CN112867916A - 选择和隔离颗粒和细胞的系统和方法及其用途 - Google Patents

选择和隔离颗粒和细胞的系统和方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开尤其提供了用于在可光固化的生物基质凝胶中从样品中选择和隔离单细胞/颗粒的方法和装置。通过显微镜观察单个细胞或颗粒，并通过精确地控制来自取向在样品下方的液晶显示器(LCD)的光透射来操纵和隔离单个细胞或颗粒，以提供样品的详细图像。在一些实施例中，然后通过用从LED像素阵列透射的蓝/紫光固化生物基质凝胶来固定选择的细胞或颗粒。在其他实施例中，允许所选择的所关注的细胞或颗粒保持活动。在任一实施例中，将所关注的单个细胞或颗粒与样品的其余部分分开以及隔离。

Description

选择和隔离颗粒和细胞的系统和方法及其用途
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的Grant R43AI147734-01的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开内容尤其提供了用于在可光固化的生物基质凝胶中从样品中选择和隔离单细胞/颗粒的方法和装置。通过显微镜观察单个细胞或颗粒，并通过精确地控制来自定向在样品下方的液晶显示器(LCD)的光透射来操纵和隔离单个细胞或颗粒，以提供样品的详细图像。在一些实施例中，然后通过用从LED像素阵列透射的蓝/紫光固化生物基质凝胶来固定选择的细胞或颗粒。在其他实施例中，允许所选择的所关注的细胞或颗粒保持可动。在任一实施例中，将所关注的单个细胞或颗粒与样品的其余部分分开并隔离。
背景技术
在显微镜下直接隔离颗粒和细胞仍然是生物医学领域的挑战。使用显微镜，识别特定形态表型的细胞或与其他细胞类型相互作用的细胞相对容易。但是，如果不采用亚微米级精度的机械仪器和方法(例如，微量移液、光镊或激光显微解剖)，则更加难以从样品中选择所关注的细胞或颗粒。为了促进基于图像从样品中隔离出单细胞和颗粒，我们开发了一种使用LCD像素阵列和显微镜的系统和方法，其消除了对昂贵或笨重的仪器或繁琐的单细胞处理技能的需求。而且，由于捕获过程是通过单个整体曝光步骤完成的，因此与单细胞处理技术相比，吞吐量得到了极大的提高。
活单细胞隔离技术在生命科学研究的多个前沿具有潜在价值，例如抗体开发、原代细胞隔离、细胞系构建、免疫细胞治疗和循环肿瘤细胞(CTC)隔离。当前用于隔离颗粒或细胞的主要竞争技术是流式细胞仪、微流体装置、微量移液和光镊。本发明的一个优点是它提供了一种低成本、鲁棒的选择机制，该机制使得能够在具有挑战性的情况下进行活细胞隔离：例如对于有限的样品大小、块状样品和贴壁细胞。例如，流式细胞仪的设置可能很昂贵，并且需要大量的实验室空间，并且不适合隔离单个细胞。另外，本发明不需要用于进行标记的特定细胞标记物或用于细胞-细胞隔离的特定细胞标记物。如在本文中将变得显而易见的，本发明解决了用于从诸如生物样品的样品中分离颗粒或细胞的当前技术的许多缺点。
发明内容
本文提供了使用显微镜和LCD技术跟踪、选择和隔离颗粒或细胞的方法。
除了别的以外，本公开提供了用于通过显微镜引导从样品中进行单细胞或颗粒选择以及隔离的方法和装置。在一些实施例中，通过精确地控制来自位于样品下方的LCD像素的光透射来操纵单个细胞或颗粒。在一些实施例中，未选择的细胞在可光固化的生物基质凝胶中通过从细胞/颗粒下方的LCD像素透射的蓝/紫光被固定。在一些实施例中，所选的细胞在可光固化的生物基质凝胶中通过从细胞/颗粒下方的LCD像素透射的蓝/紫光被固定。
基本上，构想了本发明的两个主要实施例用于执行隔离。在一个实施例中，使所关注的颗粒或细胞保持可动，而将未选择的那些颗粒或细胞捕获或固定在生物基质中，由此将所关注的颗粒或细胞与已经固定的颗粒或细胞分离。在另一个实施例中，进行相反的过程，由此将所关注的颗粒或细胞捕获或固定在生物基质中，从而允许那些未被选择的颗粒或细胞保持可动，由此将可动的颗粒或细胞从被捕获的颗粒或细胞中除去，然后将它们收集。
在允许那些所关注的颗粒或细胞保持活动的实施例中，涉及以下步骤：(a)手动拾取颗粒/细胞图像并提取图案；(b)通过连续采集相邻区域上的对齐并串联的图像获得合成图像；(c)通过图像对齐将所选细胞的坐标映射到下方的该LCD像素；(d)所关注的细胞下方的该LCD像素变暗并阻止光通过样品，并且未选择的细胞通过外部LED光源发出的蓝/紫光被生物墨水固化而被困住，LCD不具有内部光源，在本发明中，我们使用两个外部光源：用于成像的白光LED和用于微凝胶化的UV/紫LED或激光。选定的细胞保持可动，并允许下游应用的轻松洗脱。在允许不所关注的那些颗粒或细胞保持活动的另一实施例中，采用相反的选择策略，使得仅将选定的细胞照亮并捕获在基质中。
在一些实施例中，本发明涉及一种用于在可光固化的聚合物介质中从制备的样品中分离颗粒，例如所关注的颗粒的系统，该系统包括：
(a)透光样品板，具有一个或多个用于容纳样品的容器，
(b)一个或多个光源，用于照亮和/或固化样品，
(c)液晶显示器(LCD)，例如可移除的LCD，用于选择性地控制光向样品的透射，
(d)用于使样品板和LCD相对于彼此对齐的装置，
(e)用于通过显微镜观察样品的装置，
(f)用于捕获从(e)的显微镜获得的图像的装置，和
(g)用于控制该系统的微处理器和软件。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述透光样品板(a)是96孔板。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述LCD包括像素的矩形阵列。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述LCD阵列的每个像素包括两个或更多个子像素。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述LCD阵列的每个像素包括绿色发光子像素、红色发光子像素和蓝色发光子像素。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中每个像素的尺寸为约60μm×约60μm，并且每个子像素的尺寸为约20μm×约60μm。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述像素的矩形阵列包括从约500至约10,000乘以约500至约10,000的矩形阵列。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述像素的矩形阵列包括从约1500×约2400的矩形阵列。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中，所述一个或多个光源选自：发光二极管(LED)光源、激光器、白炽灯、荧光灯、紫外线、卤素灯和氙气灯。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述LED光源发射白光。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中，所述LED光源发射具有从约390nm到约700nm的波长的白光。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中，所述LED光源发出波长为约390nm至约490nm的蓝/紫光。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述LED光源发射具有从约520nm到约560nm的波长的绿光。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中辅助LED光源发射具有从约635nm到约700nm的波长的红光。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中辅助LED光源发射具有从约290nm到约390nm的波长的紫外光。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中，所述LCD被定向在所述样品板和用于照明和/或固化样品的所述一个或多个光源之间。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中，所述LCD位于所述样品板下方，并且用于照明和/或固化样品的所述一个或多个光源位于LCD下方。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中用于通过显微镜观察样品的所述装置位于所述样品板上方。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其进一步包括(h)用于从样品中去除分离的颗粒的装置。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中用于从样品去除分离的颗粒的所述装置(h)选自移液、洗涤、漂洗、抽吸。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中样品是生物样品。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中颗粒选自细胞、生物颗粒、珠、细胞外材料和液滴。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述细胞选自循环肿瘤细胞(CTC)、血细胞、细菌、原代细胞、转化细胞、病原细胞和稀有免疫细胞。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述可光固化的聚合物介质选自光反应性聚合物，当暴露于具有约290至约400nm的波长的光源时，所述光反应性聚合物表现出粘度的增加。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中所述可光固化的聚合物介质选自诸如以下项的光引发剂组成的组从：明胶衍生物、聚乙二醇衍生物、藻酸盐及其衍生物、胶原蛋白及其衍生物、
Figure BDA0002998441250000051
及其衍生物，以及它们的混合物。
在一些实施例中，本发明涉及一种用于在可光固化的聚合物介质中从制备的样品中分离颗粒—例如所关注的颗粒的系统，该系统包括：
(a)透光样品板，具有一个或多个用于容纳样品的容器，
(b)光源组合，用于产生光学阵列图案的，
(c)用于使样品板和LCD相对于彼此对齐的装置，
(d)用于通过显微镜观察样品的装置，
(e)用于捕获从(d)的显微镜装置获得的图像的装置，和
(f)用于控制系统的微处理器和软件。
在一些实施例中，本发明涉及一种系统，其中用于产生光学阵列图案的所述光源组合选自投光器或有机发光二极管(OLED)。
在一些实施例中，本发明涉及一种用于从在可光固化的聚合物载体中制备的样品中分离颗粒，例如所关注的颗粒的方法，该方法包括利用本发明的系统来影响隔离。
在一些实施例中，本发明涉及一种利用本发明的系统在可光固化的聚合物介质中从制备的样品中分离颗粒，例如所关注的颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将准备好的样品分配到透光样品板的容器中，
(b)在样品和光源之间没有LCD的情况下获得样品的显微图像，
(c)在LCD取向在样品和光源之间的情况下获得样品的显微图像，
(d)使用微处理器和软件分析和对齐从(b)和(d)获得的图像，以获得合成图像来定位和识别样品中的颗粒，以及
(f)使用来自(d)的结果来指示微处理器和软件选择性地在所需位置处将光的聚合物固化波长传输或不传输到可固化聚合物介质，以提供聚合物介质的一系列固化区域和未固化区域，来选择性固定或不固定所关注的颗粒。
在一些实施例中，本发明涉及一种利用本发明的系统在可光固化的聚合物介质中从制备的样品中分离颗粒，例如所关注的颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将准备好的样品分配到透光样品板的容器中，
(b)在样品和光源之间没有LCD的情况下获得样品的显微图像，
(c)在LCD取向在样品和光源之间的情况下获得样品的显微图像，
(d)使用微处理器和软件分析和对齐从(b)和(d)获得的图像，以获得合成图像来定位和识别样品中的颗粒，
(f)使用来自(d)的结果来指示微处理器和软件在所需位置处选择性地将聚合物固化波长的光传输或不传输到可固化聚合物介质，以提供聚合物介质的一系列固化区域和未固化区域，来选择性固定或不固定所关注的颗粒，以及
(g)使用用于去除分离的颗粒的装置来收集颗粒。
在一些实施例中，本发明涉及一种从制备的样品中分离颗粒，例如所关注的颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将样品加载到光敏介质中；
(b)使用一个或多个非凝胶灯获取一个或多个图像；
(c)在样品和该一个或多个非凝胶灯之间放置显示装置；
(d)在显示装置上显示图案；
(e)使用该一个或多个非凝胶灯获取合成图像；
(f)计算样品中的一个或多个颗粒的位置；
(g)在显示装置上显示凝胶图案；
(h)使用凝胶灯形成至少一种微水凝胶；和
(i)通过洗涤或洗脱来处理样品。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中显示装置是LCD。
在一些实施例中，本发明涉及一种从制备的样品中分离颗粒，例如所关注的颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将样品加载到光敏介质中；
(b)在样品和一个或多个非凝胶灯之间放置显示装置；
(c)在显示装置上显示图案；
(d)使用该一个或多个非凝胶灯获取合成图像；
(e)计算样品中一个或多个颗粒的位置；
(f)在显示装置上显示凝胶图案；
(g)使用凝胶灯形成至少一种微水凝胶；和
(h)通过洗涤或洗脱来处理样品。
在一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中显示装置是LCD。
在一些实施例中，可以使用由数字微镜装置产生的光图案来代替LCD。
在一些实施例中，可以使用诸如激光的其他光源代替LED。
在一些实施例中，可以使用其他波长的光代替蓝/紫光。
在一些实施例中，可以跳过图像对齐步骤。
在一些实施例中，当所选的颗粒或细胞对光敏感时，可以跳过使用生物基质固化步骤。
在一些实施例中，可以使用任何光子响应性水凝胶来代替可蓝光固化的生物墨水。
通过本文的公开，本发明的这些和其他方面将变得显而易见。
可以理解，前面的一般描述和下面的详细描述都仅仅是示例性和说明性的，并且不限制要求保护的本公开。
附图说明
结合在本说明书中并构成本说明书的一部分的附图示出了本公开的示例性方面，并且与说明书一起用于解释本公开的原理。
图1是本发明的示意性工作流程的示例。(A)操作和仪器管线。(B)仅样品的显微图像获取。(C)样品和LCD的显微图像获取(D)选择性地调暗或照亮选定的目标(E)光诱导的微凝胶形成和(F)洗涤或洗脱目标。这些步骤由计算机脚本执行。特别是，(B)将细胞池与可蓝光固化的生物墨水(Gelatin-MA或具有生物相容性光引发剂LAP的聚乙二醇MA,或其他光敏试剂-光组合)混合，并装载在用白光LED照明的LCD顶部上。所关注的细胞将通过人工或机器学习程序(由黑色箭头指示)进行拾取，显微图像将通过中间步骤(红色LCD阵列照明)与LCD像素对齐，并且所选细胞下方的像素将被设置为黑色(C)。通过打开蓝色光源和蓝色像素掩膜(D)，可以对整个阱进行短暂的蓝光曝光。对于否定选择(D，E，F的顶部面板)，未选择的细胞或区域将被固化(黑暗区域C)，且活动相中的靶细胞将被洗脱，一根人发被显示为大小参考(100微米宽度)。对于确定选择(D，E，F的底部面板)，所关注的细胞将被照亮，并且由生物相容性生物墨水捕获，不需要的细胞将被洗掉，选定的细胞将保留并可能在原位培养。
图2A-1至2A-4是示例性样品台的透视图：
图2A-1是样品台的侧视图，
图2A-2是样品台的前视图，
图2A-3是样品台的顶视图，并且
图2A-4是样品台的透视图。
图2B是根据本公开的实施例的示例性仪器的示例，其包括：LCD、样品台、96孔光学底部微量滴定板和台式立式显微镜。
图3是用于对齐的图像获取步骤的示例。
图3A-3C描绘了图像，其中仅采用了样品图，并选择了所关注的细胞，但尚未插入LCD。图3B插入LCD并显示完整图案，如图3B所示，以及孔LCD和SAMPLE图，如图3C中所描绘。
图3C描绘了准备用于图像索引的LCD上和捕获LCD图案的示例。
图4A-4F是索引像素的示例。在这样的示例中，图案为6x6，所有边界像素均设置为0。中间的4x4像素用于标识行和列。相邻的图案有一个像素的间隔。这样，使用8x8图案用于在内部搜索一个图案。红色通道用于表示行，而蓝色用于表示列。
图4A描绘了包括所有通道的LCD图案图像。
图4BA描绘了用于仅使用绿色通道搜索图4A中的一个图案的边界8×8图案。
图4C描绘了使用互相关图(cross correlation map)对图4A和图4B的边界图案的搜索结果。
图4D描绘了从红色通道裁剪的一个图案。二进制表示形式是00000000 10010011，即147。
图4E描绘了蓝色通道。二进制表示形式是0000 0000 1000 0111，即135，表示此图案块位于整个LCD的第147行第135列。
图4F描绘了作为否定控制的绿色通道，其中不应有信号。
图5A-5B描绘了精确的LCD像素控制。在显微镜图像(左面板)上直接选择所关注的颗粒后，实时图像显示打开或关闭了单个珠(标有红色箭头)下方的LCD像素。
图5A描绘了确定控制(positive control)：其中像素被打开。
图5B描绘了否定控制(negative control)：其中像素被关闭。
图6A描绘了可用于产生噬菌体并用于本发明的抗体选择应用的噬菌体展示载体的实例。
图6B描绘了设计和构建噬菌体文库，并在本发明的抗体选择应用中使用该文库作为典型的基于Kunkel诱变的文库生成过程的分子生物学过程的实例。
图6C描绘了在基于单个珠/细胞的噬菌体展示管线中使用本发明的实例。
图7A-7B描绘了通过细胞相互作用表型选择的杀死肿瘤的克隆。
图7A描绘了细胞疗法研究中已发表的免疫细胞-肿瘤细胞相互作用。
图7B描绘了在显微镜方法下通过选择进行的概念性的肿瘤相互作用克隆富集过程。肿瘤细胞为厚边实体，无关的T细胞为白色，肿瘤结合性T细胞为灰色。
图8描绘了根据本公开的一方面的从无LCD的样品图像开始的示例性方法的流程图。
图9描绘了根据本公开的一方面的仅使用LCD样品合成图像的示例性方法的流程图。
图10描绘了颗粒捕获结果的示例性图像。
具体实施方式
定义
为了使本发明更容易理解，下面定义了某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的附加定义。
亲和试剂：如本文所用，术语“亲和试剂”是与靶分子特异性结合，例如以识别，追踪，捕获或影响靶分子的活性的任何分子。通过本文描述的方法识别或回收的亲和试剂是“基因编码的”，例如抗体，肽或核酸，且因此能够被测序。术语“蛋白质”，“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，以指代连接在一起的两个或更多个氨基酸。
生物墨水(Bioink)装置：模仿细胞外基质环境以支持活细胞的粘附，增殖和分化的生物墨水材料，它们通常衍生自生物相容性聚合物，例如明胶，藻酸盐，纤维蛋白，壳聚糖，PEG和透明质酸。
生物基质：生物墨水的交联或固化形式。
水凝胶：由交联的聚合物链网络构成的高分子聚合物凝胶。水凝胶由亲水性单体通过链增长或步长增长以及功能性交联剂来促进网络形成而合成。
系统与方法
在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意味着限制本发明。每个部分可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。
本公开内容尤其提供了用于产生针对靶蛋白的功能性表位的抗体的方法和组合物。靶向靶蛋白功能性表位的抗体的产生允许抗体调节靶蛋白的功能。例如，靶向功能性表位的能力允许抗体激动或拮抗靶蛋白的功能。在一些实施例中，本文提供的方法使用缀合有配体的抗体文库来开发可以调节靶蛋白的功能的抗体。
使用先前可用的荧光激活细胞分选(FACS)或基于微流体芯片的细胞隔离工具(1、2)，来生成稀薄的流体流并询问单个细胞，并基于某些数值特征隔离细胞亚群。但是，丢失了细胞表型和细胞间相互作用的信息。其他基于图像的单细胞采集技术，例如微量移液(3)、光镊(4)或激光捕获显微切割(5，6)需要高精度的机械仪器和每个细胞的单独捕获动作，这会降低吞吐量并阻碍商业化。快速发展的消费电子行业已将液晶显示器(LCD)推低到单细胞分辨率的水平，即2K 5.5英寸显示器的单色像素直径约为30-50μm，或大约为哺乳动物细胞的横向宽度。可以对LCD上的波长选择像素阵列进行编程以形成时空图案。此外，由于机器学习技术的进步，已经应用了基于图像的颗粒识别和分割算法(7)。
生物相容性三维(3D)印刷油墨，其是模仿细胞外基质环境以支持活细胞的粘附、增殖和分化的材料，通常来自于生物相容性聚合物，例如明胶、藻酸盐、纤维蛋白、壳聚糖、PEG，且也可以使用可由可见光固化的或固定化的透明质酸(8)。这些材料可产生>90％的细胞活力，其可与商业细胞分选仪(即FACS和基于微流体的分选仪)相匹配。由于可以通过单个的整体曝光步骤执行捕获过程，因此大大提高了该技术的吞吐量。
诸如淋巴细胞、神经细胞，肌肉细胞、干细胞等的原代细胞(9)的隔离在研究，诊断和治疗应用中至关重要。当前的工作流程包括组织消化、碎片去除和流式细胞仪。碎片去除步骤可导致活细胞的大量损失(例如，约70％-90％)，但是由于堵塞风险，基于流体的系统需要该步骤。由于本发明的技术不是基于流体技术的，因此它可以耐受组织碎片和块状细胞的存在。因为本发明的系统和方法可以直接应用于消化的样品和产生单个活细胞的那些，所以本发明大大减少了所需的样品量。
在本发明中，对于细胞工程，将特定基因或调控DNA元素插入细胞基因组中。这种插入可以诱导细胞表型的改变，即报道基因的表达和表面蛋白的展示。相反，当前的工程技术(例如基因组操作)大多是随机的或受较少控制的，从而产生了一组异质细胞。因此，以优化的表型读数隔离活的单细胞是整个工程过程的关键步骤。在当前方法中，隔离过程主要使用流式细胞仪进行。然而，这些当前方法需要相对大量(数十万个细胞)的起始材料和费力的下游操作，例如连续的稀释、培养和验证，这可能需要几个月的时间才能完成。相反，利用本发明，从有限的起始样品，例如仅几百到几千个细胞中，在短至几个小时内就可以在显微镜下隔离出所需的精确克隆，这是可行的和具有成本效益的。
对于杂种细胞选择，显示不同抗体的细胞克隆混合物通常用作单克隆隔离的起始材料。常规的细胞工程，流式细胞仪或微流体装置已被用于选择具有最强抗原亲和力的克隆。目前的做法需要相对大量(数十万个细胞)的起始材料和费力的下游操作，例如连续的稀释、培养和验证，这可能需要几个月的时间才能完成。相反，利用本发明，从有限的起始样品，例如仅几百到几千个细胞，在短至几个小时时间就可以在显微镜下隔离出所需的精确克隆，这是可行的和具有成本效益的。
噬菌体展示(10、11)的过程用于隔离特别地结合以靶向抗原的结合剂，该抗原被包被在底物(即板)、珠上或在细胞上表达。然而，这些当前的方法通常需要毫克的纯化的蛋白质(其昂贵且获得起来很繁琐)才能包被(或覆盖，coat)板或数千万个细胞以通过FACS进行处理。长期以来，研究人员一直在寻找不受抗原数量限制的理想平台。本发明使得能够选择与各种生物分子缀合的珠(beads)，以用于例如抗体发现和诊断中的样品富集的目的。
在针对癌症患者的细胞疗法中，首先必须从患者的肿瘤样品中分离出杀死肿瘤的克隆(12)。此过程涉及粗分类和高通量单细胞培养。然后通过以显微方式观察肿瘤细胞-T细胞共培养中的肿瘤细胞杀伤来识别功能性克隆的功效。利用本发明，具有直接从原始库中立即识别和选择结合并诱导肿瘤细胞形态变化的T细胞克隆的能力，将大大加快该过程。
对于循环肿瘤细胞(CTC)分离，可以使用不同的参数，例如表面标记物或细胞大小(13)。前一种技术通过用肿瘤特异性表面标记物对细胞进行染色，且然后将细胞混合物应用于基于流体的流中—在其中对每个细胞进行讯问，来隔离出循环的肿瘤细胞。然后分离并合并带有特定荧光标记物的细胞。此方法是基于大小的。将全血液或预处理过的血液样品应用到单束液体中，在那里检测每个细胞的大小并收集CTC大小的细胞。由于与几个CTC相比，仅一毫升的血液就包含109个以上的血红细胞，因此干扰的血细胞构成了装置堵塞的挑战，且需要进行样品的预处理。本发明使用快速图像获取和无流体捕获机制，这对于标准化的CTC检测、隔离和表征是理想的。
图8描绘了根据本公开的一方面的从无LCD的样品图像开始的示例性方法800的流程图。该示例性方法在初始步骤802开始。在步骤802处，如本文所教导的，可以将样品加载到光敏介质中。在下一步骤804，可以通过使用一个或多个非凝胶灯来获取一个或多个图像。在下一步骤806，如图所示，可将LCD定位在样品与一个或多个非凝胶灯之间。可以理解的是，LCD不必直接放置在样品下方或样品上方，而是可以与样品间隔开。在一些实施例中，LCD和/或光源组合可以用可以产生光学阵列图案的任何装置代替，例如投光器、OLED等。
在下一步骤808，如本文教导的图案可以显示在LCD或如本文教导的任何其他合适的装置上。一旦显示了图案，则在下一步骤810，可以使用一个或多个非凝胶灯来获取合成图像。在步骤812，如本文所教导的，可以计算一个或多个颗粒的位置。在下一步骤814，如本文所教导的，可以将凝胶图案显示或投影到LCD或任何其他合适的装置上。一旦显示了凝胶图案，则在步骤816，可以使用凝胶灯形成微水凝胶。一旦形成这些微水凝胶，就可以在后处理步骤818中洗涤或洗脱整个样品。在一个示例性实施例中，可以使用洗涤来将样品加工成固定的微凝胶中的靶。通过固定，处于非活动阶段。在另一个示例性实施例中，洗脱可用于活动相中的靶。
图9描绘了根据本公开的一方面的示例性方法900的流程图。方法900仅使用LCD样品合成图像。方法900不需要使用一个或多个非凝胶灯来获取一个或多个图像的步骤。方法900相对于先前描述的方法800的其他步骤是相似的，并且为了简洁起见将不再重复。
图10描绘了根据本公开的方面的颗粒捕获结果的示例性图像。如图所示，根据本文教导的示例性过程，针对六(6)个不同的迭代1001、1002、1003、1004、1005和1006示出了捕获前图像、捕获后图像和洗涤后图像。
尽管本文参考用于特定应用的说明性实施例描述了本公开的原理，但是应当理解，本公开不限于此。本领域普通的并且可以访问本文提供的教导的技术人员将认识到附加的修改，应用，实施例以及对等价物的替换均落入本文描述的实施例的范围内。因此，本文描述的发明不应被视为由前述描述限制。
示例
以下示例进一步描述和说明了本发明范围内的实施例。给出实施例仅出于说明的目的，而不应解释为对本发明的限制，因为在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行许多变化。
示例1–珠下方LCD像素的选择性变暗
硬件设置：显微镜，如图2A-1至2A-4所描绘LCD样品台，计算机。该系统的光学系统包括直立式显微镜。5.5英寸的TFT LCD(2560x1440分辨率)实现了图像获取和掩膜。对于原型，可进行插入和提取LCD的机械设置通过ABS印刷样品台执行，如图2B所示。图像处理以及LCD和LED控制由个人笔记本电脑执行。96孔微量滴定板的利用使得对于高通量应用可能电动化。
软件设置：图像捕获，样品LCD对齐，图案识别，颗粒拾取。图像获取、处理和颗粒操纵控制软件是使用python编程语言制作的原型。主要的挑战是要准确处理每个关注颗粒下的基础LCD贴片。为了实现这一点，为每个所关注的区域获取了几张图像。如图3A所示，将未安装LCD的图像作为传统的显微图像，以及如图3B所示，将安装有LCD的图像作为传统的显微图像。。在LCD上显示图案(如下所述)，并获取具有LCD图案的样品，如图3B中所示。最后，将显微镜聚焦在LCD上，并对LCD的图案成像，如图3C所示。由于图像获取的设置，图像可能会由于LCD面板的安装和散焦的变化而产生偏移。
为了在LCD面板上获得细胞的位置(其用于打开或关闭该细胞的所需像素)，需要计算LCD图像上每个点的索引(indices)。这些图案用于识别与LCD面板相对应的LCD图像位置，下文将对此进行描述。每个像素的位置被描述为笛卡尔系统上的点。坐标系的原点和单位向量是通过在倒数空间(reciprocal space)中找到峰值来计算的。计算每个像素的位置。LCD上曝光区域的位置由图案识别。由于与LCD面板相比，曝光区域非常小，因此使用一个图案识别位置并非易事。为了克服此限制，对于LCD上的每个8x8像素2，都会生成6x6图案。LCD面板的背景设置为所需的颜色。对于每个图案，正方形的外围均关闭，并且4x4像素的中心用于在LCD上识别该图案的行和列。在当前设置中，LCD具有2560x1440像素。有366x206个图案，其可以用17个像素索引。如图3C中所描绘的外围中具有白色像素的图案框架被用作模板，以从原始图像中找到图案，如图4A所示。在图案框架和LCD图像之间计算互相关图。如图4B所示，使用最佳对齐，从原始LCD图案中裁剪出图案，且如图4D，4E和4F所示，通过将中心4×4像素映射为二进制数来标识图案的行和列索引。
LCD贴片的绝对地址由LCD上显示的图案进行索引，这将用作计算在原始明场图像处拾取的任何颗粒的参考。为了生成用于细胞分选的动态掩膜，或者如图5B所示，通过对在下面的LCD贴片下方进行调暗来进行负诱捕(negative trapping)，或者如图5A所示，通过选择性地加亮LCD贴片来进行正诱捕(positive trapping)，以选择所关注的颗粒。为了测试图像对齐和像素捕获，我们使用了直径为30-200微米的市售珠，并证明了我们的原型系统可以对齐图像，检测颗粒并控制LCD贴片下的传输而不会出现错误。
示例2–血红细胞去除
与荧光激活细胞分选(FACS)—其是一种特殊类型的流式细胞术或微流体分离方法—相反，本发明的技术在物理上限制了气密微量滴定孔内的细胞选择和分离过程。有限的生物危害暴露使显微镜下的选择成为液体活检的理想方法。循环肿瘤细胞(CTC)分析是用于液体活检到诊断和表型化癌症以及预后治疗的强大工具。CTC的相对低的冗余使得从周围的血红细胞(RBC)分离出它们具有挑战性。即使经过诸如Ficoll、裂解之类的大量富集步骤之后，通常仍会残留大量血红细胞，并阻碍了对CTC的有效下游分析，包括：单细胞加载效率低，并在物理上阻止了稀有细胞的生长。
RBC在明场显微镜图像中显示出鲜明的颜色和形态，其可以通过图案识别算法轻松选择。我们将使用此应用程序作为概念验证实验来优化系统的各个步骤：自动细胞拾取、全孔全景合成和光子聚合。
实验设计和结果。(A)样品制备和图像获取。模仿具有不同RBC污染水平的CTC样品。我们将RBC细胞(小鼠血红细胞，
Figure BDA0002998441250000171
tib-112TM)刺入培养的Hela细胞(
Figure BDA0002998441250000172
CCL-2TM)，浓度为1：0、1：10、1：100和1：1000。3000个细胞将被装载到光学器件底部微量滴定板的单个孔中。对于每个孔，将收集10个部分重叠的明场显微镜图像，最后一个图像将用于对齐。最后一个图像上的每个图像像素都与LCD绝对坐标对齐，同时将用于LCD像素映射。(B)完整的孔图像合成和自动细胞拾取。合成覆盖整个孔的合成图像，使用最后一个图像作为参考，计算整个孔全景上的图像像素位置并将其映射到LCD坐标。从仅RBC图像中选择100个80X80的单细胞图像正方形作为机器学习算法(python sci-image模块)的训练数据集。且全景图上的所有颗粒都将被拾取并归类为RBC或“非RBC”。记录RBC的质心坐标，并计算下方最近的LCD像素，以选择性地变暗照明。为了验证样品-LCD对齐的准确性，将生成验证LCD控制图像，其中仅RBC会被照亮。(C)光曝光时间优化和生物墨水选择。固化半径和固化深度是紫外线剂量和光子引发剂浓度的函数。不同的生物墨水组分也具有不同的物理性质，包括溶解度和粘度。对于LCD，不同的光子能量(波长)也将会影响光聚合速率。在五种10W UV LED(作为5度0.1cm2的通量光束，分别为365nm、390nm、395nm、400nm和410nm波长处的光子强度峰值)照明—基于明胶-MA(Igcure和IAP)以及PEG-MA(Igcure和IAP)的情况下，对市售的生物墨水组分进行了测试。最佳的凝胶条件是产生半径为20-30微米的非扩散固化盘的那些凝胶条件。(D)HeLa细胞的细胞回收和活力。在去除RBC后，粘性边缘微量滴定板将会附连到样品板上，并通过低速离心(300rpm)将保留在活动相中的细胞旋转收集到收集板上。将收集的细胞重悬，并用台盼蓝(Trypan Blue)染色验证细胞活力，并与略过分选步骤的控制细胞进行比较。
示例3–单细胞/珠上的噬菌体展示
噬菌体展示是亲和剂开发的强大方法。与其他体外展示方法(核糖体展示、mRNA展示)相比，噬菌体展示对各种形式的抗原(珠、平板或甚至全细胞)都具有很强的鲁棒性。然而，大量淘选方法需要大量的抗原(数毫克的蛋白质或数百万个细胞)，这大大增加了其成本。我们的选择技术仅需要几个珠或细胞。因此，可以使用小规模的体外转变试剂盒或哺乳动物细胞系的瞬时表达，在室内产生所需的抗原。在该方案开始之前，我们将构建一个
Figure BDA0002998441250000181
骆驼重链文库(
Figure BDA0002998441250000182
camel heavy chain library)，并使用我们在显微镜下的管线选择，在涉及肿瘤免疫治疗的两个靶标(EGFR，TIGIT，PD1和BCMA)上对其进行筛选。包括跨膜结构域在内的四个基因将被克隆到瞬时表达载体pTT5中，并被转导至HEK293FS细胞。细胞池将被等分以存储液氮。
实验设计和预期结果。(A)文库设计。骆驼种系VH序列将与可用的纳米体序列比对。并克隆为纳米体文库的框架，如图6A所示。基于可用骆驼免疫组库序列的NGS分析，可计算出位点特异性氨基酸多样性。CDRH1和CDRH2(H27、H29、H31A、H31B、H31C、H52、H52A、H52B、，H53、H54和H56)的13个位置，CDRH3(H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100A和H100B)的8个位置被选为潜在的随机位点。(B)文库构建。为了构建文库，我们将移码结合到靶向诱变的互补决定区(CDR)中，如图6B所示，且然后将采用基于Kunkel的位点定向诱变，如图6B所示，以便用编码在Kabat数据库中所选CDR位置处自然分布的残基组的三寡核苷酸替换这些移码位点。纳米体文库将作为噬菌体gpIII外壳蛋白的遗传融合物展示在噬菌体M13的表面(1)，构建一个多样性高达1010的纯真文库。(C)珠上的噬菌体展示屏，如图6C所示。四种癌症免疫学靶标(EGFR、TIGIT、PD1和BCMA)将用作单颗粒淘选筛选的靶标，从商业供应商处购买10微克纯化的C端生物素化蛋白，并将其覆盖在链霉亲和素珠上(50-微米创意诊断(Creative Diagnostics)目录号WHM-S179和10微米WHM-S110)。
对于每个选择，在50微米的珠上的靶蛋白将掺入另外100倍的被其他三种蛋白质覆盖的10微米的珠。将2000个珠池与
Figure BDA0002998441250000183
噬菌体文库一起孵育，并在洗涤后装入我们的分选显微镜，且然后将拾取10个大颗粒，并通过胰蛋白酶洗脱来回收噬菌体。总共将进行三轮选择。(D)细胞上的噬菌体展示屏。与珠淘选并行，我们使用瞬时表达靶蛋白的单个细胞评估我们的选择系统。将靶细胞掺入100倍Hela细胞中，将200细胞池与噬菌体文库一起孵育，并加载以进行分选。由于HEK293细胞小于Hela细胞，我们将选择在显微镜下标识出的10个小细胞，并将其分选出来以进行噬菌体洗脱。(E)抗体表征。从筛选中隔离出的440个或更多个体克隆将通过噬菌体ELISA进行分析，具有背景两倍以上的ELISA信号的克隆将在大肠杆菌中表达，并通过金属亲和层析纯化。(F)抗体验证。可溶性纳米体将通过全细胞ELISA在细胞瞬时表达的靶细胞和亲代HEK293FS细胞上进一步验证。
示例4–选择杀死肿瘤的淋巴细胞
细胞相互作用是基于细胞的肿瘤杀死的第一步，如图7A所示，然而，由于通常的做法是从非免疫细胞的大量去除开始，所以细胞相互作用信息尚未用于当前的过程。作为概念的证明，我们将把我们的细胞选择方法应用于可商购获得的CART测定控制中，且然后利用调整后的过程从癌标记结合剂中获得杀死肿瘤的克隆，如图7B所示。
选择靶。可商购获得的CART–肿瘤细胞系统(来自(ProMab，目录号PM-CAR1021-10M)的EGFRscFv-CD28-CD3ζCAR-T细胞，以及来自
Figure BDA0002998441250000191
EGFR遗传改变细胞小组(TCP-1027TM)的EGFR肿瘤系)将被选中以通过选择载片来评估富集水平。
实验设计和结果。(A)使用商用CART系统进行CAR-T细胞富集。两种具有不同EGFR表达状态的肿瘤细胞系将用作靶细胞：1)HCC827细胞，其包含高EGFR拷贝数扩增；2)NCI-H460细胞，其包含零EGFR拷贝数扩增。将按照推荐的方案培养HCC827和NCI-H460细胞系。将使用
Figure BDA0002998441250000192
(Corning目录号25-058-CI)收获所有细胞。使用KILR逆转录颗粒对贴壁细胞(DiscoverX目录号97-003)进行转导。CAR-T细胞将从ProMab Biotechnologies购买。这项研究利用了EGFRscFv-CD28-CD3ζCAR-T细胞，该细胞经过改造后可靶向具有单链可变片段(scFv)的EGFR，并包含CD3ζ抗原识别结构域和CD28共刺激结构域。用空载体转导模拟的ScFV控制CAR-T细胞(ProMab目录号PM-CAR1000-1M)。两个ScFV CART单元与模拟ScFvCART单元以1:10的比例混合。T细胞的混合物与肿瘤细胞以1：1的比例进一步混合。将3000个细胞在96孔板中培养4天，然后选择10、20、40、50个与肿瘤细胞粘附的T细胞，并从多个孔中洗脱。提取细胞RNA并进行反向翻译，并使用靶向scFc区域的引物进行NGS测序。通过比较同源ScFv相对于模拟ScFv载体的前mRNA比率和后mRNA比率，定量靶scFv-CART的富集。(B)CAR-T克隆的发现筛选。通过克隆，通过体外展示方法从外部富集的EGFR scFv集合重新格式化为CAR-T-慢病毒载体，并且生成CART细胞库，与HCC827和NCI-H460细胞系共培养，并使用我们的显微镜管线下的选择技术进行分选。扩增100个可行的CART克隆并针对肿瘤细胞的细胞毒性进行验证。
示例5–由于细胞活动而选择具有特定形态的细胞
使用本发明可以分析和隔离针对不同功能或发育活性将经历形态变化的细胞。该方法可用于基于细胞器易位、染色质形态、吞噬作用、突触形成和蛋白质共定位来选择和隔离细胞。
示例6–选择覆盖有DNA的珠
DNA覆盖的珠已广泛用于杂交实验。该方法可用于隔离带有特定DNA序列的实体。
示例7–选择杂交瘤克隆
该方法可用于当被与染料偶联的靶抗原覆盖时选择特定的杂交瘤克隆。
示例8–选择微滴
诸如油包水乳状液之类的微滴是用于封装细胞和其他用于高通量多重分析的材料的常用微环境。即使液滴是液体，也可以形成水凝胶壳以捕获整个液滴。因此，该方法可用于在乳液环境中选择所关注的液滴，其中细胞、珠和蛋白质可被捕获在微观液滴中，且然后液滴可被使用本发明的系统和方法生产的固化水凝胶的壳捕获。
参考：
上面引用了与以下编号相对应的以下参考文献。
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引用结合
出于所有目的，通过引用将每个专利文件的全部公开内容，包括更正证书，专利申请文件，科学文献，政府报告，网站和本文引用的其他参考文件的全部内容通过引用合并于此。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
等同物和范围
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等同物。本发明的范围不旨在限于以上描述。
在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。前述实施例在所有方面都应被认为是说明性的，而不是对本文所述发明的限制。在本发明的方法和系统的各种实施例中—其中相对于所述方法的步骤或组合物的组分使用术语“包含”，还构想到，所述方法和组合物基本上包括所述步骤或组分，或者由所述步骤或组分组成。此外，将理解的是，只要本发明保持可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序就无关紧要。而且，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
在说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在有冲突的情况下，以本说明书为准。
此外，应当认识到，在某些情况下，组合物可以描述为在混合之前由各组分组成，因为在混合后，某些组分可以进一步反应或转化成另外的材料。
除非另有说明，否则本文中使用的所有百分比和比率均以重量计。

Claims (34)

1.一种用于在可光固化的聚合物介质中从制备的样品中分离颗粒的系统，包括：
(a)透光样品板，具有一个或多个用于容纳所述样品的容器，
(b)一个或多个光源，用于照亮和/或固化所述样品，
(c)液晶显示器(LCD)，用于选择性地控制光向所述样品的透射，
(d)用于使所述样品板和LCD相对于彼此对齐的装置，
(e)用于通过显微镜观察所述样品的装置，
(f)用于捕获从(e)的所述显微镜装置获得的图像的装置，以及
(g)用于控制所述系统的微处理器和软件。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述透光样品板(a)是96孔板。
3.根据权利要求1所述的系统，其中，所述LCD包括像素的矩形阵列。
4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述LCD阵列的每个像素包括两个或更多个子像素。
5.根据权利要求3所述的系统，其中，所述LCD阵列的每个像素包括绿光发射子像素、红光发射子像素和蓝光发射子像素。
6.根据权利要求5所述的系统，其中，每个像素的尺寸为约60μm×约60μm，并且每个子像素的尺寸为约20μm×约60μm。
7.根据权利要求3所述的系统，其中，所述像素的矩形阵列包括从约500至约10000乘以约500至约10000的矩形阵列。
8.根据权利要求7所述的系统，其中，所述像素的矩形阵列包括从约1500×约2400起的矩形阵列。
9.根据权利要求1所述的系统，其中，所述一个或多个光源选自发光二极管(LED)光源、激光器、白炽灯、荧光灯、紫外灯、卤素灯和氙气灯。
10.根据权利要求9所述的系统，其中，所述LED光源发射白光。
11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述LED光源发射具有从约390nm到约700nm的波长的白光。
12.根据权利要求9所述的系统，其中，所述LED光源发射具有从约390nm到约490nm的波长的蓝/紫光。
13.根据权利要求9所述的系统，其中，所述LED光源发射具有从约520nm到约560nm的波长的绿光。
14.根据权利要求9所述的系统，其中，辅助LED光源发射具有从约635nm到约700nm的波长的红光。
15.根据权利要求9所述的系统，其中，辅助LED光源发射具有从约290nm到约390nm的波长的紫外光。
16.根据权利要求1所述的系统，其中，所述LCD被定向在所述样品板和所述一个或多个光源之间，用于照亮和/或固化所述样品。
17.根据权利要求15所述的系统，其中，所述LCD位于所述样品板下方，并且用于照明和/或固化所述样品的所述一个或多个光源位于所述LCD下方。
18.根据权利要求1所述的系统，其中，所述用于通过显微镜观察样品的装置位于所述样品板上方。
19.根据权利要求1所述的系统，还包括：(h)用于从所述样品中去除分离的颗粒的装置。
20.根据权利要求19所述的系统，其中，用于从样品中去除分离的颗粒的所述装置(h)选自移液、洗涤、漂洗、抽吸。
21.根据权利要求1所述的系统，其中，所述样品是生物样品。
22.根据权利要求21所述的系统，其中，所述颗粒选自细胞、生物颗粒、珠、细胞外材料和液滴。
23.根据权利要求22所述的系统，其中，所述细胞选自循环肿瘤细胞(CTC)、血细胞、细菌、原代细胞、转化细胞、病原细胞和稀有免疫细胞。
24.根据权利要求1所述的系统，其中，所述可光固化的聚合物介质选自光反应性聚合物，所述光反应性聚合物在暴露于具有约290至约400nm的波长的光源时表现出粘度的增加。
25.根据权利要求24所述的系统，其中所述可光固化的聚合物介质选自诸如以下项的光引发剂组成的组:明胶衍生物、聚乙二醇衍生物、藻酸盐及其衍生物、胶原蛋白及其衍生物、
Figure FDA0002998441240000031
及其衍生物，以及它们的混合物。
26.一种用于在可光固化的聚合物介质中从制备的样品中分离颗粒的系统，包括：
(a)透光样品板，具有一个或多个用于容纳所述样品的容器，
(b)光源组合，用于产生光学阵列图案，
(c)用于使所述样品板和所述LCD相对于彼此对齐的装置，
(d)用于通过显微镜观察所述样品的装置，
(e)用于捕获从(d)的显微镜装置获得的图像的装置，和
(f)用于控制所述系统的微处理器和软件。
27.根据权利要求26所述的系统，其中用于产生光学阵列图案的所述光源组合选自投光器或有机发光二极管(OLED)。
28.一种用于从在可光固化的聚合物载体中制备的样品中分离颗粒的方法，包括利用权利要求1或19的系统来实现所述分离。
29.一种利用权利要求1的系统在可光固化的聚合物介质中从制备的样品中分离颗粒的方法，包括以下步骤：
(a)将制备的样品分配到透光样品板的容器中，
(b)在所述样品和光源之间没有LCD的情况下获得所述样品的显微图像，
(c)在将LCD取向在所述样品和光源之间的情况下获得所述样品的显微图像，
(d)使用微处理器和软件分析和对齐从(b)和(d)获得的图像，以获得合成图像来定位和标识样品中的颗粒，以及
(f)使用来自(d)的结果来指示微处理器和软件在所需位置处选择性地将聚合物固化波长的光传输或不传输到可固化聚合物介质，以提供所述聚合物介质的一系列固化区域和未固化区域，以选择性地固定或不固定所关注的颗粒。
30.一种利用权利要求19的系统在可光固化的聚合物介质中从制备的样品中分离颗粒的方法，包括以下步骤：
(a)将制备好的样品分配到透光样品板的容器中，
(b)在所述样品和光源之间没有LCD的情况下获得所述样品的显微图像，
(c)在将LCD取向在所述样品和光源之间的情况下获得所述样品的显微图像，
(d)使用微处理器和软件分析和对齐从(b)和(d)获得的图像，以获得合成图像来定位和标识所述样品中的颗粒，
(f)使用来自(d)的结果来指示微处理器和软件在所需位置处选择性地将光的聚合物固化波长传输或不传输到可固化聚合物介质，以提供所述聚合物介质的一系列固化区域和未固化区域，以选择性地固定或不固定所关注的颗粒；以及
(g)使用用于去除分离的颗粒的装置来收集所述颗粒。
31.一种从制备的样品中分离颗粒的方法，包括以下步骤：
(a)将所述样品加载到光敏介质中；
(b)使用一个或多个非凝胶灯获取一个或多个图像；
(c)在所述样品和所述一个或多个非凝胶灯之间定位显示装置；
(d)在所述显示装置上显示图案；
(e)使用所述一个或多个非凝胶灯获取合成图像；
(f)计算所述样品中一个或多个颗粒的位置；
(g)在所述显示装置上显示凝胶图案；
(h)使用凝胶灯形成至少一种微水凝胶；和
(i)通过洗涤或洗脱来处理所述样品。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述显示装置是LCD。
33.一种从制备的样品中分离颗粒的方法，包括以下步骤：
(a)将样品加载到光敏介质中；
(b)在所述样品和一个或多个非凝胶灯之间定位显示装置；
(c)在所述显示装置上显示图案；
(d)使用所述一个或多个非凝胶灯获取合成图像；
(e)计算所述样品中一个或多个颗粒的位置；
(f)在所述显示装置上显示凝胶图案；
(g)使用凝胶灯形成至少一种微水凝胶；和
(h)通过洗涤或洗脱来处理样品。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述显示装置是LCD。
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