CN103003688B

CN103003688B - 估计溶液中悬浮的微粒上沉积的实体数量的方法、相关装置及其用途

Info

Publication number: CN103003688B
Application number: CN201180035691.3A
Authority: CN
Inventors: 文森特·波尔; 弗雷德里克·梵东尼; 维罗妮可·穆里耶; 菲力浦·佩尔提尔; 弗雷德里克·龙泽恩; 克里斯蒂安·瓦伦汀
Original assignee: Sanofi Pasteur SA; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2017-05-03
Anticipated expiration: 2031-07-22
Also published as: CN103003688A; EP2596338B1; WO2012011080A1; US9019496B2; FR2963103B1; FR2963103A1; EP2596338A1; AR082318A1; US20120044494A1

Abstract

本发明涉及一种用于估计溶液中悬浮的微粒上沉积的实体的数量的方法，且还涉及一种相关的装置。所述方法包括以下步骤：（a）利用光源照射所述溶液；（b）检测由照射光在所述溶液中的散射而形成的光信号；（c）分析在步骤（b）中得到的所述光信号以得到与该信号相关的指标；和（d）将步骤（c）中得到的所述指标与从参考溶液得到的参考指标做比较，该比较可估计所述微粒上沉积的实体的数量。

Description

估计溶液中悬浮的微粒上沉积的实体数量的方法、相关装置及其用途

技术领域

本发明涉及在溶液中的悬浮微粒上沉积实体的领域。

尤其，本发明涉及用于估计沉积在微粒上的实体的数量的装置和方法。

本发明可以尤其用在疫苗配制中。

背景技术

因为疫苗配制涉及实体，该实体是抗原分子、纳米尺寸的蛋白，该实体通过吸附而沉积在佐剂微粒的表面上。这些佐剂微粒通常为悬浮在溶液（例如，盐水缓冲液）中的微米尺寸的铝粒子。通常在容器中进行该吸附步骤，该容器最初含有悬浮在溶液中的佐剂微粒，并且含有抗原的溶液被添加到该容器中。然后是搅拌时段，在该搅拌时段期间抗原逐渐地吸附到佐剂微粒的表面上。

所产生的问题为尽可能精确地控制吸附到佐剂微粒上的抗原的数量。这是因为该数量为重要参数，通过连续或者至少每隔一定时间进行的测量，该数量最佳地可能为在搅拌期间可得到的数量。

已知的是，抗体与沉积在微粒表面上的抗原的相互作用能够改变溶液的光学性能，尤其是根据给定角度而散射的光的量。

例如，Lucas L.J的文献“Latex immunoagglutination assay for a vasculitismarker in a microfluidic device using static light scattering detection”（Biosensors and bioelectronics22,2007(D1)）描述了如何通过光学方法可证明在抗体-抗原反应的作用下的微球体的凝集。

更具体地，含有乳胶微珠的溶液被放置在微流体网络中，其中抗原先前已被移植在该微珠的表面上。添加对应于该抗原的抗体使在抗原-抗体反应的作用下形成微球体的凝集。该凝集通过术语“免疫凝集”来表示。根据被添加到溶液中的抗体的浓度，该凝集导致液体样品的光衰减的变化。

根据另一示例，Lucas L.J.的文献“Lab-on-a-chip immunoassay for multipleantibodies using microsphere light”（biosensors and bioelectronics23,2007(D2)）说明了在发生在微球体的表面上的抗原-抗体反应所诱导的免疫凝集的作用下，穿过放置在微流体芯片中的溶液的光散射的变化。

最初利用抗原使微球体的表面功能化。当对应于该抗原的抗体被添加时，抗体-抗原反应导致微球体的凝集，产生溶液中的光散射的变化。

上述方法不能够测量沉积在微球体的表面上的抗原的数量。

此外，已经提出使用散斑图以量化在各种溶液中的光散射。例如，这为Y.Piederriere在the université de Bretagne occidentale[西布列塔尼大学]的博士论文“Etude du speckle de milieux diffusants liquides.Application à la détermination de paramètres biophysiques”[Study of the speckle of scatteringliquid media.Application to the determination of biophysical parameters]（D3）中示出的方法的情况。

具体地，该文献示出可如何使用散斑图以量化在各种溶液中的光散射，每种溶液包含给定浓度的固定尺寸的聚苯乙烯微珠，根据溶液的不同，该尺寸在0.2μm至6μm的范围内。

然后，应当注意，分析散斑图像可估计每种溶液的光散射系数。

另一方面，并没有解决估计微珠表面上吸附的实体的数量的问题。此外，由于所进行的散斑图像的分析并不能够估计在每种溶液中包含的微珠的尺寸，因此该估计显得不可能。作者本人指出，对于相同的衰减长度，由不同尺寸的粒子组成的两种介质可产生类似尺寸的散斑颗粒，参见所述文献的第93页，第二段。

然而，估计在溶液中悬浮的微粒的表面上吸附的实体的数量是有利的。

在上文提到的疫苗配制的示例中，将含有抗原的溶液添加到含有佐剂微粒的溶液中，然后进行一段时间的混合，在混合期间抗原被逐渐吸附到佐剂微粒的表面上。

在抗原和微粒之间的混合期间，目前没有显示出吸附到微粒上的抗原的数量的变化。

发明内容

在疫苗配制的情况下，本发明的一个目的为解决该问题。

这是因为该数量是一个重要的参数，通过进行实时测量，可以在抗原和微粒混合期间理想地得到该数量。

术语“实时”意指与监测疫苗配制过程相一致的一段时间，该段时间通常小于10秒，并且理想地约为1秒。因此，理想地，这对应于定期（每秒）测量的吸附在佐剂微粒上的抗原的数量。

除了验证疫苗配制外，这种测量可更好地理解抗原被吸附在佐剂颗粒表面上的机制，尤其这些抗原的吸附动力学。

本发明不仅用于疫苗配制。

因此，更一般地说，本发明的另一目的在于估计溶液中悬浮的微粒上吸附的实体的数量。

本发明的目的还在于精确地估计溶液中悬浮的微粒上吸附的实体的数量。

甚至更一般地说，本发明的目的在于估计溶液中悬浮的微粒上沉积的实体的数量。

为了实现这些目的中的至少一个目的，本发明提出了一种用于估计溶液中悬浮的微粒上沉积的实体的数量的方法，该方法包括以下步骤：

a）利用光源照射溶液；

b）检测由照射光在溶液中的散射而形成的光信号；

c）分析在步骤b）中得到的光信号以得到与该信号相关的指标；

d）将步骤c）中得到的指标与从参考溶液得到的参考指标做比较，该比较可估计微粒上沉积的实体的数量。

根据本发明的方法可包括以下（单独或组合的）特征：

-在步骤c）中得到的指标对应于光信号的光强度；

-在步骤b）中检测到的光信号为至少一个散斑图像；

-在步骤c）中得到的指标对应于所述至少一个散斑图像的散斑的平均尺寸；

-在步骤c）中得到的指标对应于所述至少一个散斑图像的平均强度；

-实体的尺寸在1nm至10μm之间，且微粒的尺寸在0.1μm至100μm之间；

-微粒为铝微粒；

-溶液选自以下溶液中的一种：水溶液，例如盐水溶液，或者三羟甲基氨基甲烷溶液；

-该溶液形成悬浮微粒的混浊溶液；

-利用相干光执行步骤a）；

-利用单色光执行步骤a）；

-步骤d）中涉及的参考溶液为与步骤a）中被照射的溶液相同的溶液，除了不存在实体外。

为了实现这些目的中的至少一个目的，本发明还提出了一种用于估计溶液中悬浮的微粒上沉积的实体的数量的装置，该装置包括：

-光源，该光源用于照射溶液；

-成像器，该成像器用于检测由光在溶液中的散射而形成的光信号；

-部件，该部件用于分析和处理由此所检测到的光信号以得到可与从参考溶液得到的参考指标比较的指标，该比较可估计微粒上沉积的实体的数量。

根据本发明的装置可包括以下特征中的至少一种特征（单独或组合使用）：

-光源和成像器被整合在一个密封的容器（receptacle）中，该容器可被浸没在溶液中；

-分析和处理部件被整合在所述密封的容器（receptacle）中；

-该装置还包括用于容纳溶液的容器；

-光源和成像器被放置在该容器的两侧；

-该装置包括放置在成像器前的部件，该部件用于消除已经在溶液中散射数次的光的光子；

-用于消除已经在溶液中散射数次的光的光子的部件为光阑；

-光源为相干光源，例如由激光器形成的光源；

-成像器为矩阵成像器，例如CCD矩阵类型或CMOS矩阵类型，或者光电二极管矩阵类型；

-矩阵成像器检测作为光信号的散斑图像；

-成像器由光电二极管形成。

更具体地，根据本发明的装置可被用于估计溶液中悬浮的微粒上所吸附和/或解吸的实体的数量。

附图说明

将在以下参考附图的详细的描述中说明本发明的其他特征、目的和优点：

-图1示出根据“传输”配置的方法的原理；

-图2示出根据该配置所得到的图像的示例；

-图3示出自相关图像的轮廓；

-图4示出用于测试的装置，进行该测试以示出根据本发明的方法的可行性；

-图5，包括图5（a）至图5（f），示出在利用根据本发明的方法用于被吸附在悬浮在溶液中的微粒上的各种浓度的实体而进行测试的情况下，在根据图4装置的可视化平面上得到的散斑图像；

-图6，包括图6（a）至图6（c），示出对于各种缓冲液，在根据图4的装置的可视化平面上得到的散斑图像；

-图7示出在传输配置中，当溶液为TRIS（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液时，根据包含微粒的所述溶液中的实体的浓度，散斑在两个方向（Ox和Oy）上的平均尺寸的变化；

-图8示出在传输配置中，当溶液为磷酸盐缓冲液时，根据包含微粒的所述溶液中的实体的浓度，散斑在两个方向（Ox和Oy）上的平均尺寸的变化；

-图9示出在减少的浓度范围内的图7的细节；

-图10示出在传输配置中，当溶液为TRIS（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液时，根据包含微粒的所述溶液中的实体的浓度，散斑图像的平均强度的变化；

-图11示出“后向散射”配置的方法的原理；

-图12示出在后向散射配置中，当所述溶液为TRIS缓冲液时，根据包含微粒的溶液中的实体的浓度，散斑在一个方向上的平均尺寸的变化；

-图13示出在后向散射配置中，当所述溶液为TRIS缓冲液时，根据包含微粒的溶液中的实体的浓度，散斑图像的平均强度的变化；

-图14示出可用于执行过后向散射而操作的根据本发明的方法的装置的变型；

-图15示出根据利用图14装置所吸附的蛋白的浓度，通过将BSA蛋白添加到含有微粒的TRIS溶液中而得到的散斑图像的平均强度的变化；

-图16为图15中所示结果的另一种表示；

-图17示出对于与图15的浓度比较而扩展了的BSA蛋白浓度范围，利用图14装置，根据所添加的蛋白的浓度，将BSA蛋白添加到含有微粒的TRIS溶液中而得到的散斑图像的平均强度的变化；

-图18示出各种曲线，这些曲线中的每条曲线示出根据所添加的蛋白的浓度，将预定性质的蛋白添加到含有微粒的TRIS溶液中而得到的散斑图像的平均强度的变化，这些曲线利用图14的装置而得到；

-图19与图18类似，但是用于其他蛋白；

-图20与图18类似，但是连续添加了两种不同的蛋白，例如BSA蛋白和乙型肝炎抗原；

-图21主要示出根据时间，通过将PHOS缓冲液添加到含有BSA蛋白的TRIS溶液中而得到的散斑图像的平均光强度变化，该BSA蛋白已经吸附到溶液中悬浮的微粒上；

-图22示出可用于执行根据发明的方法的另一装置，该装置通过后向散射进行操作；和

-图23示出图22的装置的变型。

具体实施方式

通常，本发明涉及监测实体在溶液中的悬浮微粒上的沉积。优选地，实体的尺寸比微粒的尺寸至少小10倍。

根据本发明的方法可估计在溶液中的悬浮微粒上沉积的实体的数量。该方法包括以下步骤：

（a）利用光源照射溶液；

（b）检测由照射光在溶液中的散射而形成的光信号，例如对于该光信号可以为至少一个散斑图像；

（c）分析在步骤（b）中得到的光信号以便得到与该信号有关的指标；

（d）将步骤（c）中得到的指标与对于参考溶液而得到的参考指标做比较，该比较可估计微粒上沉积的实体的数量。

术语“微颗粒”或者“微粒”意在指其直径（或者最大对角线）介于0.1μm至100μm之间的颗粒，通常介于1μm至15μm之间，例如为3μm。

微粒可具有有机性质或者无机性质。

在无机微粒的情况下，该微粒尤其可为被称为疫苗佐剂的无机盐，例如钙盐、铁盐、或者更常见地，铝盐。这些盐可为氢氧化物，尤其为氢氧化合物、磷酸盐（例如羟基磷酸盐或者正磷酸盐）、硫酸盐等、或者其混合物，尤其是氢氧化物和磷酸盐的混合物。

在本发明的示例性实施方式中，微粒为铝微粒。

这些微粒包含在液态溶液中，诸如水溶液，例如适宜的盐水缓冲液，例如TRIS（三羟甲基氨基甲烷）。这些微粒在溶液中的浓度通常在几百毫克/升至几十克/升之间，优选地在1克/升至10克/升之间。这些浓度可得到由于溶液中的光散射而造成的散斑图像。

表述“在微粒上沉积实体”意指在微粒上吸附该实体，而且，更一般地，在实体和微粒表面之间形成键，例如，该键可能为共价键、静电键、离子键、氢键、卤键、或金属键。

沉积在微粒上的实体可具有各种特性。

该实体可为化合物或生物物质，例如蛋白、肽、多糖、糖蛋白、脂类、糖脂、多核苷酸、病毒或细菌。

在本发明应用至疫苗配制的情况下，这些实体可为抗原或者具有佐剂活性的化合物。尤其，利用作为实体的模型蛋白来完成本发明：牛血清白蛋白（BSA）。通常，BSA蛋白的尺寸介于几纳米至几微米之间。通常，BSA蛋白的尺寸介于1纳米至200纳米之间，以便其可被描述为纳米实体。

表述“量化在微粒上沉积的实体”意指例如估计沉积（例如通过吸附）在微粒上的实体的平均数量。

术语“散斑”或“散斑颗粒”是相等同的。

术语“矩阵成像器”表示以矩阵形式存在的任何图像传感器。作为示例，其可为CCD（电荷耦合装置）矩阵、CMOS（互补金属氧化物半导体）矩阵、或者光电二极管矩阵。

根据给定方向或给定表面，与散斑图像相关的指标可为所述图像的散斑的平均尺寸。

该指标可通过计算所分析的图像的自相关函数来获得。

作为变型，该指标也可对应于根据类似的测量配置而获得的多个图像的散斑的平均尺寸。

根据另一变型，与散斑图像相关的指标也可为散斑图像的强度，通过构建该图像的像素的全部积分或部分积分而获得这种强度。这相当于将该图像的全部或一部分上的像素的值相加。

该指标也可为根据类似的测量配置而获得的多个散斑图像的平均强度。

不考虑所选择的指标的性质，通常相对于参考指标来表示该指标。例如，可能比较在一个图像上所测量的指标以及将该指标与在初始图像上建立的称为初始指标的相同指标做比较。然后，以相对指标的形式表示该比较，例如所测量的指标和初始指标之间的比率的形式表示该比较，或者，以相对于初始指标减去所测量的指标的形式表示该比较。

参照图1至图3，将描述测量装置的操作原理。

图1示出了根据本发明、根据称为“传输”的第一实施方式的方法的实现原理。

这在于利用相干光照射包含在容器12中且包含悬浮微粒的溶液，相干光例如来源于激光辐射源10且通过专用部件11预成形。这为方法的步骤（a）。

悬浮在溶液中的微粒使来源于激光器10的入射光散射且在矩阵成像器的表面14（也称为可视化平面）上形成散斑13（也称为散斑颗粒）。于是在可视化平面14中可检测到由溶液中的散射光而形成的散斑图像15。这为方法的步骤（b）。

图2示出通过矩阵成像器的表面14检测到的散斑图像15，该图像包括多个散斑13。

这些散斑13的尺寸取决于测量配置（即矩阵成像器的类型）、矩阵成像器14与可被比作比色杯的容器12之间的距离D、以及矩阵成像器14相对于该比色杯12的取向α，而且还取决于溶液的光学性能。因此应当理解，当测量配置被固定时，散斑的尺寸仅取决于容器中存在的溶液的光学性能。

然而，在矩阵成像器的表面14上所得到的散斑图像15不能被直接利用。

因此，需要具有与该散斑图像相关的指标，其可与溶液的光学性能相关联。这为方法的步骤（c）。

如上所述，该指标可为包括在散斑图像15中的散斑13的平均尺寸。这样的指标可通过执行散斑图像15的空间自相关计算而得到。例如，该自相关计算利用下面公式（R1）而进行：A(x,y)=FT^-1[FT²(I(x,y))]，其中，A（x,y）为在可视化平面14的坐标（x,y）处的自相关图像，FT表示傅里叶变换且I（x,y）为在可视化平面14的坐标（x,y）处所得到的光的强度。

通过确定自相关图像在给定方向上的轮廓以及通过计算在该轮廓中存在的峰值的中间高度的宽度，该自相关计算可得到散斑在所述给定方向上的平均尺寸。例如，该方向可为根据散斑图像15的轴线Ox（或者根据散斑图像15的轴线Oy）的方向。这方面将在后续的描述中进行详细说明。

图3示出在方向Ox上，标准化后的自相关图像的根据沿着x-轴线的像素数目x的沿着y-轴线的轮廓，并且，在该轮廓上，说明了散斑在峰值的中间高度处的平均水平尺寸tx（以像素表示）。

在步骤（a）中用于照射溶液的相干光为单色的、且优选地为连续的。所考虑的波长小于微粒的尺寸。

如上所述，指标可为散斑在给定方向上的平均尺寸。对于给定的图像，通过计算用于该图像的自相关函数（例如通过公式R1），可得到该平均尺寸。这可得到在给定方向上散斑的平均尺寸或者散斑图像的颗粒的平均尺寸。该指标可通过在所述给定方向上构建自相关图像的轮廓以及将标准应用至该轮廓而被确定。术语“轮廓”意指根据给定的线所考虑的图像的像素强度的直方图。应用于轮廓的标准可为在自相关图像的轮廓中出现的峰值的中间高度的宽度。该指标还可为按照给定的表面所构建的自相关峰值的一部分的面积。

当然，可使用本领域的技术人员已知的其他自相关技术。通常，可使用可得到表示散斑的平均尺寸的指标的任何技术。

指标还可为在类似条件下产生的多个图像上所确定的、在每个图像上得到的散斑的平均尺寸的平均值。

最后，在已经完成如随后将解释的校准后，步骤（d）可估计吸附到微粒上的实体的平均数量。

在下文示出显示本方法的可行性的测试。

在图4中示出用于执行该方法的实验装置的图示。

所选择的激光辐射源1为发射连续光的激光二极管，其波长为532nm且功率为200mW。

来源于激光器1的光由光传输部件2（诸如光导纤维）所导向。该传输部件2为可选的。

可选地提供光学的光成形部件3。光成形部件3可包括一组透镜、一个或多个滤光片，并且尤其为偏振滤光片。

如果光源为激光二极管，则该组透镜是极其有用的，这可使光束尽可能的精细。

如果由激光器或者在合适的情况下由激光二极管发射的光的偏振是不充足的，则偏振滤光片是极其有用的。

意在接收溶液的容器4被插入到出于该目的而提供的装置的外壳中。

激光器1和容器4之间的距离大约为10cm。

在该测试中所使用的容器4的尺寸为1cm×1cm×4cm，且其壁由玻璃制成。因此其容积为几立方厘米。

更一般地，容器的深度可在1mm至5cm之间，通常在5mm至3cm之间。该深度是平行于入射光束的轴线而量取的尺寸。根据含有微粒的溶液的光学性能，尤其是散射性能和吸附性能而限定该深度。

容器4的壁也可由有机透明材料或无机透明材料制成，例如玻璃或有机玻璃。重要的因素为壁可透过入射光。这些壁的每个壁的厚度均可介于10μm至几厘米之间，例如介于10μm至3cm之间。

矩阵成像器6，在该情况下为设置在容器4的下游、具有1024×960像素的CCD矩阵，形成了由溶液中的光散射而产生的散斑的可视化平面。

容器4与CCD矩阵6之间的距离被优化以得到其尺寸大约为n×n像素的散斑，且n在2和10之间。这对于CCD矩阵6的给定数目的像素来说，能够在该CCD矩阵上得到足够数目的散斑，同时允许充分精确地估计散斑尺寸，尤其是散斑的平均尺寸。

在此处给出的试验的情况下，n等于3。然后，容器4与CCD矩阵6之间的距离大约为10cm。

此外，可选地但为优选地，装置包括在容器4和CCD矩阵6之间的光阑5。

该光阑5可消除已经在溶液中散射数次的光的光子。当溶液为高度散射的溶液（散射系数大于几cm^-1）时，这是尤其有利的，在高度散射的溶液中具有大量的多重散射。光阑5可提高在CCD矩阵6上得到的散斑图像的对比度。当使用光阑时，光阑5的直径可被调整以在CCD矩阵6上得到对比度大于0.9的散斑图像。

在此处给出的测试的情况下，光阑的直径为5mm，这可得到上文所提到的0.9的对比度。

此外，可选地但为优选地，偏振滤光片（未示出）可被添加在容器4和CCD矩阵6之间。偏振滤光片的功能为消除多重散射的光子，实际上当光子被多重散射时，其失去它们的偏振。当溶液为高度散射的溶液时这是尤其有利的，这可提高在CCD矩阵6上得到的散斑图像的对比度。

最后，CCD矩阵6连接到处理和分析部件8，例如计算机，处理和分析部件8可进行必需的各种处理，尤其是方法的步骤（c）的分析。

对于这些测试，溶液中的悬浮微粒为铝（AlOOH）微粒，所述溶液通常由术语“凝胶”表示。这些微粒的平均尺寸为3μm。溶液中微粒的浓度使得铝微粒的浓度1.5g/l。

此处所考虑的实体为模型蛋白，比如牛血清白蛋白（BSA）。

已经测试了几种溶液：首先，pH值固定的三羟甲基氨基甲烷（TRIS）缓冲液，以及其次，pH值固定的磷酸盐缓冲液。

在第一系列的测试中，申请人使用pH值等于6.8的TRIS缓冲液，该缓冲液包含悬浮的铝微粒，BSA浓度从一个测试到另一测试为变化的。

参考溶液对应于不含有BSA的pH值等于6.8的TRIS缓冲液。

对于进行的每个测试，将给定量的BSA引入到含有悬浮在溶液中的铝微粒的溶液中。

被引入到溶液中的BSA的量被确定以得到一定浓度的BSA，下文表示为每毫克铝（以铝微粒的形式，由符号A1表示）的BAS的微克数。相对于溶液中铝的量而表示这种浓度可能不具有溶液本身中的BSA的浓度的变化。

具体地，悬浮微粒表面上的BSA的吸附机制，且更一般地，如上文限定的实体的吸附机制，可被分解成三个阶段。

第一阶段：在第一阶段期间，BSA蛋白在溶液中混合（扩散、对流等）且被输送到悬浮的微粒处。

第二阶段：在第二阶段期间，BSA蛋白被吸附在悬浮的铝微粒的表面上。

最后，最后一个阶段对应于动态平衡系统。在该系统中，所吸附的BSA的量不再变化，因此，散斑的尺寸不再变化。

图5示出在步骤（b）期间，在CCD矩阵6的层面上，在动态平衡系统中所得到的多个散斑图像。在图5中，BSA浓度表示为Tx，其中x为以μgBSA/mgAl所表示的BSA浓度。

图7示出在两个垂直方向（Ox和Oy）上，各种浓度（在T0至T1000之间的范围内）的散斑颗粒的平均尺寸。按照上文参照图3所述的，每个平均尺寸通过计算相应的散斑图像的自相关函数（该自相关函数采取峰值的形式），并且通过根据所考虑的方向（在这种情况下在Ox或者Oy上）确定该峰值的中间高度的宽度而得到。

应当理解，T0为以凝胶形式的、包含铝微粒的pH值等于6.8的TRIS缓冲液，但不含有BSA蛋白。因此，T0为参考溶液。

因此，所测试的浓度在T0至T1000之间的范围内。术语Tx表示这样的溶液：在该溶液中，所添加的BSA蛋白的量使得获得xμgBSA/mgAl的浓度。

应当注意，这些浓度水平足够低，从而一旦达到平衡系统，则可认为所添加的几乎所有的蛋白被吸附到微粒上。在从几秒至几小时的一段时间后，实现平衡系统。

通过比较图5的各种图像以及特别是在图7中所示的结果，可以观察到BSA的浓度越高，则散斑或者散斑颗粒的尺寸越小，且当然，反之亦然。

因此，该现象表示散斑的平均尺寸与在铝微粒表面上所吸附的蛋白的数量相关。因此，当该数量未知时，通过与参考测量相比较，测量散斑的平均尺寸可估计吸附到微粒上的蛋白的平均数量。

相反，由于本领域技术人员已经考虑到吸附到微粒上的小尺寸的实体将不会改变散斑颗粒的尺寸，因此这是令人惊奇的。

例如，该参考测量可为在添加BSA蛋白之前，由微粒的“参考”溶液所产生的散斑的平均尺寸。应当理解，优选地，两个测量（参考测量和对待描述的溶液的测量）将在相同的条件下进行：相同的装置、相同浓度的铝微粒、和对施加至散斑图像的信号的相同的处理。

由于BSA蛋白的尺寸远小于颗粒的尺寸，且微粒的尺寸在吸附前后仅非常小地改变，因此本领域技术人员将认为吸附在颗粒上的这些蛋白不能够被检测到。然而，如前面谈及的结果所示，本实验证明了相反的结果。

对于溶液中给定浓度的BSA所得到的散斑的平均尺寸与参考溶液的散斑的平均尺寸相比，给出关于吸附在微粒上的BSA蛋白的数量的信息。

本发明人利用磷酸盐缓冲液代替TRIS溶液而进行了另外一系列的测试，磷酸盐缓冲液不太有利于BSA蛋白吸附到铝微粒上。这是因为在这样的溶液中，磷酸盐离子趋向于聚集在微粒的表面上。因此，蛋白在微粒表面上的吸附由于吸附位点上存在磷酸盐离子而受到阻碍。

在第二系列测试期间，使用pH值等于6.8的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液含有相同浓度的以凝胶形式存在的铝微粒和浓度介于T0至T1000之间的BSA蛋白，即介于0μg BSA/mgAl和1000μg BSA/mgAl之间。

图6，在图6（a）至图6（c）中，分别示出对于参考溶液（图6a）、对于浓度为T1000的pH值等于6.8的TRIS缓冲液（图6b）和对于浓度为T1000的pH值等于6.8的磷酸盐缓冲液（图6c），在方法的步骤（b）期间在CCD矩阵6上得到的散斑图像。

图8示出使用磷酸盐缓冲液的散斑颗粒在每个浓度下的平均尺寸。

应当注意，在图8中，根据在溶液中所添加的量的BSA蛋白的浓度，散斑平均尺寸的变化比使用TRIS缓冲液时不显著。当它发生时，出于上文所提到的原因，在磷酸盐缓冲液的情况下吸附在微粒表面上的BSA蛋白比在TRIS缓冲液的情况下更为有限。

于是，该比较可证实散斑颗粒尺寸的变化是由于吸附在铝微粒表面上的BSA蛋白的数量。

图9示出添加到微粒溶液的低浓度的BSA蛋白的图7（TRIS溶液）的子集。应当注意，从所添加的低量的蛋白开始，例如T30，散斑颗粒的平均尺寸的减少是可检测到的。

因此，不仅可通过确定散斑颗粒的平均尺寸来估计吸附到微粒表面上的实体的数量，而且该估计可在当所吸附的实体的量较低（约每毫克Al几十微克BSA）时进行。

除了涉及散斑颗粒的平均尺寸的指标外，还测试了与散斑图像有关的指标。

例如，还确定了基于散斑图像的平均强度的指标的变化。对于此，获取了多个对应于给定浓度的实体（例如BSA蛋白）的散斑图像。这些图像的每一个图像的强度通过构建该图像的积分而确定，即通过把组成该图像的像素的权重加起来，然后计算每一图像的强度的平均值而确定。

图10示出该指标根据添加到包含铝微粒的TRIS溶液中的BSA蛋白的浓度的变化。再次注意到随着BSA浓度增加，该指标降低。

至此，已经描述了通过利用传输配置而操作的装置进行的测试，根据该配置，容器4被放置在激光源和矩阵成像器之间。

根据另一实施方式，装置的测量配置为“后向散射”配置，于是，光源和矩阵成像器面向容器4的相同面而定位。

在图11中示出了这样的测量配置。

在图11中，激光辐射源10照射容器12的一部分，所散射的辐射被矩阵成像器14收集，矩阵成像器的光轴141与激光源10的光轴101成角度α。该角度α小于45°，且优选地介于几度至20°之间，在本实施方式中为12°。优选地，选择尽可能小的角度α。偏振滤光片11放置在激光源10和容器12之间（于是，滤光片11被称为偏振器）；偏振滤光片11’放置在容器12和矩阵成像器14之间（于是，滤光片11’被称为分析器）。尤其，光阑可被放置在容器12和成像器14之间。

与传输实施方式相反，这些滤光片相对于彼此正交地取向，以消除由容器所反射的光，该反射光以与入射光相同的方式被偏振。激光辐射源10和矩阵成像器14为先前所选择的用于在传输模式中进行测试的那些激光辐射源和矩阵成像器。

然后，图12示出根据被添加到包含TRIS溶液中的铝微粒的容器中的BSA蛋白的浓度，由CCD成像器14检测到的散斑的平均尺寸的变化。该尺寸为根据轴线Ox所量取的且以像素表示的平均尺寸。

再次观察到根据吸附到微粒上的BSA蛋白的数量，散斑的平均尺寸的变化，从而散斑的平均尺寸被认为是该数量的指标。

然而，与先前描述的情况（参见图7和图9）相反，将散斑的平均尺寸与所吸附的蛋白的数量相联系的函数为增函数，除了几个波动外。

还确定了根据吸附在微粒表面上的BSA蛋白的数量，散斑图像的平均强度的变化（参见图13），以类似于第一实施方式（图10）的方式进行该强度的确定，即根据图4中所示出的传输配置。对于给定浓度的BSA蛋白，获取多个散斑图像，通常几十个（在该示例中为50个），例如可通过确定由CCD成像器检测到的散斑图像的全部或者一部分上的像素的积分而确定所述图像的强度。然后，在所添加的BSA蛋白的每个浓度下确定所得到散斑图像的平均强度。

与基于与散斑尺寸相关的指标而得到的结果相反（该结果在图10中示出），得到基本上增加的函数，除了几处测量波动外。因此，该散斑图像的平均强度可被认为是吸附在微粒上的蛋白的数量的指标。

利用装置的后向散射配置，进行了其他测试。

在图14中示出该装置。

在图14中，激光辐射源10’照射容器12’的一部分，由矩阵成像器14’收集所散射的辐射，矩阵成像器14’的光轴141’与激光源10’的光轴101’成角度α。偏振滤光片11”被放置在激光源10’和容器12’之间；偏振滤光片11’”被放置在容器12’和矩阵成像器14’之间。

激光辐射源10’可为发射532nm的波长的DPSS激光器（“二极管脉冲固态”激光器）。容器12’可为具有磁力搅拌的结晶皿。

角度α小于45°，优选地介于几度至20°之间，在本实施方式中约为20度。优选地，选择尽可能小的角度α。

当容器为具有磁力搅拌的结晶皿时，偏振滤光片11”可为光阑，例如直径为3cm的光阑，以限制在结晶皿的磁力搅拌器上的反射效应。

偏振滤光片11’”（分析器）可为以与图11中示出的装置相似的方式定位在容器12’和矩阵成像器14’之间的交叉偏振器。该交叉偏振器可改善容器12’所反射的信号的质量，尤其当溶液为高度散射的溶液时。

此外，应当注意，光阑（未示出）也可被添加在容器12’和矩阵成像器14’之间以消除已在溶液中进行数次散射的光的光子。当溶液为高度散射的溶液时（散射系数大于几cm^-1），这是特别有利的。

容器12’和矩阵成像器14’之间的距离大约为20cm。

例如，矩阵成像器14’为FLEA2相机。

利用图14中示出的装置而进行的测试的条件如下。

包含在容器12’中的缓冲液中的悬浮的微粒为氢氧化铝（AlOOH）微粒。平均尺寸为3微米。

所考虑的实体始终为牛血清白蛋白（BSA）。

缓冲液为pH值等于6.8的TRIS溶液。

在第一次测试中，该测试的结果在图15中示出，BSA的浓度在0至200μgBSA/mg Al的范围内。这些浓度较低，且由于在疫苗配制领域通常遇到这些浓度水平，因此这些浓度是感兴趣的浓度。

测试在于连续将将一定量的BSA引入到包含铝微粒的缓冲液中。

每100秒添加5μgBSA/mg Al的量，直到50μg BSA/mg Al。然后，每100秒添加10μgBSA/mg Al的量，直到100μg BSA/mg Al。最后，每100秒添加20μgBSA/mg Al的量，直到200μgBSA/mg Al。

图15示出根据每毫克铝所吸附的BSA的量的变化，在矩阵成像器14’的层面上得到的光强度（任意单位）。应当注意，只要溶液没有达到饱和，被添加到缓冲液中的蛋白的量对应于由铝微粒所吸附的量。

在该情况下，光强度形成与由矩阵成像器14’捕获的散斑图像有关的指标。通过将在该图像的全部或一部分上所包含的像素的值加在一起而得到该指标。

应当注意，通过在相机上所得到的光强度的增加而反映BSA的数量的增加。此外，在每次添加BSA时所得到的强度跳跃直接与每次所引入的BSA的数量相关。

这清晰地表明吸附在铝微粒上的BSA蛋白的数量与由矩阵成像器14’所接收的光强度之间的联系。

图16示出对于BSA蛋白引入到缓冲液的每一阶段，在图15中示出的原始结果（与图16相反，在图15中比例沿着x轴线是非线性的）的平均值。应当注意，强度随着BSA蛋白浓度而呈线性增加。

应当注意，在没有将BSA蛋白引入到TRIS缓冲液的情况下，作者进行了相似的测试，且观察到与图15的光强度相比，光强度没有变化。此外，作者还利用PHOS缓冲液进行了其他测试，一方面添加BSA蛋白，且另一方面，不添加BSA蛋白。已知PHOS缓冲液抑制BSA蛋白在铝微粒上的吸附。这些测试表明由矩阵成像器14’接收的光强度的变化可与利用不添加BSA蛋白的TRIS缓冲液的测试所得到的光强度的变化相当。

为了证实本发明也可适用于更高浓度的BSA，作者进行了另一测试。

该测试的条件与得到图15和图16中所示出的结果的测试条件相同。然而，改变了将BSA蛋白引入到缓冲液中的方法。

具体地，由包含悬浮的铝微粒的TRIS缓冲液开始，进行添加100μg BSA蛋白，直到添加了2000μg BSA/mg Al。

应当注意，随着BSA蛋白浓度的增加，光强度增加。这说明当BSA浓度超过200μgBSA/mg Al时，也可执行本发明。因此，可设想除了疫苗配制以外的其他应用。

还应当注意，在大约1200μg BSA/mg Al时发生溶液的饱和效应。实际上，超过该浓度时，根据BSA的数量在矩阵成像器14’的层面上观察到的光强度的变化不再为线性的，而是弯曲的以趋向于一个恒定值。

使用除了BSA蛋白外的其他蛋白，通过图14中示出的装置进行了其他测试。

所使用的缓冲液为pH值等于6.8的TRIS缓冲液，其包含悬浮的铝微粒（AlOOH）。

所使用的蛋白为以下几种：α-酪蛋白（α-cas）、脱磷酸化的α-cas、IgG（免疫球蛋白）和最后用作参考的BSA蛋白。

对于每一测试，添加到缓冲液中的蛋白的浓度相同，例如20mg/ml，以得到从一种蛋白到另一种蛋白可比较的测量。

图18中示出了结果。该图18示出根据所吸附的蛋白的数量，由矩阵成像器14’检测到的光强度的相对变化。在0至100μg蛋白/mg Al的浓度下进行测试。

有趣的是注意到对于所测试的所有类型的蛋白，光强度增加。因此，可设想利用大量不同蛋白而执行本发明。

此外，无论所测试的是哪种蛋白，光强度变化基本上保持线性。

然而，应当注意，这些线性变化的坡度从一种蛋白到另一种蛋白不同。因此，当使用装置时，知道利用哪种蛋白是明智的。

进行了附加的测试以比较根据所吸附的蛋白浓度由矩阵成像器14’捕获的光强度的变化，一方面针对BSA蛋白，另一方面针对乙型肝炎抗原（HBs）。

对于这些测试，溶液为pH值等于6.8的TRIS缓冲液，其包含悬浮的铝微粒（AlOOH）。

所吸附的蛋白的浓度在0至50μg/mgAl时进行测试。

图19示出结果。

注意到在图19中本发明还使用HBs蛋白。

在先前的测试中，证明本发明可用于各种实体。

应当注意，也可同时使用多种具有不同性质的实体而进行本发明。

这是因为，由于由矩阵成像器14’所接收的光强度的相对变化的坡度从一种实体到另一种实体不同（例如，参见图18），因而可在所使用的各种实体之间进行区分。

这在图20中示出。

在图20中，示出根据由悬浮的微粒所吸附的实体的数量，由矩阵成像器14’所接收的光强度的相对变化。

例如，所考虑的实体为BSA蛋白和HBs蛋白。

在第一次测试（测试1）中，将BSA蛋白添加到只含有悬浮的铝微粒的TRIS缓冲液中，直达到25μgBSA/mg Al的量。然后添加乙型肝炎抗原，直到总浓度为50μg/mgAl。

对于该第一次测试，清晰地观察到与所使用的各种蛋白相关的不同坡度。

在第二次测试（测试2）中，将乙型肝炎抗原添加到只含有悬浮的铝微粒的TRIS缓冲液中，直到25μg HBs/mgAl的量。然后添加BSA蛋白，直到总浓度为50μg/mgAl。

再次，清晰地观察到与所使用的各种蛋白相关的不同坡度。

此外，应当注意，两次测试之间的最终差异（在50μg/mg Al）可以忽略不计，这说明测量装置是辅助的。

最后，利用图14示出的装置进行了最终的测试。该测试表明本发明可用于测量从佐剂微粒解吸的实体的数量。

首先，制备包含悬浮的铝微粒的TRIS缓冲液。

其次，将一定量的BSA添加到该溶液中，使得所述量可得到500μg吸附的BSA/mgAl的浓度。

最后，将500mmol的体积为30ml的磷酸盐（PHOS）缓冲液添加到该溶液中，以使BSA蛋白解吸，因为磷酸盐与BSA相竞争。

在图21中给出该测试的结果。

在图21中，示出了在成像器14’层面上所得到光强度根据时间的变化。

应当注意，添加磷酸盐缓冲液实际上使由成像器14’所检测到的光强度下降，其表征了BSA蛋白的解吸。

最终，可以与吸附动力学相同的方式来分析解吸动力学。

为了在工业环境下使用上文示出的结果，于是所有必需的是通过所考虑的装置进行校正，以得到取决于图7、图8、图10、图12、图13、或图15至图21的情况的曲线。尤其，选择缓冲液、微粒的性质和尺寸、溶液中微粒的浓度以及可被沉积在微粒上/从微粒中取出的实体的性质。

进行该校正以便进行各种校正测量，进而控制了吸附到微粒上的实体的数量。

一旦已经得到该校正曲线，则可监测对于任意随后的工业过程该实体在该特定的溶液中的吸附的变化。

这通过监测在矩阵成像器上所得到的散斑的尺寸的变化而进行。因此，通过具有与散斑图像或多个散斑图像有关的指标，可通过将该指标与参考指标相比较而确定沉积在微粒表面上的实体的数量，可通过对添加实体之前的微粒溶液进行测量或者对标准溶液进行测量而建立参考指标。从该比较可以推断出沉积的实体数量。

这也可在不涉及获得散斑图像的情况下进行。

实际上，在上文示出的所有测试中，所使用的装置利用矩阵成像器，这可得到通过光穿过溶液而形成的散斑图像。

然而，在图1、图4、图11和图14中示出的所有装置中，矩阵成像器可被替换为光电二极管。

在这种情况下，光电二极管仅提供一定程度的光强度，这足以完成本发明。实际上，与在矩阵成像器上得到的散斑图像相关的指标可尤其为该传感器所接收的平均光强度。因此，应当理解，检测由入射光在溶液中的散射而形成的散斑图像不是必须的。

此外，应当注意，提供相干光源（比如激光）不是必须的，即使这是有利的。例如，可设想用发光二极管来替代激光以照射溶液。

上文所描述的方法可确定吸附在微粒上的实体的数量。由于每个测量的持续时间较短，通常少于几秒钟，因此，该测量与工业过程的在线监测（即实时监测）相容。

应当理解，这种方法也可监测实体在微粒上吸附的动力学，这些动力学通过比较来自连续测量的结果而得到。

在本发明的上下文中所实施的方法也可作用于悬浮微粒的混浊溶液。由于在疫苗配制中特别遇到混浊溶液，因此这格外有利。

在图4和图11中示出的装置分别为通过传输或者通过反射而操作的装置。

可设想其他类型的装置。

因此，在图22中示出的装置为通过后向散射而操作的装置，其也可作为实施方式变型的主题。该装置包括与图4中所描述装置中存在的那些部件相同的部件，这些部件具有相同的附图标记。

然而，应当注意，除了激光器1和计算机8外，该装置的部件被整合在一个可被浸没在溶液中的密封的容器（receptacle）100中。该容器（receptacle）可被比作可被浸没在悬浮微粒的溶液中的探测器，其飘浮度是受控的。通过窗口41可进入含有溶液的比色杯，窗口41可由玻璃或透明塑料制成。

图23示出了该装置的一个实施方式变型，其也通过反向散射而操作。与图4中所描述的装置中存在的那些部件类似的部件具有相同的附图标记。再次，该装置可被密封且浸没在悬浮微粒的溶液中。

根据该变型，装置以可被比作探测器的容器100的形式存在。通常，该探测器的直径小于15cm，优选地在几厘米与10厘米之间。

该探测器100被密封且完全浸没在溶液中。为了达到这种效果，激光器被替换为由电池9供电的小型激光二极管1。处理部件8也被小型化且与探测器100整合。为了与外部通信，设想能够通过射频或通过有线连接而传输数据的专用部件91。

图22和图23中示出的装置可使用相干光源（比如激光器）或不相干光源（比如发光二极管），而无隐含的差别。此外，倘若只测量光强度的话，则矩阵成像器可被替换为光电二极管。

Claims

1.一种用于估计溶液中悬浮的微粒上沉积的实体的数量的方法，所述方法包括以下步骤：

a)利用光源照射包含悬浮的微粒的所述溶液；

b)检测通过悬浮在溶液中的多个微粒使照射光散射而形成的图像；

c)分析在步骤b)中得到的所述图像以得到与该图像相关的指标；和

d)通过将步骤c)中得到的所述指标与从参考溶液得到的参考指标做比较，估计所述微粒上沉积的实体的平均数量，

其中，所述实体的尺寸至多是所述微粒的尺寸的十分之一，且其中，估计所述微粒上沉积的实体的数量包括：通过将步骤c)中的所述指标与曾经从所述参考溶液获得的所述参考指标比较来估计沉积在整个溶液中的所述微粒上的实体的平均数量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤c)中得到的所述指标对应于所述图像的光强度。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤b)中检测到的所述图像为至少一个散斑图像。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤c)中得到的所述指标对应于所述至少一个散斑图像的散斑的平均尺寸。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤c)中得到的所述指标对应于所述至少一个散斑图像的平均强度。

6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，所述实体的尺寸在1nm至10μm之间，且所述微粒的尺寸在0.1μm至100μm之间。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微粒为铝微粒。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述溶液选自以下溶液中的一种：水溶液或者三羟甲基氨基甲烷溶液。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述水溶液为盐水溶液。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述溶液形成悬浮微粒的混浊溶液。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，利用相干光执行步骤a)。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，利用单色光执行步骤a)。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤d)中涉及的所述参考溶液与步骤a)中被照射的溶液为相同的溶液，除了不存在实体外。

14.一种用于估计溶液中悬浮的多个微粒上沉积的实体的数量的装置，所述装置包括：

-光源(1、10、10’)，所述光源用于照射包含悬浮的微粒的所述溶液；

-成像器(6、14)，所述成像器用于检测通过悬浮在溶液中的多个微粒使光在所述溶液中的散射而形成的光信号，所述成像器(6,14)为矩阵成像器；和

-分析和处理部件(8)，所述分析和处理部件用于分析和处理所检测到的所述光信号以得到指标并通过将所述指标与从参考溶液得到的参考指标比较来估计所述微粒上沉积的实体的平均数量，

其中，所述实体的尺寸至多是所述微粒的尺寸的十分之一，其中，所述分析和处理部件还被配置成通过将基于所述光信号获得的所述指标与曾经从所述参考溶液获得的所述参考指标比较来估计沉积在整个溶液中的所述微粒上的实体的数量。

15.根据权利要求14所述的装置，其中，所述光源(1)和所述成像器(6)被整合在一密封的容器(100)中，该容器可被浸没在所述溶液中。

16.根据权利要求15所述的装置，其中，所述分析和处理部件(8)被整合在所述密封的容器(100)中。

17.根据权利要求14和权利要求15中的任一项所述的装置，其中，所述装置还包括用于容纳所述溶液的容器(4、12、12’)。

18.根据权利要求17所述的装置，其中，所述光源(1、10、10’)和所述成像器被放置在所述容器(4、12、12’)的两侧。

19.根据权利要求14所述的装置，所述装置包括放置在所述成像器前的部件(5)，该部件(5)用于消除已经在所述溶液中散射数次的光的光子。

20.根据权利要求19所述的装置，其中，用于消除已经在所述溶液中散射数次的光的光子的部件(5)为光阑。

21.根据权利要求14所述的装置，其中，所述光源为相干光源。

22.根据权利要求21所述的装置，其中，所述相干光源为由激光器形成的光源。

23.根据权利要求14所述的装置，其中，所述矩阵成像器的类型为CCD矩阵类型或CMOS矩阵类型，或者光电二极管矩阵类型。

24.根据权利要求23所述的装置，其中，所述矩阵成像器检测作为光信号的散斑图像。

25.根据权利要求14所述的装置，其中，所述成像器由光电二极管形成。

26.采用权利要求14所述的装置估计溶液中悬浮的微粒上所吸附和/或解吸的实体的数量的用途。