CN109477796A - 允许更高光强度的利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法 - Google Patents

Abstract

说明了一种利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法，其中借助脉冲式光源(12)周期性地以激发光脉冲对样品(36)进行激发以发射荧光光子，其中在每两个相继的激发光脉冲之间定义测量间隔；借助探测器(42)检测所述荧光光子并且产生代表检测到的荧光光子的模拟探测器信号；基于所述探测器信号确定探测时间，所述荧光光子在相应的测量间隔内在所述探测时间上被所述探测器(42)探测到；基于检测到的荧光光子的探测时间，确定至少一个表征荧光衰减特性的参量，以及借助所述表征参量进行成像。在相应的测量间隔内在多个采样间隔内对所述模拟探测器信号进行采样并且将所述模拟探测器信号转换成离散的配属于各个采样间隔的信号值的序列。借助属于相应的测量间隔的离散信号值序列，确定在该测量间隔内是否检测到多于预定数量的荧光光子。当检测到多于该预定数量的荧光光子时，放弃将该测量间隔用于确定所述表征参量。

Description

允许更高光强度的利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像 显微学方法

技术领域

本发明涉及一种根据权利要求1前序部分的利用利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法以及一种根据权利要求16前序部分的用于实施这样的方法的显微镜。

背景技术

荧光寿命成像显微学，简称FLIM(“fluorescence lifetime imagingmicroscopy”)是一种荧光显微成像方法，该荧光显微成像方法基于对荧光分子的激发态的不同寿命的测量。借助测得的寿命例如可以推断出荧光分子的环境的特性，例如pH值、温度、离子浓度、FRET转移(FRET＝“Resonance Energy Transfer”，荧光共振能量转移)等。

荧光寿命可以直接在时间范围内确定(“时域寿命测量”)或者在一种备选的方法中在频率范围内确定(“频域寿命测量”)。在时间范围内的确定可以根据所谓的时间相关单光子计数、简称TCSPC(“time correlated single photon counting”)的方法来实现。在该方法中，单个地检测由于周期性地以激发光脉冲进行激发而释放的光子。为此与此相应地需要能够实现这样的单光子检测的探测器。所使用的激发光脉冲在此通常具有皮秒范围内的脉冲持续时间，该脉冲持续时间明显短于典型的处于纳秒范围内的荧光寿命。通常测量在激发光脉冲与紧接着其的由探测器检测到荧光信号之间的时间。这样所检测的荧光光子然后经由多次测量而汇集成直方图。在这样的直方图中绘出关于测得的时间的光子数量。以该方式通常能够观察到由检测到的单光子所代表的荧光强度的与时间相关的指数型减少，由此确定荧光寿命。

此时，上述基于单光子计数的方法的问题在于，传统的探测器紧接着在检测到一个单个光子之后在一定的时间段上不再次准备好证实另一个光子。该时间段也称为探测器的死区时间。传统探测器的典型死区时间处于大约50纳秒至100纳秒的范围内。因此，在所观察的在两个相继的激发光脉冲之间定义的测量间隔内，通常限制于探测到的第一荧光光子。

由于仅观察到在一个激发光脉冲之后相应出现的第一荧光光子，可能出现较小的时间份额在直方图中的权重较高。该使测量结果错误的较高权重在专业圈内也称为堆积效应。为了避免该堆积效应，典型地这样调整入射的激发光脉冲的强度，使得每个激发光脉冲仅释放1/10的光子。在该调整中存在如下可能性，即：对于每个激发光脉冲检测两个荧光光子，存在大约1％的可能性。然后可以忽略堆积效应。然而，这样强烈减小激发光强度导致相应长的曝光时间，这又使得该方法难以广泛应用。

为了解决以上所阐述的问题，在现有技术中存在一系列方案。一方面，在文献DE10 2011 055 330 A1、DE 10 2011 055 945 A1和DE 102011 052 334 A1中这样提出并行化分析电子装置，使得从探测器信号获取的数字数据序列被传输至能够实现对数据序列的快速信息处理的串并转换器。然而，分析电子装置的该并行化在技术上是耗费的并且因此涉及巨大的成本。

在WO 2010/089363 A1中提出对堆积效应进行数值修正。然而，该数值修正以期望结果的模型为前提并且因此不能通用。

在DE 43 39 784 A1中公开一种具有高时间分辨率的时间测量装置。该装置利用时间-幅度转换器工作，在该时间-幅度转换器下游连接有模数转换器。所述装置由于该转换器布置结构而相对耗费。相同的情况适用于由US 7 999 238 B2已知的时间测量装置，在该时间测量装置中使用时间数字转换器，该时间数字转换器的主要组成部分是沿着延迟线路的比较器级联。

对于现有技术最后参考US 7 215 421 B2，由其已知所谓的用于荧光寿命测量的时间窗方法。该方法能够以相对小的设备耗费实现，但在时间分辨率和信号利用率方面受到限制。利用CCD或CMOS相机工作的时间窗方法具有类似的缺点。

发明内容

本发明的任务是，给出一种荧光寿命成像显微学方法以及一种用于构成用于实施这样的方法的显微镜，所述方法和所述显微镜能够实现以相对小的技术耗费在避免堆积效应的情况下提高激发光强度。

本发明通过独立权利要求的技术方案来解决所述任务。

本发明规定一种利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法，在该方法中，借助脉冲式光源周期性以激发光脉冲对样品进行激发以发射荧光光子，其中在每两个相继的激发光脉冲之间定义测量间隔，借助探测器检测所述荧光光子并且产生代表检测到的荧光光子的模拟探测器信号，基于该探测器信号确定探测时间，所述荧光光子在相应的测量间隔内在所述探测时间上被探测器探测到，基于检测到的荧光光子的探测时间确定至少一个表征荧光衰减特性的参量，以及借助该表征参量进行成像。按照本发明，在相应的测量间隔内在多个采样间隔内对所述模拟探测器信号进行采样并且将其转换成离散的配属于各个采样间隔的信号值的序列。借助属于相应的测量间隔的离散信号值序列，确定在所述测量间隔内是否检测到多于预定数量的荧光光子。当检测到多于该预定数量的荧光光子时，放弃将所述测量间隔用于确定所述表征荧光衰减特性的参量，其中，所述预定数量等于或大于1。

亦即，本发明规定将每个在两个相继的激发光脉冲之间定义的测量间隔划分成多个采样间隔，在所述多个采样间隔内对由探测器提供的模拟探测器信号进行数字化。在此，所述采样间隔明显小于所期望的荧光衰减时间。探测器信号的该数字化提供如下可能性：使探测器信号好像经历模式识别，即在探测器信号内识别配属于一个或多个光子的信号段。然后，借助该识别出的信号段可以确定在相应观察的测量间隔内是否已经由探测器检测到多于预定数量的荧光光子。如果是这样的情况，则不考虑将该测量间隔用于确定表征荧光衰减特性的参量。预定的光子数量在此在考虑所使用的探测器的死区时间的情况下这样选择，使得可靠地避免堆积效应。优选地，该数量等于1，即只要在所观察的测量间隔内在模式识别的路径中识别到两个、三个或更多个光子，则放弃将该测量间隔用于确定表征参量。

在每两个相继的激发光脉冲之间定义的测量间隔不必等于这两个脉冲之间的时间距离。因此也可想到的是，在所提及的两个激发光脉冲中的第一个激发光脉冲之后不久才开始所述测量间隔。

表征荧光衰减特性的参量例如是荧光衰减时间，该荧光衰减时间能够从经由直方图获得的指数型荧光衰减曲线中推导出。然而，所提及的表征参量不限于这样的衰减时间。例如可能的是，表征参量从多个指数型荧光衰减曲线的叠加得出并且因此在考虑多个荧光衰减时间的情况下获得。同样地，所提及的参量可以由荧光衰减曲线自身所表示。

按照本发明放弃在其中例如检测到多于一个荧光光子的测量间隔，能够实现在避免不期望的堆积效应的同时提高激发光强度。如开头提到的那样，可相比的目的在于避免堆积效应的传统方法典型地以如下激发光强度工作，该激发光强度这样选择，使得对于每个激发光脉冲仅检测1/10个荧光光子，这相当于10％的利用率。与此相反地，在按照本发明的方法中能够以最优的光强度工作，该最优的光强度对于每个测量间隔引起一个光子。因此，从荧光光子的泊松分布出发，在期望值为n个光子的情况下存在x个光子的概率等于：

P_n(x)＝n^x/x！·e^-n。

对于x＝1的情况，通过对于n＝1时P_n(1)＝最大，结果得出对于每个激发光脉冲的最大光子数量P₁(1)＝37％。因此，将该值与常见的10％利用率相比，上升了3.7倍。

优选地，借助模数转换器对模拟探测器信号进行数字化。以该方式能够特别简单地将模拟探测器信号转变成离散信号值序列，该离散信号值序列又能被传输给按照本发明的模式识别。

备选地，借助比较器在应用阈值的情况下对模拟探测器信号进行数字化，从而离散信号值相应地等于第一二进制值或等于第二二进制值。在按照本发明的方法的该设计方案中，通过对模拟探测器信号进行数字化而产生的数据流的信号值可以相应地仅具有两种值，例如0或1，这简化了模式识别。

优选地，在配属于相应的测量间隔的离散信号值序列内，将全部等于第一二进制值的信号值子序列定义为光子间隔，并且当在光子间隔中所包含采样间隔的数量超过预定的采样间隔数量时，确认在所述测量间隔内存在多于一个的荧光光子。光子间隔的该定义使得能够以特别简单的方式确认在所观察的测量间隔内是否检测到多于一个的光子，并且必要时放弃将该测量间隔用于确定表征荧光衰减特性的参量。

优选地，在测量间隔内，将首先具有第一二进制值的那个采样间隔定义为光子间隔的始端，而将接着具有第二二进制值的那个采样间隔定义为光子间隔的末端，其中，借助光子间隔的始端和末端确定所提及的数量。在该实施方式中，按照本发明的模式识别因此简化为确定例如具有值1作为光子间隔的始端的第一采样间隔以及确定例如具有值0作为光子间隔的末端的第一采样间隔。

在特别优选的实施方案中，在参考测量中根据下列公式来求取用于预定像素的激发光脉冲的强度：

I_ex(x，y)＝I·N(x，y，0)/N(x，y，1)

其中，

I表示在参考测量中的强度，

I_ex表示待求取的强度，

N(x，y，k)表示测量间隔的总数，在所述测量间隔中检测到k＝1或k＝0个荧光光子，以及

(x，y)表示像素的位置。

激发光脉冲的强度可以针对预定像素优选这样调整，使得其中相应地检测到正好一个荧光光子的测量间隔的总数等于其中没有检测到荧光光子的测量间隔的总数。

优选地，按照本发明的显微学方法在使用的共焦扫描显微镜或多光子显微镜情况下实施。因此，不仅共焦扫描显微镜而且多光子显微镜本身就已经具有对于实施按照本发明的方法所需要的仪器技术的主要部分、尤其是脉冲式激光源。

一种特别优选的实施方式规定以上所说明的方法不是应用于整个测量间隔，而是应用于不同的在所述测量间隔内定义的间隔分段。亦即，该进一步扩展方案可以被视为仅涉及整个测量间隔的基础方法的扩展方案。在所述基础方法的该扩展方案中，在相应的测量间隔内定义不同的间隔分段，其中，然后针对这些间隔分段中的每个间隔分段单独确定在所述测量间隔内是否检测到多于预定数量的荧光光子。当在所观察的间隔分段内检测到多于预定数量的荧光光子时，放弃将该间隔分段用于确定表征荧光衰减特性的参量。在此，每个间隔分段具有多个采样间隔。

通过在基础方法的该扩展方案中规定将测量间隔划分为不同的间隔分段，能够显著提高光子利用率。在此，按照本发明的不同间隔分段的定义可这样理解，即，这些间隔分段之一也可以由测量间隔本身给出。

优选地，针对相应的测量间隔的每个间隔分段确定表征荧光衰减特性的参量并且由这些针对各个间隔分段确定的表征参量求取涉及整个测量间隔的表征参量。如果例如表征荧光衰减特性的参量由荧光衰减曲线给出，则在该实施方式中将涉及不同的间隔分段的荧光衰减曲线(其此外也称为分段的衰减曲线)组合成涉及整个测量间隔的总衰减曲线。

优选地，借助如下的系数求取涉及整个测量间隔的表征参量，所述系数从其中检测到预定数量的荧光光子的间隔分段的数量和其中没有检测到光子的间隔分段的数量中确定。该系数尤其是用于使得针对各个间隔分段单独确定的衰减曲线可以组合一个连续的总衰减曲线，该总衰减曲线然后可被传输至进一步的分析。

优选地，借助如下的模型函数来分析涉及整个测量间隔的表征参量，在所述模型函数中考虑了在间隔分段所检测到的荧光光子的数量。在此，上述模型函数可以在考虑基于所述方法的光子统计的情况下适当地选择。

在另一种实施方式中，所述不同的间隔分段包括至少两个分段，所述至少两个分段在测量间隔内带有或没有时间重叠地彼此相接。

在一种备选的实施方式中，所述不同的间隔分段包括第一分段和至少一个第二分段，所述第一分段由测量间隔给出，所述第二分段的始端相对于所述测量间隔的始端延迟，而所述第二分段的末端与所述测量间隔的末端重叠。在该实施方式中能够实现间隔分段的时间划分，利用该时间划分能够提高荧光光子的利用率。

根据本发明的另一方面，设置一种按照并列权利要求16的用于实施利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法的显微镜。

因此，用于实施利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法的显微镜包括光源、探测器和处理单元。所述光源构成用于以激发光脉冲对样品进行激发以发射荧光光子。在每两个相继的激发光脉冲之间定义测量间隔。所述探测器构成用于检测荧光光子和产生代表检测到荧光光子的模拟探测器信号。所述处理单元构成用于：基于所述探测器信号确定探测时间，荧光光子在相应的测量间隔内在所述探测时间上由探测器探测到；基于检测到的荧光光子的探测时间，确定至少一个表征荧光衰减特性的参量；以及借助所述表征参量进行成像。按照本发明，所述处理单元构成用于在相应的测量间隔内在多个采样间隔内对所述模拟探测器信号进行采样并且将所述模拟探测器信号转换为离散的配属于各个采样间隔的信号值的序列。所述处理单元构成用于：借助属于相应的测量间隔的离散信号值序列，确定在该测量间隔内是否检测到多于预定数量的荧光光子；并且当检测到多于该预定数量的荧光光子时，放弃将该测量间隔用于确定表征荧光衰减特性的参量，其中，该预定数量等于或大于1。

优选地，所述处理单元包括构成用于将模拟探测器信号数字化的模数转换器。该处理单元可以包括比较器，该比较器构成用于在应用阈值的情况下将模拟探测器信号数字化，从而离散信号值相应地等于第一二进制值或等于第二二进制值。

在按照本发明的显微镜的一种优选实施方案中，除了确定用于检测荧光光子的探测器之外还设有另外的探测器，该另外的探测器构成用于检测激发光脉冲并且产生代表该检测到的激发光脉冲的模拟激发信号，其中，所述处理单元构成用于根据采样间隔对模拟激发信号进行采样并且将该模拟激发信号转换成离散的配属于各个采样间隔的激发信号值的序列。该离散激发信号值序列形成数据流，该数据流被用于确定测量间隔并且因此被用作用于所求取的荧光光子探测时间的参考。

优选地，所述处理单元包括用于示出调整信息的显示器。利用在该显示器上示出的调整信息可以为用户提供辅助工具，该辅助工具能够使得用户最优地调整显微镜或调整处理单元的工作方式。例如可以让用户知道在测量间隔内的平均荧光光子数量。在此，平均光子数量可以涉及整个拍摄区域或者仅涉及该拍摄区域的部分区域。调整信息可以以数量形式和/或以图示形式显示给用户。对于在仅一个样品地点的拍摄，例如可以以两个柱形符号的形式显示调整信息，所述两个柱形符号例如表明无荧光光子的测量间隔的数量和例如有一个唯一的荧光光子的测量间隔的数量。用户然后可以这样调整激发光强度，使得两个柱形符号在显示器上具有相同的长度。

附图说明

以下借助附图更详细地阐述本发明，其中：

图1示出共焦扫描显微镜，该共焦扫描显微镜是按照本发明的显微镜的一个实施例；

图2示出阐明模拟探测器信号的按照本发明的采样的曲线图；

图3示出如下曲线图，该曲线图借助示例示出所产生的激光信号和探测器信号，在该示例中，在所观察的测量间隔内检测到正好一个荧光光子；

图4示出涉及根据图3的示例的直方图；

图5示出如下曲线图，该曲线图示出另外的示例性的激光信号和探测器信号；

图6至9示出如下曲线图，这些曲线图示出对测量间隔进行分段的不同示例；以及

图10至13示出如下曲线图，该曲线图示出分段的荧光衰减曲线如何彼此适配。

具体实施方式

图1示出共焦扫描显微镜10，该共焦扫描显微镜是按照本发明的显微镜的一个实施例。

共焦扫描显微镜10具有脉冲式激光源12，该激光源构成用于以周期性的激发光脉冲发射光。在图1中用14表示的激发光射入分光镜16，该分光镜将激发光14分为透射部分18和反射部分20。

透过分光镜16的激发光18穿过激发孔板22并且然后在二向色分光镜24上朝扫描单元26的方向反射。扫描单元26包含万向节悬挂的扫描反射镜28，该扫描反射镜将激发光14朝扫描透镜30的方向反射。在穿过扫描透镜30和镜筒透镜32之后，激发光进入显微镜物镜34，该显微镜物镜将激发光18引导到样品36上。

在样品36的被激发光照射的区域中，荧光分子被激发以发射荧光38。形成荧光38的荧光光子沿着如下光路径沿相反的方向传播回到分光镜24，激发光18在该光路径上从二向色分光镜24出发到达样品36中。在穿过分光镜24和探测孔板40之后，荧光然后到达第一探测器42。第一探测器42将所接收的荧光38转换为模拟探测器信号43，该模拟探测器信号然后被传输至处理单元44。该处理单元44构成用于以预定的采样率对所述模拟探测器信号43进行采样并且因此将该模拟探测器信号43转换为数字探测器信号。该数字探测器信号由离散信号值序列形成，所述离散信号值配属于各个对应于采样率的采样间隔。出于对模拟探测器信号43进行采样的目的，所述处理单元44包含比较器46。取代比较器46，也可以设有模数转换器。

除了将所接收的荧光38转换成模拟探测器信号的第一探测器42，显微镜10具有第二探测器48，该第二探测器48设置在由分光镜16分支出的光路中。因此，第二探测器48接收由激光源12发射的激发光14的由分光镜16反射的部分20。第二探测器48将在分光镜16上反射的激发光20转换为模拟激发信号49并且将该模拟激发光信号传输至处理单元44。处理单元44以预定的采样率对被传输给其的模拟激发信号49进行采样并且因此将模拟激发信号49转换为数字信号，该数字信号由离散的配属于各个采样间隔的激发信号值的序列形成。为此，处理单元44又具有在图1中未明确示出的比较器或模数转换器。由第二探测器48提供的模拟激发信号49和由此由处理单元44产生的数字信号此外也称为模拟的或数字的激光信号。

处理单元44此外构成用于以本身已知的方式操控扫描单元28。此外，处理单元44具有显示器56，例如显示屏。

在本发明的上下文中，处理单元44尤其是具有从由探测器42提供的模拟探测器信号43中确定探测时间的函数，探测器42在所述探测时间上接收从样品36中释放的荧光光子。处理单元44基于这些探测时间确定表征荧光衰减特性的参量，例如荧光衰减时间。为了避免开头阐述的堆积效应，处理单元44按照本发明构成用于基于数字探测器信号确定在测量间隔内是否由探测器42检测到多于预定数量的荧光光子，所述测量间隔例如由两个相继的激发光脉冲来定义。如果是这样的情况，则处理单元44排除该测量间隔用于确定表征荧光衰减特性的参量。

处理单元44的上述函数在下面借助在图2至5中示出的曲线图示例性地阐明。在此，此外由如下方式得出：当处理单元44确认在所观察的测量间隔内检测到多于一个荧光光子时，处理单元44放弃将该测量间隔用于确定荧光衰减特性。

根据图2的曲线图示出在两个相继的激发光脉冲之间定义的测量间隔，探测器42在该测量间隔内检测荧光光子并且产生相应的模拟探测器信号43。如图2还示出的那样，所述测量间隔通过由处理单元44对模拟探测器信号43采样而被划分为多个采样间隔。在图2中还示出被比较器46所使用的阈值，基于该阈值，模拟探测器信号在每个采样间隔中要么被分配二进制值0或二进制值1。如果模拟探测器信号在所观察的采样间隔中小于或等于所述阈值，则该采样间隔被分配二进制值0。而如果数字探测器信号在采样间隔中大于所述阈值，则该采样间隔被分配二进制值1。因此，在根据图2的示例中，在测量间隔的中间区域中得到定义光子间隔的二进制值1的子序列。因为在图2所示的示例中，在所观察的测量间隔中检测到正好一个荧光光子，所以该测量间隔被处理单元44考虑用于确定荧光衰减特性。

此外，在图2中示出荧光衰减曲线，以便阐明采样间隔的持续时间明显短于荧光衰减时间，所述采样间隔的持续时间对应于被信号处理单元44使用的采样率。

在根据图3的曲线图中，对于在一个测量间隔内由第一探测器42检测到正好一个荧光光子的情况，示出由第二探测器48产生的模拟激光信号、由此通过由信号处理单元44的采样而产生的数字激光信号、由第一探测器42产生的模拟探测器信号、由此由信号处理单元44产生的数字探测器信号以及由信号处理单元44出于信号采样的目的所使用的采样率。如由图3还可得出的那样，信号处理单元44借助数字激光信号和数字探测器信号的上升沿确定如下时间，在所述时间上在所观察的测量间隔内由探测器42检测到荧光光子。探测时间在该图中以Δt表示。

图4示出示例性的直方图，该直方图示出多个单个测量的结果，其中，在图4中，符号“+1”参考在图3中示出的测量间隔。因此示出探测到光子的各单个测量的频率，其中被测量的探测时间相应地为t。

在图5中示出模拟激光信号或数字激光信号以及模拟探测器信号或数字探测器信号的一些示例性的曲线。在以上说明的实施例中，仅借助探测器信号在所观察的测量间隔内检测到正好一个光子的情况对于荧光衰减特性的确定有贡献并且因此对于图4所示类型的直方图的填充有贡献。尤其是，放弃将其中检测到两个或更多个光子的那些测量间隔用于确定表征荧光衰减特性的参量。

在上面参考图1至5阐述了按照本发明的方法的实施例，在所述方法中，当处理单元44确认在正在观察的测量间隔内检测到多于一个的荧光光子时，放弃将该测量间隔用于确定荧光衰减特性。在该实施例中，通过放弃具有多于一个荧光光子的测量间隔，碰到探测器42的全部荧光光子的大约63％的部分在确定荧光衰减特性时保持未被利用。因此，在下面将阐述先前说明的基础方法的扩展方案，该扩展方案能够实现考虑将在基础方案中未被利用的荧光光子的一部分也用于分析。

该按照本发明的扩展方案规定，将所述基础方法应用到不同的间隔分段上，所述不同的间隔分段在相应的测量间隔内定义。用于测量间隔的这种分段的一个示例在根据图6的曲线图中阐明。

在图6中，测量间隔被定义在开始时刻t_A和结束时刻t_E之间。在根据图6的分段中，测量间隔被划分为第一间隔分段A和第二间隔分段B。间隔分段A从开始时刻t_A延伸至时刻t₁。间隔分段B从时刻t1延伸至结束时刻t_E。在图6中，为了阐明还示出荧光衰减曲线60，该荧光衰减曲线以直方图形式给出，该直方图示出多个单个测量的结果(相当于图2和4)。

按照本发明的扩展方案此时规定，将上述基础方法单独应用于所述两个间隔分段A和B。这表明，对于所述两个间隔分段A和B分别确定表征荧光衰减特性的参量，在当前示例中为单独的荧光衰减曲线。在此，在分析中仅考虑其中检测到的荧光光子数量不超过预定数量的那些间隔分段A或B，所述预定数量在当前示例中又应该等于1。如果在相应的间隔分段A或B中检测到荧光光子的数量大于1，则放弃将该间隔分段用于确定荧光衰减曲线。

在图6示出的将测量间隔分段为相继的所述两个分段间隔A和B应理解为纯示例性的。因此，测量间隔也可以以其他方式被分段，如在图7至9中所阐明的那样。

图7示出如下分段，在该分段中，所述两个间隔分段A和B在时刻t₁和t₂之间具有时间重叠。因此，间隔分段A在时刻t₂才结束，该时刻t₂在时间上滞后于时刻t₁，间隔分段B在该时刻t₁开始。

图8示出如下分段，在该分段中，测量间隔被划分为多于两个、例如六个间隔分段A至F。如图6那样，在根据图8的分段中，各个间隔分段A至F无时间重叠地彼此相接。

图9示出三个间隔分段A、B和C的定义，其中间隔分段A与测量间隔一致，而另外两个间隔分段B和C相对于间隔分段A的开始时刻t_A具有累进延迟的开始时刻t₁和t₂。结束时刻t_E对于所有间隔分段A、B和C来说是相同的。

在图6至9中示例性地示出的分段也可以以合适的方式相互组合。因此，例如在图8中无时间重叠地彼此相接的间隔分段A至F可以在时间上彼此重叠，如这针对在图7中的两个间隔分段A和B所阐明的那样。

在下面参考图10至13阐述如何将针对各个间隔分段单独确定的荧光衰减曲线组合成一个总曲线，该总曲线涉及整个测量间隔。在此，纯示例性地将具有两个间隔分段A和B的分段作为图10至13的基础，其中，间隔分段A等于测量间隔，而间隔分段B给出相对于测量间隔变短的间隔，该间隔的开始时刻相对于测量间隔的开始时刻延迟。在图10至13中，间隔区段B的开始时刻用τ_T表示并且所述两个间隔分段A和B共同的结束时刻用τ_max表示。

在图10至13所示的示例中，按照基础方法的当前扩展方案，通过分析多个间隔分段B来求取单独的荧光衰减曲线。在此，仅考虑其中没有检测出多于预定数量的光子的那些间隔分段B用于确定该分段的荧光衰减曲线，所述预定数量在当前示例中等于1。以该方式，相对于其中基础方法仅相应地应用于整个测量间隔的情况，能够提高在间隔分段B中检测到的荧光光子的总数。

如图11所示，通过求取涉及间隔分段B的分段的荧光衰减曲线，得出相对于涉及整个测量间隔的荧光衰减曲线的在间隔分段B之外的那部分的突变。因此，所述基础方法的扩展方案规定，为了消除该突变，即为了使涉及间隔分段B的分段的荧光衰减曲线与涉及整个测量间隔的荧光衰减曲线的在时间上提前的部分适配，将间隔分段B中的强度乘以系数F，以便获得按照图12的无突变的、即连续的荧光衰减曲线：

其中

在此，I_所选光子(τ)表示根据基础方法针对整个测量间隔所求取的荧光衰减曲线，而I_{B所选光子}(τ)给出当基础方法仅应用于间隔分段B时所求取的分段的荧光衰减曲线。此外，I_所有光子(τ)表示在分析所有荧光光子的情况下的理想荧光衰减曲线，该理想荧光衰减曲线在对于所有荧光光子接收时间是已知的时得出。以上提及的衰减曲线在图13中示出。

函数I_所有光子(τ)不能精确地从所接收的数据中确定。然而，关于上述提及的函数的积分从光子统计中已知：

以及

在此，N_A(k)和N_b(k)表示测量间隔的数量，在所述测量间隔中，在间隔分段A或B中识别出k个荧光光子。系数F因此简化成

亦即，通过考虑系数F，从在图11中示出的分段的荧光衰减曲线中构建按照图12的连续衰减曲线，在所述分段的荧光衰减曲线之间存在突变。

在图12中示出的荧光衰减曲线然后可以在应用适合于所观察的光子统计的模型函数f(τ)的情况下被分析，该模型函数反映具有一个或多个分量的指数型下降：

在此，m给出指数型分量的数量，A_n给出相应分量的幅度，τ_n给出分量的荧光寿命以及IRF(τ)给出仪器响应函数。

为了确定荧光寿命τ_n，例如应用用于非线性地将模型函数与按照图12构建的荧光衰减曲线适配的方法。这样的方法例如是具有泊松统计的所谓最大似然估计函数的最小化，例如在Bajzer，Z.et al.，Maximum-Likelihood Method For The Analysis Of Time-Resolved Fluorescence Decay Curves.European Biophysics Journal，1991.20(5):p.247-262中说明的那样。因此，在该方式中接着根据下列规则修改模型函数f(τ)和所构建的荧光衰减曲线I(τ)：

和

这样修改的函数f(τ)和I(τ)然后为了进一步的分析以本身已知的方式相互适配。

所述基础方法的上述扩展方案也可以在如下情况中应用，在所述情况中以不同于图10至13所示的方式对测量间隔进行分段。尤其是，当一个测量间隔被划分为多个其中分别应用上述方法的间隔分段时，能够持续提高光子利用率。尤其是如果在接收M个时隙(Zeitkanal)的情况下将一个测量间隔相应地划分为M个间隔分段，则获得特别高的利用率。在该情况下，连同所构建的衰减曲线I(τ)产生校正系数F(τ)的阵列并且提供用于进一步的分析。

附图标记列表

10 共焦扫描显微镜

12 脉冲式激光源

14 激发光

16 分光镜

18 透射的激发光

20 反射的激发光

22 激发孔板

24 二向色分光镜

26 扫描单元

28 扫描反射镜

30 扫描透镜

32 镜筒透镜

34 显微镜物镜

36 样品

38 荧光

40 探测孔板

42 第一探测器

43 模拟探测器信号

44 处理单元

46 比较器或模数转换器

48 第二探测器

49 模拟激发信号

56 显示器

60 荧光衰减曲线

Claims (21)

1.一种利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法，其中

借助脉冲式光源(12)周期性地以激发光脉冲对样品(36)进行激发以发射荧光光子，其中在每两个相继的激发光脉冲之间定义测量间隔；

借助探测器(42)检测所述荧光光子并且产生代表检测到的荧光光子的模拟探测器信号；

基于所述探测器信号确定探测时间，所述荧光光子在相应的测量间隔内在所述探测时间上被所述探测器探测到；

基于检测到的荧光光子的探测时间，确定至少一个表征荧光衰减特性的参量；以及

借助所述表征参量进行成像；

其特征在于，在相应的测量间隔内在多个采样间隔内对所述模拟探测器信号进行采样并且将所述模拟探测器信号转换成离散的配属于各个采样间隔的信号值的序列；以及

借助属于相应的测量间隔的离散信号值序列，确定在该测量间隔内是否检测到多于预定数量的荧光光子，并且当检测到多于该预定数量的荧光光子时，放弃将该测量间隔用于确定所述表征荧光衰减特性的参量，其中所述预定数量等于或大于1。

2.根据权利要求1所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，所述预定数量等于1。

3.根据上述权利要求中任一项所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，借助模数转换器(46)对所述模拟探测器信号进行数字化。

4.根据权利要求1或2所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，借助比较器(46)在应用阈值的情况下对所述模拟探测器信号进行数字化，使得离散的信号值相应地等于第一二进制值或等于第二二进制值。

5.根据权利要求4所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，在配属于相应的测量间隔的离散信号值序列内，将所有等于第一二进制值的信号值的子序列定义为光子间隔，并且当在该光子间隔中所包含的采样间隔的数量超过预定的采样间隔数量时，确认在所述测量间隔内存在多于一个的荧光光子。

6.根据权利要求5所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，在所述测量间隔内，首先具有第一二进制值的那个采样间隔定义为所述光子间隔的始端，而接着具有第二二进制值的那个采样间隔定义为所述光子间隔的末端，其中，借助所述光子间隔的始端和末端来确定所提及的数量。

7.根据上述权利要求中任一项所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，在参考测量中根据下列公式求取用于预定像素的激发光脉冲的强度：

I_ex(x，y)＝I·N(x，y，0)/N(x，y，1)

其中

I表示在参考测量中的强度，

I_ex表示待求取的强度，

N(x，y，k)表示测量间隔的总数，在所述测量间隔中检测到k＝1或k＝0个荧光光子，以及

(x，y)表示像素的位置。

8.根据权利要求7所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，这样调整用于预定像素的激发光脉冲的强度，使得其中相应地检测到正好一个荧光光子的测量间隔的总数等于其中没有检测到荧光光子的测量间隔的总数。

9.根据上述权利要求中任一项所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，在相应的测量间隔内定义不同的间隔分段，针对这些间隔分段中的每个间隔分段单独地确定在该测量间隔内是否检测到多于预定数量的荧光光子；以及

当在相应的间隔分段内检测到多于预定数量的荧光光子时，放弃将该间隔分段用于确定所述表征荧光衰减特性的参量。

10.根据权利要求9所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，针对相应的测量间隔的每个间隔分段，确定所述表征荧光衰减特性的参量，以及从针对各个间隔分段所确定的表征参量中求取涉及整个测量间隔的表征参量。

11.根据权利要求10所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，借助如下系数求取所述涉及整个测量间隔的表征参量，该系数从其中检测到预定数量的荧光光子的间隔分段的数量和其中没有检测到光子的间隔分段的数量中确定。

12.根据权利要求10或11所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，借助如下的模型函数分析所述涉及整个测量间隔的表征参量，在所述模型函数中考虑了在间隔分段中检测到的荧光光子的数量。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，所述不同的间隔分段包括至少两个分段，所述至少两个分段在所述测量间隔内带有或没有时间重叠地彼此相接。

14.根据权利要求9至12中任一项所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，所述不同的间隔分段包括第一分段和至少一个第二分段，所述第一分段由测量间隔给出，该第二分段的始端相对于所述测量间隔的始端延迟，而该第二分段的末端与所述测量间隔的末端重叠。

15.根据上述权利要求中任一项所述的荧光寿命成像显微学方法，其特征在于，在使用共焦扫描显微镜(10)或多光子显微镜的情况下实施所述方法。

16.用于实施利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法的显微镜(10)，包括：

光源(12)，该光源构成用于以激发光脉冲对样品进行激发以发射荧光光子，其中在每两个相继的激发光脉冲之间定义测量间隔；

探测器(42)，该探测器构成用于检测所述荧光光子并且产生代表检测到的荧光光子的模拟探测器信号；和

处理单元(44)，该处理单元构成用于：基于所述探测器信号确定探测时间，所述荧光光子在相应的测量间隔内在所述探测时间上被所述探测器探测到；基于检测到的荧光光子的探测时间，确定至少一个表征荧光衰减特性的参量；以及借助所述表征参量进行成像；

其特征在于，所述处理单元(44)构成用于在相应的测量间隔内在多个采样间隔内对所述模拟探测器信号进行采样并且将所述模拟探测器信号转换成离散的配属于各个采样间隔的信号值的序列，以及

所述处理单元(44)构成用于借助属于相应的测量间隔的离散信号值序列，确定在该测量间隔内是否检测到多于预定数量的荧光光子，并且当检测到多于该预定数量的荧光光子时，放弃将该测量间隔用于确定所述表征荧光衰减特性的参量，其中所述预定数量等于或大于1。

17.根据权利要求16所述的显微镜(10)，其特征在于，所述处理单元(44)包括模数转换器(46)，该模数转换器构成用于对所述模拟探测器信号进行数字化。

18.根据权利要求16所述的显微镜(10)，其特征在于，所述处理单元(44)包括比较器(46)，该比较器构成用于在应用阈值的情况下对所述模拟探测器信号进行数字化，从而离散的信号值相应地等于第一二进制值或等于第二二进制值。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的显微镜(10)，其特征在于，所述显微镜包括另外的探测器(48)，该另外的探测器构成用于检测所述激发光脉冲并且产生代表检测到的激发光脉冲的模拟激发信号，其中，所述处理单元(44)构成用于根据采样间隔对所述模拟激发信号进行采样并且将所述模拟激发信号转换成离散的配属于各个采样间隔的激发信号值的序列。

20.根据权利要求10至19中任一项所述的显微镜(10)，其特征在于，所述处理单元(44)包括用于示出调整信息的显示器(56)。

21.根据权利要求16至20中任一项所述的显微镜(10)，其特征在于，所述显微镜构成为共焦扫描显微镜或多光子显微镜。