CN116338921A - 基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜 - Google Patents

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黄维
张运海
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Abstract

本发明提供的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，包括激光器、整形透镜、偏振片、1/2玻片、1/4玻片、相位板、分光模块、X‑Y扫描机构、扫描透镜、筒镜、物镜、纳米位移台、物镜、筒镜、扫描透镜、探测镜头及面阵探测器，所述X‑Y扫描机构和纳米位移台可驱动所述样本使照明点可以光斑遍历成像区域，对于每一个扫描点，所述面探测器接收完整的点扩散函数和样本的卷积数据，对于一次扫描成像过程，所述面探测器可以记录扫描成像数据，所述计算机对所述扫描成像数据进行处理以获得的基于虚拟点扩散函数的差分成像，差分成像可以获得半高宽更小的系统有效点扩散函数，最终获得的图像是样本与系统有效点扩散函数的卷积，点扩散函数决定了系统的成像分辨率，成像图像分辨率更高。

Description

基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜
技术领域
本发明涉及显微检测仪器设计及制造领域，尤其是涉及一种基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜。
背景技术
近几十年来，涌现出了很多种超越衍射极限的远场超分辨光学显微镜，比如说PALM,STORM,SIM,STED等，它们将光学显微镜的分辨率提高到100nm或者更高。但是这些超分辨技术或成本较高，或光学系统极为复杂，或成像及数据处理时间超长，或受制于依赖于特殊的荧光染料和特殊的样本制备，这些因素都制约了超分辨技术的推广，所以发展更加通用且成本较低的超分辨技术仍是目前的研究热点。
点扩散函数是点源在经过光学系统后由于衍射而形成一个扩大的像点，在光学显微成像系统中，采用点扩散函数来描述光学系统对点源解析能力。基于点扩散函数工程的成像差分是一种有效地提高共聚焦显微系统分辨率的方法，并且这种方法光学系统比较简单，数据处理速度也很快。在点扩散函数差分过程中，通过一个实心点扩散函数减去一个环形点扩散函数，环形点扩散函数消去实心点扩散函数的外围，减小了有效点扩散函数的半高全宽，进而提高成像分辨率。但是，通过物理的方法调制产生环形点扩散函数受到调制光学元件的限制，生成的环形点扩散函数的分布有较大的局限性，通过差分过程获得的图像将产生负值，一般的处理方式是将负值部分设为零，但是，这种处理方式将使图像产生畸变。出现这种问题的原因是通过调制产生的环形点扩散函数与实心点扩散函数的外围存在差异。
发明内容
本发明的目的是：提供一种分辨率更高的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本申请提供了一种基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，包括激光器、以及沿所述激光器出射的激光光束依次设置的整形透镜、偏振片、1/2玻片、1/4玻片、相位板、分光模块、X-Y扫描机构、扫描透镜、筒镜、物镜及纳米位移台，所述纳米位移台上设置有样本，所述样本经激光激发可后产生荧光，沿所述荧光出射方向依次设置有所述物镜、所述筒镜、所述扫描透镜、所述X-Y扫描机构、所述分光模块、探测镜头及面阵探测器，所述面阵探测器还电性连接有计算机，其中：
所述纳米位移台和所述X-Y扫描机构可驱动所述样本使照明点可以光斑遍历成像区域，对于每一个扫描点，所述面探测器接收完整的点扩散函数数据，对于一次扫描成像过程，所述面探测器可以记录扫描成像数据，所述计算机对所述扫描成像数据进行处理以获得的基于虚拟点扩散函数的差分成像。
在其中一些实施例中，通过调整所述1/2玻片、所述1/4玻片及所述相位板的位置，实现对所述面阵探测器接收照明点扩散函数的光斑的偏振、相位、强度调控的调制，所述面阵探测器获得一组图像扫描成像数据
Figure BDA0003426498580000025
k＝1,2,...N，其中N代表不同调制方式，NXdim*NYdim代表扫描成像的点数，X方向NXdim个扫描点，Y方向NYdim个扫描点，NXimage*NYimage代表相机的分辨率。
在其中一些实施例中，所述面阵探测器设置有不同的虚拟针孔，通过对所述虚拟针孔的调制可以获得
Figure BDA0003426498580000021
j＝1,2,...M，M个图像，其中，/>
Figure BDA0003426498580000022
中的一个点
Figure BDA0003426498580000023
Figure BDA0003426498580000024
为第j种虚拟针孔对应的加权系数。
在其中一些实施例中，所述计算机通过线性组合获得差分成像所需的虚拟实心点扩散函数对应的图像
Figure BDA0003426498580000031
通过线性组合合伙差分成像所需的虚拟环形点扩散函数对应的图像/>
Figure BDA0003426498580000032
通过差分获得最终的分辨率提高的图像I＝I实心-I环形。
在其中一些实施例中，所述面探测器为宽场探测器，所述宽场探测器包括EMCCD或sCMOS。
本发明采用上述技术方案的优点是：
本发明提供的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，包括激光器、整形透镜、偏振片、1/2玻片、1/4玻片、相位板、分光模块、X-Y扫描机构、扫描透镜、筒镜、物镜、纳米位移台、物镜、筒镜、扫描透镜、探测镜头及面阵探测器，所述面阵探测器还电性连接有计算机，所述纳米位移台可驱动所述样本使照明点可以光斑遍历成像区域，对于每一个扫描点，所述面探测器接收完整的点扩散函数数据，对于一次扫描成像过程，所述面探测器可以记录扫描成像数据，所述计算机对所述扫描成像数据进行处理以获得的基于虚拟点扩散函数的差分成像，，差分成像可以获得半高宽更小的系统有效点扩散函数，最终获得的图像是样本与系统有效点扩散函数的卷积，点扩散函数决定了系统的成像分辨率，成像图像分辨率更高。
本发明提供的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，提供一种通用且成本较低的超分辨成像技术，有利于超分辨技术的普及，推动肿瘤等基础研究的发展，为肿瘤的早期治疗提供科学依据，促进医疗水平和人类健康文明的发展。
附图说明
图1为本发明实施例提供的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜结构示意图。
图2为本实施例通过偏振和相位调制获得的一些照明点扩散函数。
图3为本实施例提供的面阵点扫描成像所获得的数据结构图。
图4为本实施例提供的几种可能的虚拟针孔示意图。
具体实施方式
请参考图1，为本发明实施例提供的一种基于微透镜阵列的高分辨并行显微成像仪，包括激光器110、以及沿所述激光器110出射的激光光束依次设置的整形透镜120、偏振片130、1/2玻片140、1/4玻片150、相位板160、分光模块170、X-Y扫描机构180、扫描透镜190、筒镜210、物镜220及纳米位移台230，所述纳米位移台230上设置有样本，所述样本经激光激发可后产生荧光，沿所述荧光出射方向依次设置有所述物镜220、所述筒镜210、所述扫描透镜190、所述X-Y扫描机构180、所述分光模块170、探测镜头240及面阵探测器250，所述面阵探测器250还电性连接有计算机260。
可以理解，本申请提供的基于共聚焦显微镜成像系统，其采用点扫描方式进行成像：
Figure BDA0003426498580000041
为样本的共聚焦图像的强度分布，其中，S为扫描成像区域内标记物的密度分布，Heff(r)为共聚焦系统的有效点扩散函数：
Figure BDA0003426498580000042
其中，Hill为系统照明点扩散函数；
Figure BDA0003426498580000043
为系统有效探测点扩散函数，其为系统探测点扩散函数Hdet与针孔传递函数P的卷积。共聚焦系统的系统点扩散函数由照明点扩散函数Hill和有效探测点扩散函数/>
Figure BDA0003426498580000044
共同决定。当选择零针孔时，共聚焦系统将达到其极限分辨率，这时其有效点扩散函数如下：
Figure BDA0003426498580000045
上述基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，其工作方式如下：
所述纳米位移台230及所述X-Y扫描机构180可驱动所述样本使照明点可以光斑遍历成像区域，对于每一个扫描点，所述面探测器250接收完整的点扩散函数数据，对于一次扫描成像过程，所述面探测器250可以记录扫描成像数据，所述计算机260对所述扫描成像数据进行处理以获得的基于虚拟点扩散函数的差分成像。
在其中一些实施例中，通过调整所述1/2玻片、所述1/4玻片及所述相位板的位置，实现对所述面阵探测器接收照明点扩散函数的光斑的偏振、相位、强度调控的调制，所述面阵探测器获得一组图像扫描成像数据
Figure BDA0003426498580000051
k＝1,2,...N，其中N代表不同调制方式，NXdim*NYdim代表扫描成像的点数，X方向NXdim个扫描点，Y方向NYdim个扫描点，NXimage*NYimage代表相机的分辨率。
请参阅图2，为本实施例通过偏振和相位调制获得的一些照明点扩散函数。通过对偏振、相位、强度调控的照明点扩散函数调制，获取多种照明点扩散函数，包括实心点扩散函数、环形点扩散函数和虚拟点扩散函数。其中，虚拟点扩散函数通过实心点扩散函数的数学运算获得。
请参阅图3，为本实施例提供的面阵点扫描成像所获得的数据结构图。
在其中一些实施例中，所述面阵探测器250设置有不同的虚拟针孔，通过对所述虚拟针孔的调制可以获得
Figure BDA0003426498580000052
j＝1,2,...M，M个图像，其中，/>
Figure BDA0003426498580000053
中的一个点
Figure BDA0003426498580000054
Figure BDA0003426498580000055
为第j种虚拟针孔对应的加权系数。请参阅图4，为本实施例提供的几种可能的虚拟针孔示意图。
在其中一些实施例中，所述计算机通过线性组合获得差分成像所需的虚拟实心点扩散函数对应的图像
Figure BDA0003426498580000056
通过线性组合合伙差分成像所需的虚拟环形点扩散函数对应的图像/>
Figure BDA0003426498580000057
通过差分获得最终的分辨率提高的图像I＝I实心-I环形。
可以理解，在差分成像过程中，不断增大相减系数虽然可以使点扩散函数的半高宽不断缩小，但是点扩散函数中会出现负值，这在实际中这是不可能出现的，常规的处理方法是将小于零的部分直接赋值为零，但是这种处理方式带来的问题是重构出的图像是非真实的图像，即伪像。
本申请通过基于面阵成像的虚拟针孔调制，获得一组点扩散函数，然后通过线性组合的方式获得用于差分成像的实心点扩散函数和环形点扩散函数。
进一步地，通过计算机260预先的优化求解获得线性组合的系数。在优化求解中，有两个目标：最终获得点扩散函数的半高宽、通过组合产生的虚拟实心点扩散函数外围和虚拟环形点扩散函数的高相似度。
以上从点扩散函数角度分析了本申请成像方法的成像过程，最终获得的图像是样本与有效点扩散函数的卷积，点扩散函数决定了系统的成像分辨率。
在其中一些实施例中，所述面探测器为宽场探测器，所述宽场探测器包括EMCCD或sCMOS。
本发明提供的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，包括激光器、整形透镜、偏振片、1/2玻片、1/4玻片、相位板、分光模块、X-Y扫描机构、扫描透镜、筒镜、物镜、纳米位移台、物镜、筒镜、扫描透镜、探测镜头及面阵探测器，所述面阵探测器还电性连接有计算机，所述纳米位移台可驱动所述样本使照明点可以光斑遍历成像区域，对于每一个扫描点，所述面探测器接收完整的点扩散函数数据，对于一次扫描成像过程，所述面探测器可以记录扫描成像数据，所述计算机对所述扫描成像数据进行处理以获得的基于虚拟点扩散函数的差分成像，差分成像可以获得半高宽更小的系统有效点扩散函数，最终获得的图像是样本与系统有效点扩散函数的卷积，点扩散函数决定了系统的成像分辨率，成像图像分辨率更高。
本发明提供的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，提供一种通用且成本较低的超分辨成像技术，有利于超分辨技术的普及，推动肿瘤等基础研究的发展，为肿瘤的早期治疗提供科学依据，促进医疗水平和人类健康文明的发展。
当然本发明的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜还可具有多种变换及改型，并不局限于上述实施方式的具体结构。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。

Claims (5)

1.一种基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，其特征在于，包括激光器、以及沿所述激光器出射的激光光束依次设置的整形透镜、偏振片、1/2玻片、1/4玻片、相位板、分光模块、X-Y扫描机构、扫描透镜、筒镜、物镜及纳米位移台，所述纳米位移台上设置有样本，所述样本经激光激发可后产生荧光，沿所述荧光出射方向依次设置有所述物镜、所述筒镜、所述扫描透镜、所述X-Y扫描机构、所述分光模块、探测镜头及面阵探测器，所述面阵探测器还电性连接有计算机，其中：
所述纳米位移台及所述X-Y扫描机构可驱动所述样本使照明点可以光斑遍历成像区域，对于每一个扫描点，所述面探测器接收完整的点扩散函数数据和样本的卷积数据，对于一次扫描成像过程，所述面探测器可以记录扫描成像数据，所述计算机对所述扫描成像数据进行处理以获得的基于虚拟点扩散函数的差分成像。
2.根据权利要求1所述的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，其特征在于，通过调整所述1/2玻片、所述1/4玻片及所述相位板，实现对所述面阵探测器接收照明点扩散函数的光斑的偏振、相位、强度调控的调制，所述面阵探测器获得一组图像扫描成像数据
Figure FDA0003426498570000011
其中N代表不同调制方式，NXdim*NYdim代表扫描成像的点数，X方向NXdim个扫描点，Y方向NYdim个扫描点，NXimage*NYimage代表相机的分辨率。
3.根据权利要求2所述的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，其特征在于，所述面阵探测器设置有不同的虚拟针孔，通过对所述虚拟针孔的调制可以获得
Figure FDA0003426498570000012
M个图像，其中，/>
Figure FDA0003426498570000013
中的一个点
Figure FDA0003426498570000014
Figure FDA0003426498570000015
为第j种虚拟针孔对应的加权系数。
4.根据权利要求3所述的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，其特征在于，所述计算机通过线性组合获得差分成像所需的虚拟实心点扩散函数对应的图像
Figure FDA0003426498570000016
通过线性组合合伙差分成像所需的虚拟环形点扩散函数对应的图像/>
Figure FDA0003426498570000021
通过差分获得最终的分辨率提高的图像I＝I实心-I环形。
5.根据权利要求1所述的基于虚拟点扩散函数工程的差分成像显微镜，其特征在于，所述面探测器为宽场探测器，所述宽场探测器包括EMCCD或sCMOS。
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