DE69720458T2

DE69720458T2 - Programmierbares räumlich lichtmoduliertes Mikroskop und Mikroskopieverfahren

Info

Publication number: DE69720458T2
Application number: DE69720458T
Authority: DE
Inventors: Thomas M. Dr. Jovin; Quentin Dr. Hanley; Peter Verveer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-10-22
Filing date: 1997-10-22
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2017-10-23
Also published as: JPH11194275A; JP4064550B2; EP0911667B1; DE69720458D1; ATE236412T1; EP0911667A1; US6399935B1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Konfokalmikroskope und insbesondere programmierbare räumlich lichtmodulierte Mikroskope oder Mikroskope mit programmierbaren Arrays und ein Mikroskopieverfahren, das frei programmierbare Muster zur Beleuchtung und/oder Detektion verwendet.
Die Konfokalmikroskopie, die auf Systemen mit punktweiser Abtastung mit konjugierten Paaren von Beleuchtungs- und Detektionsaperturen basiert, ist ein wirksames Mittel zum Abbilden eines mikroskopischen Objekts, das mit direkter optischer Schnittbildung untersucht werden soll. Die, diskreten Aperturpunkte werden in der Objektebene des Mikroskopes beleuchtet, von der reflektiertes Licht oder Fluoreszenzlicht durch die konjugierten Detektionsaperturen in einer Bildebene beobachtet werden. Herkömmlich verwendete Konfokalmikroskope, die auf Scannsystemen mit mechanisch bewegten Aperturscheiben (sogenannte Nipkow-Scheiben mit einer Vielzahl von Aperturen) oder mit rotierenden Spiegeln basieren, sind dazu eingerichtet, ein Objekt mit einem Laserstrahl abzutasten (konfokale Laserscann-Mikroskopie, CSLM).
Beide Scannsysteme besitzen bestimmte Beschränkungen. Die Aperturscheiben ergeben insbesondere eine Beschränkung des Beleuchtungsfeldes, einen verminderten Kontrast und starke Intensitätsverluste. Typischerweise ist weniger als 3% der Scheibe durchlässig, da der Abstand zwischen den Löchern (Pinholes) groß sein muss, um die Konfokalwirkung zu erhalten. Andererseits ergeben die Scannspiegel der CSLM einen niedrigen Nutzungszyklus (F), der durch die sequentielle Datenakquisition und an einzelnen Punkten gegeben ist.
Dem Problem der Intensitätsverluste wurde durch die Einführung von Apertur-Korrelationsmikroskopen begegnet, wie sie von R. Juškaitis, T. Wilson et al. in „Nature" (Band 383, 1996, S. 804–806) und durch T. Wilson, R. Juškaitis et al. in „Optics Letters" (Band 21, 1996, S. 1879–1881) beschrieben sind. Ein derartiges Mikroskop, wie es schematisch in 9 gezeigt ist, verwendet zur Probenbeleuchtung eine Mehrpunktquelle, die durch eine Kombination der Lichtquelle mit einer programmierbaren Aperturmaske gebildet wird. Die Detektion des Lichtes, das durch die Probe reflektiert wird, wird mit einer Kamera durch die selbe Aperturmaske erhalten. Die Aperturmaske ist ein schneller räumlicher Lichtmodulator, der durch ein Array von adressierbaren Pixeln oder eine drehende. Scheibe mit fest eingeprägten Modulationscodes gebildet wird.
Die Maske trägt ein Muster von nicht-korrelierten Öffnungen und Verschlüssen, die die Transmissivität der Scheibe auf ungefähr 50% erhöhen. Durch die eine Korrelation vermeidende Codierungssequenz, die durch Juškaitis et al. verwendet wird, ist das detektierte Bild eine Überlagerung eines konfokalen Bildes mit einem herkömmlichen Bild. Um am Ende ein konfokales Endbild zu erhalten, ist es notwendig, unabhängig ein separates herkömmliches Bild (z. B. durch einen leeren Sektor in einer drehenden Scheibe) zu detektieren, das von der Überlagerung zu subtrahieren ist.
Diese zusätzliche Detektion eines herkömmlichen Bildes ist zeitaufwendig, so dass nur eine beschränkte Datenakquisitionsrate möglich ist. Die Anwendbarkeit der Apertur-Korrelationstechnik ist ferner durch die beschränkte Transmissivität beschränkt. Daher sind Fluoreszenzmessungen nur in Ausnahmefällen mit hohen Fluoreszenzausbeuten möglich. Eine entsprechende Vergrößerung der Beleuchtungsintensität könnte zu ei nem unannehmbaren Beleuchtungsschaden oder Ausbleichreaktionen führen.
Mit Blick auf diese Nachteile wurde ein verbessertes, räumlich licht-moduliertes Mikroskop durch M. Liang et al. in „Optics Letters" (Band 22, 1997, S. 751–753) und im entsprechenden US-Patent No. 5 587 832 beschrieben. Dieses herkömmliche Mikroskop ist schematisch in 10 gezeigt. Ein zweidimensionaler räumlicher Lichtmodulator wird durch eine digitale Mikrospiegeleinrichtung (im Folgenden: „DMD") gebildet, die das Beleuchtungslicht von der Quelle (Laser oder Weißlichtquelle) zu der Probe reflektiert und das Detektionslicht von der Probe zu einem zweidimensionalen Detektor reflektiert. Jeder Mikrospiegel des DMD ist einzeln steuerbar, um einen Beleuchtungs- und Detektionspunkt zu bilden oder nicht.
Die Verwendung eines DMD als ein Lichtmodulator ermöglicht die direkte Detektion von konfokalen Bildern. Des Weiteren ist es möglich, die minimale Periode konfokaler Muster (Abstand von Mikrospiegeln, die die Beleuchtungspunkte bilden) ohne Beeinträchtigung der Konfokalität zu bestimmen. Dennoch bildet das Mikroskop gemäß US 5 587 832 den Nachteil einer beschränkten Beleuchtungsintensität, da nur ein Teil des vom Objekt reflektierten Lichtes zur Abbildung verwendet werden kann. Des Weiteren besitzt dieses zur Abbildung verwendete Licht einen „out-of-focus" -Offset, der das Signal-Rausch-Verhältnis des Konfokalbildes in nachteiliger Weise beeinflusst. Schließlich ist das herkömmliche Mikroskop auf eine Konfokalabbildung ohne die Möglichkeit spezialisiert, konventionelle Bilder zu erhalten.
WO 97/31282 A beschreibt ein Konfokalmikroskop, das ein Konfokalbild und ein konventionelles Bild erzeugt.
Die Echtzeit-Konfokalmikroskopie oder -Abbildung, insbesondere im Gebiet des Abbildens biologischer Objekte, wie Zellen oder deren Bestandteile, erfordert weitere Verbesserungen in Bezug auf die Empfindlichkeit und Detektionsgeschwindigkeit und eine erweiterte Anwendbarkeit durch die Implementierung weiterer Messprinzipien.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung und ein verbessertes Verfahren zur konfokalen Abbildung bereitzustellen, die eine schnelle Datenakquisition, insbesondere mit einer effektiven optischen Schnittbildung, hoher Ortsauflösung und/oder hoher optischer Effektivität ermöglichen. Es ist insbesondere" eine Aufgabe der Erfindung, schnelle zwei- oder dreidimensionale Abbildungen von biologischen oder chemischen Materialien (z. B. lebende Zellen, Reaktionszusammensetzungen usw.) und damit Informationen über die molekulare Struktur und Funktion bereitzustellen. Wegen der inhärenten Empfindlichkeit und Selektivität ist die molekulare Fluoreszenz eine bevorzugte spektroskopische Erscheinung, die mit dem neuen Abbildungsgerät und -Verfahren zu implementieren ist.
Die o. g. Aufgabe wird durch ein konfokales optisches Abbildungsgerät oder -verfahren gelöst, das jeweils die Merkmale der Ansprüche 1 oder 14 umfasst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Die Grundidee der Erfinder ist der Betrieb eines konfokalen optischen Abbildungssystems wie z. B. eines programmierbaren, räumlich licht-modulierten Konfokalmikroskops (im Folgenden: PAM) mit räumlichen Lichtmodulatormitteln (im Folgenden: SLM) derart, dass das gesamte Licht, das von einer Probe oder einem Objekt ausgeht, in zwei Bilder geteilt wird, die gleich zeitig oder aufeinander folgend aufgenommen werden. Allgemein umfassen die räumlichen Lichtmodulatormittel ein Array von Modulatorelementen, deren Transmissions- oder Reflektionseigenschaften einzeln steuerbar sind. Mit einer ersten Gruppe von SLM-Modulatorelementen („on"-Elemente) wird das Objekt beleuchtet und ein fokales, konjugiertes Bild aufgenommen, wobei mit einer zweiten Gruppe von SLM-Modulatorelementen („off"-Elemente) ein nicht-konjugiertes Bild aufgenommen wird. Das nicht-konjugierte Bild enthält Licht aus Bereichen außerhalb des Fokus. Die Beleuchtungspunkte, die durch die SLM-Modulatorelemente gebildet werden, werden in eine Fokalebene des Objekts fokussiert.
Wenn sie in der Bildebene eines Mikroskops positioniert sind, definieren die SLM-Elemente, von denen jedes zu einem bestimmten Punkt in der Fokalebene des Objekts konjugiert ist, ein programmierbares Array, das zur Beleuchtung und/oder Detektion verwendet wird.
Die Modulatorelemente der ersten Gruppe sind einzeln derart steuerbar, dass die Mustersequenz von Beleuchtungspunkten durch ein zeitabhängig systematisch sich verschiebendes Gittermuster oder ein Muster repräsentiert wird, das auf einer Pseudo-Zufallssequenz endlicher Länge basiert. Im ersten Fall ist das erste Bild ein Bild entsprechend einem konfokalen Bild und das zweite Bild ein Differenzbild zwischen einem nicht-konfokalen Bild und dem ersten Bild. Im zweiten Fall ist das erste Bild eine Überlagerung eines konfokalen Bildes und eines nicht-konfokalen Bildes und das zweite Bild ist ein Differenzbild zwischen einem nicht-konfokalen Bild und einem konfokalen Bild. In jedem Fall kann das erste Bild einen Anteil eines konjugierten Bildes enthalten, wie es in 2 gezeigt ist.
Das SLM kann im Transmissions- oder Reflektionsmodus betrieben werden. In Abhängigkeit von der Zahl der Detektorsysteme der Detektormittel kann das PAM als ein sogenanntes Einzelweg- oder Doppelweg-PAM aufgebaut sein. Gemäß einer bevorzugten Anordnung enthalten die Lichtquellenmittel des konfokalen optischen Abbildungssystems eine Weißlichtlampe und Mittel zur Wellenlängenselektion.
Bevorzugte Anwendungen des konfokalen optischen Abbildungssystems sind Untersuchungen in der Zell- und Gewebebiologie, analytische/biotechnologische Prozeduren, in-situ-Hybridisierung in der Genanalyse, die Bildung einer optischen Maske für ortselektive photochemische Reaktionen, die Erzeugung und das Auslesen von biochemischen Arrays auf Chips, großskalige Oberflächeninspektionen in der Halbleiterindustrie und/oder optisches Aufzeichnen und Auslesen.
Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Das PAM kann als eine modulare Erweiterung vorhandener Mikroskope implementiert werden. Das Licht aus Bereichen außerhalb des Fokus, das normalerweise mit konventionellen CLSM ausgeblendet wird, wird gesammelt und verwendet, um das Fokusbild zu verstärken. Jedes Element der ersten Gruppe von Modulatorelementen ist einzeln steuerbar oder programmierbar, sodass die Mustersequenz von Beleuchtungspunkten mindestens einen vorbestimmten interessierenden Bereich des Objekts beleuchtet. Die Bereitstellung eines hochflexiblen Weißlichtmikroskops ist möglich, das zur Gesamtfeld- und/oder Konfokalabbildung (optional mit einem Laser) in der Lage ist. Aufgrund des hohen optischen Durchsatzes wird ermöglicht, dass eine Weißlichtbeleuchtung eine erweiterte Anwendbarkeit des Mikroskops ergibt.
Der gleichzeitige Gebrauch beider Bilder, die über die „on"-Elemente und die „off"-Elemente geliefert werden, ist ein einzigartiges Merkmal der Erfindung, das insbesondere verbesserte Entfaltungsalgorithmen ermöglicht. Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
1 eine schematisch Ansicht eines Fluoreszenz-PAM gemäß der Erfindung;
2 eine Simulation der Abbildung einer unendlichen Ebene in Abhängigkeit von Beleuchtungsspot-Gitterabständen;
3 eine schematische Ansicht eines Doppelreflektions-PAM mit gemeinsamen Lichtweg gemäß der Erfindung;
4 eine schematische Ansicht eines Einzelreflektions-PAM mit doppeltem Lichtweg gemäß der Erfindung;
5 eine Illustration der axialen Reaktion eines PAM;
6 eine Illustration der Schnittbildung und der Hintergrundunterdrückung;
7A, 7B schematische Ansichten eines Doppelreflektions-PAM gemäß der Erfindung mit einem gemeinsamen Lichtweg und einer einzelnen Kamera;
8 ein mikroskopisches Bild, das gemäß der Erfindung aufgenommen wurde und die Fähigkeit zur optischen Schnittbildung zeigt;
9 eine schematische Ansicht eines herkömmlichen Systems zur Erzeugung unkorrelierter Aperturen unter Verwendung der Technologie mit rotierenden Scheiben (Stand der Technik); und
10 eine schematische Ansicht eines räumlich lichtmodulierten Konfokalmikroskops (Stand der Technik) .
Das programmierbare Array-Mikroskop (PAM) gemäß der Erfindung kann auf der Basis von räumlichen Lichtmodulatoren (im Folgenden SLM) realisiert werden, die in Transmission (z. B. programmierbare Aperturmasken auf der Basis von Flüssigkristallen oder mikromechanischen Schaltern) oder in Reflektion (z. B. DMD) betrieben werden. In der folgenden Beschreibung wird ohne Beschränkung beispielhaft auf ein Reflektions-SLM mit DMD Bezug genommen. Die Erfindung kann analog mit Transmissions-SLM in die Praxis umgesetzt werden.
1 repräsentiert eine schematische Ansicht eines Fluoreszenz-PAM 100 gemäß der Erfindung. Das PAM 100 enthält im Wesentlichen eine Lichtquelle 110, die eine Weißlampen- oder Laserquelle ist, ein DMD 120, das als ein SLM betrieben wird, Abbildungsoptiken 130, einen Probenbereich 140 und ein Detektionssystem 150, 160.
Das DMD 120 besteht aus einem Array von viereckigen Spiegeln 121a, 121b ... (es ist jeweils nur ein Element illustriert), von denen jedes einzeln über einen vorbestimmten Schwenkwinkel + a relativ zur Senkrechten. in zwei stabile Anschlagzustände geschwenkt werden kann. Der Wert des Schwenkwinkels α hängt von dem praktisch benutzten DMD ab. Jedes Spiegelelement besitzt eine vorbestimmte Fläche, die wiederum vom DMD abhängt. Bevorzugte Parameter sind z. B. α = + 10° mit rechteckigen Spiegeln < 20 μm. Jedes Spiegelelement kann zwischen den Anschlagzuständen mit charakteristischen Frequenzen im kHz-Bereich entsprechend einem vorbestimmten Modulationsmuster geschaltet werden. Die Anschlagzustände werden „on"- und „off"-Positionen genannt, entsprechend denen die jeweiligen konjugierten Beiträge und die nicht-konjugierten Beiträge des detektierten Lichts (Fluoreszenz oder Reflektion) zu dem Detektionssystem 150, 160 gelenkt werden. Beide Beiträge ergeben jeweils ein fokales konjugiertes Bild I_nc und ein nichtkonjugiertes Bild I_c, auf deren Basis das gewünschte Konfokalbild erhalten wird, wie es unten beschrieben wird.
Das Detektionssystem 150, 160 ist ein Doppelreflektions-System mit gemeinsamem Lichtweg. Diese Bezeichnung wird aus dem folgenden Grund verwendet. Der „gemeinsame Lichtweg" bezieht sich auf die Tatsache, dass die Beleuchtung und die Detektion im Wesentlichen einem gemeinsamen optischen Weg zwischen den Beleuchtungs- und Detektionsaperturen folgt. Die „Doppelreflektion" bezieht sich auf die Tatsache, dass die SLM-Elemente Licht entlang zwei aufeinander folgenden optischen Wege lenken können. Entsprechend können die Bilder I_nc und I_c gleichzeitig aufgenommen werden. Eine Alternative wird unten als ein Einzelreflektions-System mit einem doppelten Lichtweg beschrieben (4).
Es wird wieder auf 1 Bezug genommen, wonach jeder Lichtweg jeweils eine zweidimensionale Kamera 151, 161 und Detektionsoptiken 111, 112, 162 enthält. Die Kamera 151 ist dazu eingerichtet, das Licht zu detektieren, das durch die Spiegel in der „on"-Position reflektiert wird, während die Kamera 161 Licht empfängt, das in der „off"-Positionreflektiert wird.
Im Folgenden wird die Detektion des fokalen konjugierten Bildes I_c mit der Kamera 151 und des nicht-konjugierten Bildes I_nc mit der Kamera 161 des Systems gemäß 1 beschrieben. Nach der Detektion werden weitere Schritte der Bildverarbeitung, Speicherung, Anzeige usw. hinzugefügt. Diese Schritte werden im Detail nicht beschrieben, soweit sie an sich von Scannsystemen bekannt sind.
Während der Frame-Integrationszeit wird das Modulationsmuster des SLM (DMD 120) N-fach geändert, um ein konfokales Bild zu erzeugen (scannen). Die i-th Modulation der SLM wird bezeichnet mit:
wobei x_d, y_d kontinuierliche Koordinaten des SLM und die Form und die endliche Größe (Spiegel) in S_i enthalten sind.
Detektion des fokalen konjugierten Bildes
Um das fokale konjugierte Bild I_c zu erhalten, werden die Modulationen Si vorzugsweise entsprechend einem Gittermuster-Ansatz oder einem Pseudozufallssequenz-Ansatz ausgewählt, die im Folgenden beschrieben werden. Der Gittermuster-Ansatz besitzt den Vorteil, dass er einfach realisierbar ist und ein Konfokalbild ohne Nachverarbeitung ergibt. Obwohl beim Pseudozufallssequenz-Ansatz eine gewisse Nachverarbeitung erforderlich ist, kann die Frame-Integrationszeit für einen gegebenen Signalpegel erheblich kürzer sein.
(i) Gittermuster=Ansatz
Beim Gittermuster-Ansatz werden die Elemente (z. B. Mikrospiegel oder Flüssigkristallelemente) des SLM entsprechend einem Gittermuster eingeschaltet und systematisch verschoben. Das Modulationsmuster wird entsprechend Sa,b (xd,Yd) = G(xd – aη, yd – bη) (2) gewählt, wobei n die Größe eines Elements (unter der Annahme quadratischer Elemente mit einem Füllfaktor 100) ist und der Index i in Gleichung (1) durch zwei-dimensionale ganze Indices a, b mit 0 ≤ a < n_x, 0 ≤ b < n_y ersetzt ist. Das Gitter wird durch das Merkmal G(xd, yd) = G(xd – pδx, yd – qδy) p,q ε N (3) definiert. δ_x = n_xη und δ_y = n_yη sind Gitterabstände des Gitters. Die realen Gitterparameter, die in der Funktion G enthalten sind, können verschiedene geeignete Formen ergeben. Diese Formen umfassen z. B. rechteckige Formen, wobei jedoch auch pseudo-hexagonale Gitter oder Zeilenmuster oder komplexere Formen möglich sind.
Das fokale konjugierte eines Objekts O (x₀,y₀,z₀) m einem Koordinatensystem (x₀,Y₀,z₀) eines Objektraumes mit einem Scannen in der axialen Richtung durch eine Versetzung über den Abstand z_s ist gegeben durch
wobei M die Verstärkung, T die Gesamt-Frame-Integrationszeit und H_em (x₀,y₀,z₀) die Emissions-PSF (point spread function) des Objektives ist. I_Gist die Gesamtbeleuchtung gemäß IG = ∬ ± F(Mu,Mv)Hex (x0 – u,Y0 – v,z0 ) dudv (5) wobei H_ex (x₀,y₀,z₀) die Anregungs-PSF des Objektivs ist. Die Gesamtbeleuchtung wird in Gleichung (4) mit räumlich variierenden Verschiebungen in der lateralen Richtung eingegeben durch
Φ_x = x_d modη Φ_y = x_d modη (6 )
Das Bild gemäß Gleichung (4) kann wegen der Abhängigkeit von Φ_x, Φ_y, x_d und y_d als eine dreidimensionale Faltung mit einer räumlich variierenden PSF betrachtet werden. Das SLM kann nicht kontinuierlich scannen und G(x_d,y_d) kann (im Unterschied zu der kontinuierlichen Bewegung in bekannten Mikroskopen, wie z. B. sogenannten Tandem-Scanning-Mikroskopen) nur über ganzzahlige Vielfache von n verschoben werden. Der Unterschied ist vernachlässigbar, falls η/M klein im Vergleich zur Abtastdichte des Bildes ist. Für sehr große n kann eine Pixelierung des Bildes auftreten. Die PSF kann räumlich invariant durch Scannen des SLM über ή gemacht werden (sogenanntes "dithering").
Eine numerische Simulation der Reaktion einer unendlichen dünnen fluoreszierenden Ebene gemäß Gleichung (4) ist in 2 als eine Funktion der Ebenenposition relativ zur Fokusebene gezeigt. Die Simulation basiert auf rechteckigen Gittern mit variierenden Gitterabständen z. B. mit den Parametern δ_x = δ_y = {2, 3, 5, 10, 20}·η, der Elementgröße η = 17 μm, NA = 1.4, M = 100, Anregungswellenlänge λ_ex = 633 nm, Emissionswellenlänge λ_em= 665 nm., Brechungsindex 1.515. Diese Para meter sind nur Beispiele, die für eine praktische Realisierung der Erfindung angepasst werden. Die Ergebnisse sind im Vergleich zum Bild eines konventionellen Mikroskops und eines idealen konfokalen Mikroskops normiert. Die konventionelle Reaktion (oberste Linie in 2 oder in den Messdaten gemäß 5, siehe unten) weicht von der erwarteten geraden Linie im Ergebnis der Simulation eines unendlich großen Objektes in ein Bild endlicher Größe ab. Selbst für relativ kleine Gitterabstände wird ein Schnittbildungseffekt erkennbar, dies allerdings mit einem zunehmenden Hintergrund. Mit zunehmenden Gitterabständen wird die Reaktion schärfer und die Hintergrundunterdrückung wird wirksamer. Ein ähnliches Verhalten der Offset-Zunahme, wie es in 2 gezeigt ist, ist gegeben, wenn die Abstände der Kacheln in den Pseudozufalls-Sequenzen endlicher Länge variiert werden.
(ii) Pseudozufallssequenz-Ansatz
Beim Pseudozufallssequenz-Ansatz werden die Elemente des SLM ebenfalls entsprechend einer Pseudozufallssequenz endlicher Länge geschaltet. Die ideale Situation einer vollständig unkorrelierten Modulation ist in der Praxis schwierig zu erreichen, da die Anzahl der-Gelegenheiten, zu denen das SLM sein Muster innerhalb eines gegebenen Integrationsrahmens ändern kann, begrenzt ist. Daher ist die gesamte Ebene mit einer wiederholten Sequenz von N zwei dimensionalen Mustern (R_i (a,b) moduliert. Die Anzahl N und die Periode von einem Muster kann derart gewählt werden, dass die Sequenz kurz im Vergleich zur Integrationszeit eines Rahmens ist. Eine andere Auswahl ist jedoch möglich. Die Mustersequenz Ri (a,b) besitzt die Gestalt:
Ri (a,b)Ri (c,d) = Nδ(a – c,b – d) a,b,c,d ε N (7) wobei R_i (a,b) den Wert 1 oder –1 besitzt. Eine Pseudozufallssequenz von zwei-dimensionalen Mustern mit der Gestalt (7) kann von einer geeigneten Aufstellung von eindimensionalen Reihen oder Spalten vonzyklischen Hadamard-Matrizen abgeleitet werden, wie sie von Harwit et al. in „Hadamark Transform Optics" (Academic Press, 1979, New York) beschrieben sind. Da S_i (x_d,Y_d) nur Werte von 0 und 1 annehmen kann, wird die Sequenz (1 + R_i (a,b))/2 verwendet. Ein anderer Apertur-Korrelationssequenz-Ansatz entsprechend der o. g. Publikation von Juškaitis et al. kann verwendet werden.
Auf der Basis eines Gitters gemäß Gleichung (3) zum „Kacheln" des i-ten Musters wird das vollständige Modulationsmuster S_i (x_d,y_d) geformt. Alle SLM-Elemente, für die G (x_d– aη,y_d – bη) = 1 gilt, werden in identischer Weise unter Verwendung der Sequenz (1 + R_i (a,b))/2 geschaltet. Die i-te Modulation ist durch eine Summation über alle a und b gegeben, da alle Elemente gleichzeitig geschaltet werden:
Die sich ergebende Modulation und entsprechend das sich ergebende Signal enthält zwei Teile, wobei der erste Teil eine "Konstant"-Modulation ist, die ein konventionelles Gesamtlichtbild ergibt.
Das fokale konjugierte Bild des Objekts O(x₀,y₀,z₀) im Koordinatensystem (x₀,y₀,z₀) ist gegeben durch:
Der Pseudozufalls-Sequenz-Ansatz besitzt eine hohe Lichteffektivität, da 50% sämtlicher SLM-Elemente im Zustand "on" sind. Dies wird durch die Gleichung (9) gezeigt, die Gleichung (4) mit Ausnahme des Koeffizienten T/4 an Stelle von T/n_Xn_yim zweiten Term gleicht. Obwohl beide Ansätze dasselbe konvokale Bild für dasselbe Gitter G (x_d,y_d) ergibt, erzeugt die Pseudo-Zufalls-Sequenz ein viel größeres Signal, dessen Stärke unabhängig von der Sequenzlänge ist.
Eine numerische Simulation der Reaktion einer unendlich dünnen fluoreszierenden Ebene gemäß Gleichung (9) ist mit Ausnahme eines konstanten Offsets identisch zu der gemäß Figur. 2.
Um das konfokale Bild mit dem Pseudozufallssequenz-Ansatz zu erhalten, muss ein Kompensationsterm subtrahiert werden. Das kann ein konventionelles Bild entsprechend der o.g. Technik sein, die von Juškaitis et al. beschrieben wird, oder es kann vorzugsweise ein nicht-konjugiertes Bild sein. In letzterem Fall wird im Vergleich zum ersten Fall das doppelte konfokale Signalerhalten.
Detektiondes nicht-konjugierten Bildes
Das nicht-konjugierte Bild I_nc kann auf die zweite Kamera 161 abgebildet werden. Alternativ ist es möglich, das nicht konjugierte Bild I_nc auf dieselbe Kamera wie das konjugierte Bild I_c abzubilden. Ein Beispiel eines solchen Einzelkamerasystems des Typs mit gemeinsamem Lichtweg ist unten unter Bezug auf die 7A und 7B illustriert. Erfindungsgemäß wird das gesamte Fluoreszenz- oder Reflexionslicht vom Objekt, das auf den SLM fällt durch die Kamera aufgenommen. Daher muss die Summe der detektierten Bilder ein herkömmliches Bild sein, so dass das nicht-konjugierte Bild I_nc die Differenz zwischen dem konventionellen Bild und dem konfokalen Bild ist, das durch die Gleichungen (4) oder (9) gegeben ist. Für die Pseudozufallssequenz ist die Differenz zwischen I_c und I_nc gleich dem gewünschten Konfokalbild.
Entfaltung
Falls die Bilder entsprechend den oben beschriebenen Ansätzen erhalten wurden, kann fakultativ ein Entfaltungsalgorithmus für eine weiter verbesserte Rekonstruktion oder Wiederherstellung des Objekts implementiert werden. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil dar, da die Leistungsfähigkeit von Entfaltungsalgorithmen stark durch die Natur und das Signal-Rausch-Verhältnis des eingegebenen Bildes (oder der Bilder) begrenzt wird. Während das detektierte Signal eines konfokalen Mikroskops mit einem verschlechterten Wiederherstellungsergebnis sehr verrauscht sein kann, ist das detektierte Signal eines konventionellen Mikroskops (das jedoch eine schlechtere Auflösung bildet und dem die Schnittbildungsfähigkeit fehlt) viel stärker, was eine verbesserte Entfaltung ermöglicht. Die Erfindung ermöglicht die Kombination der Vorteile sowohl der konfokalen als auch der konventionellen Abbildung mit der Entfaltung. Die o.g. Beschränkung wird entsprechend dem Entfältungsalgorithmus reduziert, wobei beide Bilder von einem oder mehreren optischen Schnitten in einem geeigneten Verstärkungsalgorithmus kombiniert werden.
Der Verstärkungsalgorithmus kann ein "Nearest-Neighbor"-Ansatz sein, wobei drei oder mehr Schnitte verwendet werden, um ein einzelnes verstärktes Bild zu erzeugen, oder ein Algorithmus sein, bei dem 3D-Stapel von Bildern für eine voll-ständige 3D-Rekonstruktion verwendet werden, wie es durch P.J. Verveer und T.M. Jovin in "Journal of the Optical Society of America A" (Band 14, 1997, Seite 1696–1706) beschrieben wird. Das letztere Modell wird im Folgenden in Matrix-Notation zitiert.
Ein mehrdimensionales diskretes Bild wird mit einem Vektor durch Stapeln seiner Pixel repräsentiert. Ein mehrdimensionaler linearer "blurring" Vorgang wird durch eine Matrix repräsentiert. Dies führt zur Abbildungsgleichung. i = N [Hf + b] (10) wobei i, f und b jeweils das detektierte Bild, das Objekt und einen bekannten Hintergrund repräsentieren. Die, Unschärfe („blurring"), die durch die Mikroskopoptiken eingeführt wird, wird linear angenommen und ist durch die Multiplikation mit der Matrix R gegeben. Die Funktion N[.] repräsentiert die Anwendung eines Rauschprozesses auf jedes Element seines Vektorelements, was gewöhnlich eine Poisson-Verteilung in der Fluoreszenzabbildung ist.
Die entsprechenden Gleichungen der konjugierten und nichtkonjugierten Bilder i_c = N [H_cf + b_c] und ins = N [H_ncf + b_nc] können erfindungsgemäß in eine einzige Gleichung kombiniert werden:
indem i_c und i_nc in einen einzelnen Vektor und H_c und H_nc in einen zusammengesetzten Operator kombiniert werden. Da Gleichung (11) dieselbe Form wie Gleichung (10) besitzt, kann der verfügbare Algorithmus einfach für Gleichung (11) modifiziert werden.
In den Gleichungen (10) und (11) ist die Dimensionalität des Bildes irrelevant. Die Implementierung von H hängt von der Dimensionalität ab, wobei dies jedoch nicht für die Algorithmen an sich gilt. Normalerweise ist die Dimensionalität gleich 3 (Raumdimensionen). Es können jedoch weitere Dimensionen wie z. B. spektrale oder zeitliche Dimensionen lediglich durch eine Änderung von H hinzugefügt werden. Zum Beispiel ist, falls eine Zeitabhängigkeit für jeden Bildpixel oder für Gruppen von Bildpixeln gemessen wird, die Dimensionalität gleich 4. Falls eine Unschärfe in der Zeitdimension gegeben ist, kann dieses von den Daten durch Erweitern von H mit der Zeitdimension entfaltet werden. Die Möglichkeit, diese Ent- faltungsalgorithmen auch in die spektrale und zeitlichen Dimensionen anzuwenden, während sie früher auf die Raumdimensionen beschränkt waren, repräsentiert einen wesentlichen Vorteil der Erfindung.
Weitere PAM-Anordnungen
3 zeigt eine schematische Ansicht eines Doppelreflektions-PAM 300 gemäß der Erfindung mit einem gemeinsamen Lichtweg. Wie in 1 enthält das PAM 300 im Wesentlichen eine Lichtquelle 310, einen SLM 320, Abbildungsoptiken 330, einen Probenbereich 340 und Detektionssysteme 350, 360. Das PAM 300 kann mit einem "Digital Light Processing"-Kit (z. B. Texas Instrumentss, Dallas, USA) als Lichtquelle in Kombination mit einem Mikroskop mit seitlichen Beleuchtungsanschlüssen (z. B. Zeiss Axioplan) und CCD Kameras (z. B. CH220-Kameras von Pho tometrics, Tucson, USA, mit Kodak KAF1400-CCD-Sensoren) realisiert werden. Der Probenbereich 340 enthält eine Antriebseinrichtung für z-Verschiebungen (senkrecht zur Fokusebene) wie eine Computer-Fokus-Steuerung z. B. Ludl Electronics Products, Hawthorne, USA. Das PAM 300 enthält zusätzlich eine Antriebseinheit zur Steuerung der Modulatorelemente, eine Kontrolleinheit, Berechnungs- und Entfaltungskreise und Anzeigeeinheiten (nicht gezeigt). Der Beleuchtungsweg ist schraffiert.
Das SLM 320, das ein DMD (wie oben beschrieben) ist, wird mit der Lichtquelle 310 beleuchtet, die eine gefilterte Weißlampe ist. Der Filter kann ein Bandpass für einen vorbestimmten interessierenden Wellenlängenbereich sein. Die Reflektionen der "on"-Elemente 321a (nur ein. Element ist gezeigt) werden mit dem Objektiv 342 in die Objektebene 341 fokussiert. Fluoreszenzlicht, das in der Objektebene 341 stimuliert wird, kehrt durch denselben optischen Weg zum SLM 320 zurück, wo es über den halbdurchlässigen Spiegel 311 entlang dem I_c Weg durch einen Filter 353 und eine Linse 352 zur Kamera 351 reflektiert wird. Licht, das aus Bereichen ausserhalb des Fokus stammt (z. B. Ebene nc in der Einfügung in 3) wird durch die "off"-Elemente 321b (nur ein Element ist gezeigt) über die Spiegel 364 entlang dem I_nc-Weg über den Filter 363 und eine Linse 362 zur Kamera 361 reflektiert. Die konfokaleAnordnung erlaubt es, Licht von der Fokalebene zurückzuweisen, wenn die entsprechenden SLM-Elemente ausgeschaltet sind. Die Filter 353 und 363 sind vorzugsweise Langpass-Filter, die für eine Fluoreszenzmessung eingerichtet sind (λ_em> λ₀).
Wie in 1 wird das fokale konjugierte Bild I_c mit der Kamera 351 und das nicht-konjgugierte Bild I_nc mit der Kamera 361 aufgenommen.
4 zeigt eine schematische Ansicht eines Einzelreflektions PAM 400 mit einem doppelten Lichtweg, das eine weitere Ausführungsform der Erfindung darstellt. Der Begriff "doppelter Lichtweg" bezieht sich auf die Tatsache, dass die Beleuchtung und die Detektion verschiedenen optischen Wegen folgen. Ferner wird, obwohl das SLM in der Lage ist, Licht in zwei Richtungen zu lenken, nur eine einzige Reflektionsrichtung verwendet. Während bei der Ausführungsform gemäß 3 die Konfokalität durch dasselbe SLM-Element definiert wird, wird die Konfokalität gemäß 4 durch das SLM-Element auf der Beleuchtungsseite und durch die CCD-Pixel auf der Detektionsseite definiert.
Das PAM 400 ist in einer vereinfachten Weise an ein konventionelles Mikroskop mit einer optischen Achse angepasst, auf der der Probenbereich 440, die Abbildungsoptiken 430 und das Detektionssystem 450 angeordnet sind. Das Mikroskop kann dieselben Basiskomponenten umfassen, die oben genannt wurden. Das Beleuchtungslicht in der Lichtquelle 410 wird über den SLM 420 und einem Seiteneinsatz des Mikroskops zu einem Strahlteiler (z. B. einem halb verspiegelten Spiegel) in der optischen Achse reflektiert.
Da das Detektionssystem 450 nur eine Kamera 451 enthält, wird die Trennung der I_c und I_nc-Bilder auf der Basis einer Analyse der Kamerabilder durchgeführt. Das Doppelweg PAM in Kombination mit der Analysis-Rekonstruktion bietet Vorteile einer einfachen Implementierung und einer hohen Effektivität und eines hohen Lichtdurchsatzes.
Gemäß dem Schiebegitter-Ansatz werden die Pixel der "on"-Elemente im aufgezeichneten Satz durch Auswahl der maximalen Grauwerte gefunden. Da jedes SLM Element des DMD in einer Serie genau einmal eingeschaltet werden soll, besitzen die Pi xel der "on"-Zustände eine maximale Intensität. Das I_c-Bild wird aus diesen ausgewählten Pixeln rekonstruiert, während das I_nc-Bild sich aus der Summe der übrigen Pixel ergibt.
Im Pseudozufallssequenz-Ansatz ist die Summe der hellsten Hälfte der Pixel das I_c-Bild, während die andere Hälfte das I_nc-Bild repräsentiert. Da die I_c- und I_nc-Bilder jeweils die Summe und Differenz eines konventionellen und konfokalen Bildes repräsentieren, kann das konfokale Bild durch die Differenz I_c – I_nc berechnet werden.
5 zeigt die axiale Antwort eines PAM, das ein DMD mit einem 32 × 32 – Flächengitter (entsprechend einer Spotentfernung von 544 μm) ein100 × 1.3 NA – (numerische Apertur) – Ölimmersionsobjektiv und λ = 450 – 490 nm verwendet. Der axiale z-Scann einer reflektierenden Oberfläche ergibt Konfokalbilder mit Intensitäten, die entsprechend der Simulation von Fig. 2 eine starke Fähigkeit zur optischen Schnittbildung zeigen.
Eine experimentelle Bestätigung der Unterdrückung des Hintergrundsignals während der optischen Schnittbildung ist in 6 gezeigt. Eine reflektierende Oberfläche (Spiegel) wird entlang der z-Achse durch die Fokusebene gescannt. Die Parameter sind Flächengitter mit Abständen δ_x = δ_y = {3,5,10,20} η, η = 17 μm (entsprechend der Größe 16 μm plus 1 μm Lücke zwischen den Spiegeln), ein 100 × 1.3 NA-Ölimmersionsobjektiv und λ = 450 – 490 nm.
Die 7A und 7B zeigen ein alternatives Beispiel eines Doppelreflektions-PAM 700 mit einem gemeinsamen Lichtweg mit zwei Beleuchtungsachsen, wobei nur eine einzige Kamera zur Bildaufnahme verwendet wird. Dieses Konzept hat bestimmte Vorteile in Bezug auf den kostenersparenden Gebrauch von nur einer Kamera und der einfacheren optischen Ausrichtung der Elemente, die die optischen Wege für die Bilder I_c und nc bilden.
Das PAM 700 umfasst im wesentlichen ähnliche Komponenten wie das PAM 300, das in 3 gezeigt ist, insbesondere die Lichtquellen 710a, 710b, ein SLM 720, Abbildungsoptiken 730, ein Objektiv 743, einen Probenbereich 740 und ein Detektionssystem 750. Die Aufnahme von einem Gesamtbild wird in zwei Schritten erzielt. Für die Aufnahme von Bildsequenzen werden die Bilder I_c und I_nc alternierend aufgenommen.
Zunächst wird das Bild I_c durch Beleuchtung des Objekts von einer ersten Seite mit der Lichtquelle 710a über einen halbdurchlässigen Spiegel 711, das SLM 720 und die Abbildungsoptiken 730 und Detektieren des Bildes aus der Fokalebene entlang dem umgekehrten optischen Weg über den SLM 720, den halbdurchlässigen Spiegel 711, einem Filter 753, eine Linse 752 und die Kamera 751 aufgenommen. Diese Situation ist in 7A gezeigt. Das Muster, das zur Steuerung des SLM 720 verwendet wird, wird als die "positive" Repräsentation entsprechend den Pseudozufallssequenzen oder anderen Sequenzen genannt, die auf dem SLM realisiert werden.
Als zweites wird, wie in 7B gezeigt wird, das Bild I_nc durch Beleuchtung des Objekts von der zweiten Seite (Lichtquelle 710b) aufgenommen, während das SLM 720 mit einer sogenannten "negativen" Repräsentation gesteuert wird, wobei alle "off"-Elemente entsprechend der Sequenz gesteuert werden, die zur Steuerung der "on"-Elemente im obigen ersten Schritt verwendet wurden. Da das Beleuchtungslicht entlang einer zweiten Achse gerichtet wird, die symmetrisch zu der Beleuchtung beim ersten Schritt angeordnet ist, werden die Positionen der Bilder I_c und I_nc umgekehrt .
Die zweiseitige Beleuchtung kann auf verschiedenen Wegen realisiert werden, z. B. durch eine einzelne Lichtquelle, die durch Spiegel entlang den zwei Beleuchtungsachsen gelenkt wird oder durch zwei identische Lichtquellen.
Weitere Vorteile und Anwendungen
Die verbesserte Leistungsfähigkeit einesPAM entsprechend der Erfindung im Vergleich zu einem konventionellen konfokalen Laserscanningmikroskop (CLSM) kann aus den folgenden relativen Parametern (PAM/CLSM) abgeleitet werden: α relative Beleuchtung an der Fokalebene, β relative Detektorquanteneffektivität, η relative Dwell-Zeit pro Pixel und δ relative Anzahl von Scannaperturen. Für die folgenden Beispiele wurde ein Bildfeld von 10³ × 10³ Elementen (Gesamtpixelzahl: N = 10⁶) und eine Gitterperiode n = 10 angenommen. Entsprechend ist δ = N/n² = 10⁴. Typische Werte für α und β sind 10^–2 (Gesamtfeld Lampenbeleuchtung im Vergleich zu einer beugungsbegrenzten Laserquelle) und 10 (CCD-Sensor im Vergleich zu einer Photomultiplier-Kathode). Mit einer Dwell-Zeit vom 1 ms (PAM) und 10 μs (CLSM), ist γ 100, was eine proportionale Vergrößerungsgeschwindigkeit (δ/γ) repräsentiert. Die relative Signalstärke, die mit α' β' γ geschrieben wird, würde 10-fach höher für das PAM sein. Der Pseudozufallssequenz-Ansatz ergibt eine weitere Erhöhung im Signalpegel (bei diesem Beispiel: n²/2) wegen des 50%-aktiven Zustand von jedem SLM-Element. Entsprechend wird der Pseudozufallssequenz-Ansatz für die mikroskopische in-vivo-Untersuchung von biologischen Proben bevorzugt.
Das PAM besitzt das Potential, die Akquisitionsgeschwindigkeit um zwei Größenordnungen zu erhöhen. Obwohl die Lampenquelle des PAM eine viel stärkere Bestrahlung in der Fokalebene als ein Laser in einem CLSM ergibt, wird dies durch die große Anzahl von Punkten, die parallel gescannt werden (was längere Dwell-Zeiten erlaubt), und die höhere Quanteneffektivität des Detektors kompensiert.
Bevorzugte Anwendungen der Erfindung sind in der Zell- und Gewebebiologie, wobei Bilddaten als Zwischeninformation für medizinisch-diagnostische Echtzeit-Prozeduren, analytische/biotechnologische Prozeduren geliefert werden, (wie z. B. in-situ-Hybridisierung in der Genanalyse), ein Auslesen von biochemischen Arrays auf Chips, die großskalige Oberflächeninspektion, z. B. in der Halbleiterindustrie und/oder ein optisches Aufzeichnen und Auslegen.
Ein mikroskopisches System gemäß der Erfindung ermöglicht die gleichzeitige Auslösung und Überwachung von photochemischen Reaktionen z. B. zur Proteinsynthese. Die Auslösung wird durch die Beleuchtung von vorbestimmten Substanzen mit einer geeigneten Wellenlänge erreicht, während das Beobachten mikroskopischer Messungen mit diesen Substanzen oder den Reaktionsprodukten umfasst. Eine spezielle Anwendung ist die Bildung einer optischen Maske für positionsselektive photochemische Reaktionen (z. B. für die Synthese von DNA-Sequenzen) auf einem Substrat.

Claims

Konfokales optisches Abbildungssystem (100, 300, 400, 700), das umfasst: – Lichtquellenmittel (110, 310, 410, 710); – Detektormittel (150, 160, 350, 360, 450, 750) mit mindestens einer zweidimensionalen Detektorkamera; und – ein räumliches Lichtmodulatormittel (120, 320, 420, 720) mit einer ersten (121a) und einer zweiten Gruppe (121b) von Modulatorelementen, wobei die erste Gruppe von Modulatorelementen dazu eingerichtet ist, ein Objekt, das untersucht werden soll, entsprechend einer vorbestimmten Mustersequenz von Beleuchtungspunkten zu beleuchten, die auf konjugierte Orte (141, 341, 441) des Objekts fokussiert sind, wobei Detektionslicht von den konjugierten Orten ein erstes Bild I_c auf den Detektormitteln bildet, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Gruppe von Elementen dazu eingerichtet ist, Licht - von nicht-konjugierten Orten des Objekts aufzunehmen, wobei Detektionslicht von den nicht-konjugierten Orten ein zweites Bild-I_nc auf den Detektormitteln bildet.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß Anspruch 1, bei dem jedes Element der ersten Gruppe von Modulatorelementen einzeln derart ansteuerbar ist, dass die Mustersequenz der Beleuchtungspunkte durch ein zeitabhängig systematisch sich verschiebendes Gittermuster repräsentiert wird und das erste Bild I_c ein konfokales Bild ist und das zweite Bild I_nc ein Differenzbild aus einem nicht-konfokalen Bild und dem ersten Bild I_c ist.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß Anspruch 1, bei dem jedes Element der ersten Gruppe von Modulatorelementen einzeln derart ansteuerbar ist, dass die Mustersequenz der Beleuchtungspunkte durch ein zeitabhängiges Muster repräsentiert wird, das auf einer pseudozufälligen Sequenz endlicher Länge basiert und das erste Bild I_c eine Überlagerung eines konfokalen Bildes und eines nicht-konfokalen Bildes ist und das zweite Bild I_nc ein Differenzbild aus einem konfokalem Bild und einem nicht-konfokalen Bild ist.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß Anspruch 2 oder 3, bei dem die Mustersequenz gewählt ist als: – eine systematisch sich verschiebende Zeile oder Zeilen, die entweder gleichmäßig, entsprechend einer pseudozufälligen Folge endlicher Länge, entsprechend einer S-Matrix-artigen-Hadamard-Sequenz oder zufällig voneinander beabstandet sind, – gleichförmige Punktgitter, wie z. B. Dreiecke, Quadrate, Rechtecke, Hexagone, – Zufallsmuster oder Pseudo-Zufallsmuster endlicher Länge, die auf sogenannten Walsch-, Sylvester-, Hadamard- oder Golay-Sequenzen basieren, – quadratische oder rechteckige Gitter, die aus sich schneidenden Zeilenmustern gebildet sind, – Muster mit vollständigem Feld "ein", – flächenfüllende Muster, die dazu eingerichtet sind, die Elemente des räumlichen Lichtmodulatormittels ganzzahlig einzuschalten, wenn sie auf dem räumlichen Lichtmodulatormittel erzeugt werden, – eine wiederholte Sequenz von zweidimensionalen Mustern, die aus Reihen oder Spalten zyklischer Hadamard-Matrizen abgeleitet sind, oder – eine Kombination der oben genannten Mustersequenzen.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Detektormittel dazu eingerichtet sind, durch eine kombinierte Detektion von beiden Bildern I_cund I_nc Licht aufzunehmen, das in der Bildebene des Systems verfügbar ist.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das räumliche Lichtmodulatormittel eine transmittierende oder eine reflektierende Maske umfasst.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß Anspruch 6, bei dem die reflektierende Maske eine digitale Mikrospiegeleinrichtung ist, die eine Vielzahl von Mikrospiegeln umfasst, von denen jeder einzeln in zwei stabile Anschlagzustände über einen vorbestimmten Schwenkwinkel +/- α relativ zur Senkrechten verschwenkbar ist, wobei die ersten und zweiten Anschlagzustände jeweils zu den ersten und zweiten Gruppen von Modulatorelementen beitragen.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Detektormittel zwei Detek torsysteme umfassen, von denen jedes eine zweidimensionale Kamera zur Aufnahme jeweils der ersten oder zweiten Bilder I_c und I_nc enthält .
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Detektormittel ein Detektorsystem mit einer zweidimensionalen Kamera zur gleichzeitigen oder sequenziellen Aufnahme der ersten und zweiten Bilder I_c und I_nc umfassen.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß Anspruch 9, bei dem die Kamera dazu eingerichtet ist, die ersten und zweiten Bilder gleichzeitig aufzunehmen, wobei das Abbildungssystem ferner eine Schaltung zur Bildanalyse umfaßt, die dazu eingerichtet ist, die ersten und zweiten Bilder I_c und I_nc zu trennen.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß Anspruch 9, bei dem die Kamera dazu eingerichtet ist, die ersten und zweiten Bilder derart sequenziell aufzunehmen, dass zuerst jedes Element der ersten Gruppe von Modulatorelementen individuell entsprechend der Mustersequenz zur Aufnahme des ersten Bildes I_c und darauf folgend jedes Element der zweiten Gruppe von Modulatorelementen einzeln entsprechend der Mustersequenz zur Aufnahme des zweiten Bildes I_nc ansteuerbar ist, wobei die Lichtquellenmittel erste und zweite Lichtquellen umfassen, die das Objekt entlang von zwei Achsen beleuchten.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei denen das Detektionslicht Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht oder Raman-gestreutes Licht ist, das vom Objekt emittiert wird.
Konfokales optisches Abbildungssystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das Teil eines programmierbaren räumlich lichtmodulierten konfokalen Mikroskops ist.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren, das die Schritte umfasst: – Leiten von Licht von Lichtquellenmitteln (110, 310, 410) auf ein räumliches Lichtmodulatormittel (120, 320, 420) mit einer ersten (121a) und einer zweiten (121b) Gruppe von Modulatorelementen; – Leiten von Licht von der ersten Gruppe von Modulatorelementen zu einem Objekt (140, 340, 440), das untersucht werden soll, entsprechend einer vorbestimmten Mustersequenz von Beleuchtungspunkten, die auf konjugierte Orte des Objekts fokussiert sind; und – Aufnehmen eines ersten Bildes I_c mit Detektormitteln (150, 160, 350, 360, 450) durch Leiten von Detektionslicht von den konjugierten Orten auf die Detektormittel; gekennzeichnet durch – Aufnehmen von Detektionslicht von nicht-konjugierten Orten des Objekts mit der zweiten Gruppe von Modulatorelementen. und Bilden eines zweiten Bildes von I_nc durch Leiten des Detektionslichtes von den nicht-konjugierten Orten auf die Detektormittel.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß Anspruch 14, bei dem jedes Element der ersten Gruppe von Modulatorelementen einzeln derart angesteuert wird, dass die Mustersequenz von Beleuchtungspunkten ein zeitabhängig systematisches sich verschiebendes Gittermuster ist, das mindestens einen vorbestimmten interessierenden Bereich des Objekts beleuchtet, und wobei das erste Bild I_c ein konfokales Bild und das zweite Bild I_nc ein Differenzbild aus einem nicht-konfokalem Bild und dem ersten Bild I_c ist .
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß Anspruch 14, bei dem jedes Element der ersten Gruppe von Modulatorelementen einzeln derart angesteuert 'wird, dass die Mustersequenz der Beleuchtungspunkte ein zeitabhängiges Muster ist, das auf einer pseudo-zufälligen Sequenz endlicher Länge basiert, die mindestens einen vorbestimmten interessierenden Bereich des Objekts beleuchtet, und wobei das erste Bild I_c eine Überlagerung eines konfokalen Bildes und eines nicht-konfokalen Bildes ist und das zweite Bild aus I_nc ein Differenzbild aus einem konfokalen Bild und einem nicht-konfokalem Bild ist.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß Anspruch 16, bei dem jedes Element der ersten Gruppe von Modulatorelementen einzeln derart angesteuert wird, dass die Mustersequenz der Be leuchtungspunkte durch eine wiederholte Sequenz von zweidimensionalen Mustern repräsentiert wird.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, bei dem die Detektormittel zwei Detektorsysteme umfassen, von denen jedes eine zweidimensionale Kamera enthält, und die ersten und zweiten Bilder jeweils durch die zwei Kameras aufgenommen werden.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, bei dem die Detektormittel ein Detektorsystem mit einer zweidimensionalen Kamera umfassen und die ersten und zweiten Bilder beide mit der Kamera aufgenommen werden.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß Anspruch 19, das ferner eine Bildanalyse zum Trennen der ersten und zweiten Bilder umfasst, wobei im aufgenommenen Bild die Bildpixel des ersten Bildes durch Auswahl der maximalen Grauwerte oder durch Auswahl der hellsten Hälfte der Pixel gefunden werden.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20, bei dem der Schritt des Leitens von Licht von den Lichtquellenmitteln zu dem räumlichen Lichtmodulatormittel eine Wellenlängenauswahl einschließt.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 21, das ferner eine Entfaltungsprozedur umfaßt, wobei das Objekt mit einem Entfaltungsalgorithmus rekonstruiert wird, der beide erste und zweite Bilder von einem oder mehreren aufgenommenen optischen Schnitten kombiniert.
Konfokales optisches Abbildungsverfahren gemäß Anspruch 22, bei dem der Entfaltungsalgorithmus einen Verstärkungsalgorithmus mit einem "Nearest neighbour"- Ansatz einschließt, wobei drei oder mehr Schnitte verwendet werden, um ein einzelnes verstärktes Bild zu erzeugen.
Verwendung eines konfokalen optischen Abbildungssystems oder Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche für die Anwendungen: – Untersuchungen in der Zell- und Gewebebiologie, – gleichzeitige ortsselektive Auslösung und Beobachtung photochemischer Reaktionen auf einem Substrat, wobei die Auslösung die Beleuchtung vorbestimmter Substanzen mit einer geeigneten Wellenlänge und/oder die Überwachung Fluoreszenzmessungen mit den Substanzen oder den Reaktionsprodukten umfassen, – analytische/biotechnologische Prozeduren, – in situ – Hybridisierung in der Genanalyse, – Bildung einer optischen Maske für ortsselektive photochemische Reaktionen, – ortsselektive Fluoreszensmessungen, Lebensdauermessungen, zum Beispiel mit Phasenmodulationstechniken und/oder Polarisationsmessungen, – Erzeugung und Auslese von biochemischen Arrays auf Chips, – großformatige Oberflächenuntersuchungen in der Halbleiter- Industrie, – optisches Aufzeichnen und Auslesen, – Zwei- oder Mehrphotonenmikroskopie, und/oder – stereoskopische Mikroskopie.