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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von intensitätsproportionalen Photonenzahlen in Vorrichtungen zur zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung. Das Verfahren ist insbesondere zur Erzeugung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildern in der Laser-Scanning-Mikroskopie und Endoskopie, sowie zur Verbesserung der Rekonstruktion von Struktur und Eigenschaften dicker biologischer Proben durch diffus-optische Methoden geeignet.
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Stand der Technik
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Vorrichtungen zur zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC) werden zur Messung des Zeitverlaufs von optischen Signalen mit hoher Empfindlichkeit und mit Zeitauflösungen bis herab in den Pikosekunden-Bereich eingesetzt. Da optische Methoden nicht-invasiv sind und weil sie direkten Einblick in molekulare Vorgänge ermöglichen, liegen die Anwendungen besonders in der biologischen Forschung und im klinischen Bereich. Das klassische Prinzip des TCSPC-Verfahrens besteht in der Detektion einzelner Photonen eines periodischen optischen Signals, der Messung der Detektionszeiten der Photonen innerhalb der Signalperiode und dem Aufbau einer Photonen-Verteilung über der Detektionszeit. Nach der Detektion ausreichend vieler Photonen gibt die Verteilung den zeitlichen Signalverlauf wieder [1]. Ein erweitertes TCSPC-Verfahren erzeugt multi-dimensionale Photonenverteilungen. Die Photonendichte wird nicht nur über der Zeit in der Signalperiode, sondern außerdem über zusätzlichen Parametern aufgebaut [2]. Diese können räumliche Koordinaten, z.B. die Koordinaten einer gescannten Bildfläche, zeitliche Koordinaten, z.B. die Zeit nach einer periodischen Stimulation der Probe, die Wellenlänge der Photonen oder beliebige andere physikalische Größen sein, die entweder aktiv variiert werden oder sich durch Proben-interne Vorgänge verändern.
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Das TCSPC-Verfahren arbeitet mit hoher zeitlicher Auflösung und mit nahezu idealer Photonen-Effizienz, ist aber bei hohen Photonen-Raten nicht Artefakt-frei. Im Wesentlichen werden die Ergebnisse durch zwei Effekte beeinflusst: Erstens ist ein “Pile-Up“ möglich. Pile-Up ist die Detektion eines zweiten Photons in der gleichen Signalperiode mit dem vorhergehenden. Das zweite Photon wird dann nicht verarbeitet. Das Ergebnis ist eine Verzerrung der gemessenen Zeitfunktionen. Der Pile-Up-Effekt wird gewöhnlich überbewertet. In der Praxis kann bis zu einer Photonenrate von 10 bis 20% der Wiederholrate des optischen Signals gearbeitet werden [2]. Bei den hohen Wiederholfrequenzen moderner Laser-Lichtquellen ist das zumindest für biologische Anwendungen ausreichend. Ein zweiter Effekt wird als “Counting Loss“ bezeichnet. Counting Loss ist der Verlust von Photonen während der Signalverarbeitungszeit. Dadurch entsteht eine Nichtlinearität der registrierten Photonenzahl über der Intensität: Diese folgt der Intensität linear nur bei kleinen Zählraten. Kommt die Zählrate in den Bereich der reziproken Totzeit, flacht die Kurve ab und sättigt schließlich [2]. Da die Totzeit gewöhnlich länger ist als die Signalperiode, ist der entsprechende Fehler in der Intensität größer als der Pile-Up-Fehler in der Signalform. Die Nichtlinearität der Intensitätskennlinie wird gewöhnlich nicht beachtet. Der Grund ist, dass die meisten TCSPC Anwendungen nur auf der Signalform aufbauen. Die Intensitäten werden nicht verwendet, weil diese ohnehin mit Unsicherheiten, z.B. unbekannten Konzentrationen von Fluorophoren oder Absorbern im Messobjekt behaftet sind.
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Es gibt jedoch eine Reihe von TCSPC-Anwendungen, in denen die Intensität sehr wohl eine Rolle spielt. Es Beispiel ist Fluoreszenz-Lebenszeit-Imaging in Verbindung mit Laser-Scanning [2]. Das Verfahren scannt die Probe mit einem fokussierten Laserstrahl und baut eine Photonenverteilung über den Zeiten der Photonen nach den Anregungsimpulsen und den Scan-Koordinaten auf. Diese kann interpretiert werden als ein Array von Pixeln, wobei jedes Pixel eine Fluoreszenz-Abklingkurve in Form von Photonenzahlen in einer großen Anzahl von Zeitkanälen enthält. Die Daten werden dann in Bilder konvertiert, bei denen die Farbe die Fluoreszenz-Abklingzeit (oder einen anderen Parameter der Abklingkurve), die Helligkeit die Summe der Photonenzahlen in den Zeitkanälen der Pixeln wiedergibt. Die Photonenzahl gibt jedoch, wie beschrieben, die Intensität nur bei geringen Zählraten korrekt wieder. Bei hohen Zählraten flacht die Funktion der Photonenzahl über der Intensität ab uns sättigt schließlich. Das Ergebnis ist ein Verlust des Bild-Kontrasts.
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Die Nichtlinearität der Intensität und der damit verbundene Kontrast-Verlust können in vielen Fällen als ein rein ästhetischer Nachteil angesehen werden. Wenn die aufgenommenen Daten aber quantitativ ausgewertet werden sollen, ist ein Intensitätsfehler nicht tolerierbar. Beispiele sind das “Unmixing“ der Signale verschiedener Fluorophore mit unterschiedlichen Fluoreszenzspektren aus Daten mehrerer Wellenlängen-Kanäle, oder der Aufbau von mehrdimensionalen Histogrammen der Pixelzahl über Intensitäten oder Intensitätsverhältnissen verschiedener Wellenlängen-Kanäle mit dem Ziel der Identifizierung von verschiedenen fluoreszierenden Spezies.
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Eine andere Anwendung, die Intensitätswerte aus TCSPC-Messungen verwendet, ist die Untersuchung von dickem biologischem Gewebe mit diffus-optischen Methoden. Die innere Struktur und die Gewebeparameter werden hier aus den Intensitäten und den zeitlichen Signalformen diffus gestreuter Signale rekonstruiert, die an vielen Punkten der Probe und bei mehreren Wellenlängen gemessen werden. Häufig dienen diffus-optische Methoden der Messung von zeitlichen Änderung des Verhältnisses von Oxy- und Deoxy-Hämoglobin. Es ist offensichtlich, dass solche Messungen ungenau werden, wenn die Intensitätskennline nichtlinear ist, d.h. die Amplitude von Intensitätsfluktuationen von der absoluten Intensität abhängt.
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Es gibt eine Reihe von Wegen, die Intensitätskennline zu linearisieren.
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Der einfachste ist, die Nichtlinearität rechnerisch zu korrigieren. Das ist aber nur mit begrenzter Genauigkeit möglich: Die Totzeit von TCSPC-Vorrichtungen ist nicht genau konstant. Sie hängt unter anderem von der zeitlichen Lage der Photonen im Aufzeichnungs-Intervall und damit von der zeitlichen Signalform ab.
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Eine elegante Methode ist, die Signalverarbeitungszeit für jedes Photon zu bestimmen, und die gesamte Messzeit um die Summe der Totzeiten zu verlängern [2]. Der Nachteil ist, dass das Verfahren nur funktioniert, wenn die Messzeit nicht von außen vorgegeben wird. In den oben angeführten Fällen ist gerade das nicht der Fall: Bei FLIM sind die Pixel-Zeiten durch den Scanner vorgegeben, bei Gewebemessungen mit diffus-optischen Methoden wird eine exakt definierte Folge von Einzelmessungen gefordert.
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Die beste Lösung wäre zweifellos, die Totzeit der TCSPC-Elektronik zu verringern. Das stößt allerdings auf prinzipielle Schwierigkeiten. Die enorme Zeitauflösung und Genauigkeit von TCSPC-Messungen beruht gerade darauf, dass die Zeitmessungen an aufeinanderfolgenden Photonen unabhängig sind. Das ist nur der Fall wenn ausreichend Zeit zwischen den Detektionsereignissen liegt. Folgen Photonen zu dicht aufeinander, beeinflussen sich die gemessenen Zeiten. Probleme entstehen insbesondere durch Nachschwingen der Einzelphotonen-Impulse der Detektoren, elektrische Reflektionen auf Leitungen, unvollständiges Erholen der Zeitmessungs-Elektronik, oder unvollständiges Nachladen von Beschleunigungselektroden in den Detektoren.
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Es sind eine Reihe von Verfahren bekannt, mit denen geringe Lichtintensitäten über einen weiten Intensitätsbereich mit hoher Linearität gemessen werden können.
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Im einfachsten Falle wird das Ausgangssignal des Detektors einem Analog-Digital-Wandler (ADC) zugeführt, und in kurzen Intervallen digitalisiert. Da das Detektorsignal als Analogsignal verarbeitet wird, gibt es keine Totzeit und kein Counting Loss. Mit einem ADC-Verfahren ist jedoch keine Zeitauflösung im Pikosekunden-Bereich möglich.
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Eine andere Methode besteht darin, die absolute Größe, die Modulations-Amplitude und die Phasenverschiebung des Detektorsignals in Bezug auf das (periodische) Anregungssignal zu messen [4]. Das Detektor-Signal wird als Analog-Signal verarbeitet. Die Fluoreszenzlebensdauer wird aus der Phasenverschiebung und der Modulations-Amplitude ermittelt, die Intensität aus der absoluten Signalgröße. Dabei entsteht keine Totzeit, und die gemessenen Intensitäten sind linear zur wahren Intensität. Es entsteht jedoch ein Problem bei geringen Lichtintensitäten: Das Detektorsignal ist dann kein geschlossener Signalzug mehr, sondern eine zufällige Folge von Einzelphotonen-Impulsen, und Amplitude und Phase können nicht mehr ermittelt werden.
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Weiterhin gibt es die Möglichkeit, die Einzelphotonenimpulse eines optischen Detektors mit einem einfachen Zähler in festgelegten Zeitintervallen zu zählen, und diese Werte nacheinander abzuspeichern. Die Zeitauflösung eines solchen Verfahrens ist aber für den beschriebenen Zweck unzureichend.
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Ein auf Photonenzählung basiertes Verfahren, das nahezu ohne Totzeit realisiert werden kann, ist in [5] beschrieben. Die Detektor-Signale werden über mehrere zeitlich versetzte Gates mehreren Zählern zugeführt. Fluoreszenz-Abklingzeiten werden aus den Verhältnissen der Zähl-Ergebnisse berechnet. Das Verfahren hat den Nachteil, dass nur eine geringe Anzahl von Gates und Zählern möglich ist. Die Zeitauflösung ist deshalb weitaus geringer als beim TCSPC-Verfahren.
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Hinweise auf eine Nichtlinearität der Intensität finden sich in [6]. Hier geht es jedoch nicht um die Nichtlinearität der Intensitätsmessung durch Photonenzählung sondern eine nichtlineare Abhängigkeit der Lumineszenz-Intensität der Probe selbst von der Anregungsintensität. Die dadurch verursachten Änderungen in der Point-Spread-Funktion werden zur Verbesserung der räumlichen Auflösung ausgenutzt.
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Intensitätsfehler durch Schwankungen der Intensität des Anregungslichtes und ihre Korrektur durch ein Referenzsignal werden in [7] beschrieben. Das Verfahren und die verwendeten Vorrichtungen beruhen auf einer Analog-Digital-Wandlung der Detektorsignale. Eine hochempfindliche Intensitätsmessung durch Photonenzählung ist nicht beschrieben und somit auch nicht die Notwendigkeit der Korrektur von Totzeit-bedingten Intensitätsfehlern.
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In [8] wird ein Verfahren zur Regulierung Anregungsintensität und der Detektor-Verstärkung während des Scannens einer Probe in Anhängigkeit von der örtlich unterschiedlichen Helligkeit beschrieben. Mit einer solchen Regulierung könnte man im Prinzip die Emissionsintensität währen des Scan-Prozesses konstant halten und somit den Einfluss der Nichtlinearität der gemessenen Intensität bei der zeitkorrelierten Messung überhaupt eliminieren. Ein solches Verfahren ist aber praktisch kaum zu realisieren und wird in [8] auch nicht erwähnt. Erstens müsste die Regelung extrem schnell und über einen extrem weiten Intensitätsbereich erfolgen, zweitens ist das gesuchte Intensitätsproportionale Signal nach wie vor als Eingangsgröße für die Intensitätsregelung der Lichtquelle notwendig, und drittens würde die Regelung die Änderungen gerade in diesem Signal auf null ausregeln. Ein Signal das zur üblichen Intensität der Fluoreszenz äquivalent ist, müsste deshalb aus dem von der Regelung erzeugten Steuersignal der Lichtquelle abgeleitet werden. Dieses wäre aber nicht nur umgekehrt proportional zur gesuchten Größe sondern auch noch mit der Nichtlinearität der Steuerkennlinie der Lichtquelle behaftet.
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Beschreibung
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Ziel der Erfindung ist ein Verfahren und eine Vorrichtung, bei dem innerhalb einer TCSPC-Baugruppe unabhängig von der Elektronik zur Zeitmessung eine Intensitäts-Information bereitgestellt wird, die in geeigneter Weise den zeitlich aufgelösten Daten zugeordnet und mit diesen zusammen ausgegeben oder abgespeichert wird.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß folgendermaßen gelöst.
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Eine typische TCSPC-Vorrichtung einhält einen Diskriminator für die Einzelphotonenimpulse vom Detektor, einen Diskriminator für die Referenzimpulse von der Lichtquelle, einen oder mehrere Eingänge für Signale zur Übertragung von zusätzlichen Parametern der Photonen und für Signale zur Synchronisation der Messung mit Aktionen der externen Messanordnung, sowie eine Vorrichtung zur Messung der Zeitdifferenz zwischen Detektor- und Referenzimpulsen. Weiterhing ist vorhanden eine digitale Logik, die aus den gemessenen Zeiten und den Steuer- und Synchronisationssignalen entweder in einem internen Speicher eine Photonenverteilung aufbaut oder die Zeiten und die momentanen Parameter der Photonen sowie die Übergänge im logische Zustand der Synchronisationssignale unmittelbar an einen Rechner weiterleitet.
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Erfindungsgemäß wird innerhalb dieser TCSPC-Vorrichtung ein zur Zeitmessschaltung paralleler Zähler platziert. Dieser erhält als Eingangssignal die Impulse vom Diskriminator für die Detektor-Impulse. Zu Beginn jedes Messzyklus wird der Zähler zurückgesetzt, am Ende jedes Messzyklus wird der Zähler ausgelesen. Der ausgelesene Zählerstand gibt somit die über den Messzyklus akkumulierte Photonenzahl wieder. Die Totzeit des parallelen Zähl-Kanals kann sehr gering gehalten werden. Sie wird im Wesentlichen durch die Totzeit des Diskriminators und des Detektors bestimmt und liegt bei typischen TCSPC-Vorrichtungen im Bereich von wenigen Nanosekunden. Durch speziell optimierte Diskriminatoren und Detektoren kann sie auf etwa eine Nanosekunde reduziert werden. Die vom Zähler gelieferten Photonenzahlen sind deshalb weitgehend proportional zur realen Intensität.
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Eine ähnliche Wirkung könnte im Prinzip auch durch zur TCSPC-Baugruppe parallele externe Beistellung einer der im Stand der Technik beschriebenen Vorrichtungen erreicht werden, d.h. durch einen parallel angeordneten zyklisch umsetzenden ADC, einen zyklisch ausgelesenen Zähler, oder mehrere solche Zähler mit Time-Gates.
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Die erfindungsgemäße Lösung hat jedoch weitere Vorteile, die mit einer solchen Parallel-Anordnung nicht erreicht werden. Ein offensichtlicher Vorteil ist, dass der in der TCSPC-Vorrichtung integrierte Zähler als Eingangssignal genau die gleichen Einzelphotonenimpulse wie die Schaltung zur Messung der Photonenzeiten erhält. Es ist deshalb nicht möglich, dass die Zeitmessung Zeiten von Photonen weiterleitet, ohne dass diese Photonen im Resultat des parallelen Zählers enthalten sind. Der zweite und entscheidende Vorteil liegt darin, dass das Zeitintervall in dem der interne parallele Zähler die Photonen zählt, exakt mit dem Zeitintervall synchronisiert werden kann, in dem die Zeitmess-Schaltung Photonen umsetzt. Die Bedeutung wird insbesondere in Imaging-Anwendungen mit schnellen Scannern deutlich: Die Pixel-Zeiten bei Galvanometer-Scannern liegen in der Größenordnung von einer Mikrosekunde, bei Polygon- und Resonanz-Scannern bei 100 ns. Unter diesen Bedingungen würden bereits Laufzeit-Unterschiede in der Größenordnung von 10 ns zur Zuordnung von Photonen zu falschen Pixeln führen. Entsprechende Laufzeit-Unterschiede können bereits durch unterschiedliche Kabel-Längen oder durch Verzögerungen in Logik-Gattern entstehen.
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Entscheidende Probleme treten auch durch Pipeline-Strukturen auf, wie sie z.B. in schnellen ADCs enthalten sind. Die Messzeit-Intervalle sind dann nicht mehr synchron.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Computerprogramm, welches es einer Datenverarbeitungseinrichtung ermöglicht, nachdem es in Speichermittel der Datenverarbeitungseinrichtung geladen worden ist, im Zusammenwirken mit einem Zähler und einem Diskriminator ein Verfahren zur Ermittlung von Intensitätswertenbei einer zeitkorrelierten Messung optischer Signale durchzuführen, wobei die von dem Diskriminator aufbereiteten Einzelphotonenimpulse durch einen von der Elektronik zur Bestimmung der Photonenzeiten unabhängigen Zähler gezählt, die Start- und Stop-Zeitpunkte dieses Zählvorgangs mit den Start- und Stop-Zeitpunkten der zeitkorrelierten Messung synchronisiert, und die Zählergebnisse zusammen mit den aus der zeitkorrelierten Messung resultierenden zeitlichen Photonen-Verteilungen gespeichert oder direkt bereitgestellt werden.
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Vorteilhafte Ausführungsformen sehen zusätzlich Computerprogramme vor, durch welche weitere in der Beschreibung angegebene Verfahrensschritte oder Verfahrensabläufe ausgeführt werden können.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein computerlesbares Speichermedium, auf dem Programmcode gespeichert ist, das es einer Datenverarbeitungseinrichtung ermöglicht, nachdem der Programmcode in Speichermittel der Datenverarbeitungseinrichtung geladen worden ist, im Zusammenwirken mit einem Zähler und einem Diskriminator ein Verfahren zur Ermittlung von Intensitätswertenbei einer zeitkorrelierten Messung optischer Signale durchzuführen, wobei die von dem Diskriminator aufbereiteten Einzelphotonenimpulse durch einen von der Elektronik zur Bestimmung der Photonenzeiten unabhängigen Zähler gezählt, die Start- und Stop-Zeitpunkte dieses Zählvorgangs mit den Start- und Stop-Zeitpunkten der zeitkorrelierten Messung synchronisiert, und die Zählergebnisse zusammen mit den aus der zeitkorrelierten Messung resultierenden zeitlichen Photonen-Verteilungen gespeichert oder direkt bereitgestellt werden.
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Ausführungsbeispiel
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Das Verfahren bzw. die dazu notwendige Vorrichtung sollen nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel erläutert werden.
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1 zeigt eine klassische TCSPC-Vorrichtung mit einem Diskriminator, D1, zum Empfang der Einzelphotonenimpulse des Detektors, einem Diskriminator, D2, zum Empfang der Synchronisationsimpulse von einer gepulsten Lichtquelle, der Elektronik, T, zur Messung und Digitalisierung der Zeitdifferenz zwischen den beiden Impulsen, einem Speicher für die Photonenverteilung, M, und einer Systemsteuerung zur Organisation des Messablaufes, S. Für jedes Photon wird im Speicher, M, ein Speicherplatz adressiert, dessen Adresse, at, der ermittelten Photonen-Zeit proportional ist. Der dort vorhandene Speicherinhalt wird inkrementiert. Im Speicher entsteht folglich die zeitliche Verteilung der Photonen, p(t). Die erzeugte Photonenverteilung, p(t), und der Status der Messung können von einen externen Rechner ausgelesen werden. Zusätzlich zu diesen an sich bekannten Baugruppen ist ein Zähler vorhanden, der die Impulse des Diskriminators, D1, zählt. Dieser wird von der System-Steuerung am Beginn jedes Messzyklus über ein Reset-Signal, r, zurückgesetzt, und über ein Enable-Signal, e, gleichzeitig mit der Zeit-Messschaltung aktiviert oder de-aktiviert. Das Ergebnis der Zählung im Zähler, C, wird durch den externen Rechner ausgelesen. Das Resultat ist sowohl eine Photonenverteilung, p(t), die die Zeitfunktion des optischen Signals wiedergibt, als auch eine Intensitäts-proportionale Photonenzahl, N. Beide Resultate sind exakt über die gleiche Messzeit akkumuliert.
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Für mehrdimensionale Messungen wird die oben beschriebene Vorrichtung in der in 2 gezeigten Weise erweitert. Neben der von der Zeit-Messschaltung gelieferten Adresse, at, wird ein weiterer Teil, as, der Speicheradresse von der Steuerung bereitgestellt. Mit dem erweiterten Adressraum hat der Speicher Platz für eine größere Anzahl Photonenverteilungen. Der zusätzliche Adress-Teil, as, wird in der Systemsteuerung, S, erzeugt. Im einfachsten Falle wird as zeitgesteuert durchgezählt. Das Resultat ist dann eine zeitliche Folge von Messungen, wobei as die Zeit von Start der Messung an beschreibt.
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Der Adressteil as kann aber auch durch Zählen von Impulsflanken (Statusübergängen) eines der externen Steuersignalen, ex1...exn, erzeugt werden. Der Adressteil as beschreibt in diesem Falle einen externen Parameter, der in einem externen Messaufbau systematisch verändert wird, wobei jeder Schritt dieser Änderung durch eine Impulsflanke an dem betreffenden Steuereingang angezeigt wird.
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Der Anteil as kann auch durch Zählen der Übergänge von mehreren externen Eingängen oder durch die Kombination dieses Vorganges mit einen zeitlichen Fortschreiten eines Teils von as erzeugt werden. In diesem Falle beschreibt der Adressteil as ein mehrdimensionales Array von externen Parameterwerten bzw. Parameterwerten und einer Zeit. Das beschriebene Durchschalten des Adress-Bereiches as kann einmalig oder periodisch erfolgen.
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Wie im Einzelnen der zusätzliche Adressteil erzeugt und variiert wird, ist für die folgenden Betrachtungen unerheblich. Wichtig ist nur, dass im Speicher eine große Anzahl von Photonenverteilungen p(t) erzeugt wird. Das ist identisch mit der Erzeugung einer mehrdimensionalen Photonenverteilung, p(t, ext) über der zwischen Photon und Synchronisationsimpuls und den externen Parametern. Parallel mit dem Aufbau der Photonenverteilung p(t, ext) werden in einem zweiten Speicher, M2, die Ergebnisse des parallelen Zählers, C, abgelegt. M2 wird über die Adresse as adressiert. Da der Adressteil as für M1 und M2 gemeinsam ist, kann M1 mit M2 in einem gemeinsamen Speicherchip realisiert sein, was jedoch für die folgenden Betrachtungen ohne Bedeutung ist.
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Die Steuerung gewährleistet weiterhin über die Signale e und r, dass bei jeder Änderung der Adresse as der Zähler C ausgelesen, die Photonenzahl N in den Speicher M2 übertragen, dort zu dem vorhandenen Wert addiert, sowie der Zähler C gelöscht wird. Folglich entsteht im Speicher M2 ein Array von Photonenzahlen, N(ext), die den verschiedenen, in as codierten Kombinationen von externen Parametern zugeordnet sind. Diese sind über den Zähler C erzeugt und damit frei von Totzeit-Effekten in der Zeitmessschaltung.
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Eine weitere Modifikation des beschriebenen Verfahrens ist in 3 dargestellt. Die Photonenverteilung p(t, ext) und die Intensitätsverteilung, N(ext), werden hier nicht in der TCSPC-Baugruppe, sondern in einem nachfolgenden Computer aufgebaut. Dazu werden die Zeiten, t, sowie gegebenenfalls weitere Parameter der Photonen, wie z.B. die Wellenlänge oder die absolute Zeit von Start der Messung an, einzeln in den Computer übertragen. Außerdem werden die Übergänge der externen Signale, ex1...exn, zusammen mit den absoluten Zeiten ihres Eintreffens in den Computer übertragen. Jedes Photon und jeder Übergang der externen Signale bildet ein Datenwort in diesem Datenstrom. Die einzelnen Datenworte werden zweckmäßigerweise in eine First-in-first-out-Speicheranordnung eingetragen, von wo sie nach Bedarf ausgelesen werden können.
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Die Ergebnisse der Zählung im Zähler C können bei dieser Betriebsweise in besonders vorteilhafter Weise in den Datenstrom eingeordnet werden. Die Datenworte der Photonen als auch die der externen Signalübergänge haben gewöhnlich die gleiche Länge. Da die Einträge für die externen Übergänge keine Zeiten t enthalten, gibt es dort ungenutzte Bits. In diese Bit-Positionen werden die Resultate des Zählens im Zähler C eingeordnet. Es entsteht somit kein zusätzlicher Datenverkehr zwischen der TCSPC-Vorrichtung und dem Computer.
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Eine wesentliche Anwendung des letzteren Verfahrens ist die Aufzeichnung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildern. In diesem Falle stellen die Übergänge der Signale ex1...ex3 die Pixel-, Line-, und Frame-Übergänge des Scanners dar. Es werden somit eine Verteilung p(t, x, y) und ein Array von Photonenzahlen, N(x, y) erzeugt. Die Lebensdauer Bilder werden aufgebaut, indem der gesuchte Parameter der Fluoreszenz-Abklingfunktion aus den Funktionen p(t) in den einzelnen Pixeln (x, y) hergeleitet wird, die Intensität dagegen aus der Photonenzahl N(x, y).
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Literatur
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- 1. D.V. O’Connor, D. Phillips, Time-correlated single photon counting, Academic Press, London (1984)
- 2. Advanced time-correlated single-photon counting techniques. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 2005
- 3. Apparatus and method for time-resolved spectroscopy. US 5565982
- 4. Gratton, E., Barbieri, B.B., Multifrequency phase fluorometry using pulsed sources: theory and applications, Spectroscopy 1, 28–36 (1986)
- 5. E.P. Buurman, R. Sanders, A. Draaijer, H.C. Gerritsen, J.J.F van Veen, P.M. Houpt, Y.K. Levine, Fluorescence lifetime imaging using a confocal laser scanning microscope. Scanning, 14, 155–159 (1992)
- 6. Hochauflösende optische Mikroskopie. DE 10 2005 020 202
- 7. Verfahren und Vorrichtung zur Kompensation von Intensitätsschwankungen einer Beleuchtungseinrichtung in einem konfokalen Mikroskop. DE 00010064776 A1
- 8. Verfahren zur lichtoptischen Abtastung eines Objekts und Rastermikroskop zur Anwendung des Verfahrens. DE 00019957418 A1