JPH08512137A

JPH08512137A - プレパラートの多色照明用装置

Info

Publication number: JPH08512137A
Application number: JP7513531A
Authority: JP
Inventors: エンゲルハルト、ヨハン
Original assignee: ライカレーザーテヒニークゲーエムベーハー
Priority date: 1993-11-11
Filing date: 1994-11-09
Publication date: 1996-12-17
Also published as: WO1995013527A1; EP0678193A1; DE4338531A1

Abstract

(57)【要約】有利には、蛍光法による、測定の枠内での、プレパラートの多色照明用装置。プレパラートには、異なった所定波長の光が順次照射され、光源（５、６、１０、１５）から送出される光が機械的手段を用いることなく変調される。かくて、変調手段（１３、２４、２５）は、測定装置の振動を起こさせると共に長い測定休止時間を生ずる機械的可動部材を含んではならない。そのため、電気光学的又は磁気光学的な変調手段（１３、２４、２５）を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の名称］プレパラートの多色照明用装置［技術分野］本発明は、有利には蛍光法による、測定の枠内での、プレパラートの多色照明用装置に関する。この装置は、少なくとも１つの光源と変調手段を有し、プレパラートに所定の種々異なる波長の光が順次照射される。［技術的背景］細胞または組織内のほとんどすべての生化学的過程は局所的にまたは全体的にイオン濃度を変化させるか、またはこのような変化によって生起される。これらのイオンはここではＨ⁺、Ｃａ⁺⁺，Ｎａ⁺，Ｃｌ^-および他のイオンが関連する。一例としてここでは、特にカルシウムイオンＣａ⁺⁺の役目について述べておく。カルシウムイオンは少量が細胞膜を通って移動し、その際に信号機能を果たす。すなわち、細胞は細胞内カルシウム濃度を次のように制御する。すなわち、細胞内のカルシウム濃度が実質的に一定に留まるが、しかしイオン流は細胞膜を通って出入りし、明らかに変動することができるように制御する。この規則に従う流れのサイクルは複雑な事象連鎖に組み込まれており、細胞が比較的に長時間、外部の信号に応答する過程である。この観点において（i.d.R.）、細胞はカルシウムミラー（Kalciumspiegel）における僅かな変化でも非常に鋭敏に反応する。したがって、細胞内のカルシウム濃度の検出ないしカルシウム濃度の変化の検出によって、生化学的過程の本質的な観察を行うことができる。もっとも測定自体はとくに、正確に画定された空間領域に限定されなければならない。すなわち個々の細胞、さらには細胞区画だけに限定されなければならない。測定のために、この観点において組織が蛍光性の色素によって染色される。多くの蛍光色素はＰＨ依存性の他に、他のイオンに対して固有の依存性を示す。所定の濃度領域では、吸光特性または発光特性が周囲の媒体（Hedium）に依存する。ここでは蛍光出力（Ausbeute）が濃度に依存して変化するか、または吸光または発光の固有感度が変化する。使用される色素に依存して、基本的に３つの異なる測定法を適用することができる。１．例えばＦＬＵＯ３のような所定の色素によって、濃度を簡単に蛍光出力により測定することができる。しかし絶対イオン濃度に対する校正は通常複雑で不確実である。２．これに対し例えばＦＵＲＡまたはＱＵＩＮのような他の色素では、種々異なる波長における、濃度に依存する吸光度をイオン濃度検出のために利用することができる。これらの色素は、等吸収点ないし等濃度点（isosbestischen Punkt）を有する色素の吸光度がイオン濃度にほぼ依存しない波長に相応する。この波長が基準測定のために使用される。本来の測定は別の波長で実施される。これにより、“比測定”によって絶対校正測定が可能である。３．他の色素も種々異なる波長において濃度に依存して発光し、かくて２つの異なる波長での比測定によって、絶対イオン濃度を検出することができる。第２の測定法に相応する比測定に対しても、第３の測定法に相応する比測定に対しても、プレパラートを高速に、数ミリ秒の領域にある順序で異なる波長の光により照射しなければならない。ジャーナルオブマイクロスコピイのノビリング等の下記刊行物“A micros cope fluorimeter using multiple-wavelength excitation for ultrasensitive single-cell emissien spectrometry”，R.Nobiling，C.Buehrle，Journal of Hicroscopy，Vol.156，Pt2，November 1989，pp.149-161からすでに冒頭述べた形式の装置が公知である。この装置は、水銀（高圧）ランプを光源として有する。水銀（高圧）ランプのビーム路には、高速に回転するフィルタホイールが変調手段として配置されている。プレパラートを照明する光の変調は、２つの励起波長間の高速の切り替えという形態で行われ、したがってここでは回転するフィルタホイールにより純粋に機械的に行われる。しかし公知の装置には実際上問題がある。なぜなら、高周波で回転するフィルタホイールが測定装置全体の振動を惹起するからである。このことは一方では、プレパラートないし測定装置の調整を狂わせ得る。他方では、このような振動により最大許容測定周波数が制限される。さらにそれぞれのフィルタ交換の際にデッドタイムが生じ、その間は測定を行うことができない。［発明の開示］したがって本発明の課題は、有利には蛍光法による、測定の枠内でのプレパラートの多色照明用装置を、光源から送出される光の変調が機械的補助手段なしで行われるように構成し、改善することである。したがって変調手段として機械的な可動部材を使用してはならない。本発明の有利には蛍光測定の枠内でのプレパラートの多色照明用装置は、前記の課題を請求の範囲第１項に記載された構成によって解決する。これによれば前記の装置は、変調手段が機械的に固定され、電気光学的または磁気光学的に作用するように構成される。まず、測定中の測定装置の部材の運動は基本的に測定結果に付加的な悪影響を及ぼし、したがってできるだけ回避すべきであることがわかる。本発明ではさらに、光源の光も電気光学的または磁気光学的に変調させれば、変調手段を機械的に装置に固定することができるという認識に基づく。本発明の有利な形態及びその展開形態は従属請求項に記載されている。本発明の変調手段は基本的に、光源の強度および／または周波数を変調する。どのような形式の変調を行うかは、実質的に本発明の装置により実施される測定の形式（種類）に依存するが、しかし本発明の装置がいくつの光源を有するかにも依存する。すなわちプレパラートを照明する光の波長の変調は、種々異なる周波数ないし波長の光を送出する光源間の切り替えによっても行うことができる。本発明の装置の有利な構成では、光源に変調手段が前置接続されており、光源の制御部として実現される。ここでは変調手段を、例えばオン・オフスイッチ、調光器ないし絞り調節器（Dimmer）および／または複数の光源の切換器の形態で実現することができる。光源の制御部がこの純粋の切り替え機能を有するだけでなく、切換過程の時間的シーケンスと同期（Koordination）を決定すればとくに有利である。このことはコンピュータ制御される変調手段の形態で簡単に実現される。変調手段を光源に前置接続する代わりに択一的に、変調手段を光源から送出される光のビーム路に配置することもできる。この場合は、変調手段には基本的に２つの異なる構成がある。第１の場合では、変調手段は光源のほぼ直後でビーム路に配置される。この構成では、光源に前置接続された変調手段とほぼ同じ機能を果たす。第２の場合では、変調手段はビーム路中に、ビームスプリッタの後方で配置される。このビームスプリツタは光源から送出された光を少なくとも空間的に分離する、すなわち、２つの方向に分割する。ここで発生した２つの部分ビームの波長は、例えばそれぞれのビーム路に配置されたフィルタまたは波長選択性のミラーによって定めることができる。部分ビームのビーム路に配置された変調手段によって、個々の部分ビームを選択的に絞ることができる。そのための変調手段は有利には光学的スイッチとして、例えば高速の液晶または他の光学的作動素子によって実現される。この変形実施例でも、変調手段が光源から送出される光のビーム路に配置される場合は、変調手段をコンピュータ制御すると有利である。これにより、切換過程を時間的に同期することができる。例えば蛍光測定法に対しては光源としてアークランプ、とくに水銀（高圧）ランプが適する。なぜならこのランプは比較的小さく明るい光アークを形成するからである。この理由から光源としてフラッシュランプ、例えばキセノンフラッシュランプも適する。しかし有利には、種々異なる波長の光を送出するレーザーを光源として使用することもできる。本発明の装置のとくに有利な構成では、少なくとも２つの光源が設けられており、光源のビーム路にはそれぞれ１つのフィルタが所定の波長領域の選択のために配置されている。光源の複数のビーム路は偏向手段を介して１つに統合され、被検プレパラートに向けられる。偏向手段は例えば、１つまたは複数のビームスプリッタの形で実現することができる。本発明の対象をこのように実現する際には、各光源にそれぞれ１つの制御可能なオン・オフスイッチが前置接続され、オン・オフスイッチの制御が同期して行われる。したがってオン・オフスイッチは制御かつ同期されて個々の光源の強度を変調し、このようにして所定の波長の光を強弱に変更する（ein-und ausblenden）。本発明の装置の別の有利な構成では、単に１つの光源しか設けられておらず、この光源のビーム路に１つのビームスプリッタが配置される。このビームスプリッタはこの光源の光を部分ビームに分割する。この部分ビームの各ビーム路には、所定の波長領域を選択するための手段が配置されている。偏向手段を介して部分ビームは再び１つにまとめられ、被検プレパラートに向けられる。ここでは変調手段は制御可能な電気光学的シャッターの形で実現され、シャッターは各部分ビームのビーム路に配置される。ここでもシャッターの制御は時間的に同期して行われ、これにより部分ビームがそれぞれ交互にフェードアウト（減光）される。上記の装置の測定結果はさらに次のようにして改善することができる。すなわち、光源から送出される光の予備フィルタリングを行うのである。そのためにビーム路にはプリフィルタが配置される。ここではさらに付加的に、偏光器を光の線形偏光のために配置することができる。通常、ビームスプリッタは光源の光を空間的に分離された２つの部分ビームに分割する。ビームスプリッタが二色性であると、すなわち光源の光を付加的にスペクトル分解するととくに有利である。この場合ビームスプリッタは、２つの部分ビームの各々に対して所定の波長領域を選択するための手段として用いられる。しかし各部分ビームでの所定の波長領域を選択するための手段として、波長選択特性を有するフィルタまたはミラーも考えられる。最後に、プレパラート多色照明用の本発明の装置の前記有利な実施例におけるシャッターは有利にはビデオクロックで制御、すなわちオン・オフされることを述べておく。ビデオカメラおよび適切な画像処理装置と関連して、それぞれ順次連続する画像を種々異なる波長により記録し処理することができる。本発明の基本構成を有利に発展構成するには種々の手段がある。そのためには、請求の範囲第１項に続く請求項と、図面に基づく本発明の以下の２つの実施例の説明を参照されたい。図面に基づく本発明の有利な実施例と関連して、一般的に有利な構成および発展形態を説明する。［図面の簡単な説明］図１は、本発明の装置を有する顕微鏡および評価装置の概略的ブロック回路図である。図２は、本発明の装置の第２実施例である。［実施例］図１は、有利には蛍光法測定の枠内でのプレパラートの多色照明用装置を示す。蛍光測定の際にはプレパラートが種々異なる所定の波長の光により照明される。この装置は、顕微鏡および評価装置の構成部材を有し、この装置は顕微鏡１の他に、これに接続された検出器２、コントローラ３およびコンピュータ４を有する。被検プレパラートは顕微鏡１の下に固定され、種々異なる所定の波長の光により順次交互照射される。本発明の装置は２つの光源５と６、並びに変調手段１３を有する。本発明では、変調手段は機械的に固定され、電気光学的に作用する。２つの光源５と６から送出された光のビーム路にはそれぞれフィルタ７と８が配置されている。これらフィルタによりそれぞれ１つの所定の波長領域が選択される。ビームスプリッタ９の形態の偏向手段を介して、光源５と６のビーム路は相互に１つにまとめられ、顕微鏡１下にあるプレパラートに向けられる。ビームスプリッタ９は色選択性の特性を有することもできる、すなわち所定の波長領域を選択するために使用することもできることを述べておく。さらにここに説明した装置は、光源１０、フィルタ１１およびビームスプリッタ１２からなるユニットにより拡張することもできる。これは図に破線部分によって示されている。以下、変調手段１３の機能を詳細に説明する。変調手段１３はここに図示した実施例では光源５、６そして場合により１０の強度を変調するために用いる。変調手段１３は光源に前置接続されており、光源の制御部として実現されている。変調手段１３によって光源５、６、場合により１０の照明強度は電子的に制御される。これにより、２つの波長の各強度が被検プレパラートに最適の値に調整される。これは一方では良好なＳ／Ｎ比を達成するためであり、他方ではプレパラートの光負荷をできるだけ小さく保持するためである。変調手段１３に対するブロック内に示された矩形関数は、変調手段が光源の時間的同期も行うこと、すなわち光源５と６を交互にオン・オフすることを示すものである。装置全体、すなわち変調手段１３と測定電子回路とはここに示した実施例ではコンピュータ制御される。光源５、６、場合により１０として、アークランプ、例えば水銀（高圧）ランプまたはキセノン（高圧）ランプが使用される。これらのランプはとくに高速の切り替えが可能である。ここでは１００％変調を達成することはできないが、これはしかし良好な測定結果を得るために必要なことではない。図２に示された、有利には蛍光法測定の枠内でのプレパラート多色照明用の装置は光源１５しか有しない。この蛍光法測定では、プレパラートが種々異なる所定の波長の光により交互に照射される。光源１５の光はフィルタ１６により予備フィルタリングされ、偏光器１７により線形偏光される。二色性ビームスプリッタ１８はこのように予備フィルタリングされ、線形偏光された光を空間的かつスペクトル的に２つの部分ビームに分割する。各部分ビームにはそれぞれ１つのフィルタ１９と２０が所定の波長領域を選択するために配置されており、さらにミラー２１と２２が配置されている。ミラー２１と２２はまず第１に２つの部分ビームを偏向するために用いる。しかしこれらのミラーはまた波長選択特性を有することもできる。ミラー２１と２２は２つの部分ビームをビームスプリッタ２３に案内し、ビームスプリッタは２つの部分ビームを１つにまとめて被検プレパラートに向ける。ビームスプリッタ２３もビームスプリッタ１８と同じように二色性ビームスプリッタである。ミラー２１とビームスプリッタ２３との間、並びにミラー２２とビームスプリッタ２３との間にそれぞれ１つの電気光学的シャッター２４と２５が配置されている。これらのシャッターは任意の、すなわち選択された時点で電子的にオン・オフ作動することができる。シャッター２４と２５は、図２に示された本発明の装置の実施例では変調手段である。この変調手段は装置内に機械的に固定され、電気光学的または磁気光学的に作用する。変調手段は光源１５の部分ビームの強度を変調し、光源１５から送出された光のビーム路に、ビーム方向でビームスプリッタ１８の後方に配置されている。シャッター２４と２５は光学的シャッターであり、例えば高速の液晶の形態で実現することができる。有利にはシャッターは電子的にまたはコンピュータを介して制御される。光源としてここに示された実施例でも、アークランプまたはフラッシュランプを使用することができる。しかし、例えばアルゴンレーザーのように２つの異なる波長を有する光を送出するレーザーも有利である。２つのシャッター２４と２５の開放と閉鎖をビデオクロックで行えば、ビデオカメラおよび適切な画像処理装置と関連して、種々異なる波長により記録したそれぞれ２つの順次交互する画像を、例えば比として表示することができる。これにより、例えばＦＵＲＡ染色の場合はＣａ⁺⁺イオン濃度を直接画像表示することができる。図面に示されていない本発明の装置の特徴に関しては、明細書の概説部分を参照されたい。最後に、本発明のプレパラートの多色照明用装置は有利には蛍光法測定に適用されるが、他の測定法および装置と関連して有利に使用することもできることを述べておく。参照符号１顕微鏡２検出器３コントローラ４コンピュータ５光源６光源７フィルタ８フィルタ９ビームスプリッタ１０光源１１フィルタ１２ビームスプリッタ１３変調手段１４ − １５光源１６プリフィルタ１７偏光器１８ビームスプリッタ１９フィルタ２０フィルタ２１ミラー２２ミラー２３ビームスプリッタ２４シャッター２５シャッター

Claims

【特許請求の範囲】１．有利には蛍光法による測定の枠内での、プレパラートの多色照明用装置であって、当該測定において、プレパラートが種々異なる所定の波長の光により交互して照明され、少なくとの１つの光源（５、６、１０；１５）と変調手段（１３；２４、２５）とを有する装置において、前記変調手段（１３；２４、２５）は機械的に固定されており、電気光学的または磁気光学的に作用することを特徴とする多色照明用装置。２．変調手段（１３；２４、２５）は光源（５、６、１０；１５）の強度を変調することを特徴とする請求の範囲第１項記載の装置。３．変調手段は光源の周波数を変調することを特徴とする請求の範囲第１項記載の装置。４．変調手段（１３）は光源（５、６、１０）に前置接続されていることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の装置。５．変調手段（１３）は光源（５、６、１０）の制御部として実現されていることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項記載の装置。６．変調手段（１３）は、オン・オフスイッチ、調光器および／または複数の光源（５、６、１０）間の切換器の形態で実現されることを特徴とする請求の範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載の装置。７．変調手段（２４、２５）は、光源（１５）から送出された光のビーム路に配置されていることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の装置。８．光源から送出された光のビーム路にはビームスプリッタが配置されており、変調手段は光源とビームスプリッタとの間に配置されていることを特徴とする請求の範囲第７項記載の装置。９．光源（１５）から送出された光のビーム路にビームスプリッタ（１８）が配置されており、変調手段（２４、２５）はビーム方向でビームスプリッタ（１８）の後方に配置されていることを特徴とする請求の範囲第７項記載の装置。１０．変調手段（２４、２５）は光学的スイッチとして実現されていることを特徴とする請求の範囲第７項から第９項までのいずれか１項記載の装置。１１．変調手段（２４、２５）は高速の液晶の形態で実現されていることを特徴とする請求の範囲第７項から第１０項までのいずれか１項記載の装置。１２．変調手段（１３；２４、２５）はコンピュータ制御されることを特徴とする請求の範囲第１項から第１１項までのいずれか１項記載の装置。１３．光源（５、６、１０；１５）はアークランプとして構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項から第１２項までのいずれか１項記載の装置。１４．光源（５、６、１０；１５）は水銀（高圧）ランプとして構成されていることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の装置。１５．光源（５、６、１０；１５）はフラッシュランプとして構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項から第１２項までのいずれか１項記載の装置。１６．光源（５、６、１０；１５）はキセノンフラッシュランプとして構成されていることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の装置。１７．光源（５、６、１０；１５）はレーザーとして構成されていることを特徴とする請求の範囲第１項から第１２項までのいずれか１項記載の装置。１８．少なくとも２つの光源（５、６、１０）が設けられており、前記光源（５、６、１０）のビーム路にはそれぞれ１つのフィルタ（７、８）が所定の波長領域を選択するために配置されており、光源（５、６、１０）のビーム路を１つにまとめ、プレパラートに配向するための偏向手段（１２）が設けられており、各光源（５、６、１０）の変調手段（１３）としてそれぞれ１つの制御可能なオン・オフスイッチが設けられており、前記オン・オフスイッチの制御部は同期されることを特徴とする請求の範囲第１項から第１７項までのいずれか１項記載の装置。１９．１つの光源（１５）が設けられており、該光源（１５）のビーム路には光源（１５）の光を部分ビームに分割するビームスプリッタ（１８）が配置されており、各部分ビーム毎に所定の波長領域を選択するための手段が設けられており、部分ビームを１つにまとめ、プレパラートに配向するための偏向手段（２３）が設けられており、変調手段（２４、２５）として、各部分ビームのビーム路にはそれぞれ１つの制御可能な電気光学的スイッチ（２４、２５）が配置されており、シャッター（２４、２５）の制御部は同期されることを特徴とする請求の範囲第１項から第１７項までのいずれか１項記載の装置。２０．光源（１５）から送出される光のビーム路では、光源（１５）とビームスプリッタ（１８）との間にプリフィルタ（１６）が配置されていることを特徴とする請求の範囲第１９項記載の装置。２１．光源（１５）から送出された光のビーム路では、光源（１５）とビームスプリッタ（１８）との間に偏光器（１７）が光の線形偏光のために配置されていることを特徴とする請求の範囲第１９項または第２０項記載の装置。２２．ビームスプリッタ（１８）は、光源（１５）の光を空間的に別個の２つの部分ビームに分割することを特徴とする請求の範囲第１９項から第２１項までのいずれか１項記載の装置。２３．ビームスプリッタ（１８）は二色性であり、すなわち光源（１５）の光を付加的にスペクトル分解し、また各部分ビームに対して所定の波長領域を選択するための手段として用いられることを特徴とする請求の範囲第１９項から第２２項までのいずれか１項記載の装置。２４．所定の波長領域を選択するための手段として、各部分ビームに少なくとも１つのフィルタ（１９、２０）が配置されていることを特徴とする請求の範囲第１９項から第２３項までのいずれか１項記載の装置。２５．所定の波長領域を選択するための手段として、各部分ビームに少なくとも１つのミラー（２１、２２）が配置されており、該ミラーは周波数選択特性を有することを特徴とする請求の範囲第１９項から第２４項までのいずれか１項記載の装置。２６．シャッター（２４、２５）はビデオクロックで制御され、すなわちスイッチオン・オフされ、これによりビデオカメラおよび適切な画像処理装置と関連して、それぞれ交互する画像を種々異なる波長で記録し、処理することができることを特徴とする請求の範囲第１９項から第２５項までのいずれか１項記載の装置。２７．偏向手段（１２；２３）はビームスプリッタとして実現されていることを特徴とする請求の範囲第１８項から第２６項までのいずれか１項記載の装置。