JP2019518952A

JP2019518952A - 高められた光強度を許容する時間相関単一光子計数による蛍光寿命顕微鏡検査法

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Publication number: JP2019518952A
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Abstract

時間相関単一光子計数による蛍光寿命顕微鏡検査法について述べる。これによれば蛍光光子を放出させるために、パルス化光源（１２）を用いて周期的に励起光パルスにより試料（３６）を励起し、それぞれ相前後して続く２つの励起光パルスの間に１つの測定インターバルを規定し、検出器（４２）を用いて蛍光光子を捕捉し、捕捉された蛍光光子を表すアナログ検出器信号を生成し、この検出器信号に基づき、蛍光光子が個々の測定インターバル内で検出器（４２）により検出される検出時間を特定し、捕捉された蛍光光子の検出時間に基づき、蛍光減衰特性を表す少なくとも１つの特徴量を特定し、この特徴量に基づきイメージングを行う。アナログ検出器信号を、個々の測定インターバル内で複数のサンプリングインターバルにおいてサンプリングし、個々のサンプリングインターバルに割り当てられた離散的信号値のシーケンスに変換する。個々の測定インターバルに属する離散的信号値のシーケンスに基づき、測定インターバル内で予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたか否かを判定する。予め決められた上述の個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたならば、特徴量の特定にあたりこの測定インターバルを破棄する。

Description

本発明は、請求項１の上位概念記載の時間相関単一光子計数による蛍光寿命顕微鏡検査法および請求項１６の上位概念記載のかかる方法を実施するための顕微鏡に関する。

蛍光寿命顕微鏡検査法、略してＦＬＩＭ（"fluorescence lifetime imaging microscopy"）は、蛍光分子の励起状態のそれぞれ異なる寿命の測定に基づく、イメージング蛍光顕微鏡検査法である。測定された寿命に基づき例えば、ｐＨ値、温度、イオン濃度、ＦＲＥＴ移動（FRET = "Foerster Resonance Energy Transfer"フェルスター共鳴エネルギー移動）等のような蛍光分子周囲の特性を推定することができる。

蛍光寿命の特定を、時間領域で直接行ってもよいし（"time domain lifetime measurement"）、または択一的な方法において周波数領域（"frequency domain lifetime measurement"）で行ってもよい。時間領域における特定は、いわゆる時間相関単一光子計数、略してＴＣＳＰＣ（"time correlated single photon counting"）の方法に従って行うことができる。この方法によれば、励起光パルスによる周期的な励起により放出された光子が個々に捕捉される。したがってこの目的で、かかる単一光子捕捉を実現する検出器が必要とされる。この場合、使用される励起光パルスは通常、ピコ秒領域のパルス持続時間を有しており、これはナノ秒領域にある典型的な蛍光寿命よりも著しく短い。一般的には、励起光パルスと、その後に続く検出器により捕捉された蛍光信号との間の時間が測定される。次いで、このようにして捕捉された蛍光光子が、多数の測定にわたり１つのヒストグラムにまとめられる。かかるヒストグラムには、光子数が測定時間に対して記入されている。このようにすれば通常、捕捉された単一光子により表される蛍光強度が時間に依存して指数関数的に減衰することを観察することができ、このことから蛍光寿命が特定される。

ところで、単一光子計数に基づく上述の方法の問題点は、従来の検出器は個々の光子の捕捉直後、所定の期間にわたり、後続の光子を検出する準備が整った状態に戻らない、ということである。この期間を検出器のデッドタイムとも称する。従来の検出器の典型的なデッドタイムは、おおよそ５０〜１００ｎｓの範囲にある。よって、相前後して続く２つの励起光パルスの間に規定されている着目中の測定インターバル内では通常、検出された最初の蛍光光子だけに制限されている。

１つの励起光パルス後にそのつど到来する最初の蛍光光子の観察だけしか行われないことから、ヒストグラムにおいてかなり短い時間の割合でかなり大きい重みが生じる可能性がある。測定結果を誤らせるこのようなかなり大きい重みは、専門家の間ではパイルアップ効果とも呼ばれる。このようなパイルアップ効果を回避する目的で、入射する励起光パルスの強度を、典型的には、励起光パルスごとに１／１０の光子だけしか放出されないように調整される。このように調整すれば、励起光パルスごとに２つの蛍光光子が捕捉される確率は、ほぼ１％付近にある。よって、パイルアップ効果を無視することができる。しかしながら、励起光強度をこのように著しく低減させると、記録時間がそれ相応に長くなり、他方ではこれによってこの方法を幅広く適用するのが困難にもなる。

上述の問題点を解決するため、従来技術において一連のアプローチが存在する。一方では、以下の刊行物すなわち独国特許出願公開第１０２０１１０５５３３０号明細書（DE 10 2011 055 330 A1）、独国特許出願公開第１０２０１１０５５９４５号明細書（DE 10 2011 055 945 A1）および独国特許出願公開第１０２０１１０５２３３４号明細書（DE 10 2011 052 334 A1）おいて、評価電子装置の並列化が提案されており、これによれば検出器信号から得られたデジタルデータシーケンスがシリアル−パラレル変換器へ供給され、この変換器によってデータシーケンスのいっそう高速な情報処理が可能となる。ただし評価電子装置のこのような並列化は技術的に煩雑であり、したがってこれには著しいコストが付随する。

国際公開第２０１０／０８９３６３号（WO 2010/089363 A1）によれば、パイルアップ効果に対する数値による補正が提案される。ただし、このような数値による補正は、予期される結果のモデルを前提としており、したがって汎用的に使用することはできない。

独国特許出願公開第４３３９７８４号明細書（DE 43 39 784 A1）によれば、高い時間分解能を有する時間測定装置が開示されている。この装置は時間／振幅変換器によって動作し、この変換器の後段にはアナログ／デジタル変換器が接続されている。このように変換器が配置された構成ゆえに、この装置は比較的複雑である。同じことは、米国特許第７９９９２３８号明細書（US 7 999 238 B2）から公知の時間測定装置についてもあてはまり、これによれば時間／デジタル変換器が用いられ、この変換器の基本構成部分は、遅延線に沿って設けられた複数の比較器から成るカスケードである。

従来技術ついて、米国特許第７２１５４２１号明細書（US 7 215 421 B2）を最後に挙げておく。これによれば蛍光寿命測定のためのいわゆるタイムゲート方法が公知である。この方法は、比較的僅かな装置コストで実施することができるけれども、時間分解能と信号利得とに関して制限が課される。ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラによって動作する時間ゲート法も、同様の欠点を有する。

本発明の課題は、比較的僅かな技術コストでパイルアップ効果を回避しながら励起高強度を高めることができるようにした、蛍光寿命顕微鏡検査法およびかかる方法を実施するように構成された顕微鏡を提供することである。

本発明によればこの課題は、独立請求項の構成要件によって解決される。

本発明によれば、時間相関単一光子計数による蛍光寿命顕微鏡検査法が提案される。この場合、蛍光光子を放出させるために、パルス化光源を用いて周期的に励起光パルスにより試料が励起され、それぞれ相前後して続く２つの励起光パルスの間に１つの測定インターバルが規定され、検出器を用いて蛍光光子が捕捉され、捕捉された蛍光光子を表すアナログ検出器信号が生成され、検出器信号に基づき、蛍光光子が個々の測定インターバル内で検出器により検出される検出時間が特定され、捕捉された蛍光光子の検出時間に基づき、蛍光減衰特性を表す少なくとも１つの特徴量が特定され、この特徴量に基づきイメージングが行われる。本発明によれば、個々の測定インターバル内で複数のサンプリングインターバルにおいてアナログ検出器信号がサンプリングされ、個々のサンプリングインターバルに割り当てられた離散的信号値のシーケンスに変換される。個々の測定インターバルに属する離散的信号値のシーケンスに基づき、測定インターバル内で予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたか否かが判定される。予め決められた上述の個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたならば、蛍光減衰特性を表す特徴量の特定にあたりこの測定インターバルが破棄され、ただし予め決められた個数は１以上である。

本発明によれば、相前後して続く２つの励起光パルスの間に規定された個々の測定インターバルが複数のサンプリングインターバルに分割されるようにも構成されており、それらのサンプリングインターバル内において、検出器により供給されたアナログ検出器信号がデジタル化される。この場合、サンプリングインターバルは、予期される蛍光減衰時間よりも著しく短い。検出器信号のこのデジタル化によって、検出器信号に対しいわばパターン認識を実施することができ、つまり検出器信号内において、１つまたは複数の光子に対応づけられた信号区間を識別できるようになる。次いで、識別されたそれらの信号区間に基づき、それぞれ着目中の測定インターバル内で予め決められた個数よりも多い蛍光光子が検出器によって捕捉されたか否か、を判定することができる。このことが該当するならば、蛍光減衰特性を表す特徴量の特定にあたり、この測定インターバルが考慮されない。この場合、パイルアップ効果が確実に回避されるように、用いられる検出器のデッドタイムが考慮されて、予め決められた光子数が選定される。好ましくはこの個数は１と等しく、つまり２つ、３つまたはそれよりも多い光子が、着目中の測定インターバル内でパターン認識の最中に識別されるとただちに、特徴量の特定にあたりその測定インターバルが破棄される。

それぞれ２つの相前後して続く励起光パルスの間に規定されている測定インターバルは、これら両方のパルス間の時間的な間隔と必ずしも等しくない。したがって、上述の両方の励起光パルスのうち最初の励起光パルスの短時間後にはじめて、測定インターバルを開始させるようにすることも考えられる。

蛍光減衰特性を表す特徴量は例えば蛍光減衰時間であり、これを、ヒストグラムを介して取得される１つの指数関数的蛍光減衰曲線から導出することができる。ただし上述の特徴量は、かかる減衰時間に限定されるものではない。例えばこの特徴量を、複数の指数関数的蛍光減衰曲線の加算によって、つまりは複数の蛍光減衰時間を考慮しながら、取得してもよい。同様に、上述の量が蛍光減衰曲線そのものによって表現されるようにしてもよい。

例えば１つよりも多い蛍光光子が捕捉される測定インターバルを、本発明のように破棄することによって、望ましくないパイルアップ効果を回避すると同時に、励起光強度を高めることができる。冒頭で述べたように、パイルアップ効果の回避を目指した対比可能な慣用の方法は、典型的には、励起光パルスあたり１／１０の蛍光光子しか捕捉されないように選定された励起光強度で動作し、このことは１０％の収率に相応する。これに対し本発明による方法の場合、測定インターバルあたり結果として１つの光子が生じる最適な光強度で動作可能である。蛍光光子のポアソン分布を前提とするならば、ｎ個の光子という期待値においてｘ個の光子が存在する確率は、
Ｐ_ｎ（ｘ）＝ｎ^ｘ／ｘ！・ｅ^−ｎ
と等しい。

したがってｘ＝１のとき、励起光パルスあたりの最大光子数は、
ｎ＝１のときにＰ_ｎ（１）＝ｍａｘ、よってＰ_１（１）＝３７％
により得られる。この値を通常の収率である１０％と比較すると、係数３．７の上昇となる。

好ましくは、アナログ検出器信号はアナログ／デジタル変換器によってデジタル化される。このようにして、アナログ検出器信号を特に簡単に離散的信号値のシーケンスに変換することができ、このシーケンスをさらに本発明によるパターン認識に送ることができる。

別の選択肢として、離散的信号値がそれぞれ第１のバイナリ値または第２のバイナリ値と等しくなるように、アナログ検出器信号が比較器により閾値を適用してデジタル化される。本発明による方法のこの実施形態によれば、アナログ検出器信号のデジタル化により生成されたデータ流の信号値は、そのつど２つの値だけしかとる可能性がなく、例えば０または１だけにしかならず、これによってパターン認識が簡単になる。

好ましくは、個々の測定インターバルに割り当てられた離散的信号値のシーケンス内において、すべて第１のバイナリ値と等しい信号値から成る部分シーケンスが、光子インターバルとして規定され、この光子インターバル内に含まれるサンプリングインターバルの個数が予め定められたサンプリングインターバル数を超えたならば、測定インターバル内において１つよりも多い蛍光光子の存在が検出される。１つの光子インターバルをこのように規定することによって、着目中の測定インターバル内で１つよりも多い光子が捕捉されたか否かを、特に簡単に検出できるようになり、場合によってはそのような測定インターバルを、蛍光減衰特性を表す特徴量の特定にあたり破棄することができる。

好ましくは、１つの測定インターバル内において、第１のバイナリ値を最初に有するサンプリングインターバルが、光子インターバルの開始として規定されるのに対し、第２のバイナリ値を次に有するサンプリングインターバルが、光子インターバルの終了として規定され、この場合、上述の個数が光子インターバルの開始と終了とに基づき特定される。したがってこの実施形態によれば、本発明によるパターン認識が、第１のサンプリングインターバルを例えば値１をもって光子インターバルの開始と特定すること、および第１のサンプリングインターバルを例えば値０をもって光子インターバルの終了と特定すること、に縮小される。

１つの特に好ましい実施形態によれば、励起光パルスの強度が予め決められた画素について基準測定において式
ｌ_ｅｘ（ｘ，ｙ）＝Ｉ・Ｎ（ｘ，ｙ，０）／Ｎ（ｘ，ｙ，１）
に従い求められる。ただし、
Ｉは、基準測定における強度を表し、
Ｉ_ｅｘは、求められるべき強度を表し、
Ｎ（ｘ，ｙ，ｋ）は、ｋ＝１もしくはｋ＝０の蛍光光子が捕捉された測定インターバルの総数を表し、
（ｘ、ｙ）は画素のロケーションを表す。

予め決められた画素について励起光パルスの強度を好ましくは、それぞれ正確に１つの蛍光光子が捕捉される測定インターバルの総数が、蛍光光子が捕捉されない測定インターバルの総数と等しくなるように調整することができる。

好ましくは本発明による顕微鏡検査方法は、共焦点走査顕微鏡または多光子顕微鏡を用いて実施される。共焦点走査顕微鏡も多光子顕微鏡も、いずれにせよ本発明による方法の実施に必要とされる装置技術の基本的な部分をすでに備えており、特にパルス化光源を備えている。

特に好ましい１つの実施形態によれば、これまで述べてきた方法が測定インターバル全体に適用されるのではなく、測定インターバル内で規定された種々のインターバルセグメントに適用されるように構成されている。したがってこの発展形態を、測定インターバル全体のみに関連づけられる基本方法の拡張とみなすことができる。基本方法のこのような拡張によれば、個々の測定インターバル内で種々のインターバルセグメントが規定され、この場合には、測定インターバル内で予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたか否かの判定が、これらのインターバルセグメントごとに別個に実施される。着目中のインターバルセグメント内において、予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたならば、蛍光減衰特性を表す特徴量の特定にあたり、このインターバルセグメントが破棄される。この場合、インターバルセグメント各々が、複数のサンプリングインターバルを有する。

基本方法のこのような拡張の際に行われる種々のインターバルセグメントへの測定インターバルの分割によって、光子収率を著しく高めることができる。この場合、種々のインターバルセグメントの本発明による規定は、それらのインターバルセグメントのうちの１つを測定インターバル自体によっても定めることができる、というように理解されたい。

好ましくは、個々の測定インターバルのインターバルセグメントごとに、蛍光減衰特性を表す特徴量が特定され、個々のインターバルセグメントについて特定された特徴量から、測定インターバル全体に関連づけられた特徴量が求められる。例えば、蛍光減衰特性を表す特徴量が蛍光減衰曲線によって定められているならば、この実施形態の場合には、以下ではセグメントごとの減衰曲線とも称する、種々のインターバルセグメントに関連づけられた複数の蛍光減衰曲線が、測定インターバル全体に関連づけられた１つの全体減衰曲線としてまとめられる。

好ましくは、測定インターバル全体に関連づけられた特徴量が、予め決められた個数の蛍光光子が捕捉されたインターバルセグメント数と、光子が捕捉されなかったインターバルセグメント数とから特定される係数に基づき求められる。この係数によって特にもたらされるのは、個々のインターバルセグメントについて別個に特定された減衰曲線を、１つの連続的な全体減衰曲線としてまとめることができ、次いでこの全体減衰曲線を後続の評価に送ることができる、ということである。

好ましくは、測定インターバル全体に関連づけられた特徴量が、インターバルセグメント内で捕捉された蛍光光子の個数を考慮するモデル関数に基づき評価される。この場合、前述のモデル関数を、この方法の基礎を成す光子統計を考慮しながら適切に選定することができる。

さらに別の実施形態によれば、種々のインターバルセグメントは、測定インターバル内で時間的にオーバラップしてまたはオーバラップせずに相前後して続く少なくとも２つのセグメントを含んでいる。

１つの択一的な実施形態によれば、種々のインターバルセグメントは、測定インターバルにより定められた第１のセグメントと、測定インターバルの始点よりも遅らされた始点および測定インターバルの終点と一致する終点を有する少なくとも１つの第２のセグメントとを含んでいる。この実施形態によれば、これらのインターバルセグメントの時間的な段階付けを実現することができ、このような段階付けによって蛍光光子の収率を増加させることができる。

本発明のさらに別の態様によれば、時間相関単一光子計数による蛍光寿命顕微鏡検査法を実施するための、独立請求項１６記載の顕微鏡が設けられている。

これによれば、時間相関単一光子計数による蛍光寿命顕微鏡検査法を実施するための顕微鏡は、光源と検出器と処理ユニットとを含んでいる。光源は、蛍光光子を放出させるために励起光パルスによって試料を励起するように構成されている。それぞれ２つの相前後して続く励起光パルスの間に、１つの測定インターバルが規定されている。検出器は、蛍光光子を捕捉し、捕捉された蛍光光子を表すアナログ検出器信号を生成するように構成されている。処理ユニットは、この検出器信号に基づき、蛍光光子が個々の測定インターバル内で検出器により検出される検出時間を特定し、捕捉された蛍光光子の検出時間に基づき、蛍光減衰特性を表す少なくとも１つの特徴量を特定し、この特徴量に基づきイメージングを行うように構成されている。本発明によれば処理ユニットは、個々の測定インターバル内で複数のサンプリングインターバルにおいてアナログ検出器信号をサンプリングし、個々のサンプリングインターバルに割り当てられた離散的信号値のシーケンスに変換するように構成されている。さらに処理ユニットは、個々の測定インターバルに属する離散的信号値のシーケンスに基づき、測定インターバル内において予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたか否かを判定し、この予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたならば、蛍光減衰特性を表す特徴量の特定にあたり、その測定インターバルを破棄する。ただし、予め決められた個数は１以上である。

好ましくは、処理ユニットは、アナログ検出器信号をデジタル化するように構成されたアナログ／デジタル変換器を含んでいる。処理ユニットが、以下のような比較器を含むようにしてもよい。すなわちこの比較器は、離散的信号値がそれぞれ第１のバイナリ値または第２のバイナリ値と等しくなるよう、閾値を適用してアナログ検出器信号をデジタル化するように構成されている。

本発明による顕微鏡の１つの好ましい実施形態によれば、蛍光光子を捕捉すべく定められた検出器に加えて、さらに別の検出器が設けられており、この別の検出器は、励起光パルスを捕捉し、捕捉された励起光パルスを表すアナログ励起信号を生成するように構成されており、この場合、処理ユニットは、アナログ励起信号をサンプリングインターバルに応じてサンプリングし、個々のサンプリングインターバルに割り当てられた離散的励起信号値のシーケンスに変換するように構成されている。離散的励起信号値のこのシーケンスは、測定インターバルを決定するために、つまりは蛍光光子の求められた検出時間のための基準として用いられるデータストリームを成すものである。

好ましくは、処理ユニットは、調整情報を表示するための表示装置を含んでいる。この表示装置上に表示される調整情報によって、顕微鏡もしくは処理ユニットの動作をユーザが最適に調整できるようにする補助手段を、ユーザに提供することができる。例えば測定インターバルにおける蛍光光子の平均個数を、ユーザに知らせることができる。この場合、平均光子数を、画像記録領域全体に関連づけてもよいし、またはこの領域全体のうち部分領域のみに関連づけてもよい。調整情報を、数値および／またはグラフィック表示として、ユーザに表示することができる。１つの試料ロケーションのみでの画像記録の場合であれば、調整情報を例えば２つのバーシンボルの形態で表示することができる。これら２つのバーシンボルによって例えば、蛍光光子の存在しない測定インターバルの個数と、例えば単一の蛍光光子を含む測定インターバルの個数とが呈示される。このようにすればユーザは、表示装置上の両方のバーシンボルが等しい長さとなるように、励起光強度を調整することができる。

次に、図面を参照しながら本発明について詳しく説明する。

本発明による顕微鏡の１つの実施例を成す共焦点走査顕微鏡を示す図である。アナログ検出器信号の本発明によるサンプリングを具体的に説明するグラフである。着目中の測定インターバル内で正確に１つの蛍光光子が捕捉される一例に基づき、生成されたレーザ信号および検出器信号を示すグラフである。図３による例に関連するヒストグラムである。さらに別の例示的なレーザ信号および検出器信号を示すグラフである。測定インターバルのセグメンテーションに関する種々の例を示すグラフである。測定インターバルのセグメンテーションに関する種々の例を示すグラフである。測定インターバルのセグメンテーションに関する種々の例を示すグラフである。測定インターバルのセグメンテーションに関する種々の例を示すグラフである。セグメンテーションされた蛍光減衰曲線同士がどのようにして整合されるのかについて示すグラフである。セグメンテーションされた蛍光減衰曲線同士がどのようにして整合されるのかについて示すグラフである。セグメンテーションされた蛍光減衰曲線同士がどのようにして整合されるのかについて示すグラフである。セグメンテーションされた蛍光減衰曲線同士がどのようにして整合されるのかについて示すグラフである。

図１には、本発明による顕微鏡の１つの実施例を成す共焦点走査顕微鏡１０が示されている。

共焦点走査顕微鏡１０はパルス化レーザ光源１２を有しており、この光源は、周期的な励起光パルスによって光を送出するように構成されている。図１において参照符号１４の付された励起光はビームスプリッタ１６に当射し、このビームスプリッタ１６は、励起光１４を透過成分１８と反射成分２０とに分割する。

ビームスプリッタ１６を透過した励起光１８は、励起用開口絞り２２を通過し、次いでダイクロイックビームスプリッタ２４のところで、走査ユニット２６の方向に反射させられる。走査ユニット２６は、カルダン式に懸架された走査ミラー２８を含んでおり、このミラーは励起光１４を走査レンズ３０の方向に反射させる。励起光は、走査レンズ３０およびチューブレンズ３２の通過後、顕微鏡対物レンズ３４に到達し、このレンズによって励起光１８が試料３６へと導かれる。

励起光１８により照射された試料３６の領域において、蛍光分子が励起されて蛍光３８が放出される。蛍光３８を成す蛍光光子は、励起光１８がダイクロイックビームスプリッタ２４から出て試料３６に到達した光路を逆方向に辿って、ビームスプリッタ２４に戻るように伝播する。蛍光は、ビームスプリッタ２４および検出用開口絞り４０の通過後、第１の検出器４２に到達する。第１の検出器４２は、受光した蛍光３８をアナログ検出器信号４３に変換し、次いでこの信号は処理ユニット４４に供給される。処理ユニット４４は、アナログ検出器信号４３を予め決められたサンプリングクロックでサンプリングし、それによってアナログ検出器信号４３をデジタル検出器信号に変換するように構成されている。このデジタル検出器信号は、離散的信号値のシーケンスによって形成されており、それらの離散的信号値は、サンプリングクロックに対応する個々のサンプリングインターバルに対応づけられている。アナログ検出器信号４３をサンプリングする目的で、処理ユニット４４には比較器４６が含まれている。比較器４６の代わりに、アナログ／デジタル変換器を設けてもよい。

受光した蛍光３８をアナログ検出器信号に変換する第１の検出器４２に加えて、走査顕微鏡１０は第２の検出器４８を有しており、この第２の検出器４８は、ビームスプリッタ１６により分岐されたビーム路中に配置されている。よって、第２の検出器４８は、レーザ光源１２から送出された励起光１４のうち、ビームスプリッタ１６により反射させられた成分２０を受光する。第２の検出器４８は、ビームスプリッタ１６において反射させられた励起光２０をアナログ励起信号４９に変換し、この信号を処理ユニット４４へ供給する。処理ユニット４４は、自身に供給されたアナログ励起信号４９を、予め決められたサンプリングクロックによりサンプリングし、そのようにしてアナログ励起信号４９をデジタル信号に変換し、この信号は、個々のサンプリングインターバルに割り当てられた離散的励起信号値のシーケンスによって形成されている。この目的で処理ユニット４４はさらに、図１には明示されていない比較器またはアナログ／デジタル変換器も有している。第２の検出器４８から供給されたアナログ励起信号４９、およびこの励起信号から処理ユニット４４により生成されたデジタル信号のことを、以下ではアナログレーザ信号もしくはデジタルレーザ信号と称する。

処理ユニット４４はさらに、走査ユニット２６をそれ自体公知の態様で制御するように構成されている。しかも処理ユニット４４は、表示装置５６例えばモニタを有している。

本発明のコンテキストにおいて処理ユニット４４は特に、検出器４２から供給されたアナログ検出器信号４３から、検出器４２が試料３６においてトリガされた蛍光光子を受光する検出時間を特定する機能を備えている。この検出時間に基づき処理ユニット４４は、蛍光減衰特性を表す特徴量、例えば蛍光減衰時間を特定する。冒頭で説明したパイルアップ効果を回避するために、処理ユニット４４は本発明によれば、例えば相前後して続く２つの励起光パルスにより規定された１つの測定インターバル内において、予め決められた個数よりも多い蛍光光子が検出器４２により捕捉されたか否かを、デジタル検出器信号に基づき判定するように構成されている。このことが該当するならば、処理ユニット４４は、蛍光減衰特性を表す特徴量の特定にあたり、この測定インターバルを除外する。

次に、処理ユニット４４の上述の機能について、図２〜図５に描かれたグラフを参照しながら例示的に説明する。その際に以下で前提とするのは、着目中の測定インターバル内で１つよりも多い蛍光光子が捕捉されたことを処理ユニット４４が検出したならば、処理ユニット４４は蛍光減衰特性の特定にあたりこの測定インターバルを破棄する、ということである。

図２によるグラフには、相前後して続く２つの励起光パルスの間に規定された１つの測定インターバルが示されており、この測定インターバル内で検出器４２は１つの蛍光光子を捕捉し、対応するアナログ検出器信号４３を生成する。図２にさらに示されているように、処理ユニット４４により行われるアナログ検出器信号４３のサンプリングによって、この測定インターバルが複数のサンプリングインターバルに分割される。図２にはさらに、比較器４６により適用される閾値が示されており、この閾値に基づき各サンプリングインターバル内のアナログ検出器信号に、バイナリ値０またはバイナリ値１のいずれかが割り当てられる。着目中のサンプリングインターバル内のアナログ検出器信号が閾値以下であれば、このサンプリングインターバルにバイナリ値０が割り当てられる。これに対し、１つのサンプリングインターバル内のアナログ検出器信号が閾値よりも大きければ、このサンプリングインターバルにバイナリ値１が割り当てられる。この結果として図２による例によれば、測定インターバルの中央領域に複数のバイナリ値１から成る部分シーケンスが生じており、これによって１つの光子インターバルが規定される。図２に示されている例の場合には、着目中の測定インターバル内において正確に１つの蛍光光子が捕捉されるので、この測定インターバルは蛍光減衰特性の特定にあたり処理ユニット４４により考慮される。

図２にはさらに蛍光減衰曲線が示されており、これによって具体的に説明したいのは、信号処理ユニット４４により適用されるサンプリングクロックと一致するサンプリングインターバルの持続時間は、蛍光減衰時間よりも著しく短い、ということである。

図３によるグラフには、１つの測定インターバル内で第１の検出器４２により正確に１つの蛍光光子が捕捉されるケースについて、第２の検出器４８により生成されたアナログレーザ信号、このアナログレーザ信号から信号処理ユニット４４のサンプリングにより生成されたデジタルレーザ信号、第１の検出器４２により生成されたアナログ検出器信号、このアナログ検出器信号から信号処理ユニット４４により生成されたデジタル検出器信号、ならびに信号処理ユニット４４により信号サンプリングの目的で適用されたサンプリングクロックが描かれている。図３からさらにわかるように、信号処理ユニット４４は、デジタルレーザ信号およびデジタル検出器信号の立ち上がり縁に基づき、着目中の測定インターバル内で蛍光光子が検出器４２により捕捉される時間を特定する。この検出時間は図中、参照符号Δｔによって表されている。

図４には、多数の個別測定の結果を表す例示的なヒストグラムが示されている。この場合、図４においてシンボル”＋１”は、図３に描かれた測定インターバルに関連づけられている。つまり、測定された検出時間がそれぞれｔとなる、検出された光子の個別測定の頻度が示されている。

図５には、アナログレーザ信号もしくはデジタルレーザ信号ならびにアナログ検出器信号もしくはデジタル検出器信号のいくつかの例示的な推移が描かれている。上述の実施例によれば、検出器信号に基づき１つの着目中の測定インターバル内で正確に１つの光子が捕捉されるケースだけが、蛍光減衰特性の特定に寄与し、つまりは図４に示した形式のヒストグラムを補って完成させるために寄与する。特に、２つまたはそれよりも多い光子が捕捉される測定インターバルは、蛍光減衰特性を表す特徴量の特定にあたり破棄される。

これまで図１〜図５を参照しながら、本発明による方法の１つの実施例について説明してきた。この実施例によれば、目下着目中の測定インターバル内で１つよりも多い蛍光光子が捕捉されたことを処理ユニット４４が検出したならば、蛍光減衰特性の特定にあたりこの測定インターバルが破棄される。この実施例によれば、１つよりも多い蛍光光子を含む測定インターバルの破棄により、検出器４２に当射した蛍光光子全体のうち約６３％の割合が、蛍光減衰特性を特定する際に未使用のままとなる。よって以下では、前述の基本方法の拡張について説明する。これによれば、基本方法では未使用であった蛍光光子の部分も評価に利用できるようになる。

本発明によるこの拡張によれば、個々の測定インターバル内で規定される異なる複数のインターバルセグメントに、基本方法が適用される。図６によるグラフには、測定インターバルのかかるセグメンテーションの一例が具体的に表されている。

図６によれば、測定インターバルが開始時点ｔ_Ａと終了時点ｔ_Ｅとの間に規定されている。図６によるセグメンテーションの場合には、この測定インターバルが第１のインターバルセグメントＡと第２のインターバルセグメントＢとに分割されている。インターバルセグメントＡは、開始時点ｔ_Ａから時点ｔ_１に至るまでである。インターバルセグメントＢは、時点ｔ_１から終了時点ｔ_Ｅに至るまでである。具体的に説明するため図６にはさらに、（図２および図４に相応する）多数の個別測定の結果を表すヒストグラムの形態で生じた蛍光減衰曲線６０も示されている。

さて、本発明による拡張によれば、前述の基本方法をこれら両方のインターバルセグメントＡおよびＢに別個に適用するように構成されている。つまりこのことは、これら両方のインターバルセグメントＡおよびＢについてそれぞれ、蛍光減衰特性を表す特徴量が、本実施例では別個の蛍光減衰曲線が、特定されるということを意味する。この場合、捕捉された蛍光光子の個数が、本実施例ではやはり１とする予め決められた個数を超えていないインターバルセグメントＡもしくはＢだけが、評価にあたり考慮される。捕捉された蛍光光子の個数が、個々のインターバルセグメントＡもしくはＢにおいて１よりも大きいならば、そのようなインターバルセグメントは、蛍光減衰曲線の特定にあたり破棄される。

図６に示した相前後して続く両方のインターバルセグメントＡおよびＢへの測定インターバルのセグメンテーションは、単に一例として理解されたい。したがって測定インターバルを、図７〜図９に具体的に示したように、他の態様でセグメンテーションしてもよい。

図７に示したセグメンテーションによれば、両方のインターバルセグメントＡおよびＢが時点ｔ_１とｔ_２との間で時間的にオーバラップしている。したがってインターバルセグメントＡは、インターバルセグメントＢが開始する時点ｔ_１よりも時間的に後に位置する時点ｔ_２になってようやく終了する。

図８に示したセグメンテーションによれば、測定インターバルが２つよりも多いインターバルセグメントに、例えば６個のインターバルセグメントＡ〜Ｆに分割されている。図６のように、図８によるセグメンテーションの場合には、個々のインターバルセグメントＡ〜Ｆは時間的にオーバラップすることなく相前後して続いている。

図９には、３つのインターバルセグメントＡ，ＢおよびＣが規定されている様子が示されており、これらのインターバルセグメントのうち、インターバルセグメントＡは測定インターバルと一致しているのに対し、他の２つのインターバルセグメントＢおよびＣは、インターバルセグメントＡの開始時点ｔ_Ａよりもそれぞれ段階的に遅らされた開始時点ｔ_１およびｔ_２を有している。終了時点ｔ_Ｅは、すべてのインターバルセグメントＡ，ＢおよびＣに関して同じである。

図６〜図９に例示したセグメンテーションを、適切な態様で互いに組み合わせてもよい。したがって例えば、図８では時間的にオーバラップなく相前後して続くインターバルセグメントＡ〜Ｆを、２つのインターバルセグメントＡおよびＢに関して図７に具体的に示されているように、互いに時間的にオーバラップさせてもよい。

以下では図１０〜図１３を参照しながら、個々のインターバルセグメントについて別個に特定された蛍光減衰曲線が、測定インターバル全体に関連づけられた１つの全体曲線にどのようにしてまとめられるのか、について説明する。なお、図１０〜図１３の場合、単に例示的にすぎないが、２つのインターバルセグメントＡおよびＢを有するセグメンテーションを基礎としており、ここでインターバルセグメントＡは測定インターバルと等しいのに対し、インターバルセグメントＢは、測定インターバルよりも短くされたインターバルを表しており、このインターバルセグメントの開始時点は、測定インターバルの開始時点よりも遅らされている。図１０〜図１３によれば、インターバルセグメントＢの開始時点はτ_Ｔで表されており、両方のインターバルセグメントＡおよびＢに共通する最終時点はτ_ｍａｘで表されている。

図１０〜図１３に示された例によれば、基本方法の本発明による拡張に従い、多数のインターバルセグメントＢの評価により別個の蛍光減衰曲線が求められる。この場合、本実施例では１である予め決められた個数よりも多い光子が捕捉されないインターバルセグメントＢだけが、このようなセグメントごとの蛍光減衰曲線の特定にあたり考慮される。このようにすれば、基本方法がそれぞれ測定インターバル全体にしか適用されないケースよりも、インターバルセグメントＢにおいて捕捉される蛍光光子の総数を高めることができる。

図１１に示されているように、インターバルセグメントＢに関連づけられたセグメントごとの蛍光減衰曲線を求めることによって、測定インターバル全体に関連づけられた蛍光減衰曲線のうち、インターバルセグメントＢの外側に位置する部分に対し、跳躍的変化が生じる。それ故、基本方法の拡張によれば、このような跳躍的変化を取り除くために、つまりインターバルセグメントＢに関連づけられたセグメントごとの蛍光減衰曲線を、測定インターバル全体に関連づけられた蛍光減衰曲線のうち時間的に前に位置する部分に整合させるために、インターバルセグメントＢにおける強度に係数Ｆを乗算して、跳躍的変化のない、つまり図１２に示されているように連続的な蛍光減衰曲線が得られるように、構成されている。

ここでＩ_{ｓｅｌｅｃｔｅｄ} _{ｐｈｏｔｏｎｓ}（τ）は、基本方法に従い測定インターバル全体について求められた蛍光減衰曲線を表すのに対し、Ｉ_Ｂ _{ｓｅｌｅｃｔｅｄ} _{ｐｈｏｔｏｎｓ}（τ）は、基本方法をインターバルセグメントＢだけに適用したときに求められたセグメントごとの蛍光減衰曲線を表す。さらにＩ_ａｌｌ _{ｐｈｏｔｏｎｓ}（τ）は、すべての蛍光光子を評価して、すべての蛍光光子について受光時間が既知であるとしたならば生じるであろう、理想化された蛍光減衰曲線を表す。図１３には、これら上述の減衰曲線が描かれている。

関数Ｉ_ａｌｌ _{ｐｈｏｔｏｎｓ}（τ）は、記録されたデータからは正確には特定できない。ただし、前述の関数についての積分は、光子統計から既知である。

ただしＮ_Ａ（ｋ）およびＮ_ｂ（ｋ）は、インターバルセグメントＡもしくはＢにおいてｋ個の蛍光光子が識別された測定インターバルの個数を表す。これにより係数Ｆは、以下のように簡略化される。

したがって係数Ｆを考慮することによって、曲線間に跳躍的変化が存在する図１１に描かれたセグメンテーションされた蛍光減衰曲線から、図１２による連続的な減衰曲線が作成される。

このようにすれば、図１２に描かれた蛍光減衰曲線を、考察された光子統計に対して適切なモデル関数ｆ（τ）を適用して、評価することができる。このモデル関数ｆ（τ）によれば、１つまたは複数の成分を含む指数関数的な降下がマッピングされる。

ただし、ｍは指数成分の個数を表し、Ａ_ｎは個々の成分の振幅を、τ_ｎはそれらの成分の蛍光寿命時間を、さらにＩＲＦ（τ）は装置応答関数を表す。

蛍光寿命時間τ_ｎを特定するために例えば、モデル関数ｆ（τ）を図１２のように作成された蛍光減衰曲線に非線形整合するための方法が適用される。かかる方法は例えば、ポアソン統計学によるいわゆる最尤推定関数の最小化であり、これについて例えばBajzer, Z.等によるMaximum-Likelihood Method For The Analysis of Time-Resolved Fluorescence Decay Curves. European Biophysics Journal, 1991. 20(5): p. 247-262に記載されている。このようにして処理を進めた場合、モデル関数ｆ（τ）および作成された蛍光減衰曲線Ｉ（τ）が、以下の規則に従い修正される。

このようにして修正された関数ｆ（τ）およびＩ（τ）は、次いで後続の評価のためにそれ自体公知の態様で互いに整合される。

基本方法の上述の拡張を、測定インターバルが図１０〜図１３に描かれたものとは異なるようにセグメンテーションされるケースにおいても、適用することができる。特に、これまで説明してきた方法がそれぞれ適用される多数のインターバルセグメントに測定インターバルが分割されるならば、光子収率を持続的に増大させることができる。Ｍ個のタイムスロットを記録する場合に、測定インターバルをＭ個のインターバルセグメントに相応に分割するならば特に、著しく大きい光子収率が得られる。このケースであれば、作成された減衰関数Ｉ（τ）と共に、補正係数Ｆ（τ）の配列が生成されて、後続の評価に用いられる。

１０共焦点走査顕微鏡
１２パルス化レーザ光源
１４励起光
１６ビームスプリッタ
１８透過励起光
２０反射励起光
２２励起用開口絞り
２４ダイクロイックビームスプリッタ
２６走査ユニット
２８走査ミラー
３０走査レンズ
３２チューブレンズ
３４顕微鏡対物レンズ
３６試料
３８蛍光
４０検出用開口絞り
４２第１の検出器
４３アナログ検出器信号
４４処理ユニット
４６比較器またはアナログ／デジタル変換器
４８第２の検出器
４９アナログ励起信号
５６表示装置
６０蛍光減衰曲線

Claims

時間相関単一光子計数による蛍光寿命顕微鏡検査法であって、
蛍光光子を放出させるために、パルス化光源（１２）を用いて周期的に励起光パルスにより試料（３６）を励起し、それぞれ相前後して続く２つの励起光パルスの間に１つの測定インターバルを規定し、
検出器（４２）を用いて前記蛍光光子を捕捉し、捕捉された前記蛍光光子を表すアナログ検出器信号を生成し、
前記アナログ検出器信号に基づき、前記蛍光光子が個々の前記測定インターバル内で前記検出器により検出される検出時間を特定し、
捕捉された前記蛍光光子の前記検出時間に基づき、蛍光減衰特性を表す少なくとも１つの特徴量を特定し、
前記特徴量に基づきイメージングを行う、
蛍光寿命顕微鏡検査法において、
個々の前記測定インターバル内の前記アナログ検出器信号を、複数のサンプリングインターバルにおいてサンプリングし、個々の前記サンプリングインターバルに割り当てられた離散的信号値のシーケンスに変換し、
個々の前記測定インターバルに属する離散的信号値の前記シーケンスに基づき、前記測定インターバル内において予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたか否かを判定し、
前記予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたならば、前記蛍光減衰特性を表す前記特徴量の特定にあたり、前記測定インターバルを破棄し、ただし前記予め決められた個数は１以上である、
ことを特徴とする蛍光寿命顕微鏡検査法。
前記予め決められた個数は１である、
請求項１記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
前記アナログ検出器信号をアナログ／デジタル変換器（４６）によってデジタル化する、
請求項１または２記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
前記アナログ検出器信号を、比較器（４６）により閾値を適用してデジタル化し、前記離散的信号値がそれぞれ第１のバイナリ値または第２のバイナリ値と等しくなるようにする、
請求項１または２記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
個々の前記測定インターバルに割り当てられた離散的信号値の前記シーケンス内において、すべて前記第１のバイナリ値と等しい信号値から成る部分シーケンスを、光子インターバルとして規定し、前記光子インターバル内に含まれる前記サンプリングインターバルの個数が予め定められたサンプリングインターバル数を超えたならば、前記測定インターバル内において１つよりも多い蛍光光子の存在を検出する、
請求項４記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
前記測定インターバル内において、前記第１のバイナリ値を最初に有するサンプリングインターバルを前記光子インターバルの開始と規定し、
前記第２のバイナリ値を次に有するサンプリングインターバルを、前記光子インターバルの終了と規定し、
前記個数を、前記光子インターバルの前記開始と前記終了とに基づき特定する、
請求項５記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
前記励起光パルスの強度を予め決められた画素について基準測定において式
ｌ_ｅｘ（ｘ，ｙ）＝Ｉ・Ｎ（ｘ，ｙ，０）／Ｎ（ｘ，ｙ，１）
に従い求め、ただし、
Ｉは、前記基準測定における強度を表し、
Ｉ_ｅｘは、求められるべき強度を表し、
Ｎ（ｘ，ｙ，ｋ）は、ｋ＝１もしくはｋ＝０の蛍光光子が捕捉された測定インターバルの総数を表し、
（ｘ、ｙ）は、前記画素のロケーションを表す、
請求項１から６までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
前記予め決められた画素について前記励起光パルスの強度を、それぞれ正確に１つの蛍光光子が捕捉される測定インターバルの総数が、蛍光光子が捕捉されない測定インターバルの総数と等しくなるように調整する、
請求項７記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
個々の前記測定インターバル内において種々のインターバルセグメントを規定し、
前記測定インターバル内において前記予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたか否かの判定を、前記インターバルセグメントの各々について別個に実施し、
前記インターバルセグメント内において前記予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたならば、前記蛍光減衰特性を表す前記特徴量の特定にあたり、個々の前記インターバルセグメントを破棄する、
請求項１から８までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
個々の前記測定インターバルのインターバルセグメントごとに、前記蛍光減衰特性を表す前記特徴量を特定し、
個々の前記インターバルセグメントについて特定された前記特徴量から、前記測定インターバル全体に関連づけられた特徴量を求める、
請求項９記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
前記測定インターバル全体に関連づけられた前記特徴量を、前記予め決められた個数の蛍光光子が捕捉されたインターバルセグメント数と、光子が捕捉されなかったインターバルセグメント数と、から特定される係数に基づき求める、
請求項１０記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
前記測定インターバル全体に関連づけられた前記特徴量を、前記インターバルセグメント内で捕捉された蛍光光子の個数を考慮するモデル関数に基づき評価する、
請求項１０または１１記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
種々の前記インターバルセグメントは、前記測定インターバル内で時間的にオーバラップしてまたはオーバラップせずに相前後して続く少なくとも２つのセグメントを含む、
請求項９から１２までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
種々の前記インターバルセグメントは、前記測定インターバルにより定められた第１のセグメントと、前記測定インターバルの始点よりも遅らされた始点および前記測定インターバルの終点と一致する終点を有する少なくとも１つの第２のセグメントと、を含む、
請求項９から１２までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
共焦点走査顕微鏡（１０）または多光子顕微鏡を使用して実施する、
請求項１から１４までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡検査法。
時間相関単一光子計数による蛍光寿命顕微鏡検査法を実施するための顕微鏡（１０）であって、前記顕微鏡（１０）は、
蛍光光子を放出させるために励起光パルスにより試料を励起するように構成された光源（１２）を含み、それぞれ相前後して続く２つの励起光パルスの間に１つの測定インターバルが規定されており、
さらに前記顕微鏡（１０）は、
前記蛍光光子を捕捉し、捕捉された前記蛍光光子を表すアナログ検出器信号を生成するように構成された検出器（４２）と、
前記アナログ検出器信号に基づき、前記蛍光光子が個々の前記測定インターバル内で前記検出器により検出される検出時間を特定し、前記捕捉された蛍光光子の前記検出時間に基づき、蛍光減衰特性を表す少なくとも１つの特徴量を特定し、前記特徴量に基づきイメージングを行うように構成された、処理ユニット（４４）と、
を含む顕微鏡（１０）において、
前記処理ユニット（４４）は、個々の前記測定インターバル内の前記アナログ検出器信号を、複数のサンプリングインターバルにおいてサンプリングし、個々の前記サンプリングインターバルに割り当てられた離散的信号値のシーケンスに変換するように構成されており、
さらに前記処理ユニット（４４）は、個々の前記測定インターバルに属する離散的信号値の前記シーケンスに基づき、前記測定インターバル内において予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたか否かを判定し、前記予め決められた個数よりも多い蛍光光子が捕捉されたならば、前記蛍光減衰特性を表す前記特徴量の特定にあたり、前記測定インターバルを破棄するように構成されており、ただし前記予め決められた個数は１以上である、
ことを特徴とする顕微鏡（１０）。
前記処理ユニット（４４）は、アナログ／デジタル変換器（４６）を含み、前記アナログ／デジタル変換器（４６）は、前記アナログ検出器信号をデジタル化するように構成されている、
請求項１６記載の顕微鏡（１０）。
前記処理ユニット（４４）は、比較器（４６）を含み、前記比較器（４６）は、前記離散的信号値がそれぞれ第１のバイナリ値または第２のバイナリ値と等しくなるよう、閾値を適用して前記アナログ検出器信号をデジタル化するように構成されている、
請求項１６記載の顕微鏡（１０）。
別の検出器（４８）が設けられており、前記別の検出器（４８）は、前記励起光パルスを捕捉し、捕捉された前記励起光パルスを表すアナログ励起信号を生成するように構成されており、
前記処理ユニット（４４）は、前記アナログ励起信号を前記サンプリングインターバルに従いサンプリングし、個々の前記サンプリングインターバルに割り当てられた離散的励起信号値のシーケンスに変換するように構成されている、
請求項１６から１８までのいずれか１項記載の顕微鏡（１０）。
前記処理ユニット（４４）は、調整情報を表示するための表示装置（５６）を含む、
請求項１６から１９までのいずれか１項記載の顕微鏡（１０）。
共焦点走査顕微鏡または多光子顕微鏡として構成されている、
請求項１６から２０までのいずれか１項記載の顕微鏡（１０）。