ES2244815T3 - Analizador optico de fluorescencia con doble longitud de onda. - Google Patents
Analizador optico de fluorescencia con doble longitud de onda.Info
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Abstract
Un dispositivo óptico para dirigir señales ópticas en un analizador basado en fluorescencia, que tiene fuentes de luz láser primera y segunda para proporcionar luz láser de iluminación a diferentes longitudes de onda, que comprende: filtros de paso de banda primero y segundo (2, 7) asociados con dichas fuentes de luz láser primera y segunda, respectivamente, y montados para permitir que la luz láser de la longitud de onda pertinente del láser asociado pase a su través pero que refleje la luz de otras longitudes de onda; estando cada filtro de paso de banda dispuesto a la luz láser directa procedente de ambas fuentes de luz láser en una trayectoria individual (3) dirigida a una muestra (4) que se ilumina; y al menos dos filtros de paso de banda de fluorescencia (11, 17), cada uno de las cuales se monta de tal manera que permita pasar a su través luz de una longitud de onda fluorescente seleccionada; en el que los filtros de paso de banda láser (2, 7) se montan de tal forma que reflejen la luz fluorescente recibida desde la muestra (4) hacia los filtros de fluorescencia (11, 17), de tal modo que la luz recibida de la muestra se deje pasar a través de un primero de los filtros de fluorescencia si es a una primera longitud de onda y a través del segundo de los filtros de fluorescencia si es a una segunda longitud de onda, para proporcionar una señal de salida para análisis a una salida de cada uno de los filtros de fluorescencia.
Description
Analizador óptico de fluorescencia con doble
longitud de onda.
La presente invención se refiere a una
configuración de elementos ópticos para su uso en un equipo que
analiza la concentración relativa de moléculas fluorescentes sobre
la superficie de una pieza de trabajo.
En los últimos años, la investigación de la
estructura de las moléculas biológicas, y en especial, de los
ácidos desoxirribonucleicos (ADN) y ribonucleicos (ARN), se ha
convertido en una actividad fundamental en biología. En especial,
se ha dedicado un gran esfuerzo a comprender la estructura molecular
del genoma humano, el cual está compuesto de unos tres mil millones
de unidades moleculares. Se piensa que la comprensión de esta
estructura permitirá tratamientos más eficaces de las enfermedades
de los seres humanos, tanto congénitas como infecciosas.
Una vez que se conoce la estructura básica del
genoma, es entonces necesario probar la respuesta a las influencias
exteriores de diversos elementos del genoma. Este campo, conocido
como genómica funcional, confeccionará entonces un mapa de la
función y el comportamiento del genoma cuando se somete a
influencias externas.
Se notará que, incluso aunque la genómica
funcional trata solamente de subunidades diminutas del genoma
completo, el investigador se enfrenta a cantidades significativas
de unidades de bases o combinaciones de las mismas (las cuales de
etiquetan generalmente como A, C, T y G).
Con el fin de manejar el gran número de posibles
combinaciones de diferentes experimentos que se pueden llevar a
cabo, se ha desarrollado el concepto de microdisposición
("microarray"). La microdisposición consiste en una
disposición ("array") de pequeños gránulos o sondas de
ADN soportados sobre un sustrato. Tales gránulos tienen un diámetro
del orden de 1 a 100 micrómetros. Cuando se inundan las sondas con
moléculas blanco a las cuales se han acoplado diversas moléculas
fluorescentes, entonces, según la composición de la disolución
blanco se ligarán a algunas sondas y no a otras. Después de este
proceso, la disposición ("array") de sondas se seca y se
carga en una máquina denominada "lector". En el interior del
lector se hace brillar luz sobre las sondas, las cuales producen
fluorescencia debido a la presencia de las moléculas acopladas.
Debido a que la distribución espacial de la fluorescencia sobre la
superficie del sustrato varía en respuesta a la distribución
inicial de las unidades de base sobre el portaobjetos, se puede
deducir la composición de las unidades de base en la disolución
blanco a partir de la imagen fluorescente.
Este método tiene un cierto número de ventajas
sobre los métodos tradicionales, siendo el principal la capacidad de
llevar a cabo un gran número de experimentos independientes de
manera simultánea, en los que cada gránulo o sonda se puede
considerar como un experimento individual. Con las técnicas actuales
de microdisposiciones puede haber 50-100 sondas
sobre un sustrato individual, lo cual ilustra la naturaleza
enormemente paralela de esta técnica.
En consecuencia, el reto para cualquier lector es
producir una mancha de luz enfocada pequeña (generada por un láser)
sobre la muestra que se está investigando; luego se necesita
recoger eficazmente la fluorescencia resultante del sustrato y
cuantificar su intensidad. El haz láser necesita ser enfocado en un
punto sobre la muestra, con un diámetro de haz de unos pocos
micrómetros o menos, con el fin de resolver los rasgos de pequeños
tamaños, que pueden presentarse en microdisposiciones de
vanguardia. Además con el fin de acelerar el proceso de recogida de
datos, se da el caso de que se hacen barridos sobre el sustrato con
dos haces láser de diferentes longitudes de onda, "mirando" a
dos moléculas fluorescentes diferentes en las disposiciones.
Utilizar dos colores de láser simultáneamente reduce a menos de la
mitad el número de barridos que tiene que realizar un investigador
para conseguir los datos necesarios.
El documento de la patente de Estados Unidos
número US 5.127.730 describe un sistema de representación de
imágenes confocal de barrido de láser multicolor para usarlo con un
microscopio, que comprende un filtro de paso de banda doble
asociado con una fuente de luz láser multilínea y dos filtros de
paso de banda de fluorescencia, en el que la luz fluorescente
emitida por una muestra se refleja hacia los filtros de
fluorescencia por medio de un reflector y un espejo dicroico.
El documento de la patente de Estados Unidos
número 5.847.400 describe un sistema de barrido por láser de
iluminación y recogida coaxial, que comprende dos fuentes de luz
láser que emiten luz láser a diferentes longitudes de onda, estando
dirigida dicha luz láser a un único camino o trayectoria de
iluminación, dirigido a una muestra por medio de un filtro
dicroico, y un filtro de paso de banda de fluorescencia, en el que
la luz fluorescente emitida por la muestra se transmite hacia el
filtro de paso de banda de fluorescencia por medio de un divisor de
haz.
La patente WO 00/50878 se dirige a un sistema de
representación de imágenes para un escáner óptico que comprende dos
fuentes de luz láser que emiten luz láser a diferentes longitudes
de onda, estando dirigida dicha luz láser dentro de un único camino
o trayectoria de iluminación dirigido a una muestra por medio de un
montaje obturador que comprende divisores de haz, obturadores y
espejos, y un filtro de paso de banda de fluorescencia, en el que
la luz fluorescente emitida por la muestra se refleja hacia el
filtro de paso de banda de fluorescencia por medio de un espejo de
banda ancha.
La siguiente invención trata de proporcionar un
dispositivo que realice las funciones siguientes:
i) combinar dos haces láser diferentes en una
única trayectoria, y enfocar los dos haces sobre la misma zona o
sonda de la muestra;
ii) recoger la luz de fluorescencia resultante a
partir del mismo punto de la muestra;
iii) seleccionar las señales fluorescentes de
nivel relativamente bajo de entre lo que podría ser una señal láser
retrodispersada intensa;
iv) separar las dos señales fluorescentes una de
la otra y dirigirlas por trayectorias diferentes para que sean
medidas por detectores distintos.
Según la presente invención, se proporciona un
dispositivo óptico para dirigir señales ópticas en un analizador
basado en fluorescencia, que tiene fuentes de luz láser primera y
segunda, para proporcionar luz láser de iluminación a diferentes
longitudes de onda, comprendiendo el dispositivo:
filtros de paso de banda primero y segundo,
asociados con dichas fuentes de luz láser primera y segunda,
respectivamente, y dispuestos o montados de tal forma que permitan
pasar a su través la luz láser de la longitud de onda pertinente de
su láser asociado, pero que reflejen la luz láser de otras
longitudes de onda; estando dispuesto cada filtro de paso de banda
para dirigir la luz láser a partir de ambas fuentes de luz láser
hacia un único recorrido dirigido a una muestra que se va a
iluminar cuando está en uso; y
al menos dos filtros de paso de banda de
fluorescencia, cada uno de las cuales se monta de tal manera que
permita pasar a su través luz de una longitud de onda fluorescente
seleccionada;
en el que los filtros de paso de banda láser se
montan de tal forma que reflejen la luz fluorescente recibida
desde la muestra hacia los filtros de fluorescencia, de tal modo
que la luz recibida de la muestra se deje pasar a través de un
primero de los filtros de fluorescencia si es a una primera
longitud de onda y a través del segundo de los filtros de
fluorescencia si es a una segunda longitud de onda, para
proporcionar una señal de salida para análisis a una salida de cada
uno de los filtros de fluorescencia.
Se puede colocar un filtro de dispersión en el
recorrido óptico entre los dos filtros de fluorescencia, con el fin
de filtrar la luz dispersada hacia atrás a partir de las fuentes de
luz láser. La salida del filtro de dispersión se puede utilizar para
proporcionar una señal de enfoque para controlar, cuando se emplea
el equipo, el enfoque de las ópticas colocadas entre la salida de
los láseres y la muestra que se va a iluminar cuando se usa el
equipo.
Se pueden colocar uno o más filtros adicionales a
la salida de uno o más de los filtros de fluorescencia, con el fin
de disminuir la cantidad de interferencia a partir de la luz de
iluminación retrodispersada que podría pasar a través de ellos.
La luz recibida a través del filtro de
dispersión, que puede colocarse en el recorrido óptico entre los
filtros ópticos primero y segundo, se puede pasar hacia un
componente de detección de intensidad de iluminación, el cual puede
ser un diodo sensible a la luz, para proporcionar la señal de
enfoque o para proporcionar una salida de intensidad que puede
usarse para leer un código de barras asociado con una o más
muestras.
El dispositivo puede comprender, además, una o
más fibras ópticas colocadas en la trayectoria común de la luz, a
través de las cuales pasa la luz láser y se recibe la luz de la
muestra de vuelta.
Debería notarse que, utilizando la misma
metodología, escogiendo juiciosamente la especificación o
características de los elementos selectores de longitud de onda y
ampliando los principios descritos anteriormente en el texto, es
posible construir un dispositivo con la misma metodología que
utilice tres colores de láser sobre la misma microdisposición. Un
dispositivo tal debería, además, disminuir el número de
experimentos distintos que un investigador necesitaría realizar con
el fin de llegar al resultado final, ahorrando, en consecuencia,
tiempo y costes de manera significativa.
El montaje de elementos ópticos según la
invención forma el núcleo óptico de un dispositivo para medir la
fluorescencia generada por muestras biológicas etiquetadas de
manera fluorescente, montadas sobre un sustrato.
El dispositivo utiliza sólo filtros ópticos de
paso de banda, los cuales son más sencillos de fabricar, son más
baratos y están disponibles más fácilmente que los filtros de paro
de banda. Además el dispositivo consigue todas las funciones
principales de un lector de microdisposiciones
("microarrays") con solamente cuatro elementos de
filtro, de forma que su diseño es compacto y de bajo coste.
Se describirá ahora un ejemplo de la presente
invención, con referencia a los dibujos que acompañan el texto, en
los cuales:
la figura 1 es un diagrama esquemático que
muestra un ejemplo de la presente invención;
la figura 2 es una serie de gráficos que muestran
la intensidad de luz en diversos componentes del dispositivo de la
figura 1;
la figura 3 es un diagrama esquemático de un
segundo ejemplo de la presente invención;
la figura 4 es un diagrama esquemático que
muestra componentes ópticos adicionales que pueden emplearse con el
ejemplo de la figura 3;
la figura 5 es un diagrama esquemático de un
componente de enfoque que puede emplearse con el equipo de la
presente invención;
la figura 6 es un gráfico que muestra la
intensidad de la luz recibida por el equipo de la invención;
la figura 7 es un diagrama esquemático que
muestra el ejemplo de la figura 3 adaptado además para proporcionar
una señal de control de enfoque;
la figura 8 es un diagrama esquemático de un
ejemplo de la presente invención empleado para leer un código de
barras asociado con una disposición de muestras que se va a
iluminar;
la figura 9 es un diagrama esquemático que
muestra el ejemplo de la figura 7 adaptado además para proporcionar
una señal de control de potencia láser y un segundo componente de
enfoque de ejemplo; y
la figura 10 en un diagrama esquemático y un
ejemplo adicional de la presente invención.
En la figura 1 se muestra un ejemplo de la
invención. En este montaje, hay una primera trayectoria a lo largo
de la cual hay un primer haz láser colimado 1, el cual tiene, en
este ejemplo, una longitud de onda de 635 nm. Este haz 1 pasa a
través de un primer filtro láser 2 selector de longitud de onda, el
cual permite que pasen a su través todas las longitudes de onda en
el intervalo 635\pm5 nm, pero refleja todas las otras longitudes
de onda fuera de esta banda. Por lo tanto, si aparecen señales
espurias bien provenientes del láser que genera el haz 1 o bien
generadas a lo largo de la primera trayectoria, dichas señales son
reflejadas por el primer filtro láser 2 hasta un máximo de 99,99% y,
en consecuencia, se excluyen de una trayectoria de iluminación 3
por el que pasa el haz 1 después de atravesar el primer filtro
láser 2. La trayectoria de iluminación 3 termina en una muestra 4
en la que se ha enfocado el haz 1 para generar una señal de
fluorescencia que depende del marcador de fluorescencia específico
que se esté usando (denominado a medido "fluoróforo"). Un
marcador utilizado habitualmente es Cy5, el cual, cuando se excita
por un pico láser a 635 nm, produce una señal de luz fluorescente 5
en la región de 670 nm. Esta señal fluorescente 5, junto con el
resto de la longitud de onda láser de la excitación original se
transmite recorriendo en sentido inverso la trayectoria de
iluminación 3, en dirección al primer filtro láser 2. La figura
2(a) muestra un esquema del contenido espectral del haz que
viaja a lo largo de esta trayectoria. La señal fluorescente 5 a 670
nm se refleja en la superficie del primer filtro láser 2 con un
cierto ángulo a lo largo de la trayectoria 9. A la inversa, una gran
proporción (>90%) de la luz láser residual procedente del haz 1
pasa a través del filtro 2. En consecuencia, el primer filtro láser
2 produce el efecto de disminuir la cantidad de luz láser
dispersada en un orden de magnitud respecto de la señal fluorescente
5 generada en la muestra 4.
En paralelo con esto, un segundo haz de luz láser
6 se introduce a lo largo de una segunda trayectoria de
iluminación. En este ejemplo, se trata de un haz láser verde con
una longitud de onda de 532 nm. Pasa a través de un segundo filtro
láser 7, el cual, como el primer filtro láser 2, es selectivo
frente a la longitud de onda, pero que permite, en este ejemplo,
que pasen todas las longitudes de onda del intervalo 532\pm5 nm,
mientras que refleja todas las demás longitudes de onda. De nuevo,
esta propiedad del filtro es útil para limpiar el espectro del haz
de luz 6, si ha sido "contaminado" por otras señales en su
camino hacia el segundo filtro láser 7. Luego, el segundo haz de luz
6 pasa siguiendo una trayectoria 8 hacia el primer filtro láser 2,
donde es reflejado por la superficie y dirigido hacia la
trayectoria de iluminación 3. El ángulo de la trayectoria 8
respecto de la trayectoria de iluminación 3, \theta, es tal que el
haz de luz 6 se refleja sobre una trayectoria colineal con el
primer haz láser 1 y puede, por lo tanto, utilizar la misma óptica
(figura 5) que utiliza el primer láser para enfocarse sobre la
muestra 4. Es esencial que \theta no sea demasiado grande,
puesto que las características de reflexión del primer filtro láser
2 podrían hacerse sensibles a la polarización (se supone que la luz
dentro del presente sistema es despolarizada), disminuyendo la
eficacia del primer filtro láser 2 cuando se detiene luz cuya
longitud de onda está fuera de la banda de paso del primer filtro
láser 2. En este ejemplo \theta = 30º, y siempre debería estar,
preferentemente, en el intervalo de 20º a 30º. El haz de luz 6
excita un segundo fluoróforo en la muestra 4, que en este ejemplo
es Cy3, el cual produce fluorescencia a 570 nm. De nuevo, la luz
fluorescente 5 pasa en sentido inverso a lo largo de la trayectoria
3, y es reflejada por el primer filtro láser 2 y sobre la
trayectoria 8 (véase figura 2(b)), y en este caso, la mayor
parte de la luz láser verde residual pasa a través del segundo
filtro láser 7, y resulta eficazmente atenuada en un factor de 90%,
para cualquier residuo que se dirija a través de una trayectoria 10
hacia un primer filtro de fluorescencia 11 (figura 2(c)). En
consecuencia, a lo largo de la trayectoria 10 hay dos colores de
luz fluorescente a 570 y 670 nm, respectivamente, y dos colores de
luz láser residual a 532 y 635 nm.
El primer filtro de fluorescencia 11 se diseña de
forma que permita pasar a su través longitudes de onda en el
intervalo 570\pm15 nm; por lo tanto, la fluorescencia del segundo
fluoróforo Cy3 puede atravesar el primer filtro de fluorescencia 11
y puede continuar a lo largo de una primera trayectoria de medida 12
de manera relativamente libre, sin estorbos, mientras que los otros
tres componentes espectrales son reflejados por la superficie del
primer filtro de fluorescencia 11 a lo largo de la trayectoria 13.
Por lo tanto, lo que se propaga a lo largo de la primera trayectoria
de medida 12 es un haz relativamente puro de fluorescencia de 570
nm, a partir de la muestra 4 (figura 2(d)). Este puede
recogerse y enfocarse a un detector sensible (no mostrado en el
esquema), como un fotodiodo de avalancha (APD, por sus siglas en
inglés) o un tubo fotomultiplicador (PMT, por sus siglas en
inglés), donde se puede medir su intensidad.
Posteriormente, la señal de luz que viaja a lo
largo de la trayectoria 13 incide sobre un filtro de dispersión
opcional 14. En este caso, el filtro de dispersión 14 es un filtro
selector con la misma especificación que, bien el filtro láser 2,
bien el filtro láser 7. Por lo tanto, más del 90% de la luz
procedente de uno de los láseres pasará a través de 14, atenuando
la intensidad de ese láser en la luz que se refleja posteriormente a
lo largo de una trayectoria adicional 16. La luz transmitida viaja
desde el filtro de dispersión 14 a lo largo de la trayectoria 15.
Se puede escoger la especificación o características del filtro de
dispersión 14 para compensar según sea adecuado dependiendo de cual
de los dos haces de luz láser de excitación 3, 4, causen la mayor
parte de fondo en el canal de detección fluorescente rojo. En este
ejemplo, el filtro de dispersión 14 tiene la misma especificación
que el segundo filtro láser 7. En la posición que se muestra en el
esquema, el filtro de dispersión 14 presenta ciertas ventajas, en
cuanto a su capacidad para dirigir la luz que se va a analizar en
una dirección preferida para su análisis, por ejemplo, pero podría
colocarse en cualquier otro lugar en el dispositivo y conseguir un
resultado similar.
Finalmente, la luz que viaja a lo largo de la
trayectoria 16 incide sobre un segundo filtro de fluorescencia 17,
el cual permite pasar luz con una longitud de onda de 670\pm15
nm, formando un haz de luz relativamente pura que emana del
fluoróforo Cy5, que se puede recoger y medir por un segundo
detector óptico sensible (no mostrado) (fig 2(f)).
Debido a la proximidad espectral de los láseres y
de las señales de fluorescencia, puede ser necesario tener un corte
agudo en la respuesta espectral de alguno o de todos los filtros
que se emplean a lo largo de las trayectorias de salida de las
señales fluorescentes (en este caso los filtros de fluorescencia 11
y 17), lo que hace necesario utilizar más capas de dieléctrico para
construir los filtros pertinentes, para disminuir la intensidad
transmitida de la salida de las frecuencias de banda.
Debería notarse que la selectividad en longitud
de onda de los filtros 11, 14 y 17 se puede intercambiar sin que
importe mucho de cara a los resultados, aunque se apunta que el
orden que se presenta aquí tiene algunos méritos o ventajas de
orden práctico, como la capacidad para proporcionar datos de señal
adicionales para los usos que se describen más adelante en el texto
y para optimizar las posiciones de salida de señal, por
ejemplo.
Las señales de fluorescencia procedentes de los
fluoróforos de la superficie de la muestra 4 son sumamente débiles
en comparación con la intensidad de los haces de láser 1, 6
utilizados para excitar las señales. Los cálculos muestran que la
relación de intensidades entre la señal láser y la señal
fluorescente es generalmente del orden de 10^{6}. En
consecuencia, es importante que el haz láser residual resulte
atenuado en un alto grado en las trayectorias de medida 12 y 18,
los canales de medida. Debido a diversos detalles prácticos del
diseño y de la fabricación de los filtros, podría darse el caso de
que la luz de láser residual se atenúe solamente en un factor
10^{4} en ambas trayectorias de medida 12 y 18, provocando, por lo
tanto, un problema de interferencia potencial con los detectores
sensibles.
Y así, de este modo, la figura 3 ilustra un
desarrollo del dispositivo de la figura 1 que tiene filtración
extra en los canales de salida 12 y 18. Específicamente, se colocan
un primer y un segundo filtros adicionales 19 y 20 en las
trayectorias de medidas 12 y 18. Estos filtros tienen la misma
especificación que los filtros de fluorescencia 11 y 17,
respectivamente. Como se analiza a continuación, los filtros se
diseñan para funcionar cuando la luz incide en ellos con un ángulo
\theta/2 (=15º). Es un fenómeno bien conocido que si se colocan
dos filtros de interferencia en serie con los planos de sus
superficies paralelos entre sí, entonces se pueden establecer
resonancias Fabry-Perot en el espacio entre ellos,
reduciendo su eficacia. Por lo tanto, el primer filtro adicional 19
se coloca a \theta/2 respecto de la trayectoria de medida 12, y
no paralelo al primer filtro de fluorescencia 11, de la forma que
se ilustra en la figura 3. Este disposición de montaje permite que
los filtros 11 y 19 funcionen al óptimo de su rendimiento
combinado. Por lo tanto, el filtro 20 se dispone de una manera
similar respecto del filtro 17.
De una forma similar, se pueden disponer los
filtros adicionales 21 y 22 a lo largo de las trayectorias de
medida 12 y 18. Estos son filtros diseñados para funcionar a un
ángulo de incidencia 0º, y en este caso, uno de estos filtros se
puede colocar en serie con los filtros anteriores. Tales filtros
tienen la ventaja de estar disponibles de manera mucho más
corriente y pueden, en algunas circunstancias, ser comprados como
objetos prefabricados, por lo que son baratos.
La adición de la filtración suplementaria supone
una atenuación adicional de la luz de láser residual
(\sim10^{3} -10^{4} por filtro), mientras que produce sólo
una reducción de 0,8 por filtro en la señal fluorescente que se va
a medir.
El dispositivo de la invención se puede integrar
en un sistema de recogida y entrega de fibra óptica, haciéndolo así
práctico y adecuado para entregar la luz a la muestra 4 y, a su
vez, para recoger y enfocar la luz filtrada sobre los
detectores.
En este montaje, mostrado en la figura 4, la luz
de láser roja 23 se guía en una fibra óptica 24, en el que la fibra
se termina con la luz roja formando luego un haz divergente 25 que
incide sobre una lente que, a su vez, colima la luz en un haz de
luz paralelo que se propaga a lo largo de la misma trayectoria que
en 1. De manera similar, el haz láser verde 30 se entrega al
dispositivo utilizando la misma combinación de lente y fibra.
Desde este punto la luz se mueve a través del
dispositivo como se ha descrito anteriormente en el texto, excepto
porque un montaje de conjunto de lente y fibra 29, 35, lleva la
energía del haz láser a la muestra y luego recoge la luz que viaja
desde la muestra; en consecuencia, el cono de luz 28 es
bidireccional y consiste en 4 colores de luz.
La luz se dirige luego a través del dispositivo
utilizando el mismo montaje o disposición de filtros, excepto que
cuando la luz fluorescente sale a lo largo de la trayectoria de
medida 12, la luz se enfoca utilizando la lente 32 sobre la fibra
33, la cual lleva la luz a un detector óptico. Asimismo, la luz
que sale a lo largo de la trayectoria de medida 18 se recoge
mediante un montaje similar 34 de una lente y una fibra, con el fin
de conducir la luz hasta un detector (no mostrado). En esta
disposición, todas las entradas al dispositivo y todas las salidas
desde el mismo son mediadas mediante guías de onda de fibra óptica,
permitiendo que el dispositivo sea considerado de manera flexible,
respecto de los láseres y detectores, y facilitando el empaquetado
completo del sistema.
Además, introducir los haces láser mediante
fibras permite que un único láser sea compartido entre un cierto
número de dispositivos. Por ejemplo, el dispositivo se podría
suministrar al usuario final sin láseres instalados en los extremos
de las puertas 24 y 31. Luego, el usuario final, bien tiene o bien
compra un láser con un cierto número de salidas ópticas acopladas
de fibra, a cuyo punto se introduce la luz láser acoplando una de
estas salidas a las puertas de entrada 24 o 31. De esta forma, se
puede reducir la complejidad y el coste global de instalar el
dispositivo de la invención, puesto que un láser de 100 mW puede
servir de suministro a 10 o más conjuntos independientes de
aparatos. Esta característica es especialmente útil cuando se
instalan muchos dispositivos uno junto a otro.
La figura 5 muestra un ejemplo de un sistema de
enfoque para usarlo en la presente invención. Este sistema es un
medio de acoplar luz procedente de la fibra óptica 35 sobre una
pieza de trabajo semitransparente 42, en la cual se coloca un
compuesto fluorescente en el punto 43, el cual se excita mediante la
luz y, en consecuencia, emite luz fluorescente que, a su vez, se
recoge con el sistema óptico y se hace pasar en sentido inverso por
la misma fibra óptica, por lo cual se genera una señal de
realimentación que permite al usuario medir cómo de bien enfoca el
dispositivo la luz sobre la pieza de trabajo 42. Esto constituye la
base de un sistema automático para optimizar la distancia entre una
lente objetivo 40 y la pieza de trabajo 42.
Cuando se emplea, uno o múltiples haces láser 1,6
se transmiten a través de la fibra óptica 35. En este caso la fibra
es una fibra de clase estándar para telecomunicaciones y, por
ejemplo, la fibra podría ser una fibra de diámetros 50/125
micrómetros (núcleo/revestimiento) con una apertura numérica (NA,
por sus siglas en inglés) de 0,2. La fibra acaba en una cara
partida o pulida plana y, en consecuencia, en primera aproximación
la energía láser estaría distribuida sobre un disco 47 de 50
micrómetros, irradiando en un cono 37 con un semiángulo de
\sim11,5º. Luego, la luz incide en una primera lente 38, separada
del final de la fibra por una distancia generalmente igual a su
longitud focal. En este caso, la lente 38 es una lente esférica,
optimizada para las longitudes de onda de la luz que pasan a través
de la misma. Para tomar un ejemplo concreto ilustrativo, la lente
38 podría ser una lente p/n 350260 fabricada por Geltech Inc. Aquí
la lente tiene una NA de 0,16, por lo tanto sólo acepta luz de un
cono 36 más estrecho, el cual tiene un semiángulo de \sim9,2º; en
consecuencia hay algo de exceso de la luz que sale de la fibra,
pero, como se discutirá más adelante en el texto, esto no es
importante de cara al rendimiento global del dispositivo. Como
resultado del hecho de que la luz pasa a través de la lente 38,
forma un haz paralelo 39 que se transmite hasta la lente objetivo
40. En este caso, es conveniente maximizar el NA de la lente
objetivo 40, a fin de conseguir dos metas. En primer lugar,
haciendo que el NA de la lente objetivo 40 sea mayor que el de la
lente 38, se conseguirá una disminución de la imagen del disco 47
sobre la pieza de trabajo 42, en el punto 43. En segundo lugar,
maximizando el NA de la lente objetivo 40, la cantidad de luz
fluorescente recogida se maximizará, aumentando la relación de señal
a ruido.
Se comprenderá que es posible utilizar diferentes
diámetros de fibra para la fibra 35, y, que cambiando el diámetro
y/o las propiedades de las lentes 38 y 40, es posible ajustar el
tamaño de la mancha de iluminación en el punto 43, para optimizar el
rendimiento de un analizador que emplee el dispositivo, por lo que
se refiere a su capacidad para extraer información de la superficie
del sustrato 42.
Por lo tanto, como ejemplo, la lente objetivo 40
podría ser una lente p/n 350330 de Geltech Inc., que reduciría el
tamaño de la imagen proyectada del disco 47 sobre la pieza de
trabajo 42 en un factor 4,3X (diámetro de \sim11,6 micrómetros) y
subtendería \sim27% de todo el ángulo sólido disponible.
La lente objetivo 40 enfoca la luz a través de un
cono de convergencia 41 sobre la pieza de trabajo 42, en el punto
43. Es en este punto donde se genera la señal de fluorescencia por
la muestra depositada en la superficie frontal de la pieza de
trabajo 42, siendo recogida por la lente objetivo 40 como un cono de
luz divergente 44, el cual a su vez resulta colimado en un haz
paralelo 45 por la lente convergente 40, y luego enfocado por la
lente 38 en un cono convergente 46 que se acopla en sentido inverso
en la fibra 35 y se propaga a continuación a lo largo de la fibra 35
en la dirección opuesta a los haces de láser iniciales 1,6.
Debería notarse que cuando se acopla luz en
sentido inverso en la fibra 35 es crucial que la NA de la lente 38
sea inferior a o igual que la NA de la fibra 35, con el fin de
asegurar que toda la señal de fluorescencia se acople en la fibra
35 de forma que las pérdidas debidas al exceso sean mínimas o
inexistentes. Esto es debido a que es esencial minimizar la
cantidad de energía láser necesaria para recoger una cantidad dada
de señal fluorescente, puesto que las intensidades altas de láser
durante períodos prolongados tienden a dañar los componentes
fluorescentes depositados sobre la pieza de trabajo 42, haciendo
que sean menos eficaces a medida que el tiempo pasa. Cuando se
acopla luz de la fibra 35 en la lente 38, se puede contrarrestar
una baja eficacia de recogida de luz de la lente 38 aumentando la
potencia del láser para compensar, dado que normalmente hay margen
suficiente de potencia de láser en exceso disponible.
Como se ha analizado previamente en el texto, se
trata de que la luz que se propaga se compone de la luz fluorescente
generada por las moléculas en el punto 43 y un resto de los haces
láser iniciales utilizados para excitar la fluorescencia. El resto
de láser se debe a una serie de causas. Por ejemplo, imperfecciones
sobre la superficie y en el interior del cuerpo de la pieza de
trabajo 42, más una reflexión de 4% en sentido inverso a lo largo
del recorrido provocada por la no coincidencia de impedancias entre
el cuerpo de la pieza de trabajo 42 que tiene un índice de
refracción de \sim1,5 y el aire que tiene un índice de refracción
de \sim1. De esta manera, siempre habrá una mínima cantidad de
los haces láser excitadores viajando en sentido inverso a lo largo
de la fibra 35.
Es el caso que la imagen del disco 47 en el punto
43 se debe a las distancias entre la lente 38 y el disco 47 (D1) y
entre la lente objetivo 40 y el punto 43 (D2). En este dispositivo
D1 es fijo y, por lo tanto, solo puede variar D2. En consecuencia,
midiendo la cantidad de luz láser que se propaga a lo largo de la
fibra 35 es posible decir cómo de bien se ha optimizado D2.
Específicamente, la figura 6 muestra la curva de respuesta para el
sistema cuando se varía D2; se ve que en el enfoque óptimo de la
lente objetivo 40 respecto del punto 43, la intensidad de la luz
transmitida en sentido inverso hacia la fibra alcanza un máximo 48
y que al otro lado del máximo 48 la intensidad disminuye.
En la práctica, la señal se podría detectar en un
cierto número de diferentes puntos del equipo. El lugar primario es
hacia atrás en la fibra 35 en el dispositivo mostrado en las
figuras 1, 3, 4 y 7. Con referencia ahora a la figura 7, la luz
láser verde o roja se acopla en el aparato de ejemplo descrito
anteriormente en el texto y uno de los haces láser de vuelta tiene
una camino fuera del dispositivo a lo largo de la trayectoria 15.
De este modo, la figura 7 muestra opciones de ejemplo para detectar
la luz láser reflejada. En una opción, la fibra óptica 24 tiene
insertado un acoplador direccional 49 que permite el paso de la luz
láser reflejada en sentido inverso de la fibra hacia un sensor
fotoeléctrico 52. Puesto que está ubicado detrás del primer filtro
láser 2, sólo tenderá a propagarse por esta rama una única
frecuencia de energía láser. El voltaje a través del sensor 52,
V_{salida}, será proporcional a la intensidad de la luz que se
refleja en la pieza de trabajo 42 y, de este modo, se puede usar
para generar la señal de autoenfoque, como se muestra en la figura
6.
Asimismo, se puede colocar un montaje o
disposición similar alternativamente a lo largo de la fibra 31,
donde se introduce la otra frecuencia láser, donde el otro color de
luz láser reflejada se dirige a un detector 54.
Situar los fotodetectores 52, 54 a lo largo de
las fibras 24, 31 en las cuales se introduce la energía en el
dispositivo podría hacer propenso a que la señal de vuelta de la
muestra sea débil, en comparación con la luz perdida que se
introduce en el detector directamente desde un láser 1,6. De este
modo, también es posible, como alternativa, situar un detector 55 a
lo largo de la trayectoria 15, que no tiene ningún láser. Colocar
aquí el sensor fotoeléctrico permite que la luz sea irradiada
directamente sobre el área fotosensible del sensor 55 desde el
espacio libre, sin necesidad de una fibra de conexión. De este modo
se ahorra coste y se aumenta potencialmente la señal recibida por
el sensor 55.
La salida de los sensores 52, 54 o 55 se puede
usar luego para generar una señal de control que, a su vez, se
utiliza para manejar un sistema de servomotor que varía de manera
continua la distancia D2, con el fin de optimizar la señal
fluorescente que se está midiendo. Esto es muy conveniente, porque
en la práctica la pieza de trabajo 42 no será plana ni tendrá un
espesor uniforme. De este modo, puesto que el montaje de la lente
se mueve a través de la superficie de la pieza de trabajo 42, D2
estará siempre variando. Tal control en tiempo real de la distancia
D2 asegura que la calidad de la imagen fluorescente generada por el
dispositivo sea óptima en todas las condiciones.
Para investigaciones ("screening") de
ADN de alta producción, hay una gran cantidad de datos que es
preciso catalogar rápida y eficazmente. Por consiguiente, existe
una tendencia a marcar los sustratos con códigos de barras. Esto
permite que el sustrato sea identificado durante todo su recorrido,
a lo largo de toda su vida útil, desde su creación inicial, hasta
la impresión de la microdisposición y finalmente la hibridización
y lectura. Lo que se describe a continuación ilustra como se puede
leer un código de barras utilizando el ejemplo de la invención sin
que sea necesario añadir ningún equipo adicional.
La figura 8 ilustra una posible configuración de
dicho dispositivo. En este caso, toda la electrónica de detección
utilizada para leer las débiles señales de fluorescencia que se ha
descrito anteriormente en el texto se desconecta, junto con uno de
los láseres 1, 6 y, de este modo, para los objetivos de esta
discusión, es el segundo láser (verde) 6 el que se emplea para
barrer sobre el código de barras 57. Por lo tanto, en este caso se
carga un sustrato 56 con un código de barras preimpreso 57 en una
máquina que utiliza la invención y el sustrato se pasa por debajo
de la óptica de los ejemplos descritos anteriormente en la figura
5, indicada aquí mediante el número 58. El código de barras 57 se
barre atravesando la trayectoria 59 pasado el punto focal de la
óptica 58 y de este modo una cantidad de luz láser variable con el
tiempo que es reflejada desde el código de barras 57, recogida por
la óptica 58 y enviada a lo largo de la fibra óptica 35 de vuelta
hacia la óptica espectral, según se ilustra en las figuras
1-7. Como resultado de incluir el sistema de
enfoque, según se ilustra en las figuras 5-7, la luz
de láser verde sale de la óptica espectral a lo largo de una
trayectoria 62 e incide en un detector 54 colocado como se muestra
en la figura 7. En su salida puede verse un voltaje que varía con
el tiempo (ver inserto) lo cual significará que, si se maneja a
velocidad constante el sustrato 56, el contenido de información
del código de barras 57 se puede leer mediante programas y equipos
adecuados.
Debería notarse que en este caso la distancia
focal entre la óptica 58 y el sustrato 56 es menos crítica que
cuando se está detectando la fluorescencia de alta resolución; de
este modo, la función de enfoque no es necesaria y los componentes
pueden realizar esta función doble. La figura 9 muestra un montaje
alternativo que emplea la misma metodología para generar la señal de
autoenfoque pero que no utiliza el montaje detallado en la figura 5
para introducir la luz en la muestra y para recogerla.
La figura 9 muestra un equipo de similar
construcción al que se ha detallado en la figura 1, en el que se
dispone una muestra 63 con un marcador de fluorescencia, junto al
dispositivo y en el que se enfoca en el dispositivo un haz paralelo
de luz a una sonda en 63 mediante una lente convergente 64. En este
caso, a través del dispositivo se propaga una mezcla de la luz
fluorescente y el haz láser reflejado 64 hasta que alcanza un
filtro 65 que tiene las características o especificación de los
filtros láser 2 o 7.
Dependiendo de las características del filtro 65,
el haz 66 se compone de la luz láser que es reflejada por la
superficie de la lente 64, donde este haz paralelo pasa a través de
la lente 68, la cual es, de nuevo, una lente convergente que enfoca
la luz sobre el final de la fibra 69, la cual transmite la luz por
medio de un haz 70 en el espacio libre hasta el detector 71, el
cual se emplea para formar la misma señal de salida V_{salida}
que se utiliza en el ejemplo de la figura 6. En este caso la imagen
de la mancha de luz en la muestra 63 está alineada con el final de
la fibra y se consigue una representación óptica uno a uno. De este
modo se realiza el acoplamiento de potencia óptimo con la fibra 69
cuando el espaciado D3 entre 63 y 64 es igual a la longitud focal de
la lente 64. De manera similar al ejemplo anteriormente descrito,
cambiando D3 y controlando la V_{salida} del detector 71, se
puede conseguir y mantener el valor óptimo de D3 si la muestra 63
tiende a moverse respecto de la lente 64 puesto que es barrida
"rasterizadamente" bajo la lente 64.
Hay otras opciones para colocar el detector. En
la figura 9, el número 72 es una de las fibras utilizadas para
introducir uno de los colores de luz láser en el dispositivo. Si
se da el caso de que se emplea un acoplador 1-2
ramificado en lugar de una simple pieza de fibra, entonces la luz
láser de retorno se acopla en el detector 74 y una parte de la luz
láser de retorno 75 se puede acoplar en el detector 76 y funcionar
para producir una señal adecuada para un sistema de autoenfoque.
Debería notarse que el uso del detector 74 conducirá muy
probablemente a la pérdida de la potencia láser introducida en el
dispositivo y, por lo tanto, afectará al rendimiento global del
sistema.
El uso de este método tiene ventajas
operacionales frente al uso de una fibra intermedia. Ante todo, esto
se relaciona con la peculiaridad del voltaje V_{salida}. En la
situación presentada en el párrafo precedente, la cantidad de luz
láser reflejada 63 es \sim4% para una interfaz
vidrio-aire, en la que el vidrio tiene un índice de
refracción de \sim1,5. Puesto que no existe una fibra intermedia
entre el dispositivo y la muestra 63, entonces, en este caso, hay
el número mínimo de superficies ópticas entre la muestra y la fibra
69.
Aquí, en este punto, esto conduce a que el 80%
de la señal enfocada sobre la fibra 69 esté compuesta de luz
procedente de la interesante reflexión vidrio-aire
de la muestra 63. Esto puede compararse con la situación existente
cuando hay una fibra interpuesta entre la muestra 63 y la lente 64
más el conjunto de óptica según se ilustra en la figura 5, en la
cual la luz reflejada por la superficie de la muestra 63 comprende
menos del 33% de la señal en el detector cuando la fibra termina y
las lentes adicionales contribuirán con más de dos veces tanta luz
como la reflexión de la superficie y estos otros componentes no
variarán con D3, y, por tanto, la señal eléctrica ilustrada en la
figura 6 se situará sobre un fondo constante que es más del doble
que la señal que varía. Por lo tanto, la electrónica utilizada
para optimizar el valor de D3 encontrará más fácil detectar la
condición óptima sin la presencia de la fibra.
Debería notarse que con el fin de optimizar la
cantidad de luz recogida por la detección, bien sea de la
fluorescencia o bien de la luz de autoenfoque, es necesario ajustar
la NA y el diámetro de la lente 64 a las lentes utilizadas para
acoplar luz en las fibras. En este caso, para optimizar la cantidad
de luz fluorescente dispersada recogida de la muestra es necesario
que la NA de la lente 64 sea tan grande como sea posible y, en la
práctica, este valor debería ser >0,6. En contraste, la luz usada
para acoplar la luz en la fibra 69 no debería tener una NA mayor
que la de la fibra; de este modo, el resultado es que la NA de la
lente 68 y de todas las lentes similares debería estar comprendida
en el intervalo 0,12-0,2.
Por un cierto número de razones, resulta
conveniente poder controlar la potencia del haz láser que se está
introduciendo en el bloque en tiempo real. Con el fin de hacer esto
sin pérdida significativa de señal, podría emplearse el montaje o
disposición esbozado en la figura 9. Aquí, el filtro número 75 es
idéntico al filtro 2 según se ha descrito anteriormente en el
texto. Cuando el haz láser pasa a través del filtro 75, una pequeña
cantidad de la potencia será reflejada por la superficie y se
acoplará en sentido inverso a lo largo de la trayectoria 76 hacia
un detector óptico 77. Esta cantidad puede ser tan baja como un
0,2% si se aplican al filtro 75 revestimientos multicapa correctos,
pero incluso esta pequeña fracción es aún lo bastante baja como
para ser detectada holgadamente por incluso un detector sencillo
como un diodo PIN de silicio.
Si se dispone de una medida directa de la
potencia láser introducida en el bloque, se puede emplear esa
información para diversos usos. A corto plazo, si la potencia del
láser fluctúa a lo largo de un barrido, entonces, se pueden
corregir en primer orden los cambios que esto introducirá en la
intensidad de la fluorescencia detectada. En segundo lugar, puesto
que el láser envejece cuando se usa normalmente, se puede emplear
esta señal como un medio de controlar la caída de potencia y de
señalar o avisar cuando la potencia en el dispositivo ha caído por
debajo de niveles aceptables y, por consiguiente, se debe
reemplazar el láser.
La energía reflejada de esta manera es
intrínseca, pero utilizándola de esta forma no se introducen
elementos ópticos adicionales en el haz y, por lo tanto, pérdidas
adicionales, convirtiéndolo en un método eficaz de introducir tal
característica. Además este método de control se puede utilizar en
cualquier parte del dispositivo y no se está limitado a la posición
ilustrada.
En muchos campos de estudio, en especial en
estudios de organismos vivos, puede resultar ventajoso emplear
diferentes tintes fluoróforos coloreados para resaltar diferentes
productos químicos o diferentes procesos químicos que tienen lugar
dentro de las células. Estos tienen que ser excitados utilizando
diferentes colores de energía de excitación y, entonces, las
imágenes formadas tienen que separarse según sus colores. Esto
puede llevarse a cabo de dos formas: en la primera, el haz singular
en el sistema descrito hasta ahora se puede barrer sobre la
superficie de la muestra para formar una imagen a partir de un
modelo "rasterizado" (producido por barrido). En segundo
lugar, la muestra se puede representar como se hace en el
microscopio, con el fin de detectar la fluorescencia resultante.
Como la estructura descrita del dispositivo mantiene la información
espacial contenida en el haz de luz, se pueden usar los principios
para combinar y separar los distintos componentes en sistemas de
representación mediante imágenes multifluoróforos, tales como un
microscopio.
Un dispositivo tal se ilustra en la figura 10. En
esta configuración, el dispositivo se apunta a un sustrato 78,
sobre el cual hay distribuciones espacialmente diferentes de
colorantes fluorescentes que, con propósitos ilustrativos se
muestran como una "W" (79) y una "X" (80). En concreto,
los colorantes que componen 79 y 80 se excitan con \lambda_{ew}
y \lambda_{ex}, y producen fluorescencia, respectivamente, a
\lambda_{fw} y \lambda_{fx}. En este montaje,
\lambda_{ew} se alimenta al dispositivo a lo largo de la
trayectoria 81, pasando a través del filtro de paso de banda 82.
Igualmente, \lambda_{ex} se alimenta a través de la trayectoria
83, pasando a través del filtro de paso de banda 84. Ambos filtros,
82 y 84, están puestos a punto para permitir el paso de una banda
estrecha de longitudes de onda, centradas en \lambda_{ew} y
\lambda_{ex}, respectivamente, con una anchura de
5-10 nm. Fuera de esta banda, toda la luz se
refleja de forma eficaz. Luego, \lambda_{ew} avanza a lo largo
de la trayectoria 85 a un conjunto de óptica 86 las imágenes del
haz láser paralelo sobre el sustrato 78. En paralelo,
\lambda_{ex} se transmite a lo largo de la trayectoria 87,
rebota en la superficie del filtro 82 y luego se dirige a la óptica
86 a través de la trayectoria 85. En este caso, 85 podría ser
similar en forma a un microscopio óptico, que comprende el objetivo
del microscopio que está dispuesto a la distancia correcta de la
muestra para formar una imagen y la óptica asociada para convertir
la imagen en un haz de luz paralelo (o casi paralelo) que es
adecuado para ser alimentado por el extremo frontal de la invención
descrita en el texto.
En este punto, 79 y 80 son luz excitada y
emitida a \lambda_{fw} y \lambda_{fx.}, respectivamente,
que se recogen mediante la óptica 86, la cual convierte las
imágenes en haces de luz paralelos que se transmiten de vuelta a lo
largo de la trayectoria 88. En este punto, el haz comprende las
imágenes de 79 y 80 a \lambda_{fw} y \lambda_{fx}. más
excitación láser residual a \lambda_{ew} y \lambda_{ex}.
Puesto que el haz se refleja en el filtro 82 y luego viaja a lo
largo de la trayectoria 89 y luego a través del filtro 84, tanto
\lambda_{ew} como \lambda_{ex} se atenúan en un factor de
\sim10X, puesto que los filtros 82 y 84 son transparentes a
\lambda_{ew} y \lambda_{ex} respectivamente, permitiendo a
la mayor parte de la potencia pasar a través del filtro a estas
longitudes de onda. Puesto que el haz es reflejado en el filtro 84,
pasa luego a lo largo de la trayectoria 90 al filtro 91. Aquí, con
el objetivo de ilustra la invención, el filtro 91 es un filtro de
paso de banda puesto a punto para que permita el paso de las
longitudes de onda de la región de \lambda_{fw}. De este modo,
después del filtro 91, el haz 92 contiene solamente la información
espacial codificada por 79, donde ésta pasa a un conjunto de óptica
93, que forma una imagen 94 de 79 a \lambda_{fw}. Como se ha
expuesto anteriormente, manteniendo la analogía con un microscopio
de representación mediante imágenes, 93 podría ser similar en cuanto
a la forma al ocular de un microscopio o a la óptica necesaria que
se emplea para proyectar micrografías sobre el área fotosensible de
una cámara. La imagen se puede detectar por diversos sensores de
imagen, como el ojo humano, o, más probablemente, por un detector
electrónico sensible espacial como un sensor CCD o CMOS. De manera
paralela, la luz a \lambda_{fx} y, en consecuencia, la
información espacial codificada en 80, es reflejada por el filtro
91 y pasa a lo largo de la trayectoria 95 hacia el filtro 96. En el
mismo sentido que el filtro 91, el filtro 96 permite que pasen
todas las frecuencias en la región de \lambda_{fx}, mientras
que refleja todas las demás. Por lo tanto, la información espacial
contenida dentro de 80 pasa a lo largo de la trayectoria 97 hacia
la óptica 98, que es similar a la óptica 93 en que es un conjunto
de óptica que forma una imagen 99 de 80.
La principal ventaja de este dispositivo es que
es el método más eficaz para dividir imágenes multilongitud de onda
a partir de un blanco compuesto individual. De nuevo, debería
notarse que la estructura del dispositivo descrita es escalable, y
que el haz 100 reflejado por 96 puede contener imágenes a otras
longitudes de onda que pueden dividirse mediante un montaje similar
de filtros al que comprende los filtros 82, 84, 91 y 96.
Claims (11)
1. Un dispositivo óptico para dirigir señales
ópticas en un analizador basado en fluorescencia, que tiene fuentes
de luz láser primera y segunda para proporcionar luz láser de
iluminación a diferentes longitudes de onda, que comprende:
filtros de paso de banda primero y segundo (2,7)
asociados con dichas fuentes de luz láser primera y segunda,
respectivamente, y montados para permitir que la luz láser de la
longitud de onda pertinente del láser asociado pase a su través
pero que refleje la luz de otras longitudes de onda; estando cada
filtro de paso de banda dispuesto a la luz láser directa procedente
de ambas fuentes de luz láser en una trayectoria individual (3)
dirigida a una muestra (4) que se ilumina; y
al menos dos filtros de paso de banda de
fluorescencia (11,17), cada uno de las cuales se monta de tal manera
que permita pasar a su través luz de una longitud de onda
fluorescente seleccionada;
en el que los filtros de paso de banda láser (2,
7) se montan de tal forma que reflejen la luz fluorescente recibida
desde la muestra (4) hacia los filtros de fluorescencia (11, 17),
de tal modo que la luz recibida de la muestra se deje pasar a
través de un primero de los filtros de fluorescencia si es a una
primera longitud de onda y a través del segundo de los filtros de
fluorescencia si es a una segunda longitud de onda, para
proporcionar una señal de salida para análisis a una salida de cada
uno de los filtros de fluorescencia.
2. Un dispositivo según la reivindicación 1, que
comprende además un filtro de dispersión, (14), para filtrar la luz
láser retrodispersada.
3. Un dispositivo según la reivindicación 2, en
el que una salida de uno de los filtros láser (2, 7) del filtro de
dispersión (14) se utiliza para proporcionar una señal de
control.
4. Un dispositivo según la reivindicación 3,
configurado para alimentar la señal de control a un dispositivo de
enfoque asociado con la salida del dispositivo para proporcionar
control al mismo.
5. Un dispositivo según la reivindicación 3 o la
reivindicación 4, configurado para alimentar la señal de control a
un procesador adaptado para analizar la señal de control, para
proporcionar una salida indicativa de un código de barras que se
barre por al menos uno de los haces de luz láser.
6. Un dispositivo según cualquier reivindicación
precedente, en el que se colocan uno o más filtros adicionales (19,
20, 21, 22) a la salida de uno o más de los filtros de
fluorescencia (11, 17), con el fin de disminuir la cantidad de
interferencia que puede pasar a su través, procedente de la luz de
iluminación retrodispersada.
7. Un dispositivo según cualquier reivindicación
precedente, que comprende además una o más fibras ópticas colocadas
en la trayectoria de la luz a través de la cual pasa la luz láser y
se recibe la luz de fluorescencia de retorno.
8. Un analizador basado en fluorescencia que
comprende:
unas primera y segunda fuentes de luz láser
dispuestas para emitir luz láser de diferentes longitudes de
onda;
un dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, acoplado a las fuentes de luz láser;
y
medios de análisis asociados a las salidas de
cada uno de los filtros de fluorescencia, para proporcionar datos
basados en fluorescencia sobre ellos.
9. Un analizador según la reivindicación 8, que
comprende además medios para controlar la potencia de la luz láser
introducida al dispositivo óptico y medios para comparar dicha luz
láser con los niveles de luz fluorescente recibida.
10. El analizador de las reivindicaciones 8 o 9,
que comprende además medios para enfocar la luz láser de salida
sobre una muestra; y
medios para generar un movimiento relativo entre
la luz de barrido y la muestra que se va a barrer.
11. Un analizador según las reivindicaciones 8 o
9, dispuesto para separar imágenes multilongitud de onda
procedentes de un único blanco compuesto según sus longitudes de
onda propias o particulares.
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