ES2309835T3 - Formacion de imagenes de señales fluorescentes utilizando opticas telecentricas de excitacion y de imagen. - Google Patents
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Abstract
Sistema para la formación de imágenes de señales fluorescentes de muestras múltiples incluyendo: un soporte plano (2) que incluye un conjunto de muestras múltiples individuales; por lo menos una fuente de luz (4) que emite luz que incluye por lo menos una frecuencia de excitación; un transductor (5) colocado para recibir las señales fluorescentes que proceden de las mencionadas señales fluorescentes, las que se ha adaptado el transductor para que produzca datos básicos computerizables; una trayectoria de haz de luz desde la mencionada fuente de luz (4) hasta el mencionado transductor (5) que se caracteriza por una excitación telecéntrica del mencionado conjunto de múltiples muestras individuales y por una formación de imagen telecéntrica de las mencionadas señales fluorescentes que se generan en cada muestra individual del mencionado conjunto de múltiples muestras individuales.
Description
Formación de imágenes de señales fluorescentes
utilizando ópticas telecéntricas de excitación y de imagen.
El presente invento hace referencia al campo del
análisis de ADN. En particular, el presente invento se dirige a un
dispositivo para la formación de imágenes paralelas de intensidades
fluorescentes en múltiples puntos.
Los profesionales del sector conocen varias
aplicaciones de las técnicas de la fluorescencia para analizar
muestras biológicas. En el caso de las técnicas electroforéticas se
identifican las proteínas o el ADN con una sonda fluorescente con
la que visualizan sus bandas electroforéticas en geles o columnas.
Además, la mayoría de las aplicaciones de biochips hasta ahora se
basan en una lectura de la fluorescencia, controlando la ligazón
específica de una molécula objetivo, referenciada por su
fluorescencia con una molécula sonda inmovilizada sobre un soporte
sólido. Las aplicaciones para analizar el ADN en fase líquida
incluyen sondas con fluorescencia como las sondas híbridas de
fijación de ADN de doble cadena SybrGreen l o FRET (Fluorescencia
por Transferencia de Energía de Resonancia) que utilizan dos sondas
fluorescentes y la transferencia energética. Una aplicación muy
importante de las técnicas de fluorescencia en fase líquida es la
denominada PCR en tiempo real.
En todos estos casos, se requiere un dispositivo
de lectura de fluorescencia que suministre la luz de una
determinada longitud de onda para excitar la marca de fluorescencia
de la muestra y que sea capaz de detectar la luz fluorescente de
esa marca emitida a una longitud de onda diferente. Un problema
importante de todos los dispositivos de lectura de fluorescencia es
la intensidad enorme de la luz de excitación comparada con la
intensidad de la fluorescencia emitida por el tinte, por lo que hay
que asegurarse que el haz de iluminación no incide en el detector
para poder controlar las señales fluorescentes de forma precisa. En
otras palabras, la trayectoria óptica de la luz de excitación tiene
que ser distinta, por lo menos parcialmente, de la trayectoria
óptica de la luz fluorescente.
Es sencillo conseguir el principio de la
fluorescencia cuando hay que controlar solamente una sonda
fluorescente en la fase líquida, por ejemplo, en un capilar. Ahí,
por ejemplo, una fuente de luz blanca junto a un juego de espejos
dicroicos y filtros es suficiente para cumplir los requisitos. Sin
embargo, cuando haya más de una lámina fluorescente en la muestra,
es necesario controlar la distribución lateral de puntos sobre un
soporte sólido, o bien la fluorescencia de una microplaca, siendo
más difícil cumplir los requisitos del dispositivo de lectura de
fluorescencia.
En principio, existen dos estrategias distintas
para excitar y controlar la fluorescencia de una distribución de
emplazamientos lateral. La primera estrategia consiste en escanear
la distribución de emplazamientos lateral, analizando por lo tanto
satisfactoriamente los emplazamientos individuales de uno en uno. La
segunda estrategia consiste en iluminar toda la distribución de
emplazamientos simultáneamente y conseguir las fluorescencias
correspondientes, por ejemplo, en un chip CCD. La estrategia del
escaneo presenta el inconveniente obvio de que, o bien hay que
desplazar el soporte en dos dimensiones
(WO-03/069.391, DE-10.200.499) o
bien hay que desplazar el detector respecto al soporte
(US-2002/159.057). Por otra parte, la principal
dificultad de la estratega de iluminar todo el soporte
simultáneamente es la de poder garantizar una iluminación homogénea
en toda la distribución de emplazamientos. Una alternativa de la
iluminación homogénea de toda la distribución de emplazamientos es
utilizar un conjunto de fuentes de luz, de forma que cada
emplazamiento se ilumine con su propia fuente de luz. La
DE-10.131.687 describe esta estrategia para evaluar
la PCR con un secuenciador térmico, con varios pocillos que
utilizan un separador de haces de luz y un conjunto de LED para la
iluminación. DE-10.155.142 describe el control de
un campo oscuro de señales fluorescentes, de forma que el micro
conjunto se ilumina con un grupo de LED, también, pero sin
necesitarse en esta disposición ningún separador del haz de
luz.
Respecto a los requisitos necesarios para
separar la trayectoria óptica del haz de luz de excitación y de la
luz fluorescente, al menos parcialmente, existen a su vez dos
posibilidades distintas. La primera posibilidad es la denominada
epi-iluminación, en la que se utilizan separadores
de haces de luz y el haz de luz de iluminación fluorescente
comparte al menos parcialmente la cadena óptica. La segunda
posibilidad consiste en utilizar una iluminación oblicua. En este
caso, el haz de luz de iluminación se dispone de manera que forme un
determinado ángulo respecto a la perpendicular a la superficie de
soporte, quedando la correspondiente reflexión del haz de luz de
excitación fuera del ángulo de admisión del sistema de detección
(ver US-2002/0.005.493-A1,
EP-1.275.954-A2).
La patente
US-203/0.011.772-A1 describe un
dispositivo óptico para la observación simultánea de múltiples
tintes fluorescentes en una sonda que utiliza un separador del haz
de luz. DE-19.748.211 A1 revela un sistema para
controlar las señales fluorescentes generadas en los pocillos de una
microplaca simultáneamente, empleando un separador de haz de luz,
una lente de campo y un conjunto de lentes que dirigen la luz al
interior de cada pocillo. La detección se lleva a cabo mostrando la
imagen de la luz en un grupo de fotodiodos o en un chip CCD. La luz
fluorescente que se recoge en esta disposición del sistema viene
determinada por la cantidad de tintes excitados por el cono de luz
de las lentes de enfoque y en consecuencia, depende del nivel de
llenado del pocillo. WO- 99/60.381 reivindica un instrumento para
controlar reacciones PCR simultáneamente en varios viales de un
bloque con secuencia de temperaturas. Los componentes ópticos de
este instrumento incluyen una vez más un separador de haz de luz,
una lente de campo, un conjunto de lentes de vial que dirigen cada
haz de luz al interior de cada vial, y un sistema de detección que
dirige la luz emitida a un detector por ejemplo CCD. Debido a la
necesidad de tener un conjunto de lentes de viales, el tamaño y
densidad de los emplazamientos individuales resulta limitado. La
JP-2002/014.044 describe un dispositivo medidor de
fluorescencia para controlar la fluorescencia que se genera en
múltiples pocillos. Los componentes ópticos incluyen un separador de
haz de luz y un sistema de lentes que ilumina colectivamente los
pocillos con luz paralela a la dirección de la profundidad de los
pocillos. No obstante, la imagen que forma el sistema óptico
condensa la luz en un sistema de detección. La patente
US-6.498.690-B1 revela un método
para obtener imágenes de muestras con un objetivo que incluye una
lente telecéntrica. La
US-6.246.525-B1 reivindica un
dispositivo de formación de imágenes para formarlas en un soporte
de muestra que incluye una lente de Fresnel.
La patente
EP-0.987.540-A revela un dispositivo
de formación de imágenes de muestras fluorescentes que incluye una
unidad de formación de imágenes con un grupo de lentes
telecéntricas. EP-1.406.082-A
describe un lector de fluorescencia con iluminación
telecéntrica.
En consecuencia, el objeto del presente invento
consiste en suministrar un dispositivo mejorado para el control
simultáneo de señales fluorescentes en una distribución lateral de
emplazamientos, optimizando la trayectoria óptica hacia una
iluminación homogénea y una detección de precisión. En uno de los
aspectos del presente invento, el problema que debe resolverse se
refiere a la mejora del control de la PCR multiplex en tiempo real
en un formato de microplaca.
En consecuencia, el invento hace referencia a un
instrumento óptico para obtener imágenes de la fluorescencia de un
conjunto de múltiples emplazamientos individuales, incluyendo una
excitación en toda la zona de montaje, así como una imagen precisa
de las correspondientes señales fluorescentes.
Más exactamente, el invento hace referencia a un
instrumento óptico para analizar simultáneamente una multitud de
amplificaciones de la PCR que se producen en los pocillos de una
microplaca en tiempo real, o bien obtener la imagen de la
intensidad de fluorescencia de un microhaz como medición de las
interacciones del objetivo/sonda específico.
En el contexto del presente invento, un conjunto
de múltiples emplazamientos individuales resume los objetos que se
componen de dos o más emplazamientos, separados en el espacio y
distribuidos lateralmente. Los emplazamientos pueden ser, por
ejemplo, pocillos de una microplaca o superficies con funciones de
un portaobjetos de vidrio. En la mayoría de los casos, el conjunto
de múltiples emplazamientos individuales se dispone uniformemente y
cada emplazamiento tiene un contenido distinto con el fin de
conseguir análisis multiplex. Dentro del ámbito del presente
invento, el soporte plano del conjunto está en fase sólida planar.
En el caso de un microhaz, el soporte plano del conjunto es la
superficie de esta fase sólida planar en la que se disponen los
distintos emplazamientos. En el caso de una microplaca, el soporte
plano del conjunto es el plano donde se disponen las aberturas de
los pocillos. El soporte plano del conjunto se fija por un medio de
sujeción para estabilizar la posición de cada emplazamiento
individual en la posición deseada dentro de la trayectoria
óptica.
Dentro del ámbito del presente invento, la
expresión fuente de luz (LS) incluye cualquier elemento iluminador
que emita luz en una sola frecuencia o con múltiples frecuencias
distintas. La fuente de luz puede ser, además, una disposición de
más de uno de esos elementos iluminadores.
En el contexto del presente invento, un
transductor (Det) es un dispositivo capaz de convertir luz visible
en señales eléctricas que pueden ser procesadas por un ordenador,
por ejemplo un chip CCD.
Dentro del ámbito del presente invento, un
elemento de óptica telecéntrica es un elemento óptico que tiene una
abertura muy pequeña y que, en consecuencia, ofrece una profundidad
de campo elevada. En otras palabras, la luz telecéntrica de un
elemento de óptica telecéntrica es casi paralela a los rayos
maestros en todos los puntos del objeto que sean paralelos a al eje
óptico del espacio del objeto y/o imagen. En consecuencia, la
calidad de la óptica de excitación o la óptica de imagen cuando se
emplea la telecentricidad en el espacio del objeto es insensible a
la distancia entre un determinado objeto al elemento óptico. La
apertura de la óptica telecéntrica forma la imagen en el infinito.
Además, empleando luz telecéntrica, se garantiza una buena
homogeneidad lateral en todo el haz de luz y los emplazamientos
situados en el centro del conjunto se pueden comparar con los
situados en los bordes del conjunto. En toda la extensión del
presente invento, la óptica telecéntrica incluye siempre una lente
de campo. En el contexto del presente invento, una lente de campo es
una lente individual colocada más cerca del objetivo de lo que
determina el campo de visión del instrumento, comprendiendo uno o
varios componentes (acromáticos) y que contribuye a la
telecentricidad en el espacio del objeto y/o imagen, en combinación
con otros componentes ópticos adicionales del
dispositivo.
dispositivo.
La lente de campo del presente invento transmite
la luz de excitación desde la fuente de luz hasta el conjunto de
múltiples emplazamientos individuales y transmite las señales
fluorescentes desde el conjunto de múltiples emplazamientos
individuales hasta el transductor. Esto no excluye que se puedan
introducir componentes ópticos adicionales en la trayectoria del
haz de luz, por ejemplo, entre la fuente de luz y la lente de campo,
entre la lente de campo y el transductor o entre la lente de campo
y el conjunto de emplazamientos individuales múltiples.
Dentro del ámbito del presente invento, el medio
de calentamiento y enfriamiento incluye cualquier medio que permita
controlar y alterar la temperatura del conjunto de múltiples
emplazamientos individuales de forma cíclica para conseguir la
amplificación secuencial de la PCR de los ácidos nucleicos.
Preferentemente, mantener significa que se puede calentar y enfriar
estando en contacto térmico con el soporte plano del conjunto de
múltiples emplazamientos individuales.
El presente invento hace referencia a un sistema
de obtención de imágenes de señales fluorescentes de múltiples
muestras, incluyendo un soporte plano que incluye un conjunto de
múltiples muestras individuales, por lo menos una fuente de luz
para emitir luz incluyendo por lo menos una frecuencia de
excitación, un transductor colocado para recibir señales
fluorescentes procedentes de múltiples muestras, donde el
transductor está adaptado para generar datos básicos
computerizables, y una trayectoria de haz de luz a partir de esa
fuente de luz hasta el mencionado transductor que se caracterizará
por tener una excitación telecéntrica del mencionado conjunto de
múltiples muestras individuales y por obtener una imagen
telecéntrica de las mencionadas señales telecéntricas generadas en
cada ensayo individual del mencionado conjunto de múltiples muestras
individuales.
Un conjunto de múltiples muestras individuales
resume objetos compuestos por dos o más muestras separadas en el
espacio para conseguir un análisis en paralelo. Estas muestras
pueden producirse, por ejemplo, en pocillos de una microplaca o en
superficies con la función de un portaobjetos de vidrio.
La expresión trayectoria del haz de luz se
emplea a lo largo de la totalidad del presente invento para resumir
todas las zonas que atraviesa el haz de luz en su camino desde la
fuente de luz, a través de por lo menos la lente de campo, hasta el
conjunto de múltiples muestras individuales y desde el conjunto de
múltiples muestras individuales a través por lo menos de la lente
de campo hasta el transductor.
A lo largo del presente invento, los elementos
fluorescentes ligados al ADN son todos los tintes o conjuntos de
tintes fluorescentes que conocen las personas de la profesión que
pueden utilizarse para detectar ADN amplificado, en concreto, los
tintes de ligazón de ADN de dos cadenas, sondas TagMan, marcadores
moleculares, sondas simples o sondas de hibridación FRET, por
ejemplo.
La composición o combinación reactiva capaz de
producir las reacciones PCR incluye en la totalidad del presente
invento, todos los elementos intermedios, nucleótidos, enzimas,
cebadores y de ligazón para la fluorescencia del ADN.
Protocolo de secuencia térmica es el protocolo
que define el tratamiento térmico cronológico de la composición de
la PCR, las temperaturas de fusión y de emparejamiento, número de
ciclos de amplificación, así como los tiempos de calentamiento y de
enfriamiento.
La figura 1 muestra una vista esquemática de una
disposición del instrumento óptico de acuerdo con el presente
invento;
La figura 2 muestra una vista esquemática de
otra disposición del instrumento óptico de acuerdo con el presente
invento.
Un instrumento óptico para obtener imágenes de
señales fluorescentes de múltiples emplazamientos individuales,
está compuesto por: un sistema de sujeción 1 para sujetar un soporte
plano 2 con un conjunto de múltiples emplazamientos individuales 3;
por lo menos una fuente de luz 4 para emitir luz que tenga por lo
menos una frecuencia de excitación; un transductor 5 colocado de
forma que reciba señales fluorescentes del mencionado conjunto de
múltiples emplazamientos individuales 3, donde el transductor 5 está
adaptado para producir datos básicos computerizables; una lente de
campo 6 para transmitir la mencionada luz de excitación desde la
mencionada fuente de luz 4 hasta el mencionado conjunto de
múltiples emplazamientos individuales 3 y transmitir las señales
fluorescentes desde el mencionado conjunto de múltiples
emplazamientos individuales 3 hasta el mencionado transductor 5;
una disposición de una lente de excitación 10 para transmitir la luz
de excitación desde la mencionada fuente de luz 4 hasta la
mencionada lente de campo 6; y una disposición de lentes formadoras
de imagen 11 para transmitir las señales fluorescentes desde la
mencionada lente de campo 6 hasta el mencionado transductor 5,
donde la mencionada luz de excitación y la trayectoria del haz de
luz de las mencionadas señales fluorescentes de los múltiples
emplazamientos individuales son telecéntricas sobre el lado del
objeto de la mencionada lente de campo 6.
Existe gran cantidad de instrumentos conocidos
por los profesionales del sector que son capaces de obtener señales
fluorescentes. Si el instrumento óptico fuera capaz de obtener
simultáneamente las imágenes de señales fluorescentes de un
conjunto de múltiples emplazamientos individuales, por ejemplo, de
los pocillos de una microplaca o los puntos de un micro conjunto,
habrá que garantizar que la excitación de los tintes y las imágenes
de las señales fluorescentes en el centro del conjunto son
comparables a las de los bordes del conjunto. Además, incluso si se
cumple el requisito de homogeneidad de la distribución de
intensidades en todo el haz de luz, continúa siendo importante la
alineación del soporte plano para asegurar que el soporte en su
totalidad está en el plano focal de la óptica de imagen, así como
de la óptica de excitación. Surgen además algunos problemas
adicionales, en particular, cuando el soporte tiene una determinada
profundidad, como es el caso de las microplacas.
Una solución de los problemas indicados
anteriormente consiste en la utilización de óptica telecéntrica. En
la óptica telecéntrica, el plano de foco está en el infinito y el
rayo principal emitido desde cada punto objeto es paralelo al eje
óptico. En consecuencia, todos los puntos objeto dentro de un campo
de vista finito se observan con la misma perspectiva e intensidad
igual, en otras palabras, la óptica telecéntrica tiene una gran
profundidad de campo y un perfil homogéneo de excitación y formación
de imágenes.
Una determinada óptica telecéntrica se
caracteriza por medio de su apertura numérica (NA) que debe ser todo
lo pequeña que sea posible para conseguir una gran profundidad de
enfoque:
NA = n x sen
A,
donde n es el índice de refracción
del medio y A el ángulo de apertura. Una gran profundidad de enfoque
es muy importante cuando el conjunto de emplazamientos individuales
tiene una cierta profundidad, como en el caso de las
microplacas.
Para diseñar un instrumento óptico para excitar
de forma telecéntrica una distribución lateral de emplazamientos y
la obtención de imágenes de señales fluorescentes de esos
mencionados emplazamientos, hay que tener en cuenta diversas
consideraciones. Desde el punto de vista de la profundidad de
enfoque únicamente, el valor de la apertura numérica (NA) debería
ser tan pequeña como fuera posible. Por otra parte, un valor pequeño
de NA para la óptica de imágenes resulta en una mala resolución de
imagen, y un valor pequeño de NA para la óptica de excitación
resulta en una pérdida de la potencia de iluminación de la
excitación.
Si el instrumento de óptica telecéntrica debe
poderse aplicar para una amplia gama de frecuencias, la óptica debe
ser, además, acromática. Para las imágenes de fluorescencia mismas,
han de satisfacerse aún más requisitos, puesto que las imágenes de
fluorescencia deben tener una escala adecuada para que se reproduzca
de forma correcta la distribución lateral de emplazamientos en el
transductor. Además, deben controlarse errores de imágenes, como
son las aberraciones esféricas o cromáticas, coma, astigmatismo o la
curvatura del campo.
Existen distintas maneras de conseguir ópticas
telecéntricas. En general, una óptica telecéntrica es un diseño con
lente de elementos múltiples, en el que se colocan varias lentes
sucesivamente en la trayectoria del haz de luz. Una óptica
telecéntrica puede prepararse para que sea telecéntrica en el plano
del objeto o telecéntrica en el plano de la imagen, o bien,
telecéntrica en ambos planos, lo que se conoce como óptica
doblemente telecéntrica. Además, es posible iluminar un objeto con
luz telecéntrica y/o desplazar un objeto de forma telecéntrica. En
general, resulta suficiente emplear una óptica telecéntrica en el
plano del objeto, pues esto garantiza ya una iluminación homogénea
de todo el objeto lateralmente, así como en la tercera dimensión, y
la recogida de la luz radiada por el objeto con precisión.
Con el desarrollo tecnológico actual, se conocen
instrumentos que emplean ópticas telecéntricas para obtener
imágenes de señales fluorescentes, pero la excitación se consigue
habitualmente de forma no telecéntrica, por ejemplo, por
iluminación posterior, iluminación oblicua o en un campo
evanescente. A lo largo de todo el presente invento, tanto la
excitación de los múltiples emplazamientos individuales, como la
obtención de imágenes de las señales fluorescentes de los múltiples
emplazamientos individuales se realiza de forma telecéntrica.
Las figuras 1 y 2 muestran vistas esquemáticas
de dos instrumentos ópticos de acuerdo con las formas de realización
preferentes del presente invento, que se describen detalladamente a
continuación.
Una parte fundamental de la óptica telecéntrica
es la lente de campo. Esta lente es la que está más cerca del
objeto y determina el diámetro del campo de vista del instrumento.
En consecuencia, el diámetro de esta lente tiende a aumentar el
tamaño cuando el conjunto de múltiples emplazamientos individuales
está distribuido en una zona amplia. Las lentes de campo pueden ser
simples (una sola lente) o acromáticas que incluyen, por ejemplo,
dos lentes pegadas juntas. Una lente especial que puede emplearse
como lente de campo en el presente invento es la lente de Fresnel.
Una lente de Fresnel tiene una curvatura especial compleja con
múltiples zonas biseladas en por lo menos una superficie eficaz
ópticamente, que consigue las mismas propiedades telecéntricas que
la lente de campo. En la mayoría de los casos, las lentes de Fresnel
tienen una sola superficie con múltiples zonas biseladas apoyadas
en una superficie plana perpendicular al eje óptico, y en
consecuencia, son más delgadas que las lentes de campo
convencionales. En casos especiales, se suministran lentes de
Fresnel que tienen además una superficie de apoyo curvada o que
tienen múltiples zonas biseladas en ambas caras de la lente. Además,
las lentes de Fresnel se fabrican a veces en plástico, resultando
entonces más económicas que las grandes lentes de campo hechas de
vidrio. Pero, por otra parte, la calidad de la imagen, especialmente
respecto al contraste e interferencias de estas lentes de Fresnel
es inferior a las de las lentes de campo convencionales, debido a
la dispersión de la luz en los puntos de la lente de curvatura
discontinua.
En una disposición que resulta preferible, el
instrumento óptico de acuerdo con el invento incluye además un
separador de haz de luz 7 que es transparente a por lo menos una
frecuencia de excitación y reflejante de las frecuencias de esas
señales fluorescentes, o un separador de haz de luz que refleja por
lo menos una frecuencia de excitación transparente a las
frecuencias de esas señales fluorescentes.
Un separador de haz de luz es normalmente un
espejo dicroico que deja pasar o refleja la luz en función de su
longitud de onda, y en consecuencia, puede emplearse para separar
dos componentes de un haz de luz en distintas direcciones del
espacio. Esos espejos dicroicos pueden ser de vidrio o de plástico,
si fuera necesario, con determinados recubrimientos activos
óptimamente. Se presentan en forma de finas láminas o de
prismas.
Para aplicarlo a un instrumento óptico con el
fin de obtener imágenes de señales fluorescentes, el espejo
dicroico debe reflejar la luz de excitación y ser transparente a la
luz fluorescente (figura 2) o viceversa (figura 1). La separación
entre la luz emitida por la fuente de luz en un haz de luz que
contenga la o las frecuencias de excitación y un haz de luz con las
demás frecuencias ayuda a asegurar que no se destruyen los tintes
fluorescentes por las longitudes de onda cortas y que se reducen las
radiaciones no deseadas de fondo, como por ejemplo la excitación
del soporte. La separación de la luz de los múltiples emplazamientos
individuales en un componente que contenga por lo menos una
frecuencia de excitación, del componente que contenga las señales
fluorescentes, impide que el reflejo de la luz de excitación con su
elevada intensidad incida en el transductor. Esto mejora
drásticamente la relación de la señal respecto al ruido.
En otra de las formas de realización del
presente invento, la lente de campo produce un haz de luz de
excitación que es perpendicular al soporte del conjunto de
múltiples emplazamientos individuales.
El haz de luz de excitación que es perpendicular
al soporte del conjunto de múltiples emplazamientos individuales,
produce un haz de luz reflejado que es también perpendicular al
soporte del conjunto de múltiples emplazamientos individuales. Pero
a causa del separador del haz de luz, este haz de luz reflejado se
separa de las señales de fluorescencia y no incide en el
transductor. En el caso de, por ejemplo, una placa multititer como
conjunto de múltiples emplazamientos individuales, el haz de luz de
excitación perpendicular tiene la ventaja de que penetra hasta la
profundidad de los pocillos. Por otra parte, si el haz de luz de
excitación incidiera en el soporte con un ángulo de incidencia
superior a 0º, las paredes de los pocillos taparían totalmente la
iluminación del interior del pocillo, y solo se podría excitar una
parte del tinte fluorescente. Además, la cantidad de excitación del
tinte fluorescente dentro de los pocillos depende del nivel de
llenado, cuando se emplea un haz de luz de excitación oblicuo.
En otra de las versiones preferentes, el
instrumento óptico de acuerdo con el invento incluye además un
sistema de filtraje 8 de la excitación capaz de transmitir por lo
menos una frecuencia de excitación de la mencionada fuente de luz
hasta el mencionado conjunto de múltiples emplazamientos
individuales, al tiempo que bloquea una variedad de las demás
frecuencias.
Este sistema adicional de filtraje de la
excitación bloquea determinadas frecuencias de la fuente de luz
incluso antes del separador del haz de luz. Esto puede ser
necesario si la fuente de luz incluye luz de frecuencias que no
pueden separarse respecto a las frecuencias de excitación por medio
del separador del haz de luz. Un sistema adecuado de filtraje de la
excitación es por ejemplo la denominada rueda de filtraje que
incluye un determinado número de filtros individuales que tienen
varias propiedades ópticas. La utilización de esta rueda de
filtraje es una manera sencilla de cambiar las frecuencias de
excitación. Un sistema especial de filtraje de excitación es, por
ejemplo, un filtro que adsorba las frecuencias infrarrojas (IR) o la
luz ultravioleta (UV). Este sistema especial de filtraje de
excitación puede desarrollarse en forma de componente óptico
separado, como filtro de película delgada o como recubrimiento
óptico activo sobre otros componentes ópticos del dispositivo.
En otra de las configuraciones preferentes, el
instrumento óptico de acuerdo con el invento incluye además un
sistema de filtraje 9 de imágenes capaz de transmitir las señales
fluorescentes desde el mencionado conjunto de múltiples
emplazamientos individuales hasta el mencionado transductor, al
tiempo que bloquea la luz con las frecuencias de excitación.
Este sistema adicional de filtraje de imágenes
bloquea determinadas frecuencias generadas en los múltiples
emplazamientos individuales o del reflejo de la excitación incluso
después del separador del haz de luz. Esto puede ser necesario si
la luz con frecuencias que no pueden ser separadas de las
frecuencias de excitación por el separador del haz de luz se genera
en los múltiples emplazamientos individuales. Una vez más, un
sistema adecuado de filtraje de imágenes es una rueda de filtraje
que incluye varios filtros. Análogamente al caso del sistema de
filtraje de la excitación, un sistema especial de filtraje de
imágenes es por ejemplo un filtro de infrarrojos (IR) o un filtro
de ultravioletas (UV). Los sistemas especiales de filtraje de
imágenes pueden desarrollarse en forma de componente óptico
separado, como filtro de película delgada o como recubrimiento
óptico activo sobre otros componentes ópticos del dispositivo. Otro
sistema de filtraje de imágenes es un sistema de filtrado que
impide que el detector detecte luz dispersa.
Como se mencionó anteriormente, el instrumento
óptico incluye una disposición de lentes de excitación 10,
disposición de lentes de excitación que transmite la luz desde la
mencionada fuente de luz 4 hasta la mencionada lente de campo
6.
Esto significa que la luz de la fuente de luz se
convierte en imágenes en el conjunto de múltiples emplazamientos
individuales por medio de una óptica de excitación que incluye la
lente de campo 6 y la disposición de lentes de excitación 10. Esa
óptica de excitación suministra una luz de excitación telecéntrica
sobre el lateral del objeto de la lente de campo 6, y en
consecuencia es una óptica de excitación telecéntrica. La
disposición de lentes de excitación incluye por lo menos una lente,
y preferentemente tres lentes para incrementar la apertura de la
excitación para una mejor utilización de la potencia de la fuente de
luz. La disposición de las lentes de excitación puede incluir una
esfera, si hubiera que reducir el número de lentes. Preferentemente,
la óptica de excitación telecéntrica se diseña como acromática para
conseguir una distribución homogénea de la intensidad en todo el
conjunto de múltiples emplazamientos individuales,
independientemente de la longitud de onda de la excitación.
En otra forma de realización del invento, la
mencionada fuente de luz emite una luz que incluye múltiples
frecuencias, siendo preferentemente esa fuente de luz blanca, y más
preferentemente siendo esa fuente de luz una lámpara de descarga de
gas, como una lámpara de xenón o una lámpara de Mercurio, o bien una
lámpara de filamento, como una lámpara de tungsteno.
En otra forma de realización del presente
invento, la mencionada fuente de luz emite luz de una única
frecuencia, siendo preferentemente esa fuente de luz un láser, y
más preferentemente siendo esa fuente de luz un LED.
La utilización de una fuente de luz con varias
frecuencias presenta la ventaja de que se puede emplear la fuente
de luz para distintos tintes fluorescentes sin más que cambiar el
juego de filtros compuesto por un separador de haz de luz, y si
fuera necesario, el sistema de filtraje de la excitación y/o el
sistema de filtraje de imágenes. Es preferible emplear ruedas de
filtraje de forma que el sistema de filtraje de la excitación y/o
el sistema de filtraje de imágenes contengan un determinado número
de filtros de forma que se pueda pasar de un tinte de fluorescencia
a otro fácilmente. Por otra parte, si la fuente de luz emite luz con
una única frecuencia, los requisitos del conjunto de filtraje serán
sencillos de satisfacer, pero el instrumento óptico se ve obligado
a un número limitado de tintes de fluorescencia.
En una de las formas de realización del invento,
la ventana de la fuente de luz tiene un recubrimiento óptico activo
que actúa como sistema especial de filtraje de la excitación para
absorber la luz IR y/o UV.
En otra de las versiones preferentes del
invento, la mencionada fuente de luz incluye una combinación de más
de un iluminador, preferentemente más de un láser, y más
preferentemente más de un LED.
En esta forma de realización preferente, se
emplea un conjunto de diferentes iluminadores para conseguir un
instrumento óptico de acuerdo con el invento con más de una
frecuencia de excitación. Una de las configuraciones de acuerdo con
el invento, con dos fuentes de luz distintas, se muestra en la
figura 2, mientras que cada fuente de luz tiene su propio sistema
de filtraje de la excitación 8, una disposición de lentes de
excitación 10 y un separador de haz de luz 7.
En otra versión de acuerdo con el invento, la
mencionada fuente de luz incluye además un dispositivo para
seleccionar uno o más de los mencionados iluminadores.
Se puede realizar uno de los mencionados
sistemas de selección de iluminador de distintas maneras. Una
posibilidad es utilizar espejos giratorios para inyectar la luz del
iluminador seleccionado en la trayectoria óptica. Otra posibilidad
es desplazar la disposición de los iluminadores para inyectar la Luz
del iluminador seleccionado en la trayectoria óptica.
La óptica telecéntrica de excitación puede
incluir distintos componentes adicionales además de la lente de
campo 6, el sistema de filtraje 8 de la excitación, la disposición
de lentes de excitación 10 y el separador de haz de luz 7. En una
de las configuraciones, la óptica telecéntrica de excitación incluye
adicionalmente una guía de luz, y la luz de la fuente de luz se
acopla a esa guía de luz para transmitir la luz desde la fuente de
luz a los componentes ópticos del sistema óptico. La utilización de
una guía de luz permite acoplar la luz procedente de distintas
fuentes de luz y transmitir esa luz combinada simultáneamente a los
componentes ópticos. Pueden aplicarse todo tipo de guías de luz
para la finalidad del presente invento. Unas guías de luz posibles
son por ejemplo las guías de luz de fluidos, las guías de luz de
fibra o los haces de luz de fibra. En una de las configuraciones
del invento, un extremo o los dos extremos de la mencionada guía de
luz tienen un recubrimiento óptico activo que actúa como sistema
especial de filtraje de la excitación para adsorber la luz IR y/o
UV.
En otra forma de realización del presente
invento, la óptica telecéntrica de excitación incluye además un
mezclador de luz que combina la luz de la mencionada fuente de luz y
que obtiene la imagen de la superficie iluminada del mencionado
mezclador sobre el conjunto de múltiples emplazamientos
individuales.
Un mezclador de luz es un dispositivo con una
superficie iluminada muy homogénea que puede utilizarse como fuente
de luz que suministra una distribución de intensidad homogénea en
toda la sección. Un mezclador de luz es un elemento alargado
construido con material óptico transparente, de forma que los bordes
del mencionado elemento quedan paralelos a la trayectoria óptica.
En otras palabras, un mezclador de luz es una especie de fibra
óptica. La luz que entra en el mencionado mezclador de luz
experimenta reflexiones totales múltiples en la interfaz interna
del material óptico transparente formando una sección de superficie
que queda muy homogéneamente iluminada. La reflexión total en la
interfaz interna del material óptico transparente puede basarse
simplemente en el cambio del índice de refracción en la mencionada
interfaz, o bien puede apoyarse en recubrimientos reflectantes. El
cociente entre la longitud del mencionado mezclador de luz y la
superficie de la sección formada es importante para la homogeneidad
de la iluminación. Es preferible que esa relación sea superior a
2.
La luz de la fuente de luz, en particular de la
sección de la superficie en un extremo del mezclador de luz, forma
una imagen en el conjunto de múltiples emplazamientos individuales
por medio de la óptica telecéntrica de excitación que incluye la
lente de campo 6 y la disposición de lentes de excitación 10. En
consecuencia, en el presente invento, la excitación de los
múltiples emplazamientos individuales se realiza con una óptica de
excitación que es telecéntrica en el emplazamiento del objeto de la
lente de campo 6.
El instrumento óptico de acuerdo con el invento
puede adaptarse también a imágenes de quimioluminiscencia y
bioluminiscencia. Como en esos casos no se necesita fuente de luz,
se puede omitir la fuente de luz 4, la disposición de lentes de
excitación 10 y el sistema de filtraje de excitación 8.
En otra versión preferente más, el instrumento
óptico de acuerdo con el invento incluye además una unidad que
dobla el haz de luz que contiene dos o más espejos de doblado,
doblando esas unidades de doblado de luz la luz que proviene de la
mencionada fuente de luz y las señales fluorescentes que provienen
del mencionado conjunto de múltiples emplazamientos
individuales.
Dentro del ámbito del presente invento, una
unidad dobladora del haz de luz es una unidad que suministra una
trayectoria óptica larga, al tiempo que necesita únicamente un
determinado espacio de confinamiento. Para ajustar la apertura
numérica de la óptica de excitación, un parámetro que puede
modificarse es la trayectoria óptica que atraviesa la luz.
Al ampliar la trayectoria óptica se reduce la
apertura numérica. En consecuencia, si se desea una pequeña
apertura numérica para cumplir los requisitos de profundidad de
campo y de distribución homogénea de intensidad, la trayectoria
óptica debe ser larga. Como no se pueden emplear instrumentos de
gran tamaño, pueden emplearse espejos de doblado para conseguir una
trayectoria óptica larga al tiempo que se confina el tamaño del
instrumento.
Como se mencionó anteriormente, el instrumento
óptico incluye una disposición de lentes de imagen 11, transmitiendo
esa disposición de lentes de imagen 11 la luz desde la mencionada
lente de campo 6 hasta el transductor 5.
Esto significa que las señales que se generan en
el conjunto de múltiples emplazamientos individuales forman la
imagen en un transductor 5 por medio de una óptica telecéntrica de
imagen que incluye la lente de campo 6 y la disposición de lentes
de imagen 11. En otras formas de realización del invento, la óptica
telecéntrica de imagen incluye además, por ejemplo, una unidad de
doblado del haz de luz y/o sistemas especiales de filtraje de
imágenes 9.
La óptica telecéntrica de imagen debe
optimizarse respecto al tamaño del transductor y respecto al tamaño
especial del conjunto de múltiples emplazamientos individuales. Como
en el caso de la disposición de lentes de excitación 10, la
disposición de lentes de imagen 11 incluye por lo menos una lente,
preferentemente un conjunto de por lo menos 5 lentes. Es necesario
un gran número de lentes en la disposición de lentes de imagen dado
que hay que satisfacer aún mayores requisitos en el caso de la
óptica de imagen comparado con la óptica de excitación. Las
imágenes de fluorescencia deben tener una escala adecuada para que
se reproduzca de forma correcta la distribución lateral de
emplazamientos en el transductor. Además, deben controlarse errores
de imágenes, como son las aberraciones esféricas o cromáticas,
coma, astigmatismo o errores especiales de curvatura del campo.
Debido a la imagen de las señales fluorescentes en el transductor,
las imágenes de fluorescencia se consiguen con una óptica de imagen
que es telecéntrica únicamente en el emplazamiento del objeto de la
lente de campo 6.
En otra versión preferente más del instrumento
óptico, la mencionada disposición de lentes de imagen 11 está
acoplada al mencionado transductor 5 formando una unidad de imagen
12.
Téngase en cuenta que en esta forma de
realización del invento, la óptica telecéntrica de imagen es
diferente de los objetivos estándar, puesto que todas las lentes se
disponen y fijan de una manera determinada que forma el objetivo y
ese objetivo está colocado completamente entre el transductor y el
objeto. Contrariamente, en esta forma de realización preferente del
presente invento, la disposición de lentes de imagen 11 va acoplada
al transductor 5, formando una unidad de imagen 12. Para satisfacer
los requisitos respecto a la resolución y precisión de la imagen,
la posición de la disposición de las lentes de imagen y del
transductor tiene una importancia especial. En esta forma de
realización, esos requisitos se consiguen optimizando la colocación
entre la disposición de las lentes de imagen y el transductor antes
de fijar la posición óptima. Ese acoplamiento entre la disposición
de las lentes de imagen y el transductor se mantiene a lo largo de
todas las aplicaciones para las que está diseñado, y solamente se
modifica cuando es necesario volver a optimizar la posición.
En una de las formas de realización del
instrumento óptico de acuerdo con el invento, el mencionado
transductor incluye un dispositivo semiconductor o preferentemente
un dispositivo acoplado de carga.
En el contexto del presente invento un
transductor es un dispositivo capaz de convertir la luz en señales
eléctricas que pueden procesarse por ordenador. Esto se puede
conseguir con semiconductores que tengan un espacio de banda
inferior al de la energía que corresponda a las señales
fluorescentes que se han de detectar. Los electrones generados en
la banda conductora del semiconductor debido a la iluminación del
dispositivo, producen una señal medible que puede traducirse a
datos computerizables. Algunos ejemplos de dispositivos de
semiconductores son los fotodiodos o los dispositivos acoplados de
carga (CCD).
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Otra versión preferente más del instrumento
óptico de acuerdo con el invento es un instrumento óptico en el
que, mientras los emplazamientos individuales del mencionado
conjunto son pocillos, la luz de excitación es paralela a las
paredes laterales de los mencionados pocillos y la solución que
llena los mencionados pocillos incluye tintes fluorescentes.
Un ejemplo de esta versión preferente del
instrumento óptico es un dispositivo para el control simultáneo de
la amplificación de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que
se produce en los pocillos individuales de una microplaca. La luz
de excitación es paralela a las paredes laterales de los pocillos
para iluminar completamente el interior de los pocillos
independientemente de la altura de llenado dentro de los pocillos.
Como se emplea una técnica de óptica telecéntrica para la excitación
del pocillo así como para la formación de imágenes de
fluorescencia, los resultados que se obtienen en el centro de un
pocillo son comparables con los obtenidos en los pocillos en los
bordes de la placa.
En el caso de una amplificación de la PCR
realizada en pocillos individuales, pueden emplearse todos los
elementos fluorescentes que sean tintes fluorescentes ligados
específicamente a los ácidos nucleicos de doble cadena. En el
contexto del invento, esos tintes fluorescentes se denominan
elementos de ligazón de fluorescencia del ADN, mientras que el
elemento de ligazón de fluorescencia del ADN es una molécula o un
par de moléculas que producen una luz fluorescente característica,
si van ligados a un ADN de doble cadena. En el campo del control de
la PCR en tiempo real, se conocen los siguientes formatos de
detección: formato de tinte de ligazón del ADN (por ejemplo,
SybrGreen l), sondas Taíman, marcadores moleculares, formato de
sonda simple (SLP) o sondas de hibridación
FRET.
FRET.
Una forma de realización preferente también del
instrumento óptico de acuerdo con el invento es un instrumento
óptico, siendo los emplazamientos individuales del conjunto sendos
puntos sobre un soporte plano y los tintes fluorescentes van unidos
a esos puntos.
Un ejemplo de esta forma de realización
preferente del instrumento óptico es un dispositivo para formar
imágenes simultáneamente de señales fluorescentes procedentes de
distintos puntos de una selección en plano. Una forma de
realización específica consiste en una selección de ADN, donde las
zonas laterales confinadas se funcionalizan con sondas de ADN que
tienen distintas secuencias. En este caso, el instrumento óptico de
acuerdo con el invento puede controlar los fenómenos de hibridación
con muestras que contengan ácidos nucleicos, si por ejemplo la
cadena complementaria del ADN se marca con un tinte fluorescente.
Alternativamente, en lugar de marcar las moléculas de ADN en la
muestra, los fenómenos de hibridación pueden visualizarse también
con tintes fluorescentes ligados a ácidos nucleicos de doble
cadena.
Una aplicación se refiere también a un
instrumento de la PCR en tiempo real, e incluye: un instrumento
óptico como el descrito anteriormente; y medios para calentar y
enfriar un soporte con uno o más pocillos, conteniendo cada uno una
mezcla reactiva capaz de producir una reacción de la PCR.
Dentro del ámbito del presente invento, los
medios de calentamiento y enfriamiento incluyen cualquier medio
capaz de controlar y alterar la temperatura del conjunto de
múltiples emplazamientos individuales de manera cíclica para
conseguir la amplificación cíclica de la PCR de los ácidos
nucleicos. Cada ciclo de la PCR incluye varios pasos distintos: un
paso de emparejamiento con temperatura decreciente, un paso de
amplificación enzimática a una temperatura relativamente baja,
junto a un paso de detección que emplea tintes fluorescentes, y un
paso de fusión a elevadas temperaturas.
El invento hace referencia a un sistema para
obtener imágenes de señales fluorescentes de múltiples muestras,
incluyendo: un soporte plano 2 que incluye un conjunto de múltiples
muestras individuales; por lo menos una fuente de luz 4 para emitir
luz que incluye por lo menos una frecuencia de excitación; un
transductor 5 colocado para recibir señales fluorescentes
procedentes de las mencionadas muestras múltiples, estando el
transductor adaptado para producir datos primarios computerizables,
y una trayectoria de luz desde la mencionada fuente de luz 4 hasta
el mencionado transductor 5 que se caracteriza por una excitación
telecéntrica del mencionado conjunto de múltiples muestras
individuales, y por una formación de imagen telecéntrica de las
mencionadas señales fluorescentes que se generan en cada muestra
individual del mencionado conjunto de múltiples muestras
individuales.
Un conjunto de múltiples muestras individuales
resume objetos compuestos por dos o más muestras separadas en el
espacio para llevar a cabo un análisis paralelo. Estas muestras
pueden producirse por ejemplo en pocillos de una microplaca o en
superficies funcionarizadas de un portaobjetos de vidrio. En la
mayoría de los casos el conjunto de múltiples muestras individuales
se dispone de forma uniforme y cada muestra tendrá un contenido
diferente para llevar a cabo un análisis multiplex. En el caso de
micro selecciones de ADN, cada punto de la selección se
funcionaliza con un oligómero que tenga una determinada secuencia,
mientras que en el caso de inmunoensayos, cada punto de la
selección se funcionaliza por ejemplo con proteínas que tengan
distintas afinidades. En el caso de las microplacas en cada pocillo
se realiza por ejemplo una PCR distinta.
En una forma de realización preferente del
sistema para la obtención de imágenes de señales fluorescentes de
múltiples muestras de acuerdo con el invento, el mencionado sistema
incluye además una lente de campo 6, en la que el mencionado haz de
luz pasa dos veces por la mencionada lente de campo.
En otra forma de realización preferente del
sistema para la obtención de imágenes de señales fluorescentes de
múltiples muestras de acuerdo con el invento, el mencionado sistema
incluye además una disposición de lentes de imagen 11, en la que la
mencionada disposición de lentes de imagen 11 está acoplada al
mencionado transductor 5, formando de esa forma una unidad de
imagen 12.
En otra forma de realización preferente más del
sistema para la obtención de imágenes de señales fluorescentes de
múltiples muestras de acuerdo con el invento, el mencionado sistema
incluye además un separador de haz de luz 7 que es transparente a
por lo menos una frecuencia de excitación y refleja las frecuencias
de las mencionadas señales fluorescentes, o bien un separador de
haz de luz 7 que refleja por lo menos una frecuencia de excitación
y es transparente para las frecuencias de las mencionadas señales
fluorescentes.
Otra forma de realización preferente del sistema
para la obtención de imágenes de señales fluorescentes de múltiples
muestras de acuerdo con el invento, incluye además un sistema de
filtraje de la excitación capaz de transmitir por lo menos una
frecuencia de excitación de la mencionada fuente de luz al
mencionado conjunto de múltiples emplazamientos individuales,
mientras que bloquea toda una serie de otras frecuencias y/o un
sistema de filtraje de imágenes capaz de transmitir las señales
fluorescentes desde el mencionado conjunto de múltiples
emplazamientos individuales hasta el mencionado transductor,
mientras que bloquea la luz con las frecuencias de excitación.
El invento puede aplicarse a un sistema para
conseguir y controlar múltiples reacciones de la PCR simultáneamente
en tiempo real, incluyendo una placa de múltiples pocillos con
múltiples emplazamientos individuales, conteniendo cada uno una
mezcla reactiva capaz de realizar una reacción de la PCR, elementos
fluorescentes ligados al ADN, un instrumento de la PCR en tiempo
real que incluye un instrumento óptico de acuerdo con el invento que
ilumina la totalidad de la placa de múltiples pocillos por medio de
luz telecéntrica y que detecta las señales fluorescentes de cada
pocillo de la mencionada placa de múltiples pocillos por medio de un
transductor colocado para recibir las correspondientes señales
fluorescentes con el fin de producir datos básicos
computerizables.
En general, existen distintos formatos de
elementos fluorescentes para ligar al ADN para la detección en
tiempo real del ADN amplificado, entre los cuales los siguientes
son bien conocidos por los profesionales del sector:
Como la cantidad de producto amplificado de
doble cadena habitualmente sobrepasa a la cantidad de ácido nucleico
presente originalmente en la muestra que se desea analizar, se
pueden emplear tintes específicos del ADN de doble cadena, que al
ser excitados con una longitud de onda adecuada muestran una
fluorescencia aumentada solamente cuando están ligados a ADN de
doble cadena. Preferentemente, solamente deben emplearse tintes que
no afecten la eficiencia de la reacción de la PCR, como es el caso
del SybrGreen I, por ejemplo.
Todos los demás formatos conocidos por los
profesionales del sector requieren diseñar una sonda de hibridación
fluorescente marcada que solo emita fluorescencia al ligarse a su
ácido nucleico objetivo.
Una muestra de hibridación de una sola cadena se
marca con dos componentes. Cuando el primer componente es excitado
con luz de la longitud de onda adecuada, la energía absorbida se
transmite al segundo componente, el denominado enfriador rápido
(quencher), de acuerdo con el principio de la transmisión de
energía por resonancia de fluorescencia. Durante el paso de
emparejamiento de la reacción de la PCR, la sonda de hibridación se
une al ADN objetivo y se degrada por la actividad de la exonucleasa
5'- 3' de la polimerasa Taq durante la fase subsiguiente de
elongación. Como consecuencia, el componente fluorescente excitado y
el enfriador rápido están separados en el espacio uno de otro, y en
consecuencia puede medirse la emisión fluorescente del primer
componente (US-5.538.848).
Estas sondas de hibridación se marcan también
con un primer componente y con un enfriador rápido, colocándose
preferentemente las marcas en los dos extremos de la sonda. Como
consecuencia de la estructura secundaria de la sonda, ambos
componentes se encuentran próximos en el espacio dentro de la
disolución. Después de la hibridación de los ácidos nucleicos
objetivo, ambos componentes se separan el uno del otro de forma que,
después de la excitación con una longitud de onda adecuada, puede
medirse la emisión fluorescente del primer componente (US
5.118.801).
Este formato de detección consiste en un
oligonucleótido simple marcado con un tinte simple en el extremo
5'- o 3'- (WO 02/14555). Se pueden emplear dos diseños distintos
para el oligo marcado: sondas G-Quenching y sondas
Nitroindole-Dequenching.
En la forma de realización
G-Quenching, el tinte fluorescente se une a un C en
el extremo oligo 5'- o 3'-. La fluorescencia disminuye de forma
significativa cuando la sonda se hibrida con el objetivo, en el caso
de que dos G estén colocadas en la cadena del objetivo opuesta a C
y en posición 1 al lado de la sonda complementaria
oligonucleótida.
En la forma de realización Nitroindole
Dequenching, se une el tinte fluorescente al Nitroindole en el
extremo 5'- o 3'- del oligonucleótido. El Nitroindole disminuye en
cierto modo las señales de la sonda libre. La fluorescencia aumenta
cuando la sonda se hibrida con el ADN objetivo debido a un efecto de
desenfriado rápido.
El formato de prueba de la sonda FRET de
hibridación es especialmente útil para todos los tipos de muestras
de hibridación homogénea (Matthews, J.A., y Kricka, L.J., Anal.
Biochem. 169 (1988) 1-25). Se caracteriza por
un par de dos sondas de hibridación de cadena simple que se emplean
simultáneamente y son complementarias en emplazamientos adyacentes
en la misma cadena del ácido de ácido nucleico objetivo amplificado.
Ambas sondas van marcadas con distintos componentes fluorescentes.
Cuando son excitadas con luz de una longitud de onda adecuada, un
primer componente transmite la energía absorbida al segundo
componente de acuerdo con el principio de la transmisión de energía
por resonancia de fluorescencia, de forma que la emisión de
fluorescencia del segundo componente se puede medir cuando las dos
sondas de hibridación se ligan a posiciones adyacentes de la
molécula objetivo que se desea detectar.
Cuando se emparejan con la secuencia objetivo,
las sondas de hibridación deben estar muy cerca cada una de la
otra, en disposición de cabeza con cola. Habitualmente la distancia
entre el extremo marcado 3' de la primera sonda y el extremo
marcado 5' de la segunda sonda debe ser lo más pequeña posible, por
ejemplo de 1-5 bases. Esto permite la proximidad
del componente donante FRET y del componente receptor FRET, que es
típicamente de 10 - 100 Angström.
Alternativamente, para controlar el aumento de
fluorescencia del componente receptor FRET, es posible también
controlar la disminución de la fluorescencia del componente donante
FRET, como medida cuantitativa del fenómeno de la hibridación.
En particular, el formato de sonda de
hibridación FRET puede emplearse con la PCR en tiempo real para
detectar ADN objetivo amplificado. Entre todos los formatos de
detección conocidos por los profesionales del sector de la PCR en
tiempo real, el formato de sonda de hibridación FRET ha demostrado
gran sensibilidad, exactitud y fiabilidad
(WO-97/46.707; WO-97/46.712;
WO-97.146.714). Sin embargo, el diseño de las
secuencias de las sondas de hibridación FRET pueden verse limitados
a veces por las características especiales de la secuencia del
ácido nucleico objetivo que se desea detectar.
Como alternativa al empleo de dos sondas de
hibridación FRET es también posible utilizar un cebador con marca
fluorescente y solamente una sonda oligonucleótida marcada (Bernard,
P. S. et al., Anal. Biochem. 255 (1998)
101-107). A este respecto, puede elegirse
arbitrariamente si el cebador se marca en el componente donante
FRET o en el receptor FRET.
El invento hace referencia además al método para
amplificar, detectar y/o cuantificar secuencias múltiples de ADN
objetivo, que comprenden suministrar una composición o mezcla
reactiva capaz de producir reacciones de la PCR, someter la
mencionada mezcla reactiva a un protocolo de secuencia térmica de
forma que se produzca la amplificación de la mencionada secuencia
múltiple del ADN objetivo, y controlar la presencia y cantidad de
cada secuencia de ADN por lo menos una vez después de múltiples
ciclos de amplificación utilizando elementos fluorescentes de
ligazón del ADN y un instrumento de la PCR en tiempo real de acuerdo
con el invento.
Ejemplo
Un instrumento óptico como se ha explicado en la
descripción detallada y se ilustra en la figura 2 (con solamente
una fuente de luz) se ha configurado de la forma siguiente. La
óptica telecéntrica de excitación se ha ajustado para manejar
frecuencias entre 450 y 650 nm y la óptica telecéntrica de imagen
para manejar frecuencias entre 500 y 740 nm. La fuente de luz es
una lámpara de xenón y se emplea como transductor un chip CCD 2/3''
refrigerado con 1024 x 1344 píxeles. El instrumento óptico ha sido
diseñado para obtener la imagen de una superficie de 83 mm x 117 mm
de forma que se puedan emplear microplacas (MTP) con 96 pocillos
(distancia 9 mm; diámetro 5 mm) y 384 (distancia 4,5 mm; diámetro 3
mm). La longitud de onda adecuada para la excitación y obtención de
imagen de determinados tintes se ha ajustado con filtros de
rueda.
La óptica telecéntrica de excitación tiene una
apertura numérica en el lado de la fuente de luz de 0,35 y del lado
de la MTP de 0,014. La fuente de luz se ha dispuesto
perpendicularmente al chip CCD y el haz de luz de excitación se
orientó hacia la MTP con un separador de haz de luz reflectante para
la frecuencia de excitación necesaria y transparente para las demás
frecuencias contenidas en la luz procedente de la fuente de luz. El
haz de luz de excitación del separador de haz de luz es
perpendicular a la MPT y tiene una variación de intensidad a lo
largo de todo el campo del objeto (88 mm x 122 mm) inferior a 10%.
La óptica de imagen tiene una apertura del lado del objeto de 0,014
también, y una escala de reproducción de - 0,075 con una distancia
entre objeto e imagen de 800 mm. Esta gran distancia se consigue
con dos espejos de doblado. La óptica de imagen tiene una
profundidad de campo de +/- 3 mm. El separador de haz de luz
empleado es transparente a las señales fluorescentes que se generan
en los pocillos de la MTP debido a la excitación.
Bernard, P.S., et al., Anal.
Biochem. 255 (1998) 101-107
DE 101 31 687
DE 101 55 142
DE 102 00 499
DE 197 48 211 A1
EP 1 275 954 A2
JP 2002014044.
\vskip1.000000\baselineskip
Matthews, J.A. and Kricka, L.J.,
Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25
- US 2002/0005493 A1
- WO 02/14555
- US 2002/159057
- WO 03/069391
- US 2003/0011778 A1
- WO 97/46707
- US 5,118,801
- WO 97/46712
- US 5,538,848
- WO 97/46714
- US 6,246,525 B1
- WO 99/60381
US 6,498,690 B1.
Claims (4)
1. Sistema para la formación de imágenes de
señales fluorescentes de muestras múltiples incluyendo: un soporte
plano (2) que incluye un conjunto de muestras múltiples
individuales; por lo menos una fuente de luz (4) que emite luz que
incluye por lo menos una frecuencia de excitación; un transductor
(5) colocado para recibir las señales fluorescentes que proceden de
las mencionadas señales fluorescentes, las que se ha adaptado el
transductor para que produzca datos básicos computerizables; una
trayectoria de haz de luz desde la mencionada fuente de luz (4)
hasta el mencionado transductor (5) que se caracteriza por
una excitación telecéntrica del mencionado conjunto de múltiples
muestras individuales y por una formación de imagen telecéntrica de
las mencionadas señales fluorescentes que se generan en cada
muestra individual del mencionado conjunto de múltiples muestras
individuales.
2. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 1
que incluye además una disposición de lentes de imagen (11), donde
la mencionada disposición de lentes de imagen (11) va acoplada al
mencionado transductor (5), formando así una unidad de imagen
(12).
3. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 2 que incluye además una lente de campo (6),
pasando la mencionada trayectoria del haz de luz dos veces por la
mencionada lente de campo.
4. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 3 que incluye además un separador de haz de
luz (7) que es transparente a por lo menos una frecuencia de
excitación y refleja las frecuencias de las mencionadas señales
fluorescentes o un separador de haz de luz (7) que refleja por lo
menos una frecuencia de excitación y es transparente a las
frecuencias de las mencionadas señales fluorescentes.
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