CN112930492A - 用于使用时间复用光片的快速体积荧光显微术的装置和方法 - Google Patents

用于使用时间复用光片的快速体积荧光显微术的装置和方法 Download PDF

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Abstract

一种显微设备，包括连续或脉冲波激光光源；一对平行镜，被配置为从光源接收光并反射非相干光片阵列；光束编码器（例如，频率调制分划板、哈达玛基、随机调制图案），以分割非相干光片阵列，并在互易空间中用相应的频率对每个光片进行编码；透镜，被配置为将编码的光片引导向生物样本；和图像捕获设备，被配置为从生物样本接收荧光信号。

Description

用于使用时间复用光片的快速体积荧光显微术的装置和方法
背景技术
许多年来，生物成像已经用于对生理相关系统进行成像。
理解三维（3D）中复杂生物系统的生命过程的巨大挑战在于缺乏使得能够以足够高的时空分辨率并且以低水平光损伤监测动力学的成像模态。已建立的3D生物成像技术——即共焦和多光子显微术以及光片荧光显微术（LSFM）是一种如下的生物成像技术：其通过解耦照射和检测光路来操作；并且使用不同的照射技术来优化系统的光子收集效率。然而，这些基于光的成像系统可能在生物样本中引起光损伤并且引发光毒性。这些基于光的成像系统主要依赖于激光扫描，这通常损害成像速度，因为整个3D视场（FOV）必须通过涉及振镜扫描仪或大体积成像透镜的机械运动来顺序扫描。虽然已经开发了各种各样的技术来缩放扫描速度，但是它们不可避免地需要更高的系统复杂性，包括专用的光束扫描控制和硬件同步。实际上，基于激光扫描的成像固有地是功率低效的，因为空间占空比总是远小于一单位（即，在一个体积帧时间内仅读出整个体积的一部分）。更糟糕的是，许多扫描方法反复激发离焦荧光，并且因此加速光漂白和光损伤。
常规的基于光的生物成像系统通过扫描生物样本或者同步扫描光片和检测物镜两者来使用单个光片执行三维（3D）体积成像。因此，成像速度受到扫描速度限制，这可能引起系统中的共振振荡。该振荡可能引起系统在扫描过程期间不稳定。
常规的点阵光片显微技术通过从相关的图像对比度推断信息来检测生物细胞的功能和结构信息。这些技术也强调空间分辨率，但缺乏时间分辨率，并且依赖于扫描样本台；或者照射光束和检测物镜两者。这些技术具有相当低的体积帧速率，并且受到扫描引起的台漂移的负面影响。
为了应对这些挑战，平行化照射（检测）的概念——即，所有体素同时被激发（记录）——已经成为高级3D成像中的主要追求。除了成像速度方面的改进，照射（检测）中的平行化允许最大化空间占空比，并且因此最大化光子预算。这对保留生物样品生存能力特别关键。然而，目前的平行化方法迄今要么限于2D（例如，LSFM）要么限于3D中的稀疏采样（参照多焦点或多光片显微术）。值得注意的是，可用的多光片成像系统很大程度上依赖于光束干涉、相干波前工程（在空间或傅立叶域中）或分束。然而，为了避免由相干光束和高度散射的组织（例如，散斑噪声）之间的相互影响引起的照射伪像，这些方法通常以稀疏采样模式运行，具有有限数量的光片，并且仍然需要顺序光束扫描（或抖动）来实现光片的时间平均非相干叠加。
另一种新兴技术是光场显微术，其中可以通过微透镜阵列经由2D相机上的结构维度来区分轴向信息。最终的3D图像是利用求解逆问题的算法进行计算上的重建的，这导致了横向分辨率降低和图像计算复杂性高的限制。
选择性平面照射显微术（SPIM）系统产生具有高达几毫米特征大小的样本的多维图像。SPIM使用光片照射和正交检测系统，以使用阵列检测器达成快速平行检测。这些系统可以对包括马达卡胚胎和果蝇胚胎发生在内的生物体进行成像。这些系统具有许多衍生产品，包括多视角和等视角荧光体积成像系统。然而，这些SPIM系统都用具有多个自由度的多个光束扫描样本。这引起成像速度更快降级。附加地，数据处理可能花费长达24小时来重建单个体积多视角图像。
数字扫描光片显微术经由沿一维扫描聚焦光束产生拉长的照射点扩散函数。该技术产生暂时共享的一维（1D）点扩散函数，并且避免连续照射样本，但需要更高的激光功率来产生相同水平的荧光计数。此外，需要扫描样本台以捕获体积帧，因此体积帧速率是低的。结果，固有的台漂移将引起图像质量的恶化。
发明内容
在本发明的一个实施例中，本文描述的体积荧光显微技术或编码光片阵列显微术（CLAM）使能实现平行化光片照射和检测。该技术基于非相干和频率编码的光片阵列的可重新配置生成。CLAM使能实现以＞10 Hz的视频体积速率同时捕获所有光学切片图像平面；并且没有机械扫描或主动光束操纵。与常规的显微技术（例如，共焦荧光显微术）相比，该3D平行化特征允许更长的像素停留时间和更柔和的曝光。
成像技术使用一对高度反射镜来将光束改变成一系列平行且相互非相干的光片，并且然后将光片引导向生物样本。来自生物样本的荧光信号由已经用相应的频率进行了时间调制的光片激发。阵列检测器可以记录时间调制片，并且记录的信号稍后可以离线解复用，以分析来自样本的3D信号信息。
该系统在不进行扫描的情况下获取体积图像，这使得它对于机械和环境振动更具抵抗性。两个特征使得非扫描体积成像成为可能。首先，一对高度反射镜，其在镜之间多次反射光源光，并且然后回射非相干光片。这些反射的非相干光片可以视为从一系列虚拟光源散发的。生物样本可以被体积光片照射。第二，每个非相干光片由变频斩波器暂时分割，并用相应的频率调制。样本的不同平面可以对应于不同的调制频率。生物样本的体积图像（例如，组织中的血管、植物细胞、斑马鱼胚胎等）可以由时间解复用设备进行分析，该时间解复用设备将来自样本不同深度的图像组合成单个图像。
在本发明的另一个实施例中，本文描述的方法利用了完全平行化的多平面荧光成像、压印编码的光片阵列显微术（CLAM）。它不依赖于广泛采用的相干多光片生成概念，并且因此绕过了对精确相位控制和机械光束扫描/抖动方面复杂的需求。取而代之的是，CLAM通过利用基于角度未对准的镜对的“无限远镜”的概念来生成在阵列密度和相干性方面均可重新配置的光片阵列，从而实现3D平行化照射。这保证了密集的光线阵列的非相干叠加，而没有光束抖动——从而有利于具有最小的照射伪像和散斑噪声的深度和散射的组织成像。
关于平行化3D图像检测，CLAM实现了荧光信号的复用图像平面编码。它在没有任何扫描机制的情况下确保光学切片，并且因此允许快速的体积帧速率。检测中的100%空间占空比也暗示着更长的体素停留时间。换句话说，CLAM需要强度较低的照射，并且因此在不牺牲信噪比（SNR）的情况下，进一步减少了光损伤和光漂白。CLAM的概念可以在最小的硬件或软件修改（不需要复杂的迭代图像重建算法）的情况下容易地与任何现有的LSFM系统适配。
CLAM可以特别适用于活细胞、组织和生物体的长期动态体积成像，以及存档生物样本的3D组织病理学研究的高通量体积可视化——两者都有助于宽范围的生物研究，特别是神经科学和发育生物学中。值得注意的是，该技术还可以用于工业应用中的高体积制造检查，以进行高通量体积质量控制，诸如超大规模集成（VLSI）半导体器件。
与现有的光片成像技术形成对比，本发明绕过了使用机械扫描光学器件以便以3D照射样品，并且因此提供了更高和更长期的成像稳定性。平行化光片阵列照射也允许通过激活光片的任何子集进行任意的选择性平面成像。本发明通过对来自所有成像平面的荧光信号进行复用编码来实现3D平行化检测。它是通过用一组预定义码对光片阵列进行光学调制来实现的，每个预定义码独特地表示每个图像平面。本发明确保没有任何扫描机制的光学切片，并因此允许快速的体积帧速率，其仅受相机帧速率限制。本发明最大化检测中的空间占空比，并且因此导致更长的体素停留时间。换句话说，与可用的激光扫描共焦显微术和LSFM相比，CLAM需要强度较低的照射，并且因此在不牺牲信噪比（SNR）的情况下进一步减少了光损伤和光漂白。本发明可以用波前编码/成形来实现，以便在轴向和横向维度二者上增加FOV。CLAM还可以沿轴方向执行数字结构化照射——从而改进分辨率的各向同性。
附图说明
图1A是编码光片体积成像设备的实施例的框图。
图1B是编码光片体积成像设备的实施例的框图。
图2A是CLAM设置的实施例的示意图。
图2B是CLAM设置的实施例的示意图。
图2C是光片阵列（N=10、20、30和40）的测量横向曲线（沿x-z和y-z平面）。每种情况下对应的强度线扫描曲线以蓝色示出。
图2D示出了使用另一个激光源（中心波长710 nm；L c ~0.5 mm），具有镜面间距为S~20 mm）在CLAM中对光片阵列生成的实验评估。
图2E示出了由（顶部）非相干CLAM光束（N=40）和（底部）相干宽场照射取得的散射凝胶样本的图像。
图3示出了光平面照射阵列的3D复用的实现的图解。
图3A示出了基于频分复用（FDM）编码的CLAM图像重建的例示工作流程。
图3B是频率-至-深度图，其示出了编码频率和深度（N=40）之间的线性关系。在个体光片（频率通道）之间观察到最小的串扰（左上角插图）。（下插图）旋转分划板的示意图（即，光片编码器）和投射的虚拟光源（绿点）。比例尺表示50
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
。
图4示出了用于快速体积成像设备的图像和步骤。图4（a）示出了快速体积成像设备图像点扩散函数（psf）的模拟的图像。图像示出了不同的轴向深度，Zp。图4（b）是使用频率解复用的快速体积成像设备图像形成的步骤图解。
图5示出了在不同照射深度下包埋在2%琼脂糖凝胶中的荧光微球的体积图像。图5（a）是在照射深度30
Figure DEST_PATH_IMAGE002AA
下包埋在2%琼脂糖凝胶中的荧光微球的体积图像。图5（b）是在照射深度100
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAA
下包埋在2%琼脂糖凝胶中的荧光微球的体积图像。图5（c）是在照射深度300 um下包埋在2%琼脂糖凝胶中的荧光微球的体积图像。
图6是图示了通过数字结构照射对轴向分辨率的改进的图解。
图7示出了荧光聚合物珠在不同时间的体积图像。图7（a）示出了在80 ms微流体流带来的荧光聚合物珠的体积图像。图7（b）示出了在680 ms荧光聚合物珠的体积图像。图7（c）示出了在1.36 s荧光聚合物珠的体积图像。图7（d）示出了在1.92 s荧光聚合物珠的体积图像。
图8示出了不同血管网的体积图像。图8（a）是小鼠肠道中血管网结构的体积图像。图8（b）示出了在光学透明的小鼠肾组织中附着到血管网的肾小球。
图9示出了CLAM的单物镜配置。同一物镜生成倾斜的光片阵列照射并收集荧光信号。
图10示出了本发明的实现，其具有波前编码/成形，以便在轴向和横向维度二者上操纵FOV。
图11示出了使用空间光调制器（SML）以便扩展FOV的“光片阵列平铺”。（左）设置示意图。位于图像位置的傅立叶平面的SML在面对镜对之后的光束上施加二元透镜相位图。（右）在SML上应用具有（底部）和不具有（顶部）透镜相位的光片阵列曲线。比例尺：50
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAA
。
图12示出了CLAM的系统布局。M镜子，f焦距，L透镜，PBS-偏振分束器，
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
半波板，
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
四分之一波板，（CL1和CL2）柱面透镜，（T1，T2和T3）望远镜。（O1和O2）物镜，LP长通滤波器。圆圈中的双箭头（点）示出水平（垂直）偏振。标记有红色星号的位置是虚拟光源的共轭平面。
图13示出了图像重建的实施例。
图14示出了包埋在强散射琼脂糖凝胶中的荧光微珠的体积CLAM成像。
图15示出了在微管中以13.2 vol/s（体积：170×25×28
Figure DEST_PATH_IMAGE008
）的体积帧速率流动的微粒的CLAM成像。
图16示出了CLAM对光学清楚的小鼠组织的体积成像。
具体实施方式
呈现以下公开内容和示例性实施例，以使得本领域普通技术人员能够制造和使用根据本发明的快速体积成像设备。对实施例的各种修改对于本领域技术人员来说将容易清楚，并且本文的一般原理可以应用于其他实施例。因此，与快速体积成像设备相关的设备和方法不旨在限于所示的实施例，而是要符合与本文描述的原理和特征一致的最宽范围。
图1A示出了编码光片阵列体积成像系统100的实施例的框图。光源110可以是连续波激光器或脉冲波激光器。由光源110产生的光束可以是功率控制的，并且扩束器120可以将光束扩展或缩减到适当的大小。准直光束然后可以由柱面透镜（未示出）沿着水平方向聚焦到未对准的一对镜130中。然后，光束可以在镜对130之间被多次反射，并且然后光片可以被回射到输入端口（未示出），在输入端口（未示出），四分之一波板和偏振分束器将回射片耦合到下游光学器件。来自镜对130的回射片可以被视为源自一系列虚拟光源。光片可以由中继光学器件140向编码器150透射。编码器150包括但不限于：频率调制器，该频率调制器分割非相干光片阵列并用相应的频率编码每个光片；或者时间调制器，该时间调制器通过包括哈达玛基或随机掩模的任意正交编码基分割非相干光片阵列。在一个实施例中，频率调制器包括但不限于：光束编码器，其以移动或旋转空间光调制器（例如，频率调制分划板）的形式；或者由扫描光束进行的静态空间图案化掩模照射。光片可以由编码器150切片，并以各种频率或根本基础进行编码。编码片然后可以通过中继光学器件140透射，并由照射物镜160聚焦到生物或非生物样本170上。检测物镜180与照射物镜（未示出）正交放置。然后，检测物镜180中的管透镜可以将来自样本170的荧光信号传输到高速相机（包括但不限于2D图像传感器或相机190，诸如 sCMOS相机或 EMCCD相机）。
平行化的离散光片阵列照射还提供了另一个自由度来任意选择光片的任何子集。可以通过在中继光学器件140中包括的预定义掩模（例如，扫描光束进行的静态空间图案化掩模照射或使用空间光调制器的主动可控掩模）实现该用户定义的选择性平面照射。
图1B是编码光片体积成像设备的另一个实施例的框图。CLAM是一种体积成像技术，它在没有任何机械扫描的情况下允许完全平行化的3D成像。首先，它通过利用基于角度未对准的镜对的“无限远镜”的概念来生成在阵列密度和相干性方面均可重新配置的光片阵列，从而实现3D平行化照射。关于平行化的3D图像检测，CLAM实现了复用的图像平面编码（通过使用光片编码器），其在没有任何扫描机制的情况下确保光学切片，并且因此允许快速的体积帧速率。
发明人利用该独特的属性，其使用几乎平行的镜对将脉冲激光束变换成超快线扫描光束，以生成脉冲或连续波（CW）光片阵列，其中可以通过调谐镜对几何形状（例如，镜间距S、镜长度L和未对准角度
Figure 678127DEST_PATH_IMAGE009
）来灵活地重新配置光片的密度和相干性，如图2B中所示。
如图1B中所示，输入光首先通过空间光束成形器121，其可以是任何类型的（一个或多个）衍射光学部件（例如，衍射光栅、空间光调制器）或微透镜阵列，或任何类型的（一个或多个）光束发散元件、诸如透镜，尽管实施例不限于此。输入可以是例如直接从光源111自由空间输出或者从诸如光纤的光导耦合，尽管实施例不限于此。在空间光束成形器之后的成形光束是通过光束会聚光学器件122以锥角（
Figure DEST_PATH_IMAGE010
）线聚焦的（即，在一维上会聚）并在入口O进入一对几乎平行的高反射率镜131。然后光束被分成N个小光束的集合（
Figure 595268DEST_PATH_IMAGE011
），其中每个小光束在两个镜之间遵循独特的空间线性调频之字形路径。基于射线跟踪，这N个离散的光路——称为基本模式——沿着等同的路径被回射到入口O（例如，图2B中框b中的红色路径220）。另一方面，光路偏离任何基本射线（例如，图2B中的框b中的蓝色路径230）仍然可以被路由返回，但是在入口O处与基本射线有微小的横向偏移。实际上，对于第k个返回的基本射线，有一个伴随的“光扇”，就好像它是从位于O k 处的具有非常低数值孔径（<< 0.1）的虚拟光源出现的（图2B中的框b）。结果，入射聚焦光锥内进入镜对的所有传入射线都被回射，从而变换成N个离散小光束的阵列，类似于从N个虚拟光源的阵列出现的射线（图2B中的框b）。仅有的光学损失归因于镜反射率，其高达> 99%。
可以由中继光学器件140朝向光片编码器150生成光片。编码器150包括但不限于：频率调制器，该频率调制器分割非相干光片阵列并用相应的频率编码每个光片；或者时间调制器，该时间调制器通过包括哈达玛基或随机掩模的任意正交编码基分割非相干光片阵列。在一个实施例中，频率调制器包括但不限于：光束编码器，其以移动或旋转空间光调制器（例如，频率调制分划板）的形式；或者由扫描光束进行的静态空间图案化掩模照射。光片可以由光片编码器150切片，并以各种频率或根本基础进行编码。编码片然后可以通过中继光学器件140透射，中继光学器件140可以将光片子集路由和选择到成像的样本。各片可以进一步通过波前成形模块145透射，波前成形模块145在分辨率和成像视场方面增强成像性能。然后，照射物镜160将光片聚焦到生物或非生物样本170上。检测物镜180与照射物镜（未示出）正交放置。检测到的光可以由点扩散函数（PSF）工程模块185修改，其可以增强成像景深。然后，检测物镜180中的管透镜可以将来自样本170的荧光信号传输到高速2D图像传感器或相机190（包括但不限于，sCMOS相机或EMCCD相机）。
图2A是图示在本发明的一个实施例中体积光显微术如何工作的图解。在图2A中，（a）是编码光片体积成像设备的图解；（b）是公共焦平面（CFP）附近光束的图像；（c）是该设备的光学透镜的俯视图的图解；以及（d）是该设备的光学透镜的侧视图的图解。
准直光束由柱面透镜CL沿水平方向聚焦以形成1D光锥。光锥在被未对准的平行镜对210分开之前，穿过偏振分束器PBS和四分之一波板
Figure DEST_PATH_IMAGE006AA
。回射光束穿过四分之一波板
Figure DEST_PATH_IMAGE006AAA
，并变为垂直偏振。透镜L进一步聚焦调制光束，并在公共焦平面CFP附近创建线性虚拟光源阵列。
所得光束由定制设计的光片编码器150切片，使得这些光束中的每一个用每个虚拟光源的相应调制频率或根本基础进行编码。光片编码器150包括但不限于：频率调制器，该频率调制器分割非相干光片阵列并用相应的频率编码每个光片；或者时间调制器，该时间调制器通过包括哈达玛基或随机掩模的任意正交编码基分割非相干光片阵列。在一个实施例中，频率调制器包括但不限于：光束编码器，其以移动或旋转空间光调制器（例如，频率调制分划板）的形式；或者由扫描光束进行的静态空间图案化掩模照射。频率调制光束然后由显微术系统和柱面透镜CL中继（例如，见图2（c）和2（d））。每个虚拟光源在生物样本的平面上形成平面照射光片。检测显微术物镜与照射物镜正交地安装，并且因此与每个照射光片正交地安装。因此，生物样本的每个照射区域可以由快速阵列检测器同时检测。
一般而言，检测和照射路径可以共享同一物镜，并且激发光片可以以一角度进入物镜，使得发射路径仍然可以与照射光片正交。该双物镜配置与快速体积成像设备的工作原理兼容。该配置还将激发路径与检测路径解耦，从而为操纵图像质量提供附加的自由度。
图2B是图示在本发明的另一个实施例中体积光显微术如何工作的图解。框a示出了CLAM设置的总体示意图。框b示出了虚拟光源生成（O k ）：在角度未对准的镜对之间反弹的第k个小光束内，所有光射线经受2k次反射，其中在入口O之后具有稍微不同的轨迹（例如，红色对比蓝色射线。实心蓝线：正向路径；虚线：反向路径）。框c示出了提供平行化照射的编码光片阵列。来自沿z方向不同深度的荧光信号用光片编码器生成的独特时间码标注。
虚拟光源通过中继透镜模块投射以形成N个光片的阵列（图2B中的框a、c）。这使能实现了平行化3D照射，其移除了对光束或物镜扫描的需要，从而绕过了专用同步。发明人注意到，由镜对支撑的光片（虚拟光源）的数量N可以通过镜几何形状（例如，S，
Figure DEST_PATH_IMAGE012
，L）灵活调整，如图2C中所见。根据成像规格（例如，分辨率、FOV以及光子预算）选择光片数量，具体来说，在实验中N被选择为超过100个光片。为了确保强度均匀性，选择M个最高阶基本模式（M<<N）作为CLAM照射。
图2C示出了光片阵列（N=10、20、30和40）的测量横向曲线（沿x-z和y-z平面）。每种情况下对应强度线扫描曲线以蓝色示出。
平行化的离散光片阵列照射还提供了另一个自由度来任意选择光片的任何子集。可以通过预定义掩模（例如，扫描光束进行的静态空间图案化掩模照射或使用空间光调制器的主动可控掩模）实现该用户定义的选择性平面照射。这在大脑成像应用中的神经元活动记录的稀疏采样中可能是特别感兴趣的。
此外，可以灵活地调整光片间的相干程度。虽然每个光片本身保持相干，但是阵列中的光片之间的非相干性可以通过以这样的方式调谐镜间距（S）来实现：虚拟光源之间的路径长度差（D）（即，D=2S）比激光源L c 的相干长度长。发明人先前的工作已经展示出，相邻虚拟光源之间的路径长度间距（时间延迟）可以跨几个数量级——即，毫米（皮秒）到米（纳秒）——而重新配置。这样的可控非相干性尤其是在散射介质中使图像伪像和散斑生成最小化。
图2D示出了使用另一个激光源（中心波长710 nm；L c ~0.5 mm），具有镜面间距为S~20 mm）在CLAM中对光片阵列生成的实验评估。（a）在物镜O1之后沿着传播轴（x轴）的不同位置处的光片阵列曲线。（b）当未对准的镜角度减小时（从左到右），光片阵列曲线中的改变。底部面板示出了（a）和（b）中指示的强度线曲线（黄线）。对于（a）和（b），比例尺表示100
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAA
。
在一个实施例中，采用激光源（中心波长710 nm；L c ~0.5 mm）和S~20 mm的镜对间距。该配置跨整个光片阵列之上展示出均匀的强度分布，如图2D的（a）中所见。个体光片的厚度一般保留在照射物镜定义的瑞利范围内，如图2D的（a）中所见。更重要的是，可以通过调整镜未对准角度来重新配置光片阵列密度，如图2D的（b）中所见。注意到，当光片的密度如此高以至于个体光片不可区分时，光片的非相干叠加清楚地显示为平滑的照射曲线（见图2D中（b）的最右侧曲线）。这与虚拟光源间距（S~20 mm）大于光源的测量相干长度（从激光光谱测量的L c ~0.5 mm）的事实是一致的。
在另一个实施例中，在配置中进一步验证了非相干性（L c ~4.2 mm，并且S~50 mm），其示出了通过散射凝胶介质的无散斑光片阵列照射分布。这与从单个相干高斯激光束扩展到同一区域的宽场相干照射的情况形成鲜明对比，从而导致如图2E中所示的高度散斑图案。
与常规的LSFM设备形成对比，快速体积成像设备消除了对光束、物镜、样品扫描的需要，并减少了样本/系统上的物理应变。图5示出了由1
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAA
直径的聚苯乙烯球制成的组织模拟体模的体积图像，聚苯乙烯球涂覆有尼罗红荧光团并且包埋在具有TiO2 纳米粒子的2%琼脂糖凝胶中。TiO2 纳米粒子具有1.2 mg/ml 的浓度，以模拟人类乳房组织的散射效果。图5（a）示出了当照射光束设置为30
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAA
的穿透深度时的体积图像。图5（b）示出了当照射光束设置为100
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAA
的穿透深度时的体积图像。图5（c）示出了当照射光束设置为300
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAA
的穿透深度时的体积图像。快速体积成像设备可以在大到200
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAA
的穿透深度处对荧光珠成像。如图5（c）所示，荧光珠在300
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAA
的穿透深度处可见，但在信噪比方面有所减小。
快速体积成像设备实现一对高度反射镜（R>99%）来创建相互非相干的虚拟光源，其中每个虚拟光源产生一个光片。光片的所产生光束彼此相互非相干。相互非相干性使得对微小结构成像成为可能，即使当结构被包埋在引发强散射效应的组织中时亦如此；并且光束之间具有最小的串扰。两个反射镜将光束分成一系列虚拟光源，然后该虚拟光源被转换成光片阵列。与常规的光片显微设备形成对比，该设备不需要扫描光学器件以便以3D照射生物样本，并且因此该设备提供了更高和更长期的机械稳定性。
快速体积成像设备对每个光片进行时间调制，以用相应的频率对每个光片进行编码。一系列中继光学器件用于使光片与提供一系列调制频率的定制调制掩模共轭。该过程用相应的调制频率对每个光片进行编码。
来自生物样本的荧光信号可以离线解复用。荧光信号可以通过时间复用、频率复用方案、随机基或哈达玛变换方案灵活地操纵，以使能实现高速图像采集。该特征通过时间调制被独特地利用，这在现有的商用频率斩波器系统中是没有发现的。
快速体积成像设备的另一个特征是基于FDM或CDM的3D复用，如图3中所示。一般而言，跨3D堆叠（z方向）上的第k个2D图像平面
Figure 624273DEST_PATH_IMAGE013
用独特的码
Figure DEST_PATH_IMAGE014
进行时间调制。2D图像传感器用于同时捕获所有2D平面。数学上，捕获的2D原始数据可以表述为：
Figure 426007DEST_PATH_IMAGE015
。在所有k之上来求和总和。对于基于FDM的方法，码是正弦调制（例如，
Figure DEST_PATH_IMAGE016
，其中f k 是分配给第k个平面的调制频率）。频率编码平面可以使用短时傅立叶变换（STFT）来解复用。然后可以重建整个3D FOV
Figure 974800DEST_PATH_IMAGE017
。根据奈奎斯特采样准则，最大调制频率f max 受到相机的2D帧速率f cam 限制，或者更精确地，受到关系
Figure DEST_PATH_IMAGE018
限制。对于FDM，可分辨光学切片平面的数量N受可分辨频率数量限制，并且应该是
Figure DEST_PATH_IMAGE020
，其中f 3D 是3D帧速率。当N在100-120个可分辨平面的范围内时，可以使用高速sCMOS相机（
Figure 249792DEST_PATH_IMAGE021
）实现
Figure DEST_PATH_IMAGE022
的高速3D成像速率。快速体积成像设备的3D成像速率随着sCMOS相机技术中的持续进步而增加。注意到，编码特性天生供应跨3D堆叠的光学切片。由于3D复用，因此与点扫描显微术或LSFM技术相比，快速体积成像设备可以最小化光漂白和/或光毒性。
对于CDM，分配给每个2D平面的码
Figure 251246DEST_PATH_IMAGE023
可以是沃尔什哈达玛（WH）码（或纠错正交码，或伪随机噪声（PN）序列，其是看起来是随机噪声的确定性二元序列）。基于两种类型码的复用（即，扩频调制）抗噪声且有利于通信系统中高信号保真度。
快速体积成像设备还可以用于3D体积荧光光片成像以用于生物医学和临床应用中的检查（例如，发育生物学、细胞生物学、高体积制造检查、用于高通量体积质量控制的工业应用以及超大规模集成（VLSI）半导体器件）。
常规的共焦显微设备用具有几十MW/cm2量级功率密度的聚焦光束照射生物样本。快速体积成像设备具有比常规设备小大约6个数量级的功率密度。减少的功率密度减少了与外源荧光标记相关联的光漂白和细胞毒性；并减少对生物样本的光损伤。常规的显微技术（例如，宽场和共焦）也比快速体积成像设备向生物样本引入更多的辐射。该设备通过仅照射生物样本上的成像平面来产生较少的辐射，这使光损伤和光毒性最小化。
由于每个光片的变频调制，快速体积成像设备在不扫描光片的情况下可以实现高速体积成像。体积荧光信号的时间调制准许信号在频域中被解复用。虚拟光源可以成像到由锁定驱动器控制的变频调制器上。然后，在显微镜物镜下，时间调制的光束可以被转换成个体光片，以照射生物样品。
CLAM中的平行化体积检测是通过复用光片编码实现的。这可以通过投射到空间调制掩模上的光片阵列的强度调制来实现，该空间调制掩模可以是旋转图案化的分划板/掩模，或者具有扫描光束的静态图案化掩模；或者主动可重新配置的图案化掩模，例如具有扫描线光束的空间光调制器（SLM），如图3中所见。图3（a）示出激光是用旋转分划板调制的，该旋转分划板位于由两个柱面透镜形成的4f系统的公共焦平面处。图3（b）示出了通过跨静态反射掩模（即，液晶SLM或数字微镜器件（DMD））之上扫描1D聚焦光束调制激光。两种方法可以用不同的码沿一维（x方向）对光束进行编码（例如，FDM中的调制频率或CDM中的PN/WH码），该光束随后被映射到照射阵列的3D堆叠中的不同光平面/光片。
因此，来自第k个切片的荧光信号
Figure DEST_PATH_IMAGE024
用独特的时间码
Figure DEST_PATH_IMAGE026
进行强度调制（图2B中的框c），其中z 0 是相邻的光片间距。正交检测物镜收集复用的荧光发射，该荧光发射被登记在2D图像传感器上。相机拍摄的2D原始数据可以表示为，
Figure 981305DEST_PATH_IMAGE027
。
当满足码的正交性时，可以如实地恢复平面间具有最小串扰的图像。编码可以是但不限于频分复用（FDM）和码分复用（CDM）。该信号在FDM中用独特的载波频率编码，而在CDM中用伪随机码序列编码。在CDM中，分配给每个2D平面的码
Figure DEST_PATH_IMAGE026A
可以是沃尔什哈达玛（WH）码，其是纠错正交码；或者伪随机噪声（PN）序列，其是看起来是随机噪声的确定性二元序列。
受无线通信网络中正交频分复用（OFDM）启发，一个实施例可以用
Figure DEST_PATH_IMAGE028
来调制光片，其中
Figure 853446DEST_PATH_IMAGE029
是第k个光片的深度相关调制频率。频率载波在周期T内满足正交性质，即，
Figure DEST_PATH_IMAGE030
，
Figure 581230DEST_PATH_IMAGE031
，其中
Figure DEST_PATH_IMAGE032
为德尔塔函数，并且
Figure 991352DEST_PATH_IMAGE033
指代内积。因此，不同深度处的2D切片用可区分的调制频率被标注，并被复用到图像传感器上登记的单个2D帧序列中（图3A）。通过对2D图像序列
Figure DEST_PATH_IMAGE034
应用短时傅立叶变换，
Figure 728364DEST_PATH_IMAGE035
其中
Figure DEST_PATH_IMAGE036
标示
Figure 455011DEST_PATH_IMAGE037
的时间傅立叶变换。与现有的频率复用成像方法形成对比，CLAM复用2D图像堆叠，以通过跨光片阵列之上的频率线性调频强度调制使能实现平行化3D成像。图3B例示了图像复用和解复用步骤，并且可以从解复用的图像序列呈现分支血管的体积图像。
分划板图案的设计原理一般由两个关键规范指导，这两个规范关键性地确定CLAM性能。首先，相邻光片之间的调制频率间距（
Figure DEST_PATH_IMAGE038
）定义了体积成像速率（f vol ），即，
Figure 416014DEST_PATH_IMAGE039
。此外，为了确保最佳可实现的轴向分辨率，
Figure 392060DEST_PATH_IMAGE038
也应该被选择成使得编码频率通道之间相关联的空间间距（即，
Figure DEST_PATH_IMAGE041A
，其中β是深度和频率之间的校准转换因子）保持等于或小于每个光片的厚度（w LS ），即，
Figure DEST_PATH_IMAGE043A
。第二，受奈奎斯特采样准则和相机帧速率两者管控，允许编码所有光片的总调制频率范围（BW）确定了光片的数量（即，N）。遵循奈奎斯特准则，调制频率的上限（f H ）应该低于相机帧速率（f cam ）的一半，即，
Figure DEST_PATH_IMAGE044
（快速模式下，设置在
Figure 854135DEST_PATH_IMAGE045
）。另一方面，调制频率的下限（f L ）应该保持在频率上限的一半以上，即，
Figure DEST_PATH_IMAGE047A
，以便消除来自高阶谐波振荡的串扰。对于给定的频率带宽，即，
Figure DEST_PATH_IMAGE048
（由分划板的设计和旋转速度设置），频率“通道”的数量，或者等效地，可以分配的光片数量（N）是
Figure 904130DEST_PATH_IMAGE049
。因此，CLAM可以如实地生成
Figure DEST_PATH_IMAGE051A
个光片，以实现
Figure DEST_PATH_IMAGE052
体积/秒的3D成像速率。虽然这样的体积速率与最先进技术的基于扫描的LSFM平台相当，并且与许多生物成像应用中所需的速度相匹配，但是CLAM中的复用特性进一步改进了灵敏度，因为体积中的所有体素都是并行读出的（即，100%空间占空比）——从而将有效体素停留时间增加至复用数（N）倍，而不损害体积速率。给定这一改进，CLAM还降低了照射功率，并且因此降低了光漂白和光毒性。发明人注意到，给定散粒噪声限制条件，该灵敏度改进在原则上与荧光样本的稀疏性成比例，因为复用固有地将散粒噪声跨所有2D堆叠之上分布。
在基于FDM编码方案的一个实施例中，通过对时间信号逐像素地应用短时傅立叶变换，生成来自CLAM系统的频率-深度图，其示出了编码深度和调制频率（N=40）之间清楚的线性关系（R 2=0.995，β= 0.23
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAA
/Hz的斜率），如图3B中所见。这与分划板设计相一致，分划板设计跨小光束阵列之上生成线性频率线性调频（见补充信息）。如图3B中所见，具有~1.5
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAA
平均厚度的个体解码光片用450 Hz与750 Hz之间的独特中心频率标注，并一致地与有限带宽（~3 Hz）相关联。所有频率通道之上的平均SNR >5 dB，其中邻近通道之间的串扰最小，如频率-深度图中确证的。发明人注意到，每个频率通道中的残留旁瓣主要归因于旋转分划板的机械抖动和摆动。除了应用短时傅立叶变换之外，还可以实现其他解码方案，诸如数字正交解码或反正切解码方法，以减少在调制阶段期间引入的噪声，并进一步减小所需的信号长度，并且因此增加体积帧速率。
本发明的实施例可以在不进行机械/电扫描的情况下用于产生生物样本的体积成像视频。与扫描照射光片或样本台的现有光片显微技术相比，本文描述的技术最小化了台漂移和光损伤的影响。本设备的非扫描编码光片显微术可以以近似16
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAA
/秒的流动速率捕获微流体流中荧光球体的体积图像视频。捕获的体积帧速率可以高达25体积/秒。随着更高的相机速度，体积流动速率可以进一步增加。这使得该技术比常规的扫描技术或结构化光束光片显微术更快。该技术最小化对昂贵和复杂的光束控制设备、诸如空间光调制器、声光偏转器和压电台的使用。因此，可以在没有附加的复杂控制机制的情况下产生体积图像，并且因此可以最小化光束失真。
在一个实施例中，CLAM可以在双物镜或单物镜方法中实现。在双物镜配置中，彼此正交的两个单独物镜分别用于照射和荧光检测。基于该方案，同时多视角CLAM也可以通过从多个方向传送光片阵列来实现——这是一种有效的策略，其被证明在存在光散射和分辨率各向同性的情况下改进图像质量；在单物镜配置中，相同的物镜生成倾斜的光片阵列照射并收集荧光信号，如图9中所见。
图10示出了本发明可以用波前编码/成形来实现，以便在轴向和横向维度两者上操纵FOV。图10中的图片a示出了基于引发球面像差的延伸景深（DOF）的实现，这是通过在样本和检测物镜之间放置PDMS块来实现的。图10中的图片b示出了在具有和不具有PDMS块的情况下所拍摄的CLAM图像之间的DOF比较。比例尺表示（顶部）50
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAA
和（底部）20
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAA
。图片c示出了在不具有PDMS块（红色）和具有PDMS块（蓝色）的情况下沿深度（z）的PSF的所测量全宽半最大值（FWHM）（相对于最小值）。实线是二次拟合。在存在球面像差的情况下，DOF延伸了~32%。
在一个实施例中，可以利用球面像差来延伸景深（DOF）。这基本上是通过波前编码（WFC）145进行PSF工程的步骤，如图1B中所示。这是通过在样本和检测物镜之间引入高折射率材料块（具有n=1.42的折射率；5 mm的厚度的聚二甲基硅氧烷（PDMS））成为可能的（在图10中的a.）。在存在高折射率介质的情况下，荧光发射光射线，尤其是外围射线将聚焦在沿深度轴的不同点上，并且因此创建相当大但均匀的球面像差。这有效地延伸了DOF，而不使横向分辨率显著降级（在图10中的b.）。发明人针对两种情况——即具有和不具有延伸DOF——实验性地测量了跨FOV的PSF的FWHM（在图10中的b.）。相比之下，没有延伸DOF的点扩散函数（PSF）沿轴向方向更快地变宽。将DOF定义为其中FWHM维持在最小可实现的FWHM的
Figure 828179DEST_PATH_IMAGE053
内的范围，发明人观察到当前的配置可以产生~32%的DOF扩展（即，轴向FOV从31
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAA
延伸到41
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAA
（在图10中的c.）。在另一个实施例中，还可以进一步应用涉及无衍射照射光束的PSF工程技术，其例如使用轴棱镜、立方相位掩模或可调声梯度折射率透镜，以便缩放DOF。
在另一个实施例中，横向FOV可以通过采用波前成形（见图1B中的波前成形145）来延伸，该波前成形例如是可以用于光片平铺或贝塞尔光束生成的远程聚焦技术。在“光片阵列平铺”的情况下，可以采用空间光调制器（SLM），其将二元球面相位图案施加到由CLAM生成的光片阵列上。因此，整个光片照射阵列可以沿着x方向快速偏移，如图11中所见。
快速体积成像设备的另一个特征是沿轴向方向执行数字结构化照射（即，改进分辨率各向同性）的能力。通过使用FDM技术，可以利用每个2D平面的频率编码特性来以数字方式选择3D堆叠的子集（使用在图1A和图1B中所示的中继光学器件140中包括的光片编码器150或另一个预定义掩模）以形成轴向调制的3D图像（例如，每隔两个平面进行拍摄，并且形成沿轴向维度具有周期性条纹图案的3D图像，如图6中所见）。通过选择各自具有相应相移的子集，可以跨轴向维度重建高分辨率图像。通过沿轴向维度对3D堆叠进行过采样，3D堆叠的三个子集（红色、绿色和蓝色）可以被以数字方式选择，因为每个2D平面是经编码的。每个子集类似于由周期性结构化照射捕获的图像，各自具有固定的相位（
Figure DEST_PATH_IMAGE054
）。具有三个图像子集，它们的频谱可以被重新定位，使得最终图像的通带被扩展，即，分辨率得以改进。
为了得到更高的分辨率，轴向调制周期应该略小于或等于理论分辨率极限。可以同时获得多个结构化图像，而不是如在典型的SIM中那样顺序获得，因为对于更高的分辨率，不损害帧速率。如果期望，则快速体积成像设备可以被修改为在SIM模式下工作，以执行分辨率各向同性。
图6示出了基于FDM编码的CLAM中的数字结构照射。通过沿轴向维度对3D堆叠进行过采样，可以以数字方式选择3D堆叠的三个子集（红色、绿色和蓝色），因为每个2D平面是经编码的（这里用f 1 、f 2 、f 3 、f 4 等进行频率编码）。每个子集类似于由周期性结构化照射捕获的图像，各自具有固定的相位（
Figure 229204DEST_PATH_IMAGE055
）。具有三个图像子集，它们的频谱以这样的方式被重新定位使得最终图像的通带被扩展，即，分辨率得以改进。这与SIM中采用的通常成像处理基本上等同。
本发明适用于多色荧光成像，其可以通过使用多个激光（脉冲和连续波（CW））波长——包括但不限于从紫外到近红外的波长范围（取决于荧光团的激发光谱）——以及一个或多个用于图像检测的2D图像传感器来实现。处于不同波长的光可以由二向色滤光器或声光可调滤光器（AOTF）组合，并且可以使用相同的光学器件传送到镜对。CLAM也适用于多光子成像，其中激发光是短脉冲激光（通常为飞秒）。这包括但不限于双光子和三光子荧光体积光片显微术。
CLAM还可以沿轴向方向执行数字结构化照射，从而改进分辨率各向同性。在一个实施例中，基于FDM作为示例，可以利用每个2D平面的频率编码特性，并以数字方式选择3D堆叠的子集，以形成轴向调制的3D图像（例如，每隔两个平面进行拍摄，并且形成沿轴向维度具有周期性条纹图案的3D图像，如图6中所见）。通过选择周期性3D堆叠的其他子集，每个子集相对于彼此具有相移，可以基于这些子集以计算方式重建高分辨率图像（跨轴向维度上）——类似于结构化照射显微术（SIM）中采用的算法。为了得到更高的分辨率，轴向调制周期应该略小于或等于理论分辨率极限。注意到，同时获得多个结构化图像，而不是如在典型的SIM中那样顺序获得——即，对于更高的分辨率，不损害帧速率。
例示实施例
来自二极管泵浦的固态激光器（CW，波长532 nm，功率400 mW）的准直光束由柱面透镜（fCL= 200 mm）线聚焦到入口O处角度未对准的镜对（反射率R>99%；间距S=50 mm；长度L=200 mm）中。光束分裂成一组离散的（空间线性调频的）之字形路径，其由它们的入射角度管控。小光束的数量N主要由未对准角度、光锥角度和可变狭缝（N被选择从30到70的范围）控制。该光束由透镜（f=200 mm）收集，并通过望远镜T2（2x放大倍数）中继到旋转分划板（即，基于OFDM的光片阵列编码器）上，继之以另一个望远镜T3（1/4放大倍数）以匹配FOV。所有虚拟光源都成像在L和T2的公共焦平面（CFP）附近的平面上。该配置基本上确保了所有虚拟光源都在照射物镜的DOF内成像（图12）。光束通过照射管透镜TL1（f=200 mm）和柱面透镜CL2（f=50 mm），并且然后由照射物镜O1（20x，NA=0.45，W.D. 8.2-6.9 mm）聚焦，以生成光片阵列。正交检测物镜O2（10x，NA=0.25，W.D. 10.6 mm）收集复用的荧光发射，该荧光发射以高达3183 fps的帧速率登记在以滚动快门模式操作的2D图像传感器上。检测臂中的长通滤波器（截止在543 nm）清除激发光（图12）。频率分划板具有传输功能，
Figure DEST_PATH_IMAGE056
其中，
Figure 104757DEST_PATH_IMAGE057
是半径相关调制频率，并且
Figure DEST_PATH_IMAGE058
是符号函数（图6）。它是在透明薄膜（直径20 mm）上制造的，并且由具有锁相角速度控制的步进电机（转速= 120-2000 rpm）旋转。为了评估光漂白性能，该设置被配置为生成对应于CLAM、单光束光片和共焦显微术的三种照射场景。对于单光束光片和共焦情况，相干照射绕过具有附加（圆柱）透镜的镜对，以操纵入射曲线。
在没有复杂计算的情况下，图像重建简单地基于频率复用数据的逐像素短时傅立叶变换，继之以标准的理查森-露西去卷积。CLAM的3D点扩散函数（PSF）通过对分散在倾斜盖玻片上的荧光珠（直径=100 nm）成像来评估。测量的横向分辨率（~1.2
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
，半最大值全宽（FWHM））接近衍射极限（NA=0.25），而轴向分辨率（~2.7
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
）（如图13，a-b中所见）由光片厚度以及检测物镜的光学传递函数和间距来确定。在图13中，a（左）是3D PSF（体积：
Figure 789685DEST_PATH_IMAGE059
），并且（右）是从两个珠（珠1和2）测量的投射3D PSF。比例尺为2
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
，并且b是沿3维测量分辨率的箱线图。
CLAM展示了高达300
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
的穿透深度范围，在此范围内图像质量一般被保留。为了认证，对包埋在组织模拟体模中的荧光微珠（直径1
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
）进行成像。微珠的荧光曲线对于高达300
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
的深度是一致的而没有严重失真（图14，a-d）。对个体纳米球图像的横向和线性曲线的检查允许对图像质量进行剖析（图14，e-h）。体模中二氧化钛（TiO2）纳米粒子具有160nm的平均直径，其由透射电子显微镜表征。米氏散射计算表明，在532 nm处减小的散射系数
Figure DEST_PATH_IMAGE060
，其与生物组织的减小的散射系数相当。这样的性能表明，使用密集、非相干光片阵列的3D平行化照射以及因此复用光片编码不损害高度散射介质中的穿透深度——与最先进技术的基于扫描的共焦和LSFM模态相当（深度~100
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
）。在图14中，深度为a、e 30
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
；b、f 100
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
；c、g 200
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
；以及d、h 300
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
；c、d中的右上角被去噪以便比较。深度用a~d颜色编码。e~h示出a~d中标记的珠的最大强度投射（左）和线性强度曲线（右）。比例尺表示40
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
（a~d）和5
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
（e~h）。
本文描述的方法和过程可以体现为代码和/或数据。本文描述的软件代码和数据可以存储在一个或多个机器可读介质（例如，计算机可读介质）上，其可以包括能够存储供计算机系统使用的代码和/或数据的任何设备或介质。当计算机系统和/或处理器读取并执行存储在计算机可读介质上的代码和/或数据时，计算机系统和/或处理器执行被体现为存储在计算机可读存储介质内的数据结构和代码的方法和过程。
本领域技术人员应该领会，计算机可读介质包括可移除和不可移除的结构/设备，其可以用于存储信息，诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块和计算系统/环境所使用的其他数据。计算机可读介质包括但不限于易失性存储器，诸如随机存取存储器（RAM、DRAM、SRAM）；以及非易失性存储器，诸如闪存、各种只读存储器（ROM、PROM、EPROM、EEPROM）、磁性和铁磁/铁电存储器（MRAM、FeRAM）、以及磁性和光学存储设备（硬盘驱动器、磁带、CD、DVD）；网络设备；或现在已知或以后开发的能够存储计算机可读信息/数据的其他介质。计算机可读介质不应该被解释或翻译为包括任何传播信号。本发明的计算机可读介质可以例如是致密盘（CD）、数字视频盘（DVD）、闪存设备、易失性存储器或硬盘驱动器（HDD）（诸如外部HDD或计算设备的HDD），尽管实施例不限于此。计算设备可以例如是膝上型计算机、台式计算机、服务器、蜂窝电话或平板设备，尽管实施例不限于此。
从通过说明的方式给出的以下示例中，可以更好地理解本发明及其许多优点。以下示例是本发明的一些方法、应用、实施例和变型的说明。当然，它们不应被认为是对本发明进行限制。可以关于本发明进行许多改变和修改。
示例1
快速体积成像设备可以捕获生物样本中发生的动态过程的连续视频。为了展示此，将直径为1
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
的荧光聚合物珠供给到水，并且通过注射泵注入方形玻璃移液管中。照射和检测物镜与玻璃移液管的相邻侧正交定位。该配置准许检测物镜捕获荧光聚合物珠在微流体流中的动态运动。图7（a）示出了在80 ms荧光聚合物珠的体积图像。图7（b）示出了在680 ms荧光聚合物珠的体积图像。图7（c）示出了在1.36 s荧光聚合物珠的体积图像。图7（d）示出了在1.92 s荧光聚合物珠的体积图像。体积帧速率为-25体积/秒，并且视频用于估计流动的速为27
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
/秒。
示例2
快速体积成像设备用于对小鼠肠道中的血管系统和小鼠肾脏中的肾小球进行成像。肠道和肾脏组织在OPTIClear溶液中被清除，以得到更好的光学透明度，并用DiI（DiIC18）染料在内皮细胞膜上标记。图8（a）是肠内血管网结构的体积图像。该图像表明，甚至血管生成芽可以清楚地可视化。图8（b）示出了在光学透明的小鼠肾组织中附着到血管网的三个肾小球。体积帧速率为1.6体积/秒。
示例3
快速体积成像设备可以被配置为并入具有波前编码（WFC）的延伸的焦深（DOF）。可以在检测路径中放置预定义的相位掩模，使得它将系统的点扩散函数（psf）设计成较小的深度变化。在去卷积期间，可以使用基于立方相位掩模（CPM）的WFC方案来实现快速体积成像设备中的延伸的DOF。CPM相位函数可以描述为
Figure 138495DEST_PATH_IMAGE061
其中u和v是空间频率坐标，并且r是自由优化参数。CPM放置在检测物镜的后焦平面（20×，NA=0.4）。PSF跨深度>50
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
几乎不变。与没有CPM（仅有~5
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
的DOF）的PSF相比，这示出了清楚的延伸DOF效果。CPM仅调制相位，并且因此不引入损失。psf模拟研究示出了当添加CPM时psf的深度不变性（大于50
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
）（例如，见图4）。使用CPM创建的psf图像展现出不对称的模糊，其可以通过去卷积来改进。
为了评估快速体积成像设备的性能，模拟了位于不同轴向位置（Zp=-25，0，& +25
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
）的3个图像平面。每个位置分别以400、500和600 Hz进行时间调制。图像以2kHz采样，并且3D帧速率设置为4 Hz。还添加了图像模糊和光子噪声。在每个采样时间点取所有3个图像平面的和，获得了包括CPM情况下的500个复用图像的序列。通过对图像序列及时进行傅立叶变换来完成对3个图像平面的解复用。理查森-露西去卷积与全变分（TV）正则化算法（100次迭代，并且TV=0.001）一起用于恢复3个图像。恢复的图像保留了所有主要的原始特征，并且模糊得到抑制。
通过使用图3中所示的解复用概念以及使用去卷积算法，3个图像的主要原始特征得以恢复。图像模糊可以通过去卷积来移除。图3（a）和3（b）中所示的方法可以各自用于用不同的码沿一维（x方向）对光束进行编码（例如，FDM中的调制频率或CDM中的PN/WH码），该光束随后被映射到在照射阵列的3D堆叠中的不同光平面/光片。
示例4
发明人通过将微流体泵供给的流动荧光珠成像到流体通道（方形玻璃移液管，内侧长度1 mm）中，进一步评估了CLAM的成像速度。作为概念验证实验，CLAM系统——配置在从1100~1400 Hz的频率范围（BW）内并且总共N=24个光片——能够以高达13体积/秒的体积速率f vol 捕获流（~20
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
/s的流动速率）中的微球，如图15中所见。注意到，当前设置中的实际体积速率可以进一步增强，这取决于实验所需的光片的数量（N）。例如，当沿轴向方向的成像FOV减少一半时（即，N=12），体积速率可以在我们当前的相机的情况下增加到~25 vol/s。
示例5
组织清除通过替换、移除、修改部分成分而不变更其解剖结构来均匀化折射率以使大的生物样本（例如，整个生物体）呈现透明。这允许在光显微术下在最小的光散射并且因此在最小的图像降级的情况下分析组织结构。CLAM为与组织清除相组合的组织结构的3D可视化提供了先进的工具。这里，最近的方法——称为OPTIClear——被用来使组织呈现透明，因为它不含去污剂和变性剂的特性，具有最小的结构和分子变更，并使用CLAM对用亲脂性碳菁染料（DiI）灌注的OPTIClear处理的小鼠组织（回肠和肾脏）进行成像。将样品浸入介质（n=1.47）中，以便实现球面像差辅助的延伸DOF。
发明人展示出，如图16，a中所见的管状上皮结构和如图16，b中所见的小鼠肾脏中的肾小球，以及如图16，c中所见的小鼠肠道中的血管系统全部可以以~6.6体积/秒的体积速率可视化。如图16 a-e中所见，通过使用总共多达34个密集封装的复用光片，CLAM在没有任何光束扫描或物镜致动的情况下同时捕获所有光学切片平面。更重要的是，由于3D平行化，CLAM在生物成像中的适用性通过其低得多的光损伤和/或光漂白风险得到进一步证实。通过比较分别对应于LSFM和CLAM的两个连续照射场景之间的光漂白效应，例示了该益处（见方法）。清楚的是，CLAM在显著较慢的光漂白方面优于LSFM，如图16，f中所见。CLAM中较低的光漂白速率以及因此潜在的较低的光损伤/光毒性风险归因于其高度平行化的操作（100%空间占空比），这需要较低的照射强度并享有较长的曝光时间，而不牺牲SNR和成像速度。注意到，标准共焦显微术用聚焦光束照射样本，其功率密度在几十kW/cm2的量级。关于编码光片荧光显微术的发明具有大约小4个数量级的功率密度，这防止了与外源荧光标记相关联的光漂白和细胞毒性以及对生物样品的光损伤。因此，预计CLAM在长期生物监测应用中、尤其是在发育生物学中可能特别有价值。
在图16中，a是以6.6体积/秒的体积速率在小鼠肾脏（N=34）中的管状上皮结构的三个正交标准偏差强度投射（SDIP）的3D渲染图像。体积：
Figure DEST_PATH_IMAGE063A
。b.的SDIP是肾小球（见箭头）并且c.是沿3个正交轴的小鼠内的肠道血管系统。d-e分别在b、c中的图像的2D切片的蒙太奇；c是如下两种照射条件的光漂白的比较：单光片（SLS，N=1，红色）和光片阵列（CLAM，N=40，蓝色）。阴影区域表示每个条件的
Figure DEST_PATH_IMAGE064
1标准偏差（SLS和CLAM的情况下分别为20和30次测量）。比例尺表示b、c 20
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
和d、e 40
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
。
应该理解，本文描述的示例和实施例仅仅是为了说明的目的，并且根据这些示例和实施例的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物——包括所有图和表格——在它们没有与本说明书的明确教导不一致的程度上通过引用以其整体并入。

Claims (15)

1.一种基于光片的显微设备，包括：
光源；
一对平行镜，被配置为从光源接收光并反射非相干光片阵列；
编码器，被配置为对非相干光片阵列进行编码，包括：
频率调制器，被配置为分割非相干光片阵列，并且用相应的频率对每个光片进行编码；或者
时间调制器，被配置为通过包括哈达玛基或随机掩模的任意正交编码基来分割非相干光片阵列；
透镜，被配置为将编码的光片引导向生物样本，以及
图像捕获设备，被配置为从生物样本接收荧光信号。
2.根据权利要求1所述的基于光片的显微设备，其中所述光源是多个连续波激光器或处于不同波长的脉冲波激光激光器中的至少一个或其组合。
3.根据权利要求1所述的基于光片的显微设备，其中所述一对平行镜各自具有大于99%的相应反射率。
4.根据权利要求1所述的基于光片的显微设备，进一步包括扩束器，所述扩束器被配置为扩展或缩减来自所述光源的光束。
5.根据权利要求1所述的基于光片的显微设备，其中所述频率调制器是：以移动或旋转的空间光调制器的形式的光束编码器，或由扫描光束进行的静态空间图案化掩模照射。
6.根据权利要求1所述的基于光片的显微设备，进一步包括被配置为将光透视到生物样本的照射物镜，以及与所述照射物镜正交设置的检测物镜。
7.根据权利要求1所述的基于光片的显微设备，进一步包括用于解复用图像信号的电路。
8.根据权利要求1所述的基于光片的显微设备，其中，图像捕获设备是2D图像传感器或相机，并且图像捕获设备被配置为捕获视频，并且其中，图像捕获设备物镜或者与照射物镜正交设置，或者与照射物镜成一直线。
9.一种基于光片的显微设备，包括：
光源；
角度未对准的镜对，被配置为从光源接收光并反射光片阵列，其中光片阵列的密度和相干性通过调谐角度未对准的镜对的几何形状而可重新配置；
光片编码器，被配置为对光片阵列进行编码以形成平行化照射；
透镜，被配置为将编码的光片引导向生物样本，以及
图像捕获设备，被配置为从生物样本接收荧光信号。
10.根据权利要求9所述的基于光片的显微设备，进一步包括光束成形器，用于对进入角度未对准的镜对的光进行成形，以形成具有锥角的线聚焦光束。
11.根据权利要求9所述的基于光片的显微设备，进一步包括中继透镜，被配置为穿过投射的编码光片以形成N个光片的阵列。
12.根据权利要求11所述的基于光片的显微设备，进一步包括预定义的掩模，用于选择所述N个光片的阵列的任何子集来照射生物样本，其中预定义的掩模包括由扫描光束进行的静态空间图案化掩模照射或使用空间光调制器的主动可控掩模。
13.根据权利要求9所述的基于光片的显微设备，其中，通过调谐镜间距S而可调整阵列中的光片间的相干度，并且通过调整镜未对准角度
Figure DEST_PATH_IMAGE001
而可配置光片的阵列密度。
14.根据权利要求9所述的基于光片的显微设备，进一步包括波前编码/成形部件，所述波前编码/成形部件被配置为在轴向和横向维度上增加视场（FOV）。
15.根据权利要求9所述的基于光片的显微设备，其中所述光片编码器包括：
频率调制器，被配置为分割光片阵列，并且用相应的频率对每个光片进行编码；或者
时间调制器，被配置为通过包括哈达玛基或随机掩模的任意正交编码基来分割光片阵列。
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