JP2023522403A - Ｎ個の光子事象を計数するように構成された方法および装置 - Google Patents

Abstract

複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内におけるＮ個の光子事象を計数するように構成された装置が開示される。Ｎは１よりも大きい自然数であり、Ｎは２であることが好ましい。Ｎ個の光子事象は、時間的に重なり合う少なくともＮ個の単一光子事象の発生を表す。装置（１０）は、信号処理デバイス（４４）と感光性検出器（４２）とを備える。感光性検出器（４２）は、感光性検出器（４２）を用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性シーケンスを表すデジタルパターン（６８，７０，７２，７４）を有する時間依存性デジタル信号を生成するように構成されている。デジタル信号内の各デジタルパターン（６８，７０，７２，７４）が、少なくとも１つの光子と感光性検出器（４２）との相互作用の少なくとも１つの事象を表すデジタル値の連続シーケンスを有するデジタルパターン幅（ｄ１，ｄ２，ｄ３）を有する。信号処理デバイス（４４）は、それぞれのデジタルパターン幅（ｄ１，ｄ２，ｄ３）に依存して、デジタル信号内のデジタルパターンからＮ個の光子事象を特定するように構成されている。Ｎ個の光子事象の量が、計数される。

Description

本発明は、光の複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内において、Ｎ個の光子事象を計数するように構成された方法および装置に関するものである。

顕微鏡、特に走査型顕微鏡または共焦点顕微鏡で取得されうるルミネセンス光の標本を計数する従来の光子計数法は、試料の照明光強度が低いことに起因しうる低い検出信号強度で正確に動作する。このような状況下では、光子は感光性検出器にまばらに当たっている。しかし、照明光の強度を少し上げると、２個以上の光子がほぼ同時に検出器に当たることとなり、１つ以上の光子と感光性検出器とが相互作用した事象を区別することができなくなる。

国際公開第２０１７／２０２９８０号には、顕微鏡システムにおいて蛍光色素の蛍光寿命を求める方法として、感光性検出器によって検出されたであろう多光子事象を破棄する方法が主として開示されている。

場合によっては、このような光子計数測定において多光子事象を考慮することが望ましいであろう。そのため、複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内において、Ｎ個の光子事象を計数するように構成された方法および装置を提供することを目的とする。

本目的は、独立請求項の特許発明の主題によって解決される。有利な実施態様および実施形態は、従属請求項の特許発明の主題によって定義される。したがって、本発明は、複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内におけるＮ個の光子事象を計数するように構成された装置に関するものであり、Ｎは１よりも大きい自然数であり、Ｎは２であることが好ましい。特に、これは少なくとも１つの有限時間長、例えば光源の２つの隣接する光パルス間において行うことが可能である。Ｎ個の光子事象は、時間的に重なり合う少なくともＮ個の単一光子事象の発生を表し、ここでの「時間的に重なり合う」とは、例えば、２個以上の光子が、検出システムの不感時間、特に、検出システムの不感時間以下の画像取得時間中に、感光性検出器と相互作用するという意味で理解されうる。装置は、信号処理デバイスと感光性検出器とを備え、感光性検出器は、時間依存性のデジタル信号を生成するように構成されており、時間依存性のアナログ信号は、感光性検出器を用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性のシーケンスを表すデジタルパターンを有する適切な変換手段／電子回路によってデジタルシステムへと変換されうる。デジタル信号内の各デジタルパターンは、デジタル値の連続シーケンスを有するデジタルパターン幅を有する。デジタル値は、好ましくは０および１である。デジタル値は、少なくとも１つの光子と感光性検出器との相互作用の少なくとも１つの事象を表す。信号処理デバイスは、それぞれのデジタルパターン幅に依存して、デジタル信号内のデジタルパターンからＮ個の光子事象を識別するように構成されている。Ｎ個の光子事象の量は、計数される。好ましくは、Ｎ個の光子事象の計数は、上記のそれぞれの有限時間長の間に実行される。

本発明によれば、有利には、より高い精度で光子計数を実行することが可能であり、特に、例えば、試料のより高い照明強度においても、上記の制限を克服することが可能である。重なり合う光子事象を単一光子事象と区別することができる。重なり合う光子は、単一光子検出信号および／または単一光子事象の時間パルス応答関数の時間幅以下である到来時間差で感光性検出器に到来する、または相互作用する光子の意味で理解されるであろう。本発明により、「ゼロ値」のより良い判別および／または弁別を達成することが可能であり、これにより単一光子事象および２つの光子事象についてより高いダイナミックレンジおよび／または精度を有する測定または計数結果がもたらされ、光子と感光性検出器との実際の相互作用が特にノイズから独立し、または検出システムノイズへの依存性が無くなるかもしくは検出システムノイズへの依存性が低減されうる。一般に、光の複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンスを表すデジタルパターン内のＮ個の光子事象の識別は、デジタルデータストリームのパターン認識とみなすことができ、デジタルデータストリームは、実際に生じる光の複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象のシーケンスに時間相関している。

信号処理デバイスは、デジタルパターンのデジタルパターン幅が、単一光子事象を表すデジタルパターン幅の１／Ｎ倍よりも大きい場合、Ｎ個の光子事象としてデジタルパターンを定めるように構成されうる。デジタルパターンをＮ個の光子事象として定める、デジタルパターン幅の追加の範囲が規定される場合がある。例えば、２つの光子事象が識別される場合（すなわち、この例ではＮ＝２）、単一光子事象を表すデジタルパターン幅は、例えば５時間単位の予め規定された値を有するとみなされうる。ここで、時間単位は、１つの光子との相互作用に応答して感光性検出器によって生成されるアナログ信号のデジタルサンプリングのサンプリング周波数に依存する期間となりうる。この例では、２つの光子事象は、５時間単位より大きいデジタルパターンについて定められうる。しかしながら、デジタルパターンを２つの光子事象として定めるデジタルパターン幅の追加範囲を考慮する場合、２つの光子事象が識別されるデジタルパターン幅は、８時間単位または６時間単位のはずである。

付加的または代替的に、信号処理デバイスは、デジタルパターンのデジタルパターン幅が、単一光子事象を表すデジタルパターン幅より大きく、かつ単一光子事象を表すデジタルパターン幅のＮ倍以下である場合に、デジタルパターンをＮ個の光子事象として定めるように構成されうる。この場合にも、デジタルパターン幅の追加範囲が考慮されうるが、好ましくは、本項の主題が、前項の主題と組み合わされる場合に、これは一貫して規定されるべきである。

本装置は、デジタルパターンのデジタルパターン幅が単一光子事象のインパルス応答／インパルス応答関数の時間長のＸ倍を実質的に表す場合、信号処理デバイスがデジタルパターンを単一光子事象として識別するように構成されるように、さらに構成されうる。ここで、Ｘは０．５～１．５の範囲内の実数であり、Ｘは好ましくは１．０である。通常、単一光子事象は、感光性検出器との規定された時間的相互作用を有し、好ましくは、感光性検出器とのこの時間的相互作用の持続は、感光性検出器および／またはデジタル化電子機器のインパルス応答の時間長とみなされうる。Ｘは、付加的または代替的に検出器の特性に依存する場合がある。好ましくは、本装置は識別された単一光子事象の計数をも考慮するようにさらに構成される。

信号処理デバイスが、デジタルパターンのデジタル値が光子と感光性検出器との相互作用の事象を表していない場合、またはデジタルパターンのデジタルパターン幅が、単一光子事象のインパルス応答の時間長のＹ倍よりも小さい場合に、デジタルパターンを偽陽性信号または不完全な信号として識別するように構成されうる。Ｙは０．０～０．４９の範囲内の実数であり、Ｙは好ましくは０．２４である。偽陽性信号は、光子と感光性検出器との相互作用の事象を表すものではない。

上記の実数Ｘおよび／またはＹの値は、検出された事象のデジタルパターン幅の統計分布に依存し、かつ／または検出システムの不完全性に依存しうる。検出システムの不完全性とは、例えば、感光性検出器内で生成された電子の不整合もしくは内部クロック生成ユニットによるシステムクロックの生成の不整合、またはアナログ信号のサンプリング周波数の不整合によって生成されるジッタでありうる。なぜなら、単一光子事象のインパルス応答／インパルス応答関数の時間長のＸ倍の結果および／または単一光子事象のインパルス応答の時間長のＹ倍の結果は、実数であるはずなので、Ｘおよび／またはＹに実際に使用される値として、乗算結果よりも大きい、または小さい隣り合う自然数を選択することは理にかないうる。

光源は、照明光パルスのシーケンスを生成するように、または変調光を生成するように構成することができる。

好ましくは、デジタル照明データシーケンス生成ユニットが、照明光パルスのシーケンスの時間プロファイルまたは変調光の時間プロファイルを表すデジタル照明データシーケンスを生成するように構成されている。デジタル照明データシーケンスは、感光性検出器および／またはデジタル信号内のデジタルパターンを用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性シーケンスを用いて規定された時間相関をさらに有しうる。

光源は、連続波特性を有する照明光を生成するように構成されうる。トリガ信号生成ユニットは、有限時間長が導出される周期的トリガ信号を生成するように構成されうる。生成された周期的トリガ信号は、内部クロックとして使用されうるか、または感光性検出器のアナログ信号がデジタル信号へサンプリングされる／デジタル化される／変換されるサンプリング周波数となりうる。感光性検出器のアナログ信号のサンプリングは、特に、信号シーケンスの時間情報が維持され、かつ事象の時間依存性シーケンスと１対１で対応する方式で実行される。周期的トリガ信号は、感光性検出器および／またはデジタル信号内のデジタルパターンを用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性シーケンスを用いて規定された時間相関を有しうる。

好ましい実施形態によれば、本装置は、撮像デバイスを備えるか、または撮像デバイスに組み込まれており、撮像デバイスは、照明光で試料領域を照明するように構成されている。付加的または代替的に、撮像デバイスは、試料領域を感光性検出器上で撮像するように構成されうる。撮像デバイスは、光学顕微鏡、走査型顕微鏡、または共焦点走査型顕微鏡でありうる。装置は、例えば、スペクトル選択光学ユニットを用いてさまざまな波長を有する光子を検出するために、２つ以上の感光性検出器を備えることが可能であり、さまざまな光子をさまざまな感光性検出器へ向けることができる。

光の光子は、少なくとも１つの光子を放出することによる励起状態から基底状態へ、もしくは非励起状態への放射性変換から、または試料領域に由来するルミネセンス発光過程から、特に蛍光発光過程または燐光発光過程に起因するルミネセンス発光過程から生じ、かつ／または光子は光源の反射光から生じうる。

光源の全体的な光強度が、光子と感光性検出器との間の単一相互作用の少なくともいくつかが時間的に分解可能である方式で試料領域を照明するのに適するように選択されうる。

デジタル信号のデジタルパターンは、下位標準化信号から上位標準化信号への変化または上位標準化信号から下位標準化信号への変化が生じる瞬間である第１のスイッチング瞬間と、上位標準化信号から下位標準化信号への変化または下位標準化信号から上位標準化信号への変化が生じる瞬間である第２のスイッチング瞬間と、を判別することによって生成され、ここで、デジタル値は、判別された第１のスイッチング瞬間および判別された第２のスイッチング瞬間に依存して、デジタルパターンに割り当てられる。好ましくは、割り当てられているデジタル値は、０または１のいずれかである。

好ましくは、複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内におけるＮ個の光子事象が、２つの後続する光パルス間の時間長または走査型顕微鏡のピクセル滞留時間の少なくとも一部以下である少なくとも１つの有限時間長の間に計数される。代替的または付加的に、少なくとも１つの有限時間長は、感光性検出器によって出力されているアナログ信号がサンプリングされるサンプリング周波数に依存する。サンプリング周波数は、１ＭＨｚ～２０ＧＨｚの範囲内の値を有しうる。サンプリング周波数は、好ましくは１０ＧＨｚの値を有する。

本発明は、複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内において、Ｎ個の光子事象を計数する方法に関するものである。Ｎは１より大きい自然数である。Ｎは好ましくは２である。Ｎ個の光子事象は、時間的に重なり合う少なくともＮ個の単一光子事象の発生を表す。感光性検出器は、感光性検出器を用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性シーケンスを表すデジタルパターンを有する時間依存性デジタル信号を生成する。デジタル信号内の各デジタルパターンは、少なくとも１つの光子と感光性検出器との相互作用の少なくとも１つの事象を表すデジタル値の連続シーケンスを有するデジタルパターン幅を有する。本方法は、それぞれのデジタルパターン幅に依存して、デジタル信号内のデジタルパターンからＮ個の光子事象を識別するステップと、Ｎ個の光子事象の量を計数するステップと、を備える。

有利には、請求項１７記載の方法が、請求項１から１６までのいずれか１項記載の装置を操作するように構成されている。請求項１から１６までのいずれか１項に記載される装置の知識の範囲内で、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の装置を操作するための方法を提供することは、当業者にとって明らかであり、したがって繰り返しを避けるために上記でなされた説明を参照する。

偽陽性信号のより良い判別および／または弁別は、より高いダイナミックレンジを有する計数および／または測定および／または撮像の結果によって実現される。代替的または付加的に、単一光子事象およびＮ個の光子事象についてのより良い精度の計数および／または測定および／または撮像がノイズから独立しうる。検出システムノイズへの依存性がなくなり、検出システムノイズへの依存性が低減されうる。これは、顕微鏡などの撮像システムで実現されうる。

請求項１から１６までのいずれか１項記載の信号処理デバイス上で実行される際に、請求項１７または１８記載の方法を実行するためのプログラムコードを含む、コンピュータプログラムも提供される。

本発明は、例示的な図に基づいて、以下でさらにより詳細に説明されるであろう。本発明は、例示的な実施形態に限定されるものではない。本明細書に記載されたおよび／または図示された全ての特徴は、本発明の実施形態において、単独で使用される、またはさまざまな組み合わせで組み合わされうる。本発明のさまざまな実施形態の特徴および利点は、次の事項を示す添付図面を参照して以下の詳細な説明を読むことにより明らかになるであろう。

本発明による装置を備えた共焦点顕微鏡システムを概略的に示す図である。 レーザー光源パルス、光子の発生および検出信号の例を時間の関数として概略的に示す図である。 レーザー光源パルス、光子の発生および検出信号の例を時間の関数として概略的に示す図である。 レーザー光源パルス、光子の発生および検出信号の例を時間の関数として概略的に示す図である。 単一光子事象およびＮ個の光子事象の特定の例を概略的に示す図である。 １秒あたりの信号計数を照明光強度の関数として概略的に示す図である。 顕微鏡とコンピュータシステムとを備えたシステムであり、本システムが本明細書に記載された方法を実行するように構成されていることを概略的に示す図である。

図１は、本発明による装置を備えた撮像デバイスとみなすことのできる共焦点走査型顕微鏡１０を示す図である。

共焦点走査型顕微鏡１０は、周期的な励起／照明光パルスで光を放出するように設計された光源１２を有する。図１において１４と表示された励起光は、ビームスプリッタ１６へ当たり、このビームスプリッタ１６は、励起光１４を透過成分１８と反射成分２０とに分割する。

ビームスプリッタ１６を透過した励起光１８は、励起用アパーチャ２２を通過した後、ダイクロイックビームスプリッタ２４で走査ユニット２６の方向へ反射される。走査ユニット２６は、ジンバル式走査ミラー２８を含み、励起光１４，１８を走査レンズ３０の方向へ反射させる。走査レンズ３０とチューブレンズ３２とを通過した後、励起光は顕微鏡対物レンズ３４に入射し、顕微鏡対物レンズ３４は励起光１８を試料３６へと向ける。

蛍光分子、好ましくは試料３６内またはその上に特異的に結合されている蛍光分子は、励起光１４，１８によって励起され、励起光１４，１８によって照明された試料３６の領域において蛍光光３８（破線で示す。蛍光光３８は光子を含む）を放出する。蛍光光３８を構成する蛍光光子は、光路に沿って試料３６に接近する励起光１８とは逆方向へ伝播し、ビームスプリッタ２４に戻る。ビームスプリッタ２４および検出用アパーチャ４０を通過した後、蛍光光３８は感光性検出器４２に到達する。感光性検出器４２は、受光した蛍光光３８をアナログ検出器信号４３に変換し、アナログ検出器信号４３がその後信号処理デバイス４４に送信される。信号処理デバイス４４は、アナログ検出器信号４３を所定のサンプリング周期でサンプリングし、それによってアナログ検出器信号４３を時間依存性デジタル信号に変換するように設計されている。この時間依存性デジタル信号は、サンプリング周期に対応する個々のサンプリングインターバルに関連付けられた離散的信号デジタル値のシーケンスを構成する。信号処理デバイス４４は、アナログ検出器信号４３をサンプリングする目的で、比較器４６を含む。また、比較器４６に代えて、アナログ－デジタル変換器を設けてもよい。

受光した蛍光光３８をアナログ検出器信号に変換する感光性検出器４２に加えて、走査型顕微鏡１０は、ビームスプリッタ１６によって方向転換されたビーム経路に位置するさらなる検出器４８を有する。したがって、さらなる検出器４８は、光源１２によって放出され、かつビームスプリッタ１６によって反射された励起光１４の部分２０を受光する。さらなる検出器４８は、ビームスプリッタ１６上で反射した励起光の部分２０をアナログ励起信号４９に変換し、それを信号処理デバイス４４へ供給する。信号処理デバイス４４は、送信されてきたアナログ励起信号４９を所定のサンプリングレートでサンプリングし、その結果、アナログ励起信号４９を、個々のサンプリングインターバルと関連付けられた離散的励起信号値のシーケンスを構成するデジタル信号に変換する。これを実現するためには、繰り返しになるが、信号処理デバイス４４は比較器またはアナログ－デジタル変換器を有する。以下、第２の検出器４８によって供給されるアナログ励起信号４９と、信号処理デバイス４４によってそこから生成されるデジタル信号と、をそれぞれアナログレーザー信号およびデジタルレーザー信号と称する。

この実施例では、信号処理デバイス４４は、実質的に公知の方式で走査ユニット２８を制御するようにも設計されている。

とりわけ、信号処理デバイス４４は、感光性検出器４２が試料３６によって放出された１つ以上の蛍光光子を受光する検出時間を、検出器４２によって供給されるアナログ検出器信号４３から判別する機能を有している。

感光性検出器、検出器電子回路および信号処理デバイス（例えばＦＰＧＡ内で具現化されうる）のうちの少なくとも１つの構成は、刊行物としての国際公開第２０１７／２０２９８０号、欧州特許出願公開第２５９２４１３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１１９２７６号明細書、国際公開第２０１４／０５９９８３号および未公開の独国特許出願公開第１０２０１８１３３４４３．５号明細書のうちの少なくとも１つに開示されているように具現化されてもよく、これら全ての文献はその全体において本明細書に組み込まれるものとする。

図２および図３に一例として示した図に基づいて、上述した信号処理デバイス４４の役割を、以下の詳解において説明する。図２～図４はそれぞれ、レーザー光源パルス、光子の発生、アナログおよびデジタル検出信号の例を時間ｔの関数として概略的に示した図である。時間スケールは任意単位であってよく、この例では時間スケールをｎｓと示した。

本発明に従って連続波特性を有するレーザー光源も適用されうるが、図２～図４には、照明光パルスのシーケンスを生成するように構成されているレーザー光源１２によって生成された、試料３６を照明するための光パルスおよびそのデジタルパターン６８を示す。

図２は、照明光パルスおよび検出信号のシナリオの一例を示す。特に、最上段の図では、レーザー光源１２によって放出された２つの隣接する光パルスのシーケンスを表すアナログ信号６０が示されている。その下の図では、感光性検出器４２と相互作用する蛍光光３８の光子６２の例が示されている。その下の図では、感光性検出器４２によって生成されるアナログ検出器信号４３，６４が示されている。その下の図では、感光性検出器４２のアナログ検出器信号４３，６４とさらなる検出器４８からの検出信号４９とをサンプリングするサンプリング周波数６６が示されている。この例では、サンプリング周波数は、１０ＧＨｚの値を有する。その下の図では、レーザー１２の光パルスと検出器４８との相互作用の後に検出器４８によって生成されているデジタル化信号４９のデジタルレーザー光源信号のデジタルパターン６８が示されている。その下の図では、デジタル化されたアナログ検出器信号６４の時間依存性デジタル信号のデジタルパターン７０が示されている。

図３は、時間の関数としての照明光パルスおよびさまざまな光子事象の例示的なシナリオを示す。特に、最上段の図（「レーザー」）では、レーザー光源１２によって放出される２つの隣接する光パルスのシーケンスを表すアナログ信号６０とともに、レーザー１２の光パルスと検出器４８との相互作用の後に検出器４８によって生成されたデジタル化信号４９のデジタルレーザー光源信号のデジタルパターン６８が示されている。

その下の図（「光子なし」）では、光子事象がない場合であり、したがって光子と感光性検出器４２との相互作用がない例を示している。したがって、アナログ信号およびデジタル信号は、一定の値０を有する。

その下の図（「１つの光子」）では、感光性検出器４２と相互作用する蛍光光３８の単一光子の例が、アナログ検出器信号６４の時間依存性デジタル化信号のデジタルパターン７０とともに示されている。したがって、ここでは、光子と感光性検出器４２との１つの相互作用を表す単一光子事象が示されている。

その下の図（「２つの光子」）では、感光性検出器４２と相互作用する蛍光光３８の２つの単一光子の例が、デジタル化されたアナログ検出器信号６４の時間依存性デジタル信号のデジタルパターン７０とともに示されている。これらの２つの光子は、それらを２つの単一光子事象として区別できるほど十分に大きな時間的距離を有している。なぜなら、２つのデジタルパターン７０は互いに離間しており、２つのデジタルパターン７０間に時間依存性デジタル信号の一定の少なくとも１つの０値が存在するからである。

その下の図（「重なり合う２つの光子」）では、感光性検出器４２と相互作用する蛍光光３８の２つの単一光子の例が、デジタル化されたアナログ検出器信号の時間依存性デジタル信号のデジタルパターン７２とともに示される。これらの２つの光子は、時間的距離が十分に大きくないので、それらを２つの単一光子事象として区別することができない。

その下の図（「重なり合う２つよりも多くの光子」）では、感光性検出器４２と相互作用する蛍光光３８の重なり合う２つよりも多くの光子の例が、デジタル化されたアナログ検出器信号の時間依存性デジタル信号のデジタルパターン７４，７０とともに示される。左側の光子事象は、複数の光子の時間的距離が十分に大きくないので、それらを単一光子事象として識別することができない。なぜなら、デジタルパターン７４は、単一光子事象が時間的に重なり合って発生した結果であるからである。しかし、右側のデジタルパターン７０で表現されている光子事象は、単一光子事象として識別することができる。

図５の上段は、さまざまな光子事象の発生およびそれらのアナログ検出器信号６４の特定の一例を示す。その左側には、図２に示されたもの、または図３の「１つの光子」図に示されたものと同等の状況が示されている。その中央には、図３の「２つの光子」図に示されたものと同等の状況が示されている。その右側には、図３の「重なり合う２つの光子」図に示されたものと同等の状況が示されている。この重なり合う２つの光子の状況は、従来技術で公知である識別法によれば２つの光子事象として正確に識別することができず、１つの光子事象として識別されてしまう可能性が最も高い。光子事象が単一または２つであるかの判別結果は、丸囲みの数字で、すなわち１または２によって示されている。

図５の下段は、複数の光子６２と感光性検出器４２との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内におけるＮ個の光子事象を計数するように構成された本発明による装置の動作例を示し、Ｎは１よりも大きい自然数であり、Ｎは好ましくは２である。Ｎ個の光子事象は、時間的に重なり合う少なくともＮ個の単一光子事象６２の発生を表す。装置は、図１を参照すると、信号処理デバイス４４と感光性検出器４２とを備える。感光性検出器４２は、感光性検出器４２を用いた複数の光子６２の検出による事象の時間依存性シーケンスを表すデジタルパターン７０，７２，７４を有する時間依存性デジタル信号を生成するように構成されている。デジタル信号内の各デジタルパターン７０，７２，７４は、デジタルパターン幅ｄ１，ｄ２，ｄ３を有しており、例えば図３を参照すると、少なくとも１つの光子６２と感光性検出器４２との相互作用である少なくとも１つの事象を表すデジタル値０および１（デジタル値０は予め定められたスイッチング瞬間より小さい検出器信号を表し、値１は予め定められたスイッチング瞬間より大きいデジタル値を表す）の連続シーケンスを有する。信号処理デバイス４４は、それぞれのデジタルパターン幅ｄ１，ｄ２，ｄ３に依存して、デジタル信号内のデジタルパターン７０，７２，７４からＮ個の光子事象を識別するように構成されており、Ｎ個の光子事象の量が計数される。

図５の下段では、繰り返しになるが、その左側に、図２に示されたもの、または図３の「１つの光子」図に示されたものと同等の状況が示されている。その中央に、図３の「２つの光子」図に示されたものと同等の状況が示されている。その右側に、図３の「重なり合う２つの光子」図に示されたものと同等の状況が示されている。この重なり合う２つの光子の状況は、デジタルパターン７２のデジタルパターン幅ｄ２を考慮することにより、本発明によって２つの光子事象として正しく識別される。したがって、光子事象が単一または２つであるかの正しい判別結果は、丸囲みの数字で、すなわち１または２によって示されている。この結果は、図６に示されるように、単一光子と感光体検出との物理的な相互作用の真の状態にかなり近いものである。図６は、光子が例えば１つ以上の蛍光色素によって生成される場合の励起強度である照明光強度の関数としての１秒あたりの信号計数を概略的に示す図である。図６において、点線は、光源によって放出される光の強度を選択することによって、選択または調整することができる励起強度と、計数されうる光子と感光性検出器との相互作用の検出された事象の１秒あたりの計数と、の間の理想的な線形関係を示す。

一例では、Ｎを２とする。したがって、デジタルパターン７２のデジタルパターン幅ｄ２が、単一光子事象を表すデジタルパターン幅ｄ１の１倍より大きい場合、事象は２つの光子事象として識別される。さらに、デジタルパターン７２のデジタルパターン幅ｄ２が、単一光子事象を表すデジタルパターン幅ｄ１よりも大きく、かつ単一光子事象を表すデジタルパターン幅ｄ１の２倍以下であれば、デジタルパターン７２は２つの光子事象として識別される。このような例は、図５の下段にある図の右側、または図３における「重なり合う２つの光子」図に示されている。

デジタルパターン７０のデジタルパターン幅ｄ１が、単一光子事象のインパルス応答の時間長のＸ倍を表している場合、事象は単一光子事象として識別され、Ｘは０．５～１．５の範囲内の実数であり、Ｘは好ましくは１．０である。これは、例えば、図５の下段にある図の左側および中央、または図３の「１つの光子」もしくは「２つの光子」図に示されている。本発明による装置は、好ましくは、識別された単一光子事象の計数をも考慮するようにさらに構成されている。

好ましい実施形態において、また測定された光子から検出システムにおける信号の不確実性を低減させるため、かつ／または例えば請求項５において言及されているように、疑わしい光子事象を「クリーンアップ」するために、検出器信号、特にアナログ検出器信号は、信号処理デバイス４４の上流にある感光性検出器の電気回路の一部で分析されうる。

図２～図５に示している例では、デジタル照明データシーケンスは、デジタル信号内のデジタルパターン７０，７２，７４とともに、感光性検出器４２を用いた複数の光子６２の検出による事象の時間依存性シーケンスを用いて規定された時間相関を有する。

図２に示したサンプリング周波数は、周期的なトリガ信号とみなされうる。サンプリング周波数は、デジタル信号内のデジタルパターン７０，７２，７４とともに、感光性検出器４２を用いた複数の光子６２の検出による事象の時間依存性シーケンスを用いて規定された時間相関を有する。

光子６２と感光性検出器４２との間の単一相互作用の少なくともいくつかが時間的に分解可能である方式で、試料３６またはその試料領域が照明されるような、光源１２の全体的な光強度を選択することが有利である。

アナログ信号からのデジタル信号のデジタルパターン７０，７２，７４の生成を、図２を参照して一例において説明する。デジタルパターン７０は、標準化された電気信号またはデジタル値、すなわちこの例では２進数の０および１を利用して、サンプリングされるアナログ信号の振幅が規定されたアナログ値閾値以下である場合、下位デジタル値、すなわち０が設定され、またはサンプリングされているアナログ信号の振幅が規定されたアナログ値閾値以上である場合、上位デジタル値、すなわち１が設定される方式で、生成される。閾値は同じであってもよいが、必ずしも同じである必要はない。この例では、アナログ信号の振幅に対する規定された閾値は、実質的に、アナログ信号パルスのアナログ信号の振幅の最大値の半分である。したがって、第１のスイッチング瞬間８０は、下位標準化信号、すなわち０から上位標準化信号への変化がある瞬間であると規定される。第２のスイッチング瞬間８２は、上位標準化信号、すなわち１から下位標準化信号への変化がある瞬間であると規定される。

本発明による装置を用いた測定結果は、複数の光子と感光性検出器４２との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内のＮ個の光子事象および／または単一光子事象が、２つの後続の光パルス間の時間長以下である少なくとも１つの有限時間長の間に計数されうる。代替的に、複数の光子と感光性検出器４２との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内のＮ個の光子事象および／または単一光子事象は、走査型顕微鏡のピクセル滞留時間の少なくとも一部の間に計数されうる。少なくとも１つの有限時間長は、感光性検出器４２のアナログ信号がサンプリングされるサンプリング周波数に依存しうる。サンプリング周波数は、本実施例では、１０ＧＨｚの値を有する。

明細書で使用されるように、用語「および／または（かつ／または）」は、関連する記載項目のうちの１つまたは複数の項目のあらゆる全ての組み合わせを含んでおり、「／」として略記されることがある。

いくつかの態様を装置の文脈において説明してきたが、これらの態様が、対応する方法の説明も表していることが明らかであり、ここではブロックまたは装置がステップまたはステップの特徴に対応している。同様に、ステップの文脈において説明された態様は、対応する装置の対応するブロックまたは項目または特徴の説明も表している。

いくつかの実施形態は、図１から図６のうちの１つまたは複数の図に関連して説明されたようなシステムを含んでいる顕微鏡に関する。択一的に、顕微鏡は、図１から図６のうちの１つまたは複数の図に関連して説明されたようなシステムの一部であってもよい、または図１から図６のうちの１つまたは複数の図に関連して説明されたようなシステムに接続されていてもよい。図７は本明細書に記載された方法を実施するように構成されたシステム７００の概略図を示している。システム７００は、顕微鏡７１０とコンピュータシステム７２０とを含んでいる。顕微鏡７１０は、撮像するように構成されており、かつコンピュータシステム７２０に接続されている。コンピュータシステム７２０は、本明細書に記載された方法の少なくとも一部を実施するように構成されている。コンピュータシステム７２０は、機械学習アルゴリズムを実行するように構成されていてもよい。コンピュータシステム７２０と顕微鏡７１０は別個の存在物であってもよいが、１つの共通のハウジング内に一体化されていてもよい。コンピュータシステム７２０は、顕微鏡７１０の中央処理システムの一部であってもよく、かつ／またはコンピュータシステム７２０は、顕微鏡７１０のセンサ、アクター、カメラまたは照明ユニット等の、顕微鏡７１０の従属部品の一部であってもよい。

コンピュータシステム７２０は、１つまたは複数のプロセッサおよび１つまたは複数のストレージデバイスを備えるローカルコンピュータデバイス（例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレットコンピュータまたは携帯電話）であってもよく、または分散コンピュータシステム（例えば、ローカルクライアントおよび／または１つまたは複数のリモートサーバファームおよび／またはデータセンター等のさまざまな場所に分散されている１つまたは複数のプロセッサおよび１つまたは複数のストレージデバイスを備えるクラウドコンピューティングシステム）であってもよい。コンピュータシステム７２０は、任意の回路または回路の組み合わせを含んでいてもよい。１つの実施形態では、コンピュータシステム７２０は、任意の種類のものとすることができる、１つまたは複数のプロセッサを含んでいてもよい。本明細書で使用されるように、プロセッサは、例えば、顕微鏡または顕微鏡部品（例えばカメラ）のマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、複合命令セットコンピューティング（ＣＩＳＣ）マイクロプロセッサ、縮小命令セットコンピューティング（ＲＩＳＣ）マイクロプロセッサ、超長命令語（ＶＬＩＷ）マイクロプロセッサ、グラフィックプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、マルチコアプロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または任意の他の種類のプロセッサまたは処理回路等のあらゆる種類の計算回路を意図していてもよいが、これらに限定されない。コンピュータシステム７２０に含まれうる他の種類の回路は、カスタム回路、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）等であってもよく、例えばこれは、携帯電話、タブレットコンピュータ、ラップトップコンピュータ、双方向無線機および類似の電子システム等の無線装置において使用される１つまたは複数の回路（通信回路等）等である。コンピュータシステム７２０は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）の形態のメインメモリ等の特定の用途に適した１つまたは複数の記憶素子を含みうる１つまたは複数のストレージデバイス、１つまたは複数のハードドライブおよび／またはコンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュメモリカード、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）等のリムーバブルメディアを扱う１つまたは複数のドライブ等を含んでいてもよい。コンピュータシステム７２０はディスプレイ装置、１つまたは複数のスピーカーおよびキーボードおよび／またはマウス、トラックボール、タッチスクリーン、音声認識装置を含みうるコントローラ、またはシステムのユーザーがコンピュータシステム７２０に情報を入力すること、およびコンピュータシステム７２０から情報を受け取ることを可能にする任意の他の装置も含んでいてもよい。

ステップの一部または全部は、例えば、プロセッサ、マイクロプロセッサ、プログラマブルコンピュータまたは電子回路等のハードウェア装置（またはハードウェア装置を使用すること）によって実行されてもよい。いくつかの実施形態では、極めて重要なステップのいずれか１つまたは複数が、そのような装置によって実行されてもよい。

一定の実装要件に応じて、本発明の実施形態は、ハードウェアまたはソフトウェアで実装されうる。この実装は、非一過性の記録媒体によって実行可能であり、非一過性の記録媒体は、各方法を実施するために、プログラマブルコンピュータシステムと協働する（または協働することが可能である）、電子的に読取可能な制御信号が格納されている、デジタル記録媒体等であり、これは例えば、フロッピーディスク、ＤＶＤ、ブルーレイ、ＣＤ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭまたはＦＬＡＳＨメモリである。したがって、デジタル記録媒体は、コンピュータ読取可能であってもよい。

本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法が実施されるように、プログラマブルコンピュータシステムと協働することができる、電子的に読取可能な制御信号を有するデータ担体を含んでいる。

一般的に、本発明の実施形態は、プログラムコードを備えるコンピュータプログラム製品として実装可能であり、このプログラムコードは、コンピュータプログラム製品がコンピュータ上で実行されるときにいずれかの方法を実施するように作動する。このプログラムコードは、例えば、機械可読担体に格納されていてもよい。

別の実施形態は、機械可読担体に格納されている、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためのコンピュータプログラムを含んでいる。

したがって、換言すれば、本発明の実施形態は、コンピュータプログラムがコンピュータ上で実行されるときに本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラムである。

したがって、本発明の別の実施形態は、プロセッサによって実行されるときに本明細書に記載のいずれかの方法を実施するために、格納されているコンピュータプログラムを含んでいる記録媒体（またはデータ担体またはコンピュータ読取可能な媒体）である。データ担体、デジタル記録媒体または被記録媒体は、典型的に、有形である、かつ／または非一過性である。本発明の別の実施形態は、プロセッサと記録媒体を含んでいる、本明細書に記載されたような装置である。

したがって、本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためのコンピュータプログラムを表すデータストリームまたは信号シーケンスである。データストリームまたは信号シーケンスは例えば、データ通信接続、例えばインターネットを介して転送されるように構成されていてもよい。

別の実施形態は、処理手段、例えば、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するように構成または適合されているコンピュータまたはプログラマブルロジックデバイスを含んでいる。

別の実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するために、インストールされたコンピュータプログラムを有しているコンピュータを含んでいる。

本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためのコンピュータプログラムを（例えば、電子的にまたは光学的に）受信機に転送するように構成されている装置またはシステムを含んでいる。受信機は、例えば、コンピュータ、モバイル機器、記憶装置等であってもよい。装置またはシステムは、例えば、コンピュータプログラムを受信機に転送するために、ファイルサーバを含んでいてもよい。

いくつかの実施形態では、プログラマブルロジックデバイス（例えばフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）が、本明細書に記載された方法の機能の一部または全部を実行するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイは、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するためにマイクロプロセッサと協働してもよい。一般的に、有利には、任意のハードウェア装置によって方法が実施される。

Claims (20)

1. 複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内のＮ個の光子事象を計数するように構成された装置であって、Ｎは、１より大きい自然数であり、Ｎは、好ましくは２であり、Ｎ個の光子事象は、時間的に重なり合う少なくともＮ個の単一光子事象の発生を表し、
   前記装置は、信号処理デバイスと前記感光性検出器とを備え、
   前記感光性検出器は、前記感光性検出器を用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性シーケンスを表すデジタルパターンを有する時間依存性デジタル信号を生成するように構成されており、
   前記デジタル信号内の各デジタルパターンは、少なくとも１つの光子と前記感光性検出器との相互作用の少なくとも１つの事象を表すデジタル値の連続シーケンスを有するデジタルパターン幅を有し、
   前記信号処理デバイスは、それぞれの前記デジタルパターン幅に依存する前記デジタル信号内の前記デジタルパターンからＮ個の光子事象を識別するように構成されており、
   前記Ｎ個の光子事象の量が計数される、
   装置。
2. 前記信号処理デバイスは、前記デジタルパターンの前記デジタルパターン幅が単一光子事象を表す前記デジタルパターン幅の１／Ｎ倍よりも大きい場合、前記デジタルパターンをＮ個の光子事象として識別するように構成されている、
   請求項１記載の装置。
3. 前記信号処理デバイスは、前記デジタルパターンの前記デジタルパターン幅が単一光子事象を表す前記デジタルパターン幅より大きく、かつ単一光子事象を表す前記デジタルパターン幅のＮ倍以下である場合、前記デジタルパターンをＮ個の光子事象として識別するように構成されている、
   請求項１または２記載の装置。
4. 前記装置は、前記信号処理デバイスが前記デジタルパターンを単一光子事象として識別すべく構成されるようにさらに構成されており、前記デジタルパターンの前記デジタルパターン幅が単一光子事象のインパルス応答の時間長のＸ倍を表す場合に、Ｘは、０．５～１．５の範囲内の実数であり、Ｘは、好ましくは１．０であり、前記装置は、好ましくは、識別された前記単一光子事象の計数も考慮するようにさらに構成されている、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の装置。
5. 前記信号処理デバイスは、前記デジタルパターンの前記デジタル値が光子と前記感光性検出器との相互作用の事象を表していない場合、または前記デジタルパターンの前記デジタルパターン幅が単一光子事象のインパルス応答の時間長のＹ倍よりも小さい場合に、前記デジタルパターンを偽陽性信号として識別するように構成されており、Ｙは、０．０～０．４９の範囲内の実数であり、Ｙは、好ましくは０．２４である、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の装置。
6. Ｘおよび／またはＹは、検出された事象の前記デジタルパターン幅の統計分布および／または検出システムの不完全性に依存する、
   請求項４または５記載の装置。
7. 光源は、照明光パルスのシーケンスを生成するように、または変調光を生成するように構成されている、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の装置。
8. デジタル照明データシーケンス生成ユニットは、前記照明光パルスのシーケンスの時間プロファイルまたは前記変調光の時間プロファイルを表すデジタル照明データシーケンスを生成するように構成されている、
   請求項７記載の装置。
9. 前記デジタル照明データシーケンスは、前記感光性検出器および／または前記デジタル信号内の前記デジタルパターンを用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性シーケンスを用いて規定された時間相関を有する、
   請求項８記載の装置。
10. 光源は、連続波特性を有する照明光を生成するように構成されており、
    トリガ信号生成ユニットは、有限時間長が導出される周期的トリガ信号を生成するように構成されている、
    請求項１から６までのいずれか１項記載の装置。
11. 前記周期的トリガ信号は、前記感光性検出器および／または前記デジタル信号内の前記デジタルパターンを用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性シーケンスを用いて規定された時間相関を有する、
    請求項１０記載の装置。
12. 好ましくは光学顕微鏡の形式であり、特に走査型顕微鏡または共焦点顕微鏡である撮像デバイスは、照明光で試料領域を照明するように構成されており、かつ／または、前記感光性検出器上で試料領域を撮像するように構成されている、
    請求項１から１１までのいずれか１項記載の装置。
13. 光の光子は、少なくとも１つの光子を放出することによる励起状態から基底状態への放射性変換から、または試料領域に由来するルミネセンス発光過程から、特に蛍光発光過程もしくは燐光発光過程に起因するルミネセンス発光過程から生じ、かつ／または、
    前記光子は、光源の反射光から生じる、
    請求項１から１２までのいずれか１項記載の装置。
14. 光源の全体的な光強度は、光子と前記感光性検出器との間の単一相互作用の少なくともいくつかが時間的に分解可能である方式で試料領域を照明するのに適するように選択されている、
    請求項１から１３までのいずれか１項記載の装置。
15. 前記デジタル信号のデジタルパターンは、下位標準化信号から上位標準化信号への変化または上位標準化信号から下位標準化信号への変化が生じる瞬間である第１のスイッチング瞬間と、上位標準化信号から下位標準化信号への変化または下位標準化信号から上位標準化信号への変化が生じる瞬間である第２のスイッチング瞬間と、を判別することによって生成され、判別された前記第１のスイッチング瞬間および判別された前記第２のスイッチング瞬間に依存して、デジタル値は、前記デジタルパターンに割り当てられる、
    請求項１から１４までのいずれか１項記載の装置。
16. 複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内におけるＮ個の光子事象は、２つの後続の光パルス間の時間長または走査型顕微鏡のピクセル滞留時間の少なくとも一部以下である少なくとも１つの有限時間長の間に計数され、かつ／または、少なくとも１つの有限時間長は、前記感光性検出器のアナログ信号がサンプリングされるサンプリング周波数に依存し、前記サンプリング周波数は、１ＭＨｚ～２０ＧＨｚの範囲内の値を有し、前記サンプリング周波数は、好ましくは１０ＧＨｚの値を有する、
    請求項１から１５までのいずれか１項記載の装置。
17. 複数の光子と感光性検出器との相互作用の事象の時間依存性シーケンス内のＮ個の光子事象を計数する方法であって、Ｎは、１より大きい自然数であり、Ｎは、好ましくは２であり、Ｎ個の光子事象は、時間的に重なり合う少なくともＮ個の単一光子事象の発生を表し、前記感光性検出器は、前記感光性検出器を用いた複数の光子の検出による事象の時間依存性シーケンスを表すデジタルパターンを有する時間依存性デジタル信号を生成し、前記デジタル信号内の各デジタルパターンは、少なくとも１つの光子と前記感光性検出器との相互作用の少なくとも１つの事象を表すデジタル値の連続シーケンスを有するデジタルパターン幅を有し、
    前記方法は、
    それぞれの前記デジタルパターン幅に依存する前記デジタル信号内の前記デジタルパターンからＮ個の光子事象を識別するステップと、
    前記Ｎ個の光子事象の量を計数するステップと、
    を含む方法。
18. 請求項１から１６までのいずれか１項記載の装置を動作させる、
    請求項１７記載の方法。
19. 偽陽性信号のより良い判別および／もしくは弁別は、単一光子事象の計数／測定／撮像のより高いダイナミックレンジおよび／もしくはより良い精度を有する計数／測定／撮像の結果によって実現され、前記Ｎ個の光子事象は、ノイズから独立しており、かつ／または、検出システムノイズへの依存性が存在しないかもしくは検出システムノイズへの依存性が低減されている、
    請求項１から１６までのいずれか１項記載の装置または請求項１７または１８記載の方法。
20. 請求項１から１６までまたは請求項１９のいずれか１項記載の信号処理デバイス上で実行される際に、請求項１７または１８記載の方法を実行するためのプログラムコードを有するコンピュータプログラム。

Images