JPWO2008084647A1 - レーザー顕微鏡 - Google Patents

Abstract

まず、ショットノイズと判断する閾値ｃを設定する（ΔＤｍａｘ＝ｃ）。Ｄ−ＦＦ２から入力される１ピクセル内の前半の積分結果ＡｎとＤ−ＦＦ１から入力される１ピクセル内の後半の積分結果Ｂｎの差の絶対値を求める（ΔＤ＝｜Ａｎ−Ｂｎ｜）。絶対値ΔＤと閾値ΔＤｍａｘを比較し、ΔＤ＜ΔＤｍａｘであればショットノイズは混入していないと判断し、Ａｎ＋Ｂｎを１ピクセルの積算データとして出力する。一方、ΔＤ＞ΔＤｍａｘであれば大きい値の積分期間にショットノイズが混入したと判断し、小さいほうの値を２倍して１ピクセルの積算データとして出力する。これにより、ショットノイズの影響を低減し、高Ｓ／Ｎ比で画像の形成が可能なレーザー顕微鏡とすることができる。

Description

本発明は、レーザー顕微鏡に関するものである。

レーザー顕微鏡は、一般に、光源から発せられた光束を標本上に集光させ、この集光スポットで照射（励起）された標本からの蛍光を光検出器で受光することによって、標本の画像情報を得ている。

このような蛍光レーザー走査顕微鏡で標本を観察する場合、観察する標本にダメージを与えないために、照射（励起）する光をできるだけ弱くして蛍光画像を得ることが望ましい。そのため、蛍光の検出効率を高めて弱い蛍光でも画像化できるようにしている。

その一つの方法として、光検出器からの微弱信号を最良のＳ／Ｎ比特性で増幅するために、光検出器の出力信号を積分増幅することが従来から行われている。通常、この積分回路では、ピクセルクロック（サンプリングクロック）ごとに、各画素の出力信号を順に積分するとともに、積分後に積分した信号をリセットする動作が行われている。このような方式のレーザー顕微鏡は、例えば特許第２５１６１１５号公報（特許文献１）に記載されている。
特許第２５１６１１５号公報

このようなレーザー顕微鏡においては、高感度の光検出を行うために、フォトマルチプライヤーチューブ（ＰＭＴ）等の高増幅度の光検出器が使用されている。このような、高増幅度の光検出器においては、ショットノイズの発生が避けられない。よって、１画素の積分時間内に短時間でも大きなショットノイズが発生すると、その影響により積分値が大きくなり、正確な輝度データが得られないことがある。そのため、レーザー顕微鏡としてのＳ／Ｎ比が低下してしまうという問題点がある。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、ショットノイズの影響を低減し、高Ｓ／Ｎ比で画像の形成が可能なレーザー顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を解決するための第１の手段は、レーザー光を発する光源と、前記光源から発せられたレーザー光を二次元に走査させながら標本に照射するとともに、前記標本から発せられた蛍光又は反射光を集光する光学系と、前記光学系により集光された前記標本からの蛍光又は反射光を受光して輝度信号に変換する光検出器と、クロック信号にしたがって前記光検出器の輝度信号を画素単位に積分する積分手段と、前記積分手段により積分した画素ごとの輝度信号により前記標本の画像を生成する画像生成回路とを備えたレーザ顕微鏡において、前記積分手段は、前記光検出器の輝度信号を入力して積分する積分器を２個備えるともに、前記２個の積分器の出力を演算する演算器とを備え、前記クロックの１周期を２つの期間に区分した各期間に相当する時間を前記積分器の積分期間として積分動作をさせ、前記各期間において前記積分器を順に切り換えながら前記輝度信号を積分するとともに、以下の条件で前記演算器から出力することを特徴とするレーザー顕微鏡である。

（１）２つの積分器の出力のうちいずれか一方のみ、閾値を越えた場合は、閾値を超えた積分器の出力を０と置き換え、残りの積分器の出力を２倍する。

（２）２つの積分器の積分値がいずれも閾値を越えた場合、又はいずれも閾値以下の場合は、２つの積分器の出力を加算する。

前記課題を解決するための第２の手段は、レーザー光を発する光源と、前記光源から発せられたレーザー光を二次元に走査させながら標本に照射するとともに、前記標本から発せられた蛍光又は反射光を集光する光学系と、前記光学系により集光された前記標本からの蛍光又は反射光を受光して輝度信号に変換する光検出器と、クロック信号にしたがって前記光検出器の輝度信号を画素単位に積分する積分手段と、前記積分手段により積分した画素ごとの輝度信号により前記標本の画像を生成する画像生成回路とを備えたレーザ顕微鏡において、前記積分手段は、前記光検出器の輝度信号を入力して積分する積分器を２個備えるともに、前記２個の積分器の出力を演算する演算器とを備え、前記クロックの１周期を２つの期間に区分した各期間に相当する時間を前記積分器の積分期間として積分動作をさせ、前記各期間において前記積分器を順に切り換えながら前記輝度信号を積分するとともに、以下の条件で前記演算器から出力することを特徴とするレーザ顕微鏡である。

（１）２つの積分器の出力の差の絶対値が、閾値を越えた場合は、２つ積分器の出力のうち、小さい方の出力を２倍する。

（２）２つの積分器の出力の差の絶対値が、閾値を越えない場合は、２つの積分器の出力を加算する。

前記課題を解決するための第３の手段は、レーザー光を発する光源と、前記光源から発せられたレーザー光を二次元に走査させながら標本に照射するとともに、前記標本から発せられた蛍光または反射光を集光する光学系と、前記光学系により集光された前記標本からの蛍光または反射光を受光して輝度信号に変換する光検出器と、クロック信号にしたがって前記光検出器の輝度信号を画素単位に積分する積分手段と、前記積分手段により積分した画素ごとの輝度信号により前記標本の画像を生成する画像生成回路とを備えたレーザー顕微鏡において、前記積分手段は、前記光検出器の輝度信号を入力して積分する積分器をＮ個（Ｎ≧２）備えるとともに、前記Ｎ個の積分器の出力を演算する演算器とを備え、１画素分の時間をＴ_０〜Ｔ、ｎ番目（ｎ＝１〜Ｎ）の積分器の積分時間をＴｓ_ｎ〜Ｔｅ_ｎとするとき、Ｔｓ_１＝Ｔ_０、Ｔｅ_ｎ＝Ｔ、Ｔ_０≦Ｔｓ_ｎ＜Ｔ、Ｔ_０＜Ｔｅ_ｎ≦Ｔであって、１画素の積分が完了した後、各積分器の出力の積分値が正常かどうかを判定し、ｎ番目（ｎ＝１〜Ｎ）の積分器の出力Ａ_ｎのうち、積分値が異常であるＭ個の積分器の出力を０とみなして、以下の加重加算式により、前記１画素の積分値Ｓを求めるものであることを特徴とするレーザー顕微鏡である。

前記課題を解決するための第４の手段は、前記第３の手段であって、積分値が予め定められた閾値を超えた積分器の数をａとするとき、予め定められた数をＫ（（Ｋは自然数で、Ｋ≦Ｎ−１））として
１≦ａ≦Ｋ …（２）
が成立するとき、前記ａ個の積分器の積分値が異常であると判断するものであることを特徴とするレーザー顕微鏡である。

本発明によれば、ショットノイズの影響を低減し、高Ｓ／Ｎ比で画像の形成が可能なレーザー顕微鏡を提供することができる。

本発明の実施の形態の１例であるレーザー顕微鏡の構成を示す概要図である。 積分増幅回路を中心とした、本発明の要部の例を説明するための図である。 図２に示す回路のタイミングチャートである。 ショットノイズを低減する演算を行う例のフローチャートである。

符号の説明

１…レーザー光源、２…コリメーターレンズ、３…ダイクロイックミラー、４…二次元走査光学系、５…対物レンズ、６…ＸＹステージ、７…標本、８…スキャナードライバー、９…集光レンズ、１０…蛍光フィルター、１１…光検出器、１２…積分増幅回路、１３…同期信号発生回路、１４…フレームメモリ、１５…Ｄ／Ａコンバーター、１６…モニター

図１は、本発明の実施の形態の１例であるレーザー顕微鏡の構成を示す概要図である。レーザー光源１から射出されたレーザー光はコリメーターレンズ２を通って平行光になり、ダイクロイックミラー３で反射されて二次元走査光学系４へ導かれ、さらに対物レンズ５を通ってＸＹステージ６に搭載された標本７上に光スポットを形成する。二次元走査光学系４は、例えば２つのガルバノミラースキャナーなどにより構成され、スキャナードライバー８からの駆動信号により制御されて標本７上の光スポットをＸ−Ｙ軸方向に二次元に走査する。

スポット光が照射された標本７からは蛍光（または反射光）が発生し、戻り光として光路を逆行して対物レンズ５を通って二次元走査光学系４へ導かれる。さらに、二次元走査光学系４でデスキャンニングされた後、ダイクロイックミラー３を透過して集光レンズ９へ導かれる。集光レンズ９により集光された蛍光は蛍光フィルター１０により波長選択され、フォトマルチプライヤーチューブ（ＰＭＴ）やフォトダイオード（ＰＤ）のような光検出器１１へ入射して電気信号に変換される。この実施の形態では、同期信号発生回路１３から出力されるピクセルクロックＰＩＸＣＬＫに同期して光検出器１１からのアナログ信号を、画素ごとに積分増幅して画像として表示する。

光検出器１１は、検出光の輝度信号を出力する。光検出器１１の輝度信号は積分増幅回路１２へ入力され、積分増幅回路１２において同期信号発生回路１３のピクセルクロックＰＩＸＣＬＫに同期して積分増幅され、デジタル信号に変換される。積分増幅回路１２の詳細については後述する。積分増幅されデジタル信号に変換された輝度データは、同期信号発生回路１３から出力された垂直同期信号ＶＤ、水平同期信号ＨＤ、ピクセルクロックＰＩＸＣＬＫに同期してフレームメモリ１４に格納される。画像を表示する場合は、フレームメモリ１４から輝度データを読み出し、Ｄ／Ａコンバーター１５でアナログ信号に変換されてモニター１６に表示される。

図２は、積分増幅回路１２を中心とした、本発明の要部の例を説明するための図である。ＰＭＴはフォトマルチプライヤーであり、光電変換を行う。ＰＩＸＣＬＫは画素に同期したクロックを意味する。

ＰＭＴからの出力電流を電流電圧変換器で電圧に変換し、リセット付き積分器Ａとリセット付き積分器Ｂに入力する。リセット付き積分器Ａとリセット付き積分器Ｂの出力は、アナログ加算器に入力される。アナログ加算器の出力は、サンプルホールド回路（Ｓ／Ｈ）に入力され、その出力がＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）に入力されデジタルデータに変換される。

Ｄ−ＦＦ１、Ｄ−ＦＦ２、Ｄ−ＦＦ３はＤフリップフロップを示す。演算器はＤ−ＦＦ１およびＤ−ＦＦ２でラッチされたデジタルデータを演算し、その結果は１ピクセルの画像輝度データとしてＤ−ＦＦ３に入力されラッチされる。

タイミング生成回路は、ＰＩＸＣＬＫから上記素子を制御するタイミング信号を生成する。図２中のＲＳＴ＿Ａ信号は、リセット付き積分器Ａのリセット信号を示す。“Ｈ”でリセット状態になる。ＲＳＴ＿Ｂ信号は、リセット付き積分器Ｂのリセット信号を示す。これも“Ｈ”でリセット状態になる。

ＳＨ信号は、Ｓ／Ｈ回路の制御信号を示し、”Ｈ”でサンプルして”Ｌ”でホールド状態になる。ＡＳ＿ＳＴはＡＤ変換開始信号を示す。この信号の立ち上がりでＡＤ変換を開始する。ＣＬＫ１は、Ｄ−ＦＦ１とＤ−ＦＦ２に入力するクロック信号、ＣＬＫ２はＤ−ＦＦ３に入力するクロック信号を示す。

以下、図に示す回路の作動を、図３に示すタイミングチャートを参照しながら説明する。

図３では、アナログ電圧波形（積分器の出力やアナログ加算器の出力）の極性は、わかりやすくするためにすべて正として示してある。また、ＡＤ変換はＰＩＸＣＬＫの周期の半分以内で終了することを前提とする。

積分器ＡはＰＩＸＣＬＫの”Ｈ”の領域で積分を行い、積分器Ｂは”Ｌ”の領域で積分を行う。”Ｈ”の時間長さと”Ｌ”の時間長さは同一である。リセット区間中の各積分器の出力は”０”になる。積分器Ａと積分器Ｂのリセット区間はずれているのでその出力を加算するとＳＨ信号が”Ｈ”のタイミングで積分器Ａの出力電圧と積分器Ｂの出力電圧を交互に検出することが可能となる。

サンプルホールドされた出力電圧を、ＡＳ＿ＳＴ信号のタイミングでＡＤ変換する。Ａ／Ｄの出力データを、Ａ０、Ｂ０、Ａ１、Ｂ１、・・・・とする。積分器Ａで増幅した最初の出力データＡ０とし、積分器Ｂで増幅した最初の出力データＢ０としている。以後、積分器Ａの出力はＡ１、Ａ２、・・・となり、積分器Ｂの出力はＢ１、Ｂ２、・・・となる。

Ｄ−ＦＦ１はＣＬＫ１の立ち上がりでＡ／Ｄ出力データをラッチする。Ｄ−ＦＦ２はＣＬＫ１の立ち上がりでＤ−ＦＦ１の出力データをラッチする。Ｄ−ＦＦ１の出力とＤ−ＦＦ２の出力を演算して、その結果をＤ−ＦＦ３でＣＬＫ２の立ち上がりでラッチする。Ｄ−ＦＦ３の出力には、Ａ０とＢ０、Ａ１とＢ１、Ａ２とＢ２、・・・のそれぞれの演算結果が１画素の積分データとして順番に現れる。

演算器はソフトウェアまたはハードウェアで実現されるが、目的に応じて演算式を変更することが可能である。ここではＰＭＴ（光電子増倍管）がもつショットノイズを低減する演算を行う場合について、図４のフローチャートで説明する。

ＰＭＴのショットノイズが混入した場合、１ピクセル内の前半の積分結果Ａｎと後半の積分結果Ｂｎの出力値の差が大きくなることを利用し、出力差の絶対値｜Ａｎ−Ｂｎ｜があらかじめ設定した閾値ｃよりも大きい場合、大きい側の出力値は無視し、小さい側の出力値を２倍することでショットノイズを排除する。

まず、ショットノイズと判断する閾値ｃを設定する（ΔＤｍａｘ＝ｃ）。Ｄ−ＦＦ２から入力される１ピクセル内の前半の積分結果ＡｎとＤ−ＦＦ１から入力される１ピクセル内の後半の積分結果Ｂｎの差の絶対値を求める（ΔＤ＝｜Ａｎ−Ｂｎ｜）。絶対値ΔＤと閾値ΔＤｍａｘを比較し、ΔＤ＜ΔＤｍａｘであればショットノイズは混入していないと判断し、Ａｎ＋Ｂｎを１ピクセルの積算データとして出力する。一方、ΔＤ＞ΔＤｍａｘであれば大きい値の積分期間にショットノイズが混入したと判断し、小さいほうの値を２倍して１ピクセルの積算データとして出力する。

ＰＭＴのショットノイズは使用条件により出方が変わるため、閾値ｃは実際の画像を見ながら最適になるように調整することが望ましい。

又、ショットノイズの検出を、出力差の絶対値｜Ａｎ−Ｂｎ｜に基づいて行う代わりに、出力の大きさＡｎ、Ｂｎが所定の閾値を超えた場合にショットノイズが混入したとして、超えた方の値を無視し、他方を２倍して１ピクセルの積算データとして出力するようにしてもよい。この場合、出力の大きさＡｎ、Ｂｎが共に所定の閾値を超えた場合には、ショットノイズでなく、信号が大きくなったものとして、通常どおり、（Ａｎ＋Ｂｎ）を１ピクセルの積算データとして出力する。また、出力の大きさＡｎ、Ｂｎが共に所定の閾値を超えない場合は、ショットノイズが混入していないとして、（Ａｎ＋Ｂｎ）を１ピクセルの積算データとして出力する。

以上説明した実施の形態は、１画素に対応する時間を２つの等しい時間帯に分けて、各時間帯の積分データにショットノイズが混入しているかどうかを判断し、ショットノイズが混入している場合には、ショットノイズが混入している側のデータを無視して、他方の積分値を２倍して出力するものであった。

一般には、１画素に対応する時間を２つ以上の時間帯（オーバラップしていてもよい）に分けて、そのうちのいくつかにショットノイズが混入しているかどうかを判断し、ショットノイズが混入している時間帯のデータを無視して、他の時間帯のデータだけを用いて計算を行い、１ピクセルの積算データとして出力するようにしてもよい。

この場合には、例えば、時間帯の数をＮ個とし、各時間帯での積分データのうち予め定められた閾値を超えたものの数をａとするとき、予め定められた数をＫ（Ｋは自然数）として
１≦ａ≦Ｋ
であるときに、閾値を超えた時間帯にショットノイズが混入したものとしてもよい。前述した実施の形態は、Ｎ＝２、Ｋ＝１の特別な場合に相当する。

又、この場合には、ｎ番目（ｎ＝１〜Ｎ）の積分器の出力Ａ_ｎのうち、積分値が異常であるＭ個の積分器の出力を０とみなして、以下の加重加算式により、前記１画素の積分値Ｓを求め、１ピクセルの積算データとして出力するようにしてもよい。ただし、１画素分の時間をＴ_０〜Ｔ、ｎ番目（ｎ＝１〜Ｎ）の積分器の積分時間をＴｓ_ｎ〜Ｔｅ_ｎとし、Ｔｓ_１＝Ｔ_０、Ｔｅ_ｎ＝Ｔとする。

上述した、実施の形態は、Ｎ＝２、（Ｔｅ_１−Ｔｓ_１）＝（Ｔｅ_２−Ｔｓ_２）＝（Ｔ−Ｔ_０）／２にあたる特別の場合である。但し、Ｋ＜ａ≦Ｎの場合は、ノイズ混入ではないと考えて、積分器の出力を全て加算する。

本発明により、特に目立つ画像輝度が０近傍の暗い状態に発生するショットノイズが軽減できるため、従来のレーザー顕微鏡画像に比べＳ／Ｎが良い画像が得られる特徴がある。

Claims (4)

1. レーザー光を発する光源と、
   前記光源から発せられたレーザー光を二次元に走査させながら標本に照射するとともに、前記標本から発せられた蛍光又は反射光を集光する光学系と、
   前記光学系により集光された前記標本からの蛍光又は反射光を受光して輝度信号に変換する光検出器と、
   クロック信号にしたがって前記光検出器の輝度信号を画素単位に積分する積分手段と、
   前記積分手段により積分した画素ごとの輝度信号により前記標本の画像を生成する画像生成回路とを備えたレーザー顕微鏡において、
   前記積分手段は、前記光検出器の輝度信号を入力して積分する積分器を２個備えるともに、前記２個の積分器の出力を演算する演算器とを備え、
   前記クロックの１周期を２つの期間に区分した各期間に相当する時間を前記積分器の積分期間として積分動作をさせ、前記各期間において前記積分器を順に切り換えながら前記輝度信号を積分するとともに、以下の条件で前記演算器から出力することを特徴とするレーザー顕微鏡。
   （１）２つの積分器の出力のうちいずれか一方のみ、閾値を越えた場合は、閾値を超えた積分器の出力を０と置き換え、残りの積分器の出力を２倍する。
   （２）２つの積分器の積分値がいずれも閾値を越えた場合、又はいずれも閾値以下の場合は、２つの積分器の出力を加算する。
2. レーザー光を発する光源と、
   前記光源から発せられたレーザー光を二次元に走査させながら標本に照射するとともに、前記標本から発せられた蛍光又は反射光を集光する光学系と、
   前記光学系により集光された前記標本からの蛍光又は反射光を受光して輝度信号に変換する光検出器と、
   クロック信号にしたがって前記光検出器の輝度信号を画素単位に積分する積分手段と、
   前記積分手段により積分した画素ごとの輝度信号により前記標本の画像を生成する画像生成回路とを備えたレーザー顕微鏡において、
   前記積分手段は、前記光検出器の輝度信号を入力して積分する積分器を２個備えるともに、前記２個の積分器の出力を演算する演算器とを備え、
   前記クロックの１周期を２つの期間に区分した各期間に相当する時間を前記積分器の積分期間として積分動作をさせ、前記各期間において前記積分器を順に切り換えながら前記輝度信号を積分するとともに、以下の条件で前記演算器から出力することを特徴とするレーザー顕微鏡。
   （１）２つの積分器の出力の差の絶対値が、閾値を越えた場合は、２つ積分器の出力のうち、小さい方の出力を２倍する。
   （２）２つの積分器の出力の差の絶対値が、閾値を越えない場合は、２つの積分器の出力を加算する。
3. レーザー光を発する光源と、
   前記光源から発せられたレーザー光を二次元に走査させながら標本に照射するとともに、前記標本から発せられた蛍光または反射光を集光する光学系と、
   前記光学系により集光された前記標本からの蛍光または反射光を受光して輝度信号に変換する光検出器と、
   クロック信号にしたがって前記光検出器の輝度信号を画素単位に積分する積分手段と、
   前記積分手段により積分した画素ごとの輝度信号により前記標本の画像を生成する画像生成回路とを備えたレーザー顕微鏡において、
   前記積分手段は、前記光検出器の輝度信号を入力して積分する積分器をＮ個（Ｎ≧２）備えるとともに、前記Ｎ個の積分器の出力を演算する演算器とを備え、
   １画素分の時間をＴ_０〜Ｔ、ｎ番目（ｎ＝１〜Ｎ）の積分器の積分時間をＴｓ_ｎ〜Ｔｅ_ｎとするとき、Ｔｓ_１＝Ｔ_０、Ｔｅ_ｎ＝Ｔ、Ｔ_０≦Ｔｓ_ｎ＜Ｔ、Ｔ_０＜Ｔｅ_ｎ≦Ｔであって、
   １画素の積分が完了した後、各積分器の出力の積分値が正常かどうかを判定し、ｎ番目（ｎ＝１〜Ｎ）の積分器の出力Ａ_ｎのうち、積分値が異常であるＭ個の積分器の出力を０とみなして、以下の加重加算式により、前記１画素の積分値Ｓを求めるものであることを特徴とするレーザー顕微鏡。
   

   
4. 請求項３に記載のレーザー顕微鏡であって、積分値が予め定められた閾値を超えた積分器の数をａとするとき、予め定められた数をＫ（Ｋは自然数で、Ｋ≦Ｎ−１）として
   １≦ａ≦Ｋ …（２）
   が成立するとき、前記ａ個の積分器の積分値が異常であると判断するものであることを特徴とするレーザー顕微鏡。

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