WO2015182258A1 - ラマン散乱光測定用チップ及びラマン散乱光測定装置 - Google Patents

ラマン散乱光測定用チップ及びラマン散乱光測定装置 Download PDF

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WO2015182258A1
WO2015182258A1 PCT/JP2015/061194 JP2015061194W WO2015182258A1 WO 2015182258 A1 WO2015182258 A1 WO 2015182258A1 JP 2015061194 W JP2015061194 W JP 2015061194W WO 2015182258 A1 WO2015182258 A1 WO 2015182258A1
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WO
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sample
raman scattered
scattered light
light
raman
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Application number
PCT/JP2015/061194
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English (en)
French (fr)
Inventor
堂脇　優
寛和 辰田
松居　恵理子
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ソニー株式会社
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering

Definitions

  • This technology relates to a Raman scattered light measurement chip and a Raman scattered light measurement device. More specifically, the present invention relates to a technique for improving sensitivity in measurement of Raman scattered light emitted from a sample.
  • Measured Raman scattered light and used for sample analysis. However, it may be difficult to measure Raman scattered light emitted from the sample with high sensitivity due to noise or the like.
  • Patent Document 1 discloses that “excitation light is applied to a sample on a sheet member made of a material different from the container disposed in the container.
  • the method for measuring the Raman scattered light is disclosed, which includes a detection procedure for detecting the Raman scattered light by irradiating.
  • this method by installing a sheet member on the bottom surface of the sample container, the focal position of the objective lens is separated from the sample container, and the intensity of detection of Raman scattered light derived from the sample container that causes noise is reduced. Can do.
  • the Raman scattered light emitted from the sample can be measured with higher sensitivity by suppressing the noise by the method for measuring Raman scattered light described in Patent Document 1.
  • the Raman scattered light emitted from the sample itself may be weak, and further improvement is required.
  • the main object of the present disclosure is to provide a chip for measuring Raman scattered light emitted from a sample with higher sensitivity.
  • the present disclosure includes a base material, a sample holding portion disposed to face the base material, and a sample storage portion provided between the base material and the sample holding portion.
  • the surface of the base material in contact with the sample storage portion transmits illumination light applied to the sample in the sample storage portion from the base material side, and the sample storage portion from the sample holding portion side.
  • a light wavelength selection region for reflecting Raman scattered light emitted from the sample is formed by excitation light irradiated on the sample in the unit, and at least a part of the sample holding unit facing the light wavelength selection region is light transmissive.
  • a Raman scattered light measuring chip is provided.
  • the light wavelength selection region may be configured to reflect the excitation light.
  • the whole sample holding part may have light transmittance.
  • the sample holder may include a gel substance at least in a contact portion with the sample.
  • the sample holder may be made of synthetic quartz.
  • the Raman scattered light measurement chip has a first space, a second space, and a flow path connecting the first space and the second space, and the measurement is provided in the flow path. A part may be formed. Moreover, the said flow path may have a branch part, and the said 1st space and the said 2nd space may connect with the 3rd space via the said branch part.
  • the sample may contain cells.
  • the sample holder may include an extracellular matrix at least in a contact portion with the sample. Both the sample holder and the sample container may be made of an extracellular matrix.
  • the present disclosure also includes a measurement unit including a base material, a sample holding unit disposed to face the base material, and a sample storage unit provided between the base material and the sample holding unit.
  • the surface of the base material in contact with the sample storage portion transmits illumination light applied to the sample in the sample storage portion from the base material side, and from the sample holding portion side to the sample in the sample storage portion.
  • a light wavelength selection region that reflects the Raman scattered light emitted from the sample by the irradiated excitation light is formed, and the sample holder has at least a portion facing the light wavelength selection region to have a light transmissive Raman scattering light measurement.
  • Raman scattered light measurement comprising: a chip for use; a first light source that irradiates the illumination wavelength to the light wavelength selection region; and a second light source that irradiates the excitation light to a portion facing the light wavelength selection region Providing equipment.
  • the Raman scattered light measurement device may include a driving mechanism that changes a relative position in a horizontal direction of the irradiation position of the illumination light and the excitation light and the Raman scattered light measurement chip.
  • a chip or the like for measuring Raman scattered light emitted from a sample with higher sensitivity is provided. Note that the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in the present disclosure.
  • A is a plan view of the Raman scattered light measurement chip shown in FIG. 1, and B is a cross-sectional view taken along the line P1-P1 of A.
  • FIG. A and B are schematic diagrams for explaining an optical wavelength selection region.
  • A is a schematic plan view showing an example of a Raman scattered light measurement chip of a Raman scattered light measurement apparatus according to a modified embodiment of the first embodiment, and B is a cross-sectional view taken along the line P2-P2 of A in FIG. is there.
  • It is a mimetic diagram showing an example of a Raman scattering light measuring device concerning a 2nd embodiment of this indication.
  • FIG. 6 is a plan view of the Raman scattered light measurement chip shown in FIG. 6, and B is a cross-sectional view taken along line P3-P3 of A.
  • FIG. A is a schematic plan view showing an example of a Raman scattered light measurement chip of a Raman scattered light measurement apparatus according to a modified embodiment of the third embodiment, and B is a cross-sectional view taken along line P4-P4 in A. is there. It is a schematic diagram for demonstrating the measurement of the Raman scattered light in Experimental example 1.
  • FIG. 5 is a drawing substitute graph showing a Raman spectrum measured in Experimental Example 1.
  • FIG. 5 is a drawing substitute graph showing a Raman spectrum measured in Experimental Example 1.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting graph showing a Raman spectrum measured in Experimental Example 2.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting graph showing a Raman spectrum measured in Experimental Example 3.
  • FIG. 6 is a drawing-substituting photograph showing a phase difference image of a cell used in Experimental Example 4.
  • FIG. 14 is a drawing substitute graph showing a Raman spectrum measured in Experimental Example 4.
  • FIG. 1 illustrates an example of a Raman scattered light measurement apparatus according to a first embodiment of the present disclosure.
  • the Raman scattered light measurement apparatus D1 includes at least a first light source 1, a second light source 2, and a Raman scattered light measurement chip 3a. Each configuration of the Raman scattered light measurement device D1 will be described in order.
  • the 1st light source 1 is illumination light (FIG. 1, arrow L11) to the light wavelength selection area
  • the 1st light source 1 should just be able to radiate
  • a white light source such as a halogen lamp can be employed as the first light source 1.
  • the illumination light emitted from this white light source is light that includes a wide wavelength band in the visible range.
  • illumination light (FIG. 1, arrow L11) is irradiated from the first light source 1 to the sample accommodated in the Raman scattered light measurement chip 3a.
  • the illumination light after passing through the sample or the illumination light diffracted and scattered by the sample (FIG. 1, arrow L12) passes through the objective lens 41 and is imaged on the imaging unit 51 by the imaging lens 42. An image is taken.
  • the image of the sample to be imaged may be a bright field image or a dark field image, but when imaging a transparent sample such as a cell type that does not contain a dye, a phase difference image or a dark field image Is preferred.
  • the second light source 2 is excited light at a portion facing a light wavelength selection region provided in a Raman scattered light measuring chip 3a described later in the Raman scattered light measuring device D1 (FIG. 1). , Arrow L21).
  • the 2nd light source 2 should just be able to radiate
  • a light source having a short wavelength line width such as a semiconductor laser or a solid-state laser can be employed.
  • the wavelength having a short line width is, for example, 532 nm, 785 nm, 1064 nm, or the like.
  • excitation light (arrow L21 in FIG. 1) is irradiated from the second light source 2 to the sample housed in the Raman scattered light measurement chip 3a.
  • the excitation light is applied to the sample via the imaging lens 42 and the objective lens 41, and Raman scattered light (FIG. 1, arrow L22) is generated from the sample irradiated with the excitation light.
  • This Raman scattered light is detected by the Raman scattered light detector 52 via the objective lens 41 and the imaging lens 42.
  • the Raman scattered light incident on the Raman scattered light detection unit 52 may be dispersed and detected as a spectrum.
  • the Raman scattered light measurement apparatus D1 includes an optical path for measuring Raman scattered light and an optical path for guiding illumination light after passing through the sample or illumination light diffracted and scattered by the sample to the imaging unit 51.
  • An optical path switching mechanism 43 for sharing a part of the optical path may be provided.
  • the Raman scattered light measurement device D1 a configuration provided in a known microscope or the like such as a diaphragm or a mirror can be appropriately adopted as necessary.
  • the imaging unit 51 may be connected to a display device such as a monitor so that the user can visually recognize the acquired sample image.
  • the Raman scattered light measuring chip 3a has a configuration for accommodating a sample to be measured in the Raman scattered light measuring device D1.
  • FIG. 2 schematically shows the configuration of the Raman scattered light measurement chip 3a.
  • 2A is a plan view of the Raman scattered light measurement chip 3a shown in FIG. 1, and
  • FIG. 2B is a cross-sectional view taken along line P1-P1 in FIG. 2A.
  • the “chip” is configured to include a base material to be described later, and includes various structures such as a region for accommodating a sample and a measurement unit for measuring the sample. Further, like the Raman scattered light measurement chip in the third embodiment to be described later, the “chip” may be provided with a fine structure such as a flow path.
  • the Raman scattered light measurement chip 3a has at least a measurement unit 31 as shown in FIG. 2A.
  • the measurement unit 31 includes a base material 311, a sample holding unit 312 disposed to face the base material 311, and a sample storage unit 313 provided between the base material 311 and the sample holding unit 312. Have. Each structure of the measurement part 31 is demonstrated in order.
  • tip 3a for Raman scattered light measurement is not limited to the ratio shown in FIG.
  • the size of the measurement unit 31 can be appropriately designed according to the size of the sample to be measured, the size of the Raman scattered light measurement device D1, and the like.
  • the base material 311 has a configuration for forming the sample storage portion 313 together with the sample holding portion 312 in the Raman scattered light measurement chip 3a.
  • a light wavelength selection region 311a is formed on a surface F1 of the base material 311 that is in contact with the sample storage portion 313.
  • the base material 311 may be, for example, a plate-like member as shown in FIG. 2B or may be a block shape.
  • the shape of the base material 311 is not particularly limited as long as the light wavelength selection region 311a can have the characteristics described later.
  • the material of the base material 311 can be appropriately selected from known materials. Examples of the material of the base material 311 include white plate glass such as “B270” (high transparency crown glass) and “BK7” (borosilicate glass).
  • 3A and 3B are cross-sectional views taken along line P1-P1 shown in FIG. 2A, similarly to the cross-sectional view shown in FIG. 2B.
  • 3A and 3B show a state in which the sample S is accommodated in the sample accommodating portion 313.
  • the light wavelength selection region 311a transmits the illumination light (FIG. 3A, arrow L11) applied to the sample S in the sample storage unit 313 from the base material 311 side.
  • the light wavelength selection region 311a includes Raman scattered light (FIG. 3B, FIG. 3B) emitted from the sample S by the excitation light (FIG. 3B, arrow L21) applied to the sample S in the sample storage unit 313 from the sample holding unit 312 side.
  • the arrow L22b) is reflected. That is, the light wavelength selection region 311a is a region where light is transmitted or reflected according to the wavelength.
  • an optical film may be formed on the surface F1 of the base material 311 in contact with the sample storage portion 313.
  • the optical film body may be formed on a member different from the base material 311, and the light wavelength selection region 311 a may be formed on the base material 311 by providing the member on the surface F ⁇ b> 1 in contact with the sample storage portion 313.
  • optical film for example, an appropriate film can be adopted from known optical filters in accordance with the characteristics of the sample, the wavelength of the excitation light, and the like.
  • the optical filter include a short pass filter that transmits light in a short wavelength band but does not transmit light in a long wavelength band. It is also possible to employ a long pass filter that transmits light in a long wavelength band but does not transmit light in a short wavelength band.
  • the second the emitted excitation light from the light source 2 (Fig. 3B, arrows L21) the wavelength of 785 nm, the Raman scattered light detection unit 52, when measuring the Stokes Raman scattered light to shift of about 4000 cm -1 Is assumed.
  • the optical wavelength selection region 311a is set in the base material 311 so that the reflected wavelength band is longer than 785 nm and the transmitted wavelength band is 785 nm or less. Can be formed.
  • the illumination light emitted from the first light source 1 light having a wavelength of 785 nm or less passes through the light wavelength selection region 311a.
  • the light wavelength selection region 311a can transmit the illumination light (see arrow L11 in FIG. 1) and reflect the Raman scattered light.
  • the wavelength of the excitation light (FIG. 3B, arrow L21) emitted from the second light source 2 is 532 nm
  • the Raman scattered light detector 52 measures the Stokes Raman scattered light up to a shift of about 4000 cm ⁇ 1.
  • the wavelength band reflected in the optical wavelength selection region 311a can be made longer than 532 nm.
  • the wavelength band reflected in the optical wavelength selection region 311a can be made less than 676 nm.
  • the optical film it is difficult for the optical film to completely switch between reflection and transmission with the design switching wavelength as a boundary, and therefore any optical characteristics due to design and manufacture may be taken into consideration.
  • the wavelength of the excitation light described above is 785 nm, it is desirable to set the switching wavelength to a shorter wavelength side than 785 nm.
  • the Raman scattered light measurement chip 3 a the light wavelength selection region 311 a described above is formed on the base material 311, so that irradiation light (FIG. 3A, arrow L ⁇ b> 11) is stored in the sample storage unit 313 in the measurement unit 31.
  • the sample S can be irradiated.
  • the Raman scattered light (FIG. 3B, arrows L22a and L22b) emitted from the sample S the Raman scattered light (FIG. 3, arrow L22b) emitted toward the substrate 311 is reflected in the light wavelength selection region 311a. become able to.
  • the above-described optical wavelength selection region 311a may further be configured to reflect the excitation light (FIG. 3B, arrow L21) emitted from the second light source 2.
  • the sample S is repeatedly irradiated with the excitation light, and the Raman scattered light (FIG. 3B, arrows L22a and L22b) emitted from the sample S can be enhanced.
  • the reflectance of the excitation light in the light wavelength selection region 311a can be appropriately set according to the intensity of Raman scattered light emitted from the sample S, the intensity of leakage of excitation light into the Raman scattered light detection unit 52, and the like.
  • the sample holder 312 has a configuration for forming the sample container 313 together with the base material 311 in the Raman scattered light measurement chip 3a (see FIG. 2B). Further, the sample S accommodated in the Raman scattered light measurement chip 3 a can be held on the surface F ⁇ b> 2 of the sample holding part 312 that is in contact with the sample holding part 313.
  • the sample holder 312 at least a portion (opposite portion) 312 a facing the light wavelength selection region 311 a is light transmissive.
  • the material of the sample holder 312 can be appropriately selected from known materials as long as the facing portion 312a has light transmittance.
  • a light-transmitting material such as glass for the facing portion 312a
  • at least the facing portion 312a can be light-transmitting in the sample holder 312.
  • the entire sample holder 312 may be configured to have light transmittance.
  • a member made of synthetic quartz such as synthetic quartz glass, polydimethylsiloxane (PDMS), or the like is preferably used. Since these have light transmissivity, the entire sample holding unit 312 can be provided with light transmissivity by being used as the sample holding unit 312. Further, since the Raman scattered light emitted from a member made of synthetic quartz or PDMS does not generate a strong peak in a specific wave number band, the Raman scattered light emitted from the sample holder 312 when measuring the Raman scattered light of the sample S. Noise derived from light can be reduced.
  • synthetic quartz such as synthetic quartz glass, polydimethylsiloxane (PDMS), or the like is preferably used. Since these have light transmissivity, the entire sample holding unit 312 can be provided with light transmissivity by being used as the sample holding unit 312. Further, since the Raman scattered light emitted from a member made of synthetic quartz or PDMS does not generate a strong peak in a specific wave number band, the Raman scattered light emitted from the sample
  • a member made of synthetic quartz has a flat Raman spectrum measured in a wide waveband
  • the use of a member made of synthetic quartz for the sample holder 312 suppresses noise originating from the sample holder 312.
  • the Raman scattered light of the sample S can be measured with higher sensitivity.
  • a member made of synthetic quartz or PDMS can be used only for the facing portion 312 a of the sample holder 312.
  • a contact portion of the sample holder 312 with the sample S is provided with a material that does not emit Raman scattered light with high intensity.
  • a material that does not emit Raman scattered light with high intensity is a gel substance.
  • the gel substance is composed of a liquid component and a gelling component for holding the liquid component.
  • the gelling component include polyacrylic acid, which is a synthetic polymer, proteins that constitute an extracellular matrix such as collagen, and polysaccharides such as agarose.
  • the facing portion 312 a has light transmissivity, so that illumination light after passing through the sample or illumination light diffracted and scattered by the sample (FIG. 3A, arrow L ⁇ b> 12) can be transmitted. .
  • an image of the sample S can be taken.
  • the opposing portion 312a has light transmittance, so that excitation light is applied to the sample S accommodated in the sample accommodating portion 313 (FIG. 3B, arrow L21). Can be irradiated.
  • the sample storage unit 313 is a region for storing a sample in the Raman scattered light measurement chip 3a (see FIGS. 2A and 2B again).
  • the sample storage portion 313 is formed as a gap formed between the base material 311 and the sample holding portion 312.
  • Such a void can be formed, for example, by arranging a spacer 313a between the base material 311 and the sample holder 312 as shown in FIG. 2B.
  • the height h of the spacer 313a can be appropriately set according to the size and properties of the sample to be accommodated.
  • the type of the sample is not particularly limited as long as the sample can use Raman scattered light for analysis.
  • the sample include a polymer material, a metal compound, a biological sample, and the like.
  • a sample it can also contain a cell.
  • individual cells can also be measured without pretreatment such as staining, so that the cells can be analyzed more easily. Therefore, the Raman scattered light measurement device D1 can be suitably used for cell analysis.
  • an extracellular matrix may be provided in a contact portion with the sample S of the sample holding unit 312 such as the surface F2 of the sample holding unit 312 that contacts the sample storage unit 313. (See FIGS. 2B and 3A).
  • the sample S can be introduced into the sample container 313 using a capillary phenomenon.
  • the Raman scattering light measurement chip 3a has the sample holder 312 and the base material 311 overlapped with each other. It is preferable to have a portion that does not exist (see FIGS. 2A and 2B).
  • the measurement unit 31 is provided in the Raman scattered light measurement chip 3a.
  • a light wavelength selection region 311a that reflects Raman scattered light is formed, and a portion 312a facing the light wavelength selection region 311a has light transmittance. For this reason, even if the Raman scattered light emitted from the sample S is weak, among the Raman scattered light emitted in all directions, the Raman scattered light emitted toward the substrate 311 is also reflected by the light wavelength selection region 311a. Thus, the light can be guided to the Raman scattered light detection unit 52. As a result, the Raman scattered light measurement apparatus D1 can measure Raman scattered light with higher sensitivity.
  • the excitation light emitted from the second light source 2 is also configured to be reflected in the light wavelength selection region 311a, the reflected excitation light is irradiated again on the sample S, and the Raman scattered light is emitted from the sample S again. . For this reason, the Raman scattered light of the sample S can be measured more efficiently.
  • the gold coating portion when gold is coated on the base material 311, the gold coating portion can reflect the excitation light and the Raman scattered light described above, and can increase the intensity of the Raman scattered light to be measured.
  • the gold coating portion cannot transmit illumination light, it is difficult to image the sample S by irradiation with illumination light.
  • the light wavelength selection region 311a of the measurement unit 31 provided in the Raman scattered light measurement chip 3a transmits illumination light.
  • the Raman scattered light measurement apparatus D1 can capture not only the measurement of the Raman scattered light but also an image of the sample S irradiated with the illumination light. Therefore, observation of the sample S with illumination light and acquisition of Raman scattered light emitted from the sample S can be achieved with a single device. As a result, since the position of the sample S can be specified in advance based on the captured image of the sample S, even when a plurality of measurement objects are included in the sample S, the specific measurement object, Alternatively, Raman scattering spectroscopic measurement can be performed only on a specific measurement target site, and high-speed measurement of Raman scattered light can be realized.
  • the sample holder 312 is disposed on the side where the excitation light from the second light source 2 is incident on the sample.
  • Raman scattered light emitted from 312 becomes noise.
  • the sample holder 312 by using the above-described member made of synthetic quartz or the like as the sample holder 312, noise can be reduced and Raman scattered light emitted from the sample S can be measured with higher sensitivity.
  • FIG. 4 shows a Raman scattered light measurement chip 3b provided in a Raman scattered light measurement apparatus D11 according to a modified embodiment of the first embodiment.
  • 4A is a schematic plan view of the Raman scattered light measurement chip 3b
  • FIG. 4B is a cross-sectional view taken along the line P2-P2 of FIG. 4A. Since the configuration other than the Raman scattered light measurement chip 3b is the same as that of the Raman scattered light measurement device D1 according to the first embodiment, the description thereof is omitted. Moreover, the same code
  • both the sample holding unit 3121 and the sample storage unit 3131 are made of an extracellular matrix. Therefore, as shown in FIG. 4B, the sample S is accommodated in the Raman scattered light measurement chip 3b in a state of being embedded in the extracellular matrix constituting the sample accommodating portion 3131. Further, regarding the extracellular matrix constituting the sample holding unit 3121 and the extracellular matrix constituting the sample storage unit 3131, different types of extracellular matrix can be used, but the same extracellular matrix is used to integrate them. It can also be molded.
  • the gel made of extracellular matrix has a loose molecular structure, the spectrum derived from the Raman scattered light from the gel itself is flat. For this reason, the Raman scattered light emitted from the extracellular matrix is unlikely to become noise with respect to the Raman spectrum from the sample. Further, when the sample S contains cells, the extracellular matrix allows gas exchange with the surroundings of the cells.
  • the extracellular matrix can be appropriately selected according to the type of cells used as the sample S.
  • Examples of the extracellular matrix include collagen and gelatin.
  • both the sample holding unit 3121 and the sample storage unit 3131 can be made of agarose. The concentrations of these extracellular matrix, agarose, and the like can be appropriately set according to the properties of the cells used as the sample S.
  • the sample S is used for the measurement by being laminated on the base material 311 together with the extracellular matrix. be able to.
  • the illumination light is irradiated from the base material 311 side to the sample S in the sample storage unit 3131, and the sample storage unit 3121 side has the inside of the sample storage unit 3131.
  • the orientation of the Raman scattered light measurement chip 3b is not limited.
  • the arrangement of the first light source 1 and the second light source 2 is changed.
  • the Raman scattered light can be measured with the substrate 311 facing downward.
  • noise derived from Raman scattered light emitted from the sample holding unit 3121 is configured by configuring both the sample holding unit 3121 and the sample storage unit 3131 with an extracellular matrix.
  • the Raman scattered light of the sample S can be measured with higher sensitivity.
  • gas exchange around the sample S is possible, so that Raman scattering can be measured while performing cell culture for a relatively long period of time.
  • Other effects of the Raman scattered light measurement apparatus D11 according to the modified embodiment of the first embodiment are the same as those of the Raman scattered light measurement apparatus D1 according to the first embodiment described above.
  • FIG. 5 is a schematic diagram illustrating a configuration example of a Raman scattered light measurement apparatus according to a second embodiment of the present disclosure.
  • the Raman scattered light measurement device denoted by reference numeral D2 includes a drive mechanism 6 that changes the irradiation position of the illumination light and the excitation light and the relative position in the horizontal direction of the Raman scattered light measurement chip 3a.
  • symbol is attached
  • the drive mechanism 6 shown in FIG. 5 is configured to move the Raman scattered light measurement chip 3a in the direction indicated by the arrow X1. As the Raman scattered light measurement chip 3a moves, the irradiation positions of the illumination light and the excitation light change. That is, the Raman scattered light emitted from the sample S can be measured while scanning the illumination light and the excitation light in the spreading direction of the light wavelength selection region 311a in the Raman scattered light measurement chip 3a.
  • the drive mechanism 6 only needs to be able to change the relative positions in the horizontal direction of the illumination light and excitation light irradiation positions and the Raman scattered light measurement chip 3a. Is not limited to the configuration shown in FIG.
  • the drive mechanism 6 can be appropriately designed from a configuration of a known scanning microscope, for example.
  • a galvanometer mirror or the like may be employed as the drive mechanism 6 and the irradiation position of the illumination light and the excitation light may be changed by rotating the mirror.
  • the driving mechanism 6 moves the first light source 1, the second light source 2, the imaging unit 51, and the like instead of the Raman scattered light measurement chip 3 a, thereby illuminating and exciting the scattered light measurement chip 3 a. You may change the irradiation position of light.
  • the drive mechanism 6 may be configured such that both the Raman scattered light measurement chip 3a and the optical system such as the first light source 1 are movable.
  • the drive mechanism 6 may be configured to be movable with respect to two orthogonal axes.
  • the sample S can be measured by changing the relative position two-dimensionally.
  • the Raman scattered light measurement device D2 the first light source 1 and the second light source 2 may be configured as line light sources. In this case, even if the relative position change by the drive mechanism 6 is only in one axis direction, the sample S can be measured in the same manner as when the relative position is changed two-dimensionally.
  • the irradiation position of the illumination light and the excitation light and the relative position in the horizontal direction of the Raman scattered light measurement chip 3a can be changed. For this reason, imaging or measurement can be performed while scanning the imaging position or the measurement position of Raman scattered light, and the distribution of Raman scattered light in the sample S can also be obtained.
  • Other effects of the Raman scattered light measurement device D2 according to the second embodiment are the same as those of the Raman scattered light measurement device D1 according to the first embodiment described above.
  • FIG. 6 is a schematic diagram illustrating an example of a Raman scattered light measurement apparatus according to a third embodiment of the present disclosure.
  • the Raman scattered light measuring device indicated by reference sign D3 in FIG. 6 has a Raman scattered light measuring chip 3c. Further, the Raman scattered light measurement device D3 may have liquid feeding portions 71 and 72 as a configuration for allowing the sample S to flow through a flow path provided in the later-described Raman scattered light measurement chip 3c. Good.
  • the configuration other than the Raman scattered light measurement chip 3c and the liquid feeding units 71 and 72 is the same as the Raman scattered light measurement device D1 according to the first embodiment described above.
  • symbol is attached
  • FIG. 7 schematically shows the configuration of the Raman scattered light measurement chip 3c.
  • 7A is a plan view of the Raman scattered light measurement chip 3c shown in FIG. 6, and
  • FIG. 7B is a cross-sectional view taken along the line P3-P3 in FIG. 7A.
  • the Raman scattered light measurement chip 3c includes a first space (first space) 321, a second space (second space) 322, a first space 321, and a second space 322.
  • a measurement part 31 is formed in the flow path 34.
  • the first space 321 and the second space 322 are spaces for accommodating the sample S.
  • the channel 34 is configured to allow the sample S to flow from the first space 321 to the second space 322.
  • the first space 321, the second space 322, and the flow path 34 are all configured as grooves formed in the sample holder 312.
  • the first space 321, the second space 322, and the flow path 34 can be formed on the sample holder 312 by a microfabrication technique using a microchip or the like.
  • the measurement part 31 mentioned above is formed in at least one part of the flow path 34.
  • the size of the measurement unit 31 with respect to the flow path 34 can be appropriately set according to the size of the sample to be measured. For example, it is preferable that the size of the flow path 34 is formed so that the sample S can be divided into units to be measured and flowed.
  • the configurations of the first space 321, the second space 322, and the flow path 34 may be provided on the base material 311 side, and a part thereof is provided on the base material 311. The other part may be provided in the sample holder 312.
  • the portion of the base material 311 where the optical wavelength selection region 311a is formed is flat. Is preferably formed into the sample holder 312.
  • a liquid containing the sample S1 is introduced into the first space 321 from the inlet 3211 (FIG. 7B). Thereafter, the sample S1 flows through the flow path 34 (see arrow X2) and reaches the measurement unit 31 (see sample S2). Then, for the sample S2, when passing through the measuring unit 31, imaging and measurement of Raman scattered light are performed. Imaging and measurement of Raman scattered light are as described above.
  • the sample S3 that has passed through the measurement unit 31 flows through the flow path 34 (see arrow X3), reaches the second space 322, and is accommodated in the second space 322.
  • the liquid feeding units 71 and 72 are configured to introduce a liquid containing the sample S into the first space 321 in the Raman scattered light measurement apparatus D3, to flow through the flow path 34, and to flow into the second space 322. (Refer again to FIG. 6).
  • a liquid feed pump or the like can be adopted as the liquid feed units 71 and 72.
  • the liquid feeding units 71 and 72 can continuously pass the sample S through the flow path 34 by being connected to a container for storing the sample S or a container for collecting the waste liquid.
  • the liquid that has flowed through the flow path 34 can be discharged by providing a discharge port 3221 in the second space 322.
  • the Raman scattered light measurement according to the second embodiment described above is performed by forming the flow path 34 in the Raman scattered light measurement chip 3c and allowing the sample S to flow. Even when the drive mechanism 6 in the apparatus D2 is not provided, the sample S can be continuously measured.
  • the Raman scattered light measurement device D3 is suitable for, for example, a particulate sample S that can be circulated by a liquid. Examples of such a sample S include a cell suspension.
  • Other effects of the Raman scattered light measurement device D3 according to the third embodiment are the same as those of the Raman scattered light measurement device D1 according to the first embodiment described above.
  • FIG. 8 shows a Raman scattered light measurement chip 3d provided in a Raman scattered light measurement apparatus D31 according to a modified embodiment of the third embodiment.
  • 8A is a schematic plan view of the Raman scattered light measurement chip 3d
  • FIG. 8B is a cross-sectional view taken along line P4-P4 shown in FIG. 8A. Since the configuration other than the Raman scattered light measurement chip 3d and the fractionation unit 8 described later is the same as the Raman scattered light measurement device D3 according to the third embodiment, the description thereof is omitted. Moreover, the same code
  • the flow path 34 has a branch portion 35, and the first space 321 and the second space 322 pass through the branch portion 35 in the third space (third The space) 323.
  • the third space 323 is a space for accommodating the sample S, like the first space 321 and the second space 322 described above.
  • the discharge port 3231 can be provided in the third space.
  • the third space 323 can be formed in the sample holder 312 in the same manner as the first space 321 described above.
  • the molding method is also as described above.
  • a part of the configuration of the sorting unit 8 to be described later may be inserted into the flow path 34 between the branching unit 35 and the measurement unit 31.
  • the sorting unit 8 puts the sample S flowing through the flow path 34 into either the second space 322 or the third section 323 according to the measurement result of the sample S. It is the structure for making it flow.
  • the configuration of the sorting unit 8 only needs to be able to collect the sample in a desired space according to the measurement result, and can be freely designed from a known configuration.
  • a charging unit is provided in the flow path 34 between the measurement unit 31 and the branching unit 35 to apply a charge to the sample S according to the measurement result (the charging unit is not shown in FIG. 8).
  • the electrode pair 81, 81 in the taking part 8 it is possible to flow the sample S to which a charge is applied to a desired space according to the charge.
  • the Raman scattered light measurement chip 3d shown in FIG. 8A an example in which one branching portion 35 is provided is shown.
  • the sample S is provided by providing a plurality of branching portions 35 and providing a space communicating with each of them. Can be divided into three or more.
  • the third space 323 and the branching portion 35 are provided in the Raman scattered light measurement chip 3d, so that the sample is measured after the measurement performed by the measurement unit 31. S can be divided into two. Furthermore, by providing the sorting unit 8 in the Raman scattered light measurement device D31, the sample S can be divided into two according to the measurement result of the Raman scattered light. For this reason, it is possible to more easily collect the sample S according to the measurement result.
  • Other effects of the Raman scattered light measurement device D31 according to the modified embodiment of the third embodiment are the same as those of the Raman scattered light measurement device D3 according to the third embodiment described above.
  • the present disclosure can have the following configurations.
  • a measurement unit including a base material, a sample holding unit arranged to face the base material, and a sample storage unit provided between the base material and the sample holding unit, The illumination light irradiated from the base material side to the sample in the sample storage part is transmitted to the surface of the base material in contact with the sample storage part, and the sample in the sample storage part is irradiated from the sample holding part side.
  • An optical wavelength selection region for reflecting Raman scattered light emitted from the sample by the excited light is formed, and the sample holding portion has a light transmitting property at least in a portion facing the light wavelength selection region. .
  • a first space, a second space, and a flow channel connecting the first space and the second space, and the measurement unit is formed in the flow channel.
  • the Raman scattered light measurement chip according to any one of (1) to (7), wherein the sample includes cells.
  • the sample holding unit includes an extracellular matrix at least in a contact portion with the sample.
  • a measurement unit including a base material, a sample holding unit disposed to face the base material, and a sample storage unit provided between the base material and the sample holding unit, The illumination light irradiated from the base material side to the sample in the sample storage part is transmitted to the surface of the base material in contact with the sample storage part, and the sample in the sample storage part is irradiated from the sample holding part side.
  • An optical wavelength selection region for reflecting Raman scattered light emitted from the sample by the excited light is formed, and the sample holding portion has a light transmitting property at least in a portion facing the light wavelength selection region.
  • the Raman scattered light measurement apparatus further including a driving mechanism that changes a relative position in a horizontal direction of the irradiation position of the illumination light and the excitation light and the Raman scattered light measurement chip.
  • Experimental example 1 In this experimental example, it was verified whether or not the sensitivity of measurement of Raman scattered light emitted from a sample was improved by forming an optical film on a substrate.
  • the horizontal axis represents Raman shift (cm ⁇ 1 ), and the vertical axis represents intensity (au).
  • the Raman scattered light was detected with the highest sensitivity. This is because gold reflects both excitation light and Raman scattered light.
  • the peak intensity at 1000 cm ⁇ 1 was 5933.2219.
  • the peak intensity at 1000 cm ⁇ 1 was 3924.681.
  • Experimental example 2 In this experimental example, materials suitable for the sample holder of the Raman scattered light measurement chip were examined.
  • FIG. 11 shows the results of this experimental example.
  • the horizontal axis represents Raman shift (cm ⁇ 1 ), and the vertical axis represents intensity (au). It was shown that strong Raman scattering was emitted from a glass slide over a wide range of wave numbers.
  • the Raman scattering spectrum was almost flat over the entire wave number.
  • the synthetic quartz glass also had a flat Raman scattering spectrum over the entire wave number, similar to the gold-coated substrate. Therefore, it was shown that a member made of synthetic quartz having optical transparency, such as quartz glass, is suitable for the sample holder.
  • Experimental example 3 In this experimental example, materials suitable for the sample holder of the Raman scattered light measurement chip were examined.
  • Excitation light (785 nm) was irradiated to each of a polystyrene culture dish and plate-like polydimethylsiloxane (PDMS), and Raman scattered light was measured. Further, the Raman scattered light was subjected to spectroscopy to obtain a Raman spectrum.
  • PDMS polystyrene culture dish and plate-like polydimethylsiloxane
  • FIG. 12 shows the results of this experimental example.
  • the horizontal axis in FIG. 12 indicates the Raman shift (cm ⁇ 1 ), and the vertical axis indicates the intensity (au).
  • a broken line shows the culture dish (PS) made from polystyrene
  • a continuous line shows PDMS.
  • PS culture dish
  • PDMS PDMS
  • the Raman scattered light of the sample can be measured.
  • FIG. 13 is an image of a phase difference image with an optical magnification of 40 times.
  • FIG. 14 shows the results of Raman scattering spectroscopic measurement for each cell observed for phase difference.
  • the horizontal axis in FIG. 14 indicates the Raman shift (cm ⁇ 1 ), and the vertical axis indicates the intensity (au).
  • each alphabet of A to K corresponds to the alphabet attached to each cell in FIG.
  • the Raman scattered light can be measured more efficiently by determining the position where the Raman scattered light is measured in advance based on the image obtained by the illumination light.

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Abstract

　試料から発せられるラマン散乱光をより感度高く測定するためのチップを提供する。　基材と、前記基材に対向して配置された試料保持部と、前記基材と前記試料保持部との間に設けられた試料収容部と、を有する測定部を備え、前記基材の前記試料収容部と接する面に、前記基材側から前記試料収容部内の試料へ照射される照明光を透過し、かつ前記試料保持部側から前記試料収容部内の前記試料へ照射された励起光によって前記試料から発せられるラマン散乱光を反射する光波長選択領域が形成され、前記試料保持部は少なくとも前記光波長選択領域と対向する部分が光透過性を有するラマン散乱光測定用チップを提供する。

Description

ラマン散乱光測定用チップ及びラマン散乱光測定装置
　本技術は、ラマン散乱光測定用チップ及びラマン散乱光測定装置に関する。より詳しくは、試料から発せられるラマン散乱光の測定において感度を向上させる技術に関する。
　ラマン散乱光を測定して、試料の分析に用いることが行われている。しかし、ノイズなどによって、試料から発せられるラマン散乱光を高感度に測定することが困難な場合もあった。
　ノイズを抑えて試料から発せられるラマン散乱光をより高感度に測定するために、例えば、特許文献１には、「容器内に配された該容器と異なる材質のシート部材上の試料に励起光を照射してラマン散乱光を検出する検出手順を含む、ラマン散乱光測定方法」が開示されている。当該方法では、試料用容器の底面にシート部材を設置することによって、対物レンズの焦点の位置が試料用容器から離れ、ノイズとなる試料用容器由来のラマン散乱光の検出の強度を低下させることができる。
特開２０１３－１７４４９７号公報
　上記特許文献１に記載されているラマン散乱光の測定方法によって、ノイズを抑えて試料から発せられるラマン散乱光をより高感度に測定することができる。しかし、試料から発せられるラマン散乱光自体が微弱な場合もあり、さらなる改良が求められている。
　そこで、本開示は、試料から発せられるラマン散乱光をより感度高く測定するためのチップを提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本開示は、基材と、前記基材に対向して配置された試料保持部と、前記基材と前記試料保持部との間に設けられた試料収容部と、を有する測定部を備え、前記基材の前記試料収容部と接する面に、前記基材側から前記試料収容部内の試料へ照射される照明光を透過し、かつ前記試料保持部側から前記試料収容部内の前記試料へ照射された励起光によって前記試料から発せられるラマン散乱光を反射する光波長選択領域が形成され、前記試料保持部は少なくとも前記光波長選択領域と対向する部分が光透過性を有するラマン散乱光測定用チップを提供する。
　さらに前記光波長選択領域は前記励起光を反射するように構成されていてもよい。
　また、前記試料保持部全体が光透過性を有していてもよい。
　前記試料保持部は、少なくとも前記試料との接触部分にゲル状物質を備えることもできる。前記試料保持部は、合成石英からなっていてもよい。
　上記ラマン散乱光測定用チップは、第１の空間と、第２の空間と、前記第１の空間と前記第２の空間とを連絡する流路と、を有し、前記流路に前記測定部が形成されていてもよい。
　また、前記流路は分岐部を有し、前記第１の空間及び前記第２の空間は前記分岐部を介して第３の空間と連絡していてもよい。
　前記試料は細胞を含むものとすることができる。
　前記試料保持部は少なくとも前記試料との接触部分に細胞外基質を備えていてもよい。
　前記試料保持部及び前記試料収容部は共に細胞外基質からなるものとすることもできる。
　本開示はまた、基材と、前記基材に対向して配置された試料保持部と、前記基材と前記試料保持部との間に設けられた試料収容部と、を有する測定部を備え、前記基材の前記試料収容部と接する面に、前記基材側から前記試料収容部内の試料へ照射される照明光を透過し、かつ前記試料保持部側から前記試料収容部内の前記試料へ照射された励起光によって前記試料から発せられるラマン散乱光を反射する光波長選択領域が形成され、前記試料保持部は少なくとも前記光波長選択領域と対向する部分が光透過性を有するラマン散乱光測定用チップと、前記光波長選択領域へ前記照明光を照射する第１の光源と、前記光波長選択領域と対向する部分に前記励起光を照射する第２の光源と、を有するラマン散乱光測定装置を提供する。
　上記ラマン散乱光測定装置は、前記照明光及び前記励起光の照射位置と前記ラマン散乱光測定用チップの水平方向における相対位置を変化させる駆動機構を備えていてもよい。
　本開示により、試料から発せられるラマン散乱光をより感度高く測定するためのチップ等が提供される。なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載された何れかの効果であってもよい。
本開示の第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置の一例を示す模式図である。 Ａは、図１に示すラマン散乱光測定用チップの平面図であり、Ｂは、ＡのＰ１－Ｐ１線の矢視断面図である。 Ａ及びＢは、光波長選択領域を説明するための模式図である。 Ａは、第１実施形態の変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置のラマン散乱光測定用チップの一例を示す平面模式図であり、Ｂは、ＡのＰ２－Ｐ２線の矢視断面図である。 本開示の第２実施形態に係るラマン散乱光測定装置の一例を示す模式図である。 本開示の第３実施形態に係るラマン散乱光測定装置の一例を示す模式図である。 Ａは、図６に示すラマン散乱光測定用チップの平面図であり、Ｂは、ＡのＰ３－Ｐ３線の矢視断面図である。 Ａは、第３実施形態の変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置のラマン散乱光測定用チップの一例を示す平面模式図であり、Ｂは、ＡのＰ４－Ｐ４線の矢視断面図である。 実験例１におけるラマン散乱光の測定を説明するための模式図である。 実験例１において測定されたラマンスペクトルを示す図面代用グラフである。 実験例２において測定されたラマンスペクトルを示す図面代用グラフである。 実験例３において測定されたラマンスペクトルを示す図面代用グラフである。 実験例４で用いた細胞の位相差像を示す図面代用写真である。 実験例４において測定されたラマンスペクトルを示す図面代用グラフである。
　以下、本開示を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。また、説明は、以下の順序で行う。

１．第１実施形態
（試料収容部が空隙として構成されている例）
２．第１実施形態の変形実施形態
（試料収容部が細胞外基質で構成されている例）
３．第２実施形態
（光照射位置を走査するための構成を有する例）
４．第３実施形態
（測定対象が通流する流路に測定部が設けられている例）
５．第３実施形態の変形実施形態
（分取部を備える例）
１．第１実施形態
　本開示の第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置の一例を図１に示す。図１に示すように、ラマン散乱光測定装置Ｄ１は、少なくとも、第１の光源１と、第２の光源２と、ラマン散乱光測定用チップ３ａと、を有する。ラマン散乱光測定装置Ｄ１の各構成について、順に説明する。
（１）第１の光源
　第１の光源１は、ラマン散乱光測定装置Ｄ１において、後述するラマン散乱光測定用チップ３ａに設けられた光波長選択領域へ、照明光（図１、矢印Ｌ１１）を照射するための構成である。第１の光源１は、試料の透過像を撮像するための照明光を出射することができればよく、公知の光源の中から自由に選択することができる。例えば、第１の光源１として、ハロゲンランプ等の白色光源を採用することもできる。この白色光源から発せられる照明光は、可視域の波長帯を広く含む光である。
　ラマン散乱光測定装置Ｄ１では、第１の光源１からラマン散乱光測定用チップ３ａに収容された試料へ照明光（図１、矢印Ｌ１１）が照射される。そして、試料を透過した後の照明光、又は試料により回折散乱した照明光（図１、矢印Ｌ１２）は、対物レンズ４１を経て、結像レンズ４２によって撮像部５１に結像して、試料の像が撮像される。なお、撮像される試料の像は、明視野像でも暗視野像でも構わないが、色素を含有しない種類の細胞のような、透明な試料を撮像する場合には、位相差像や暗視野像が好ましい。
（２）第２の光源
　第２の光源２は、ラマン散乱光測定装置Ｄ１において、後述するラマン散乱光測定用チップ３ａに設けられた、光波長選択領域と対向する部分に励起光（図１、矢印Ｌ２１）を照射するための構成である。第２の光源２は、試料への励起光を出射することができればよく、公知の光源の中から自由に選択することができる。第２の光源２には、例えば、半導体レーザーや固体レーザー等の波長の線幅の短い光源を採用することができる。線幅の短い波長とは、例えば、５３２ｎｍ、７８５ｎｍ、１０６４ｎｍ等である。
　ラマン散乱光測定装置Ｄ１では、第２の光源２から、ラマン散乱光測定用チップ３ａに収容された試料へ励起光（図１、矢印Ｌ２１）が照射される。励起光は、結像レンズ４２、対物レンズ４１を介して試料に照射され、励起光が照射された試料からはラマン散乱光（図１、矢印Ｌ２２）が生じる。このラマン散乱光は、対物レンズ４１及び結像レンズ４２を介してラマン散乱光検出部５２で検出される。また、例えば、ラマン散乱光検出部５２に、分光器や光検出器を備えることにより、ラマン散乱光検出部５２に入射したラマン散乱光を分光して、スペクトルとして検出してもよい。
　この他、ラマン散乱光測定装置Ｄ１には、ラマン散乱光測定のための光路と、試料を透過した後の照明光、又は試料により回折散乱した照明光を撮像部５１へ導光するための光路の一部を共有するための光路切替機構４３が備えられていてもよい。また、ラマン散乱光測定装置Ｄ１においては、絞りやミラー等、公知の顕微鏡等に備えられる構成を、必要に応じて適宜採用することもできる。さらに、撮像部５１は、取得した試料の像をユーザが視認できるように、モニター等の表示装置に接続されていてもよい。
（３）ラマン散乱光測定用チップ
　ラマン散乱光測定用チップ３ａは、ラマン散乱光測定装置Ｄ１において、測定対象の試料を収容するための構成である。図２に、ラマン散乱光測定用チップ３ａの構成を模式的に示す。図２Ａは、図１に示すラマン散乱光測定用チップ３ａの平面図であり、図２Ｂは、図２ＡのＰ１－Ｐ１線の矢視断面図である。
　本開示において「チップ」とは、後述する基材を含んで構成され、試料を収容する領域や、試料を測定する測定部等の各構造を備えるものである。また、後述する第３実施形態におけるラマン散乱光測定用チップのように、「チップ」には、流路等の微細構造が設けられていてもよい。
　ラマン散乱光測定用チップ３ａは、図２Ａに示すように、少なくとも測定部３１を有する。そして、測定部３１は、基材３１１と、基材３１１に対向して配置された試料保持部３１２と、基材３１１と試料保持部３１２との間に設けられた試料収容部３１３と、を有する。測定部３１の各構成について順に説明する。なお、ラマン散乱光測定用チップ３ａ全体に対して測定部３１が占める割合は、図２に示す割合には限定されない。測定部３１の大きさは、測定対象とする試料の大きさやラマン散乱光測定装置Ｄ１の大きさ等に応じて適宜設計できる。
＜基材＞
　基材３１１は、ラマン散乱光測定用チップ３ａにおいて、試料保持部３１２と共に試料収容部３１３を形成するための構成である。また、基材３１１の、試料収容部３１３と接する面Ｆ１には、光波長選択領域３１１ａが形成されている。
　基材３１１は、例えば、図２Ｂに示すような板状の部材であってもよく、ブロック状であってもよい。光波長選択領域３１１ａが後述する特性を備えることができる限り、基材３１１の形状は特に限定されない。また、光波長選択領域３１１ａが後述する特性を備えるように構成される限り、基材３１１の材質についても、公知の材料の中から適宜採用できる。基材３１１の材料としては、例えば、「Ｂ２７０」（高透明度クラウンガラス）や「ＢＫ７」（硼珪酸ガラス）などの白板ガラス等が挙げられる。
　図３Ａ及び図３Ｂは、図２Ｂに示す断面図と同様に、図２Ａに示すＰ１－Ｐ１線の矢視断面図である。また、図３Ａ及び図３Ｂに示すラマン散乱光測定用チップ３ａは、試料収容部３１３に試料Ｓが収容された状態を示す。
　図３Ａ及び図３Ｂに示すように、光波長選択領域３１１ａは、基材３１１側から試料収容部３１３内の試料Ｓへ照射された照明光（図３Ａ、矢印Ｌ１１）を透過する。加えて、光波長選択領域３１１ａは、試料保持部３１２側から試料収容部３１３内の試料Ｓへ照射された励起光（図３Ｂ、矢印Ｌ２１）によって試料Ｓから発せられるラマン散乱光（図３Ｂ、矢印Ｌ２２ｂ）を反射する。即ち、光波長選択領域３１１ａは、光を、その波長に応じて、透過させたり反射したりする領域である。
　光波長選択領域３１１ａを上述した特性を備える領域とするために、例えば、基材３１１の試料収容部３１３と接する面Ｆ１に、光学膜が形成されていてもよい。また、基材３１１とは別の部材に光学膜体が形成されて、当該部材を試料収容部３１３と接する面Ｆ１に設けて、基材３１１に光波長選択領域３１１ａを形成することもできる。
　光学膜としては、例えば公知の光学フィルタの中から、試料の特性や励起光の波長等に合わせて、適切なものを採用することができる。光学フィルタとしては、例えば、短い波長帯の光を透過する一方、長い波長帯の光を透過させないショートパスフィルタが挙げられる。また、長い波長帯の光を透過する一方、短い波長帯の光を透過させないロングパスフィルタを採用することもできる。
　一例として、第２の光源２から発せられる励起光（図３Ｂ、矢印Ｌ２１）の波長が７８５ｎｍであり、ラマン散乱光検出部５２において、ストークスラマン散乱光を４０００ｃｍ－１程度のシフトまで測定する場合を想定する。この場合、７８５ｎｍを切替波長とするショートパスフィルタを採用することにより、反射する波長帯を７８５ｎｍより長くし、かつ、透過する波長帯を７８５ｎｍ以下とする、光波長選択領域３１１ａを基材３１１に形成することができる。また、第１の光源１から発せられる照明光についても、７８５ｎｍ以下の光が、光波長選択領域３１１ａを透過する。このように、光波長選択領域３１１ａは、照明光（図１、矢印Ｌ１１参照）を透過して、ラマン散乱光を反射させることができる。
　また、一例として、第２の光源２から発せられる励起光（図３Ｂ、矢印Ｌ２１）の波長が５３２ｎｍであり、ラマン散乱光検出部５２において、ストークスラマン散乱光を４０００ｃｍ－１程度のシフトまで測定する場合を想定する。この場合、例えば、５３２ｎｍを切替波長とするショートパスフィルタを採用することにより、光波長選択領域３１１ａにおいて反射される波長帯を５３２ｎｍより長くすることができる。また、例えば、６７６ｎｍを切替波長とするロングパスフィルタを採用することにより、光波長選択領域３１１ａにおいて反射される波長帯を６７６ｎｍ未満とすることができる。このように、５３２ｎｍを切替波長とするショートパスフィルタ、又は６７６ｎｍを切替波長とするロングパスフィルタを光波長選択領域３１１ａに採用することにより、光波長選択領域３１１ａにおいて、測定対象とする波長帯のラマン散乱光を反射させることができる。
　なお、光学膜については、設計上の切替波長を境に完全に反射と透過を切り替えることは困難であるため、設計や製造による光学特性のだれを考慮してもよい。例えば、上述した励起光の波長を７８５ｎｍとする場合には、切替波長を７８５ｎｍより短波長側に設定することが望ましい。
　ラマン散乱光測定用チップ３ａでは、上述した光波長選択領域３１１ａが基材３１１に形成されていることにより、測定部３１において照射光（図３Ａ、矢印Ｌ１１）を試料収容部３１３に収容された試料Ｓに照射することが可能となる。また、試料Ｓから発せられたラマン散乱光（図３Ｂ、矢印Ｌ２２ａ，Ｌ２２ｂ）のうち、基材３１１側へ発せられたラマン散乱光（図３、矢印Ｌ２２ｂ）は、光波長選択領域３１１ａにおいて反射できるようになる。
　上述した光波長選択領域３１１ａは、さらに、第２の光源２から発せられる励起光（図３Ｂ、矢印Ｌ２１）を反射するように構成されていてもよい。励起光が反射することにより、試料Ｓに繰り返し励起光が照射され、試料Ｓから発せられるラマン散乱光（図３Ｂ、矢印Ｌ２２ａ，Ｌ２２ｂ）を増強することができる。光波長選択領域３１１ａにおける励起光の反射率は、試料Ｓから発せられるラマン散乱光の強度や、励起光のラマン散乱光検出部５２への漏れ込み強度等に合わせて適宜設定できる。
＜試料保持部＞
　試料保持部３１２は、ラマン散乱光測定用チップ３ａにおいて、基材３１１と共に、試料収容部３１３を形成するための構成である（図２Ｂ参照）。また、ラマン散乱光測定用チップ３ａに収容された試料Ｓは、試料保持部３１２の、試料収容部３１３と接する面Ｆ２に保持することができる。
　試料保持部３１２は、少なくとも光波長選択領域３１１ａと対向する部分（対向部分）３１２ａが光透過性を有する。試料保持部３１２の材質は、対向部分３１２ａに光透過性を有する限り、公知の材料の中から適宜採用できる。例えば、ガラス等、光透過性を有する材料を対向部分３１２ａに用いることで、試料保持部３１２においては、少なくとも対向部分３１２ａに光透過性を備えることができる。また、光透過性を有する材料を試料保持部３１２として用いることにより、試料保持部３１２全体が光透過性を有するように構成されていてもよい。
　試料保持部３１２には、例えば、合成石英ガラス等の合成石英からなる部材や、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等を用いることが好ましい。これらは、光透過性を有しているため、試料保持部３１２として用いることにより、試料保持部３１２全体に光透過性を備えることができる。さらに、合成石英からなる部材やＰＤＭＳから発せられるラマン散乱光は、特定の波数帯に強いピークを生じないため、試料Ｓのラマン散乱光を測定する際に、試料保持部３１２から発せられるラマン散乱光に由来するノイズを低減できる。特に、合成石英からなる部材は、広い波数帯で測定されるラマンスペクトルが平坦であるため、試料保持部３１２に合成石英からなる部材を採用することにより、試料保持部３１２に由来するノイズを抑えて、より感度高く試料Ｓのラマン散乱光を測定することができる。なお、合成石英からなる部材やＰＤＭＳを、試料保持部３１２の対向部分３１２ａにのみ用いることもできる。
　試料Ｓのラマン散乱光測定において試料保持部３１２に由来するノイズを低減するため、試料保持部３１２の少なくとも試料Ｓとの接触部分に、高い強度でラマン散乱光を発しない材料が備えられていてもよい。このような材料としては、例えば、ゲル状物質が挙げられる。ゲル状物質は、液体成分と、当該液体成分を保持するためのゲル化成分と、から構成される。ゲル化成分としては、例えば、合成高分子であるポリアクリル酸や、コラーゲン等の細胞外基質を構成するタンパク質、アガロース等の多糖類が挙げられる。
　上述した試料保持部３１２では、対向部分３１２ａが光透過性を有することにより、試料を透過した後の照明光、又は試料により回折散乱した照明光（図３Ａ、矢印Ｌ１２）を透過させることができる。この結果、ラマン散乱光測定装置Ｄ１を用いた試料Ｓの測定では、試料Ｓの像を撮像することができる。
　また、図３Ｂに示すように、ラマン散乱光測定用チップ３ａでは、対向部分３１２ａが光透過性を有することにより、試料収容部３１３に収容された試料Ｓへ励起光（図３Ｂ、矢印Ｌ２１）を照射することができる。
＜試料収容部＞
　試料収容部３１３は、ラマン散乱光測定用チップ３ａにおいて、試料を収容するための領域である（図２Ａ及び図２Ｂ再度参照）。また、図２Ｂに示すラマン散乱光測定用チップ３ａでは、試料収容部３１３は、基材３１１と試料保持部３１２との間に形成された空隙として形成されている。このような空隙は、例えば、図２Ｂに示すように、基材３１１と試料保持部３１２との間にスペーサー３１３ａを配置することで、形成することができる。スペーサー３１３ａの高さｈは、収容する試料の大きさや性質などに応じて適宜設定することができる。
　本開示の第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１において、試料は、ラマン散乱光を分析に用いることが可能な試料であれば、その種類は特に限定されない。試料としては、例えば、高分子材料や金属化合物、生体試料などが挙げられる。また、試料については、細胞を含むものとすることもできる。細胞のラマン散乱光を測定する際には、染色等の前処理を行うことなく個々の細胞を測定することもできるため、細胞をより簡便に分析することができる。このため、ラマン散乱光測定装置Ｄ１は細胞の分析に好適に用いられ得る。試料Ｓに細胞が含まれる場合、例えば、試料保持部３１２の試料収容部３１３と接する面Ｆ２など、試料保持部３１２の試料Ｓとの接触部分には、細胞外基質が備えられていてもよい（図２Ｂ、図３Ａ参照）。
　試料収容部３１３への試料Ｓの導入は、例えば、試料収容部３１３の高さｈが十分に細い場合には、毛細管現象を利用して試料Ｓを含む液体を導入することもできる。また、毛細管現象を利用して試料Ｓを導入する場合には、試料Ｓの導入をより簡便にするために、ラマン散乱光測定用チップ３ａは、試料保持部３１２と基材３１１とが重なり合わない部分を有している方が好ましい（図２Ａ及び図２Ｂ参照）。
　本開示の第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１では、ラマン散乱光測定用チップ３ａに測定部３１が設けられている。測定部３１には、ラマン散乱光を反射する光波長選択領域３１１ａが形成され、光波長選択領域３１１ａと対向する部分３１２ａは、光透過性を有する。このため、試料Ｓから発せられるラマン散乱光が微弱な場合であっても、全方向に発せられるラマン散乱光のうち、基材３１１側へ発せられるラマン散乱光についても光波長選択領域３１１ａによって反射させて、ラマン散乱光検出部５２へ導光することができる。この結果、ラマン散乱光測定装置Ｄ１では、より高感度にラマン散乱光を測定できる。
　さらに、第２の光源２から発せられる励起光についても光波長選択領域３１１ａにおいて反射するように構成した場合、反射した励起光が試料Ｓに再び照射され、試料Ｓからラマン散乱光が再度発せられる。このため、より効率的に試料Ｓのラマン散乱光を測定できる。
　また、例えば、金を基材３１１にコートした場合、金のコーティング部分は、上述した励起光及びラマン散乱光を反射することができ、測定されるラマン散乱光の強度を高めることができる。しかし、金のコーティング部分は、照明光を透過できないため、照明光の照射による試料Ｓの撮像が困難となる。これに対して、第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１では、ラマン散乱光測定用チップ３ａに設けられた測定部３１の光波長選択領域３１１ａが照明光を透過する。
　このため、ラマン散乱光測定装置Ｄ１では、ラマン散乱光の測定のみならず、照明光を照射された試料Ｓの像を撮像することもできる。従って、照明光による試料Ｓの観察と、試料Ｓから発せられるラマン散乱光の取得を一台の装置で両立することができる。この結果、撮像された試料Ｓの像に基づき、予め試料Ｓの位置を特定することができるため、試料Ｓ中に複数の測定対象が含まれている場合であっても、特定の測定対象、又は特定の測定対象部位に対してのみラマン散乱分光測定を行うことができ、ラマン散乱光の高速な測定を実現できる。
　また、上述した本実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１では、試料保持部３１２は、試料に対して、第２の光源２からの励起光が入射する側に配置されるため、試料保持部３１２から発せられるラマン散乱光がノイズとなるおそれがある。例えば、上述した合成石英なる部材等を試料保持部３１２として用いることにより、ノイズを低減して試料Ｓから発せられるラマン散乱光をより感度高く測定することができる。
２．第１実施形態の変形実施形態
　図４に、第１実施形態の変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１１に備えられるラマン散乱光測定用チップ３ｂを示す。図４Ａは、ラマン散乱光測定用チップ３ｂの平面模式図であり、図４Ｂは、図４ＡのＰ２－Ｐ２線の矢視断面図である。なお、ラマン散乱光測定用チップ３ｂ以外の構成は、第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１と同一であるため、その説明は省略する。また、ラマン散乱光測定用チップ３ｂの各構成のうち、第１実施形態と同一の構成については同一の符号を付し、その説明は省略する。
＜ラマン散乱光測定用チップ＞
　本変形実施形態のラマン散乱光測定用チップ３ｂは、試料保持部３１２１及び試料収容部３１３１が共に細胞外基質からなる。このため、図４Ｂに示すように、試料Ｓは、試料収容部３１３１を構成する細胞外基質に包埋された状態で、ラマン散乱光測定用チップ３ｂに収容されている。また、試料保持部３１２１を構成する細胞外基質と試料収容部３１３１を構成する細胞外基質については、各々、種類の異なる細胞外基質とすることもできるが、同じ細胞外基質を用いて、一体成形することもできる。
　細胞外基質からなるゲルは、分子構造が緩いため、ゲル自体からのラマン散乱光に由来するスペクトルは平坦となる。このため、細胞外基質から発せられるラマン散乱光は、試料からのラマンスペクトルに対してノイズとなり難い。また、試料Ｓに細胞が含まれる場合には、細胞外基質によって、細胞の周囲とのガス交換が可能となる。
　細胞外基質は、試料Ｓとする細胞の種類等に合わせて適宜選択することができる。細胞外基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。また、細胞外基質以外でも、例えば、試料保持部３１２１及び試料収容部３１３１を共にアガロースで構成することもできる。これらの細胞外基質やアガロース等の濃度は、試料Ｓとする細胞の性質等に合わせて適宜設定できる。
　ラマン散乱光測定用チップ３ｂを用いる場合には、例えば、細胞外基質と試料Ｓとを予め混合した後、当該試料Ｓを細胞外基質と共に基材３１１の上に積層することにより、測定に用いることができる。なお、本変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１１においては、基材３１１側から試料収容部３１３１内の試料Ｓへ照明光が照射され、かつ試料保持部３１２１側から試料収容部３１３１内の試料Ｓへ励起光が照射されるように構成されている限り、ラマン散乱光測定用チップ３ｂの載置の向きは限定されない。例えば、上述した細胞外基質やアガロースの濃度等により、試料保持部３１２１及び試料収容部３１３１の流動性が高い場合には、第１の光源１、第２の光源２等の配置を変えるなどすることにより、基材３１１を下方にしてラマン散乱光を測定することもできる。
　本変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１１においては、試料保持部３１２１及び試料収容部３１３１を、共に細胞外基質で構成することにより、試料保持部３１２１から発せられるラマン散乱光に由来するノイズを低減して、試料Ｓのラマン散乱光をより感度高く測定できる。さらに、試料Ｓが細胞を含む場合には、試料Ｓ周辺におけるガス交換が可能となるため、比較的長期間、細胞培養を行いながらラマン散乱の測定を行うことができる。第１実施形態の変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１１の他の効果は、上述した第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１と同様である。
３．第２実施形態
　図５は、本開示の第２実施形態に係るラマン散乱光測定装置の構成例を示す模式図である。図５中、符号Ｄ２で示すラマン散乱光測定装置は、照明光及び励起光の照射位置とラマン散乱光測定用チップ３ａの水平方向における相対位置を変化させる駆動機構６を備える。なお、第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１と同一の構成については同一の符号を付し、その説明は省略する。
＜駆動機構＞
　図５に示す駆動機構６は、ラマン散乱光測定用チップ３ａを矢印Ｘ１で示す方向へ移動させるための構成である。ラマン散乱光測定用チップ３ａが移動することにより、照明光及び励起光の照射位置が変化する。即ち、ラマン散乱光測定用チップ３ａにおける光波長選択領域３１１ａ広がり方向へ照明光及び励起光を走査しながら試料Ｓから発せられるラマン散乱光を測定することができる。
　ラマン散乱光測定装置Ｄ２において、駆動機構６は、照明光及び励起光の照射位置とラマン散乱光測定用チップ３ａの、水平方向における相対位置を変化させることが可能であればよく、駆動機構６は、図５示す構成には限定されない。駆動機構６は、例えば公知の走査型顕微鏡等の構成から適宜設計できる。
　例えば、駆動機構６としてガルバノミラー等を採用して、ミラーの回転によって、照明光及び励起光の照射位置を変化させてもよい。この他、駆動機構６によって、ラマン散乱光測定用チップ３ａの代わりに第１の光源１、第２の光源２及び撮像部５１等を移動させて、散乱光測定用チップ３ａにおける照明光及び励起光の照射位置を変化させてもよい。また、ラマン散乱光測定装置Ｄ２においては、ラマン散乱光測定用チップ３ａと、第１の光源１等の光学系の両方が移動可能となるように駆動機構６が構成されていてもよい。
　図５に示す駆動機構６の構成では、一軸方向における相対位置の変化を示したが、直行する２軸に関して、移動可能となるように駆動機構６が構成されていてもよい。この結果、相対位置を２次元的に変化させて試料Ｓを測定できる。また、ラマン散乱光測定装置Ｄ２において、第１の光源１及び第２の光源２は、ライン光源として構成されていてもよい。この場合、駆動機構６による相対位置の変化が一軸方向のみであっても、２次元的に相対位置を変化させた場合と同じように、試料Ｓを測定できる。
　本実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ２では、照明光及び励起光の照射位置とラマン散乱光測定用チップ３ａの水平方向における相対位置を変化させることができる。このため、撮像位置やラマン散乱光の測定位置を走査しながら、撮像又は測定を行うことができ、試料Ｓ内でのラマン散乱光の分布を得ることもできる。第２実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ２の他の効果は、上述した第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１と同様である。
４．第３実施形態
　図６は、本開示の第３実施形態に係るラマン散乱光測定装置の一例を示す模式図である。図６中符号Ｄ３で示すラマン散乱光測定装置は、ラマン散乱光測定用チップ３ｃを有する。さらに、ラマン散乱光測定装置Ｄ３は、後述するラマン散乱光測定用チップ３ｃ内に設けられた流路に試料Ｓを通流させるための構成として、送液部７１，７２を有していてもよい。
　ラマン散乱光測定装置Ｄ３において、ラマン散乱光測定用チップ３ｃと送液部７１，７２以外の構成は、上述した第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１と同一の構成である。第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１と同一の構成については同一の符号を付し、その説明は省略する。
＜ラマン散乱光測定用チップ＞
　図７にラマン散乱光測定用チップ３ｃの構成を模式的に示す。図７Ａは、図６に示すラマン散乱光測定用チップ３ｃの平面図であり、図７Ｂは、図７ＡのＰ３－Ｐ３線の矢視断面図である。図７Ａに示すように、ラマン散乱光測定用チップ３ｃは、第１空間（第１の空間）３２１と、第２空間（第２の空間）３２２と、第１空間３２１と第２空間３２２とを連絡する流路３４と、を有し、流路３４に測定部３１が形成されている。
　ラマン散乱光測定用チップ３ｃにおいて、第１空間３２１と第２空間３２２は、試料Ｓを収容するための空間である。また、流路３４は、試料Ｓを第１空間３２１から第２空間３２２へ通流させるための構成である。
　図７Ｂに示すラマン散乱光測定用チップ３ｃでは、第１空間３２１、第２の空間３２２及び流路３４は、共に試料保持部３１２に形成された溝として構成されている。試料保持部３１２への、第１空間３２１、第２空間３２２及び流路３４の成形は、マイクロチップ等における微細加工技術等によって行うことができる。そして、流路３４の少なくとも一部には、上述した測定部３１が形成されている。また、測定部３１の流路３４に対する大きさは、測定対象とする試料の大きさ等に合わせて、適宜設定できる。例えば、流路３４の大きさは、試料Ｓを、測定対象とする単位に分けて通流させることができる大きさに形成されていることが好ましい。
　また、上述した測定部３１の機能を損なわない限り、第１空間３２１、第２空間３２２及び流路３４の構成は、基材３１１側に設けられていてもよく、一部が基材３１１に設けられ、他の部分が試料保持部３１２に設けられていてもよい。光波長選択領域３１１ａにおける波長選択性の精度を十分に確保するためには、基材３１１の光波長選択領域３１１ａが形成される部分は平坦であることが好ましいため、流路３４等の微細構造は、試料保持部３１２へ成形することが好ましい。
　ラマン散乱光測定装置Ｄ３を用いた試料Ｓの測定では、ラマン散乱光測定用チップ３ｃにおいて、先ず、試料Ｓ１を含む液体が導入口３２１１から第１空間３２１へ導入される（図７Ｂ）。その後、試料Ｓ１は、流路３４を通流して（矢印Ｘ２参照）、測定部３１まで達する（試料Ｓ２参照）。そして、試料Ｓ２に対しては、測定部３１を通過する際、撮像とラマン散乱光の測定が行われる。撮像とラマン散乱光の測定については上述した通りである。測定部３１を通過した試料Ｓ３は、流路３４を通流して（矢印Ｘ３参照）、第２空間３２２に達し、第２空間３２２に収容される。
＜送液部＞
　送液部７１，７２は、ラマン散乱光測定装置Ｄ３において、試料Ｓを含む液体を第１空間３２１へ導入して、流路３４を通流させ、第２空間３２２へ送流するための構成である（図６再度参照）。液体は、送液部７１，７２としては、例えば、送液ポンプ等を採用することができる。また、送液部７１，７２は、試料Ｓを収容する容器や、廃液を回収する容器と連結することにより、流路３４内に試料Ｓを連続的に通流させることもできる。なお、流路３４を通流した液体は、第２空間３２２に排出口３２２１を設けることにより排出することもできる。
　本実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ３では、ラマン散乱光測定用チップ３ｃに流路３４を形成して、試料Ｓを通流させることにより、上述した第２実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ２における駆動機構６を有していない場合であっても、試料Ｓを連続的に測定することができる。ラマン散乱光測定装置Ｄ３は、例えば、液体によって通流可能な粒子状の試料Ｓに対して好適であり、このような試料Ｓとしては、例えば細胞懸濁液が挙げられる。第３実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ３の他の効果は、上述した第１実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ１と同様である。
５．第３実施形態の変形実施形態
　図８に、第３実施形態の変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ３１に備えられるラマン散乱光測定用チップ３ｄを示す。図８Ａは、ラマン散乱光測定用チップ３ｄの平面模式図であり、図８Ｂは、図８Ａに示すＰ４－Ｐ４線の矢視断面図である。なお、ラマン散乱光測定用チップ３ｄと、後述する分取部８以外の構成は、第３実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ３と同一であるため、その説明は省略する。また、ラマン散乱光測定用チップ３ｄの各構成のうち、第３実施形態と同一の構成については同一の符号を付し、その説明は省略する。
＜ラマン散乱光測定用チップ＞
　図８Ａに示すように、ラマン散乱光測定用チップ３ｄにおいて、流路３４は分岐部３５を有し、第１空間３２１及び第２空間３２２は、分岐部３５を介して第３空間（第３の空間）３２３と連絡している。第３空間３２３は、上述した第１空間３２１及び第２空間３２２と同様に、試料Ｓを収容するための空間である。なお、第３空間についても、第２空間３２２と同様に、排出口３２３１を設けることができる。
　第３空間３２３は、上述した第１空間３２１等と同様に、試料保持部３１２に成形することができる。また、成形方法についても上述した通りである。この他、ラマン散乱光測定用チップ３ｄにおいては、分岐部３５と測定部３１との間の流路３４に、後述する分取部８の構成の一部が挿入されていてもよい。
＜分取部＞
　分取部８は、ラマン散乱光測定用チップ３ｄにおいて、流路３４を通流した試料Ｓを、当該試料Ｓの測定結果に応じて、第２空間３２２又は第３区間３２３のいずれか一方に通流させるための構成である。分取部８の構成は、試料を測定結果に応じて、所望の空間へ集めることができればよく、公知の構成から自由に設計することができる。例えば、測定部３１と分岐部３５の間の流路３４に、試料Ｓに対して、測定結果に応じて電荷を付与するための荷電部を設け（図８において荷電部は不図示）、分取部８に電極対８１，８１を設けることで、電荷が付与された試料Ｓを、その電荷に応じて所望の空間へ通流させることができる。
　なお、図８Ａに示すラマン散乱光測定用チップ３ｄでは、分岐部３５が１カ所設けられた例を示しているが、複数の分岐部３５を設け、各々と連絡する空間を設けることにより試料Ｓを３つ以上に分けることも可能である。
　本変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ３１では、ラマン散乱光測定用チップ３ｄに第３空間３２３及び分岐部３５が設けられていることにより、測定部３１によって行われた測定の後、試料Ｓを２つに分けることができる。さらに、ラマン散乱光測定装置Ｄ３１に分取部８が設けられることにより、ラマン散乱光の測定結果に応じて、試料Ｓを２つに分けることができる。このため、測定結果に応じた試料Ｓの回収をより簡便に行うことができる。第３実施形態の変形実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ３１の他の効果は、上述した第３実施形態に係るラマン散乱光測定装置Ｄ３と同様である。
　なお、上記に記載された効果はあくまで例示であって、限定されるものではなく、また他の効果があってもよい。
　本開示は、以下のような構成もとることができる。
　（１）基材と、前記基材に対向して配置された試料保持部と、前記基材と前記試料保持部との間に設けられた試料収容部と、を有する測定部を備え、前記基材の前記試料収容部と接する面に、前記基材側から前記試料収容部内の試料へ照射される照明光を透過し、かつ前記試料保持部側から前記試料収容部内の前記試料へ照射された励起光によって前記試料から発せられるラマン散乱光を反射する光波長選択領域が形成され、前記試料保持部は少なくとも前記光波長選択領域と対向する部分が光透過性を有するラマン散乱光測定用チップ。
　（２）さらに前記光波長選択領域は前記励起光を反射する上記（１）に記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（３）前記試料保持部全体が光透過性を有する上記（１）又は（２）に記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（４）前記試料保持部は少なくとも前記試料との接触部分にゲル状物質を備える上記（１）～（３）のいずれかに記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（５）前記試料保持部は、合成石英からなる上記（３）に記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（６）第１の空間と、第２の空間と、前記第１の空間と前記第２の空間とを連絡する流路と、を有し、前記流路に前記測定部が形成されている
上記（１）～（５）のいずれかに記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（７）前記流路は分岐部を有し、前記第１の空間及び前記第２の空間は前記分岐部を介して第３の空間と連絡している上記（６）に記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（８）前記試料は細胞を含む上記（１）～（７）のいずれかに記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（９）前記試料保持部は少なくとも前記試料との接触部分に細胞外基質を備える上記（８）に記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（１０）前記試料保持部及び前記試料収容部は共に細胞外基質からなる上記（８）に記載のラマン散乱光測定用チップ。
　（１１）基材と、前記基材に対向して配置された試料保持部と、前記基材と前記試料保持部との間に設けられた試料収容部と、を有する測定部を備え、前記基材の前記試料収容部と接する面に、前記基材側から前記試料収容部内の試料へ照射される照明光を透過し、かつ前記試料保持部側から前記試料収容部内の前記試料へ照射された励起光によって前記試料から発せられるラマン散乱光を反射する光波長選択領域が形成され、前記試料保持部は少なくとも前記光波長選択領域と対向する部分が光透過性を有するラマン散乱光測定用チップと、前記光波長選択領域へ前記照明光を照射する第１の光源と、前記光波長選択領域と対向する部分に前記励起光を照射する第２の光源と、を有するラマン散乱光測定装置。
　（１２）前記照明光及び前記励起光の照射位置と前記ラマン散乱光測定用チップの水平方向における相対位置を変化させる駆動機構を備える上記（１１）に記載のラマン散乱光測定装置。
１．実験例１
　本実験例では、基材に光学膜を形成することにより、試料から発せられるラマン散乱光の測定の感度が向上するか検証した。
＜材料と方法＞
　本実験例では、試料としてポリスチレン製の球（直径６μｍ）を用いた（図９、Ｓ参照）。試料Ｓを、金をコートした基材、光学膜としてショートパスフィルタ（切替波長７５０ｎｍ）を形成した基材、及び合成石英ガラスの、各々の上に載せて（図９、３１１参照）、試料側から励起光（波長７８５ｎｍ、図９、Ｌ２１参照）を照射してラマン散乱光（図９、Ｌ２２参照）を測定した。また、ラマン散乱光については、分光して、ラマンスペクトルを得た。
＜結果＞
　本実験例の結果を図１０に示す。図１０の横軸は、ラマンシフト（ｃｍ－１）を示し、縦軸は、強度（ａ．ｕ．）を示す。金をコートした基材上に試料Ｓを載せてラマン散乱光を測定すると、最も感度良くラマン散乱光を検出できた。これは、金が、励起光とラマン散乱光の両方を反射するためである。また、金をコートした基材を用いた場合、１０００ｃｍ－１におけるピーク強度は５９３３．２１９であった。また、ショートパスフィルタが形成された基材に試料Ｓを載せてラマン散乱光を測定すると、１０００ｃｍ－１におけるピーク強度は、３９２４．６８１であった。これは、合成石英ガラスを用いた場合の１０００ｃｍ－１におけるピーク強度（４１２．３２７４）に比べて９．５倍程度高い値である。一方、合成石英は、励起光とラマン散乱光のいずれも反射しないため、測定されたラマン散乱光は他の基材に比べて微弱であった。
　本実験例の結果、光学膜が形成された基材に試料を載せてラマン散乱光を測定すると、試料から発せられるラマン散乱光が反射し、反射しない基材に比べて高感度にラマン散乱光を検出できることが明らかとなった。
２．実験例２
　本実験例では、ラマン散乱光測定用チップの試料保持部に好適な材料を検討した。
＜材料と方法＞
　合成石英ガラス、金をコートした基材、及びスライドガラス（水板ガラス）の各々に対して励起光（７８５ｎｍ）を照射して、ラマン散乱光を測定した。また、ラマン散乱光については、分光して、ラマンスペクトルを得た。
＜結果＞
　図１１に本実験例の結果を示す。図１１の横軸は、ラマンシフト（ｃｍ－１）を示し、縦軸は、強度（ａ．ｕ．）を示す。スライドガラスからは広範囲の波数に渡って強いラマン散乱が発せられることが示された。一方、金がコーティングされた基材では、ラマン散乱分光スペクトルが全波数に渡っておよそ平坦であった。また、合成石英ガラスも、金がコーティングされた基材と同様に、全波数に渡ってラマン散乱分光スペクトルが平坦であった。従って、石英ガラス等、光透過性を有する合成石英からなる部材は、試料保持部に好適であることが示された。
３．実験例３
　本実験例では、ラマン散乱光測定用チップの試料保持部に好適な材料を検討した。
＜材料と方法＞
　ポリスチレン製の培養ディッシュ及び板状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の各々に対して励起光（７８５ｎｍ）を照射して、ラマン散乱光を測定した。また、ラマン散乱光については、分光して、ラマンスペクトルを得た。
＜結果＞
　図１２に本実験例の結果を示す。図１２の横軸は、ラマンシフト（ｃｍ－１）を示し、縦軸は、強度（ａ．ｕ．）を示す。また、図１２において、破線はポリスチレン製の培養ディッシュ（ＰＳ）を示し、実線はＰＤＭＳを示す。図１２に示すように、ポリスチレンから得られたラマンスペクトルにおいては、複数の波数帯で強いピークが見られた。一方、ＰＤＭＳのラマンスペクトルは、ＰＳに比べてピークの数も少なく、各ピークの強度も弱かった。従って、ＰＤＭＳは試料保持部の材料として好適であることが示された。特に、ＰＤＭＳに由来するラマンスペクトルのピークが試料から得られるラマンスペクトルのピークから外れていれば、ＰＤＭＳを試料保持部として用いた場合、試料保持部に由来するラマン散乱光の影響を受けることなく、試料のラマン散乱光を測定することができる。
４．実験例４
　図１に示す装置を用いて、透過光による試料の撮像と、試料のラマン散乱光の測定を行った。
＜材料と方法＞
　本実験例では、図１に示すラマン散乱光測定装置を用いた。また、試料として、骨髄系共通前駆細胞（common myeloid progenitor、ＣＭＰ）と巨核球/赤芽球前駆細胞（megakaryocyte/erythroid progenitor、ＭＥＰ）とが混合されたものを用いた。これらの細胞は、予め固定した後、図３に示すラマン散乱光測定用チップ内に収容した。ラマン散乱光を測定するための励起光には、波長７８５ｎｍの光を用いた。
＜結果＞
　図１３及び図１４に本実験例の結果を示す。図１３は、光学倍率４０倍の位相差像の画像である。図１４は位相差観察した各細胞に対してラマン散乱分光測定を行った結果である。図１４の横軸は、ラマンシフト（ｃｍ－１）を示し、縦軸は、強度（ａ．ｕ．）を示す。また、Ａ～Ｋの各アルファベットは、図１３において、各細胞に付されたアルファベットに対応する。
　Ａ～Ｋの各細胞について測定されたラマン散乱光については、図１４の縦線（図１４、矢印参照）で示す波数において、細胞ごとの違いを捉えることができた。このように、照明光により得た画像に基づき、予めラマン散乱光の測定する位置を決めることで、より効率的にラマン散乱光を測定できる。
Ｓ：試料、Ｄ１，Ｄ１１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ３１：ラマン散乱光測定装置、１：第１の光源、２：第２の光源、３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄ：ラマン散乱光測定用チップ、３１：測定部、３１１：基材、３１１ａ：光波長選択領域、３１２，３１２１：試料保持部、３１２ａ：対向部分、３１３，３１３１：試料収容部、３１３ａ：スペーサー、３２１：第１空間（第１の空間）、３２１１：導入口、３２２：第２空間（第２の空間）、３２２１：排出口、３２３：第３空間（第３の空間）、３２３１：排出口、３４：流路、３５：分岐部、４１：対物レンズ、４２：結像レンズ、４３：光路切替機構、５１：撮像部、５２：ラマン散乱光検出部、６：駆動機構、７１，７２：送液部、８：分取部、８１：電極対

Claims (12)

  1. 　基材と、
    　前記基材に対向して配置された試料保持部と、
    　前記基材と前記試料保持部との間に設けられた試料収容部と、を有する測定部を備え、
    　前記基材の前記試料収容部と接する面に、前記基材側から前記試料収容部内の試料へ照射される照明光を透過し、かつ前記試料保持部側から前記試料収容部内の前記試料へ照射された励起光によって前記試料から発せられるラマン散乱光を反射する光波長選択領域が形成され、
    　前記試料保持部は少なくとも前記光波長選択領域と対向する部分が光透過性を有する
    ラマン散乱光測定用チップ。
  2. 　さらに前記光波長選択領域は前記励起光を反射する
    請求項１に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  3. 　前記試料保持部全体が光透過性を有する
    請求項１に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  4. 　前記試料保持部は少なくとも前記試料との接触部分にゲル状物質を備える
    請求項１に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  5. 　前記試料保持部は、合成石英からなる
    請求項３に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  6. 　第１の空間と、第２の空間と、前記第１の空間と前記第２の空間とを連絡する流路と、を有し、
    　前記流路に前記測定部が形成されている
    請求項１に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  7. 　前記流路は分岐部を有し、
    　前記第１の空間及び前記第２の空間は前記分岐部を介して第３の空間と連絡している
    請求項６に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  8. 　前記試料は細胞を含む
    請求項１に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  9. 　前記試料保持部は少なくとも前記試料との接触部分に細胞外基質を備える
    請求項８に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  10. 　前記試料保持部及び前記試料収容部は共に細胞外基質からなる
    請求項８に記載のラマン散乱光測定用チップ。
  11. 　基材と、
    　前記基材に対向して配置された試料保持部と、
    　前記基材と前記試料保持部との間に設けられた試料収容部と、を有する測定部を備え、
    　前記基材の前記試料収容部と接する面に、前記基材側から前記試料収容部内の試料へ照射される照明光を透過し、かつ前記試料保持部側から前記試料収容部内の前記試料へ照射された励起光によって前記試料から発せられるラマン散乱光を反射する光波長選択領域が形成され、
    　前記試料保持部は少なくとも前記光波長選択領域と対向する部分が光透過性を有するラマン散乱光測定用チップと、
    　前記光波長選択領域へ前記照明光を照射する第１の光源と、
    　前記光波長選択領域と対向する部分に前記励起光を照射する第２の光源と、を有する
    ラマン散乱光測定装置。
  12. 　前記照明光及び前記励起光の照射位置と前記ラマン散乱光測定用チップの水平方向における相対位置を変化させる駆動機構を備える
    請求項１１に記載のラマン散乱光測定装置。
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