ES2642930T3 - Procedimiento y aparato para detectar fluorescencia de una muestra - Google Patents

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ES2642930T3 ES01923535.7T ES01923535T ES2642930T3 ES 2642930 T3 ES2642930 T3 ES 2642930T3 ES 01923535 T ES01923535 T ES 01923535T ES 2642930 T3 ES2642930 T3 ES 2642930T3
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Abstract

Un aparato para detectar la fluorescencia de una muestra líquida (1), que comprende: - un primer medio lumínico de excitación que comprende al menos dos fuentes lumínicas de excitación (4a, 4b) que comprenden una primera fuente lumínica de excitación (4a), teniendo la primera fuente lumínica (4a) una trayectoria lumínica principal (5a), y una segunda fuente lumínica de excitación (4b); - un plano de muestra para colocar dicha muestra, donde el plano de muestra se dota de un área de detección: - un compartimento de muestra (2), - un medio de detección (6) que comprende al menos un primer detector (7) para detectar señales de fluorescencia de la muestra, siendo el eje entre el medio de detección y el plano de muestra el eje de detección-muestra (8), - un procesador acoplado para recibir datos del detector o detectores, - un medio de enfoque (10) para enfocar las señales al medio de detección (6), teniendo dicho medio de enfoque (10) un ángulo de recogida, estando el ángulo entre la trayectoria lumínica principal de excitación de la primera fuente lumínica y el eje de detección-muestra (8) entre el ángulo de recogida/2 y 90º, caracterizado porque las al menos dos fuentes lumínicas (4a, 4b) son al menos dos diodos emisores de luz; el compartimento de muestra (2) es para albergar la muestra líquida; el primer medio de detección (6) es una fila de elementos de detección; y el medio de enfoque (10) proporciona aumentos en el intervalo de 2/1 a 1/10, formando así una imagen del área de detección en la fila de detección de elementos de detección.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento y aparato para detectar fluorescencia de una muestra 5 La presente invencion se refiere a un aparato y a un procedimiento para detectar fluorescencia de una muestra. Antecedentes de la invencion
La iluminacion de una muestra en microscopfa puede clasificarse en principio en dos clases diferentes:
10
• Microscopios de transmision, donde la fuente lumfnica esta localizada en un lado de la muestra y un sensor o detector en el otro lado de la muestra para detectar la luz que se transmite a traves de la muestra.
• Microscopios de reflexion, donde la fuente lumfnica esta localizada en el mismo lado de la muestra que el sensor o detector para detectar la luz que se refleja de la muestra. La luz de la fuente lumfnica se deflecta por una superficie
15 parcialmente transmisora y deflectora, tal como un divisor de haz, p.ej. un espejo dicroico, para iluminar la muestra. La luz reflejada de la muestra se permite transmitir a traves de la superficie hacia el medio de deteccion.
En microscopfa de fluorescencia, la fuente lumfnica proporciona luz de excitacion en lugar de meramente iluminacion. Puesto que la senal de fluorescencia que se detecta es de baja intensidad en comparacion con la 20 intensidad de la luz de excitacion, es importante que no se transmita luz de excitacion directamente o sin filtrar al detector.
En el documento US 5.805.342 (Gravely), se muestra un sistema de fluorescencia de tipo transmision asf como de tipo reflexion, donde la fuente lumfnica se propaga por o barre la muestra en el plano de muestra. La luz de 25 excitacion esta localizada en el lado opuesto de la muestra o localizada de modo que la luz se deflexione por una superficie parcialmente transmisora y deflectora.
Para producir microscopios de fluorescencia mas compactos que tengan mas funcionalidades, los presentes inventores han inventado un microscopio de fluorescencia que puede construirse de manera mas compacta que los 30 anteriormente conocidos, y por lo tanto utilizable como microscopio de fluorescencia portatil.
Puede encontrarse tecnica relevante adicional en los documentos US 4.421.772, US 4.331.358, US 4.336.029 y US 4.146.604.
35 Resumen de la invencion
La presente invencion se refiere a un aparato para detectar la fluorescencia de una muestra como se define en la reivindicacion 1.
40 Ademas, la invencion se refiere a un procedimiento de valoracion de un parametro de una muestra como se define en la reivindicacion 24.
Dibujos
45 La Fig. 1 muestra un sistema de excitacion de un lado.
La Fig. 2 muestra una seccion transversal del filtro lumfnico de excitacion en un plano paralelo al plano de muestra.
La Fig. 3 muestra el angulo de recogida C y el angulo E entre la trayectoria lumfnica principal de excitacion y el eje
de deteccion-muestra.
La Fig. 4 muestra un sistema de excitacion/deteccion de dos lados.
50 La Fig. 5 muestra un sistema de excitacion de dos lados.
La Fig. 6 muestra un sistema de deteccion de dos lados.
La Fig. 7 muestra un resultado de emision registrado de una muestra de celulas somaticas en solucion de leche.
Definiciones
55
Los siguientes terminos tienen los significados expuestos a continuacion:
Angulo de recogida: se usa en su significado convencional, es decir, el angulo para el que un medio de enfoque puede recoger senales para detectar por el medio de deteccion.
60 Angulo de recogida/2: significa la mitad del angulo de recogida.
Area de deteccion: el area de la superficie de la muestra para detectar por una deteccion.
Eje de detector-muestra: el eje del detector a la muestra.
Exposicion directa: significa que el angulo entre la trayectoria lumfnica principal y el eje de deteccion-muestra esta entre el angulo de recogida/2 y 90°.
5 Profundidad de foco: la distancia que puede moverse un objeto a lo largo del eje de un sistema de enfoque sin distorsionar su imagen, definiendose tal distorsion como cuando una imagen, que cuando esta en foco ilumina un solo elemento de deteccion, cuando esta distorsionada ilumina un area que se extiende a dos elementos de deteccion en una o dos direcciones. Cuando se combinan dos o mas elementos de deteccion antes del analisis, deberfan considerarse los elementos de deteccion combinados en la definicion de profundidad de foco.
10 Angulo de incidencia: el angulo entre la trayectoria lumfnica principal y el eje de deteccion-muestra.
Medio lumfnico: el sistema lumfnico que comprende todas las fuentes lumfnicas a las que se expone un lado de la muestra.
Plano lumfnico: un plano a traves de dos o mas fuentes lumfnicas.
Trayectoria lumfnica principal: la trayectoria desde el centro del haz lumfnico al plano de muestra, que se ejemplifica 15 por el centro de un diodo emisor de luz.
Plano de muestra: el plano perpendicular al eje de detector-muestra y sobre el cual se dispone la muestra. Descripcion detallada de la invencion
20 El aparato de acuerdo con la invencion puede ser un microscopio de fluorescencia fijo o un microscopio de fluorescencia portatil. En una realizacion preferida, el aparato es portatil para detectar la fluorescencia de muestras de campo.
Se dispone la fuente lumfnica en relacion con la muestra de manera que proporcione el maximo de energfa lumfnica 25 a la muestra. Puesto que la luz se transmite desde una fuente lumfnica localizada en el mismo lado de la muestra que el medio de deteccion, es posible aumentar la intensidad de la luz de excitacion por encima de lo aplicable practicamente en un microscopio de fluorescencia de transmision, porque la luz de la primera fuente lumfnica no se transmite directamente al eje de deteccion-muestra.
30 Se prefiere usar una luz de excitacion divergente, tal como diodos emisores de luz, como una manera economica de exponer un area tan grande como sea posible de la muestra a la luz de excitacion. La fuente lumfnica es un diodo emisor de luz.
A menudo se prefiere usar mas de una fuente lumfnica con el fin de aumentar el flujo de luz sobre la muestra, por 35 ejemplo usando dos o mas diodos emisores de luz. Tambien es posible usar mas de una fuente lumfnica cuando algunas de las fuentes lumfnicas tienen diferentes propiedades electromagneticas.
El medio lumfnico de excitacion comprende preferiblemente al menos un diodo emisor de luz (LED), sin embargo se prefiere proporcionar al menos dos LED, mas preferiblemente al menos 4 LED. Cuando se usan mas de un LED, los 40 LED se espacian preferiblemente a distancias identicas entre sf. Pueden disponerse en cualquier patron simetrico alrededor del eje de deteccion-muestra siempre que se explote suficientemente el efecto lumfnico, tal como en un patron circular o un patron cuadrado alrededor del eje de deteccion-muestra. Las luces de excitacion se disponen preferiblemente en un plano lumfnico, es decir un plano a traves de las fuentes lumfnicas. El plano lumfnico es preferiblemente paralelo al plano de muestra.
45
Mediante el uso de varios LED, se expone la muestra a luz de excitacion desde varios angulos conduciendo a una excitacion sustancialmente optima de la muestra, las fuentes lumfnicas funcionan preferiblemente de tal modo que todas transmitan de forma sustancialmente simultanea. No hay un lfmite superior al numero de LED usados, pero a menudo se proporcionan tantos como 30 LED, tal como hasta 20 LED.
50
Sin embargo, para algunas aplicaciones donde al menos una primera y segunda fuentes lumfnicas se disponen en el primer medio lumfnico de excitacion, teniendo la primera fuente lumfnica una banda de longitud de onda diferente a la segunda fuente lumfnica, las fuentes lumfnicas pueden transmitir de manera alterna. Mediante el uso de dos fuentes lumfnicas diferentes, es posible obtener dos senales de fluorescencia diferentes de la muestra. Asf, es 55 posible obtener al menos dos clases diferentes de informacion, porque cuando transmiten las fuentes lumfnicas de una longitud de onda se transmite un tipo de senal al detector, y cuando transmiten las fuentes lumfnicas de otra longitud de onda, se transmite otro tipo de senal al detector.
Si se usa una fuente lumfnica menos divergente, puede disponerse un medio optico divergente en la trayectoria 60 lumfnica de excitacion para divergir apropiadamente la luz de excitacion. Independientemente de lo divergentes que
sean la fuente o fuentes lumfnicas, se prefiere emitir la luz dirigida a la muestra sin deflectar de su trayectoria lumfnica para asegurar una excitacion apropiada de la muestra, asf como para reducir el riesgo de transmitir luz de excitacion directamente al medio de deteccion.
5 La fuente lumfnica puede proporcionar luz de cualquier longitud de onda adecuada, tal como en el intervalo entre 200 a 980 nm, tal como en el intervalo de 200-700, 200-600, 200-500 o 200-400.
En otra realizacion, se dispone la fuente lumfnica en un primer plano lumfnico, paralelo al plano lumfnico de muestra, estando colocado dicho primer plano lumfnico a una distancia del plano de muestra detras del detector. Mediante 10 esta construccion, la luz se emite por las fuentes lumfnicas directamente hacia el plano de muestra propagandose por el medio detector. En otra realizacion, la luz se dirige inicialmente en la direccion opuesta hacia un reflector que refleja el haz lumfnico hacia el plano de muestra que se propaga por el medio detector. Independientemente de la colocacion de la luz de excitacion, tiene que asegurarse que el angulo entre la trayectoria lumfnica principal y el eje de deteccion-muestra es como se define anteriormente. El reflector puede ser cualquier medio reflector adecuado, 15 tal como un espejo concavo.
El medio de deteccion se dispone preferiblemente en una carcasa cuando las fuentes lumfnicas estan localizadas detras del medio de deteccion. En este caso, la carcasa esta dotada de una abertura que permite que las senales emitidas por la muestra alcancen los detectores.
20
En una realizacion de la invencion, las fuentes lumfnicas se disponen de modo que el primero medio lumfnico de excitacion este localizado en un primer plano lumfnico paralelo al plano de muestra, estando dicho primer plano entre el plano de muestra y el primer medio de deteccion. Los angulos de incidencia de al menos la primera fuente lumfnica del primer medio lumfnico de excitacion estan entre el angulo de recogida/2 y 90°. Preferiblemente, todas 25 las fuentes lumfnicas tienen angulos de incidencia en este intervalo, mas preferiblemente todas las fuentes lumfnicas tienen angulos de incidencia sustancialmente identicos.
Asf, se asegura que la trayectoria lumfnica de excitacion y las senales emitidas no interfieran, dando como resultado errores en las senales para detectar.
30
El angulo incidente esta preferiblemente en el intervalo entre 30 y 90°, mas preferiblemente entre 45 y 85°, tal como entre 50 y 85°, tal como entre 50 y 75°, tal como entre 50 y 60°, proporcionando una excitacion adecuada de la muestra.
35 Se transmite la luz de excitacion directamente a la muestra, es decir, sin deflectar por un divisor de haz, mecanicamente por ejemplo por deflectores o similares, con lo que es posible construir un aparato mas compacto y que tiene menos piezas, puesto que no tiene que incorporarse un medio de deflexion a las trayectorias lumfnicas.
Para evitar ademas errores de senal, se encierra la fuente lumfnica, o se protege de otro modo, para asegurar que 40 no se transmite luz de excitacion directamente al medio de deteccion.
El plano de muestra esta constituido por la superficie de la muestra. En una realizacion del aparato, se disponen medios para colocar la muestra en el plano de muestra. El plano de muestra comprende un compartimento de muestra para albergar una muestra lfquida al menos durante la deteccion. El compartimento de muestra puede ser 45 un compartimento fijo o un compartimento reemplazable, tal como un cartucho conformado para ajustarse al plano de muestra.
Un compartimento de muestra, que contiene la muestra que se analiza, dispone preferiblemente todo el volumen de muestra posible de tal modo que pueda exponerse a la fila de elementos de deteccion, permitiendo por tanto el 50 analisis de un gran area de muestra. Es un procedimiento para lograr esto definir el grosor del compartimento de muestra en una direccion que no sea paralela al plano de elementos de deteccion, aumentando por tanto el volumen efectivo por area de compartimento de muestra expuesto a los elementos de deteccion. El grosor optimo esta a menudo determinado por cualquier profundidad de foco efectiva de un sistema de enfoque.
55 En tales casos, el compartimento de muestra limita la dimension de la muestra en una direccion que es sustancialmente no paralela al plano de la fila de elementos de deteccion a un grosor de al menos 20 pm o menos, preferiblemente a un grosor de mas de 20 pm, mas preferiblemente a un grosor de mas de 40 pm, mas

preferiblemente a un grosor de mas de 60 pm, mas preferiblemente a un grosor de mas de 80 pm, mas

preferiblemente a un grosor de mas de 100 pm, mas preferiblemente a un grosor de mas de 140 pm, mas

60 preferiblemente a un grosor de mas de 180 pm, mas preferiblemente a un grosor de mas de 250 pm, mas
preferiblemente a un grosor de mas de 500 pm y mas preferiblemente a un grosor de mas de 1000 pm.
De forma similar, es ventajoso extender el area de deteccion del compartimento de muestra en una direccion paralela a la fila de elementos de deteccion, aumentando por tanto el area efectiva de la muestra que se expone a la 5 fila de elementos de deteccion. Para algunas de estas aplicaciones, la longitud de la dimension es de 1 mm o mas, preferiblemente 2 mm o mas, mas preferiblemente 4 mm o mas, mas preferiblemente 10 mm o mas, mas
preferiblemente 20 mm o mas, mas preferiblemente 40 mm o mas, mas preferiblemente 100 mm o mas, mas
preferiblemente 200 mm o mas y mas preferiblemente 400 mm o mas.
10 Para algunas aplicaciones, se usa un compartimento de muestra tubular, con lo que tambien es posible aumentar el area de muestra que se analiza simultaneamente aumentando el radio de tal compartimento de muestra tubular. El radio optimo de tal compartimento de muestra se determina a menudo por la disposicion de los diversos componentes del sistema, tales como la profundidad de foco. El tubo puede tener en estas circunstancias un radio interno de mas de 0,01 mm, preferiblemente de 0,02 mm o mas, mas preferiblemente 0,04 mm o mas, mas
15 preferiblemente 0,1 mm o mas, mas preferiblemente 0,2 mm o mas, mas preferiblemente 0,4 mm o mas, mas
preferiblemente 1 mm o mas, mas preferiblemente 2 mm o mas, mas preferiblemente 4 mm o mas y mas
preferiblemente 10 mm o mas.
El compartimento de muestra puede ser un dispositivo de muestreo desechable como se describe en el documento 20 PCT/DK99/00605.
El aparato de acuerdo con la presente invencion permite la valoracion de muestras de una amplia variedad de volumenes. El volumen de la muestra de la que se exponen senales sobre la fila esta normalmente en el intervalo entre 0,01 pl y 20 pl, tal como en el intervalo entre 0,01 pl y 10 pl, tal como en el intervalo entre 0,01 pl y 4 pl, tal 25 como en el intervalo entre 0,02 pl y 10 pl, preferiblemente en el intervalo entre 0,04 pl y 2 pl, tal como en el intervalo entre 0,05 pl y 2 pl y tal como en el intervalo entre 0,01 pl y 1,50 pl.
La profundidad de foco del sistema es a menudo importante para la determinacion de las dimensiones optimas del compartimento de muestra. Se ha encontrado que es posible usar una dimension que supere la profundidad de foco 30 de un sistema de enfoque, incluso hasta una extension en que la dimension sea mayor de 1 vez y menor de 1,5 veces la profundidad de enfoque, mas preferiblemente mayor o igual a 1,5 veces y menor de 2 veces dicha profundidad de enfoque, mas preferiblemente mayor o igual a 2 veces y menor de 3 veces dicha profundidad de enfoque, mas preferiblemente mayor o igual a 3 veces y menor de 4 veces dicha profundidad de enfoque, mas preferiblemente mayor o igual a 4 veces y menor de 6 veces dicha profundidad de enfoque, mas preferiblemente 35 mayor o igual a 6 veces dicha profundidad de enfoque.
La muestra esta preferiblemente en estado de reposo durante la exposicion para obtener condiciones de estado de reposo para los medios de deteccion.
40 Filtros
Para obtener la senal fluorescente requerida para la deteccion, se interpone un filtro en la trayectoria lumfnica entre la fuente lumfnica y la muestra. El filtro puede ser cualquier filtro adecuado para la luz de excitacion/luz de emision. El filtro puede seleccionarse de entre filtros de interferencia, filtros coloreados y filtros de polarizacion. 45 Preferiblemente, se proporciona un filtro separado para cada fuente lumfnica. Los filtros pueden ser sustancialmente identicos, pero para algunas muestras puede ser conveniente usar filtros diferentes.
Por ejemplo, puede usarse un dispositivo monocromatico para separar la radiacion electromagnetica en uno o mas componentes de longitud de onda antes de transmitir uno o varios de estos componentes de longitud de onda a la 50 muestra uno cada vez o mas de uno cada vez, preferiblemente cuando se transmite mas de un componente de longitud de onda a la muestra simultaneamente, se transmiten los componentes de longitud de onda a porciones diferentes de la muestra, dando por tanto la oportunidad para obtener informacion tanto cualitativa como cuantitativa sobre las partfculas de la muestra. Esto es en particular de interes cuando la muestra contiene partfculas que responden diferentemente a diferentes componentes de longitud de onda.
55
Se prefiere que los filtros para las fuentes lumfnicas individuales en un medio lumfnico de excitacion esten conectados, p.ej. dispuestos en un material de soporte continuo. Asf se facilita la construccion del microscopio, puesto que los filtros conectados pueden colocarse en el aparato en una operacion de manipulacion.
60 El material de soporte puede ser cualquier material adecuado que o bien sea no transparente a la luz de excitacion o
que tenga la funcion de filtro correspondiente a los filtros usados.
La forma del material de soporte corresponde preferiblemente al patron de disposicion de las fuentes lumfnicas, tal como semicircular, circular, rectangular, triangular o en forma de cuadrado. Cuando se disponen las luces alrededor 5 del eje de deteccion-muestra, es importante que las senales emitidas por la muestra se permitan pasar al medio de deteccion.
En una realizacion preferida, el filtro es circular y tiene un "orificio" circular, siendo el diametro de dicho "orificio" preferiblemente correspondiente a o mayor que el diametro del haz de senal.
10
Se preve por la presente invencion que los filtros puedan ser cambiables, de modo que puedan transmitirse una variedad de componentes de longitud de onda a la muestra. En esta realizacion, el filtro o filtros como tales pueden cambiarse o se cambian el filtro y las fuentes lumfnicas. En la ultima situacion, se combinan preferiblemente el filtro o filtros y fuentes lumfnicas en forma de una unidad de filtro-lumfnica reemplazable.
15
La luz que se transmite a la muestra puede enfocarse por un sistema de enfoque que comprende una o mas lentes. El efecto de dicho sistema de enfoque es a menudo aumentar la eficiencia efectiva de la fuente lumfnica.
Ademas, puede usarse un dispositivo monocromatico para separar las senales electromagneticas emitidas por, o 20 transmitidas a traves de la muestra en uno o mas componentes de longitud de onda antes de detectar tales senales electromagneticas por un elemento de deteccion, o bien de tal modo que se mida una longitud de onda cada vez o de tal modo que se midan mas de un componente de longitud de onda cada vez. Esto es en particular de interes cuando la muestra contiene partfculas que responden diferentemente a diferentes componentes de longitud de onda, por ejemplo cuando una partfcula puede emitir fotoluminiscencia con diferentes propiedades dependiendo de la 25 naturaleza de la partfcula. Este efecto puede producirse tambien mediante el uso de mas de un tipo de fuente lumfnica que tienen diferentes caracterfsticas de longitud de onda, preferiblemente en combinacion con un dispositivo monocromatico.
En particular, la radiacion electromagnetica espectralmente rica emitida por o transmitida a traves de la muestra 30 puede separarse espacialmente en una pluralidad de componentes de longitud de onda, de tal modo que cada uno de los elementos de deteccion en la fila de elementos de deteccion que mide informacion sustancialmente de la misma fraccion de muestra se exponga a componentes de longitud de onda sustancialmente diferentes.
Esto puede lograrse usando uno o varios de los siguientes, pero sin limitacion: filtros de interferencia, filtros 35 coloreados, una rejilla optica, un prisma o cristales opticamente activos.
Ademas, la luz de excitacion o senales de fluorescencia pueden modularse en intensidad, tal como por cristales opticamente activos o interferometrfa, preferiblemente mediante el uso de un interferometro de Michelson, mas preferiblemente mediante el uso de un interferometro donde pueda moverse al menos una superficie reflectante.
40
A menudo, es preferible usar unas o varias tecnicas de procesamiento de imagenes del estado de la tecnica, tales como filtros bidimensionales o identificacion de imagenes, para valorar el numero de partfculas en una muestra, o cualquier propiedad morfologica de una partfcula.
45 El medio de deteccion puede comprender cualquier detector que pueda percibir o detectar la senal de fluorescencia emitida por la muestra.
En una realizacion preferida, el medio de deteccion comprende un detector que es una fila de dispositivos detectores o elementos de deteccion, tales como un dispositivo de carga acoplada (CCD), el CCD puede ser un CCD de cuadro 50 completo, CCD de transferencia de cuadro, CCD de transferencia interlineal, CCD de barrido lineal, fila de CCD p.ej. de longitud de onda intensificada, fila de planos focales, fila de fotodiodos o fila de fotodetectores tales como CMOS. El CMOS es preferiblemente un sensor de imagenes de CMOS con condiciones de senal integradas en chip y/o procesamiento de senal. Independientemente de la eleccion de cualquiera de los dispositivos de deteccion anteriores, el medio de deteccion puede comprender ademas un CCD o CMOS en blanco y negro o en color.
55
El tamano de los elementos de deteccion determina en cierta medida su sensibilidad. En algunas aplicaciones, es por lo tanto de interes tener elementos de deteccion de un tamano de aproximadamente 1 pm2 o menor. En ciertas situaciones, el tamano de los elementos de deteccion en la fila de elementos de deteccion es menor de 20 pm2, preferiblemente menor de 10 pm2, mas preferiblemente menor de 5 pm2, mas preferiblemente menor de 2 pm2, mas 60 preferiblemente menor o igual a 1 pm2. En otras situaciones, el tamano de los elementos de deteccion en la fila de
elementos de deteccion es mayor o igual a 5000 pm2, tal como mayor o igual a 2000 pm2 mas preferiblemente mayor o igual a 1000 pm2, tal como mayor o igual a 500 pm2 o incluso mayor o igual a 200 pm2, mas preferiblemente mayor o igual a 100 y menor de 200 pm2, mas preferiblemente mayor o igual a 50 y menor de 100 pm2, mas preferiblemente mayor o igual a 20 y menor de 50 pm2.
5
La fila de elementos de deteccion es preferiblemente sensible a radiacion electromagnetica de longitud de onda en una o varias de las siguientes regiones: 100 nm a 200 nm, 200 nm a 600 nm, 300 nm a 700 nm, 400 nm a 800 nm, 600 nm a 1 pm, 800 nm a 2 pm, 2 pm a 10 pm, 5 pm a 10 pm, 10 pm a 20 pm, 20 pm a 40 pm.
10 La inclusion de un dispositivo de enfoque para el enfoque de una senal desde la muestra a los elementos de deteccion de tal manera que se maximice el angulo de recogida, estando definido el angulo de recogida como el angulo de plano completo en que se detecta una senal, se ha encontrado en muchas situaciones que da condiciones mejoradas para valoracion. Sorprendentemente, se ha encontrado que un angulo de recogida tan amplio, incluso en la medida en que el objetivo usado en el enfoque distorsionaba la relacion de aspecto de la imagen de cualquier 15 partfcula diferentemente a traves del plano en que se colocaban los elementos de deteccion, o producfa variacion en el enfoque a traves de la muestra que se analiza, o reduccion de la calidad de enfoque, podia usarse en la valoracion de, por ejemplo, el numero de particulas en la muestra.
La relacion de aspecto de los elementos de deteccion puede ser importante en la recogida de senales para la 20 valoracion de particulas. Se prefiere algunas veces una relacion de aproximadamente 1/1, pero en algunas condiciones, puede preferirse usar una relacion diferente de 1/1. En particular, cuando esto facilita la deteccion de senales de volumen aumentado de cualquier muestra, permitiendo por tanto la valoracion simultanea de, por ejemplo, mas particulas. En esas circunstancias, la relacion de la mas corta de altura o anchura a la mas larga de altura o anchura de los elementos de deteccion en la fila de elementos de deteccion es sustancialmente menor o 25 igual a 1, preferiblemente menor de 1/2, mas preferiblemente menor de 1/4, mas preferiblemente menor de 1/10, mas preferiblemente menor de 1/50, mas preferiblemente menor de 1/100 y mas preferiblemente menor de 1/200.
Otro modo de expresar la relacion a la que deberfa formarse preferiblemente la imagen en la fila es considerar la formacion de imagen de una partfcula individual de la muestra en los elementos de deteccion. Se prefiere a menudo 30 formar imagenes de las particulas individuales en como maximo 100 elementos de deteccion, tal como como maximo 81 elementos de deteccion, tal como como maximo 64 elementos de deteccion, tal como como maximo 49 elementos de deteccion, tal como como maximo 36 elementos de deteccion, tal como como maximo 25 elementos de deteccion, en particular como maximo 16 elementos de deteccion y mas preferiblemente como maximo 9 elementos de deteccion. Se prefiere aun mas formar imagenes de las particulas individuales cuyo parametro o 35 parametros se van a valorar como maximo en 5 elementos de deteccion, o incluso como maximo en 1 elemento de deteccion. El mayor numero de elementos por partfcula proporcionara mas informacion sobre las particulas individuales, mientras que el menor numero de elementos por partfcula aumentara el recuento total que puede hacerse en una exposicion de deteccion.
40 Las senales de al menos una porcion de la muestra se enfocan en la fila de elementos de deteccion mediante el uso de un medio de enfoque, preferiblemente mediante el uso de una lente, sin embargo es posible usar dos lentes o mas de dos lentes. El numero de lentes usadas para el sistema de enfoque puede afectar a la complejidad de cualquier sistema de medida.
45 El enfoque de una senal desde la muestra a cualquier detector depende de la posicion de la muestra respecto a cualquier detector. Cuando la construccion del sistema de medida es tal que la posicion relativa de la muestra y cualquier detector puedan variar, entonces hay ventajas en poder ajustar el enfoque del sistema. Esto puede conseguirse a menudo tomando en primer lugar al menos una medida de cualquier senal de la muestra y entonces, basandose en esta, ajustar el enfoque del sistema. Este procedimiento puede repetirse una serie de veces para 50 obtener un enfoque aceptable. De la misma manera, se ajusta el enfoque de la senal desde la muestra o material de muestra, preferiblemente cuando la extension del ajuste se determina por al menos una medida de una senal desde la muestra.
El angulo de recogida de la disposicion de enfoque usada puede tener efecto sobre la intensidad de cualquier senal 55 recogida en la fila de elementos de deteccion. Cuando se necesita una alta sensibilidad, es por lo tanto practico aumentar el angulo de recogida. El tamano preferido del angulo de recogida puede determinarse tambien por otros requisitos que se piden al sistema, tales como profundidad de enfoque. En estas situaciones, el angulo de recogida del medio de enfoque se preferiblemente de al menos 2 grados, preferiblemente mas de 5 grados, mas preferiblemente mas de 15 grados, mas preferiblemente mas de 20 grados, mas preferiblemente mas de 50 grados, 60 mas preferiblemente mas de 120 grados y mas preferiblemente mas de 150 grados.
La senal que se detecta esta causada sustancialmente por uno o varios de los siguientes: fotoluminiscencia con un tiempo de vida del estado de salida menor o igual a 10-6 segundos, fotoluminiscencia con un tiempo de vida del estado de salida mayor de 10-6 segundos, quimioluminiscencia, dispersion de Raman, atenuacion de la radiacion 5 electromagnetica, absorcion de la radiacion electromagnetica o dispersion de la radiacion electromagnetica.
Las senales medidas de uno o mas elementos de deteccion pueden corregirse por sesgos sistematicos o variables mediante el uso de un medio de calculo, lograndose la correccion del sesgo mediante el uso de uno o mas valores predefinidos, preferiblemente cuando cada senal medida para uno o mas elementos de deteccion en dicha fila de 10 elementos de deteccion tiene uno o mas valores predefinidos, mas preferiblemente cuando se determina cada valor predefinido basandose en una o mas medidas anteriores.
La correccion de sesgos puede efectuarse restando los resultados obtenidos en una o varias de otras medidas de la senal original, preferiblemente cuando las otras medidas son una o varias medidas de la misma muestra o material 15 de muestra, mas preferiblemente cuando la otra medida es la medida tomada anteriormente de la misma muestra o material de muestra.
Tambien la senal de uno o mas elementos de deteccion puede corregirse en intensidad mediante el uso de un medio de calculo, lograndose dicha correccion del sesgo mediante el uno de uno o mas valores predefinidos, 20 preferiblemente cuando cada senal medida para uno o mas elementos de deteccion en dicha fila de elementos de deteccion tiene uno o mas valores predefinidos, mas preferiblemente cuando se determina cada valor predefinido basandose en una o mas medidas anteriores.
En algunas situaciones, p.ej. en una conversion de analogico a digital, la conversion podrfa ser tambien de interes 25 para ajustar el nivel de 2, preferiblemente 3, mas preferiblemente 4, mas preferiblemente 5, mas preferiblemente 6, mas preferiblemente 7, mas preferiblemente 8, mas preferiblemente mas de 8 canales de salida separados de tal modo que uno, preferiblemente mas de uno, de los canales de salida tenga un nivel sustancialmente diferente del otro u otros canales de salida, donde la identificacion de cual de los canales de salida, o combinacion de los mismos, tiene un nivel de salida sustancialmente diferente esta correlacionada con la intensidad de dicha senal.
30
Para el analisis de cualquier senal medida, a menudo es necesario digitalizar la senal de tal modo que la intensidad dada de cualquier senal se transforme en una representacion digital. Esto puede hacerse teniendo una serie de canales, en que la informacion sobre cual de estos canales tiene una senal que difiere de los otros canales determina la intensidad, o incluso teniendo mas de uno de estos canales que forman una combinacion, 35 preferiblemente de modo similar a una representacion binaria.
La informacion de las senales detectadas por los medios de deteccion se introduce en un procesador para el procesamiento, presentacion y opcionalmente almacenamiento de la informacion.
40 La informacion de senal puede presentarse en una pantalla conectada con el procesador y/o imprimirse. La informacion presentada puede ser cualquier clase de informacion relativa a las senales medidas y/o al sistema usado, tal como numero, distribucion de tamano, morfologfa, clasificacion de partfculas, longitud de onda de excitacion, longitud de onda de emision o aumentos.
45 El espacio de almacenamiento, por ejemplo, usado para almacenar informacion sobre senales medidas de elementos de deteccion es a menudo uno de esos componentes que tienen un efecto considerable sobre el coste de produccion. Es por lo tanto de interes poder efectuar la valoracion de parametros sin ningun uso sustancial de tal espacio de almacenamiento, de tal modo que se efectue la valoracion de las partfculas biologicas en una muestra sin el uso de sustancialmente ningun medio de espacio de almacenamiento que se use para almacenar senales 50 medidas de los elementos de deteccion en la fila de elementos de deteccion.
Por otro lado, a menudo es diffcil lograr la valoracion sin el uso de ningun espacio de almacenamiento, pero preferiblemente la cantidad de tal espacio de almacenamiento no deberfa ser mayor de lo necesario para almacenar la informacion de todos los elementos de deteccion medidos, preferiblemente cuando solo puede almacenarse una 55 fraccion de la informacion.
En algunas situaciones, se almacena la senal medida de los elementos de deteccion en la fila de elementos de deteccion mediante un espacio de almacenamiento, pudiendo almacenar el espacio de almacenamiento una serie de medidas equivalente a, o menor que, el numero de elementos de deteccion, preferiblemente menor de 1/2 el numero 60 de elementos de deteccion, mas preferiblemente menor de 1/4 el numero de elementos de deteccion, mas
preferiblemente menor de 1/8 el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente menor de 1/16 el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente menor de 1/32 el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente menor de 1/64 el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente menor de 1/128 el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente menor de 1/256 el numero de elementos de deteccion, mas 5 preferiblemente menor de 1/512 el numero de elementos de deteccion y mas preferiblemente menor de 1/1024 el numero de elementos de deteccion en la fila de elementos de deteccion.
En otras ciertas circunstancias, es ventajoso que la senal medida de los elementos de deteccion en la fila de elementos de deteccion se almacene mediante un espacio de almacenamiento, pudiendo el espacio de
10 almacenamiento almacenar una serie de medidas mayor que el numero de elementos de deteccion, preferiblemente equivalente a o mayor de 2 veces el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente equivalente o mayor de 4 veces el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente equivalente o mayor de 8 veces el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente equivalente o mayor de 16 veces el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente equivalente o mayor de 32 veces el numero de elementos de deteccion, mas
15 preferiblemente equivalente o mayor de 64 veces el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente equivalente o mayor de 128 veces el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente equivalente o mayor de 256 veces el numero de elementos de deteccion, mas preferiblemente equivalente o mayor de 512 veces el numero de elementos de deteccion y mas preferiblemente equivalente o mayor de 1024 veces el numero de elementos de deteccion en la fila de elementos de deteccion.
20
Otros aspectos mas complicados de la valoracion de parametros pueden requerir el uso de una considerable cantidad del espacio de almacenamiento. En este aspecto, puede ser necesario por lo tanto tener un espacio de almacenamiento que pueda almacenar mas informacion que la recogida en una medida de los elementos de deteccion usados.
25
Es posible hacer la correlacion y la valoracion de los parametros de la muestra usando un medio de calculo, preferiblemente un ordenador digital comercialmente disponible en Analogue Devices (ADSP 2101), equipado con espacio de almacenamiento que puede almacenar solo informacion en una cantidad sustancialmente equivalente a una pequena fraccion del numero total de elementos de deteccion, basandose entonces la valoracion del numero de
30 objetos en el procesamiento de datos a tiempo sustancialmente real, preferiblemente de tal modo que se use la informacion medida de cada elemento de deteccion, o una lfnea de elementos de deteccion, o dos o mas lfneas de elementos de deteccion, sustancialmente sin ningun retardo, tal como el retardo que causarfa de otro modo almacenar la informacion medida.
35 Sin embargo, a menudo se prefiere almacenar sustancialmente toda la informacion medida mediante el uso de un primer medio de calculo, preferiblemente un ordenador digital, antes del procesamiento de la informacion por un segundo medio de calculo, preferiblemente un ordenador digital, y permitir por tanto procesar la informacion medida sustancialmente a la misma velocidad que se obtiene, pero con un retardo temporal sustancial entre la medida de cualquier informacion y el procesamiento de la misma informacion; preferiblemente esto se logra usando solo un
40 medio de calculo, preferiblemente un ordenador digital equipado con suficientes recursos para lograr la tarea.
El aparato es particularmente util para valorar parametros de una muestra a pocos aumentos o ampliaciones. Asf, es posible conseguir informacion relativa a una gran area de la muestra.
45 Los aumentos pueden proporcionarse por el medio de enfoque. Los aumentos de tal enfoque pueden ser diferentes de 1/1, dependiendo de la organizacion de los otros componentes del sistema o de las partfculas o material de muestra usado. Por ejemplo, la ampliacion puede ser practica cuando se valoran propiedades morfologicas de una partfcula.
50 En situaciones en que las partfculas son relativamente pequenas, la relacion del tamano de una partfcula biologica al tamano de la imagen de la partfcula biologica en la fila de elementos de deteccion podrfa ser de 1/1 o menor, preferiblemente menor de 1/1 y mayor de 1/100, e incluso menor de 1/1 y mayor de 1/40, o en otras situaciones preferidas menor de 1/1 y mayor de 1/10, e incluso en algunas situaciones se prefiere que la relacion sea menor de 1/1 y mayor de 1/4, mas preferiblemente menor de 1/1 y mayor de 1/2.
55
Cuando las partfculas en cuestion tienen dimensiones que son comparables con el tamano de un elemento de deteccion, a menudo se prefiere tener aumentos de aproximadamente 1/1, enfocando por tanto la imagen de cualquier partfcula en uno cualquiera o solo unos pocos elementos de deteccion. Esto puede dar en algunas condiciones una deteccion favorable de cualquier senal.
En estas situaciones, se prefiere que la relacion del tamano de una partfcula biologica al tamano de la imagen de la partfcula biologica en la fila de elementos de deteccion este en el intervalo entre 5/10 y 20/10, preferiblemente en el intervalo entre 6/10 y 18/10, mas preferiblemente en el intervalo entre 7/10 y 16/10, mas preferiblemente en el intervalo entre 8/10 y 14/10, mas preferiblemente en el intervalo entre 9/10 y 12/10, mas preferiblemente sea 5 sustancialmente igual a 10/10.
Cuando se analizan partfculas que tienen dimensiones que son comparables con o mayores que los elementos de deteccion usados, a menudo es ventajoso reducir el tamano de la imagen de tal partfcula en un grado en que el tamano de la imagen sea comparable al tamano de un elemento de deteccion.
10
En estas situaciones, se prefiere que la relacion del tamano de una partfcula biologica al tamano de la imagen de la partfcula biologica en la fila de elementos de deteccion sea de 1/1 o menor, preferiblemente menor de 1/1 y mayor de 1/100, mas preferiblemente menor de 1/1 y mayor de 1/40, mas preferiblemente menor de 1/1 y mayor de 1/10, mas preferiblemente menor de 1/1 y mayor de 1/4, mas preferiblemente menor de 1/1 y mayor de 1/2.
15
Por tanto, se prefiere a menudo que la representacion espacial expuesta en la fila de elementos de deteccion se someta a una ampliacion lineal tal que la relacion de la imagen de una dimension lineal en la fila de elementos de deteccion a la dimension lineal original en el dominio de exposicion sea menor de 40:1, normalmente como maximo 20:1, preferiblemente menor de 10:1 y en muchos casos incluso como maximo 6:1 o incluso menor de 4:1.
20
La ampliacion se correlaciona adecuadamente con los parametros para determinar, en particular con el tamano de las partfculas para las que se va a valorar un parametro. El tamano de la partfcula se da aproximando la partfcula a una partfcula redonda, donde el tamano mencionado a continuacion se refiere al diametro de la partfcula. Preferiblemente, se usa la dimension menor de la partfcula como diametro cuando se aproxima la partfcula a una 25 partfcula redonda. Por tanto, por ejemplo cuando el tamano esta entre 0,1 pm y 5 pm, tal como entre 1/3 pm y 3 pm, la relacion anteriormente mencionada esta preferiblemente en el intervalo entre 40:1 y 1:10, mas preferiblemente en el intervalo entre 20:1 y 1:10, tal como en el intervalo entre 10:1 y 1:10. En la mayorfa de realizaciones que se ha probado que dan excelentes resultados en la practica, la relacion esta en el intervalo entre 6:1 y 2:1.
30 Cuando el tamano esta entre 1 pm y 100 pm, tal como entre 3 pm y 100 pm, tal como entre 5 pm y 100 pm, la relacion anteriormente mencionada esta normalmente en el intervalo entre 3:1 y 1:100, preferiblemente en el intervalo entre 2:1 y 1:100. En muchas realizaciones practicas, la relacion estara en el intervalo entre 2:1 y 1:2. Puede ser interesante, en particular con elementos de deteccion pequenos de alta precision, trabajar con relaciones muy pequenas, tal como en el intervalo entre 1:4 y 1:100, p.ej. en el intervalo entre 1:1 y 1:100.
35
Sorprendentemente, se ha encontrado que la relacion de aspecto de una imagen puede distorsionarse considerablemente en la fila de elementos de deteccion sin que esto tenga un efecto negativo considerable sobre la valoracion de partfculas. En tal situacion, se prefiere que la relacion de la mas corta a la mas larga de las dos dimensiones de la imagen de una partfcula biologica en la fila de elementos de deteccion sea de sustancialmente 1 o 40 menos, preferiblemente 1/2 o menos, mas preferiblemente 1/4 o menos, mas preferiblemente 1/10 o menos, mas preferiblemente 1/50 o menos, mas preferiblemente 1/100 o menos, mas preferiblemente 1/200 o menos respecto a la relacion de las correspondientes dimensiones de la partfcula biologica. En tal situacion, la relacion de la mas corta a la mas larga de las dos dimensiones de la imagen de una partfcula biologica en la fila de elementos de deteccion no es en ciertas circunstancias sustancialmente la misma en el area cubierta por la fila de elementos de deteccion.
45
El aparato de acuerdo con la presente invencion puede usarse como un aparato de un lado, es decir un aparato para el que la luz de excitacion se dirige a la muestra desde el mismo lado de la muestra que el lado por el que se detectan la senales emitidas por la muestra.
50 Mediante este aparato se han conseguido una variedad de ventajas en comparacion con los microscopios de fluorescencia convencionales. En primer lugar, es posible disponer la muestra para valorar directamente en el plano de muestra en lugar de deslizarla en el plano de muestra entre el detector y la luz de excitacion. Ademas, se ha hecho posible detectar fluorescencia de superficie de una muestra que no es transparente.
55 Como se menciona anteriormente, tambien es posible aumentar la intensidad de la luz de excitacion sin comprometer los detectores.
Tambien muestras que tienen una naturaleza con la que normalmente no es posible disponer la muestra en un microscopio pueden valorarse mediante el uso del presente sistema, porque el microscopio puede colocarse 60 directamente sobre la muestra con lo que la superficie de la muestra constituye simplemente el plano de muestra.
Finalmente, es posible producir un aparato mas compacto, y asf mas facilmente manipulable, en que el medio lumfnico de excitacion se dispone en el mismo lado del plano de muestra que el detector, acortando por tanto el eje del aparato en al menos un 25 % en comparacion con aparatos convencionales.
Mediante la presente invencion, es posible valorar parametros de una muestra que hasta la fecha se han valorado fiablemente solo mediante el uso de un equipo de citometrfa de flujo. Es posible valorar parametros de una muestra grande en una exposicion, reduciendo por tanto los errores estadfsticos con los que se cuenta normalmente cuando se valoran muestras grandes al valorar solo partes de la misma por exposicion.
10
Ademas, es posible obtener mas de una senal de fluorescencia de la muestra en una exposicion, facilitando asf la clasificacion de las partfculas de la muestra, debido a sus diferentes senales de fluorescencia.
Por tanto, el aparato de un lado de acuerdo con la invencion puede construirse con una amplia variedad de 15 combinaciones, que estan todas dentro del alcance de esta invencion. En particular, se concibe la combinacion principal discutida a continuacion.
El aparato puede construirse como un aparato de fluorescencia simple donde las fuentes lumfnicas y filtros lumfnicos de excitacion son identicos.
20
Puede proporcionarse un aparato de fluorescencia multiple, tal como un aparato que proporciona al menos dos senales de fluorescencia diferentes, mediante al menos uno de los siguientes:
• Una primera y una segunda fuentes lumfnicas, emitiendo dichas fuentes lumfnicas luz de diferentes longitudes de 25 onda.
• Un primer y un segundo filtros que son diferentes, con lo que se expone la muestra a luz de excitacion de al menos dos longitudes de onda diferentes.
• Un primer y un segundo filtros de emision que son diferentes, tales como un filtro de banda dual, con lo que se emiten al menos dos senales de fluorescencia diferentes al detector o detectores.
30
Sin embargo, es una ventaja adicional que el presente aparato puede construirse como un aparato de dos lados, con lo que la luz de excitacion puede dirigirse a la muestra desde ambos lados de las muestras, o los medios de deteccion se disponen para detectar senales de ambos lados de las muestras, o una combinacion de ambos.
35 Por tanto, se entiende por un aparato de dos lados un aparato de acuerdo con la invencion dotado adicionalmente de:
• Un segundo medio lumfnico de excitacion en un segundo plano lumfnico, siendo dicho segundo plano lumfnico paralelo al plano de muestra y localizado al otro lado del plano de muestra en oposicion al primer plano lumfnico.
40 Asf, la muestra recibe luz de excitacion de ambos lados de la muestra, aumentando considerablemente la energfa expuesta a la muestra; y/o
• Un segundo medio de deteccion dispuesto de modo que la muestra se coloque entre el primer medio de deteccion y el segundo medio de deteccion. Por la presente, es posible valorar diferente informacion referente a las senales de la muestra mediante deteccion de una exposicion. Por ejemplo, el primer medio de deteccion puede adaptarse para
45 registrar el numero de partfculas de la muestra, mientras que el segundo medio de deteccion se adapta para registrar la morfologfa de las partfculas en la muestra.
En una realizacion preferida, el aparato de dos lados comprende tanto un sistema de excitacion de dos lados como un sistema de deteccion de dos lados.
50
El segundo medio lumfnico de excitacion puede ser cualquiera de los medios lumfnicos discutidos con relacion al primer medio lumfnico. Dependiendo del fin del microscopio de fluorescencia, el medio lumfnico puede ser diferente o identico.
55 Ademas, puede ser de interes que la luz de excitacion constituya bandas de diferente longitud de onda, con lo que se consigue iluminacion de diferentes longitudes de onda. El segundo medio de deteccion puede ser cualquiera de los medios de deteccion discutidos en relacion con el primer medio de deteccion.
La siguiente tabla 1 muestra una lista no exhaustiva de combinaciones de configuraciones de sistema de acuerdo 60 con la presente invencion.
Tabla 1: Configuraciones de sistema
Detector 1
Filtro de emision 1 Excitacion 1 Filtro de excitacion 1 S Filtro de excitacion 2 Excitacion 2 Filtro de emision 2 Detector 2 Configuracion n°
X
x X x 1
X
x x/y x/y 2
X
x x x x x 3
X
x x x y y 4
X
x x x x y 5
X
x x x x x x y 6
X
x x x y y y y 7
X
x x x x x y y 8
X
x x x x 9
X
x x x x x x 10
X designa un tipo de detector, filtro de emision, fuente de excitacion y filtro de excitacion respectivamente, e Y designa otro tipo de detector, filtro de emision, fuente de excitacion y filtro de emision, respectivamente.
5
Las configuraciones n°: 1 y 2 corresponden a un sistema de un lado, donde en la conf. 2 se aplican dos fuentes y/o filtros lumfnicos de excitacion diferentes.
Las configuraciones n°: 3 y 4 corresponden a un sistema de excitacion de dos lados, o bien para aumentar la 10 cantidad de luz de excitacion (conf. 3) o para anadir otro tipo de luz de excitacion (conf. 4).
Las configuraciones n°: 5 y 6 son un sistema de deteccion de dos lados donde los dos detectores son diferentes, tal como por ejemplo por tener diferentes aumentos. La config. n° 6 usa ademas excitacion doble.
15 La configuracion n° 7 es un sistema de dos lados con respecto a la excitacion asf como la deteccion. Todos los parametros, es decir, detector, filtro de emision, fuente de excitacion y filtro de excitacion respectivos, son diferentes para los dos lados, ofreciendo la posibilidad de obtener una amplia variedad de informacion de la muestra.
La configuracion n° 8 es tambien un sistema de dos lados con respecto a la excitacion asf como la deteccion. En 20 contraposicion a la config. n° 7, solo los detectores y los filtros de emision son diferentes para los dos lados, ofreciendo de nuevo la posibilidad de obtener una variedad de informacion de la muestra.
Las configuraciones n° 9 y 10 emplean ambas un microscopio como segundo detector. En la configuracion n° 10, el sistema es de dos lados con respecto a las fuentes de excitacion. El microscopio puede ser cualquier clase de 25 microscopio, tal como un microscopio convencional.
Como se muestra anteriormente, se preve cualquier combinacion adecuada de fuentes lumfnicas, filtros, aumentos y detectores por la presente invencion, tambien combinaciones no mostradas expresamente en esta solicitud. A continuacion, se discuten realizaciones preferidas del sistema de dos lados.
30
El aparato puede ser un sistema de fluorescencia simple, donde se expone la muestra a luz de excitacion de longitud de onda sustancialmente identica desde dos lados. Asf, puede intensificarse la luz de excitacion.
En un aparato lumfnico de excitacion de dos lados, un primer medio lumfnico de excitacion expone la muestra a una 35 longitud de onda por un lado de la muestra, y la segunda luz de excitacion expone la muestra a otra longitud de onda por el otro lado de la muestra. Se entiende en la presente memoria que, por supuesto, la primera luz de excitacion y la segunda luz de excitacion, respectivamente, pueden comprender diferentes fuentes y/o filtros lumfnicos, con lo que la muestra puede iluminarse con aun mas longitudes de onda de lo discutido anteriormente.
40 El aparato lumfnico de excitacion de dos lados puede comprender un detector, con lo que el aparato funciona como un sistema parcialmente transmisor.
En otra realizacion, el aparato lumfnico de excitacion de dos lados comprende dos medios de deteccion. Asf, puede obtenerse una cantidad aumentada de informacion de la muestra. En un aspecto, los dos medios de deteccion 45 pueden obtener imagenes iguales, aunque especulares (las imagenes en los dos detectores son imagenes especulares entre sf), proporcionando la informacion relativa a la muestra una validacion de la informacion.
El aparato de acuerdo con la invencion puede ser tambien un aparato de deteccion de dos lados que usa un medio lumfnico de excitacion de un lado. Asf, un detector detecta senales que se transmiten a traves de la muestra.
Independientemente de la disposicion de la luz de excitacion, un sistema de deteccion de dos lados puede aumentar la cantidad de informacion recibida. Por ejemplo, pueden recibirse diferentes longitudes de onda por los dos detectores y/o pueden usarse diferentes detectores que tienen diferente sensibilidad. Ademas, al usar por ejemplo 5 aumentos diferentes para los dos detectores, puede aumentarse la informacion relativa a la muestra. Un lado del sistema puede valorar por ejemplo el numero de partfculas en una gran area de la muestra, por ejemplo mediante bajos aumentos, y el otro lado del sistema puede valorar la morfologfa de las partfculas usando unos mayores aumentos. Las combinaciones de aumentos pueden ser, por ejemplo, 1:1 y 1:4, 1:1 y 1:10, 1:2 y 1:4, 1:2 y 1:10. La informacion de senal transferida desde los dos detectores se transmite preferiblemente al mismo procesador, con lo 10 que la informacion puede presentarse separadamente asf como combinarse, proporcionando por ejemplo informacion especffica de la morfologfa relacionada con partfculas especfficas cuya posicion y numero se detectan por el otro detector.
Es tambien posible usar el aparato de acuerdo con la invencion como un aparato de dos lados en que el otro lado es
15 un microscopio optico convencional o cualquier otro tipo de microscopio. Cuando se usa el otro lado del sistema
como microscopio no de fluorescencia, la luz de iluminacion para el microscopio puede disponerse adecuadamente en cualquier lado de la muestra con relacion al microscopio.
El aparato de dos lados que comprende un microscopio convencional en un lado puede comprender un sistema
20 lumfnico de excitacion de un lado o dos lados para la parte de fluorescencia del sistema.
Cuando se usa un sistema de deteccion de dos lados, el procesador del primer medio de deteccion puede recibir datos de senal del segundo medio de deteccion tambien para simplificar el aparato. Sin embargo, es posible instalar un procesador separado para cada medio de deteccion.
25
La fuente de potencia electrica del aparato puede ser un transformador, capaz de transformar la fuente electrica alterna con un voltaje alterno de entre -150 y 150 voltios, o con un voltaje alterno de entre -250 y 350 voltios, o con un voltaje alterno de entre -350 y 350 voltios, en voltaje de corriente sustancialmente continua.
30 La invencion se refiere ademas a un procedimiento de valoracion de una senal de fluorescencia de una muestra, donde la muestra se dispone en el plano de muestra del aparato como se discute anteriormente.
De acuerdo con el procedimiento, se expone una primera superficie de la muestra directamente a la luz de excitacion de un primer medio lumfnico que tiene al menos una primera fuente lumfnica, se enfocan las senales de 35 fluorescencia de la primera superficie sobre el detector o detectores mediante el uso de un medio de enfoque y se detectan por el detector o detectores. Se procesan las senales detectadas, con lo que se obtienen los datos de senal. Estos datos de senal pueden correlacionarse entonces con el parametro para valorar, y finalmente se valora el parametro o parametros de la muestra.
40 La muestra puede ser cualquier muestra de la que sea adecuado detectar una senal o senales de fluorescencia. En muchas aplicaciones, la muestra es una muestra lfquida cuyo contenido se va a valorar. A menudo, la senal de fluorescencia esta relacionada con un parametro de una partfcula de la muestra, tal como el numero de partfculas en la muestra y/o la morfologfa de las partfculas en la muestra. En particular, en este caso es ventajoso aplicar el procedimiento en un aparato de dos lados de acuerdo con la invencion, con lo que pueden valorarse ambos 45 parametros simultaneamente, cada uno por un medio de deteccion individual.
Asf, el procedimiento puede aplicarse en una amplia variedad de aplicaciones tales como:
La invencion permite el analisis de diversos tipos de partfculas biologicas como se describe anteriormente, y la 50 invencion es por lo tanto particularmente adecuada para la valoracion del numero de partfculas en un material de muestra lfquido en las siguientes aplicaciones:
En particular, en relacion con el analisis de muestras de leche, tales como leche para productos lacteos, la invencion es adecuada. En la leche, la invencion puede aplicarse para analizar celulas somaticas, tales como el tamano y/o numero de celulas somaticas en la leche. Ademas, puede llevarse a cabo el analisis de bacterias en la leche.
55
La leche puede analizarse en cualquier punto de tratamiento de la leche, pero la invencion es particularmente adecuada para analisis en lfnea o junto a la lfnea, donde la leche se analiza durante el ordeno. Las diversas operaciones incorporadas al dispositivo permiten que incluso personas no especialistas en las tecnicas de laboratorio efectuen resultados validos.
En relacion con el analisis de sangre, el aparato es adecuado para todas las valoraciones de partfculas sangufneas, tales como la valoracion del numero, morfologfa y tipo de diversos tipos de celulas sangufneas.
La invencion puede usarse en laboratorio o en la practica general para recuentos celulares o recuentos diferenciales. 5 Ademas, la invencion puede usarse por pacientes, por ejemplo cuando se controlan los recuentos celulares totales en conexion con tratamientos tales como tratamiento del cancer.
En las muestras de orina pueden analizarse de acuerdo con la presente invencion bacterias, por ejemplo cuando es necesaria una valoracion del recuento celular total en conexion con infecciones del tracto urinario.
10
Tambien puede usarse la invencion cuando se diagnostica la causa especffica de infecciones del tracto urinario, tales como el tipo de bacterias.
Ademas, puede valorarse el semen en el presente aparato, por ejemplo puede realizarse el recuento de 15 espermatozoides, el recuento total asf como el recuento de espermatozoides viables y/o espermatozoides muertos. Tambien puede examinarse la morfologfa de los espermatozoides mediante el presente aparato.
Puede realizarse la valoracion de partfculas en agua por la presente invencion, tal como el control de agua potable, control de aguas residuales o de agua de una planta purificadora de agua. En todas las aplicaciones, el control 20 puede estar relacionado con el recuento de partfculas totales, tal como el recuento de bacterias, o puede estar relacionado mas particularmente con un proceso de monitorizacion de bacterias especfficas, tales como bacterias patologicas.
Con respecto a la valoracion de bacterias, la invencion puede usarse tambien en conexion con muestras de alimento 25 o pienso asf como muestras petroqufmicas (p.ej., para combustible de avion).
Ademas, puede realizarse por la invencion el control de la fermentacion, es decir el control del crecimiento celular y las celulas viables en tanques de fermentacion. Esto se relaciona con todos los campos tecnicos que usen fermentacion, tales como la industria farmaceutica, para producir una composicion de peptido o protefna.
30
El aparato esta dotado de un compartimento de muestra para albergar el lfquido durante la valoracion como se discute anteriormente.
A continuacion, se discute la invencion con mas detalle en relacion con los dibujos.
35
En la Fig. 1, se muestra un aparato 1 de acuerdo con la invencion en forma esquematica. Se dispone la muestra en un compartimento de muestra 2 del plano de muestra. Se expone la muestra a la luz de excitacion de las fuentes lumfnicas 4a, 4b en el medio lumfnico de excitacion 3 a traves de la trayectoria lumfnica principal 5a, 5b.
40 Se emiten senales de fluorescencia por la muestra al medio de deteccion 6, que comprende al menos un detector 7. La trayectoria de las senales emitidas sigue el eje entre la muestra y el detector, el eje de deteccion-muestra 8.
Se transmiten los datos de senal a un procesador (no mostrado) acoplado con el medio de deteccion 6. Se filtran las senales de fluorescencia de la muestra mediante el filtro de emision 14 y se enfocan al medio de deteccion 9 45 mediante una lente de enfoque 10.
Se disponen las fuentes lumfnicas 4a, 4b en una carcasa lumfnica 11, con lo que se evita la transmision de la luz de excitacion directamente al medio de deteccion. Ademas, se colocan los filtros lumfnicos de excitacion 12a, 12b en el haz lumfnico de excitacion.
50
La Fig. 2 muestra una seccion transversal del material de soporte circular 13 de los filtros lumfnicos de excitacion, donde se ha indicado la posicion de las fuentes lumfnicas por cfrculos en lfneas discontinuas.
En la Fig. 3, se muestran la trayectoria lumfnica y la trayectoria de senal con mas detalle. En la trayectoria lumfnica, 55 se muestra la trayectoria lumfnica principal como 5. Ademas, se muestra el eje de deteccion-muestra por las lfneas discontinuas 8. El angulo de recogida del sistema se designa C, mostrado entre dos flechas, y el angulo entre la trayectoria lumfnica principal y el eje de deteccion-muestra se designa E.
En la Fig. 4, se muestra un sistema de excitacion/deteccion de dos lados 1 donde los sistemas en cada lado de la 60 muestra son identicos y como se describen para un sistema de un lado de la Fig. 1
La Fig. 5 muestra un sistema de excitacion de dos lados donde se expone la muestra 2 a la luz de excitacion de las fuentes lummicas 4a, 4b en el primer medio lummico de excitacion 3a y a la luz de excitacion de las fuentes lummicas 4a, 4b en el segundo medio lummico de excitacion 3b por ambos lados de muestra 2. Como se discute 5 anteriormente, las fuentes lummicas pueden ser identicas o diferentes dependiendo de la informacion para valorar. Ademas, los filtros usados para cada fuente lummica pueden ser diferentes o identicos.
Se transmiten las senales de fluorescencia a traves de y se reflejan por la muestra debido a la disposicion de la luz de excitacion, y se emiten al medio de deteccion 6. La trayectoria de las senales emitidas sigue el eje entre la 10 muestra y el detector, el eje de deteccion-muestra 8.
Se transmiten los datos de senal a un procesador acoplado con el medio de deteccion como se describe anteriormente.
15 La Fig. 6 muestra un sistema de deteccion de dos lados que usa un sistema de excitacion de dos lados, donde las senales de fluorescencia reflejadas de la muestra 2 se detectan por el medio de deteccion 6a que comprende el detector 7a. Se transmiten las senales de fluorescencia reflejadas a traves del filtro 14a y se enfocan por la lente 10a.
20 Ademas, se detectan las senales de fluorescencia transmitidas por la muestra 2 por el medio de deteccion 6b que comprende el detector 7b. Se transmiten las senales de fluorescencia reflejadas a traves del filtro 14b y se enfocan por la lente 10b.
El filtro 14a es preferiblemente diferente del filtro 14b, con lo que es obtenible informacion relativa a al menos dos 25 senales de fluorescencia diferentes.
Tambien los aumentos en los dos sistemas de deteccion pueden ser diferentes, por ejemplo siendo la lente 10a diferente de la lente 10b.
30 Ejemplo
Una imagen de celulas obtenida de acuerdo con la presente invencion.
Se efectua una valoracion del numero de celulas somaticas en leche detectando senales de fluorescencia originadas 35 en un fluorocromo unido a ADN en el nucleo celular, presentes en el compartimento de muestra en un sistema de configuracion como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. El compartimento de muestra se define por dos planos sustancialmente paralelos de material transmisor, formando por tanto un compartimento con dimensiones de aproximadamente 6x8x0,07 mm (altura, anchura, profundidad). En el presente ejemplo, el compartimento de muestra es una parte integrada de un cartucho desechable.
40
La fluorescencia se genera pasando luz de alta energfa (luz de excitacion de longitud de onda de 550 nm o menos) a traves del compartimento de muestra. La fuente de la luz de excitacion es una fuente lummica de acuerdo con la presente invencion como se ilustra en la Figura 1, que comprende 8 diodos emisores de luz dispuestos como se ilustra en la Figura 2. Los diodos emisores de luz son del tipo NSPG-500S (Nichia Chemical Industries Ltd., Japon). 45
Para evitar que sustancialmente cualquier componente de la luz de excitacion con longitud de onda superior a aproximadamente 550 nm alcance el compartimento de muestra, se inserta un filtro optico en la trayectoria lummica. Este filtro optico se integra en la fuente lummica y se pone en practica como un disco circular con un orificio circular en el medio a traves del cual se permite pasar cualquier luz emitida por el compartimento de muestra (vease la 50 Figura 2 para ilustracion adicional). Este filtro es de tipo Ferroperm SWP550, filtro de interferencia de dos lados, sobre un sustrato de 2 mm (Hoya, CM-500) que absorbe la radiacion infrarroja.
La luz emitida por el compartimento de muestra se enfoca a los sensores del modulo de deteccion mediante el uso de una lente. Este lente es un objetivo de microscopio estandar de 4x con apertura numerica de 0,10 (es un 55 suministrador G. J. Carl Hansens Eftf., Dinamarca). Se dispone la lente del modo que de una imagen de un objeto en el compartimento de muestra sobre los sensores del modulo de deteccion que tenga aproximadamente el mismo tamano que el objeto original (aumentos de aproximadamente 1x).
Para evitar que sustancialmente cualquier componente de la luz emitida por el compartimento de muestra con 60 longitud de onda inferior a aproximadamente 575 nm alcance el modulo de deteccion, se inserta un filtro optico en la
trayectoria lumfnica. Este filtro es de tipo Schott OG590 (grosor de 3 mm).
Se detecta la luz filtrada del compartimento de muestra por un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) de tipo ICX054BL-6 (suministrado por Sony).
5
Se amplifica la informacion electrica del CCD y se mide mediante un modulo conversor de analogo a digital (ADC). Esta informacion puede disponerse para dar una representacion en imagen de la informacion registrada. Se muestra una de tales imagenes en la Figura 7.
10 La imagen de la Figura 7 es el resultado de emision, registrado a partir de una muestra de celulas somaticas en solucion de leche que contiene aproximadamente 1 % de Triton X-100 y yoduro de propidio aproximadamente 30 pg/ml (CAS-25535-16-4) como tinte de tincion de ADN cuando sale con luz de una fuente lumfnica de acuerdo con la presente invencion.

Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un aparato para detectar la fluorescencia de una muestra liquida (1), que comprende:
    5 - un primer medio lumfnico de excitacion que comprende al menos dos fuentes lumfnicas de excitacion (4a, 4b) que comprenden una primera fuente lumfnica de excitacion (4a), teniendo la primera fuente lumfnica (4a) una trayectoria lumfnica principal (5a), y una segunda fuente lumfnica de excitacion (4b);
    - un plano de muestra para colocar dicha muestra, donde el plano de muestra se dota de un area de deteccion:
    - un compartimento de muestra (2),
    10 - un medio de deteccion (6) que comprende al menos un primer detector (7) para detectar senales de fluorescencia de la muestra, siendo el eje entre el medio de deteccion y el plano de muestra el eje de deteccion-muestra (8),
    - un procesador acoplado para recibir datos del detector o detectores,
    - un medio de enfoque (10) para enfocar las senales al medio de deteccion (6), teniendo dicho medio de enfoque (10) un angulo de recogida, estando el angulo entre la trayectoria lumfnica principal de excitacion de la primera
    15 fuente lumfnica y el eje de deteccion-muestra (8) entre el angulo de recogida/2 y 90°, caracterizado porque las al menos dos fuentes lumfnicas (4a, 4b) son al menos dos diodos emisores de luz; el compartimento de muestra (2) es para albergar la muestra liquida;
    el primer medio de deteccion (6) es una fila de elementos de deteccion;
    y el medio de enfoque (10) proporciona aumentos en el intervalo de 2/1 a 1/10, formando asf una imagen del area de 20 deteccion en la fila de deteccion de elementos de deteccion.
  2. 2. El aparato (1) de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el menos el primer medio lumfnico esta localizado en un primer plano lumfnico paralelo al plano de muestra, estando dicho primer plano lumfnico entre el plano de muestra y el primer medio de deteccion (7).
    25
  3. 3. El aparato (1) de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, donde se inserta un filtro lumfnico de excitacion (12a) en la trayectoria lumfnica de excitacion desde las al menos dos fuentes lumfnicas (4a, 4b).
    30 4. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se usan filtros
    sustancialmente identicos (12a, 12b) para todas las fuentes lumfnicas (4a, 4b).
  4. 5. La fuente lumfnica (4a) de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, donde el filtro o filtros lumfnicos de excitacion (12a, 12b) para cada fuente lumfnica se conectan entre si sobre un material de soporte (13).
    35
  5. 6. El aparato (1) de acuerdo con la reivindicacion 5, donde el material de soporte (13) tiene una forma seleccionada de entre circular, rectangular, cuadrada y semicircular.
  6. 7. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la primera fuente 40 lumfnica (4a) se filtra a traves del primer filtro (12a) y la segunda fuente lumfnica (4b) se filtra a traves de un segundo
    filtro (12b), siendo diferentes el primer filtro (12a) y el segundo filtro (12b).
  7. 8. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde un segundo medio lumfnico de excitacion se localiza en un segundo plano lumfnico, siendo dicho plano paralelo al plano de
    45 muestra y localizado en el otro lado del plano de muestra que el primer plano lumfnico, permitiendo que la muestra reciba luz de excitacion por los dos lados.
  8. 9. El aparato (1) de acuerdo con la reivindicacion 8, donde el filtro (14a, 14b) insertado en la trayectoria lumfnica desde el segundo medio lumfnico es diferente del filtro insertado en la trayectoria lumfnica del primer medio
    50 lumfnico (12a, 12b).
  9. 10. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se dispone un segundo medio de deteccion de modo que el plano de muestra este colocado entre el primer medio de deteccion (6) y el segundo medio de deteccion.
    55
  10. 11. El aparato (1) de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el primer medio de deteccion (6) es una fila de dispositivos de carga acoplada.
  11. 12. El aparato (1) de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el primer medio de deteccion (6) es identico 60 al segundo medio de deteccion.
  12. 13. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se inserta un
    filtro lumfnico de emision en la trayectoria lumfnica de emision hacia al menos el primer detector (7).
    5 14. El aparato (1) de acuerdo con la reivindicacion 13, donde la luz de emision se selecciona de entre
    filtros de interferencia, filtros coloreados y filtros de polarizacion.
  13. 15. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medio de enfoque (10) es una lente.
    10
  14. 16. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el area de deteccion de la muestra es de al menos 0,1 mm 2 preferiblemente al menos 0,5 mm2, mas preferiblemente al menos 1 mm2.
    15 17. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el angulo entre
    la luz principal de excitacion y el eje de deteccion-muestra (8) esta en el intervalo entre 35 y 90°, preferiblemente entre 45 y 85°, mas preferiblemente entre 50 y 85°.
  15. 18. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-17, donde al menos el primer 20 medio lumfnico esta localizado en un primer plano lumfnico paralelo al plano de muestra, estando colocado dicho
    primer plano lumfnico a una distancia del plano de muestra detras del detector.
  16. 19. El aparato (1) de acuerdo con la reivindicacion 18, donde se coloca el detector en una carcasa que tiene una abertura hacia la muestra.
    25
  17. 20. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medio de enfoque (10) proporciona aumentos en el intervalo de 2/1 a 1/4, preferiblemente en el intervalo de 2/1 a 1/2.
  18. 21. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera 30 fuente lumfnica (4a) tiene una banda de longitud de onda diferente de la segunda fuente lumfnica (4b).
  19. 22. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera fuente lumfnica (4a) y la segunda fuente lumfnica (4b) tienen bandas de longitud de onda identicas.
    35 23. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-22, donde el compartimento de
    muestra es un compartimento fijo.
  20. 24. El aparato (1) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-22, donde el compartimento de muestra es un compartimento reemplazable.
    40
  21. 25. Un procedimiento de valoracion de un parametro de una muestra lfquida que comprende:
    - disponer la muestra en un plano de muestra, donde el plano de muestra esta dotado de un area de deteccion;
    - exponer una primera superficie de la muestra directamente a luz de excitacion de un primer medio lumfnico que 45 tiene al menos una primera fuente lumfnica de excitacion (4a) y una segunda fuente lumfnica de excitacion (4b),
    mediante el uso del medio de enfoque (10), detectando una senal de fluorescencia de la primera superficie de la muestra en un primer medio de deteccion (6), siendo el primer medio de deteccion (6) una fila de elementos de deteccion;
    - teniendo dicho medio de enfoque (10) un angulo de recogida, estando el angulo entre la trayectoria lumfnica 50 principal de la primera fuente lumfnica de excitacion (4a) y el eje de deteccion-muestra entre el angulo de recogida/2
    y 90°, caracterizado porque
    las al menos dos fuentes lumfnicas son al menos dos diodos emisores de luz; la muestra se dispone en un compartimento de muestra para albergar una muestra lfquida; y el medio de enfoque (10) proporciona aumentos en 55 el intervalo de 2/1 a 1/10, formando asf una imagen del area de deteccion sobre la fila de deteccion de elementos de deteccion.
  22. 26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 25, donde el menos el primer medio lumfnico esta localizado en un primer plano lumfnico paralelo al plano de muestra, estando dicho primer plano lumfnico entre el
    60 plano de muestra y el primer medio de deteccion.
  23. 27. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-26, donde se inserta un
    filtro lumfnico de excitacion en la trayectoria lumfnica de excitacion de al menos una fuente lumfnica.
    5 28. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 27, donde se dispone la luz de excitacion como
    fuentes lumfnicas sobre un material de soporte (13).
  24. 29. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-28, donde se usan filtros sustancialmente identicos (12a, 12b, 14a, 14b) para todas las fuentes lumfnicas.
    10
  25. 30. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-29, donde la primera fuente lumfnica (4a) se filtra a traves del primer filtro (12a) y la segunda fuente lumfnica (4b) se filtra a traves de un segundo filtro (12b), siendo diferentes el primer filtro (12a) y el segundo filtro (12b).
    15 31. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-30, que comprende
    ademas exponer una segunda superficie de la muestra directamente a luz de excitacion de un segundo medio lumfnico que tiene al menos una fuente lumfnica (4a).
  26. 32. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 31, donde un segundo medio lumfnico de excitacion 20 se localiza en un segundo plano lumfnico, siendo dicho plano paralelo al plano de muestra y localizado en el otro
    lado del plano de muestra que el primer plano lumfnico, permitiendo que la muestra se exponga por dos superficies opuestas.
  27. 33. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 31 o 32, donde el filtro (14a) insertado en la
    25 trayectoria lumfnica del segundo medio lumfnico es diferente del filtro (12a) insertado en la trayectoria lumfnica del
    primer medio lumfnico.
  28. 34. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-33, donde se dispone un segundo medio de deteccion de modo que el compartimento de muestra este colocado entre el primer medio de
    30 deteccion (6) y el segundo medio de deteccion.
  29. 35. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-34, donde el primer medio de deteccion (6) es una fila de dispositivos de carga acoplada.
    35 36. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33-34, donde el primer medio
    de deteccion (6) es identico al segundo medio de deteccion.
  30. 37. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-36, donde se inserta un
    filtro lumfnico de emision en la trayectoria lumfnica de emision hacia al menos el primer detector (7).
    40
  31. 38. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-37, donde se dispone una lente de colimacion en la trayectoria lumfnica de emision.
  32. 39. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-38, donde dicha area de 45 deteccion es de al menos 0,1 mm2, preferiblemente al menos 0,5 mm2 y mas preferiblemente al menos 1 mm2.
  33. 40. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-39, donde se dispone un compartimento de muestra (2) en el plano de muestra para albergar la muestra.
    50 41. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-40, donde el angulo entre
    la luz principal de excitacion y el eje de deteccion-muestra (8) esta en el intervalo entre 35 y 90°, preferiblemente entre 45 y 85°, mas preferiblemente entre 50 y 85°.
  34. 42. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 25, donde al menos el primer medio lumfnico esta 55 localizado en un primer plano lumfnico paralelo al plano de muestra, estando colocado dicho primer plano lumfnico a
    una distancia del plano de muestra detras del detector (7).
  35. 43. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 42, donde el detector se coloca en una carcasa que tiene una abertura que posibilita que las senales emitidas alcancen el detector o detectores (7).
  36. 44. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 43, donde la senal de fluorescencia esta relacionada con un parametro de una partfcula en la muestra.
  37. 45. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 43 o 44, donde se valora el numero de partfculas.
    5
  38. 46. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 43-45, donde se valora la morfologfa de las partfculas.
  39. 47. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 46, donde se valora el numero de partfculas por el
    10 primer medio de deteccion (6) y se valora la morfologfa de las partfculas por un segundo medio de deteccion.
  40. 48. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-47, donde la muestra es
    una parte de un material solido que puede emitir una senal de fluorescencia.
    15 49. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 48, donde la muestra es tejido, partes y/o agregados
    celulares.
  41. 50. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 49, donde la muestra es un documento o una nota.
    20 51. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 50, donde la muestra es una parte de una
    construccion metalica para detectar senales de fallo del metal.
  42. 52. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-51, donde la primera fuente lumfnica (4a) tiene una banda de longitud de onda diferente de la segunda fuente lumfnica (4b).
    25
  43. 53. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-52, donde la primera fuente lumfnica (4a) y la segunda fuente lumfnica (4b) tienen bandas de longitud de onda identicas.
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