JPH08512137A - プレパラートの多色照明用装置 - Google Patents
プレパラートの多色照明用装置Info
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Abstract
(57)【要約】
有利には、蛍光法による、測定の枠内での、プレパラートの多色照明用装置。プレパラートには、異なった所定波長の光が順次照射され、光源(5、6、10、15)から送出される光が機械的手段を用いることなく変調される。かくて、変調手段(13、24、25)は、測定装置の振動を起こさせると共に長い測定休止時間を生ずる機械的可動部材を含んではならない。そのため、電気光学的又は磁気光学的な変調手段(13、24、25)を用いる。
Description
【発明の詳細な説明】
[発明の名称] プレパラートの多色照明用装置
[技術分野]
本発明は、有利には蛍光法による、測定の枠内での、プレパラートの多色照明
用装置に関する。この装置は、少なくとも1つの光源と変調手段を有し、プレパ
ラートに所定の種々異なる波長の光が順次照射される。
[技術的背景]
細胞または組織内のほとんどすべての生化学的過程は局所的にまたは全体的に
イオン濃度を変化させるか、またはこのような変化によって生起される。これら
のイオンはここではH+、Ca++,Na+,Cl-および他のイオンが関連する。
一例としてここでは、特にカルシウムイオンCa++の役目について述べておく。
カルシウムイオンは少量が細胞膜を通って移動し、その際に信号機能を果たす。
すなわち、細胞は細胞内カルシウム濃度を次のように制御する。すなわち、細胞
内のカルシウム濃度が実質的に一定に留まるが、しかしイオン流は細胞膜を通っ
て出入りし、明らかに変動することができるように制御する。この規則に従う流
れのサイクルは複雑な事象連鎖に組み込まれており、細胞が比較的に長時間、外
部の信号に応答する過程である。この観点において(i.d.R.)、細胞はカルシウ
ムミラ
ー(Kalciumspiegel)における僅かな変化でも非常に鋭敏に反応する。したがっ
て、細胞内のカルシウム濃度の検出ないしカルシウム濃度の変化の検出によって
、生化学的過程の本質的な観察を行うことができる。もっとも測定自体はとくに
、正確に画定された空間領域に限定されなければならない。すなわち個々の細胞
、さらには細胞区画だけに限定されなければならない。測定のために、この観点
において組織が蛍光性の色素によって染色される。
多くの蛍光色素はPH依存性の他に、他のイオンに対して固有の依存性を示す
。所定の濃度領域では、吸光特性または発光特性が周囲の媒体(Hedium)に依存
する。ここでは蛍光出力(Ausbeute)が濃度に依存して変化するか、または吸光
または発光の固有感度が変化する。
使用される色素に依存して、基本的に3つの異なる測定法を適用することがで
きる。
1.例えばFLUO3のような所定の色素によって、濃度を簡単に蛍光出力によ
り測定することができる。しかし絶対イオン濃度に対する校正は通常複雑で不確
実である。
2.これに対し例えばFURAまたはQUINのような他の色素では、種々異な
る波長における、濃度に依存する吸光度をイオン濃度検出のために利用すること
ができる。これらの色素は、等吸収点ないし等濃度点(isosbestischen Punkt)
を有する色素の吸光度がイオン濃度にほぼ依存しない波長に相応する。この波長
が基準測定のために使用される。本来の測定は別の波長で実施される。これによ
り、“比測定”によって絶対校正測定が可能である。
3.他の色素も種々異なる波長において濃度に依存して発光し、かくて2つの異
なる波長での比測定によって、絶対イオン濃度を検出することができる。
第2の測定法に相応する比測定に対しても、第3の測定法に相応する比測定に
対しても、プレパラートを高速に、数ミリ秒の領域にある順序で異なる波長の光
により照射しなければならない。
ジャーナル オブ マイクロスコピイのノビリング等の下記刊行物“A micros
cope fluorimeter using multiple-wavelength excitation for ultrasensitive
single-cell emissien spectrometry”,R.Nobiling,C.Buehrle,Journal of
Hicroscopy,Vol.156,Pt2,November 1989,pp.149-161からすでに冒頭述べた
形式の装置が公知である。この装置は、水銀(高圧)ランプを光源として有する
。水銀(高圧)ランプのビーム路には、高速に回転するフィルタホイールが変調
手段として配置されている。プレパラートを照明する光の変調は、2つの励起波
長
間の高速の切り替えという形態で行われ、したがってここでは回転するフィルタ
ホイールにより純粋に機械的に行われる。
しかし公知の装置には実際上問題がある。なぜなら、高周波で回転するフィル
タホイールが測定装置全体の振動を惹起するからである。このことは一方では、
プレパラートないし測定装置の調整を狂わせ得る。他方では、このような振動に
より最大許容測定周波数が制限される。さらにそれぞれのフィルタ交換の際にデ
ッドタイムが生じ、その間は測定を行うことができない。
[発明の開示]
したがって本発明の課題は、有利には蛍光法による、測定の枠内でのプレパラ
ートの多色照明用装置を、光源から送出される光の変調が機械的補助手段なしで
行われるように構成し、改善することである。したがって変調手段として機械的
な可動部材を使用してはならない。
本発明の有利には蛍光測定の枠内でのプレパラートの多色照明用装置は、前記
の課題を請求の範囲第1項に記載された構成によって解決する。これによれば前
記の装置は、変調手段が機械的に固定され、電気光学的または磁気光学的に作用
するように構成される。
まず、測定中の測定装置の部材の運動は基本的に測定結果に付加的な悪影響を
及ぼし、したがってできる
だけ回避すべきであることがわかる。本発明ではさらに、光源の光も電気光学的
または磁気光学的に変調させれば、変調手段を機械的に装置に固定することがで
きるという認識に基づく。
本発明の有利な形態及びその展開形態は従属請求項に記載されている。
本発明の変調手段は基本的に、光源の強度および/または周波数を変調する。
どのような形式の変調を行うかは、実質的に本発明の装置により実施される測定
の形式(種類)に依存するが、しかし本発明の装置がいくつの光源を有するかに
も依存する。すなわちプレパラートを照明する光の波長の変調は、種々異なる周
波数ないし波長の光を送出する光源間の切り替えによっても行うことができる。
本発明の装置の有利な構成では、光源に変調手段が前置接続されており、光源
の制御部として実現される。ここでは変調手段を、例えばオン・オフスイッチ、
調光器ないし絞り調節器(Dimmer)および/または複数の光源の切換器の形態で
実現することができる。光源の制御部がこの純粋の切り替え機能を有するだけで
なく、切換過程の時間的シーケンスと同期(Koordination)を決定すればとくに
有利である。このことはコンピュータ制御される変調手段の形態で簡単に実現さ
れる。
変調手段を光源に前置接続する代わりに択一的に、変調手段を光源から送出さ
れる光のビーム路に配置することもできる。この場合は、変調手段には基本的に
2つの異なる構成がある。第1の場合では、変調手段は光源のほぼ直後でビーム
路に配置される。この構成では、光源に前置接続された変調手段とほぼ同じ機能
を果たす。
第2の場合では、変調手段はビーム路中に、ビームスプリッタの後方で配置さ
れる。このビームスプリツタは光源から送出された光を少なくとも空間的に分離
する、すなわち、2つの方向に分割する。ここで発生した2つの部分ビームの波
長は、例えばそれぞれのビーム路に配置されたフィルタまたは波長選択性のミラ
ーによって定めることができる。部分ビームのビーム路に配置された変調手段に
よって、個々の部分ビームを選択的に絞ることができる。そのための変調手段は
有利には光学的スイッチとして、例えば高速の液晶または他の光学的作動素子に
よって実現される。この変形実施例でも、変調手段が光源から送出される光のビ
ーム路に配置される場合は、変調手段をコンピュータ制御すると有利である。こ
れにより、切換過程を時間的に同期することができる。
例えば蛍光測定法に対しては光源としてアークランプ、とくに水銀(高圧)ラ
ンプが適する。なぜならこ
のランプは比較的小さく明るい光アークを形成するからである。この理由から光
源としてフラッシュランプ、例えばキセノンフラッシュランプも適する。しかし
有利には、種々異なる波長の光を送出するレーザーを光源として使用することも
できる。
本発明の装置のとくに有利な構成では、少なくとも2つの光源が設けられてお
り、光源のビーム路にはそれぞれ1つのフィルタが所定の波長領域の選択のため
に配置されている。光源の複数のビーム路は偏向手段を介して1つに統合され、
被検プレパラートに向けられる。偏向手段は例えば、1つまたは複数のビームス
プリッタの形で実現することができる。本発明の対象をこのように実現する際に
は、各光源にそれぞれ1つの制御可能なオン・オフスイッチが前置接続され、オ
ン・オフスイッチの制御が同期して行われる。したがってオン・オフスイッチは
制御かつ同期されて個々の光源の強度を変調し、このようにして所定の波長の光
を強弱に変更する(ein-und ausblenden)。
本発明の装置の別の有利な構成では、単に1つの光源しか設けられておらず、
この光源のビーム路に1つのビームスプリッタが配置される。このビームスプリ
ッタはこの光源の光を部分ビームに分割する。この部分ビームの各ビーム路には
、所定の波長領域を選択するための手段が配置されている。偏向手段を介して部
分ビームは再び1つにまとめられ、被検プレパラートに向けられる。ここでは変
調手段は制御可能な電気光学的シャッターの形で実現され、シャッターは各部分
ビームのビーム路に配置される。ここでもシャッターの制御は時間的に同期して
行われ、これにより部分ビームがそれぞれ交互にフェードアウト(減光)される
。
上記の装置の測定結果はさらに次のようにして改善することができる。すなわ
ち、光源から送出される光の予備フィルタリングを行うのである。そのためにビ
ーム路にはプリフィルタが配置される。ここではさらに付加的に、偏光器を光の
線形偏光のために配置することができる。
通常、ビームスプリッタは光源の光を空間的に分離された2つの部分ビームに
分割する。ビームスプリッタが二色性であると、すなわち光源の光を付加的にス
ペクトル分解するととくに有利である。この場合ビームスプリッタは、2つの部
分ビームの各々に対して所定の波長領域を選択するための手段として用いられる
。しかし各部分ビームでの所定の波長領域を選択するための手段として、波長選
択特性を有するフィルタまたはミラーも考えられる。
最後に、プレパラート多色照明用の本発明の装置の前記有利な実施例における
シャッターは有利にはビデオクロックで制御、すなわちオン・オフされることを
述べておく。ビデオカメラおよび適切な画像処理装置と関連して、それぞれ順次
連続する画像を種々異なる波長により記録し処理することができる。
本発明の基本構成を有利に発展構成するには種々の手段がある。そのためには
、請求の範囲第1項に続く請求項と、図面に基づく本発明の以下の2つの実施例
の説明を参照されたい。図面に基づく本発明の有利な実施例と関連して、一般的
に有利な構成および発展形態を説明する。
[図面の簡単な説明]
図1は、本発明の装置を有する顕微鏡および評価装置の概略的ブロック回路図
である。
図2は、本発明の装置の第2実施例である。
[実施例]
図1は、有利には蛍光法測定の枠内でのプレパラートの多色照明用装置を示す
。蛍光測定の際にはプレパラートが種々異なる所定の波長の光により照明される
。この装置は、顕微鏡および評価装置の構成部材を有し、この装置は顕微鏡1の
他に、これに接続された検出器2、コントローラ3およびコンピュータ4を有す
る。被検プレパラートは顕微鏡1の下に固定され、種々異なる所定の波長の光に
より順次交互照射される。
本発明の装置は2つの光源5と6、並びに変調手段13を有する。
本発明では、変調手段は機械的に固定され、電気光学的に作用する。2つの光
源5と6から送出された光のビーム路にはそれぞれフィルタ7と8が配置されて
いる。これらフィルタによりそれぞれ1つの所定の波長領域が選択される。ビー
ムスプリッタ9の形態の偏向手段を介して、光源5と6のビーム路は相互に1つ
にまとめられ、顕微鏡1下にあるプレパラートに向けられる。ビームスプリッタ
9は色選択性の特性を有することもできる、すなわち所定の波長領域を選択する
ために使用することもできることを述べておく。さらにここに説明した装置は、
光源10、フィルタ11およびビームスプリッタ12からなるユニットにより拡
張することもできる。これは図に破線部分によって示されている。
以下、変調手段13の機能を詳細に説明する。変調手段13はここに図示した
実施例では光源5、6そして場合により10の強度を変調するために用いる。変
調手段13は光源に前置接続されており、光源の制御部として実現されている。
変調手段13によって光源5、6、場合により10の照明強度は電子的に制御さ
れる。これにより、2つの波長の各強度が被検プレパラートに最適の値に調整さ
れる。これは一方では良好なS/N比を達成するためであり、他方ではプレパラ
ートの光負荷をできるだけ小さく保持するためである。
変調手段13に対するブロック内に示された矩形関数は、変調手段が光源の時間
的同期も行うこと、すなわち光源5と6を交互にオン・オフすることを示すもの
である。装置全体、すなわち変調手段13と測定電子回路とはここに示した実施
例ではコンピュータ制御される。
光源5、6、場合により10として、アークランプ、例えば水銀(高圧)ラン
プまたはキセノン(高圧)ランプが使用される。これらのランプはとくに高速の
切り替えが可能である。ここでは100%変調を達成することはできないが、こ
れはしかし良好な測定結果を得るために必要なことではない。
図2に示された、有利には蛍光法測定の枠内でのプレパラート多色照明用の装
置は光源15しか有しない。この蛍光法測定では、プレパラートが種々異なる所
定の波長の光により交互に照射される。光源15の光はフィルタ16により予備
フィルタリングされ、偏光器17により線形偏光される。二色性ビームスプリッ
タ18はこのように予備フィルタリングされ、線形偏光された光を空間的かつス
ペクトル的に2つの部分ビームに分割する。各部分ビームにはそれぞれ1つのフ
ィルタ19と20が所定の波長領域を選択するために配置されており、さらにミ
ラー21と22が配置されている。ミラー21と22はまず第1に2つの部分ビ
ー
ムを偏向するために用いる。しかしこれらのミラーはまた波長選択特性を有する
こともできる。ミラー21と22は2つの部分ビームをビームスプリッタ23に
案内し、ビームスプリッタは2つの部分ビームを1つにまとめて被検プレパラー
トに向ける。ビームスプリッタ23もビームスプリッタ18と同じように二色性
ビームスプリッタである。ミラー21とビームスプリッタ23との間、並びにミ
ラー22とビームスプリッタ23との間にそれぞれ1つの電気光学的シャッター
24と25が配置されている。これらのシャッターは任意の、すなわち選択され
た時点で電子的にオン・オフ作動することができる。
シャッター24と25は、図2に示された本発明の装置の実施例では変調手段
である。この変調手段は装置内に機械的に固定され、電気光学的または磁気光学
的に作用する。変調手段は光源15の部分ビームの強度を変調し、光源15から
送出された光のビーム路に、ビーム方向でビームスプリッタ18の後方に配置さ
れている。シャッター24と25は光学的シャッターであり、例えば高速の液晶
の形態で実現することができる。有利にはシャッターは電子的にまたはコンピュ
ータを介して制御される。
光源としてここに示された実施例でも、アークランプまたはフラッシュランプ
を使用することができる。
しかし、例えばアルゴンレーザーのように2つの異なる波長を有する光を送出す
るレーザーも有利である。
2つのシャッター24と25の開放と閉鎖をビデオクロックで行えば、ビデオ
カメラおよび適切な画像処理装置と関連して、種々異なる波長により記録したそ
れぞれ2つの順次交互する画像を、例えば比として表示することができる。これ
により、例えばFURA染色の場合はCa++イオン濃度を直接画像表示すること
ができる。
図面に示されていない本発明の装置の特徴に関しては、明細書の概説部分を参
照されたい。
最後に、本発明のプレパラートの多色照明用装置は有利には蛍光法測定に適用
されるが、他の測定法および装置と関連して有利に使用することもできることを
述べておく。
参照符号
1 顕微鏡
2 検出器
3 コントローラ
4 コンピュータ
5 光源
6 光源
7 フィルタ
8 フィルタ
9 ビームスプリッタ
10 光源
11 フィルタ
12 ビームスプリッタ
13 変調手段
14 −
15 光源
16 プリフィルタ
17 偏光器
18 ビームスプリッタ
19 フィルタ
20 フィルタ
21 ミラー
22 ミラー
23 ビームスプリッタ
24 シャッター
25 シャッター
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.有利には蛍光法による測定の枠内での、プレパラートの多色照明用装置であ って、 当該測定において、プレパラートが種々異なる所定の波長の光により交互して 照明され、 少なくとの1つの光源(5、6、10;15)と変調手段(13;24、25 )とを有する装置において、 前記変調手段(13;24、25)は機械的に固定されており、電気光学的ま たは磁気光学的に作用する ことを特徴とする多色照明用装置。 2.変調手段(13;24、25)は光源(5、6、10;15)の強度を変調 する ことを特徴とする請求の範囲第1項記載の装置。 3.変調手段は光源の周波数を変調する ことを特徴とする請求の範囲第1項記載の装置。 4.変調手段(13)は光源(5、6、10)に前置接続されている ことを特徴とする請求の範囲第1項から第3項までのいずれか1項記載の装置 。 5.変調手段(13)は光源(5、6、10)の制御部として実現されている ことを特徴とする請求の範囲第1項から第4項までのいずれか1項記載の装置 。 6.変調手段(13)は、オン・オフスイッチ、調光器および/または複数の光 源(5、6、10)間の切換器の形態で実現される ことを特徴とする請求の範囲第1項から第5項までのいずれか1項記載の装置 。 7.変調手段(24、25)は、光源(15)から送出された光のビーム路に配 置されている ことを特徴とする請求の範囲第1項から第3項までのいずれか1項記載の装置 。 8.光源から送出された光のビーム路にはビームスプリッタが配置されており、 変調手段は光源とビームスプリッタとの間に配置されている ことを特徴とする請求の範囲第7項記載の装置。 9.光源(15)から送出された光のビーム路にビームスプリッタ(18)が配 置されており、 変調手段(24、25)はビーム方向でビームスプリッタ(18)の後方に配 置されている ことを特徴とする請求の範囲第7項記載の装置。 10.変調手段(24、25)は光学的スイッチとして実現されている ことを特徴とする請求の範囲第7項から第9項までのいずれか1項記載の装置 。 11.変調手段(24、25)は高速の液晶の形態で 実現されている ことを特徴とする請求の範囲第7項から第10項までのいずれか1項記載の装 置。 12.変調手段(13;24、25)はコンピュータ制御される ことを特徴とする請求の範囲第1項から第11項までのいずれか1項記載の装 置。 13.光源(5、6、10;15)はアークランプとして構成されている ことを特徴とする請求の範囲第1項から第12項までのいずれか1項記載の装 置。 14.光源(5、6、10;15)は水銀(高圧)ランプとして構成されている ことを特徴とする請求の範囲第13項記載の装置。 15.光源(5、6、10;15)はフラッシュランプとして構成されている ことを特徴とする請求の範囲第1項から第12項までのいずれか1項記載の装 置。 16.光源(5、6、10;15)はキセノンフラッシュランプとして構成され ている ことを特徴とする請求の範囲第15項記載の装置。 17.光源(5、6、10;15)はレーザーとして構成されている ことを特徴とする請求の範囲第1項から第12項ま でのいずれか1項記載の装置。 18.少なくとも2つの光源(5、6、10)が設けられており、 前記光源(5、6、10)のビーム路にはそれぞれ1つのフィルタ(7、8) が所定の波長領域を選択するために配置されており、 光源(5、6、10)のビーム路を1つにまとめ、プレパラートに配向するた めの偏向手段(12)が設けられており、 各光源(5、6、10)の変調手段(13)としてそれぞれ1つの制御可能な オン・オフスイッチが設けられており、 前記オン・オフスイッチの制御部は同期される ことを特徴とする請求の範囲第1項から第17項までのいずれか1項記載の装 置。 19.1つの光源(15)が設けられており、 該光源(15)のビーム路には光源(15)の光を部分ビームに分割するビー ムスプリッタ(18)が配置されており、 各部分ビーム毎に所定の波長領域を選択するための手段が設けられており、 部分ビームを1つにまとめ、プレパラートに配向するための偏向手段(23) が設けられており、 変調手段(24、25)として、各部分ビームのビ ーム路にはそれぞれ1つの制御可能な電気光学的スイッチ(24、25)が配置 されており、 シャッター(24、25)の制御部は同期される ことを特徴とする請求の範囲第1項から第17項までのいずれか1項記載の装 置。 20.光源(15)から送出される光のビーム路では、光源(15)とビームス プリッタ(18)との間にプリフィルタ(16)が配置されている ことを特徴とする請求の範囲第19項記載の装置。 21.光源(15)から送出された光のビーム路では、光源(15)とビームス プリッタ(18)との間に偏光器(17)が光の線形偏光のために配置されてい る ことを特徴とする請求の範囲第19項または第20項記載の装置。 22.ビームスプリッタ(18)は、光源(15)の光を空間的に別個の2つの 部分ビームに分割する ことを特徴とする請求の範囲第19項から第21項までのいずれか1項記載の 装置。 23.ビームスプリッタ(18)は二色性であり、すなわち光源(15)の光を 付加的にスペクトル分解し、また各部分ビームに対して所定の波長領域を選択す るための手段として用いられる ことを特徴とする請求の範囲第19項から第22項までのいずれか1項記載の 装置。 24.所定の波長領域を選択するための手段として、各部分ビームに少なくとも 1つのフィルタ(19、20)が配置されている ことを特徴とする請求の範囲第19項から第23項までのいずれか1項記載の 装置。 25.所定の波長領域を選択するための手段として、各部分ビームに少なくとも 1つのミラー(21、22)が配置されており、 該ミラーは周波数選択特性を有する ことを特徴とする請求の範囲第19項から第24項までのいずれか1項記載の 装置。 26.シャッター(24、25)はビデオクロックで制御され、すなわちスイッ チオン・オフされ、 これによりビデオカメラおよび適切な画像処理装置と関連して、それぞれ交互 する画像を種々異なる波長で記録し、処理することができる ことを特徴とする請求の範囲第19項から第25項までのいずれか1項記載の 装置。 27.偏向手段(12;23)はビームスプリッタとして実現されている ことを特徴とする請求の範囲第18項から第26項までのいずれか1項記載の 装置。
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