CZ302233B6 - Zpusob získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie a zarízení k provádení tohoto zpusobu - Google Patents
Zpusob získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie a zarízení k provádení tohoto zpusobu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302233B6 CZ302233B6 CZ20090706A CZ2009706A CZ302233B6 CZ 302233 B6 CZ302233 B6 CZ 302233B6 CZ 20090706 A CZ20090706 A CZ 20090706A CZ 2009706 A CZ2009706 A CZ 2009706A CZ 302233 B6 CZ302233 B6 CZ 302233B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- fluorescence
- polarization
- excited
- laser beam
- Prior art date
Links
- 230000010287 polarization Effects 0.000 title claims abstract description 128
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 title abstract description 21
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000198 fluorescence anisotropy Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims description 20
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 20
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 20
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 16
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 12
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical group [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 9
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 claims description 7
- 229940125730 polarisation modulator Drugs 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000482 two photon fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002311 multiphoton fluorescence microscopy Methods 0.000 claims 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 27
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 23
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 23
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 22
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 11
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 11
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 8
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 5
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 5
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 5
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 4
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 3
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 3
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 3
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 1
- 102000010831 Cytoskeletal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037414 Cytoskeletal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021238 Dynamin-2 Human genes 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000817607 Homo sapiens Dynamin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010010914 Metabotropic glutamate receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016193 Metabotropic glutamate receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N Procaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010014719 metabotropic glutamate receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6445—Measuring fluorescence polarisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0068—Optical details of the image generation arrangements using polarisation
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Pri zpusobu získání strukturních a funkcních informací o proteinech, na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie, se protein s navázaným fluoroforem podrobí dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescencní mikroskopii, kdy se zkoumaný protein s fluoroforem ozárí laserovým svazkem, jehož svetlo je polarizované pri alespon dvou ruzných polarizacích, a který excituje fluorescenci fluoroforu, a na základe informace o lokalizaci, intenzitách a polarizaci fluorescence excitované ruznými polarizacemi excitacního laserového svazku se zjistí lokalizace a míra anisotropie absorpce a/nebo lokalizace a míra anisotropie fluorescence, a ta se pak užije ke zjištení strukturních a funkcních a vlastností proteinu. Vhodné zarízení pro získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie obsahuje modulátor (P) pro rychlou modulaci polarizace excitacního svazku (1) pro vyvolání dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescence a rídicí jednotku (R), pricemž cinnost modulátoru (P) a rídicí jednotky (R) je synchronizovaná se skenováním mikroskopu (M) tak, že informace o intenzite fluorescence zaznamenávaná mikroskopem (M) je priraditelná k ruzným polarizacním stavum excitacního svazku (1) na základe znalostí casového profilu použité modulace polarizace excitacního svazku (1) vyvolané modulátorem (P).
Description
Způsob získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi polarizační fluorescenční mikroskopie a zařízení k provádění tohoto způsobu
Oblast techniky
Vynález se obecně týká polarizační mikroskopie, konkrétně ve dvoufotonovém a více fotonovém uspořádání. Předmětem vynálezu je způsob získávání strukturních a funkčních informací o vlastnostech proteinů, výhodně proteinů v buňkách, a zařízení k provádění tohoto způsobu. Způsob ío a zařízení umožňují pomocí dvoufotonové či vícefotonové polarizační fluorescenční mikroskopie určovat a monitorovat strukturu a funkci proteinů, například i membránových proteinů, a tak sledovat i fyziologické procesy v živých buňkách.
Dosavadní stav techniky
Ke studiu proteinů v živých buňkách se, po označení studovaného proteinu nějakou opticky pozorovatelnou značkou, využívají optické metody. Často se jako tato opticky aktivní značka používají fluorescentní proteiny. Připojení fluorescentního proteinu pak umožňuje za pomoci fluorescenčního mikroskopu sledovat přítomnost a prostorovou distribuci proteinu v živých buňkách. Samotná přítomnost a lokalizace fluorescence však vesměs neumožňuje sledovat funkční aktivitu studovaného proteinu, tedy např. zda je sledovaný receptorový protein aktivován, iontový kanál otevřen či uzavřen, transportér aktivní v transportu atd.
Současné technické možnosti pozorovat funkční aktivitu proteinů v živých buňkách jsou velice omezené. Dostupné optické metody vesměs spoléhají najeden či více ze tří základních principů: 1) produkci opticky detekovatelné látky prostřednictvím aktivace transkripce, 2) FLIM (fluorescence lifetime imaging), zobrazování doby života fluorescence a 3) FRET (fluorescence rezonance energy transfer), rezonanční přenos energie fluorescence. Ačkoliv jsou užitečné, všechny tyto metody mají výrazná omezení. Aktivace transkripce trvá minuty až hodiny, což je pro mnoho studovaných systémů nevhodné. FLIM vyžaduje nákladné vybavení, je málo citlivý, a neposkytuje informace, které by byly interpretovatelné z hlediska struktury proteinů. FRET vyžaduje použití dvou opticky aktivních molekul (např. fluorescentních proteinů), což často negativně ovlivňuje funkci sledovaného systému. Pozorovaný přenos fluorescenční energie (FRET signál) je pouhou frakcí celkové fluorescence aje tudíž často obtížně pozorovatelný na pozadí fluorescence dvou přítomných fluorescentních látek.
Podstata vynálezu
Nedostatky současných, výše popsaných metod, odstraňuje způsob založený na provádění dvoufotonové (případně vícefotonové) polarizační fluorescenční mikroskopie a zařízení k provádění polarizační fluorescenční mikroskopie, jež umožňují získávat strukturní informace o proteinech, např. výhodně membránových proteinech, a sledovat tak i procesy v těchto proteinech. Obecně, polarizační fluorescenční mikroskopie využívá skutečnosti, že mnoho fluoroforů (včetně fluoroforů fluorescenčních proteinů) má anisotropické vlastnosti, takže jak proces absorpce světla tak proces emise fluorescence závisí na orientaci fluoroforu. Výpočty i experimenty, které původce provedl, ukázaly, že pokud je fluorescenční značka (fluorescentní protein) připojena k vhodné podpoře (k membránovému proteinu, k proteinu jenž je součástí cytoskeletu, nebo k jinak imobi50 lizovanému proteinu, např. uměle imobilizovanému proteinu), omezení volné rotace je často dostatečné k tomu, aby byla anisotropie fluorescence (jak absorpce, tak fluorescentní emise) za vhodného experimentálního uspořádání pozorovatelná i pokud je imobilizační podpora (např. membrána buňky či cytoskelet) značně nerovná a spojení fluorescentní značky (fluorescentního proteinu) se zkoumaným proteinem ohebné. U fluorescentně značených rozpustných proteinů je sice orientace fluorescentní značky náhodná a anisotropické vlastnosti fluoroforu se při použití
- 1 CZ 302233 B6 různých polarizací excitačního svazku neprojeví na množství celkové fluorescence, ale projeví se na její polarizaci a na směru emise. Anisotropické vlastnosti fluoroforů tak lze pozorovat za mnoha různých okolností a lze je využít ke sledování fyziologických procesů v živých buňkách.
Ačkoliv v principu je možné fluorescenční anisotropii pozorovat s jednoťotonovou excitací, vícefotonová excitace, konkrétně např. dvou fotonová, přináší značné výhody: vyšší citlivost absorpce na orientaci fluoroťoru (u dvouťotonové excitace je funkcí čtvrté mocniny kosinu úhlu mezi polarizací excitačního svazku a přechodovým dipólovým momentem fluoroforu, oproti druhé mocnině tohoto kosinu pro jednoťotonovou excitaci) a excitaci fluorescence pouze v bezprostřední blízio kosti lokální roviny (kde je polarizace excitovaného svazku dobře definovaná), spojenou s dobrým vertikálním rozlišením. Tyto výhody jsou nezbytné pro úspěšné pozorování poměrně malých změn anisotropie spojených s mnoha fyziologickými procesy. Z pozorované anisotropie lze usuzovat na orientaci fluorescentní značky (fluorescentního proteinu) v pozorovaných buňkách, na omezení volné rotace, na rychlost rotace fluorescentní molekuly (a tím i na její velikost či inter15 akce sjinými molekulami), na změny v době života excitovaného stavu (a tím i na prostředí v blízkosti fluoroforu, včetně blízkosti vhodného akceptoru pro homo- či heteromolekulární FRET) a další vlastnosti. Změny pozorované anisotropie lze využít ke sledování fyziologických jevů, jako např. aktivace G-proteinů, proteinových kináz, změn intracelulárních koncentrací vápníku, membránového napětí, interakcí cytoplazmatických proteinů s membránami a sjinými proteiny atd.
Ve výhodném provedení vynálezu je mikroskopické zobrazení pozorovaných buněk provedeno nejméně se dvěma různými (výhodně navzájem kolmými lineárními) orientacemi polarizace polarizovaného světla, výhodně laserového svazku. Zobrazení se výhodně provádí tak, že mezi akvizicemi jednotlivých obrázků je lineární polarizace laserového svazku (tato může být předem upravena polarizačním „beamsplitterem“) otočena pomocí půl vlnové destičky, polarizátoru, nebo jiného zařízení. Obrázkem se přitom rozumí obraz objektu sledovaného v mikroskopu v digitalizované podobě, např. ve formátu TIFF, který je složen z matrice základních bodů - pixelů. Každý pixel přitom představuje grafické znázorněné naměřené intenzity fluorescence z přesně
3» definované části vzorku během přesně definovaného časového intervalu. Odborník si je vědom toho, že data reprezentující intenzitu fluorescence mohou mít i jinou podobu, např. mohou být ve formě grafu nebo tabulky.
Pro získání informace o relativních změnách intenzit fluorescence korelujících se změnami pola35 rizace excitačního světla se takto získané obrázky navzájem porovnají, výhodně vydělením intenzit pixelů jednoho obrázku intenzitami odpovídajících pixelů v druhém obrázku.
Vzhledem ktomu, že živé buňky se na mikroskopické úrovni pohybují, je nutné k přesnému porovnání obrázků získaných s různými polarizacemi získat kvalitní obrázky v co nejkratším
4o intervalu. Rychlé získávání obrázků s různými polarizacemi také umožňuje sledování rychlých fyziologických procesů, jako jsou změny koncentrace vápníkových iontů nebo změny membránového napětí.
Zařízení k provádění více foton ové, výhodně dvoufotonové, polarizační fluorescenční a vyšší har45 monické mikroskopie, které umožňuje rychlé získávání obrázků s různými polarizacemi a dovoluje tak realizovat výše popsaný způsob, je dalším předmětem vynálezu. Toto zařízení je výhodně ve formě modulu, připojitelného v podstatě k jakémukoliv laserovému skenovacímu mikroskopu umožňujícímu synchronizaci s externími ěi interními zařízeními, a splňujícímu požadavky kvality a kvantity excitačního laserového záření a zobrazování nutné pro pozorování fluorescence bio50 logických vzorků. Zařízení sestává z modulátoru polarizace excitačního laserového svazku, synchronizovaného pomocí řídicí jednotky prostřednictvím časovačích signálů s mikroskopem. Pro potřeby měření polarizace emitované fluorescence lze toto zařízení výhodně doplnit polarizátorem či polarizačním beamsplitterem, vloženým mezi pozorovaný vzorek a detektor fluorescence.
-2CZ 302233 B6
Podstata funkce zařízení podle vynálezu spočívá v tom, že v závislosti na skenování laserového svazku mikroskopem zařízení mění polarizaci svazku tak, že jeden obrázek, tzv. směsný obrázek, získaný mikroskopem obsahuje různé části (výhodně pixely), kde každá z různých Částí obrázku byla získána sjednou z různých polarizací excitačního svazku (ve skutečnosti každá z různých částí obrázku je získána převážně sjednou z různých polarizací excitačního svazku, vzhledem k distorzi polarizace použitými optickými součástmi, a vzhledem k opožděné odpovědi detektorů, což je matematicky korigováno, jak je ukázáno dále). Tento směsný obrázek je pak rozložen na jednotlivé obrázky získané s různými polarizacemi excitačního svazku, které se dále analyzují a zpracovávají stejným způsobem jako sekvence obrázků získaných postupně s různými polarizacemi.
Způsob rozkládání směsného obrázku je rovněž součástí vynálezu. Způsob rozkládání směsného obrázku obsahuje dva základní kroky. V kroku 1 je ve směsném obrázku identifikován signál (tj. fluorescence) excitovaný jednotlivými polarizacemi (polarizace č. 1, polarizace č. 2,...) excitačního svazku. V kroku 2 je signál excitovaný každou z těchto polarizací excitačního svazku použit k vytvoření samostatného obrázku. Výsledkem tak jsou dva či více obrázků, z nichž každý obsahuje pouze signál excitovaný jednou polarizací excitačního svazku.
Ve výhodném provedení, po sobě následující pixely směsného obrázku obsahují informaci o fluorescenci získanou s různými polarizacemi excitačního svazku. Takže například každý lichý pixel obsahuje informaci o fluorescenci získané s excitačním svazkem polarizovaným horizontálně, a každý sudý pixel obsahuje informaci o fluorescenci získané s excitačním svazkem polarizovaným vertikálně. Krok 1 rozkládání směsného obrázku potom sestává z identifikace lichých, respektive sudých pixelů každého řádku obrázku. V kroku 2 je potom ze všech lichých pixelů řádků směsného obrázku sestaven obrázek obsahující signál vybuzený excitačním laserovým svazkem polarizovaným horizontálně, a ze všech sudých pixelů řádků směsného obrázku sestaven obrázek obsahující signál vybuzený excitačním laserovým svazkem polarizovaným vertikálně. Každý z výsledných obrázků tak obsahuje informaci pouze o fluorescenci získané sjednou polarizací excitačního svazku.
Výhodně, krok 1 způsobu rozkládání obrázku může dále zahrnovat způsoby kompenzuj ící opožděnou reakci detektorů či jiné nežádoucí vlastnosti mikroskopického systému. Krok 2 může výhodně zahrnovat způsoby kompenzující bělení či jiné změny pozorovaného fluoroforu. Zařízení a způsob provádění fluorescenční mikroskopie tak umožňují velmi přesné, téměř současné mikroskopické pozorování fluorescence s dvěma či několika různými polarizacemi excitačního svazku, a analýzu získaných dat pro určování a sledování struktury proteinů, interakcí proteinů (nebo jiných fluorescentních molekul) s dalšími molekulami a s okolním prostředím, a pro sledování funkce proteinů.
Výhodné provedení zařízení podle vynálezu je popsáno dále podrobněji v příkladu 1.
Způsob podle vynálezu využívající zařízení podle vynálezu byl demonstrován sledováním zeleného fluorescentního proteinu (GFP) modifikovaného tak, aby se při exprimování, např. v buňkách linie HEK293, navázal na jejich buněčnou membránu (příklad 2).
Získání informace o struktuře proteinů bylo demonstrováno na G-proteinu s navázaným kyanovým fluorescentním proteinem (CFP), na proteinu citlivém na koncentraci vápníkových iontů, na proteinu citlivém na membránové napětí, na receptorových proteinech, a na proteinu navázaném na cytoskelet (příklad 3). Příklady ukazují, že způsob podle vynálezu umožnil z informací o anisotropii absorpce světla fluorescentními proteiny získat kvantitativní popis orientace fluorescentních proteinů.
Způsob podle vynálezu umožňuje i sledování strukturních změn proteinů v důsledku jejich funkce, a tím i sledování funkce proteinů, což je ilustrováno na příkladu G-proteinů a proteinové kinázy C (příklad 4).
-3 CZ 302233 B6
Způsob a zařízení podle vynálezu umožňují sledovat polarizaci fluorescence jakožto reportér interakcí řluorescentně značeného cytoplazmatického proteinu sjinými molekulami, jak je demonstrováno v příkladu 5 na cytoplazmatickém žlutém fluorescentním proteinu (YFP) exprimovaném v buňkách linie IIEK293.
Předmětem vynálezu tedy je konkrétně způsob získání strukturních a funkčních informací o proteinu na bázi polarizační fluorescenční mikroskopie, kdy se I) ke sledovanému proteinu naváže lluorofor, kterýžto způsob dále spočívá vtom, že II) sledovaný protein s navázaným tl noro forem se podrobí dvou foton ové nebo více foton ové fluorescenční mikroskopii, kdy se zkoumaný protein s fhioroforcm ozáří laserovým svazkem, jehož světlo je polarizované při alespoň dvou různých polarizacích, a který excituje fluorescenci fluoroforu, (II) získá se informace o lokalizaci, intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku, IV) informace o lokalizaci, intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku se užije ke zjištění lokalizace anisotropie absorpce a/nebo fluorescence, a V) lokalizace anisotropie absorpce a/nebo fluorescence se užije ke zjištění strukturních a funkčních a vlastností sledovaného proteinu.
Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se informace o lokalizaci a intenzitách fluorescence excitovaných různými polarizacemi excitačního laserového svazku získá ve formě směsného obrázku, který obsahuje v různých svých částech intenzity fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku.
Zpracovávání směsného obrázku při výhodném způsobu zahrnuje kroky, kdy a) pro každou část směsného obrázku se identifikuje signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního svazku, a b) pro každou z použitých polarizací excitačního laserového svazku se sestaví samostatný obrázek obsahující signál excitovaný příslušnou polarizací.
Při dalším výhodném provedení různé části směsného obrázku obsahující intenzity fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku jsou pixely.
Výhodně se k excitaci použije laserový svazek, jehož světlo je polarizované při dvou různých polarizacích.
Ještě výhodněji se k excitaci použije laserový svazek, jehož světlo je polarizované pri dvou vzájemně kolmých polarizacích.
Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje směsný obrázek v lichých pixelech intenzity fluorescence excitované pri první ze dvou užitých polarizací a v sudých pixelech obsahuje intenzity fluorescence excitované při druhé ze dvou užitých polarizací.
Výhodně se anisotropie fluorescence pro různé pixely stanovuje tak, že se vypočte podíl mezi intenzitou fluorescence excitovanou jednou polarizací excitačního laserového svazku a intenzitou fluorescence excitovanou druhou polarizací excitačního laserového svazku.
Ve výhodném provedení vynálezu je sledovaným proteinem membránový protein.
V jiném výhodném provedení je sledovaným proteinem G-protein.
V dalším výhodném provedení je sledovaným proteinem protein citlivý na koncentraci vápníkových iontů.
Výhodně může být sledovaným proteinem také protein citlivý na membránové napětí.
V dalším výhodném provedení je sledovaným proteinem receptorový protein.
-4CZ 302233 B6
V ještě dalším výhodném provedení je sledovaným proteinem enzym.
V jiném výhodném provedení je sledovaným proteinem cytoplazmatický protein.
Výhodně může být sledovaný proteinem také protein připojený k cytoskeletu.
Dalším předmětem vynálezu je zařízení, a to ve formě doplňkového zařízení pro fluorescenční mikroskop, pro získání strukturních a funkčních informací o proteinu výše popsaným způsobem, kteréžto zařízení obsahuje modulátor pro rychlou modulaci polarizace excitačního svazku pro vyvolání dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescence a řídicí jednotku, přičemž modulátor, řídicí jednotka a mikroskop jsou synchronně propojeny tak, že informace o intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence zaznamenávaná mikroskopem je přiřaditelná k různým polarizačním stavům excitačního svazku na základě časového profilu použité modulace polarizace excitačního svazku vyvolané modulátorem.
Výhodně zařízení podle vynálezu obsahuje polarizátor vložený před detektor fluorescence v mikroskopu.
Ve výhodném provedení modulátor obsahuje Pockelsovu celu řízenou vysokonapěťovým driverem pro modulaci vysokého napětí poskytovaného zdrojem vysokého napětí v závislosti na nízkonapěťových pulzech generovaných generátorem nízkonapěťových pulzů.
Výhodně jsou řídicí jednotka, modulátor polarizace a fluorescenční mikroskop synchronně propojeny prostřednictvím taktovacího signálu akvizičního zařízení mikroskopu.
Ve výhodném provedení je řídicí jednotka ve formě počítače a obsahuje implementovaný program k automatizovanému provádění alespoň jednoho kroku výše popsaného způsobu podle vynálezu.
Ještě výhodněji řídicí jednotka ve formě počítače obsahuje implementovaný program k provádění výhodného způsobu, jak byl popsán výše, kdy se anisotropie fluorescence pro různé pixely stanovuje výpočtem podílu mezi intenzitou fluorescence excitovanou jednou polarizací excitačního laserového svazku a intenzitou fluorescence excitovanou druhou polarizací excitačního laserového svazku.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Schematické znázornění principu zařízení pro získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi fluorescenční polarizační mikroskopie.
Obr. 2. Příklad výhodného provedení zařízení pro získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi fluorescenční polarizační mikroskopie
Obr. 3. Ilustrace funkce zařízení pro získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi dvoufotonové polarizační fluorescenční mikroskopie. Panel a: Experimentální uspořádání je v podstatě stejné jako na obr. 1, avšak pro ilustrační účely byl do laserového svazku vložen polarizační beamsplitter. Panel b: Obrázek homogenně fluorescentního předmětu vytvořený systémem popsaným na panelu a. Každý pixel odpovídá časovému intervalu 0.25 μβ.
Obr. 4. Schematické znázornění způsobu rozkládání směsného obrázku.
Obr. 5. Savčí buňka produkující membránový protein označený fluorescentním proteinem se zřejmou fluorescenční anisotropií, zobrazená pomocí zařízení pro rychlou modulaci polarizace
- 5 CZ 302233 B6 pro dvou foto novou fluorescenční polarizační anisotropíí. Panel a: Směsný obrázek, v němž v každém řádku liché pixely odpovídají době, po kterou byl excitační svazek polarizován vertikálně, sudé pixely odpovídají době po kterou byl excitační svazek polarizován horizontálně. Panel b: Směsný obrázek po započtení prodlevy a doznívání odpovědi detektorů. Panel c: Obrázky obsahující signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního laserového svazku. Panel d: Příklad dalšího zpracování obrázků z panelu 5c.
Obr. 6 Ukázky aplikace způsobu dvoufotonové polarizační fluorescenční mikroskopie ke sledování struktury proteinů. Panel a: Buňka exprimující podjednotku Gai2-YFP bez přítomnosti podjcdnotek Gf31 a Gy2 nevykazuje anisotropii absorpce. Panel b: Buňka exprimující podjednotku G(xi2-YFP v přítomnosti podjednotek Gpl a Gy2 vykazuje anisotropii absorpce ukazující na přibližně rovnoběžnou orientaci fluoroforu a buněčné membrány. Panel c: Cyanový fluorescentní protein sondy vápníkových iontů lynD3cpV vykazuje anisotropii absorpce ukazující na přibližně kolmou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel d: Žlutý fluorescentní protein sondy vápníkových iontů lynD3cpV nevykazuje pozorovatelnou anisotropii absorpce, což ukazuje na neuspořádanou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel e: Cyanový fluorescentní protein, jenž je součástí fluorescentní sondy membránového napětí VSFP3.1, vykazuje anisotropii absorpce ukazující na přibližně rovnoběžnou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel f: Zelený fluorescentní protein připojený ke glutamátovému receptoru mGluRl vykazuje velmi silnou anisotropii absorpce ukazující na téměř rovnoběžnou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel g: Cyanový fluorescentní protein připojený k a2-adrenergnímu receptoru vykazuje ve srovnání s panelem e slabší anisotropii absorpce ukazující na přibližně rovnoběžnou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel h: Žlutý fluorescentní protein připojený k a2adenosinovému receptoru vykazuje anisotropii absorpce ukazující na přibližně kolmou orientaci fluoroforu vůči buněčné membráně. Panel i: Zelený fluorescentní protein připojený k cytoskeletálnímu proteinu tau vykazuje anisotropii ukazující na přibližně rovnoběžnou orientaci fluoroforu vůči orientaci mikrotubulů.
Obr. 7. Ukázka aplikace způsobu dvoufotonové polarizační fluorescenční mikroskopie ke sledování fyziologických procesů (aktivace G-proteinů, aktivace proteinové kinázy C) v živých buňkách. Panel a: Buňka exprimující podjednotky Gai2-YFP, Gpl, Gy2 a adrenergní receptor v klidovém stavu vykazuje fluorescenční anisotropii. Panel b: Buňka v panelu a, po aktivaci Gproteinu nevykazuje žádnou, nebo jen velmi slabou fluorescenční anisotropii. Panel c: Buňka v panelu a, b, po skončení aktivace G-proteinu vykazuje fluorescenční anisotropii. Panel d: Buňky exprimující kinázu PKC-RFP v klidovém stavu vykazují cytoplazmatickou lokalizaci fluorescence a absenci anisotropie absorpce. Panel e: Buňky exprimující kinázu PKC-RFP po aktivaci vykazují membránovou lokalizaci fluorescence a anisotropii absorpce.
Obr. 8. Ukázka aplikace způsobu dvoufotonové polarizační fluorescenční mikroskopie ke sledování interakcí cytoplazmatických proteinů s jinými molekulami. Panel a: Nezpracovaný obrázek buňky exprimující fluorescentní protein lokalizovaný do cytoplasmy. Panel b: zpracovaný obrázek z panelu a, ukazující zvýšenou depolarizaci pozorované fluorescence v blízkosti buněčné membrány.
Příklady provedení vynálezu
Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní příklady provedení vynálezu doprovázené obrázky jsou uvedeny pro ilustraci výhodných provedení a nikoliv jako omezení rozsahu vynálezu.
-6CZ 302233 B6
Příklad 1
Zařízení pro získání strukturních a funkčních informací o proteinech na bázi fluorescenční polarizační mikroskopie.
Bylo zkonstruováno zařízení k provádění polarizační fluorescenční mikroskopie v principu odpovídající základnímu schématu na obr. 1. Zařízení ve své základní podobě obsahuje jako hlavní části modulátor P polarizace excitačního světelného svazku 1 emitovaného laserem L, synchronizovaný pomocí řídicí jednotky R prostřednictvím časovačích signálů 2, 4 se skenovacím fluorescenčním mikroskopem M.
Zařízení ukázané na obr. 2, je uspořádáno tak, že vytváří excitační laserový svazek I s lineární polarizací modulovanou v součinnosti se skenovacím mikroskopu M. Této vlastnosti bylo dosaženo použitím modulátoru polarizace P sestávajícího z Pockelsovy cely C (RTP-3-20-AR80G1000, Leysop Inc., Velká Británie) pod kontrolou vysokonapěťového driveru D (model B2, BME Bergmann GmbH, SRN). Driver D moduluje vysoké napětí 6 (0 až 1,2 kV) poskytované zdrojem vysokého napětí Z (model HV, BME Bergmann GmbH, SRN) v závislosti na nízkonapěťových TTL pulzech 5 generovaných generátorem pulzů G (model SP05, BME Bergmann GmbH, SRN). Synchronizace funkce modulátoru P polarizace s mikroskopem M (laserový skenovací mikroskop ÍMic, Till Photonics GmbH, SRN, vybavený dvoufotonovým laserem Chameleon Ultra II (Coherent Inc., Velká Británie) a fotonásobiěovými detektory fluorescence/druhé harmonické emise Hamamatsu) je zabezpečena řídicí jednotkou R (založenou na zpožďovací G02, BME Bergmann GmbH, SRN) prostřednictvím časovačích signálů 2, 4. Jako časovači signál je využit 8MHz taktovací signál poskytovaný akvizičním modulem mikroskopu (na bázi akviziční karty PCI—6111, National Instruments Inc., USA). Popisovaný polarizační modul je spouštěn nízkonapěťovým signálem vysílaným mikroskopem M při skenování každé z řádek obrázku. K nastavení frekvence změn polarizace excitačního svazku 1 je využívaná informace o trvání akvizice jednotlivého pixelu mikroskopem M poskytovaná softwarem ovládajícím mikroskop M. Mikroskopická data 3 obsahující zejména mikroskopické obrázky a doprovodné informace o době trvání akvizice jednotlivých pixelů, době prodlevy mezi jednotlivými řádkami, pozici vzorku a laserového svazku, excitační vlnové délce a intenzitě jsou zpracovávána řídicí jednotkou R. V tomto uspořádání Pockelsova cela C mění polarizaci excitačního laserového svazku 1 tak, že po sobě jdoucí pixely zobrazené mikroskopem M obsahují fluorescenci excitovanou různými polarizacemi excitačního svazku 1.
Funkce popsaného zařízení (obr. 2) k provádění polarizaci fluorescenční mikroskopie je ilustrována na obr. 3. Pro znázornění funkce zařízení byl do excitačního svazku 1 po průchodu polarizačním modulátorem P vložen polarizační beamsplitter B, který odráží světlo polarizované horizontálně mimo mikroskop M (obr. 3a). Polarizace excitačního svazku 1 byla střídavě horizontální a vertikální, s periodou 2,5 ps. Doba akvizice jednotlivého pixelu mikroskopem byla 0,25 ps. Obr. 3b představuje zobrazení homogenně fluorescentního předmětu (destičky z fluorescentně upraveného plastu) systémem popsaným na obr. 3a. Patrná je synchronizace změn polarizace laserového svazku 1 s frekvencí skenování mikroskopu M. Pokud by byly použity detektory fluorescence bez zpoždění a doznívání odpovědi, obrázek by obsahoval homogenně bílé a černé pruhy. Viditelné odstíny šedé jsou způsobené zpožděním a dozníváním odpovědi detektorů mikroskopu (tj. fluorescence excitovaná vertikálně polarizovaným laserovým svazkem je detektory reportována i během doby, kdy je laserový svazek polarizovaný horizontálně). Zpoždění a doznívání odpovědi detektorů je typické pro citlivé detektory na bázi fotonásobičů, které se často používají jako detektory fluorescence u mikroskopů.
-7CZ 302233 Β6
Příklad 2
Získání strukturních a funkčních informací o modifikovaném proteinu GFP na bázi fluorescenční polarizační mikroskopie užitím zařízení z příkladu 1
Zařízením podle příkladu 1 se získal obrázek, který obsahuje různé části (pixely) získané s různou polarizací excitačního laserového svazku, tzv. směsný obrázek. Tento směsný obrázek byl pak rozložen na jednotlivé obrázky získané s různými polarizacemi excitačního svazku způsobem, který je schematicky znázorněn na obr. 4. Výsledek je ilustrován na obr. 5. Při rozkládání směsného obrázku byla zohledněna zpožděná odezva detektorů a další faktory. Zohlednění se provádělo tak, že časový profil odezvy detektorů byl předem proměřen a bylo zjištěno, jaká percentuální část signálu (fluorescence) vybuzeného během doby excitace jednou polarizací je detektorem reportována během akvizice daného pixelu, a jaká část je reportována později. Při rozkládání směsného obrázku byla zohledněna zpožděná odezva detektorů a další faktory. Zohlednění se provádělo tak, že časový profil odezvy detektorů byl předem proměřen a bylo zjištěno, jaká procentuální část signálu (fluorescence) vybuzeného během doby excitace jednou polarizací je detektorem reportována během akvizice daného pixelu, a jaká část je reportována později. Při rozkládání směsného obrázku se potom spočítalo z intenzity prvního pixelu, jaké množství signálu s první polarizací excitace je obsaženo v následujících pixelech. Signál prvního pixelu byl potom o toto množství navýšen, zatímco signál dalších pixelu byl o příslušné množství snížen. Takto se postupovalo pixel po pixelu.
Směsný obrázek je demonstrován na obr. 5a, kde je buňka linie KEK293, do níž byl vložen gen kódující zelený fluorescentní protein (GFP) upravený tak, aby produkovaný protein byl připojen k buněčné membráně v dobře definované orientaci (doubly-lipidated.eGFP, připraven dr. Gero Miesenboeckem, Oxford University, Velká Británie). Tato buňka byla zobrazena dvoufotonovým laserovým skenovacím mikroskopem i Míc (Ti 11 Photonics GmbH, SRN), který byl vybaven výše popsaným prototypem zařízení podle vynálezu (obr. 2). V každém řádku obrázku byly liché pixely zaznamenány v době, kdy byl laserový excitační svazek polarizován vertikálně, sudé pixely byly zaznamenány v době, kdy byl laserový excitační svazek polarizován horizontálně. Polarizace laserového svazku se měnila s periodou 2,5 μβ.
V kroku 1 způsobu rozkládání směsného obrázku byl pro každou část obrázku identifikován signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního laserového svazku. Pokud by byla odezva detektorů fluorescence okamžitá, byl by signál (fluorescence) excitovaný vertikálně polarizovaným laserovým svazkem přítomen pouze v lichých pixelech každého řádku směsného obrázku. Odezva použitých detektorů (fotonásobičů) byla však obecně opožděná a doprovázená dozníváním, takže fluorescence produkovaná laserovým svazkem jedné polarizace produkovala odezvu detektorů i po změně polarizace excitačního svazku. Z měření odezvy detektorů použitých v tomto příkladu vyplynulo, že přibližně 31 % fluorescence excitované během akvizice jednoho pixelu bylo detektory reportováno během akvizice následujícího pixelu mikroskopem.
Pro identifikování signálu (fluorescence) excitované jednotlivými polarizacemi excitačního laserového svazku se postupovalo pro každý řádek směsného obrázku následovně. Hodnota intenzity prvního pixelu (např. 1000) byla zvýšena o 31 % (tj. o 310, na 1310). Hodnota druhého pixelu (např. 900) byla o tuto hodnotu snížena (na 590). Hodnota druhého pixelu byla následně zvýšena o 31 % (tj. o 183, na 773). Hodnota třetího pixelu (např. 1050) byla o tuto hodnotu snížena (tj. na 867), načež byla o 31 % zvýšena (tj. o 269, na 1136). Takto se postupovalo pixel po pixelu pro celý řádek směsného obrázku, a pro všechny řádky. Výsledkem je obrázek (viz obr. 5b), ve kterém v každém řádku liché pixely obsahují signál excitovaný vertikálně polarizovaným excitačním laserovým svazkem, a sudé pixely obsahují signál excitovaný horizontálně polarizovaným excitačním laserovým svazkem. Tímto způsobem byl identifikován (tj. kvantifikován a prostorově lokalizován) signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního svazku, což je obsahem kroku 1 způsobu rozkládání směsného obrázku.
- 8 CZ 302233 B6
V kroku 2 způsobu rozkládání směsného obrázku byl pro každou ze dvou použitých polarizací (vertikální a horizontální) excitačního laserového svazku vytvořen ze signálu excitovaného příslušnou polarizací excitačního svazku samostatný obrázek (obr. 5c), a to tak, že obrázek příslušející vertikální polarizaci excitačního svazku (obr. 5c, napravo) byl sestaven z lichých pixelů (obsahujících signál excitovaný vertikálně polarizovaným excitačním laserovým svazkem), a obrázek příslušející horizontální polarizaci excitačního svazku (obr. 5c, nalevo) byl sestaven ze sudých pixelů (obsahujících signál excitovaný horizontálně polarizovaným excitačním laserovým svazkem).
Obrázky takto získané byly využity k měření či sledování anisotropie pozorované fluorescence. Byl vypočten podíl mezi intenzitou fluorescence excitovanou jednou polarizací excitačního laserového svazku a intenzitou fluorescence excitovanou druhou polarizací excitačního laserového svazku. Tento výpočet byl proveden tak, že pro každou pozici pozorovaného vzorku, intenzita fluorescence excitované s vertikální polarizací laserového svazku byla vydělena intenzitou fluorescence excitovanou s horizontální polarizací laserového svazku, a hodnoty logaritmu tohoto podílu byly prezentovány ve formě obrázku, kde odstín šedé vyjadřuje velikost tohoto logaritmu (obr. 5d). Převaha světlých odstínů v částech obrysu buňky orientovaných horizontálně a převaha tmavých odstínů v částech buňky orientovaných vertikálně (nebo naopak) znamenají přítomnost anisotropie v absorpci fluoroforu. Přítomnost a velikost této anisotropie pak vypovídá o orientaci fluoroforu vůči buněčným strukturám, jako je např. buněčná membrána, a lze ji využít ke sledování biologických procesů.
Výhodně lze zobrazení také provádět tak, že pro každou pozici pozorovaného vzorku je logaritmus podílu intenzit fluorescence excitovaných jednotlivými polarizacemi laserového svazku prezentován ve formě obrázku, kde velikost tohoto logaritmu určuje barvu na barevné škále (např. červená-žlutá-zelená) a celková intenzita naměřené fluorescence určuje jas. Převaha jedné barvy v horizontálně orientovaných částech obrysu buňky a převaha druhé barvy ve vertikálně orientovaných částech obrysu buňky pak znamenají přítomnost anisotropie v absorpci fluoroforem.
Příklad 3
Sledování a určování struktury proteinů
Způsob dvou fotonové polarizační mikroskopie a zařízení podle vynálezu byly využity pro určování a sledování struktury G-proteinů, struktury proteinu citlivého na koncentraci vápníkových iontů, proteinu citlivého na membránové napětí, receptorových proteinů a proteinu navázaném na cytoskelet (Obr. 6).
Příklad 3a - struktura G-proteinů
G-proteiny typicky sestávají ze tří podjednotek, Ga, Gfl, a Gy, které spolu v živých buňkách mohou interagovat. Funkci G-proteinů je přenos a zesílení signálů z různých receptorových proteinů. Schopnost opticky přímo sledovat aktivaci G-proteinů způsobenou aktivací daného receptorového proteinu je využitelná pro lepší porozumění mechanismům buněčné signalizace, ale také pro objevování farmakologicky aktivních látek působících na G-proteiny nebo na receptorové proteiny s nimi spřažené.
Pozorování na podjednotkách GaÍ2-CFP, Gpl a Gy2G ukázala, že kyanový fluorescentní protein (CFP) připojený k podjednotce Gai2 nevykazuje pozorovatelnou fluorescenční anisotropii, pokud je tato podjednotka exprimována v savčích buňkách bez exprimace obou zbývajících podjednotek, Gpl a Gy2 (obr. 6a). Nejpravděpodobnějším vysvětlením nepřítomnosti anisotropie je
-9CZ 302233 B6 neuspořádaná orientace přítomných molekul CFP. Tato může být způsobena neuspořádanou orientací samotné Ga podjednotky.
Pokud jsou vsak všechny tři podjednotky (Gai2-CFP, Gpi a Gy2) exprimovány v jedné buňce současně, fluorescence CFP vykazuje pozorovatelnou anisotropii (obr. 6b), která se v obrázcích zpracovaných obdobně jako obr. 5 projevila jako převaha tmavých odstínů ve vertikálně orientovaných částech obrysu buňky a převaha světlých odstínů v horizontálně orientovaných částech obrysu buňky. Tato převaha fluorescence excitované horizontálně polarizovaným světlem oproti fluorescenci excitované vertikálně polarizovaným světlem ve vertikálně orientovaných částech io obrysu buňky (a naopak) ukazuje, že dipolový moment excitace fluoroforu (přibližně shodný s dlouhou osou fluoroforu) je v živých buňkách orientován přibližně rovnoběžně s buněčnou membránou.
Popsaným způsobem dvou fotonové polarizační mikroskopie tedy bylo zjištěno, že v nepřítomi5 nosti podjednotek Gp a Gy je orientace fluorescentního proteinu připojeného k Gai2 pravděpodobně neuspořádaná. V přítomnosti podjednotek ϋβΐ a Gy2 je orientace fluorescentního proteinu naopak do značné míry uspořádaná, a to tak, že dlouhá osa fluoroforu je přibližně rovnoběžná s buněčnou membránou. Způsob podle vynálezu tak umožnil pozorovat interakci mezi Gai2CFP, Οβί a Gy2, a dedukovat informace o struktuře proteinů v živých buňkách. Popsaným zo způsobem lze také monitorovat exprimování podjednotek Οβί a Gy2, které nejsou fluorescentně značené, ale jejichž současná přítomnost se projeví pozorovatelnou anisotropii fluorescence CFP konstruktu Gai2-CFP. Popsaným způsobem lze i sledovat změny ve struktuře a interakcích mezi jednotlivými podjednotkami, které jsou způsobeny aktivací/inaktivací, tj. funkcí sledovaného Gproteinu (viz příklad 4).
Příklad 3b - struktura proteinu citlivého na vápníkové ionty
Cytoplazmatická koncentrace vápníkových iontů je jednou z nejdůležitějších známek aktivace různých buněčných signálních kaskád. Ke sledování koncentrace vápníkových iontů bylo vyvinuto množství sond na bázi fluorescentních proteinů. Jednou z nich je i lynD3cpV. Tato sonda funguje na základě FRET mezi cyanovým fluorescentním proteinem, jenž je připojen k buněčné membráně, a žlutým fluorescentním proteinem (circularly peremuted Venus', cpV). Oba fluorescentní proteiny jsou navzájem spojeny doménou citlivou na koncentraci vápníkových iontů. Při změně koncentrace vápníkových iontů dochází ke strukturním změnám v této doméně, jež se projeví změnami vzájemné orientace fluorescentních proteinů, a tím i ve změnách FRET.
Způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu bylo zjištěno, že cyanový fluorescentní protein je v klidovém stavu připojen k buněčné membráně tak, že dlouhá osa fluoroforu je přibližně rovnoběžně s membránou (obr. 6c). Žlutý fluorescentní protein nejeví pozorovatelnou anisotropickou absorpcí (obr. 6d), a je tudíž v klidovém stavu pravděpodobně v neuspořádané orientaci. Změny koncentrací vápníkových iontů se projeví změnami orientací těchto fluorescentních proteinů, které jsou pozorovatelné popsaným způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie.
Příklad 3c - struktura proteinu citlivého na membránové napětí
Vzruchy jsou v nervových buňkách přenášeny prostřednictvím změn elektrického napětí na so buněčné membráně. K optickému sledování změn napětí bylo vyvinuto několik různých sond na bázi fluorescentních proteinů. Jedním žních je i konstrukt VSFP3.1 vyvinutý T. Knopfelem (RIKEN Institut, Japonsko). VSFP3.1 obsahuje cyanový fluorescentní protein, jehož orientace se při změně membránového napětí změní. Popsaným způsobem dvoufotonové fluorescenční mikroskopie bylo zjištěno, že fluorescentní protein v konstruktu VSFP3.1 je v klidovém stavu
- 10CZ 302233 B6 v buňkách orientován tak, že dlouhá osa fluoroforu je orientována přibližně rovnoběžně s buněčnou membránou (obr. 6e). Změny membránového napětí se projeví změnami struktury VSFP3.1, které jsou pozorovatelné způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu.
Příklad 3d - struktura receptorových proteinů
Vlastnosti extracelulámího prostředí, včetně přítomnosti molekulárních signálů vysílaných jinými buňkami, jsou v buňce detekovány prostřednictvím membránových receptorových proteinů, io Tyto proteiny reagují na přítomnost příslušné látky ve vnějším prostředí konformační změnou, která se projeví na vnitřní straně cytoplazmatické membrány. Existuje velké množství konstruktů skládajících se z receptorového proteinu označeného fluorescentním proteinem, např. metabotropní glutamátový receptor mGluRl-GFP, ct2-adrenergní receptor-CFP, a2-adenosinový receptor-YFP. Popsaným způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie bylo zjištěno (obr. 6f až 6h), že fluorofor GFP v mGluRl-GFP je orientován téměř rovnoběžně s buněčnou membránou; fluorofor CFP v a2-adrenergním receptoru-CFP je také přibližně rovnoběžný s buněčnou membránou, ale ne do takové míry jako GFP v mGluRl-GFP. Fluorofor v a2-adenosinovém receptoru-YFP je přibližně kolmý k buněčné membráně. Aktivace těchto, ale i dalších receptorových proteinů se projeví konfonmačními změnami, které jsou, při změnách orientace fluores20 centních proteinů, pozorovatelné způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu.
Příklad 3e - struktura cytoskeletálních proteinů
Sledování strukturních vlastností proteinů způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu není omezeno jen na membránové proteiny, ale lze je provádět i u proteinů navázaných na jinou podporu, např. na cytoskeleton. Pozorování provedené popsaným způsobem na zeleném fluorescentním proteinu připojeným prostřednictvím peptidového linkeru k proteinu tau, jenž je přirozenou součástí mikrotubulů, ukázalo (obr. 6i), že dlouhá osa fluoroforu tohoto zeleného fluorescentního proteinu je orientována přibližně rovnoběžně k orientaci mikrotubulů.
Příklad 4
Sledování funkce proteinů prostřednictvím sledování změn anisotropie.
Funkce proteinů v živých buňkách je často doprovázena změnami ve struktuře proteinů v interakcích s jinými proteiny, či změnami v buněčné lokalizaci proteinů. Všechny tyto druhy změn se mohou projevit změnami pozorovatelných an i sotrop ických vlastností fluorescentních značek, jimiž jsou tyto proteiny označeny. Tudíž popsaný způsob získávání strukturních informací pomocí polarizační fluorescenční mikroskopie lze využít i ke sledování funkce proteinů. Toto je ukázáno na příkladu sledování funkce G-proteinů a funkce proteinové kinázy C (PKC).
Příklad 4a — sledování funkce G—proteinu během aktivace noradrenalinem
Dle současného stavu poznání existují v buňce v klidovém stavu G-proteiny typicky jako komplexy sestávající ze tří podjednotek (Ga, Gp a Gy). Po aktivaci receptoru, který s G-proteiny interaguje, agonistoii dochází k disociaci či reorientaci podjednotek G-proteinů. Po ukončení aktivace dochází k opětovné formací trimemího komplexu podjednotek. S tím souhlasí výsledky v příkladu 3a, kdy bylo popsaným způsobem dvoufotonové polarizační mikroskopie zjištěno, že v nepřítomnosti interakcí s podjednotkami Ωβ a Gy je orientace fluorescentního proteinu připojeného k Gai2 pravděpodobně neuspořádaná. V přítomnosti interakcí s podjednotkami Gpl a Gy2 je orientace tohoto fluoreseentního proteinu připojeného k podjednotce Gai2 naopak do značné míry uspořádaná, a to tak, že dlouhá osa fluoroforu je přibližně rovnoběžná s buněčnou membránou,
Velikost pozorované anisotropie absorpce tedy vypovídá o interakcí podjednotky GaÍ2 s podjednotkami Gpl a Gy2, a tím i o funkci těchto G-proteinů. Na obr. 7 je ilustrována schopnost způsobu podle vynálezu vizualizovat existenci trimerního komplexu Gcti2-CFP, ΰβΐ a Gy2 před aktivací přítomných receptorů (obr. 7a), disociaci či reorganizaci tohoto komplexu způsobenou aktivací přítomných adrenergních receptorů noradrena línem (obr. 7b), a opětovnou formaci in tohoto komplexu po vymytí noradrenalinu (obr. 7c), tj. změny funkčního stavu pozorovaného G— proteinu.
Příklad 4b - sledování aktivace enzymu
Enzymy v buňkách katalyzují chemické reakce. Příkladem enzymů jsou tzv. kinázy, jež v buňce katalyzují fosforylační reakce. Zástupcem kináz je proteinová kináza C (PKC). Tato kináza je v klidovém stavu přítomna v cytoplasmě buňky. Po aktivaci prostřednictvím různých signálních kaskád dochází k přesunu PKC k buněčné membráně a její aktivaci. Schopnost popsaného
2o způsobu dvou fotonové polarizační mikroskopie pozorovat aktivaci konstruktu PKC označeného červeným fluorescentním proteinem (RFP) je ilustrována na obr. 7. V klidovém stavuje PKC lokalizována převážně v cytoplazmě, orientace jejích molekul je náhodná, a anisotropie dvoufotonové absorpce není pozorovatelná (obr. 7d). Po aktivaci zvýšením teploty dochází k přesunu PKC k buněčné membráně, a tím i k omezení přítomných orientací RFP a k projevení anisotropie (obr. 7e). V aktivovaném stavu PKC-RFP je dlouhá osa fluoroforu orientována přibližně kolmo k buněčné membráně. Způsob dvoufotonové polarizační mikroskopie podle vynálezu tak umožňuje sledování funkce PKC.
to Příklad 5
Sledování anisotropie fluorescence jako reportéru interakcí fluorescentně značeného cytoplazmatického proteinu sjinými molekulami
Způsob polarizační mikroskopie a zařízení podle vynálezu byly použity ke sledování anisotropie emitované fluorescence cytoplazmatického žlutého fluoreseentního proteinu (YFP) exprimovaného v buněčné linii HEK293 (obr. 8). Experimentální uspořádání bylo jako na obr. 2, avšak před detektor fluorescence byl vložen polarizátor, orientovaný horizontálně. Polarizace excitačního svazku byla mezi akvizicí po sobě jdoucích pixelů alternována mezi horizontální a vertikální, což vedlo k přítomnosti alternujících světlejších a tmavších sloupců ve směsném obrázku získaném mikroskopem (obr. 8a). Tento směsný obrázek byl pak zpracován obdobně jako v příkladech 2 a 3, a výsledek zobrazen tak, že tmavé odstíny odpovídají nižšímu stupni polarizace detekované fluorescence a světlé odstíny odpovídají vyššímu stupni polarizace detekované fluorescence (obr. 8b). Stupeň polarizace emitované fluorescence závisí na době života excitovaného stavu fluorofo45 ru (a tím i na prostředí v blízkosti fluoroforu), na rychlosti rotace fluorescentní molekuly (a tím i na její velikosti či interakcích sjinými molekulami) a na dalších jevech jako je homomolekulární FRET či omezení volné rotace. Pozorovaný nižší stupeň polarizace (tj. vyšší depoíarizace) detekované fluorescence v blízkosti buněčné membrány ukazuje na odlišné prostředí v blízkosti buněčné membrány a na přítomnost interakcí fluoreseentního proteinu s molekulami nacházej ící50 mi se v buněčné membráně nebo v její bezprostřední blízkosti.
Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým provedením vynálezu, která jsou zde popsána. I tyto ekvivalenty spadají do rozsahu následujících patentových nároků.
Claims (22)
1. Způsob získání strukturních a funkčních informací o proteinu na bázi polarizační fluorescenční mikroskopie, kdy se
I) ke sledovanému proteinu naváže fluorofor, vyznačující se tím, že
II) sledovaný protein s navázaným fluoroforem se podrobí dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescenční mikroskopii, kdy se zkoumaný protein s fluoroforem ozáří laserovým svazkem, jehož světlo je polarizované při alespoň dvou různých polarizacích, a který excituje fluorescenci fluoroforu,
IÍI) získá se informace o lokalizaci, intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku,
IV) informace o lokalizaci, intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku se užije ke zjištění lokalizace anisotropie absorpce a/nebo fluorescence, a
V) lokalizace anisotropie absorpce a/nebo fluorescence se užije ke zjištění strukturních a funkčních a vlastností sledovaného proteinu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že informace o lokalizaci a intenzitách fluorescence excitovaných různými polarizacemi excitačního laserového svazku se získá ve formě směsného obrázku, který obsahuje v různých svých částech intenzity fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že zpracovávání směsného obrázku zahrnuje kroky, kdy
a) pro každou část směsného obrázku se identifikuje signál excitovaný jednotlivými polarizacemi excitačního svazku, a
b) pro každou z použitých polarizací excitačního laserového svazku se sestaví samostatný obrázek obsahující signál excitovaný příslušnou polarizací.
4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že různé části směsného obrázku obsahující intenzity fluorescence excitované různými polarizacemi excitačního laserového svazku jsou pixely.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, žesekexcitaci použije laserový svazek, jehož světlo je polarizované při dvou různých polarizacích.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, žesek excitaci použije laserový svazek, jehož světlo je polarizované při dvou vzájemně kolmých polarizacích.
7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že směsný obrázek obsahuje v lichých pixelech intenzity fluorescence excitované při první ze dvou užitých polarizací a v sudých pixelech obsahuje intenzity fluorescence excitované při druhé ze dvou užitých polarizací.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5až7, vyznačující se tím, že se anisotropie fluorescence pro různé pixely stanoví tak, že se vypočte podíl mezi intenzitou fluorescence exci- 13 CZ 302233 B6 tovanou jednou polarizací excitačního laserového svazku a intenzitou fluorescence excitovanou druhou polarizací excitačního laserového svazku.
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároku I až 8, vyznačující se tím, že sledovaný 5 protein je membránový protein.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že sledovaný protein je G-protein.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že sledovaný protein je protein io citlivý na koncentraci vápníkových iontů.
12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že sledovaný protein je protein citlivý na membránové napětí.
15
13. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že sledovaný protein je receptorový protein.
14. Způsob podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se t í m , že sledovaný protein je enzym.
2o
15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že sledovaný protein je cytoplazmatický protein.
16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že sledovaný protein je protein připojený k cytoskeletu,
17. Zařízení ve formě doplňkového zařízení pro fluorescenční mikroskop (M), pro získání strukturních a funkčních informací o proteinu způsobem podle kteréhokoliv z nároků I až 16, vyznačující se tím, že obsahuje modulátor (P) pro rychlou modulaci polarizace excitačního svazku (1) pro vyvolání dvoufotonové nebo vícefotonové fluorescence a řídicí jednotku (R), přičemž modulátor (P), řídicí jednotka (R) a mikroskop (M) jsou synchronně propojeny tak, že informace o intenzitě a/nebo polarizaci fluorescence zaznamenávaná mikroskopem (M) je přiřaditelná k různým polarizačním stavům excitačního svazku (1) na základě časového profilu použité modulace polarizace excitačního svazku (1) vyvolané modulátorem (P).
35
18. Zařízení podle nároku 17, vyznačující se tím, že obsahuje polarizátor vložený před detektor fluorescence v mikroskopu (M),
19. Zařízení podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že modulátor (P) obsahuje Pockelsovu celu (C) řízenou vysokonapěťovým driverem (D) pro modulaci vysokého napětí
40 (6) poskytovaného zdrojem (Z) vysokého napětí v závislosti na nízkonapěťových pulzech (5) generovaných generátorem (G) nízkonapěťových pulzů.
20. Zařízení podle nároků 17 až 19, vyznačující se tím, že řídicí jednotka (R), modulátor (P) polarizace a fluorescenční mikroskop (M) jsou synchronně propojeny prostrednict45 vím taktovacího signálu (2) akvizičního zařízení mikroskopu (M),
21. Zařízení podle nároku 20, vyznačující se tím, že řídicí jednotka (R) je ve formě počítače a obsahuje implementovaný program k automatizovanému provádění alespoň jednoho kroku způsobu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16.
22. Zařízení podle nároku 21, vyznačující se tím, že řídicí jednotka (R) ve formě počítače obsahuje implementovaný program k provádění způsobu podle nároku 8.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090706A CZ2009706A3 (cs) | 2009-10-27 | 2009-10-27 | Zpusob získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie a zarízení k provádení tohoto zpusobu |
| US13/504,112 US8722358B2 (en) | 2009-10-27 | 2010-10-27 | Method for obtaining structural and functional information on proteins, based on polarization fluorescence microscopy |
| EP10801109.9A EP2494335B1 (en) | 2009-10-27 | 2010-10-27 | A method for obtaining structural and functional information on proteins, based on polarization fluorescence microscopy |
| PCT/CZ2010/000111 WO2011050760A1 (en) | 2009-10-27 | 2010-10-27 | A method for obtaining structural and functional information on proteins, based on polarization fluorescence microscopy, and a device implementing said method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20090706A CZ2009706A3 (cs) | 2009-10-27 | 2009-10-27 | Zpusob získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie a zarízení k provádení tohoto zpusobu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ302233B6 true CZ302233B6 (cs) | 2011-01-05 |
| CZ2009706A3 CZ2009706A3 (cs) | 2011-01-05 |
Family
ID=43410319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20090706A CZ2009706A3 (cs) | 2009-10-27 | 2009-10-27 | Zpusob získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie a zarízení k provádení tohoto zpusobu |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8722358B2 (cs) |
| EP (1) | EP2494335B1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2009706A3 (cs) |
| WO (1) | WO2011050760A1 (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110632750B (zh) * | 2019-08-30 | 2024-01-12 | 北京临近空间飞行器系统工程研究所 | 荧光显微光学系统和荧光染色细胞扫描及分析系统 |
| CN114216887B (zh) * | 2021-12-02 | 2023-11-28 | 南昌大学 | 偏振调制提高受激发射损耗显微系统分辨率的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5952192A (en) * | 1998-01-07 | 1999-09-14 | Western Michigan University | Method of fluorescent analysis of biological sample utilizing biebrich scarlet |
| JP2006098386A (ja) * | 2004-08-31 | 2006-04-13 | National Univ Corp Shizuoka Univ | 散乱光検出方法、偏光変調装置及び走査型プローブ顕微鏡 |
| EP2053381A2 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-29 | Sony Corporation | Optical detection method and optical detection apparatus for a fine particle |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5457536A (en) * | 1994-04-04 | 1995-10-10 | California Institute Of Technology | Polarization modulation laser scanning microscopy |
| EP2801624B1 (en) * | 2001-03-16 | 2019-03-06 | Singular Bio, Inc | Arrays and methods of use |
| US7864380B2 (en) * | 2001-03-19 | 2011-01-04 | Dmetrix, Inc. | Slide-borne imaging instructions |
| US20050031605A1 (en) * | 2003-02-03 | 2005-02-10 | Bunn Howard F. | Compositions and methods of treating diabetes |
| US20050009109A1 (en) * | 2003-07-08 | 2005-01-13 | Stanford University | Fluorophore compounds and their use in biological systems |
| JP5189301B2 (ja) * | 2007-03-12 | 2013-04-24 | オリンパス株式会社 | レーザー走査型顕微鏡 |
| WO2009047760A2 (en) * | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Anima Cell Metrology, Inc. | Systems and methods for measuring translation activity in viable cells |
-
2009
- 2009-10-27 CZ CZ20090706A patent/CZ2009706A3/cs not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-10-27 US US13/504,112 patent/US8722358B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-10-27 WO PCT/CZ2010/000111 patent/WO2011050760A1/en active Application Filing
- 2010-10-27 EP EP10801109.9A patent/EP2494335B1/en not_active Not-in-force
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5952192A (en) * | 1998-01-07 | 1999-09-14 | Western Michigan University | Method of fluorescent analysis of biological sample utilizing biebrich scarlet |
| JP2006098386A (ja) * | 2004-08-31 | 2006-04-13 | National Univ Corp Shizuoka Univ | 散乱光検出方法、偏光変調装置及び走査型プローブ顕微鏡 |
| EP2053381A2 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-29 | Sony Corporation | Optical detection method and optical detection apparatus for a fine particle |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2011050760A1 (en) | 2011-05-05 |
| US8722358B2 (en) | 2014-05-13 |
| EP2494335A1 (en) | 2012-09-05 |
| EP2494335B1 (en) | 2017-05-24 |
| CZ2009706A3 (cs) | 2011-01-05 |
| US20120219983A1 (en) | 2012-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Scarselli et al. | Revealing G‐protein‐coupled receptor oligomerization at the single‐molecule level through a nanoscopic lens: methods, dynamics and biological function | |
| Festy et al. | Imaging proteins in vivo using fluorescence lifetime microscopy | |
| Levitt et al. | Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology | |
| van der Linden et al. | A turquoise fluorescence lifetime-based biosensor for quantitative imaging of intracellular calcium | |
| Lazar et al. | Two-photon polarization microscopy reveals protein structure and function | |
| van Unen et al. | A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells | |
| Ma et al. | A FRET sensor enables quantitative measurements of membrane charges in live cells | |
| Whelan et al. | Super-resolution single-molecule localization microscopy: tricks of the trade | |
| Reshetniak et al. | A comparative analysis of the mobility of 45 proteins in the synaptic bouton | |
| Millington et al. | High-precision FLIM–FRET in fixed and living cells reveals heterogeneity in a simple CFP–YFP fusion protein | |
| Huang et al. | Effect of receptor dimerization on membrane lipid raft structure continuously quantified on single cells by camera based fluorescence correlation spectroscopy | |
| Billaudeau et al. | Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy | |
| Suhling et al. | Time-resolved fluorescence anisotropy imaging | |
| Brameshuber et al. | Detection and quantification of biomolecular association in living cells using single-molecule microscopy | |
| Hummert et al. | An update on molecular counting in fluorescence microscopy | |
| Haasen et al. | G protein‐coupled receptor internalization assays in the high‐content screening format | |
| CZ302233B6 (cs) | Zpusob získání strukturních a funkcních informací o proteinech na bázi polarizacní fluorescencní mikroskopie a zarízení k provádení tohoto zpusobu | |
| Petazzi et al. | Fluorescence microscopy methods for the study of protein oligomerization | |
| Heikal | Time-resolved fluorescence anisotropy and fluctuation correlation analysis of major histocompatibility complex class I proteins in fibroblast cells | |
| Li et al. | Probing rotation dynamics of biomolecules using polarization based fluorescence microscopy | |
| Nawara et al. | Imaging nanoscale axial dynamics at the basal plasma membrane | |
| Evans et al. | Imaging neuronal signal transduction using multiphoton FRET-FLIM | |
| EP4184168A1 (en) | Probe and method for detecting membrane-associated molecules in living cells | |
| Bartels et al. | A Minimal Model of CD95 Signal Initiation Revealed by Advanced Super-resolution and Multiparametric Fluorescence Microscopy | |
| van Zanten et al. | Quantitative fluorescence emission anisotropy microscopy for implementing homo-FRET measurements in living cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20201027 |