KR20190087983A - 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 항원의 정량 분석용 디바이스, 및 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법 - Google Patents

항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 항원의 정량 분석용 디바이스, 및 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 표적 항원을 포함하는 분석 시료, 표적 항원과 항원 항체 반응하는 제1 항체가 고정된 자성 입자 및 제1 항체와 상이한 제2 항체가 고정된 비즈를 혼합하는 단계, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 혼합된 분석 시료를 적하하는 단계, 자력 인가부를 포함하는 디지털 직시 현미경 기반의 검출기에 항원의 정량 분석용 마이크로 칩을 도입하여, 자력 인가부에 자력을 인가하는 단계, 및 검출기에 의해 획득된 이미지를 이용하여 비즈를 검출함으로써, 표적 항원의 수를 계수하는 단계를 포함하는, 항원의 정량 분석 방법을 제공한다.

Description

항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 항원의 정량 분석용 디바이스, 및 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법
본 발명은 분석 시료에 존재하는 표적 항원의 검출을 용이하게 수행할 수 있도록 구성된 채널을 포함하는 항원의 정량 분석용 마이크로 칩과 마이크로 칩에 검출된 표적 항원을 계수하여 정량 분석하도록 구성된 항원의 정량 분석용 디바이스와, 이를 이용한 표적 항원의 검출 방법에 관한 것이다.
바이러스 감염에 의한 질환을 진단하기 위한 방법으로는 항원 분석법이 있다. 구체적으로 항원 분석법은 바이러스에서 유래된 항원을 인식하는 항체를 이용하여 면역 반응을 유도함으로써, 표적 항원을 검출하고 이를 통해 바이스러에 의해 매개되는 질환의 진단을 가능하게 한다. 질환의 정확한 진단과 치료 효과의 모니터링에 있어서 바이러스에 대한 항원의 존재 유무를 분석하는 정성 분석뿐만 아니라, 대상 샘플 내에서 존재하는 항원의 양을 측정하는 항원의 정량 분석이 중요할 수 있다.
한편, 랩온어칩 기술을 적용한 소형화된 분석 마이크로 칩과 이를 이용한 진단 방법이 개발됨에 따라, 대상 샘플 내의 항원의 정량 분석을 보다 빠르게 수행할 수 있게 되었다. 이러한 마이크로 칩의 미세채널 내벽에는, 항원과 같은 표적 물질에 특이적인 항체 등의 프로브 (probe) 가 고정되어 있음에 따라, 채널 내에 부유하는 표적 물질을 검출할 수 있게 된다. 이때, 프로브에는 형광 표지가 되어있어, 화학적으로 처리된 표적 물질에 대한 형광량, 발광량, 흡광량 또는 산란광량을 검출하고 검출되는 신호의 평균 강도를 정량화 함으로써, 마이크로 칩 상에 검출된 표적 물질의 정량 분석이 가능해진다.
그러나, 분석 시료의 이동을 유발하는 주요 구동력이 모세관력인 마이크로 칩은 미세채널의 상하 내벽과 유체와의 상호작용에 의한 작용력, 미세채널의 좌우 내벽과 유체와의 상호작용에 의한 작용력이 상이할 수 있다. 이에, 채널에 의해 형성된 공간을 흐르는 분석 시료는 불규칙적이고 불균일한 이동 패턴을 가지게 된다. 이러한 분석 시료의 이동 패턴은, 분석 시료 내의 항원과 채널에 고정된 항체 간의 항원 항체 반응 효율의 저하, 나아가 항원 항체 반응에 의해 형성된 면역 복합체에 대한 검출의 민감도의 저하를 야기할 수 있다. 따라서, 분석 시료에 항원이 미량으로 존재할 경우, 이에 대한 정량 분석 결과는 신뢰도가 떨어지게 된다.
또한, 마이크로 칩 상에 검출되는 신호의 평균 강도를 정량화함으로써 검출된 항원을 정량 분석하는 방법은, 검출 센서의 감도에 따라 추정치의 정밀도가 상이할 수 있어, 정확도를 유지하기 위해 민감한 센서 교정이 요구될 수 있다. 이에, 회로의 복잡성, 단가 상승 등의 새로운 문제점이 야기될 수 있다. 또한, 이상의 정량 분석 방법은 채널 내에서 항원과 결합되지 않은 형광 표지 프로브, 또는 표적 항원과 결합되었으나 칩 내에 고정되지 않고 부유하는 형광 프로브-표적 항원 복합체에서 유래한 신호 검출에 의한 분석 오류를 발생시킬 수 있다.
이에 따라, 마이크로 칩을 이용한 질환의 정밀 진단, 나아가 치료의 모니터링을 위해, 질환 특이적 항원의 검출에 대한 민감도가 향상된 새로운 항원의 정량 분석 방법에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 발명의 발명자들은 자력, 및 광학적 표지가 없고 계수 가능한 크기를 갖는 비즈를 항원 정량 분석에 이용함으로써, 종래의 항원 분석 방법에서 발생되는 문제점을 해결할 수 있음을 인식하였다.
그 결과, 본 발명의 발명자들은 표적 항원을 매개로 면역 복합체를 형성하는, 자성 입자 및 계수 가능한 크기의 비즈를 이용한, 새로운 항원의 정량 분석 방법을 개발하기에 이르렀다.
구체적으로, 본 발명의 발명자들은, 표적 항원, 자성 입자 및 비즈의 항원 항체 반응에 의해 형성된 면역 복합체를 민감도 높게 검출할 수 있도록, 채널 내에 웰 (well) 이 형성된, 유체 항력 및 자력 기반의 항원의 정량 분석용 마이크로 칩을 개발하였다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 채널의 일 면에서 회전하여 이동하고, 광학적으로 계수 가능한 비즈의 크기를 발견할 수 있었다. 또한, 본 발명의 발명자들은, 자력을 인가하여 마이크로 칩에 형성된 웰에 면역 복합체가 효과적으로 포획되도록 구성되고, 넓은 분석 범위로 마이크로 칩 내에 포획된 면역 복합체의 비즈를 광학적으로 계수함으로써 신속하고 정밀도 높게 항원을 정량 분석할 수 있는, 디지털 직시 현미경 기반의 항원의 정량 분석용 디바이스를 개발하였다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 유체 항력 및 자력 기반의 항원의 정량 분석용 마이크로 칩, 및 디지털 직시 현미경 기반의 항원의 정량 분석용 디바이스를 이용함으로써, 높은 정밀도로 분석 시료 내의 항원을 정량 분석할 수 있는, 항원의 정량 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 유체 항력 및 자력을 기반으로 분석 시료를 유동시키고, 웰이 형성되어 효과적으로 항원을 포획하여 정량 분석이 용이한, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 디지털 직시 현미경 기반으로 하고, 이에 넓은 분석 범위를 가져 신속한 분석이 가능하며, 형광 표지 물질을 이용하지 않는 마이크로 칩 내에 검출된 항원을 효과적으로 계수할 수 있는, 항원의 정량 분석용 디바이스를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 동일한 표적 항원에 대하여 서로 상이한 단 클론 항체가 각각 부착된 자성 입자 및 비즈의 면역 반응을 이용하여, 적은 양의 분석 시료로부터 극미량의 항원을 검출할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 광학적으로 계수 가능한 비즈의 크기를 제공함에 따라, 형광 표지된 프로브의 이용 없이도 광학적으로 항원의 정량 분석이 가능한, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩, 항원의 정량 분석용 디바이스 및 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명은 유체 항력 및 자성을 이용함에 따라, 모세관력을 주요 구동력으로 하는 종래의 마이크로 칩이 갖는 단점을 해결할 수 있는 효과가 있다. 이에, 본 발명은 항원 항체 반응에 의해 형성된 면역 복합체에 대하여 높은 검출 민감도를 갖는, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩, 항원의 정량 분석용 디바이스 및 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
특히, 채널 내에 웰이 형성된 항원의 정량 분석용 마이크로 칩은, 자력이 인가됨에 따라 자성 입자를 포함하는 면역 복합체를 효과적으로 마이크로 칩 내에 포획할 수 있다. 나아가, 웰에 의해 서로 응집된 면역 복합체는 분리될 수 있고, 그 결과 하나의 웰에 하나의 면역 복합체가 보획될 수 있다. 이에, 본 발명은 마이크로 칩 내에 부유하는 표적 항원을 높은 정확도로 검출할 수 있고, 고정된 표적 항원에 대한 광학 분석 또한 용이할 수 있다.
또한, 본 발명은 복수개의 표적 항원에 대하여 각각 다른 형상으로 나타나도록 비즈의 크기, 모양 등을 조절하고, 이에 따른 마이크로 칩 내의 웰의 크기를 조절함으로써, 복수개의 표적 항원에 대하여 동시 항원검사를 수행할 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명은 두 개의 다른 역할을 하는 입자를 3차원 적으로 활용한 하여 체적대비 넓은 표면적에 항체를 고정화한 면역 복합체를 이용함으로써 면역반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 이에, 본 발명은 낮은 농도의 표적 항원 및 표적 물질을 효과적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 개략적인 평시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 디바이스의 구성을 도시한 개략적인 분해 사시도이다.
도 3a은 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 디바이스를 이용한, 항원의 정량 분석 방법의 절차를 도시한 것이다.
도 3b는 항원의 정량 분석 방법에서, 분석 시료, 자성 입자 및 비즈를 혼합하는 단계를 예시적으로 도시한 것이다.
도 3c 및 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 개략적인 측면도 및 표적 항원의 검출 과정을 설명하기 위한 요부 확대도이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내의 검출 채널을 예시적으로 도시한 것이다.
도 3f 내지 3h는 항원의 정량 분석 방법에서, 이미지 센서부에 의해 획득된, 면역 복?d체의 그림자 이미지를 재구성하여 표적 항원의 수를 계수하는 단계를 예시적으로 도시한 것이다.
도 4a 내지 4c는 표적 항원의 농도에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내 내의 검출 채널을 예시적으로 도시한 것이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법을 평가하기 위한, 실험실적 수준의 면역 반응 실험 결과를 도시한 것이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법의 신뢰도 평가를 위한, 마이크로 칩 내의 면역 반응 실험 결과를 도시한 것이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법에 따른, 표적 항원의 정량 분석 결과를 도시한 것이다.
발명의 이점, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 면역반응을 통해서 항원을 검출하는 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우, '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.
본 명세서의 해석의 명확함을 위해, 이하에서는 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "정량 분석"은 물질을 구성하는 양적 관계를 명확하게 하는 분석법을 의미한다. 본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 항원의 정량 분석 방법이 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스를 이용한, 본 발명의 항원의 정량 분석 방법에 따르면, 검출 채널에 포획된 면역 복합체를 계수함에 따라, 표적 항원의 검출 및 정량 분석이 가능할 수 있다. 질환 특이적인 항원과 같은 표적 항원의 정량 분석은, 질환에 대한 정밀 진단을 제공하고, 질환의 치료 효과를 모니터링하는 것에 있어서 중요할 수 있다.
이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩은 항원의 정량 분석에 이용될 수 있다.
구체적으로, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내부에는, 상부면 및 하부면으로 구성된 바디부에 의해 유체가 연통하는 채널이 형성될 수 있다.
이때, "채널"은 상부면 및 하부면 사이에 형성된 미세채널을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩은 복수의 채널을 포함하며 각각의 채널들은 그 기능에 따라, 투입 채널, 검출 채널로 분리되어 명명될 수 있다. 예를 들어 투입 채널은 분석 시료가 투입되도록 구성된 채널이고, 검출 채널은 분석 시료 내의 표적 항원을 포획하도록 구성된 채널일 수 있다. 이때, 검출 채널은 복수개의 웰을 포함할 수 있다. 선택적으로, 각각의 채널들은 유체로 연통되는 하나의 채널로 나타날 수도 있다.
한편, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에서 상부면 및 하부면까지의 길이인 채널의 높이는 1 μm 내지 200 μm일 수 있다. 예를 들어, 투입 채널 및 검출 채널의 높이가 1 μm 내지 200 μm일 경우, 10-6이하의 레이놀즈 상수를 갖는 극한 층류 흐림이 발생될 수 있어, 채널 내에서 유체의 분석 시료가 유동할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "분석 시료"는 표적 항원을 포함하는 시료를 의미할 수 있다. 바람직하게, 분석 시료는 유체 시료일 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물과 같은 세포 시료, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액 및 복막액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 표적 항원은 항원 또는 항원으로서 작용하는 핵 단백질일 수 있다. 그러나, 표적 항원은 목적에 따라 사용자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 나아가, 본 명세서 내에서 "분석 시료"는 정량 분석을 위해 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 투입되는 모든 시료를 의미할 수 있다.
한편, 분석 시료는 그 종류에 따라 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 투입되기 전에 전처리 될 수 있다. 예를 들어, 분석 시료가 세포를 포함하는 경우 용해 (lysis) 될 수 있다.
나아가, 분석 시료는 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내에 투입되기 전에, 항원 항체 반응이 먼저 유도될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법에서 분석 시료는, 항체가 부착된 자성 입자 및 비즈와 면역 반응된 후, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내에 정량 분석을 위해 투입될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항원"은, 면역 반응을 유발하는 항체에 반응하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 항원은 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법에서, 검출하고자 하는 표적 항원일 수 있다. 나아가, 특정 바이러스의 감염 여부를 확인을 목적으로 하는 경우, 항원은 바이러스의 핵 단백질일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고, 항원은 특정 항체와 면역 반응할 수 있는, 예를 들어 면역 반응을 일으키는 세포, 바이러스, 원충등의 표면 분자와 같은 분석 시료의 모든 물질일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법을 이용하여, 호흡기 감염성 질환 검사를 하고자 하는 경우, 표적 항원은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 호흡기세포융합바이러스 (RSV, respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza Virus)-1, 파라인플루엔자바이러스-2, 파라인플루엔자바이러스-3, 아데노바이러스 (adenovirus), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV, human metapneumovirus) 또는 리노바이러스 (rhinovirus) (1, 2) 항체일 수 있다. 또한, 항원의 정량 분석 방법을 이용하여, 알러지 질환 검사를 하고자 하는 경우, 표적 항원은 IL-1 베타, IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-71, IFN 감마, TNF-α 또는 GM-CSF일 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법을 이용하여, 급성심근경색증 진단 검사를 하고자 하는 경우, 표적 항원은 트로포닌 Ⅰ (troponin I), BNP, 고민감도 (hs, high-sensitivity) CRP, CK-MB, D-다이머 또는 미오글로빈일 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법을 이용하여, 성감염 질환 검사를 하고자 하는 경우, 표적 항원은 HIV (human immunodeficiency virus), 클라미디아 (Chlamydia) 세균, 트레포네마 팔라둠 (Treponema pallidum), 임균 (Neisseria gonorrhoeae) 또는 HPV (human papilloma virus) 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법을 이용하여, 전립선 암 검사를 하고자 하는 경우, 표적 항원은 전립선특이항원 (PSA, prostate specific antigen) 일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법을 이용하여, 이식환자의 면역력 검사를 하고자 하는 경우, 표적 항원은 BK 바이러스 또는 거대세포바이러스 (CMV, cytomegalovirus) 항원일 수 있다. 나아가, 표적 항원은 면역 반응을 일으키는 세포 그 자체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항체"는 바이러스, 세균과 같은 항원을 비활성화시키고 신체에 침입한 미생물에 대항하기 위해, 항원에 특이적으로 면역 반응을 일으키는 물질을 의미한다. 나아가, 단클론 (monoclonal) 항체는 단일 항체 형성세포가 생성한 항체로서, 1차 구조 (아미노산 배열) 가 균일한 항체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "제1 항체"는 표적 항원의 에피토프에 결합되도록 구성되고 자성 입자에 고정된 단 클론 항체를 의미한다. 또한, "제2 항체"는 동일한 표적 항원에 대하여 제1 항체와 상이한 에피토프에 결합되도록 구성되고 비즈에 고정된 단 클론 항체를 의미한다. 이때, 제1 항체 및 제2 항체는 형광표지 항체와 상이할 수 있다.
한편, 제1 항체 및 제2 항체는 자성 입자 및 비즈 각각과 혼합한 후, 0.05 M의 MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) 완충 용액에서 15 분간 반응 시키고, 2.5 mM의 EDC를 이용하여 자성 입자 및 비즈 각각에 접합반응이 유도될 수 있다. 이때, 자성 입자는 자석을 이용하여 제1 항체와 접합되지 않은 자성 입자를 분리, 세척할 수 있고, 비즈는 원심분리 (25000 g, 10분) 에 의해 항체와 접합되지 않은 비즈를 분리 세척할 수 있다.
한편, 본 명세서에서 사용되는 용어, "비즈"는 형광이나 염색 없이 현미경으로 확인 가능한 입자를 의미할 수 있다. 예를 들어, 비즈는 형광 또는 염색 없이도 현미경 광학의 200 배율에서 확인 가능한 크기를 갖는 폴리머 비즈 (polymer bead), 폴리스틸렌 비즈 (polystyrene bead), 퀀텀닷 (quantum dot), 금입자, 라텍스 비즈 (latex bead) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 검출기의 성능, 표적 항원의 종류 등에 따라 다양하게 설정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "면역 복합체"는, 자성 입자와 비즈가 표적 항원을 매개로 결합하여 형성한 면역 복합체를 의미할 수 있다. 이때, 면역 복합체는 비대칭 형태를 가질 수 있다. 이때 면역 복합체 내에서의 자성 입자는, 마이크로 칩 내에서 시료의 유동을 능동적 제어할 수 있고, 면역 복합체 내에서의 비즈는 면역 복합체가 계수 가능하도록 신호를 담당할 수 있다. 이러한 면역복합체는, 두 개의 다른 역할의 입자를 3차원적으로 활용하여 체적대비 넓은 표면적에 항체를 고정화함으로써 면역반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 이에, 면역 복합체를 이용한, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법은 낮은 농도의 항원 및 표적물질을 효과적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법에서는, 면역 복합체를 계수함으로써, 표적 항원을 정량 분석할 수 있다. 보다 구체적으로, 면역 복합체 내에서 비즈는 광학적으로 계수 가능한 크기를 갖고 있어, 항원 정량 분석용 마이크로 칩의 검출 채널에 포획된 비즈를 계수함으로써, 간접적으로 이와 결합된 표적 항원에 대하여 정량 분석이 가능할 수 있다. 또한, 면역 복합체는 검출 채널에 자성이 인가될 경우, 자성 입자에 의해 검출 채널로 이동할 수 있고, 검출 채널에 형성된 복수개의 웰에 포획되어 고정될 수 있다. 이때, 면역 복합체는 자력에 의해 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 일면에서 회전하며 검출 채널로 이동할 수 있다. 한편, 면역 복합체를 형성하지 않은 비즈는 자력에 반응하지 않음에 따라 검출 채널에 포획되지 않고, 면역 복합체를 형성하지 않은 자성 입자는 검출 채널에 포획될 수 있으나 광학적으로 계수될 수 없다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법에서는 형광표지 항체의 이용 없이도 민감도 높은 표적 항원에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 광학적으로 계수 가능하고, 면역 복합체를 형성 했을 때 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 일면에서 회전하여 이동할 수 있는 비즈의 입경은 0.5 내지 5 ㎛일 수 있다. 나아가, 광학적으로 계수 가능하지 않은 자성 입자의 입경은 0.05 내지 2.8 ㎛일 수 있다.
항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 검출 채널 내에 형성된 웰의 입경은 비즈 및 자성 입자의 입경을 합한 값 또는 이들이 형성한 면역 복합체의 입경에 대하여, 1.2 배 내지 2 배의 크기를 가질 수 있다.
항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내에 검출된 표적 항원은, 자력 인가부와 디지털 직시 현미경 기반의 항원의 정량 분석용 디바이스를 이용하여, 효과적으로 정량 분석될 수 있다. 이때, 항원의 정량 분석용 디바이스는 본 명세서 내에서 검출기와 동일한 의미로 이용될 수 있다.
이때, "자력 인가부"는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 외부에서 칩 내의 자성 입자와 자성을 형성할 수 있는 모든 물질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 자력 인가부는, 웰이 형성된 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 일면에 자력을 인가하여, 분석 시료 내의 면역 복합체가 검출 채널로 유동할 수 있게 된다. 나아가, 자력 인가부에 의해 면역 복합체는 웰 내에 효과적으로 포획될 수 있어 이들의 정량 분석이 보다 용이할 수 있다. 그 결과, 표적 항원에 대한 정확도 높은 검출이 가능할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "디지털 직시 현미경"은 디지털 적으로 면역 복합체와 같은 표적 물질에 대한 영상을 디지털 신호로 바꾸어 저장하도록 구성된 이미지 센서를 포함하는 현미경을 의미할 수 있다. 이때, 디지털 직시 현미경은 마이크로 칩 내에 포획된 비대칭의 면역 복합체를 형광 물질 또는 염색 없이 계수할 수 있는 한, 다양한 광학 분석 장치가 이용될 수 있다. 예를 들어, 디지털 직시 현미경은 CMOS 이미지 센서 기반의 무렌즈 디지털 직시 현미경일 수 있다.
한편, 이러한 디지털 직시 현미경 기반의 항원 정량 분석 디바이스는 기존의 정량 분석 디바이스보다 향상된 분석 성능을 발휘할 수 있다. 보다 구체적으로, 광학 배율 조절 시스템 기반의 정량 분석 디바이스는 표적 항원에 대하여 확대되거나 축소된, 일부의 형광 이미지를 기초로 표적 항원에 대한 정량 분석을 수행할 수 있음에 따라 분석 시간이 오래 걸리고, 표적 항원에 대한 초점에 따라 정량 분석의 결과가 달라질 수 있다.
항원의 정량 분석용 마이크로 칩이 디지털 직시 현미경 기반의 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 디바이스에 도입되는 경우, 이미지 센서에 의해, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내에 포획된 면역 복합체에 대한 이미지가 신속하게 획득될 수 있다. 정량 분석용 디바이스의 프로세서는 획득된 이미지를 고해상도의 이미지로 재구성하고, 이미지 내의 면역 복합체를 계수할 수 있다. 그결과, 표적 항원에 대한 정확한 계수 결과가 제공될 수 있다.
이하에서는, 도 1을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법에 이용되는, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 대하여 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 개략적인 평면도이다. 도 1을 참조하면, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 은 상부면과 하부면 사이에 형성된 복수의 채널들 (110, 120) 을 형성할 수 있다. 나아가, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 내에는 유체가 일 방향으로 이동하도록, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 측면에 복수의 관통 홀 (131) 이 형성될 수 있다. 또한, 관통 홀 (131) 은 흐름 유지 채널 (130) 로 분석 시료의 흐름이 충분히 일어날 수 있도록 공기압을 유지시키실 수 있다.
복수의 채널들은 투입 채널 (110) 및 검출 채널 (120) 을 포함한다. 구체적으로, 투입 채널 (110) 은 상부면을 투입구 (112) 을 통해 표적 항원이 포함된 분석 시료가 투입되도록 구성된다. 검출 채널 (120) 은 복수의 웰 (124) 을 포함하는 복수의 검출부 (122) 포함할 수 있다. 각각의 검출부 (122) 는 검출 채널 (120) 내에서 일련의 간격을 가질 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고, 검출부 (122) 는 분석 시료의 종류, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 이용 목적, 또는 다중 항원 분석 유무에 따라 간격, 영역, 웰 (124) 의 수, 웰 (124) 의 크기가 다양하게 설정될 수 있다.
한편, 투입 채널 (110) 에 투입되는 분석 시료는 전처리에 의해 표적 항원, 자성 입자 및 비즈로 구성된 면역 복합체를 포함할 수 있다. 이에, 검출 채널 (120) 부근에 자성이 인가되는 경우, 면역 복합체는 자성 입자에 의해 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 일 면에서 회전하며 검출 채널 (120) 로 이동할 수 있다. 나아가, 면역 복합체는 검출 채널 (120) 에 형성된 복수개의 웰 (124) 에 포획되어 고정될 수 있다. 이때, 웰 (124) 에 의해 서로 응집된 면역 복합체들은 분리될 수 있고, 그 결과, 하나의 웰 (124) 에 하나의 면역 복합체가 포획될 수 있다.
면역 복합체를 형성하지 않은 비즈 또는 표적 항원은 자력에 반응하지 않음에 따라 검출 채널 (120) 에 포획되지 않을 수 있다. 이처럼 면역 반응을 일으키지 않은 비즈 또는 표적 항원은, 관통 홀 (131) 에 의해 형성되는 공기압에 의해 흐름 유지 채널 (130) 로 이동할 수 있다.
이하에서는, 도 2를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법에 이용되는, 항원의 정량 분석용 디바이스에 대하여 설명한다. 이때, 설명의 편의를 위해, 도 1에서 사용된 도면 부호가 구성 요소들을 지칭하기 위해 사용된다. 이때, 이미지 센서를 포함하는 무렌즈 디지털 직시 현미경 기반의 디바이스를 예로 들어 설명하나, 항원의 정량 분석용 디바이스의 구성은 이에 제한되지 않고 표적 항원 또는 비대칭 면역 복합체를 광학적으로 계수할 수 있는 한, 다양하게 구성될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 디바이스의 구성을 도시한 개략적인 분해 사시도이다
도 2를 참조하면, 항원의 정량 분석용 디바이스 (200) 는 광 조사부 (210), 자력 인가부 (220), 이미지 센서부 (230) 및 프로세서 (240) 를 포함한다. 이때, 표적 항원이 검출된 항원 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 은 광 조사부 (210) 및 이미지 센서부 (230) 사이에 배치될 수 있다.
광 조사부 (210) 는 복수개의 LED를 포함하고, 이들 LED는 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 특정한 검출부 (122) 에 광을 조사하도록 구성되어 있다. 이때, 광 조사부 (210) 는 핀홀 어퍼처 (212) 를 포함할 수 있고, 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 에 조사되는 광 (214) 은 동위성광 일 수 있다. 한편, 광 조사부 (210) 의 각각의 LED 들은 3mm 간격으로 배치될 수 있고, 검출부 (122) 와 수직인 각도를 포함하는, 다양한 각도로 조사되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, LED들은 검출부 (122) 와 수직인 0 °와 ± 2.5 °, ± 3.5 °, ± 4.9 °, ± 6.9 °로 배치될 경우, 소량의 LED 만으로도 항원 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 내의 모든 검출부 (122) 에 대하여 광 (214) 이 일정하게 조사될 수 있다. 그 결과, 검출부 (122) 에 대한 고해상도 이미지를 획득할 수 있다. 한편, 광 조사부 (210) 내의 LED의 개수 및 각도는 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 크기, 구성 또는 표적 항원의 종류에 따라 다양하게 설정될 수 있다.
자력 인가부 (220) 는 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 검출 채널 (120) 에 전자력을 인가하도록 구성된다. 예를 들어, 자력 인가부 (220) 는 웰 (124) 이 형성된 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 상부면 또는 하부면에 대응하도록 배치될 수 있다. 나아가, 자력 인가부 (220) 는 후술할 이미지 센서부 (230) 에 검출되지 않도록 검출 채널 (120) 이 끝나는 부위에 배치될 수 있다. 이때, 자력 인가부 (220) 는 검출 채널 (120) 에 자성을 인가하는 한 다양한 형태를 가질 수 있다. 자력 인가부 (220) 에 의해 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 검출 채널 (120) 부근에 자성이 인가되는 경우, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 일 면에서 면역 복합체는 검출 채널 (120) 로 회전하여 이동할 수 있고, 검출 채널 (120) 에 형성된 복수개의 웰 (124) 에 포획되어 고정될 수 있다.
이미지 센서부 (230) 는 광 조사부 (210) 를 통해 광 (214) 이 조사됨에 따라, 검출 채널 (120) 내의 복수개의 웰 (124) 에 포획된 면역 복합체들을 감지할 수 있다. 그 결과, 면역 복합체들에 대한 이미지를 획득할 수 있게 된다. 예를 들어, 이미지 센서부 (230) 를 통해, 복수개의 각도로 광 (214) 이 조사됨에 따라 생성된 검출부 (122) 내의 면역 복합체에 대한 복수개의 저해상도 이미지를 획득할 수 있다. 이때, 이미지 센서부 (230) 는 CMOS 이미지 센서를 포함하는 다양한 이미지 센서, 디지털 직시 현미경, 또는 소형 현미경일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 면역 복합체를 형성하는 비즈는 이미지 센서부 (230) 에 의해 검출될 수 있는 크기를 가질 수 있고, 자성 입자 또는 표적 항원은 이미지 센서부 (230) 에 의해 검출될 수 없는 작은 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 입경이 0.5 내지 5 ㎛인 비즈는 이미지 센서부 (230) 에 검출될 수 있고, 입경이 0.05 내지 2.8 ㎛인 자성 입자는 이미지 센서부 (230) 에 검출되지 않을 수 있다.
프로세서 (240) 는 이미지 센서부 (230) 와 연결되도록 구성되어 있고, 이에 따라, 획득한 검출부 (122) 에 대한 이미지를 기초로, 이미지 내의 면역 복합체를 계수할 수 있다. 예를 들어, 프로세서 (240) 는 이미지 센서부 (230) 를 통해 획득한 면역 복합체에 대한 복수개의 저해상도 이미지를 기초로 고해상도 이미지를 재구성하고, 고해상도 이미지 내의 면역 복합체를 계수할 수 있도록 구성될 수 있다. 이에, 표적 항원을 간접적으로 계수함으로써, 표적 항원에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다.
이하에서는, 도 3a 및 도 3b 내지 3e를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법에서의 표적 항원의 검출 절차를 구체적으로 설명한다. 이때, 설명의 편의를 위해, 도 1 및 도 2에서 사용된 도면 부호가 구성 요소들을 지칭하기 위해 사용된다.
도 3a은 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 디바이스를 이용한, 항원의 정량 분석 방법의 절차를 도시한 것이다. 도 3b는 항원의 정량 분석 방법에서, 분석 시료, 자성 입자 및 비즈를 혼합하는 단계를 예시적으로 도시한 것이다. 도 3c 및 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 개략적인 측면도 및 표적 항원의 검출 과정을 설명하기 위한 요부 확대도이다. 도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내의 검출 채널을 예시적으로 도시한 것이다.
도 3a 및 도 3b를 참조하면, 표적 항원의 정량 분석을 위해 먼저, 표적 항원 (306) 을 포함하는 분석 시료와 표적 항원 (306) 에 대한 제1 항체가 고정된 자성 입자 (302) 및 표적 항원 (306) 에 대한 제2 항체가 고정된 비즈 (304) 를 혼합한다 (S310). 이때, 자성 입자 (302) 및 비즈 (304) 는 동결 건조된 파우더의 형태를 가질 수 있고, 비즈 (304) 는 폴리스틸렌의 투명한 비즈일 수 있다. 나아가, 제1 항체 및 제2 항체 각각은 자성 입자 (302) 및 비즈 (304) 에 대하여 1 x 105배수 내지 4 x 105배수의 개수로 부착될 수 있다. 혼합하는 단계 (S310) 의 결과로, 면역 반응이 일어나고, 표적 항원 (306), 자성 입자 (302) 및 비즈 (304) 가 결합하여 비대칭을 이루는 면역 복합체 (308) 가 생성될 수 있다. 이에, 비대칭 면역 복합체 (308) 를 포함하는 반응 시료 (312) 가 준비될 수 있다. 한편, 반응 시료 (312) 는 면역 반응하지 않아 소량으로 존재하는, 단독의 자성 입자 (302), 비즈 (304) 및 표적 항원 (306) 를 포함할 수 있다.
도 3a 및 도 3c를 참조하면, 혼합하는 단계 (S310) 에서 생성된 비대칭 면역 복합체 (308) 를 포함하는 반응 시료 (312) 를 표적 항원 (306) 의 정량 분석을 위해, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 에 형성된 투입구 (112) 를 통해 적하한다 (S320). 적하하는 단계 (S320) 의 결과로, 충분한 양의 반응 시료 (312) 가 투입 채널 (110) 로 주입될 수 있다.
도 3a 및 도 3d를 참조하면, 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 을 자력 인가부 (220) 및 이미지 센서부 (230) 를 포함하는 정량 분석용 디바이스 (200) 에 도입하고, 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 검출 채널 (120) 인근에 자력을 인가한다 (S330). 이때, 자력 인가부 (220) 는 웰 (124) 이 형성된 검출 채널 (120) 의 상부면에서, 웰 (124) 이 끝나는 면에 대응하도록 배치될 수 있다. 보다 구체적으로 인가하는 단계 (S330) 에서, 투입된 반응 시료 (312) 내의 면역 복합체 (308) 는 자성 입자 (302) 에 인간된 자력에 의해 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 상부 면으로 부유하게 된다. 나아가, 자력 인가부 (220) 에 의해 면역 복합체 (308) 는 검출 채널 (120) 로 회전하여 이동할 수 있다.
도 3a 및 도 3e를 참조하면, 인가하는 단계 (S330) 에서는 자력에 의해 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 의 상부 면에서 회전하여 일 방향으로 이동한 면역 복합체 (308) 가 검출 채널 (120) 에 형성된 복수개의 웰 (124) 에 포획될 수 있다. 도 3f를 참조하면, 자력 인가부 (220) 에 의해 자력이 인가됨에 따라, 자성 입자 (302) 를 포함하는 면역 복합체 (304) 는 웰 (124) 에 고정될 수 있다. 나아가, 웰 (124) 에 의해 서로 응집된 복수개의 비대칭 면역 복합체 (308) 는 분리될 수 있고, 그 결과, 하나의 웰 (124) 에 하나의 비대칭 면역 복합체 (308) 가 포획될 수 있다. 한편, 비대칭 면역 복합체 (308) 를 형성하지 않은 단독의 자성 입자 (302) 또한 웰 (124) 에 포획될 수 있다. 그러나, 자성 입자 (302) 는 이미지 센서부 (230) 에 의해 검출 되지 않을 정도의 작은 크기를 가지고 있을 수 있다. 나아가, 복합체 (308) 를 형성하지 않은 단독의 비즈 (304) 및 표적 항원 (306) 은 자성에 반응하지 않음에 따라, 유체의 흐름에 의해 검출 채널 (120) 의 밖으로 빠져나갈 수 있게 된다.
도 3a를 참조하면, 항원의 정량 분석용 디바이스 (200) 의 이미지 센서부 (230) 를 이용하여, 검출 채널 (120) 또는 검출부 (122) 에 포획된 비대칭 면역 복합체 (308) 에 대한 이미지를 획득하고, 비대칭 면역 복합체 (308) 내의 계수 가능한 크기를 갖는 비즈 (304) 를 검출함으로써, 표적 항원 (306) 의 수를 간접적으로 계수 한다 (S340). 예를 들어, 계수하는 단계 (S340) 에서는 항원의 정량 분석용 디바이스 (200) 의 프로세서 (240) 가 이미지 센서부 (230) 를 통해 획득한 비대칭 면역 복합체 (308) 에 대한 복수개의 저해상도 이미지를 기초로 고해상도 이미지를 재구성하여, 고해상도 이미지 내의 비대칭 면역 복합체 (308) 를 계수할 수 있다. 그 결과, 표적 항원 (306) 에 대한 정량 분석이 가능할 수 있다.
이하에서는, 도 3g 내지 3i를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석 방법에서의 검출된 표적 항원의 계수 절차를 구체적으로 설명한다. 이때, 설명의 편의를 위해, 도 1, 도 2, 및 도 3a 내지 도 3f에서 사용된 도면 부호가 구성 요소들을 지칭하기 위해 사용된다.
도 3g 내지 3i는 항원의 정량 분석 방법에서, 이미지 센서부에 의해 획득된, 면역 복합체의 그림자 이미지를 재구성하여 표적 항원의 수를 계수하는 단계를 예시적으로 도시한 것이다.
도 3g 및 도 3h를 참조하면, 항원의 정량 분석용 디바이스 (200) 의 광 조사부 (210) 의 복수개의 LED (216) 각각이 복수개의 각도 (θa, θb, θc) 로, 면역 복합체 (304) 가 포획된 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 에 광을 조사함에 따라, 복수개의 비대칭 면역 복합체의 그림자 (324) 를 포함하는 저해상도 이미지 (332) 를 획득할 수 있다.
그 다음, 도 3h를 참조하면, 복수개의 비대칭 면역 복합체의 그림자 (324) 각각이 갖는 픽셀값 (Pa), 상이한 영역에 조사되는 광 (218) 의 파장 (λk) 및 복수개의 LED (216) 각각이 광을 조사하는 복수개의 각도 (θa, θb, θc), 이미지 센서부 (230) 과 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) (또는, 검출 채널 (120), 검출부 (122)) 과의 간격 (Dk) 을 기초로, 재구성 (reconstruction) 된 비대칭 면역 복합체 (326) 를 포함하는, 고해상도 이미지 (334) 가 획득될 수 있다. 이때, 고해상도 이미지 (334) 는 비대칭 면역 복합체 (308) 에 대한 다층 이미지로 구성될 수 있다 (334 (a) 및 334 (b) 참조).
그 다음, 도 3i를 참조하면, 획득한 고해상도 이미지 (334) 를 기초로, 비대칭 면역 복합체 (308) 를 계수할 수 있다. 예를 들어, 정렬 키 (align key) 패턴에 의해 인식된 고해상도 이미지 (334) 내의 검출부 (122) 에 분포된 복수개의 재구성된 비대칭 면역 복합체 (326) 각각과 미리 결정된 탬플릿을 매칭할 수 있다. 그 다음, 탬플릿과 매칭된 면역 복합체 (327), 보다 구체적으로 비즈 (304) 를 계수함에 따라, 표적 항원 (306) 에 대한 정량 분석 결과를 얻을 수 있다.
이하에서는, 도 4a 내지 도 4c를 참조하여 다양한 표적 항원의 농도에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내의 표적 항원의 검출 결과를 예시적으로 설명한다. 이때, 설명의 편의를 위해 도 3a 내지 도 3f에서 사용된 도면 부호가 구성 요소들을 지칭하기 위해 사용된다.
도 4a 내지 4c는 표적 항원의 농도에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내 내의 검출 채널을 예시적으로 도시한 것이다.
도 4a를 참조하면, 표적 항원 (306) 을 포함하지 않은 반응 시료 (312) 를 투입한 상태의, 자력 인가부 (200) 에 의해 자력이 인가된 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 이 도시된다. 보다 구체적으로, 자성 입자 (302) 및 비즈 (304) 는 항원의 부재로 인해 면역 복합체 (308) 를 형성할 수 없다. 그 결과, 자성 입자 (302) 만이 자력 인가부 (200) 에 의해 자력이 인가됨에 따라 검출 채널 (120) 로 이동하게 되고, 검출 채널 (120) 에 배치된 복수개의 웰 (124) 에 포획, 고정될 수 있다.
도 4b를 참조하면, 저농도의 표적 항원 (306) 을 포함하는 반응 시료 (312) 를 투입한 상태의, 자력 인가부 (200) 에 의해 자력이 인가된 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 이 도시된다. 보다 구체적으로, 자성 입자 (302) 및 비즈 (304) 는 표적 항원 (306) 에 의해 면역 복합체 (308) 를 형성할 수 있다. 이때, 면역 복합체 (308) 내에서의 자성 입자 (302) 는, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 내에서 반응 시료 (312) 의 유동을 능동적 제어할 수 있고, 면역 복합체 (308) 내에서의 비즈 (304) 는 면역 복합체 (308) 가 계수 가능하도록 신호를 담당할 수 있다. 자성 입자 (302) 에 자력이 인가됨에 따라 면역 복합체 (308) 는 검출 채널 (120) 로 이동하게 되고, 검출 채널 (120) 에 배치된 복수개의 웰 (124) 에 포획, 고정될 수 있다. 따라서, 저농도의 표적 항원 (306) 은 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 에 효과적으로 포획될 수 있고, 포획된 면역 복합체 (308) 의 계수 가능한 크기의 비즈 (304) 를 계수함으로써, 저농도로 존재하는 표적 항원 (306) 의 정량 분석이 가능할 수 있다.
도 4c를 참조하면, 고농도의 표적 항원 (306) 을 포함하는 반응 시료 (312) 를 투입한 상태의, 자력 인가부 (200) 에 의해 자력이 인가된 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 (100) 이 도시된다. 보다 구체적으로, 자성 입자 (302) 및 비즈 (304) 는 고농도의 표적 항원 (306) 에 의해 면역 복합체 (308) 를 형성할 수 있고, 자력이 인가됨에 따라 면역 복합체 (308) 대부분이 검출 채널 (120) 에 배치된 복수개의 웰 (124) 에 포획, 고정될 수 있다. 따라서, 포획된 면역 복합체 (308) 의 계수 가능한 크기의 비즈 (304) 를 계수함으로써, 고농도로 존재하는 표적 항원 (306) 의 정밀도 높은 정량 분석이 가능할 수 있다.
실시예 1: 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법의 평가
이하에서는, 도 5a를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법에 대한 실험실적 수준의 면역 반응 실험 결과를 설명한다.
본 평가를 위해, 입경이 0.1 μm인 자성 입자와 0.2 μm인 비즈가 이용되었고, 자성 입자에 고정된 항체 및 비즈에 고정된 항체와 면역 반응을 일으키는 인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질이 항원으로 이용되었다. 이때, 자성 입자는 532 nm의 파장에서 녹색을 띄고, 비즈는 635 nm의 파장에서 붉은색을 띄도록 설정되었다. 자성 입자 및 비즈를 포함하는 웰 플레이트에 0 pM, 0.1 pM, 10 pM, 100 pM 및 1000 pM의 농도를 갖는 항원을 각각 처리하고, 2 시간 동안 진탕 배양 (shaking incubation) 하여 면역 반응을 유도하였고, 자성 입자를 3 번 워싱하였다. 워싱이 끝난 플레이트에 대하여 532 nm 및 635 nm 에서의 흡광도를 측정하였고, 항원의 농도에 따른 면역 반응 결과를 확인하였다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법을 평가하기 위한, 실험실적 수준의 면역 반응 실험 결과를 도시한 것이다.
도 5a의 (a)를 참조하면, 흡광도 측정 결과가 도시된다. 이때, 신호의 세기의 증가는 면역 반응의 증가를 의미할 수 있다. 구체적으로, 항원의 농도가 1 pM 이상일 경우, 자성 입자 및 비즈와 면역 반응을 일으키는 것으로 나타난다. 나아가, 100 pM 농도의 항원과 1000 pM 농도의 항원은, 유의한 면역 반응의 차이가 나타나지 않는다.
도 5a의 (b)를 참조하면, 기저 신호 대비 항원의 신호값을 의미하는 자성 입자에 대한 비즈의 흡광도 비율이 도시된다. 도 5a의 (a)의 결과와 마찬가지로, 항원의 농도가 1 pM 이상일 경우, 흡광도 비율이 0.311로 유의하게 증가함에 따라, 자성 입자 및 비즈와 면역 반응을 일으키는 것으로 나타난다. 나아가, 100 pM 농도의 항원과 1000 pM 농도의 항원의 처리에 따른 흡광도 비율은 각각 0.610 및 0.606으로, 큰 차이를 보이지 않는다. 이는, 100 pM 농도의 항원과 1000 pM 농도의 항원에 대하여 유의한 면역 반응의 차이가 나타나지 않는 것을 의미할 수 있다.
이상의 결과로, 1 pM 이상의 농도를 갖는 항원은 자성 입자 및 비즈와 면역 반응할 수 있고, 그 결과 항원에 의해 매개되는 비대칭 면역 복합체가 형성될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스와, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법에서는, 항원에 의해 매개되는 자성 입자 및 비즈의 면역 반응을 이용함으로써, 비대칭 면역 복합체 내의 표적 항원을 검출하고 정량 분석할 수 있다. 또한, 효율적인 정량 분석을 위해, 분석 시료내의 표적 항원의 농도는 1 pM 내지 100 pM일 수 있다.
이하에서는, 도 5b를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 대한 면역 반응 실험을 통한, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법의 신뢰도 평가 결과를 설명한다.
본 평가를 위해, 인플루엔자 바이러스 A의 핵 단백질을 항원으로 이용하였다. 나아가, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 검출 채널에 고정된 M-2nd555가 마커로 이용하였고, 자성 입자에 항체를 고정하기 위해 이용한 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimide/NHS ((N-hydroxysuccinimide) 를 양성 대조군으로, 트롬빈을 음성 대조군으로 설정하였다. 또한, 본 평가에서는 비즈, 40 ng/㎕의 자성 입자 (또는, 100 ng/㎕의 자성 입자), 및 항원을 반응 시킨 분석 시료를 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 투입하여 검출 채널의 상부면 및 상부면 (또는, 하부면) 에서의 흡광도를 측정하였다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법의 신뢰도 평가를 위한, 마이크로 칩 내의 면역 반응 실험 결과를 도시한 것이다.
도 5b의 (a)를 참조하면, 항원의 농도 증가에 따라, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 검출 채널에서 일어나는, 항원, 자성 입자 및 비즈의 면역 반응 결과가 도시된다. 보다 구체적으로, 항원, 비즈 및 40 ng/㎕의 자성 입자를 반응시키고, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 상부면에서 면역 측정한 실험군 1과, 항원, 비즈 및 40 ng/㎕의 자성 입자를 반응 시키고, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 하부면에서 면역 측정한 실험군 2, 그리고 항원, 비즈 및 100 ng/㎕의 자성 입자를 반응 시키고, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 상부면에서 면역 측정한 실험군 3 및, 항원, 비즈 및 100 ng/㎕의 자성 입자를 반응 시키고, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 하부면에서 면역 측정한 실험군 4에 대하여, 0.1 nM 농도, 10 nM 농도의 항원에서 면역 반응이 일어나고, 그 결과 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내에서 면역 복합체를 형성한 것으로 나타난다.
도 5b의 (b)를 참조하면, 음성 대조군에 대한 각각의 실험군에 대한의 흡광도 비율이 도시된다. 구체적으로, 동일한 항원의 농도 (0.1 nM 또는 10 nM) 에서 40 ng/㎕ 및 100 ng/㎕의 자성 입자의 이용에 따른, 면역 반응의 유의한 차이는 없는 것으로 나타난다. 나아가, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 상부면 하부면에서의 면역 반응은 유의한 차이가 없는 것으로 나타난다. 다만, 항원의 농도에 있어서, 이의 농도가 증가할수록 흡광도 비율은 높아지는 것으로 나타난다. 이는, 고농도의 항원의 이용에 따른 면역 반응의 증가, 나아가 항원의 정량 분석용 마이크로 칩상에 포획된 면역 복합체 수의 증가를 의미할 수 있다.
이상의 결과로, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내에서의 포획된 면역 복합체를 확인하였고, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법 또한 높은 신뢰도를 갖는 분석 결과를 제공할 수 있다.
이하에서는, 도 5c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법에 따른, 표적 항원의 정량 분석 결과를 설명한다.
본 평가에서는, 검출 대상항원으로 인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질이 설정되었고, 4 가지의 농도로 실험이 수행되었다. 구체적으로, 평가에 이용된 인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질의 4 가지의 농도는, 0 pM, 1 pM, 10 pM 및 100 pM 이다.
5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스, 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법에 따른, 표적 항원의 정량 분석 결과를 도시한 것이다.
도 5c의 (a)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩의 검출 채널의 일부에 대한 이미지들이 도시된다.
인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질이 투입되지 않은 검출 채널에서는, 3 반복의 실험 별로 11 개의 비즈가 관찰되었다. 이의 결과는, 유체의 흐름에 의해 검출 채널에 포획된 비즈의 수를 의미할 수 있다.
1 pM의 항원을 비즈 및 자성 입자와 면역 반응 시킨 분석 시료가 투입된 검출 채널 에서는, 반복실험 별로 각각 75 개, 63 개 및 57 개의 비즈가 관찰된다. 또한, 10 pM의 항원을 비즈 및 자성 입자와 면역 반응 시킨 분석 시료가 투입된 검출 채널 에서는, 반복실험 별로 각각 267 개, 273 개 및 265 개의 비즈가 관찰되고, 100 pM의 항원을 비즈 및 자성 입자와 면역 반응 시킨 분석 시료가 투입된 검출 채널 에서는, 반복실험 별로 각각 1172 개, 1148 개 및 1216 개의 비즈가 관찰된다. 이때, 검출 채널에서 관찰된 비즈, 보다 구체적으로 면역 복합체는 검출 채널의 웰 내에 포획된 것으로 나타난다.
도 5c의 (b)를 참조하면, 인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질의 농도 증가에 따른 자성 입자의 수에 대한 그래프가 도시된다. 그 결과, 인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질의 농도가 증가함에 따라, 자성 입자의 수가 비례하여 증가하는 것으로 나타난다.
이상의 실시예 1의 결과로, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스와 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법은, 분석 시료 내에 pM 단위의 극미량 농도로 존재하는 표적 항원을 민감도 높게 검출할 수 있다.
특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩과 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법은, 두 개의 다른 역할의 입자를 3차원적으로 활용하여 체적대비 넓은 표면적에 항체를 고정화한 면역 복합체를 이용함으로써, 면역반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 이에, 본 발명은 낮은 농도의 표적 항원과 표적 물질을 효과적으로 검출할 수 있다.
나아가, 유체 항력과 자력이 균형을 이루도록 구성된, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩은 균일한 분석 시료의 이동 패턴을 제공할 수 있다. 그 결과, 본 발명은 기존의 항원의 정량 분석용 마이크로 칩이 가지고 있던, 불균일한 유체이동 패턴에 따른 검출 및 분석에서의 장애 요인들을 극복할 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스와 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법은, 형광표지 항체를 이용하지 않아도 비즈의 수를 광학적으로 계수함으로써, 표적 항원에 대한 정량 분석을 제공할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 및 디바이스와 이를 이용한 항원의 정량 분석 방법은, 복수개의 표적 항원에 대하여 각각 다른 형상으로 나타나도록 비즈의 크기, 모양 등을 조절하고 표적 항원이 포획된 복수의 웰이 나타내는 패턴을 분석함으로써 복수개의 표적 항원에 대하여 동시 항원검사를 수행할 수 있는 효과가 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
100: 항원의 정량 분석용 마이크로 칩
110: 투입 채널
112: 투입구
120: 검출 채널
122: 검출부
124: 웰
130: 흐름 유지 채널
131: 관통 홀
200: 항원의 정량 분석용 디바이스
210: 광 조사부
212: 핀홀 어퍼처
214: 광
216: LED
218: 상이한 영역에 조사되는 광
220: 자력 인가부
230: 이미지 센서부
240: 프로세서
302: 자성 입자
304: 비즈
306: 표적 항원
308: 비대칭 면역 복합체
312: 반응 시료
324: 비대칭 면역 복합체의 그림자
326: 재구성된 비대칭 면역 복합체
327: 탬플릿과 매칭된 면역 복합체
332: 저해상도 이미지
334: 고해상도 이미지
334 (a): 고해상도 평면 이미지
334 (b): 고해상도 측면 이미지
S310: 혼합하는 단계
S320: 적하하는 단계
S330: 전자력을 인가하는 단계
S340: 표적 항원의 수를 계수하는 단계

Claims (16)

  1. 표적 항원을 포함하는 분석 시료, 상기 표적 항원과 항원 항체 반응하는 제1 항체가 고정된 자성 입자 및 상기 제1 항체와 상이한 제2 항체가 고정된 비즈를 혼합하는 단계;
    항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 혼합된 상기 분석 시료를 적하하는 (dropping) 단계;
    자력 인가부를 포함하는 디지털 직시 현미경 기반의 검출기에 상기 항원의 정량 분석용 마이크로 칩을 도입하여, 상기 자력 인가부를 이용해 상기 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 자력을 인가하는 단계, 및
    상기 검출기에 획득된 이미지를 이용하여 상기 비즈를 검출함으로써, 상기 표적 항원의 수를 계수하는 단계를 포함하는, 항원의 정량 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원의 정량 분석용 마이크로 칩은, 상기 항원의 정량 분석용 마이크로 칩 내부에 형성된 검출 채널로 상기 분석 시료를 유동시킴으로써 상기 표적 항원, 상기 자성 입자 및 상기 비즈가 결합하여 형성한 비대칭 면역 복합체를 검출하도록 구성되고,
    상기 검출 채널은 상부면 또는 하부면에 형성된 복수의 웰을 포함하고,
    상기 자력을 인가하는 단계는, 상기 복수의 웰과 인접한 위치에 배치된 상기 자력 인가부에 자력을 인가하는 단계를 포함하고,
    상기 비대칭 면역 복합체는, 상기 복수의 웰에 자기력에 의해 포획되는, 항원의 정량 분석 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 계수하는 단계는, 상기 자력 인가부가 자력을 인가하는 동안 상기 복수의 웰에 포획된 상기 비대칭 면역 복합체의 수를 계수하는 단계를 포함하는, 항원의 정량 분석 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 복수의 웰 각각은 하나의 비대칭 면역 복합체가 고정되고,
    상기 계수하는 단계는, 상기 하나의 비대칭 면역 복합체가 표획된 상기 복수의 웰의 수를 계수하는 단계를 포함하는, 항원의 정량 분석 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자성 입자의 입경은 0.05 내지 2.8 ㎛이고,
    상기 비즈의 입경은 0.5 내지 5㎛인, 항원의 정량 분석 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 자성 입자는 상기 검출기에 의해 검출되지 않고,
    상기 비즈는 상기 검출기에 의해 검출되는, 항원의 정량 분석 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 항체 및 제2 항체 각각은, 형광표지 항체 (fluorescence-labeled antibody) 와 상이하고, 동일한 표적 항원에 대하여 서로 상이한 에피토프에 결합되도록 구성된 단 클론 항체인, 항원의 정량 분석 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는, 상기 자성 입자 및 상기 비즈 각각에 대한 입경의 반지름의 제곱에 대하여 105배수의 개수로 부착되는, 항원의 정량 분석 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 분석 시료 내의 상기 표적 항원의 농도는 1pM 내지 1000pM인, 항원의 정량 분석 방법.
  10. 항원의 정량 분석 방법에 이용되는 항원의 정량 분석용 마이크로 칩으로서,
    상기 항원의 정량 분석용 마이크로 칩은, 상부면과 하부면을 가진 바디부로 이루어지고, 상기 상부면과 상기 하부면 사이에 형성된 내부 채널로 분석 시료를 유동시킴으로써 상기 분석 시료 내의 표적 항원을 포함하는 면역 복합체를 검출하도록 구성되고,
    상기 상부면을 관통하는 홀을 통해 상기 분석 시료가 주입되도록 구성된 투입 채널; 및
    상기 투입 채널로부터 유동된 상기 분석 시료 내에서 형성된 상기 면역 복합체를 포획하도록 구성된 복수개의 웰을 포함하는 검출 채널을 포함하는, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 투입 채널 및 검출 채널의 높이는 1 내지 200 ㎛인, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 웰의 직경 및 깊이는 상기 면역 복합체의 입경에 대하여, 1.2 내지 2.0 배의 크기를 갖는, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 투입 채널은 필터를 포함하는, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 면역 복합체는 자성 입자를 포함하고,
    상기 항원 정량 분석용 마이크로 칩이 상기 자성 입자를 끌어당기거나 밀어낼 수 있는 자력 인가 물질을 포함하는 검출기에 도입되는 경우,
    상기 복수개의 웰은 상기 자성 물질에 대응하는 면에 배치되는, 항원의 정량 분석용 마이크로 칩.
  15. 항원의 정량 분석 방법에 이용되는 표적 항원의 광학적 계수 디바이스로서,
    항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 투입된 표적 항원, 자성 입자 및 비즈가 결합하여 형성한 비대칭 면역 복합체가 상기 항원의 정량 분석용 마이크로 칩에 형성된 검출 채널로 일방향으로 회전하여 이동하고 상기 검출 채널에 포획되도록, 상기 검출 채널에 인접한면에 배치되어 자력을 상기 검출 채널의 수평 방향으로 인가하도록 구성된, 자력 인가부;
    상기 검출 채널에 광을 조사하도록 구성된, 광 조사부;
    상기 광이 조사된 검출 채널의 적어도 일부와 대응하고, 상기 비대칭 면역 복합체를 포함하는 검출 영역에 대한 저해상도 이미지를 획득하도록 구성된, 이미지 센서부, 및
    상기 이미지 센서부를 통해 획득한 상기 검출 영역에 대한 복수개의 이미지를 정렬하고, 상기 영역에 대한 재구성된 이미지를 기초로 고해상도 이미지를 획득하고, 상기 고해상도 이미지를 기초로, 상기 이미지 내의 상기 비대칭 면역 복합체를 계수하도록 구성된 프로세서를 포함하는, 항원의 정량 분석용 디바이스.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 자력 인가부는, 상기 이미지 센서부에 의해 상기 자력 인가부가 검출되지 않도록 상기 검출 채널이 끝나는 면에 배치되는, 항원의 정량 분석용 디바이스.
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