CN103025886A - 用于确定颗粒和/或细胞分散体的迁移率的全息波动显微装置和方法 - Google Patents
用于确定颗粒和/或细胞分散体的迁移率的全息波动显微装置和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及实现如下测量和检验方法的仪器、测量装置和方法：所述测量和检验方法以快速且有效的方式，根据所检测到的细胞/颗粒的群体的迁移率来表征细胞/颗粒的群体或检测细胞/颗粒的亚群。
Description
相关申请的交叉引用
本发明要求于2010年5月25日提交的申请号为No.61/347,956的美国临时专利申请和于2010年5月25日提交的申请号为No.61/348,072的美国临时专利申请的优先权，在此通过引证方式将它们的全部内容引入到本文中。
技术领域
本发明涉及实现如下测量和检验方法的仪器、测量装置和方法：所述测量和检验方法以快速且有效的方式根据所检测到的细胞/颗粒的迁移率来表征细胞/颗粒的群体和或它们与化学改性(或未改性)表面的相互作用和/或检测细胞/颗粒的亚群。
背景技术
传统的细胞/颗粒追踪方法可以利用标准的显微技术如明视场、暗视场和荧光来检测颗粒在两个和三个维度上的运动。但是，在较低的放大倍数，视场中存在大量的细胞/珠子，这导致传统逐帧颗粒检测和追踪方法落后于需要。由于对于例如高通量诊断应用而言使检验时间最小化是关键的，因此，需要能够更快速地测量颗粒迁移率的新型显微方法和装置。
发明内容
本发明涉及实现如下测量和检验方法的仪器、测量装置和方法：所述测量和检验方法以快速且有效的方式根据所检测到的细胞/颗粒的迁移率来表征细胞/颗粒的群体和/或检测细胞/颗粒的亚群。
在根据本发明的一个实施方式中，用于测量颗粒的迁移率的装置包括相干光源(例如激光、超发光二极管)；准直器，该准直器准直所述光源(其可以是纤维偶合的)；透明样品保持器，该透明样品保持器保持颗粒或细胞的样品，所述颗粒/细胞被激光束照射；透明盖玻片，该透明盖玻片放置在所述样品保持器上，所述盖玻片使用预定的接头分子处理，所述预定的接头分子附接在位于所述盖玻片的表面上的适当抗体/抗原，以允许所述颗粒/细胞发生特异性结合；物镜，所述物镜接收来自所述透明样品保持器的激光束；和监视器，所述监视器接收来自所述物镜的激光束，所述监视器对被透射照射的所述颗粒/细胞的放大图案进行成像。
在一个实施方式中，用于根据所检测到的颗粒的迁移率来测量、检测和表征颗粒的群体或亚群的装置包括：成像装置，所述成像装置包括：发射光束的相干光源；和准直来自所述相干光源的所述光束的准直器；显微镜的透明样品保持器，该透明样品保持器上放置样品并且被经准直的所述光束所照射，所述样品包含颗粒分散体；和用于测量所述样品保持器上的所述颗粒的迁移率以便推断所述颗粒与所述样品保持器的相互作用的存在或不存在的机构。
在一个类似的实施方式中，透明、半透明或部分镜面反射样品和样品室可以以反射模式进行测量，包括激光照射和图像形成，所述激光照射用于从收集侧照射样品，所述图像形成由从样品反射的光发生，所述样品随后在镜子上成像。
在根据本发明的另一个实施方式中，所述透明、半透明或部分镜面反射样品保持器是具有数据采集和分析能力的自动化流体设备或微滴定板器件。
所述细胞/颗粒的迁移率可以是特定性能的函数，所述特定性能影响所述细胞/颗粒和基底之间的相互作用(例如表面抗原与结合有疏水、带静电等的抗原的表面的特异性结合)。所述细胞/颗粒-表面相互作用的类型和量级将会影响处于热平衡的细胞/微观颗粒的热生成运动的程度。它还会影响所述细胞/颗粒对所施加的物理力的反应。与表面具有可忽略的相互作用的细胞/颗粒进行布朗型运动，而具有足够强度的相互作用往往会限制在表面上所观测到的运动的范围(例如受阻布朗运动)。类似的，与表面的相互作用弱的细胞/颗粒将对所施加的物理力具有较大的反应，不过在较强的表面相互作用的存在下这种反应也会减弱。
所述细胞/颗粒分散体的迁移率还可以是在介质中在热平衡时测得的集体性能例如它们的有效粘度、粘弹性等的函数。例如，在较粘的介质中的细胞/颗粒与在粘度较低的介质中的相同细胞/颗粒相比，它们将还会具有减弱的热驱动(或物理驱动)的运动范围。
本发明根据热平衡时或在施加摄动力的情况下检测到的细胞/颗粒的分散体的扩散性能(例如一个或多个有效扩散系数、有效粘度)来表征细胞/颗粒的分散体。
作为一种传统细胞/颗粒追踪方法的备选方法，本文中描述的全息波动显微装置和方法(技术)很容易地应用于低放大倍数测量(允许增加通量)并且聚焦要求的严苛程度较小。这种装置和技术的另一个优点是由于可以采用相干照射对样品成像，因此可以对样品衍射图案的显著处在焦点外的图像进行成像。所述衍射图案然后可以进行数学转换和数值化传播(propagate)以计算焦点量度的极值(例如参见W.Li等，J.Opt.Soc.Am.A,Vol.24,No.10,3054-62,2007)。数值化传播距离与距离焦点的距离有关，其使用使数值化计算焦点量度极值与距离焦点的实际距离相关的标准曲线来测量。该特征允许以快速的自动方式将样品聚焦至希望的成像平面，不需要额外的自动聚焦装置和耗时的机械焦点扫描。
对样品室中的多个颗粒进行全息光学聚焦的方法包括：使用成像装置的相干光源照射透明样品室中的颗粒样品；使用聚焦照相机采集所述颗粒的图像；在显示器上显示所述颗粒的焦点外衍射图案的图像；使用计算机系统的处理器对所述图像中的一个图像的经成像的全息图进行数值化聚焦，以确定所述颗粒的焦点平面；其中，所述数值化聚焦包括所述焦点外图像传播至不同距离，从而允许通过所述处理器对焦点量度进行数值化确定；使用所述处理器使所述焦点量度与每个数值化传播图像关联，使得能够找到每个数值化传播图像的所述聚焦量度的极值；和允许所述计算机系统进行所述样品室的单阶段移动以将所述样品定位于所要求的焦点位置。
在根据本发明的一个实施方式中，通过测量颗粒的迁移率来测量颗粒对表面的亲和性的方法包括使用物理力施加机构将物理力施加于放置在平面上的多个颗粒；和测量所述多个颗粒对所述物理力的反应；其中，所述测量步骤包括脉冲反应测量或频率反应测量中的一种。
在根据本发明的一个实施方式中，测量颗粒的迁移率的方法包括使用物理力施加机构将物理力施加于多个颗粒；测量所述颗粒对所述物理力的反应；其中，所述测量步骤包括采集视场中的所述颗粒的全息图像序列；和与将所述物理力施加于所述多个颗粒同步地对所述全息图像序列进行统计分析，以获得所述颗粒的迁移率的测量结果。
在一个实施方式中，所述颗粒被放置在表面上，并且所述物理力施加机构包括可以移动所述样品的平移平台，其中平移平台移动的充分加速导致相对于所述表面的额外颗粒运动，并且其中所述移动是不连贯运动(例如步进式(step-like)脉冲反应测量)或连续运动(例如频率反应测量)中的一种。
在一个实施方式中，所述物理力施加机构包括使用光学施力机构以光学方式生成的力。或者，所述物理力施加机构包括外部机构，所述外部机构包括超声机构、声学机构、与珠子/细胞的物理探针接触、平台的物理运动或者提供液体流的自动化流体流式设备。
在一个实施方式中，确定多个颗粒与样品保持器的表面的相互作用的方法包括：使用物理力施加机构，将物理力施加至样品保持器上的至少一个颗粒样品，或者施加至样品保持器的表面；使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射所述颗粒；使用所述成像装置，通过采集所述视场中的所述颗粒的全息图像序列来测量所述颗粒对所述物理力施加机构的反应；所述图像的所述采集与所述物理力施加机构同步；使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由成像装置捕获的所述全息图像进行统计分析；其中，所述图像包括由所述颗粒衍射的第一分量，和不被所述颗粒衍射的第二分量，并且所述两个分量在成像平面中干涉，从而获得由所述处理器产生的干涉图案，所述干涉图案由颗粒强度波动值表示颗粒；并且其中通过扩散或者所述物理力施加机构中的一种能够移动的所述颗粒显示高强度波动，而结合至所述样品保持器的所述表面的那些颗粒显示低强度波动，从而获得所述样品保持器的所述表面上的所述相互作用的性质。
在一个实施方式中，使用全息显微装置捕获颗粒样品的图像序列；其中每个图像展示表示所述颗粒样品的干涉图案，所述干涉图案包括衍射分量和非衍射分量；和调节图像的散焦(defocus)量以改善干涉图案的信噪比。当所述干涉图案具有较高的对比度时，所述信噪比得到改善。然后处理图像序列，获得统计学图像，从而获得颗粒动态信息。反映响应所述物理力的颗粒的图像序列中的像素的强度波动的所述统计学图像然后可以使用由颗粒邻域(neighborhood)组成的蒙蔽图像蒙蔽(mask)。通过对图像采用标准图像处理技术(例如背景校正、边缘检测、图像过滤)可以生成颗粒邻域蒙蔽图像。所采集的图像序列中的一帧足以确定颗粒的邻域，因为图像序列的持续时间期间颗粒位置的变化显著小于平均颗粒间距离。这意味着利用所生成的颗粒邻域，仅使用所述序列中的一个图像就可以毫无疑义地标识颗粒。利用颗粒邻域蒙片正片叠底统计学图像后，可以生成一组与每个颗粒关联的统计学数量。可以针对每个颗粒计算这些数量的平均值，以生成聚集的颗粒迁移率或颗粒运动的统计学测量，得到视场中这些数量的全息分布。这种分布也利用来自部分视场以及多个视场的颗粒来生成。
在一个实施方式中，统计学图像采用如下方法生成：计算像素强度的像素级((pixel-wise))标准偏差，除以像素强度的像素级平均值，得到针对所述图像序列的像素强度的归一化标准偏差的统计学图像。统计学图像可以使用颗粒邻域的图像蒙蔽以生成针对每个颗粒进行平均值运算的归一化标准偏差值。可以对如此生成的针对每个颗粒的平均归一化标准偏差值进行全息图作图，以生成这些值的分布。相对于具有较低的归一化标准偏差值的颗粒而言，高归一化标准偏差的颗粒是展示高迁移率或移动大的颗粒。可以选择归一化标准偏差的阈值来区分移动最小的颗粒级分(即低归一化标准偏差值)与展示更多移动自由度的颗粒(较高归一化标准偏差)。可以采用归一化标准偏差的其他阈值来选择具有中度归一化标准偏差值的其他级分。
在一个实施方式中，可以通过测量归一化标准偏差值小于结合颗粒的阈值的颗粒级分来进行包括测量结合颗粒级分的测定。对于具有统计学显著性的待结合颗粒级分，必须表征背景信号水平。背景信号可以通过测量实验条件下一般应当没有结合的类似颗粒分散体来表征。在这种条件下发现将要被结合的这些未粘合颗粒级分(即，具有小于阈值的归一化标准偏差值的这些颗粒级分)是背景信号。知道这种级分以及实验中受检颗粒的数量，就可以利用二项式概率分布来确定由背景源生成给定实验结合级分测量的统计学概率。可以基于结果的希望的统计学显著性来确定结合颗粒级分的最小阈值，以决定在颗粒分散体与受处理表面之间是否已经发生阳性反应。
在一个实施方式中，可以使用生成颗粒物理运动(例如行进距离均方根)与其归一化标准偏差值之间的关系的受控颗粒移动校准实验或者受控颗粒运动的模拟来生成校准曲线。
在一个实施方式中，统计学图像可以通过像素统计学量度的一些组合来生成，所述像素统计学量度包括平均像素值、像素标准偏差、像素方差、高阶像素波动、像素时间相关函数、像素空间相关函数、像素空间-时间相关函数、背景像素值、背景像素标准偏差、背景像素方差、高阶背景像素波动、背景像素时间相关函数、背景像素空间相关函数、背景像素空间-时间相关函数。像素统计学量度可以在图像序列上以像素级生成，然后针对颗粒邻域计算平均值。像素统计学量度可以针对颗粒邻域进行计算，然后针对所述序列的其他图像中的对应邻域进行计算。颗粒邻域蒙片可以使用所述序列中的一帧来生成。可以使用来自所述序列的多帧来生成颗粒邻域蒙片。像素统计学量度可以针对所述图像序列中的子集进行计算。像素统计学量度可以针对所述图像序列的连续子集(successive subset)进行计算，生成时间变化统计学测量/颗粒。可以使时间变化统计学测量/颗粒与时间变化实验条件(例如物理移动、振动、溶液条件、流动条件、其他环境效应)关联。可以进行基于颗粒的统计学测量的空间和时间相关。可以计算基于颗粒的统计学测量的时间变化空间-时间相关(不同于基于像素的统计学测量)。可以选择统计学颗粒测量中的阈值以选择具有希望的表面亲和性、具备商业诊断相关性的相互作用特性的级分。选定级分中的阈值可以根据希望的统计学显著性选择为在指示阳性结果之前指示测量需要的最小级分水平。
在一个实施方式中，随时间追踪颗粒位置，并且可以生成颗粒位置的统计学量度(例如均方位移(mean squared displacement)、净位移(netdisplace)等)，并针对多个颗粒对这些量的分布进行作图。颗粒位置量度中的阈值和基于颗粒位置的颗粒统计量可以用来确定具有标靶颗粒-表面亲和性的级分。颗粒移动的统计学量度可以基于均方颗粒位移、平均颗粒位移、净颗粒位移、高阶颗粒位置统计数量或任何或所有这些量的组合。可以为对照目的(例如背景校正)而测量颗粒移动的类似量度。
在一个实施方式中，确定多个颗粒与样品保持器的表面之间的相互作用的方法包括：使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在流体流式设备的透明底部表面上的颗粒样品；使用所述成像装置，通过采集位于所述视场中的所述颗粒的全息图像堆栈，测量处于热平衡的所述颗粒的移动；使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述全息图像进行统计分析；其中所述统计分析包括通过所述全息图像堆栈确定每个像素的位置，以确定每个像素的标准偏差及其平均像素值；使用所述处理器生成每个所述像素的全息波动图像；其中，所述全息波动图像是所述图像堆栈每一个所述像素的归一化标准偏差分布的表示；使用所述处理器处理所述全息波动图像，以生成针对每个所述颗粒的平均归一化标准偏差的分布；其中信号强度中相对较大波动指示所述颗粒在运动，而信号强度中相对较小波动或缺乏波动指示所述颗粒不存在；并且由此获得与所述样品的迁移率和所述颗粒在所述样品保持器的表面上的相互作用有关的信息。
在一个实施方式中，在热平衡位置分析颗粒的运动的波动，并且所述统计分析包括使用全息显微装置捕获所述颗粒样品的图像序列；分析所述图像序列以确定每个像素的平均值和标准偏差；生成全息波动图像，由此使每个像素值等于该像素随时间的标准偏差值(除以该像素的平均值)；并且处理所述全息波动图像以生成针对每个颗粒的平均归一化标准偏差(NSD)的分布。
在一个实施方式中，未结合颗粒或部分结合颗粒在较低温度的运动比在较高温度的运动更加受到限制。在一个实施例中，在三个不同温度获取的扩散在平板玻璃质盖玻片上的4.8μm二氧化硅珠子的归一化标准偏差分布图显示，分布的平均值随温度上升，反映了珠子的增加的均方位移作为温度的函数。
对于自由扩散，均方位移与温度呈线性比例：
<Δx2>=4D t,D=kB T/(6πηr)，
其中，D是扩散系数(或者有效扩散系数)，t是颗粒位置测量之间的时间间隔，KB是玻尔兹曼常数，T是开氏温度，η是粘度(或有效粘度)，而r是球形扩散体的半径。珠子运动测量值和模拟值之间的比较证实归一化标准偏差是珠子迁移率的量度的优异选择。上述自由扩散公式还可以应用于展示受阻扩散的珠子/细胞，从而生成有效扩散系数估计值。
在一个实施方式中，统计分析包括使用全息显微装置捕获颗粒(例如红细胞)的图像序列；分析所述图像序列以确定每个像素的平均值和标准偏差；生成全息波动图像，由此使每个像素值等于该像素随时间的标准偏差值(除以该像素的平均值)；并且处理具有归一化标准偏差值的所述全息波动图像，以生成针对每个颗粒的平均归一化标准偏差(NSD)的分布。
在一个实施方式中，确定多个颗粒与样品保持器的表面之间的相互作用的方法包括：使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在流体流式设备的透明底部表面上的颗粒样品；使用所述成像装置，通过采集位于所述视场中的所述颗粒的全息图像堆栈，测量处于热平衡的所述颗粒的移动；使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述全息图像进行统计分析；其中所述统计分析包括通过所述全息图像堆栈确定每个像素的位置，以确定每个像素的标准偏差及其平均像素值；使用所述处理器生成每个所述像素的全息波动图像；其中，所述全息波动图像是所述图像堆栈每一个所述像素的归一化标准偏差分布的表示；使用所述处理器处理所述全息波动图像，以生成针对每个所述颗粒的平均归一化标准偏差的分布；其中信号强度中相对较大波动指示所述颗粒在运动，而信号强度中相对较小波动或缺乏波动指示所述颗粒不存在；并且由此获得与所述样品的迁移率和所述颗粒在所述样品保持器的表面上的相互作用有关的信息。
在一个实施方式中，确定样品保持器中多个颗粒之间的相互作用的方法包括：(1)使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在样品保持器上的颗粒样品；(2)使用所述成像装置，通过采集位于所述视场中的所述颗粒的全息图像序列，测量处于热平衡的所述颗粒的形状；(3)使用所述处理器检测每个所述全息图像中的每个所述颗粒；(4)使用所述处理器确立(estabilsh)在每个所述全息图像中彼此临近的一对所述颗粒可以结合在一起并且可以展示相关运动；(5)使用所述处理器提取每个所述临近颗粒对的图像，形成两个子图像；(6)使用所述处理器将所述两个子图像正片叠底(multiply)在一起，以获得乘积子图像(productsub-image)；(7)针对所有所述全息图像中的所有临近颗粒对重复步骤(3)至步骤(6)，得到与每个所述临近颗粒对相对应的乘积子图像序列；(8)使用所述处理器计算所述乘积子图像序列的像素级标准偏差；(9)通过如下方法生成所述临近颗粒对中的一个颗粒的平均标准偏差：使用所述处理器，通过计算所述像素级标准偏差的平均值，除以整个乘积子图像上每个像素的平均值；其中粘合在一起的临近颗粒对具有增加乘积子图像值的相应归一化标准偏差(相对于没有粘合在一起的那些临近颗粒对)的相关运动，以获得分布较窄的相对较低的乘积子图像值的所述归一化标准偏差(相对于没有显示相关运动的未结合颗粒)，其中子图像值的所述归一化标准偏差相对较高，分布相对较宽，使得结合颗粒对区别于未结合颗粒对。
在根据本发明的一个实施方式中，所述统计分析包括：使用全息显微装置捕获样品颗粒的图像序列作为全息图像；检测每个全息图像中的每个颗粒；确定每个全息图像中的临近颗粒对；通过提取每个颗粒对中的每个颗粒的图像来分析每个颗粒对，从而形成两个子图像；将所述两个子图像的每个图像正片叠底(或添加(add))在一起，以获得乘积(和(summed))子图像；针对所有临近颗粒对重复所述分析步骤；针对所述序列中的所有全息图像重复所述分析步骤，得到与每个独特临近颗粒对相对应的乘积(和)子图像序列；针对每一对计算乘积(和)子图像序列的像素级标准偏差和像素级平均阵列；计算像素级标准偏差除以所述产品(和)子图像上的每个像素的平均值的平均值，以获得每个颗粒的平均归一化标准偏差。
在根据本发明的一个实施方式中，所述颗粒/细胞被放置在经过抗体处理的表面上，使得所述抗体选择性地结合被预定抗原包被的颗粒/细胞。另外，颗粒/细胞的运动基于颗粒/细胞与所述表面上的所述抗体的结合而受到限制。没有与所述抗体反应的颗粒/细胞没有结合并且在所述表面上自由(相对自由)地扩散。
在根据本发明的一个实施方式中，所述颗粒是红细胞，并且所述红细胞结合至所述表面上的抗体，所述表面对所述红细胞的表面上的抗原具有特异性。
在根据本发明的一个实施方式中，所述颗粒可以是表达表面抗原(例如表面受体)的细胞和结合至固定在所述表面上的特异性抗体和/或受体配体的细胞，具有较低的迁移率。于是，通过测量迁移率(例如归一化标准偏差)，可以确定细胞表面上抗原覆盖的存在、不存在和/或程度。
在根据本发明的一个实施方式中，所述颗粒是带有可以与自由扩散抗原竞争表面结合位点的表面抗原的细胞/珠子。所述扩散物种的存在可以以浓度依赖性方式影响结合细胞/珠子的迁移率。这种类型的测量可以用来确定与所述珠子/细胞结合物种竞争表面结合位点的自由扩散物种的存在、不存在和/或浓度。
在一个实施方式中，对样品保持器表面上的不同类型颗粒进行选择性检测的方法包括：将溶液中的颗粒样品引导至所述样品保持器的抗体包被表面上，所述颗粒要么被一种类型抗原包被，要么被另一种类型抗原包被；其中被一种类型抗原包被的颗粒特异性地结合至包被在样品保持器上的被固定的特异性抗体，由此限制所述颗粒的运动；其中被另一种类型抗原包被的颗粒没有特异性地结合至所述样品保持器，并且所述颗粒在所述样品保持器的表面上的所述溶液中自由扩散；使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在所述样品保持器上的所述颗粒样品；使用所述成像装置，通过获取位于所述视场中的所述颗粒的全息图像堆栈，测量处于热平衡的所述颗粒的移动；使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述全息图像进行统计分析；其中所述统计分析包括通过所述全息图像堆栈确定每个像素的位置，以确定每个像素的标准偏差及其平均像素值；使用所述处理器生成每个所述像素的全息波动图像；其中，所述全息波动图像是所述图像堆栈每一个所述像素的归一化标准偏差分布的表示；使用所述处理器处理所述全息波动图像，以生成针对每个所述颗粒的平均归一化标准偏差的分布；并且其中位于所述视场中的所述特异性结合颗粒在归一化标准偏差量度中显示出相对较低的量级和相对较窄的分布，平均值相对较低，而自由扩散的颗粒显示出相对较高的量级和相对较宽的分布，所述归一化标准偏差分布的平均值实质性地相对较高；由此确定所述颗粒上的所述一种类型抗原或所述另一种类型抗原或者所述样品保持器上的所述特异性抗体。
在根据本发明的一个实施方式中，所述颗粒是带有可以结合至存在于溶液中的扩散部分的表面抗原的细胞/珠子。而且，所述部分可以具有同时结合至经适当处理的表面(固相)的能力。采用这种方式，通过测量所述经适当处理的表面(固相)上的适当包被颗粒的迁移率，可以确定所述溶液中所述部分的存在和数量。所述扩散物种的存在可以以浓度依赖性方式影响结合细胞/珠子的迁移率。这种类型的测量可以用来确定用作所述颗粒捕获剂的自由扩散标靶部分的存在、不存在和/或浓度。
在一个实施方式中，没有结合至所述表面上的抗体的血细胞展示归一化标准分布的较宽分布，归一化标准偏差的平均值高，而结合至所述表面上的抗体的血细胞展示较窄分布，并且归一化标准分布的平均值低。
在一个实施方式中，中度水平的结合是可检测的，如带有中度归一化标准偏差的血细胞的增加级分所示。
在一个实施方式中，通过如下方法，通过测量异源性有效扩散性质可检测的带有异源性结合性质的颗粒通过如下方法是可检测的：分析分布的宽度和形状，将通过实验测得的分布与异源性扩散模型拟合，从而获得可以反映颗粒-表面相互作用和亲和性的扩散性质的群体分布的估计值。
在一个实施方式中，当存在结合在一起的颗粒对的相内运动时，出现相关波动。另外，结合在一起的临近颗粒对将具有相关波动，所述相关波动将增加乘积(和)子图像的相应归一化标准偏差的值(与没有结合在一起并且由于没有相关波动而具有相对较低归一化标准偏差的那些颗粒对相比)。
在一个实施方式中，作为诊断程序来检测颗粒形状的方法包括：使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在样品保持器上的颗粒样品；使用所述成像装置，通过采集位于所述视场中的所述颗粒的全息图像序列，测量处于热平衡的所述颗粒的形状；使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述全息图像进行统计分析；其中所述统计分析包括确定所述全息图像序列上的所述颗粒的空间强度；使用所述处理器生成每个所述像素的全息波动图像；其中，所述全息波动图像是所述图像序列每一个所述像素的归一化标准偏差分布的表示；使用所述处理器处理所述全息波动图像，以生成针对每个所述颗粒的平均归一化标准偏差的分布；其中由于外部施加力或热波动中的一种的原因而更容易地改变它们的形状的所述颗粒与相对而言更加具有刚性的所述颗粒相比展示出相对较高的空间强度波动；并且其中所述全息图像序列上的所述颗粒的所述空间强度的所述统计分析的这些归一化标准偏差分布可以用作颗粒挠性、弹性/粘弹性、健康或疾病、年龄、溶液条件或结合状态中的至少一种的诊断。
至此，已经概述了根据本发明的一些特征，目的是可以更好地理解本发明随后的具体实施方式，并且更好地认识到本发明对现有技术的贡献。当然，本发明还有将在下文中描述并且遵循所附特征的主题的其他特征。
在该方面，在详细说明根据本发明的至少一个实施方式之前应当理解的是，本发明的用途不限于在以下具体实施方式中给出或在附图中展示的部件/组分的布置/配制和结构的细节。根据本发明的方法和装置可以包括其他实施方式并且能够以各种不同方式实践或实现。还应当理解的是，本文使用的措辞和术语以及说明书摘要仅出于描述目的并且不应当理解为用于限制目的。
因此，本领域的技术人员应当认识到，本公开内容所根据的构想可以容易被用作设计用于实现本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此重要的是，这些特征应当被看作包括这些范围内的等同结构，只要它们没有偏离本发明的方法和装置的实质和范围。
附图说明
图1A是联机(in-line)全息显微装置的示意图，所述全息显微装置设计为测量细胞/颗粒的迁移率以推断细胞/颗粒分散体的粘弹性性能/集体扩散性能和/或表面相互租用。
图1B是样品保持器的截面图，所述样品保持器上具有透明表面，在所述透明表明上提供有至少一个细胞/颗粒。
图1C是透明样品保持器的截面图，所述透明样品保持器具有玻璃质载玻片、隔离件和经处理的盖玻片，由此形成容纳有颗粒分散体的样品室。所述颗粒可是使用图1A的采集硬件、照射源、显微镜物镜以及成像光学器件进行成像。
图1D是样品保持器的截面图，在所述样品保持器的最低表面(1)或最高表面(2)上具有反射/部分反射表面，在所述表面上提供有至少一个细胞/颗粒，从而还可以以反射模式进行测量。样品室包括沉降至经处理的盖玻片表面的颗粒分散体。
图2展示了图1B的全息图像如何由于扩散而移位以及如何可以导致像素强度的大波动。
图3A显示了样品室的截面，样品流体移动通过所述样品室。
图3B显示了盖玻片的受差异化处理的区域(A、B、C和D)的俯视图，每个区域具有异源性的颗粒混合物，其中每种类型的颗粒是可区别的(通过例如荧光标记或全息图像特征加以区别)。
图4，屏幕截图A是显示2μm二氧化硅珠子的全息图像，而屏幕截图B显示由全息图像堆栈(60张图像)生成的波动图像。
图5A显示全息图像堆栈的分析，获得通过所述图像堆栈上每个像素的用像素级标准偏差除以像素级平均值而建构的全息波动图像S(i，j)。
图5B显示如何使用波动图像(即归一化标准偏差(NSD)图像)计算每颗粒波动测量结果，所述波动图像由颗粒邻域蒙蔽图像蒙蔽，所述颗粒邻域蒙蔽图像由全息图序列的一张图像生成。对每个颗粒邻域的归一化标准偏差值进行平均计算，然后制作柱状图。
图6，屏幕截图A显示在5℃去离子水中的2μm二氧化硅珠子的全息波动图像(由60帧堆栈建构)，而屏幕截图B显示在47℃去离子水中的2μm二氧化硅珠子的全息波动图像(由60帧堆栈建构)。明亮区域(代表因颗粒移动导致的高强度波动区域)在较低温度时受到较多的约束。
图7显示在6.8℃(底部柱状图)、28℃(中间柱状图)和46.3℃(顶部柱状图)测量的在水中的4.8μm直径的二氧化硅珠子的归一化标准偏差的三张柱状图。柱状图中的主峰与自由扩散颗粒相对应，而较低值的NSD(5%至10%)的小峰表示珠子的被粘连或被部分粘连至表面的明显较小的级分。
图8是自由扩散的4.8μm珠子的在不同温度测量的NSD值的平均标准偏差的图(空心正方形)。
图9画面(1)显示将每种类型的颗粒放在抗体包被表面上(即，直接免疫测定)。被A抗原包被的颗粒特异性地结合至包被在盖玻片表面上的被固定的特异性抗体(A抗体)，由此限制颗粒的运动。
图9画面(2)显示每种类型颗粒的不同表现，其中没有特异性结合的B-抗原包被颗粒在溶液中可以在表面上自由扩散，而A型颗粒运动由于与表面抗体的特异性结合而受到严格限制。
图10A显示两种不同样品或RBC(红细胞)在抗-A包被表面上测量的归一化标准偏差柱状图的图。在表面上带有A抗原(即A型)的红细胞特异性地结合抗-A包被表面，而没有A抗原(即A阴性)的红细胞没有结合并因此自由扩散。
图10B显示对抗原A呈阳性(A型，黑色柱状图)的特异性结合细胞具有类似较窄的分布，具有类似较低的平均值(与图10A的A阳性柱状图相比)。
图11画面(1)显示每种类型颗粒被放在抗原包被表面上(其在溶液中存在互补抗体(即间接免疫测定)。溶液中的A抗体能够结合至A抗原包被表面，还同时能够结合至由A抗原包被的颗粒。
图11画面(2)显示每种类型颗粒的不同表现，其中没有特异性结合的B-抗原包被颗粒在溶液中可以在表面上自由扩散，而A型颗粒运动由于与抗体的特异性结合而受到严格限制，所述抗体本身特异性地结合至表面上。
图12A和12B显示在不同时间获取的两种红细胞样品的一系列NSD柱状图。图12A包括在存在分散在表面上的合成血浆中的高浓度的抗A-抗体(100nM)的情况下的类型A红细胞，类型B抗原在盖玻片表面上。如高平均值的NSD可观测值所证明的，细胞能够扩散。图12B显示在与图12A相似的条件下的时间系列柱状图，不同之处在于，所述表面在其上面具有类型A抗原(不像图12A的类型B抗原表面测量)。图12A和12B的装置图的比较可以让我们选择NSD的阈值以确定细胞结合与否。
图13A和13B与图12A和12B中测量的条件相似，不同之处在于，在合成血浆中使用低得多的抗体浓度(1nM抗-A)。在图13A中，在将样品引导到B类型表面上之后19分钟首次测量时，B类型表面上的A类型细胞大部分没有结合。在图13B中，在被引导至带有A类型抗原的表面上之后测量在含有1nM抗-A的合成血浆中的A类型细胞。
图14显示在图13A和13B中研究的相同样品的细胞粘附动力学。
图15，画面A显示4.8μm直径二氧化硅珠子的图像，其中使用颗粒追踪算法分析这种扩散珠子的40帧序列(每秒采集5帧)，在测量形心位置获得偏移序列(Δx和Δy)，如在图15画面B中所作的图。
图16，画面A显示由在图15中所示的颗粒追踪分析中使用的相同的40帧测得序列算得的NSD的图像，画面B，获得了针对珠子区域求均得到的23.6%NSD的NDS值。将针对集合体(ensemble)的每一个成员中的珠子区域的NSD平均值在图16中作图，画面B显示了与实验测得的NDS具有优异的一致性。
图17显示了将测得的珠子NDS分布的平均值与均方根位移(rootmean squared displacement)关联的校准曲线。
图18显示在图17中所作的校准曲线以及由两个其他珠子图像(4.8μm直径二氧化硅)生成的两个其他校准曲线。
图19显示来自图18的珠子以及称为对比度校正因子的数量。该因子通过计算每个珠子的邻域中(即在包围每个珠子的矩形内)的像素强度的标准偏差，除以相同区域中的像素强度的平均值(即归一化空间标准偏差)来确定。
图20的图A是合成血浆中的B类型红细胞的NSD柱状图，所述合成血浆包括分散在带有A抗原的表面上的抗-B。图20的图B是将在图20的图A中测量的每个红细胞的NSD值与其归一化空间标准偏差关联的散点图。
图21的图A显示在合成血浆中的B类型红细胞的NSD柱状图，所述合成血浆包括分散在带有B抗原的表面上的抗-B。抗-B抗体连接(attach)至红细胞上的B抗原以及表面上的B抗原，由此将细胞固定。结果，与A抗原斑块(图20的图A)上的细胞相比，生成的强度波动显著降低，如图21A的图A中的较低NSD测量结果所示。图21的图B是将在图21的图A中测量的每个红细胞的NSD值与其归一化空间标准偏差关联的散点图。
图22的图A和图B显示未结合(图20的图A)和结合(图21的图A)的红细胞NSD柱状图的校正和未校正的柱状图，其中通过使用线性拟合(图20的图B和图21的图B)以消除NSD对归一化空间标准偏差的依赖性来进行校正。
图23是在图22的图A和图22的图B中显示的柱状图的累积概率分布的图(即具有小于或等于特定NSD值的NSD的细胞级分的图)。
图24显示在水中的4.8μm直径珠子的NSD柱状图(上边柱状图)以及使用高斯分布的模拟NSD柱状图(下边柱状图)，其得到0.131μm的均方位移平方根(square-root mean squared displacement)。
图25显示在含有0.4%的盐水的水中的4.8μm直径珠子的NSD柱状图(上边柱状图)以及使用高斯分布的模拟NSD柱状图(下边柱状图)，其得到0.0064μm的均方位移平方根。
图26的图A、B和C显示在合成血浆中的类型A红细胞的NSD柱状图，所述合成血浆含有分散在带有B抗原的表面上的5nM抗-A。
图27的图A和B是未结合红细胞和结合红细胞的分别从一幅图像测得的归一化空间标准偏差值的图。
图28的图A和B对在总共40帧的序列上针对在图20的图A和图24的图A的未结合群体中的100个细胞的平均空间归一化标准偏差进行作图(图28的图A)以及在图20的图B和图24的图B的结合群体中的100个细胞的平均空间归一化标准偏差进行作图(图28的图B)。在两个图中，误差线标绘了在40帧序列上每个细胞的空间归一化标准偏差的标准偏差。
图29针对结合细胞和未结合细胞在40帧序列上对每个细胞测得的空间归一化标准偏差的标准偏差进行作图。
图30显示了用于使用全息聚焦的标准曲线。含有颗粒的校准样品位移距离焦点位置已知的距离，在每个距离采集图像。然后将每个图像进行数值化传播，并且将其焦点量度极值的位置标绘作为距离焦点样品距离的函数。
图31显示最初从距离焦点+1mm至-1mm之间的初始位置范围内开始的样品的最终位置。焦距内位置被可视化地确定并且具有估计为±1μm的误差。全息聚焦的精确度与焦点位置估计的误差相当。
图32A和32B显示颗粒/细胞对的校正图，其中子图像被用来部分结合颗粒/细胞对与未结合颗粒/细胞对。
图33A显示两种不同珠子分散体样品(4.8μm二氧化硅)在没有施加任何外力的情况下测得(即热平衡测量)的珠子强度波动(NSD，归一化标准偏差值)，其中一种样品结合至表面(密集交叉条纹柱状图)，而另外一种样品未结合至表面(带有稀疏斜纹图案的柱状图)。通过将珠子稀释在0.9%盐水溶液中使这样的珠子结合至玻璃质盖玻片的表面，同时通过将珠子稀释在去离子水中使它们在盖玻片上自由扩散。在这些实验条件(即重叠分布最小化)下使未结合珠子明显区别于结合珠子。图33B显示在施加阶段式移动后测量的相同样品。在沿着一个轴线将样品前后压电阶段式移动25μm后获取被分析的柱状图堆栈中的每个图像。系统上的这种物理摄动没有影响珠子结合群体(密集交叉条纹柱状图)的迁移率(与没有施加力所进行的测量相比)，如NSD测量所测定的。然而，未结合珠子显示出高于它们在图33A中的非施力的对应珠子的NSD值，结果提高了由阶段式运动生成的珠子迁移率。因此，施加物理力能够更好地解析结合群体和未结合群体，如在图33B中的结合珠子和未结合珠子柱状图之间更加分离所证明的。
具体实施方式
本发明涉及用于测量和检测的仪器和测量装置以及方法，所述仪器和测量装置以及方法根据它们所检测到的迁移率以快速且有效的方式表征细胞/颗粒的群体，或者能够检测细胞/颗粒的亚群。
装置
在一个实施方式中，图1A显示了联机(in-line)全息显微装置10的示意图，所述全息显微装置被设计为作为测量颗粒(即细胞)的迁移率的手段以推断表面相互作用(即特异性表面-颗粒相互作用)的存在或不存在、和/或颗粒分散体的集体扩散/粘弹性性能(例如有效粘度)。
在图1A和1C的例示性实施方式中，用于实现本发明的装置10包括相干光源100(例如，激光、超发光二级管)，所述相干光源100由准直器101准直，其可以偶合至光学纤维103，并且它的激光束104照射显微镜106的透明样品保持器105(即显微镜载玻片)。
在一个实施方式中，所述相干光源100是具有短相干波长(小于400μm)并且在660nm处工作的激光器。也可以使用其他波长和类型的照射源，包括非激光器光源(例如超发光二级管0和常规光源(例如LED、白炽灯、弧光灯)。全息光学俘获装置在本技术领域中是已知的，例如，如在授予Grier的美国专利No.7,161,140所公开的，在此通过引证方式将其全部内容引入本文。
在一个实施方式中，放置在样品保持器105上的样品107包括颗粒108(即细胞)的分散体，所述分散体放置在经处理或未经处理的透明表面109(即盖玻片109A)上。可以通过手动方式或者通过自动流体设备116(将在后文讨论，其结构和操作在本技术领域是已知的)将具有细胞/颗粒108的样品107引导至样品保持器105。
颗粒108可以沉降在表面109上以检测颗粒-表面相互作用。在一个实施方式中，颗粒108可以利用重力而沉降在表面109上。在另一个实施方式中，颗粒108可以利用使用离心机(例如117)施加于样品室118(见图3A)的离心力而沉降在表面109上。另外，在另一个实施方式中，颗粒108可以利用施加于颗粒108的其他力(将在本文中进一步讨论)而沉降在表面109上。
所使用的颗粒108可以具有不同的物理和化学属性，并且可以基于尺寸、形状和材料而属于不同的类型，从而在成像装置上获得可区分的图像。例如，颗粒108可以是具有一些对称性的规则形状(例如球形、长椭圆形、扁椭圆形)的珠子或是形状不规则的珠子。颗粒108可以由一种类型的材料制成，或者由多种类型的材料制成。颗粒108可以是实心的、多孔性的或者具有空洞核心的。颗粒108可以全部或者部分地被其他材料(一种或者多种)所包被。颗粒108可以是金属的或者部分金属的。颗粒108可以是非金属的或者部分非金属的。颗粒108的表面可以经过处理或者施加有纹理。颗粒108可以是表面上带有接头分子的二氧化硅珠子，或者带有连接在表面上的生物分子或合成分子的二氧化硅珠子。颗粒108还可以是带有连接至表面上的所述接头分子的生物分子或合成分子的二氧化硅珠子。颗粒108可以是由与颗粒108共价或非共价连接或者与颗粒108一体形成的荧光或发光标记分子(一种或多种)包被或嵌合的珠子，这样的珠子还可以基于荧光或发光发射光谱来区分颗粒类型。颗粒108可以是由与颗粒108共价或非共价连接或者与颗粒108一体形成的不同荧光或发光标记分子(一种或多种)的组合包被或嵌合的珠子，这样的珠子还可以基于荧光或发光发射光谱来区分颗粒的类型。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的纳米颗粒(一种或多种)、磁性纳米颗粒(一种或多种)或者荧光纳米颗粒(一种或多种)的珠子。
在另一个实施例中，颗粒108可以是生物细胞。颗粒108可以是经过遗传工程改造的生物细胞或者经过遗传工程改造的生物细胞的派生物。颗粒108可以是经过生物分子和/或合成分子处理的细胞。颗粒108可以是经过接头分子处理的细胞。颗粒108可以是这样的细胞，该细胞受到连接至接头分子的生物分子和/或合成分子的处理。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的荧光或发光标记分子(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是带有与颗粒108共价或非共价连接或者与颗粒108一体形成的不同荧光或发光标记分子(一种或多种)的组合的细胞。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的纳米颗粒(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的磁性纳米颗粒(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的荧光纳米颗粒(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是自然表达荧光蛋白(一种或多种)或者经过遗传改造而表达荧光蛋白(一种或多种)的细胞。
在一个实施方式中，具有颗粒108的样品107可以进一步通过在测量之前、测量期间或者测量之后在样品保持器105上引入试剂或者非反应性溶液来进行改性。例如，如图1B所示，对于细胞/颗粒108的表面相互作用的测量，样品保持器105的上面沉降有细胞/颗粒108的透明表面109可以提供有特殊的处理。
例如，可以以各种不同方式提供表面109(包括盖玻片109A)。在一个实施方式中，表面109可以是平整的并且是透明的。另外，表面109可以是平整的并且是部分透明的。还有，表面109可以是平整的并且完全反射的或者部分反射的。表面109还可以是具有纹理的平整表面。表面109可以使用生物分子或合成分子进行处理。表面109可以使用接头分子进行处理。表面109可以使用连接至接头分子的生物分子或合成分子进行处理。表面109可以使用不同的分子进行差异化处理。表面109可以使用不同的接头分子进行差异化处理。表面109可以分子混合物进行处理。表面109可以是微流体设备的一部分。表面109可以是微滴定板的一部分。表面109可以是透明的或者部分透明的样品室118(参见图1D和图3A)的一部分。表面109可以是反射性或部分反射性样品室118的一部分(即，图1D的反射性或者部分反射性表面120)。表面109可以在微观上是充分光滑的以允许对颗粒108进行成像。
在一个实施例中，图3B显示了样品保持器105上的盖玻片109A的受差异化处理的区域(A、B、C和D)的俯视图，每个区域具有异源性的颗粒108的混合物，其中每种类型的颗粒108是可区分的(通过例如荧光标记或全息图像特征加以区分)。请注意每个表面109、109A在颗粒108的异源性群体的迁移率量度上获得不同的相互作用(即，不同类型的颗粒108能够在各区域中扩散)。图3B展示了如何根据本发明通过使用颗粒108的可区分异源性(带有或不带有经过差异化处理的表面109、109A区域)同时探查很多不同类型的相互作用。
在一个实施方式中，可以同时测量颗粒108的异源性群体，可以针对不同的数量或者数量相似方案检测每种类型的颗粒(多路测量)(参见图3B)。可以根据标记(例如荧光、纳米颗粒)、颗粒图像(利用不同的吸收、散射、荧光、发光特性、荧光或发光发射谱、荧光或发光衰变半衰期)、和/或颗粒位置(假设颗粒类型的沉积受控)区分所有类型或一些类型的颗粒108。可以通过每种颗粒108的数据的多模式收集来区分所有类型或一些类型的颗粒108。可以根据由相干光源生成的它们的全息图像来区分所有类型或一些类型的颗粒108。可以根据由相干光源100生成它们的聚焦和/或散焦全息图来区分所有类型或一些类型的颗粒108。可以根据它们的在多于一个焦点平面上收集的全息图像来区分所有类型或一些类型的颗粒108。可以同时测量颗粒108的同源性群体。
在一个实施方式中，样品107包括由生物分子A包被的颗粒108、在存在含有(或不含有)生物分子A以及含有(或不含有)其他类型的生物分子(例如生物分子C、D、E等)的溶液的情况下由生物分子B包被的表面(即固相)。所述方法的样品测量通过响应受控力或热力的颗粒迁移率的分析，在存在用于研究、工业和/或临床目的的溶液的情况下，得到颗粒108和表面109之间的生物分子相互作用的信息。
在根据本发明的一个实施方式中，颗粒108是带有表面抗原的细胞/颗粒108，所述表面抗原可以结合至存在于溶液中的扩散部分。另外，所述部分可以具有同时结合至经适当处理的表面(固相)的能力。采用这种方式，可以通过测量在经适当处理的表面109(固相)上的适当包被颗粒的迁移率来测量所述部分在溶液中的存在或数量。这种扩散物种的存在可能以浓度依赖性方式影响结合细胞/珠子108的迁移率。这种类型的测量可以用来确定用作颗粒的捕获剂的自由扩散标靶部分的存在、不存在和/或浓度。
在一个例示性的实施方式中，如果在细胞/颗粒表面108a上探查特定的抗原(参见图1B和1C)，对透明表面109的适当表面处理可以包括使用适合的接头分子对表面109进行化学改性，以能够将适当的抗体连接至表面109上，这允许呈递标靶抗原的细胞/颗粒108与透明表面109上的表面抗体发生特异性结合。在这种情况中，在它们的表面108a上没有标靶抗原的细胞/颗粒108不会特异性地结合至透明表面109的表面上。在例如测量细胞/颗粒108扩散性能(例如有效扩散系数、有效粘度或粘弹性性能)的情况中，将使用惰性表面109。
细胞/颗粒108可以通过显微装置的显微镜物镜110(参见图1A)和镜筒透镜111来成像，所述镜筒透镜111可以将细胞/颗粒108的放大图案在CCD或CMOS照相机112上成像，所述照相机112连接至用于图形处理等的计算机113。样品107的不同区域可以使用平移平台114(例如自动显微镜平移平台)平移样品107来成像，所述平移平台114在本技术领域中是已知的。样品保持器105还可以允许使用其中的温度控制装置使所有或部分的检测区域的温度受到控制，从而例如允许在生物分子相互作用发生的优化温度进行温育。另外，利用显微镜106成像的焦平面可以使用焦点控制器115(还可以由马达驱动)进行调节。
在一个实施方式中，当颗粒108被包被或者具有嵌合荧光或发光分子或纳米颗粒(其根据荧光或发光发射光谱利用颗粒类型加以区分)时，装置10应当装配有荧光或发光激发源100、适当的滤波器(未显示)和二向色元件(未示出)并且具有颜色检测功能(例如彩色照相机113和/或发射滤波器选择)。引导不同类型并且每种类型进行独特包被的颗粒108可以允许进行多路测量(即，同时进行多种类型相互作用的测量)。
不像很多传统的荧光多路测量中的那样，分离洗涤步骤是不需要的，这是因为没有标志阳性结合相互作用的特定颗粒108存在，指示阳性结合的是颗粒的迁移率测量。
在根据本发明的另一个实施方式中，透明、半透明或部分镜似样品107和带有反射涂层120的样品室118(参见图1D)可以以反射模式进行测量，包括激光器照射(或者可选的照射源)以从收集侧照射样品107，图像形成由从样品107反射的光发生，样品107随后在计算机113的监视器上成像。
在本发明的又一个实施方式中，所述透明样品保持器105是如本文所述的带有数据采集和分析功能的微滴定板设备或自动流体设备116(请参见图3A)。颗粒108流动进入到微流体设备116的样品室118中，或者通过机器人微滴定装置将颗粒108引导到微滴定板中，所述机器人微滴定装置将一定量的样品107(颗粒108和溶液)引导到不同的板孔中。每个板孔可以具有独特的表面化学性，由位置标引，允许进行多个检测(例如独立的结合测定)，最终允许以多个表面109检测单个样品107(或者多个样品107)。
上面沉降有颗粒108的透明表面109可以由经处理的塑料或玻璃制成。微滴定板可以具有或者可以不具有定制的构造，包括光学透明盖、样品输送区、样品观察区等。在此概述的仪器可以与用于将流体从样品容器自动(并且是可平行地)输送至每个板孔、用于样品混合和温育功能以及平行化微滴定板测量功能的机器人微滴定板操作机器一体形成，其可以是可程序化的和自动化的。于是，测定可以设计为以平行方式对一个或大量样品107进行多种检测。而且，可以使用适当平行化的光学对准(train)和检测装置(setup)以平行方式测量多个微滴定板。机器人装置可以将微滴定板馈送至检测区以以自动方式进行测量，从而允许无需使用者干预的情况下对微滴定板堆栈进行测量。
在添加溶液、颗粒或混合物或者更换溶液、颗粒或混合物和/或在不同温度温育之后，可以重复给定样品室105、微流体样品室105或微滴定板板孔中的测量。
可以通过将额外的分析物引导至所述样品室/板孔溶液(一种或多种)中而在给定样品室105、微流体样品室105或微滴定板板孔(一个或多个)中进行滴定测量。
另外，可以在给定样品室105、微流体样品室105或微滴定板板孔(一个或多个)中进行动力学实验，接着在将额外的分析物引导至样品室/板孔溶液(一种或多种)中之后(或者不引导)进行一时间过程的颗粒迁移率测量(例如NSD)。
所公开的测定方法可以作为供计算机系统使用的计算机程序产品实现。这些实现方式(implementation)可以包括一系列的计算机指令，所述计算机指令固定至有形介质(例如计算机可读介质(例如软盘、CD-ROM、ROM、或硬盘)或者经由调制解调器或其他接口设备(例如利用介质连接至网络的通信适配器)可传送至计算机系统。所述介质可以是有形介质(例如光学或模拟通信线路)或者通过无线技术(例如微波、红外或其他传送技术)实现的介质。所述一系列的计算机指令包括全部或者部分本文此前针对所述系统描述的功能。本领域的技术人员应当认识到，这些计算机指令可以采用众多程序语言编写以供很多计算机体系结构或者操作系统使用。
可以预料的是，这种计算机程序产品可以作为附随有打印文档或电子文档(例如压缩打包软件)的可移动介质进行发配，或者与计算机系统预加载(例如在系统ROM或硬盘上)，或者在网络(例如互联网或万维网)上由服务器或电子公告板发配。当然，本发明的一些实施方式可以作为软件(例如计算机程序产品)和硬件这两者的组合实现。另外，本发明的其他一些实施方式可以全部作为硬件或者全部作为软件(例如计算机程序产品)实现。
结合技术
在一个实施方式中，多个颗粒108(例如表达受体的细胞108)被放置在表面109(即固相)上，所述表面109经过使用诸如受体配体(即固相)处理，使得所述配体将选择性地检测颗粒108的被与所述配体互补的受体包被的一些级分。
颗粒108与样品溶液中的标靶受体竞争固相上的结合位点，所述固相的目的是用于确定所述样品溶液中的受体。含有标靶受体的溶液可以在引导包被颗粒108之前在固相表面109上预温育。
在一个实施方式中，多个颗粒108是在它们的表面上表达蛋白的细胞，并且被放置在表面109(即固相)上，所述表面109由诸如蛋白结合受体或者抗体的部分进行处理，使得所述表面蛋白选择性地被所述固相受体或抗体结合。换言之，颗粒108被互补抗原包被，然后其与样品溶液中的抗原竞争固定在固相上的蛋白结合受体/抗体上的结合位点。如上所述，带有标靶抗原的样品溶液可以在引导包被颗粒108之前在样品室105、、微流体样品室105或微滴定板孔(包括固相)中预温育，其然后结合至固相上的空余抗体，并且根据它们的迁移率可区别于未结合颗粒108。利用校准，所述方法可以获得所述样品溶液中的标靶抗原浓度。
颗粒108上的抗原/抗体/分析物/表面蛋白的覆盖强度(或者细胞中的表面蛋白的表达水平)可以根据使用已知的溶液条件在已知固相上观察到的受限运动的程度进行估计。
固相包括对感兴趣的分析物的特定表位(一种或多种)具有特异性的固定化捕获抗体，并且颗粒108可以被对相同分析物的不同区域上的表位具有特异性的第二抗体(secondary andibody，即，类似于“标记抗体”)包被，使得固相捕获抗体和结合“标记抗体”的颗粒可以同时结合至分析物(即夹心式测定法)。结合至表面109的颗粒108由于这种相互作用而可以被用来测量未知样品107的分析物浓度。另外，级分颗粒结合(即结合颗粒的级分)的动力学可以用作测量分析物浓度以及分析物生物化学性质(例如速率常数、平衡常数等)的方法。这样的测量不需要“标记抗体”洗涤步骤，因为结合的“标记抗体”(即，抗体包被颗粒)可以通过它们的扩散行为(即，结合颗粒显示出显著较小的迁移率)或者对物理力的反应(即，结合颗粒对物理力显示出显著较小的反应)而区别于未结合颗粒108。不像传统的免疫测定法，“标记抗体”不是必需要指示阳性结合相互作用。它们的存在是必要的但不是充分的。阳性结合相互作用最终由颗粒迁移率测量结果确定。
在一个实施方式中，多个颗粒108是红细胞108，并且结合至表面109上的抗体。
在一个实施方式中，标靶抗体取自血液样品，并且检测是针对受独特处理表面的阵列进行的，以确定抗体谱图(andibody profile)。具体地说，标靶抗体取自用于检测病毒感染目的的血液样品。出现在给定病毒的表面的蛋白可以被固定至表面(即，固相)，从而能够俘获对该病毒具有特异性的抗体。另外，被与病毒抗体的另一个区域互补的抗体包被的颗粒存在于该检测中，使得在存在标靶病毒抗体的情况下，可以发生颗粒的固定，从而对血液样品中抗体的存在进行信号传导。进行这种测量以使用适当的对照来诊断感染或者量化标靶抗体浓度。
如通过颗粒结合来降低颗粒迁移率所测量的，颗粒结合的量级和结合强度的动力学可以用作测量分析物浓度和生物化学性质(例如速度常数和平衡常数等)的方法。
全息聚焦
多视场测量、样品室118(参见图3A)、微流体室118和/或微滴定板室可以要求多重再调焦事件(event)。为了增加这种测量的通过量，聚焦时间应当保持最小。
传统聚焦技术要求多焦点偏移，并且要求比较在这些不同焦点位置采集的图像。通过利用针对每个图像的焦点量度，可以确定焦点偏移是否靠近真实焦点位置。样品107多次物理移动以确定焦点的事实使得该技术是耗时的。
然而，与传统技术不同的是，使用相干光源100来对颗粒108进行成像允许对成像的全息图进行数值化处理以以快速方式确定颗粒108的焦点平面。例如采用相干光源100照射透明样品室118中的具有颗粒108的样品107，即使明显处于焦点之外也能够对颗粒108衍射图案进行成像。用于聚焦的数值化方案允许在焦点外的长距离范围内进行快速聚焦。数值化聚焦包括焦点外图像传播到不同的距离，这允许对焦点进行数值化确定。通过使焦点量度与每个数值化传播图像关联，可以找到焦点量度中的极值，从而允许单阶段移动来将样品定位在所需的焦点位置。这与传统聚焦方法明显不同，传统聚焦方法要求比较慢地物理扫描样品通过不同的焦点距离以根据一些焦点量度确定焦点位置。
因此，可以在一定距离范围内数值化传播所采集的焦点外衍射图案以确定使焦点量度最大化的距离。一旦数值化确定该距离，就可以执行单阶段移动来将样品107定位至所需的焦点位置。
在采集用于执行数值化传播计算的图像中，可以使用专用聚焦照相机217(参见图1A)。在一个实施方式中，可以将该照相机放置在成像平面上，该成像平面不同于用于通过分束器218测量迁移率的照相机112的成像平面。于是，由收集自该独立的聚焦照相机217的图像进行聚焦计算，所述聚焦照相机217位于相对于测量照相机而言在焦点外的位置。
聚焦和迁移率测量还可以都使用单个照相机112来进行。可以在样品107的受控散焦之后收集用于聚焦目的的图像。
图30展示了由数值化传播图像生成的校准曲线形成校准样品107，该校准样品107从真实焦点上方1mm的位置平移至焦点下方1mm的位置。在物空间中从焦点平移开1mm的专用聚焦照相机上收集图像。使用的物镜110具有低放大倍率和低数值光圈物镜。校准曲线还可以使用不同的物镜110以及CCD位置生成。校准曲线的x轴显示校准样品107相对于焦点位置移动的实际距离，而y轴值指示焦点量度的数值化传播峰的位置。对于显著远离焦点位置散焦的样品107，可以要求多于一个数值焦点迭代来获得所需的聚焦准确度。
图31展示了当针对在+1mm至-1mm范围的初始开始位置范围进行聚焦迭代时使用图30的校准曲线的聚集性能。可视化确定真实焦点位置并且该焦点位置具有约±1μm的误差。相对于焦点平面的最终位置的值在可视化确定的焦点位置测量结果的估计误差内是准确的。
执行本发明的方法和装置
有很多使用上述装置执行本发明的方法-它们将在下文中说明。
物理力施加方法
在根据本发明的一个实施方式中，使用物理力施加装置10将物理力施加在细胞/颗粒108和/或其表面108a上(刹那间图1A和1B)，并且可以使用计算机113测量细胞/颗粒108的反应(即，脉冲反应测量、频率反应测量)。物理力施加装置10可以包括平移平台114的不连贯或者连续周期性移动，或者使用光学施力装置100,101等光学生成的力、或者通过使用诸如采用将超声波施加在样品107上的超声波发射器117的超声波装置117等其他外部装置，声学装置(即，声波施加)，或者物理探针接触，或者通过来自例如自动流体流式(微流体)设备116生成的力，所有这些对于本领域的技术人员来说是已知的。
在上述物理力施加方法中，本发明的测量方法包括采集视场(即通过显微镜106所看到的)中的细胞/颗粒108的全息图像序列(参见图1A、1B和2)。
在施加外力(即物理力施加方法)相应地进行测量的情况中，与外力施加同步的全息显微图像序列的统计分析获得表面108a上的相互作用的性质或细胞/颗粒108分散体的扩散/粘弹性特性。
具体地说，在通过计算机113对细胞/颗粒108的由成像装置112捕获的图像进行分析时，所述图像包括由细胞/颗粒108衍射的分量以及未衍射的分量。这两个分量在成像平面中干涉，获得表示样品107的干涉图案。在空间上相干的相干照射的使用允许即使明显处在焦点外也能够对样品107进行成像。通过调节散焦量，可以调节干涉图案以改善测量结果的信噪比。
在下文讨论的例示性测量中，调节焦距使得干涉图案在中央具有低强度波谷(参见图2)，在其周围包围着亮强度环。具有较低调制深度的额外的同心暗环和亮环从中央延伸开来。通过形成具有低中央强度和高周围强度环的干涉图案可以获得高信噪比。
在该实施方式中，没有移动的珠子或细胞(即，颗粒)108意味着它们的全息图像像素计数的波动受到来自量级相对较小的监视器噪音、环境振动、光子统计数量的效应的控制。移动(例如通过物理力或者扩散)的颗粒或细胞108将随着颗粒或细胞108移动而具有它们的干涉图案偏移。当细胞或颗粒108在一帧中相对于前帧移动时，在第一帧中的中央波谷中具有低计数的像素可能暴露在在后帧中的临近亮环。如果重复，像素强度从较低计数值到较高计数值的这种大波动将获得高的平均像素波动值(参见图2中的曲线图)。对这种波动进行归一化(即，按像素逐一将像素值的标准偏差除以它们的平均值)，估算在颗粒/细胞108全息图的中央出现的强度波动最高，这是因为在该区域的平均值最低。
总而言之，该实施方式按照颗粒逐一获得了强度波动值，由此使通过物理力施加或者扩散能够移动的颗粒108显示出高强度波动，而那些结合至表面109上的颗粒显示出低强度波动。这种强度波动量度单位是用于确定基于颗粒结合测定中的颗粒结合的可测量值。
与很多其他类型的结合测定不同，不需要为移除未结合颗粒108而洗涤表面109，这是因为结合是基于迁移率测量来确定的，并且未结合颗粒108在这方面明显区别于结合颗粒。
具体地说，图2展示了全息图是如何因为扩散而偏移并且如何可以引起像素强度的大的波动。对于位于中央位置(全息图的低强度部分)的像素，全息图位置的偏移在检测全息图的周围亮条纹时导致大的波动。全息图中的像素k在全息图位于位置x1时检测全息图的中央最小值。全息图偏移至位置X2导致像素k见到周围环的峰强度。全息图返回到初始位置X1导致像素k又返回到低计数速度。整体效果是最小计数值的中央区域借助于全息图移动增加大的像素强度波动，从而导致周围亮条纹周期性地影响高像素强度。
如上所述，相干激光器源100具有短的相干波长(小于400μm)，并且在660nm处工作。短的相干波长防止形成干涉条纹，这是由于光学反射与透射光束的相干叠加的缘故。如上所述，其他波长和类型的照射源包括非激光器源(例如超发光二极管)和常规光源(例如LED、白炽灯、弧光灯)。允许以足够的对比度对颗粒108成像的任何源100都是适宜的。
在该实施方式中，使用CCD112捕获样品107的放大图像。CCD112的曝光时间(或者在使用脉冲激光器作为选通脉冲源的情况中，脉冲激光器100的脉冲持续时间)会显著短于扩散时间常数。这确保了细胞/颗粒108在曝光时间过程中没有显著扩散，从而使图像模糊。
对于脉冲反应测量，可以将适当的脉冲生成装置117附接在显微镜106上以将力施加至细胞/颗粒108，这与图像采集同步以测量它们的反应。
图33A显示了没有施加任何外力的情况下测量(即热平衡测量)的珠子(4.8μm二氧化硅)分散体的两种不同样品的珠子强度波动(NSD，归一化标准偏差值)，其中一种样品结合至表面上(密集交叉条纹的柱状图)，而另一种没有结合至表面(稀疏斜纹线图案)。通过将珠子稀释在0.9%盐水溶液中来使珠子结合至玻璃质盖玻片的表面上，同时通过在去离子水中稀释而使珠子在盖玻片上自由扩散。在这些实验条件(即，使分布的重叠最小化)下，未结合珠子明显区别于结合珠子。
图33B显示了在施加阶段式移动后测量的相同样品。在压电平台将样品沿着一个轴线来回移动25μm之后，获取被分析的全息图堆栈中的每个图像。如NSD度量单位所测得的，该系统上的这种物理扰动没有影响珠子的结合群体的迁移率(密集交叉条纹柱状图)(与没有施加力的情况下进行的测量相比)。然而，作为阶段式运动引起珠子迁移率上升的结果，未结合珠子显示出比其在图33A中的非施力对应珠子较高的NSD。因此，施加物理力能够更好地解析结合群体和未结合群体，如图33B中的结合珠子和未结合珠子柱状图之间分开更大所证明的。尽管结合群体和未结合群体之间的分离度即使在没有施加力的情况下(即图33A中的热平衡测量)也是优异的，但是仍存在保证在物理力的影响下珠子或细胞迁移率测量的更好的解析能力的样品和情况。
从机器人样品容器操作到样品的泵送或者吸移器输送和它们的温度控制，到样品107的不同区域的聚焦和采样，到同步施加力、图像采集和数据分析，所有检测方面都可以自动化和计算机控制(即利用计算机113)，从而在没有人干预的情况下实现测量和获得结果。
热平衡测量方法
在另一个例示性的实施方式中，在无源探针法中的全息图像序列的统计性质的分析获得与在样品107中的细胞/颗粒108的热平衡位置生成的运动的范围相关的测量。在该实施方式中，使用无源探针法，其中，使用图1A的改进型装置，通过分析处于热平衡的显微细胞/颗粒108运动中的波动来测量样品107(例如平衡波动测量)。代替独立的外部施加物理力探针技术，在热平衡位置进行的无源探针法使用包围珠子/颗粒108的流体分子的热能，使自由的珠子/细胞108发生布朗运动。然后可以使用本文所述的技术测量这种布朗运动的程度，以得到与样品相关的结论。
在无源探针法中，如在上述物理力施加法中所述的那样，该实施方式的测量方法包括采集视场中(例如通过显微镜106所看到的)的细胞/颗粒108的全息图像序列(参见图2)。
具体地说，在热平衡法中，使用基于微流体(或者微滴定板)装置116，其中颗粒/细胞108的物流进入样品室118中，在样品室118中，使用激光器光源100照射已经沉降在样品室118的底部光学透明成像表面119上的颗粒/细胞108的充分稀释的分散体。微流体(或者微滴定板)装置116可以允许将多种溶液和分散体于适当的样品室118中混合、温育和测量。微流体(或者微滴定板)装置116还含有对于本领域的技术人员而言已知的必要的可能构造性能、必要的泵送(吸移)功能和温度控制功能。
图4屏幕截图A显示了2μm二氧化硅珠子的全息图像。这种全息图像序列通过成像设备112采集并通过计算机113进行统计分析。
图5A展示了如何通过堆栈分析每个像素的位置以确定其标准偏差及其平均像素值。然后通过计算机113生成全息波动图像，从而通过每个像素随时间的标准偏差的值除以像素的平均值而得到每个像素值。
在一个实施方式中，通过多个像素统计学量度的组合来生成统计学图像，所述像素统计学量度包括平均像素值、像素标准偏差、像素方差、高阶像素波动、像素时间相关函数、像素空间相关函数、像素空间-时间相关函数、背景像素值、背景像素标准偏差、背景像素方差、高阶背景像素波动、背景像素时间相关函数、背景像素空间相关函数和背景像素空间-时间相关函数。像素统计学量度可以针对图像序列以像素级生成，然后针对颗粒邻域进行平均计算。像素统计学量度可以针对颗粒邻域进行计算，然后针对序列中的其他图像中的对应邻域进行计算。可以使用序列中的一帧生成颗粒领域蒙片(mask)。来自序列的多帧可以用来生成颗粒邻域蒙片。像素统计学量度可以针对图像序列的子集进行计算。像素统计学量度可以针对图像序列的连续子集进行计算，从而生成时间变化统计学测量/颗粒。可以使时间变化统计学测量/颗粒与时间变化实验条件(例如物理移动、振动、溶液条件、流动条件、其他环境效应)关联。可以进行基于颗粒的统计学测量的空间和时间关联。可以计算基于颗粒的统计学测量的时间变化空间和时间关联(与基于像素的统计学测量相反)。可以选定统计学颗粒测量的阈值以选择具有希望的表面亲和性、具有商业、诊断相关性的相互作用特性的级分。可以选择所选取的级分中的阈值以根据希望的统计学显著性指示在指示阳性结果之前测量所需的最小级分水平。
在一个实施方式中，随时间追踪颗粒位置，并且可以生成颗粒位置的统计学测量(例如均方位移、净位移等)，并针对多个颗粒对这些量的分布进行作图。可以利用颗粒位置测量中的阈值以及基于颗粒位置的颗粒统计学数量来确定具有标靶颗粒-表面亲和性的级分。颗粒移动的统计学量度可以基于均方颗粒移位、平均颗粒位移、净颗粒位移、高阶颗粒位置统计数量或者任意或所有这些数量的组合。可以针对对照目的(例如背景校正)测量颗粒移动的类似量度。
如上文针对图5A所讨论的，由全息图像的堆栈或者序列(即，60个图像)生成的全息波动图像的示例显示在图4屏幕截图B中。图像中的明亮区域对应于样品平面中在信号强度上具有大的波动的区域(对应于其中颗粒/细胞108在移动的位置)，而黑暗背景展示在没有颗粒/细胞108存在的区域中的波动要低得多。
相应地，图5A显示了全息图像堆栈的分析，获得全息波动图像S(i，j)，其通过针对图像堆栈上的每个像素将像素级标准偏差除以像素级平均值来构建。
更具体地说，波动图像S(i，j)是针对图像堆栈的归一化标准偏差分布(即，按像素逐一将标准偏差除以平均值)的表示。然后处理该图像以生成针对每个细胞/颗粒108的平均归一化标准偏差的分布。正是细胞/颗粒108的归一化标准偏差(NSD)的这种柱状图或者分布获得了所希望的与样品107迁移率有关进而与颗粒-表面相互作用有关的信息。
在利用如图1A所示的装置的另一个实施方式中，将2μm二氧化硅珠子108分散在水中，使所述珠子在盖玻片平面109上扩散，并且将全息波动图像(即针对图像序列的归一化标准偏差的图像)显示在图6的屏幕截图A和B中。数据在温度受控的显微镜平台114上获取。
具体地说，图6屏幕截图A是样品在5℃的全息波动图像(即归一化标准偏差图像)(由60帧堆栈构建)，而图6屏幕截图B显示了在平衡至47℃时在去离子水中的2μm二氧化硅珠子的样品107全息波动图像(由60帧堆栈构建)。每个全息波动图像都是由在约11秒的时间内采集的60个图像生成。
从所述屏幕截图可以看出，在较低温度的高强度区域(图6A)比在较高温度的高强度区域(图6B)受到更多的约束。这表明生成高强度波动的颗粒运动在较低温度时受到更多的约束。这是根据扩散理论所预料到的，因为颗粒的均方位移随着温度的下降而下降。
图7显示了在6.8℃(底部柱状图)、28℃(中间柱状图)和46.3℃(顶部柱状图)的温度测量的在玻璃质盖玻片上的水中的4.8μm直径的二氧化硅珠子的归一化标准偏差的三张柱状图(以5帧/秒采集40帧)。在最低温度(6.8℃)测量的分布也具有最低的归一化标准偏差(NSD)的值。柱状图中的主峰与自由扩散珠子108相对应，而较低值的NSD(5%至10%)的小峰表示珠子108的被粘连或被部分粘连至表面的明显较小的级分。
随着温度的上升，主峰向较高的NSD值偏移。在较高温度的珠子发生较高振幅热诱导运动，导致较高的像素强度波动，其被检测为较高的珠子NSD值。
具体地说，对于自由扩散，均方位移与温度呈线性比例相关：
<Δx2>=4D t,D=kB T/(6πηr),
其中，D为扩散系数(或者有效扩散系数)，t为颗粒位置测量之间的时间间隔，KB为玻尔兹曼常数，T为开氏温度，η为粘度(或者有效粘度)，而r为球形扩散体的半径。水的粘度随着温度的上升而下降，造成额外的温度依赖性，这使均方位移随着温度的上升而增大。图8是在不同温度在玻璃质盖玻片上自由扩散的4.8μm二氧化硅珠子的归一化标准偏差分布的平均值和标准偏差的图(空心正方形)。上方x轴反映进行测量时的温度，而下方x轴显示均方位移的理论预计的平方根，考虑到珠子直径、温度(其放置在温度受控样品台上)、水的温度依赖性粘度、表面-粘度校正(Faxen定律)和时间间隔。将测得的NSD值针对温度(上方轴线)以及根据扩散公式(见上文)和表面粘度校正系数(Faxen定律)计算的对应的均方位移平方根(下方轴线)进行作图。
图8中的第二条曲线(黑色正方形)显示了模拟珠子运动的并且以受高斯分布决定的(其平均值为零并且具有不同的宽度(与不同的均方位移平方根相对应)的步长(step-size)使珠子的子图像位移而生成的平均值和标准偏差。生成40个这样位移的子图像，模拟单个珠子的图像堆栈。针对一系列步长(即，均方位移平方根)进行具有250个这样的模拟系集(ensemble)。然后将应用于实验数据(在持续时间内为40帧)的用于计算珠子归一化强度波动(归一化标准偏差(NSD))的相同算法应用于模拟数据，在每个步长生成模拟NSD值的分布，并对其平均值和标准偏差进行作图。
测量值和模拟值之间的比较是理想的，证实了归一化标准偏差的选择是量化测量珠子的均方位移中的变化作为温度函数的理想量度，并且是应用颗粒追踪算法的可选方法。如上所述，对于被测量珠子的归一化标准偏差值的稍大的误差线和较低的平均值可以由在大量未结合群体中结合珠子级分较小来解释(请注意在图7的柱状图中，5%至10%的NSD之间的小峰)。
使用归一化标准偏差作为量化颗粒迁移率的量度具有很多的优点。首先，只需要一个表示通过堆栈的像素级统计学的空间地图的图像就可以反映颗粒108的集合的动力学。这种与像素波动相关的统计学图像还可以实时生成，因为对其计算所需的计算工作量相对较少。而且，计算这种统计学图像不需要与细胞/颗粒形状相关的任何假设。
第二，只需要使用来自所述序列的一帧就可以建立颗粒位置。为了给每个颗粒108分配波动可观测值，需要来自所述序列的额外图像来确定每个颗粒108的位置。然后使用统计学像素波动图像蒙蔽颗粒邻域以针对视场中所有颗粒生成平均波动/颗粒(参见图5B)。由于相对于平均颗粒间距离，颗粒只扩散/移动较短的距离，因此一帧就足以建立用于由统计学像素波动图像生成归一化标准偏差分布的颗粒邻域。这种方法可以使对于一般应用于序列中每个图像的物体识别的计算要求显著宽松。
第三，归一化标准偏差测量方法容易以较低放大倍数测量，从而允许每个视场可以测量更多的颗粒。在预计颗粒结合概率低的情况下，这是特别有用的，因为这可以一次测量更多的颗粒，从而改善了测量的结合检测统计学。
使用相干光源100照射具有颗粒108的样品107为样品107测量提供了额外的优点。虽然在常规照射下对比度较低的扩散物体可能由于背景图像噪音对测量的影响较大而对于机器人检测和位置追踪来说存在挑战，但是使用相干光源100来形成较高对比度的图像可以通过调整散焦量来生成。另外，使用相干光源100，可以数值化确定焦点平面位置(例如全息聚焦)，从而克服传统使用的机械焦点扫描方法的耗时问题。这是可能的，因为由相干光源100照射的散焦样品107生成衍射图案，然后可以在一定距离范围上数值化传播该衍射图案以找到所需的焦点位置。
表面结合检测测量
在根据本发明的另一个实施方式中，上述仪器和数据分析技术的用途是检测结合至表面109的颗粒108，如图9所示。在该例示性实施方式中也是使用图1A的装置。
例如，图9显示了在经过处理的表面109上具有被一种类型的抗原(A-○)或另一种类型的抗原(B-□)包被的珠子108的样品107的组分的图表，该测定的目的是根据每种类型珠子与抗体包被表面的相互作用来选择性地检测每种类型的珠子。
图9画面1显示每种类型的珠子108被放置在抗体包被表面109上。被A抗原包被的颗粒108特异性地结合至包被在盖玻片表面109上的被固定的特异性抗体(A抗体)，由此限制颗粒108的运动。图9画面2显示了每种类型的颗粒108的不同表现，其中，没有特异性地结合的B-抗原包被颗粒108可以在表面109上的溶液中自由扩散，而A类型颗粒运动由于与表面抗体特异性结合而受到严格限制。
使用细胞108可以得到类似类型的结果。下文将讨论使用如图1A、1B和图3所述的装置10在红细胞上进行以根据与包被在盖玻片表面109上的特异性抗体的相互作用来区分它们的表面抗原的实验。
例如，红细胞可以采用它们的ABO血型来表征。一个人可以检测为类型A(是指他们具有红细胞的表面上带类型A抗原的红细胞(RBC)；或者检测为类型B(在它们的表面上带有类型B抗原)；或者检测类型O(两种抗原都不具有)；或者检测为类型AB(表面上同时存在两种抗原)。
除了A抗原和B抗原，还检测红细胞存在或者不存在RhD抗原，该抗原存在则标以“+”号或者“阳性”，并且该抗原不存在则用“-”号或者“阳性”指示。通过使用图1A的装置对表面109上的三个分开的区域上的患者红细胞的相互作用进行成像来进行检测。表面109包括经过化学处理从而允许特异性抗体连接至表面109上的盖玻片109。表面109包括3个区域，一个区域具有连接至表面109上的抗-A抗体；一个区域连接有抗-B，而另一个区域连接有抗-RhD。
将患者血液稀释然后引导至样品室118中，样品室118的底部表面119是带有固定抗体斑块的经过处理的盖玻片109玻璃。红细胞沉降在底部表面119上并且与所述斑块上存在的特定抗体相互作用。在表面119上带有与下层斑块上存在的抗体相对应的特异性抗原的细胞108特异性地结合至表面119。没有与下层固定抗体相对应的特异性抗原的细胞108可以在表面119上自由扩散。这种类型的检测(即红细胞膜表面上的抗原分型)类似于血液样品的正向分型(forward typing)(与反向分型相反，反向分型是测量对血浆中的表面抗原具有特异性的抗体的存在的互补型分型技术)。
上述的全息波动方法被用来确定如果：a)红细胞特异性地粘附到特定斑块，则指示对该斑块上存在的抗体呈阳性反应；或者b)它们自由地扩散，则指示阴性反应，并且因此缺乏特异性相互作用。这种测定根据它们的全息像素波动的细胞归一化标准偏差的测得柱状图来进行。视场中特异性结合细胞108被归一化标准偏差量度中的较窄分布且平均值相对较低所反映。自由细胞展示较宽的分布，具有显著较高的NSD(归一化标准偏差)平均值。
图10A显示了在抗-A包被表面上测量的两种不同样品107的归一化标准偏差柱状图的图。来自对固定有抗-A抗体的表面上的A抗原呈阳性的供体的红细胞标记为黑色(A类型)，而在类似抗-A包被的表面上，来自对A抗原呈阴性的另一个供体的RBC标记为画线图案(B类型供体–即，细胞上不存在A抗原)。类型A细胞(黑色)特异性地粘附至表面上，严重限制了它们的运动范围，如细胞归一化标准偏差的较低的值所反映的。另一方面，类型B(画线图案)没有结合至表面，如细胞像素值中的大的波动以及高的归一化标准偏差值所证明的。
类型B血细胞没有特异性地结合至抗-A表面，如归一化标准偏差值的大的量级以及宽的分布所证明。类型A血液发生特异性结合，如归一化标准偏差值的窄的分布和低的量级所反映。
除了结合细胞和未结合细胞之间的显著差异化之外，还可以检测中度水平的结合。图10B显示了在抗-A包被表面上测得(在图10A中的测量之后的1个小时测量)的两个不同样品107的归一化标准偏差柱状图的图。
图10B中的类型A分布(A阳性)看上去类似于图10A中的分布，但是图10B中的类型B分布(A阴性)的特征在于第二峰，由带有中度归一化标准偏差值的增加的细胞级分所示，表明与表面存在部分或者中度状态的结合，这可能是由于时间依赖性非特异性细胞-表面相互作用的缘故。
在图10B中，类型B供体细胞(画线图案)没有特异性地结合(即，对于抗原A呈阴性)并且具有宽的柱状图，是扩散行为的反映。然而，在经过1小时之后，在约7%NSD(归一化标准偏差)具有峰的亚群是明显的。这些细胞可能表示由于与表面的非特异性结合而存在部分结合级分，其随时间变得更加明显。虽然这种亚群展示出相对于其他未结合细胞而言增加的固定性，但是，这种亚群仍然明显区别于特异性结合的群体(即对抗原A呈阳性的群体)，从而使这种技术可以区分特异性结合和非特异性结合。
显然，具有“中度”水平结合的细胞仍然明显区别于特异性结合的细胞，说明这种技术可以解析与基底具有不同的相互作用的细胞亚群。
采用能够与被抗-B包被的斑块以及固定至表面的抗-RhD相互作用的供体细胞也可以收集到类似的数据。在这种方式中，可以探查每个供体的红细胞是否存在A、B和/或RhD抗原，从而获得正向血液分型检测结果。
图11画面1显示了两种类型的颗粒，即，被类型A抗原包被的类型A颗粒和被类型B抗原包被的类型B颗粒。在这种结构中，表面被抗原A包被。在存在A-抗体(即IgM)的情况下类型A颗粒可能与表面结合(A-抗体可以同时结合至A抗原包被颗粒和A抗原包被表面)，从而使颗粒固定。该检测包括混合患者的血浆(含有抗体)，并且将其与带有已知表面抗原的颗粒(表面上带有已知类型的抗原)一起温育。该检测的目标是通过测量每种类型的对照颗粒在每种类型的表面上的表现来确定血浆中存在何种类型的抗体。
可以通过测量被适当抗原包被的表面上的颗粒的迁移率来确定溶液中存在的抗体的类型。与已知抗体不同的是，可以通过测量在被适当抗原(一种或多种)包被的表面上的颗粒迁移率来确定颗粒的类型。溶液中的A抗体能够结合至A抗原包被表面，还同时结合至被A抗原包被的颗粒。图11画面2显示了每种类型颗粒的不同表现，其中，没有特异性结合的B-抗原包被颗粒能够在表面上在溶液中自由扩散，而A类型颗粒运动由于与本身特异性地结合至表面的抗体发生特异性结合而受到严格限制。因此，图11画面2显示了如何可以通过测量颗粒迁移率来区分未结合的类型B颗粒和结合的类型A颗粒。
图12A显示了在不同时间获取的红细胞样品的一系列NSD柱状图。样品由在分散在表面上的合成血浆中的高浓度的抗-A IgM抗体(100nM)存在的情况下的类型A红细胞组成，类型B抗原在玻璃质盖玻片上。这种测量构造类似于反向血液分型方法，其中通过能够检测已知类型的表面上的已知类型的血细胞之间的结合程度来检测受试者的血浆存在或者不存在天然出现的抗体。这种情况下存在结合指示能够同时使细胞结合至表面从而使它们固定的抗体的存在。实质上，正向分型包括检测红细胞表面的特定抗原的存在，而反向分型检测血浆中特定抗体的存在。测定法可以设计为根据所检测到的血型抗体的存在或者不存在(这将被反映在珠子/细胞全息图序列中的波动程度)来实现反向血液分型结果。
图12A中的底部柱状图是在分散在带有100nM抗-A的合成血浆中的类型A细胞被引导至带有B抗原的表面上之后13分钟测量的。每个柱状图都是通过对以5帧/秒的速度采集的40帧序列进行的分析(细胞NSD计算)来生成的。细胞能够扩散，如能NSD可观测值的高平均值所证明的。细胞在后期显示出类似的扩散行为，如通过在21、29、37和45分钟标记测量的柱状图的相似性可以看到的。
图12B显示了在与图12A类似的条件下的时间系列柱状图，不同的是表面具有在其上面的类型A抗原(不像图12A的类型B抗原表面测量)。选择这样高浓度的抗-A(100nM)来确保A细胞结合至A类型表面(如可视化证实的那样)。在细胞被引导至表面上14分钟获取的首次测量柱状图(底部柱状图)显示，细胞如所预期的那样被固定(低平均NSD和窄宽度)，考虑到合成血浆中的高浓度抗体。在后期，细胞还是保持结合，如由位于22、30、38和46分钟标记的类似NSD柱状图所见到的。图12A和12B的柱状图的比较可以让我们选择NSD阈值以确定细胞是否结合。在这些条件下7%NSD阈值是合适的，在图12A的未结合群体中的大部分细胞高于该阈值，在图12B的结合群体中的大部分细胞低于该阈值。
图13A和13B与图12A和12B中的测量条件类似，不同之处在于使用低得多的抗体浓度，在合成血浆中只存在1nM抗-A。在图13A中，在含有分散在B类型表面上的1nM抗-A的合成血浆中的A类型细胞在样品被引导至表面上之后19分钟的首次测量时大部分没有结合。在25、31、37、43、49和55分钟标记的随后测量显示类似的行为。在图13B中，在含有1nM抗-A的合成血浆中的A类型细胞在被引导至带有A类型抗原的表面上之后测量。18分钟后，可以检测到相对于图13A中测量的对照组细胞(即未结合细胞)稍高的细胞级分，NSD值较低。随着时间的推移，这种低NSD级分的量级增加，如通过柱状图中的渐次向左偏移所能够见到的。低的1nM浓度的抗-A降低了细胞和表面之间发生结合的速度(与使用100nM抗-A时细胞和表面之间的快得多的结合相互作用(图12B)相比，其中，事实上发现所有细胞都在14分钟内结合)。
在另一个实施方式中，可以对给定样品进行一连串的结合测定，获得颗粒粘附动力学曲线。这种测定不仅可以获得与在给定时间时的结合程度有关的信息，还可以获得与结合的变化速度有关的信心，从而可以对结合动力学进行建模。图14显示了在图13A和13B中研究的相同样品的细胞粘附动力学。在每个时间点(样品在t=0时制备)，针对每个表面计算具有低于7%NSD阈值的NSD值的细胞级分，以估计结合至每个表面的细胞级分。对于B表面上的A细胞，可忽略的结合是可以检测到的(即约0.5%)，尽管其随时间上升很慢(即，存在时间依赖性非特异性细胞-表面相互作用，这种相互作用随时间增加了结合级分)。另一方面，A表面上的A细胞在第一测量时间点处显示出显著较高的结合，并且结合级分随后在约35分钟的过程中显著增加(即从约1%增加至5%)。
通过以细胞方式测量细胞的迁移率，可以测量结合的细胞级分。与其中大量的细胞级分必须反应以获得信号的很多大体积测量(bulkmeasurement)不同，这种技术由于其单细胞敏感性的缘故而在只要有细胞级分结合时就可以测量阳性反应。
扩散建模(校准)和模拟结果
颗粒的归一化标准偏差测量及其基础颗粒位置测量之间存在关系。对颗粒运动进行模拟以对实验测得的NSD分布进行模拟。
图15画面A显示了4.8μm直径二氧化硅珠子的图像。使用颗粒追踪算法分析这种扩散珠子的40帧序列(每秒采集5帧)，所述颗粒追踪算法在测量形心位置(Δx和Δy)获得偏移序列，在图15画面B中作图。测得x和y方向上的标准偏差为0.17μm(与针对在水中的等价尺寸珠子由扩散理论计算(并且包括来自Faxen定律的表面-粘度校正系数)的0.16μm理论预计值相当)。
可以通过使用归一化标准偏差法对像素波动进行分析来对经过图15中的颗粒追踪分析的相同帧序列进行再分析。
图16画面A显示了由在图15中所示的颗粒追踪分析中使用的相同的40帧测得序列算得的NSD的图像，获得了针对珠子区域求均得到的23.6%NSD的NDS值。
通过生成40个移位珠子图像序列而使用珠子的来自所述序列中的一帧进行模拟，移位由高斯分布决定，其宽度使用来自图15图B颗粒追踪结果通过实验测得。生成250个这种模拟珠子序列的系集，以及250个计算的NSD图像(即，一个序列一个NSD图像)。将针对所述系集的每个成员的珠子区域的平均NSD值在图16的图B中作图，平均值为23.7%NSD，标准偏差为2.1%NSD，显示出与实验测得的NSD的理想一致性(参见图16画面A)。
可以进行一系列的模拟以以不同的步长(具有不同宽度的高斯分布)使NSD结果与颗粒运动关联。
使测得珠子NSD分布的平均值与一系列模拟的均方根位移(rootmean squared displacement)关联的这种校准曲线显示在图17中(实心正方形)通过逐帧模拟具有高斯分布的珠子偏移来生成曲线，所述高斯分布具有与带有一系列均方位移(mean-squared displacement)的珠子运动相对应的一系列宽度。曲线中的每个点使用250个模拟珠子序列的系集(每个40帧)生成，从而生成NSD分布，对该NSD分布的平均值(实心正方形)和标准偏差(空心正方形)作图。注意，对于小于0.1μm的均方根位移(在图17中标记为“std dev”)，曲线呈线性。但是，对于较大的位移(0.3μm至0.4μm)，NSD值水平发生偏离并且开始出现量级上的降低。这种效果是由于在40帧的过程中珠子运动到其邻域的边界外，因此导致邻域记录的波动也下降。
图18显示了在图17中作图的校准曲线(实心正方形)以及由两个其他珠子(4.8μm直径二氧化硅)图像生成的两个其他校准曲线(圆圈和三角形)。虽然使用相同范围的分布使每个图像移位，但是曲线显著不同，表明珠子图像的强度分布的差异是差异的来源。空心符号表示每个珠子的针对40帧序列的实验测得的平均NSD值。实验结果遵循模拟的结果。
图19显示了来自图18的珠子以及称为对比度校正因子的数量。该因子通过计算每个珠子的邻域中(即在包围每个珠子的矩形内)的像素强度的标准偏差，除以相同区域中的像素强度的平均值(即归一化空间标准偏差)来确定。对比度较高的图像往往具有较高的对比度校正因子。具有较高对比度校正因子的扩散珠子还生成更大的像素波动(与具有较低对比度校正因子的类似扩散珠子相比)，导致测量的NSD值相对较高。为了校正这种图像矫作物(artifact)，相对于珠子1的对比度校正因子对每个珠子的曲线进行换算。重新换算(rescale)导致图18中的三个曲线大致倒向珠子1的曲线。空心符号表示重新调节的实验测得的平均NSD值(进行类型的重新调节)。这些还显示出更为严密的分布。由于NSD参数拟用于反映珠子/细胞的动力学而不是它们的对比度，因式分解出对像素波动量级的对比度依赖性贡献(即对比度校正因子)改进了对归一化标准偏差(NSD)作为动态可观测值的利用。
还可以对分散在受处理表面上的细胞群体进行对比度校正。图20的图A是合成血浆中的B类型红细胞的NSD柱状图，所述合成血浆包括分散在带有A抗原的表面上的抗-B。由于附接至B细胞的抗-B抗体没有结合至表面上的A抗原，因此它们自由扩散。图20的图B是将在图20的图A中测量的每个红细胞的NSD值与其归一化空间标准偏差关联的散点图(即对比度校正因子)。通过该拟合显示为阳性关系表明，不管动力学如何，通过低归一化空间标准偏差可以生成低的NSD值。由于细胞/珠子的动力学基本上独立于归一化空间标准偏差，因此使用线性拟合针对对归一化空间标准偏差的依赖性来校正动态可观测值(NSD)，以生成经过对比度校正的数据。
图21的图A显示了在合成血浆中的B类型红细胞的NSD柱状图，所述合成血浆包括分散在带有B抗原的表面上的抗-B。抗-B抗体连接至红细胞上的B抗原以及表面上的B抗原，由此将细胞固定。结果，与A抗原斑块(图20的图A)上的细胞相比，生成的强度波动显著降低，如图21A的图A中的较低NSD测量结果所示。图21的图B是将在图21的图A中测量的每个红细胞的NSD值与其归一化空间标准偏差关联的散点图。如上文的图20的图B中的那样，存在正相关。使用线性拟合，针对它们对于归一化空间标准偏差值的假性(spurious)依赖性来校正NSD值。
图22的图A和图B显示了未结合(图20的图A)和结合(图21的图A)的红细胞NSD柱状图的校正和未校正的柱状图，其中通过使用线性拟合(图20的图B和图21的图B)以消除NSD对归一化空间标准偏差的依赖性来施行校正。所述校正没有显著改变柱状图的总体形状。这所具有的最显著的影响是未结合NSD分布的拖尾变细。可以对NSD值采用阈值以确定细胞/珠子是否“结合”(即“结合”级分=NSD柱状图中的细胞的级分<阈值，“未结合”级分=NSD柱状图中的细胞的级分>阈值)。经校正的NDS分布的拖尾边缘(trialing edge)的变细意味着在采用尾部区域中的阈值的值时将存在较小的“结合”细胞的级分。从而使未结合群体的所谓“非特异性结合”级分下降。校正的这种特征等同于检测的“非特异性背景”的降低。使对NSD的对比度贡献的由对比度对NSD的贡献引起的矫作物最小化的另一种选择是对可容许的空间标准偏差建立最小和/或最大阈值，并且只分析处在阈值内的那些颗粒。
图23是在图22的图A和图22的图B中显示的柱状图的累积概率分布的图(即具有小于或等于该特定NSD值的NSD的细胞级分的图)。经校正“未结合”的柱状图具有显著较少的NSD值小于或等于阈值9(0.93%)的细胞级分(与未校正的1.7%的级分相比)。这具有相对于可以比较的红细胞结合数量而言降低了背景值的效果。
异源性扩散动力学检测和表征
在均一表面上扩散的均一尺寸珠子应该显示出通过单个扩散系数可表达的扩散。图24显示了在玻璃质盖玻片上的水中的4.8μm直径珠子的NSD柱状图(上边柱状图)以及使用高斯分布的模拟NSD柱状图(下边柱状图)，其得到0.131μm的均方位移平方根。该模拟柱状图与测量柱状图中的自由珠子形成很好的比较(即，NSD>7%)。比较中不包括珠子的测量为粘连(由于非特异性结合)的小级分珠子(即，NSD<7%)。
通过将盐浓度增加至0.4%，可以使珠子与表面粘连。图25显示了在含有0.4%的盐水的水中的4.8μm直径珠子的NSD柱状图(上边柱状图)以及使用高斯分布的模拟NSD柱状图(下边柱状图)，其得到0.0064μm的均方位移平方根。该模拟柱状图与针对在它们的运动中显示出受到大得多的限制的那些珠子的测量柱状图形成很好的比较。即，显示出结合的珠子实际上经历了类似扩散的量级小得多的运动，并且可以直接建模。因此，结合珠子可以由它们的结合自由度表征，使得具有较小均方根位移(因而具有较小的NSD值)的珠子更加高度地结合。
图26的图A、B和C显示了在合成血浆中的类型A红细胞的NSD柱状图，所述合成血浆含有分散在带有B抗原的表面上的5nM抗-A(图26的图A，上边柱状图)，测量了2653个细胞)。抗-A抗体不能形成桥接细胞与表面的键。发现在对高斯步长分布的宽度采用0.069的均方根位移时，具有单特征性均方根位移的RBC扩散的模拟建构了平均NSD值的模型。该模拟进行了2650次以得到NSD值的分布(图26的图B，中间柱状图)。注意测量柱状图比模拟柱状图显著较宽，表明单均方根位移(single root-mean displacement)不能表征表面上的RBC的动力学。图26的图C显示了使用均方根位移值(0.069±0.02μm)的高斯分布的模拟NSD分布(2650个试验)将测量细胞扩散建模为细胞扩散性的异源性分布。将扩散性建模为自由扩散球体的分布(获得相同的均方根位移的相同分布)获得了变化超过3因子(在平均半径的标准偏差内)的半径的高斯分布。意味着分布动力学中的显著异源性。由于细胞的尺寸分布窄得多，因此这个结果表明细胞与表面的异源性相互作用，这是因为导致表面上的细胞的相互作用潜能的异源性的表面和/或细胞异源性的缘故(即，扩散不是自由的，并且它不是均一的)。因此，本发明允许检测异源性以及同源性扩散动力学，这可以用作在已知表面条件存在的情况下细胞性质的分布的诊断。特别是，这种测量和分析可以在存在已知表面的情况下获得用于研究或诊断目的的细胞(颗粒)性质(例如表面结合强度、亲和性等)的异源性的信息。例如，细胞的群体可以表达具有一系列表达水平的一系列表面蛋白。确定表达给定强度的蛋白的细胞的级分可以具有诊断重要性。表达较高表面蛋白浓度的细胞将比具有较低表面蛋白浓度的细胞更强地结合至互补表面，如在它们的迁移率可观察值(例如细胞归一化标准偏差值)中所反映的。另外，检测了细胞的标靶级分，它们可以使用其他表面并在其他条件下分离和/或检测以生成额外诊断值的信息。还可以分离这种细胞以用于进一步操作(例如遗传学操作)和培养的目的。培养所选择的细胞可以用于表达和纯化治疗有用的细胞组分(例如蛋白质)的目的。
补充的是，这种测量和分析在存在已知颗粒的情况下测量时可以获得表面性质(例如用于质量控制、检查等)的异源性的信息。例如，通过使用在表面上具有给定表面强度的抗原的校准颗粒，来自群体的同源性迁移率反应指示同源性表面，而异源性迁移率反应指示具有一定程度的异源性的表面(例如，表面连接部分的非均一表面强度)。
细胞空间统计和细胞形状变化动力学
与结合状态有关的信息还可以见于红细胞的空间归一化标准偏差。图27的图A和B分别是在图20的图A和图21的图A中测量的未结合红细胞和结合红细胞的归一化空间标准偏差值的图。红细胞的结合群体具有稍微较低的平均值，但是与未结合群体的归一化空间标准偏差值有明显的重叠。结合至表面的细胞与未结合细胞相比稍显平坦，这是红细胞的典型双面凹几何学的特征。这种稍显平坦又小量地降低了细胞的对比度。尽管群体中存在平均差异，但是结合和未结合空间归一化标准偏差值的分布显著重叠。每个特定细胞的归一化空间标准偏差在测量的持续时间上帧与帧之间没有显著变化(参见图28的图A和图28的图B)，证明了本发明的上述校准方法是正确的。
图28的图A和B对在每个40帧的序列上针对在图20的图A和图24的图A的未结合群体中的100个细胞的平均空间归一化标准偏差(图28的图A)以及在图20的图B和图24的图B的结合群体中的100个细胞的平均空间归一化标准偏差(图28的图B)进行作图。在两个图中，误差线指示在40帧序列上的每个细胞的空间归一化标准偏差的标准偏差。细胞在多帧上的偏差相对于在细胞上的偏差而言是显著的。
还可以通过在图像序列上分析细胞空间强度统计学来提取并利用与细胞形状变化动力学有关的信息。“更松弛”的细胞(即，因热波动或外部施加力而更容易改变它们的形状)相对于相对更具有刚性的细胞应该展示出更高的空间强度波动。注意在这部分(空间强度)描述的强度波动在基准的每个细胞帧中计算，使得质量细胞运动(即，使用前文所述的归一化标准偏差测量所测得的细胞迁移率)的中心没有影响细胞空间动力学的计算。
图29针对结合细胞和未结合细胞在序列的40帧上针对每个细胞测得的空间归一化标准偏差的标准偏差进行作图。即使帧与帧之间归一化空间标准偏差变化的量级小，但是证明结合红细胞和未结合红细胞在归一化空间标准偏差上的变化之间差异是显著的。结合细胞具有较宽的分布并且具有显著较多的低量级变化细胞(与未结合细胞相比)，表明更高的结合细胞级分具有低量级空间强度波动(与未结合细胞相比)。在图29中，百分之十九(19%)的结合细胞具有归一化空间标准偏差(以5帧/秒获取的40帧上测量)的小于0.005的标准偏差，而在未结合的群体中，只有0.3%的细胞具有小于0.005的值。不像前面进行的分析，40帧序列中的每帧中确定细胞邻域(不同于仅在序列中的一帧确定邻域)，以校正质量运动中心对空间标准偏差中的波动的影响。在帧序列上进行细胞的空间统计学的这种分布可以用作膜挠性、细胞质弹性/粘弹性、细胞健康/疾病、细胞衰老、溶液条件、结合状态等(所有这些可以影响反映在细胞空间统计学随时间的动力学中和在这些数量的分布中的细胞形状变化的动力学)的诊断。帧曝光时间必须足够短以锁定(freeze)波动细胞的图像，如果帧曝光时间过长，则细胞运动将在整个曝光过程中平均化，从而较低了这种技术的灵敏性。
关联的运动检测
对于不要求检测珠子运动的关联性的情况，上述分析技术是足够的。但是，可以根据检测珠子-珠子结合(不同于珠子表面结合)进行测定。阳性结合事件(即，两个或更多个珠子的结合)要求关联珠子运动和未关联珠子运动之间有可检测的差异。没有彼此结合的珠子将具有它们的时间上关联的移动，而未结合珠子尽管彼此临近，但是没有展示出关联的珠子运动。
因此，在根据本发明的另一个实施方式中，区别彼此结合的临近珠子/细胞(而不同于只是彼此临近沉降)的方法如下。
在该方法中，对于细胞/颗粒的每个临近对，通过逐帧正片叠底(或者可选地为求和)每对细胞/颗粒子图像的邻域计算关联的波动。这获得了“关联邻域”，该关联邻域可以通过计算其平均归一化标准偏差来量化。
关联邻域中的波动在存在结合在一起的珠子对的相内运动时在量级上增加。
就像独立珠子/细胞的迁移率可以通过比较每个珠子/细胞邻域中的平均波动的程度来量化那样，每个临近的珠子/细胞对的关联迁移率可以通过比较每个关联邻域的平均波动的程度来量化。
检测关联运动的技术包括：在步骤200，检测每个全息图像120中的每个珠子/细胞18。在图像中临近的珠子/细胞18是结合在一起并因而展示关联运动的候选物。在确定在步骤201中具有临近邻居的珠子/细胞18时，可以在步骤202中制作珠子/细胞对的列表。
在步骤203中，通过提取每对121中的每个珠子/细胞18的图像分析每个临近珠子/细胞18对121，从而建立两个子图像。然后在步骤204中将两个子图像正片叠底在一起，获得乘积子图像。在步骤205中，对所有的临近细胞/珠子18的所有对重复这一过程，然后在步骤206中针对序列中的所有帧122也重复这一过程，得到与每个临近珠子/细胞18对121相对应的乘积子图像序列(参见图32A)。与每个珠子/细胞18对121每个这样序列相对应，在步骤207中计算乘积子图像序列的像素级标准偏差，这最终获得了在步骤208中通过计算像素级标准偏差的平均值除以整个乘积子图像上每个像素的平均值而生成的平均标准偏差(参见图32B，关联图)。
平均归一化标准偏差(NSDP，乘积子图像的归一化标准偏差)是归因于图像120、122的序列中的单个临近细胞/珠子18对的单个数。结合在一起的细胞/珠子18的临近对将具有往往增加对应NSDP值的关联运动(与没有结合在一起的那些对相比)，这可以由此独立扩散以获得因未关联运动而较低的NSDP值)。基于此，结合细胞/珠子18对121可以区别于未结合的细胞/珠子18对121。
于是，使用统计学分析确定颗粒结合，这包括处理全息图波动图像以生成每个颗粒的平均归一化标准偏差，这是在给定表面上的颗粒迁移率的量度，其可以是颗粒性质、溶液性质、表面性质或者这些性质的一些组合的用于研究、工业和/或临床目的的诊断，并且其可以包括在帧序列上每个颗粒的空间统计学的分析，其可以是形状变化统计学的量度和颗粒性质、溶液性质、表面性质或者这些性质的一些组合的用于研究、工业和/或临床目的的诊断。
没有结合至所述表面上的抗体的颗粒展示出大量级并且具有宽分布的所述归一化标准偏差分布，并且结合至表面上的抗体的颗粒展示窄分布并且低量级的归一化标准偏差分布。
在一个实施方式中，颗粒是红细胞，但是也可以是红细胞之外的细胞。中度水平的细胞结合是可检测的，如具有中度的归一化标准偏差值的颗粒级分所示。
分析归一化标准偏差的分布的扩散异源性以表征颗粒性质、溶液性质、表面性质或者这些性质的一些组合以用于研究、工业和/或临床目的。
应当强调的是，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚理解本发明的原理而给出的一些可能的实施例。在不偏离本发明的精神和原理的情况下可以对本发明的上述实施方式进行多种改变和改进。所有这些改进和改变在此拟被包括在本发明的范围内并且通过如下特征进行保护。
Claims (8)
1.一种确定多个颗粒与样品保持器的表面之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使用物理力施加机构，将物理力施加至所述样品保持器上的至少一个颗粒样品，或者施加至所述样品保持器的所述表面；
使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射所述颗粒；
使用所述成像装置通过采集所述视场中的所述颗粒的图像序列来测量所述颗粒对所述物理力施加机构的反应，所述图像的所述采集与所述物理力施加机构同步；
使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述图像进行统计分析；
其中，所述图像包括由所述颗粒衍射的第一分量和不被所述颗粒衍射的第二分量，并且所述两个分量在成像平面中干涉，从而获得由所述处理器产生的干涉图案，所述干涉图案由颗粒强度波动值表示颗粒；并且
其中，通过扩散或者所述物理力施加机构中的一种能够移动的所述颗粒显示高强度波动，而结合至所述样品保持器的所述表面的那些颗粒显示低强度波动，从而获得所述样品保持器的所述表面上的所述相互作用的性质。
2.一种对样品室中的多个颗粒进行全息光学聚焦的方法，所述方法包括：
使用成像装置的相干光源照射透明样品室中的颗粒样品；
使用聚焦照相机采集所述颗粒的图像；
在显示器上显示所述颗粒的焦点外衍射图案的图像；
使用计算机系统的处理器对所述图像中的一个图像的经成像的全息图进行数值化聚焦，以确定所述颗粒的焦点平面；
其中，所述数值化聚焦包括将所述焦点外图像传播至不同距离，从而允许通过所述处理器对焦点量度进行数值化确定；
使用所述处理器使所述焦点量度与每个数值化传播图像关联，使得能够找到每个数值化传播图像的所述聚焦量度中的极值；并且
允许所述计算机系统进行所述样品室的单阶段移动以将所述样品定位于所要求的焦点位置。
3.一种确定多个颗粒与样品保持器的表面之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在流体流式设备的透明底部表面上的颗粒样品；
使用所述成像装置，通过采集位于所述视场中的所述颗粒的图像堆栈，测量处于热平衡的所述颗粒的移动；
使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述图像进行统计分析；
其中，所述统计分析包括通过所述图像堆栈确定每个像素位置，以确定每个像素的标准偏差及其平均像素值；
使用所述处理器生成每个所述像素的波动图像；
其中，所述波动图像是针对所述图像堆栈的每一个所述像素的归一化标准偏差分布的表示；
使用所述处理器处理所述波动图像，以生成针对每个所述颗粒的平均归一化标准偏差的分布；
其中，信号强度中相对较大波动指示所述颗粒在运动，而信号强度中相对较小波动指示所述颗粒因表面相互作用而被固定；并且
获得与所述样品的迁移率和所述颗粒在所述样品保持器的所述表面上的相互作用有关的信息。
4.一种确定多个颗粒与样品保持器的表面之间的相互作用的方法，所述方法包括：
使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在流体流式设备的透明底部表面上的颗粒样品；
使用所述成像装置，通过采集位于所述视场中的所述颗粒的图像堆栈，测量处于热平衡的所述颗粒的移动；
使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述图像进行统计分析；
其中，所述统计分析包括通过所述图像堆栈确定每个像素位置，以确定每个像素的标准偏差及其平均像素值；
使用所述处理器生成每个所述像素的波动图像；
其中，所述波动图像是针对所述图像堆栈的每一个所述像素的归一化标准偏差分布的表示；
使用所述处理器处理所述波动图像，以生成针对每个所述颗粒的平均归一化标准偏差的分布；
其中，信号强度中相对较大波动指示所述颗粒在运动，而信号强度中相对较小波动或缺乏波动指示所述颗粒因表面相互作用而被固定；并且由此
获得与所述样品的迁移率和所述颗粒在所述样品保持器的所述表面上的相互作用有关的信息。
5.一种对样品保持器表面上的不同类型颗粒进行选择性检测的方法，所述方法包括：
将溶液中的颗粒样品引导至所述样品保持器的抗体包被表面上，所述颗粒被一种类型抗原包被或者被另一种类型抗原包被；
其中被一种类型抗原包被的颗粒特异性地结合至包被在所述样品保持器上的固定化特异性抗体，由此限制所述颗粒的运动；
其中，被另一种类型抗原包被的颗粒没有特异性地结合至所述样品保持器，并且所述颗粒在所述样品保持器的表面上的所述溶液中自由扩散；
使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在所述样品保持器上的所述颗粒样品；
使用所述成像装置，通过采集位于所述视场中的所述颗粒的图像堆栈，测量处于热平衡的所述颗粒的移动；
使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述图像进行统计分析；
其中，所述统计分析包括通过所述图像堆栈确定每个像素的位置，以确定每个像素的标准偏差及其平均像素值；
使用所述处理器生成每个所述像素的波动图像；
其中，所述波动图像是针对所述图像堆栈的每一个所述像素的归一化标准偏差分布的表示；
使用所述处理器处理所述波动图像，以生成针对每个所述颗粒的平均归一化标准偏差的分布；并且
其中，位于所述视场中的所述特异性结合颗粒在归一化标准偏差量度中显示出相对较低的量级和相对较窄的分布，平均值相对较低，而自由扩散的颗粒显示出相对较高的量级和相对较宽的分布，所述归一化标准偏差分布的平均值实质性地相对较高；由此
确定所述颗粒上的所述一种类型抗原或所述另一种类型抗原或者所述样品保持器上的所述特异性抗体。
6.一种作为诊断程序来检测颗粒形状的方法，所述方法包括：
使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在样品保持器上的颗粒样品；
使用所述成像装置，通过采集位于所述视场中的所述颗粒的图像序列，测量处于热平衡的所述颗粒的形状；
使用计算机系统的处理器对所述颗粒的由所述成像装置捕获的所述图像进行统计分析；
其中，所述统计分析包括确定针对所述图像序列的所述颗粒的强度的空间分布；
使用所述处理器利用每个所述像素生成波动图像；
其中，所述波动图像是针对所述图像序列的每一个所述像素的归一化标准偏差分布的表示；
使用所述处理器处理所述波动图像，以生成针对每个所述颗粒的平均归一化标准偏差的分布；
其中，由于外部施加力或热波动中的一种的原因而更容易地改变它们的形状的所述颗粒与相对而言更加具有刚性的所述颗粒相比展示出相对较高的空间强度波动；并且
其中，所述图像序列上的所述颗粒的所述空间强度的所述统计分析的所述归一化标准偏差分布可以用作颗粒挠性、弹性/粘弹性、健康或疾病、年龄、溶液条件或结合状态中的至少一种的诊断。
7.一种确定样品保持器中多个颗粒之间的相互作用的方法，所述方法包括：
(1)使用具有带视场的显微镜的成像装置的照射源照射放置在样品保持器上的颗粒样品；
(2)使用计算机系统的处理器，通过使用所述成像装置采集位于所述视场中的所述颗粒的图像序列，测量处于热平衡的所述颗粒的形状；
(3)使用所述处理器检测每个所述图像中的每个所述颗粒；
(4)使用所述处理器确定在每个所述图像中彼此临近的一对所述颗粒可以结合在一起并且可以展示出相关运动；
(5)使用所述处理器提取每个所述临近的一对颗粒的图像，形成两个子图像；
(6)使用所述处理器将所述两个子图像正片叠底在一起，以获得乘积子图像；
(7)针对所有所述图像中的临近颗粒的所有对重复步骤(3)至步骤(6)，得到与所述临近颗粒的每一对相对应的乘积子图像序列；
(8)使用所述处理器计算所述乘积子图像序列的像素级标准偏差；
(9)使用所述处理器，通过将所述像素级标准偏差的平均值除以针对整个乘积子图像上的每个像素的平均值而进行的计算，生成临近颗粒对中的一个颗粒的平均标准偏差；
其中，结合在一起的临近颗粒对具有相关运动，与没有结合在一起的那些临近颗粒对相比，所述相关运动使乘积子图像值的相应归一化标准偏差增加，以获得与显示出非相关运动的未结合颗粒相比分布相对较窄的相对较低的乘积子图像值的所述归一化标准偏差，其中子图像值的所述归一化标准偏差相对较高，分布相对较宽，使得结合颗粒对区别于未结合颗粒对。
8.一种用于根据颗粒的迁移率来测量、检验和表征所述颗粒的群体或者亚群的装置，所述装置包括：
成像装置，所述成像装置包括：
相干光源，所述相关光源发射光束；和
准直器，所述准直器准直来自所述相干光源的所述光束；
显微镜的透明样品保持器，所述透明样品保持器上放置有样品并且被经准直的所述光束照射，所述样品包含颗粒的分散体；和
用于测量所述样品保持器上的所述颗粒的迁移率的机构，以推断所述颗粒与所述样品保持器的相互作用的存在或者不存在。
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