiosuoria merkitään matemaattisesti log[R(t)]= g log(t) + c , jossa R(t) on ajasta riippuva signaalivaste, g on regressiosuoran kulmakerroin, joka ilmentää reaktionopeutta ja c on vakio, 5 joka ilmentää signaalivasteen arvoa hetkellä t * 1 s. Vakio c kuvaa siis myös analyytin pitoisuutta.

Mittauslaitetta standardisoitaessa tunnetuilla standardinäytteillä voidaan määrittää edellä selostetut kineettiset signaalivasteet analyytin Ag eri pitoisuuksille 10 ja näille signaalivasteille sen jälkeen yllä määritellyt regressiosuorat. Tulokseksi saadaan suoraparvi, joiden kulmakertoimet muuttuvat analyytin Ag pitoisuuden funktiona analyytin pitoisuuden ylittäessä huippupistettä vastaavan pitoisuuden. Tämän suoraparven kulmakertoimiin voidaan 15 sovittaa funktio. Esimerkki tällaisesta kuvan 4 integraalikäyriin sovitetusta funktiosta on esitetty kuvassa 6. Tästä käyrästä todetaan, että määrityksen vastealueella huippupisteeseen asti kulmakertoimilla on sama arvo, mutta kun Ag:n pitoisuus ylittää huippupisteen, 20 laskee kulmakertoimen g arvo voimakkaasti.

Tuntemattoman näytteen tullessa mittaukseen, seurataan sen signaalivastetta tai signaalivasteen integraalia reaktion edistyessä lähelle tasapainotilaa edellä esitetyllä tavalla ja määritetään lopulta regressiosuoran kulmakertoimen arvo. 25 Lukemalla kuvan 6 esittämästä käyrästä tätä kulmakerrointa vastaava näytteen pitoisuus, voidaan todeta ensimmäiseksi, onko tuntemattoman näytteen pitoisuus pienempi vai suurempi kuin huippupistettä vastaava analyytin pitoisuus. Jos pitoisuus todetaan pienemmäksi, luetaan tuntemattoman 30 näytteen pitoisuus valitun reaktioajan kuluttua normaalilla tavalla kuvassa 5 esitetyltä standardikäyrältä P = P(R).

Jos pitoisuus todetaan olevan huippupisteen alueella, luetaan tuntemattoman näytteen pitoisuus kuvassa 6 esitetyltä käyrältä P = P(g). Jos pitoisuus todetaan olevan ^ · 35 huippupisteen yläpuolella, voidaan tuntemattoman näytteen pitoisuus lukea joko kuvan 5 tai kuvan 6 esittämiltä 11 104585 käyriltä.

Edellä esitetyssä esimerkissä käytetty ensimmäisen kertaluvun lineaarinen sovitus intensiteetin kasvukäyriin on esimerkin omainen. On selvää että standardikäyrän P = 5 P(g) määritykseen voidaan käyttää myös muita matemaattisia tulkintamenetelmiä. Esimerkiksi sovitettaessa kineettisiin mittauskäyriin korkeamman asteen polynomeja, kuvaavat polynomien kertoimet reaktion etenemistä. Kertoimia tarkastelemalla voidaan muodostaa järjestelmälle 10 tarvittavat vastekäyrät.

Esimerkki 2

Edellä on jo todettu, että tämän keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erityisesti sellaisiin määrityksiin, joissa pystytään seuraamaan suoraan kompleksien 15 muodostumista niihin sitoutuneen leiman antaman signaalin avulla ja joissa reaktioliuoksessa oleva vapaa leima ei anna merkittävää signaalia. Seuraavassa kuvataan esimerkki tällaisesta määrityksestä.

Määrityksessä käytetään fluoresoivalla molekyylillä 20 leimattua biospesifistä sekundäärireagenssia ja primäärireagenssilla päällystettyjä latex-mikropartikkeleita kiinteänä faasina. Mikropartikkelien joukkoon lisätään määritettävä näyte ja biospesifinen sekundäärireagenssi, jonka jälkeen alkaa bioaffiniteetin 25 vaikutuksesta mikropartikkelien pinnalla oleviin reagenssimolekyyleihin sitoutua analyyttimolekyylin ja - leimatun biospesifisen reagenssin muodostamia komplekseja.

Mikropartikkelisuspensioon kohdistetaan valonsäde, jonka kohdistustilavuus rajoittuu jyrkästi ja on esimerkiksi 30 diffraktion rajoittama, jonka vuoksi tämä valonsäde voi kohdistua ainoastaan yhteen mikropartikkeliin kerrallaan. Suspension liikkeen vuoksi mikropartikkelit ajautuvat ·· kohdistustilavuuteen ja siitä ulos. Mikropartikkelin pinnalla oleva väriaine virittyy ja sen emission voimakkuus 12 104585 mitataan fotoni-ilmaisimella, jonka antaman sähköisen signaalin voimakkuus ajan funktiona on verrannollinen reaktion etenemisnopeuteen ja kyseessä olevan analyytin pitoisuuteen.

5 Tällainen menetelmä voidaan toteuttaa erityisesti siten, että käytetään kiinteänä faasina mikropartikkeleita ja niihin sitoutuva fluoresoiva leima viritetään konfokaalisesti tai kaksoisfotonivirityksellä, jolloin fluoresenssin viritys ja ilmaisu pystyvät optisesti 10 erottamaan lasersäteen kohdistuspisteessä olevan mikropartikkelin lähettämän valoemission sen ympäristössä olevan vapaan leimatun reagenssin lähettämästä signaalista, eikä vapaana olevista leimoista synny merkittävää signaalia. Tässä menetelmässä fluoresenssin viritykseen 15 käytettävä lasersäde voidaan kohdistaa suoraan reaktiokyvetin läpinäkyvän seinämän läpi reaktiosuspensioon. Fluoresenssisignaali voidaan saada aina, kun mikropartikkeli ajautuu diffuusion tai nesteen liikkeen takia kohdistustilavuuteen. Mittauksen 20 nopeuttamiseksi kyvetissä oleva suspensio voidaan panna myös muulla tavalla liikkeeseen tai kyvettiä voidaan liikuttaa tai pyörittää sopivalla nopeudella. Samalla saadaan signaaleja, joiden amplitudi on suoraan verrannollinen kyseessä olevaan mikropartikkeliin kyseessä olevalla 25 hetkellä sitoutuneiden leimattujen kompleksien määrään.

Näin pystytään seuraamaan reaktion kineettistä edistymistä aina tasapainotilaan saakka fluoresenssin intensiteetin perusteella. Vaadittava tilastollinen tarkkuus saavutetaan, kun mikropartikkeleita havainnoidaan tilastollisesti 30 riittävän suuri määrä. Signaalivasteen mittaustulokset suhteutetaan standardinäytteillä suoritettuihin mittauksiin, joiden perusteella tuntemattomien näytteiden pitoisuudet lasketaan.

= Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset 35 sovellutusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten puitteissa.

Claims (4)

13 104585

1. Biospesifinen määritysmenetelmä, jossa analyytti ja leimattu sekundäärireagenssi lisätään samanaikaisesti primäärireagenssin kanssa reaktiokyvettiin, jossa muodostuu edellä mainittujen komponenttien reaktiotuotetta ja jossa 5 käytetään sellaista leiman antaman signaalin ilmaisumenetelmää, joka pystyy erottamaan reaktiotuotteesta lähteneen signaalin liuokseen vapaaksi jääneen leiman antamasta signaalista ja joka rekisteröi reaktiotuotteeseen sitoutuneen leiman antaman signaali-intensiteetin ajan 10 funktiona, tunnettu siitä, että - reaktion alkuvaiheessa rekisteröidään reaktiotuotteessa olevan leiman antaman signaali-intensiteetin kasvunopeutta kuvaava parametri g yhdellä tai useammalla ajanhetkellä tai 15 aikavälillä ennen reaktiotasapainon saavuttamista ja - leimatun reaktiotuotteen signaalivaste R mitataan tietyn reaktioajan päätyttyä ja - analyytin pitoisuus P määritetään ennakolta määritettyjen standardikäyrien P(R) tai P(g)avulla siitä riippuen, onko 20 analyytin pitoisuus P primäärireagenssin pitoisuutta alhaisempi vai korkeampi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että signaali-intensiteetin kasvunopeus määritetään sovittamalla ajan funktiona mitattuun signaali- 25 intensiteetin käyrään polynomifunktio ja polynomifunktion kertoimista määritetään analyytin pitoisuus. „ : 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sovitettava funktio on ensimmäisen asteen funktio ja funktion kulmakertoimesta luetaan analyytin 30 pitoisuus.

4. Patenttivaatimuksien 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leimana käytetään fluoresoivaa leimaa ja leiman antaman signaalin mittausmenetelmä perustuu joko 14 104585 kaksoisfotoniviritykseen tai konfokaaliseen optiikkaan. • · [ • "S * 15 104585