DE102022112378A1

DE102022112378A1 - Verfahren, lichtmikroskop und computerprogramm zur bestimmung eines referenzzeitpunktes

Info

Publication number: DE102022112378A1
Application number: DE102022112378.2A
Authority: DE
Inventors: Benjamin Harke; Lars KASTRUP
Original assignee: Abberior Instruments GmbH
Current assignee: Abberior Instruments GmbH
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2023-11-23
Anticipated expiration: 2042-05-18
Also published as: DE102022112378B4; US20230375473A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Referenzzeitpunkts (t₀) mittels eines Lichtmikroskops (1), wobei eine Probe (2) durch erste Lichtpulse (P1) beleuchtet wird, um lichtemittierende Einheiten in der Probe (2) anzuregen, wobei ein mittels der ersten Lichtpulse (P1) erzeugtes Lichtsignal detektiert wird, und wobei der Referenzzeitpunkt (t₀) auf der Grundlage des detektierten Lichtsignals bestimmt wird, und wobei das Lichtsignal in mindestens zwei Messungen jeweils in einem ersten Detektionszeitfenster (G1) erfasst wird, wobei ein Startzeitpunkt des ersten Detektionszeitfensters (G1) für jede der Messungen angepasst wird. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Lichtmikroskop (1) und ein Computerprogramm durch Durchführung des Verfahren.

Description

Technischer Bereich der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Referenzzeitpunktes, wobei das Verfahren mit einem Lichtmikroskop durchgeführt wird, ein Lichtmikroskop und ein Computerprogramm zur Durchführung des Verfahrens.
Stand der Technik
In der Lichtmikroskopie, insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie, wird die gepulste Beleuchtung der Probe für verschiedene Zwecke eingesetzt, z. B. für die Analyse der Fluoreszenzlebensdauer, für die mehrfarbige gepulste Mikroskopie (sogenannte pulse interleaved-Mikroskopie), für die konfokale Mikroskopie und für die STED- (stimulated emission depletion) oder RESOLFT-Mikroskopie (reversible saturable optical linear fluorescence transitions).
Bei der STED- und RESOLFT-Mikroskopie wird ein Anregungslichtfokus üblicherweise mit einer donut- oder bottle-beam-förmigen Lichtverteilung von Verhinderungslicht oder Schaltlicht überlagert, das den angeregten Zustand der Fluorophore bis auf einen schmalen zentralen Bereich des Fokus entvölkert, was zu einer Steigerung der Auflösung bis unterhalb der Beugungsgrenze führt.
Lichtpulse können z. B. mit intern oder extern gepulsten Lasern oder mit CW-Lasern in Kombination mit einem Pulspicker erzeugt werden.
Für bestimmte Anwendungen müssen die Lichtpulse mit anderen Ereignissen synchronisiert werden. So muss zum Beispiel bei der sogenannten pulse-interleaved-Mikroskopie die Zeitverzögerung zwischen den Pulsen verschiedener Laserquellen angepasst werden, um eine gewünschte Pulsfolge zu erzeugen.
Auch die Auflösung der gepulsten STED-Mikroskopie hängt stark von der Zeitverzögerung zwischen den Anregungspulsen und den STED-Pulsen ab. Die STED-Pulse müssen später als der Anregungspuls erfolgen, um sicherzustellen, dass der angeregte Zustand der Fluorophore ausreichend besiedelt ist. Erfolgt der STED-Puls jedoch zu spät, zerfällt ein erheblicher Teil der Fluorophore spontan auch in Bereichen um das zentrale Intensitätsminimum des STED-Donuts, was zu einer suboptimalen räumlichen Auflösung des resultierenden Bildes führt.
Wenn ein Einzelphotonen-Detektor oder ein sogenannter gated-Detektor verwendet wird, ist außerdem eine genaue Synchronisierung des (externen oder internen) Taktgebers des Detektors mit den Anregungspulsen erforderlich, um aussagekräftige Daten zu erhalten.
Bei der gated detection wird das Licht der Probe nur in einem bestimmten Zeitintervall erfasst oder aufgezeichnet, während das restliche Lichtsignal verworfen werden kann. Das so genannte elektronische Gating kann auch durch zeitkorrelierte Einzelphotonenzählmodule (time correlated single photon counting, TCSPC) durchgeführt werden. Zu diesem Zweck werden bestimmte Teile des erhaltenen zeitaufgelösten Photonenhistogramms für die weitere Verarbeitung ausgewählt, während andere Teile verworfen werden.
Die gated detection kann z. B. zur Reduzierung von Streulicht in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden (siehe z. B. US 9,372,334 ).
Darüber hinaus wurde die gated detection in einer Kombination von gepulsten Anregungslasern mit kontinuierlichen STED-Lasern in der sogenannten CW-STED-Mikroskopie eingesetzt (J. R. Moffitt, C. Osseforth und J. Michaelis, „Time-gating improves the spatial resolution of STED microscopy“, Opt. Express 19, 4242-4254 (2011); G. Vicidomini, G. Moneron, K. Han, et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods 8, 571-573 (2011). https://doi.org/10.1038/nmeth.1624; US 9,952,155 B2 ).
Die gated detection kann auch allgemeiner eingesetzt werden, um die Auflösung von STED-Mikroskopiebildern durch Lebensdauertrennung zu erhöhen, da spontan emittierende Fluorophore eine längere Lebensdauer haben als Fluorophore, die durch den STED-Puls depletiert werden.
Schließlich wurde das Gating in der STED-Mikroskopie zur Verringerung des Hintergrundsignals eingesetzt, das sich aus der direkten Anregung durch den STED-Strahl ergibt ( WO 2015/022635 A1 ).
Viele mikroskopische Anwendungen, wie z. B. die oben genannten, erfordern eine genaue zeitliche Koordination der Lichtpulse, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen.
Bei nicht getriggerten Laserquellen wird die zeitliche Abfolge der Pulse durch die feste Repetitionsrate bestimmt, während die von getriggerten Laserquellen emittierten Laserpulse durch die an die Laserquelle angelegten Triggerpulse getaktet werden.
Der Zeitpunkt des Eintreffens der Laserpulse auf der Probe ist jedoch schwer zu bestimmen und kann zwischen verschiedenen Mikroskopaufbauten und während der Experimente variieren, insbesondere aufgrund unterschiedlicher Umgebungsparameter. Dies führt zu einem Mangel an Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit bestimmter mikroskopischer Experimente.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Methoden zur Zeitmessung von Laserpulsen bekannt. So kann der Laserpuls beispielsweise in zwei Pulse aufgespalten werden, wobei die Korrelationsfunktion der beiden Teilpulse mithilfe eines Interferometers ermittelt wird (siehe z.B. Barry, L.P.; Bollond, P.G.; Dudley, J.M.; Harvey, J.D.; Leonhardt, R.: ‚Autocorrelation of ultrashort pulses at 1.5 µm based on nonlinear response of silicon photodiodes‘, Electronics Letters, 32 (20), 1922-1923, 1996; Youngchan Kim, Steven S. Vogel, „Measuring finio-photon microscopy ultrafast laser pulse duration at the sample plane using time-correlated singlephoton counting," J. Biomed. Opt. 25 (1) 014516, 2020; Shin SI, Lim SL: „Simple Autocorrelation Measurement by Using a GaP Photoconductive Detector," J. Opt. Soc. Korea 20, 435-440 (2016); Wolleschensky R., Feurer T., Sauerbrey R., Simon U.: „Characterization and optimization of a laser-scanning microscope in the femtosecond regime"; Applied Physics B: Lasers and Optics 67(1), 87-94, 1998; Kaushalya, Fried, H: „Measuring ultra-short pulse widths before and after the objective with a home built autocorrelator“, arXiv 2021 doi: 10.48550/ARXIV.2112.00353; Hage CH, Billard F, Kibler B, Finot G, Millot G: „Direct temporal reconstruction of picosecond pulse by cross-correlation in semiconductor device" Electronics Letters 48(13), 778-780, 2012).
Diese Methoden haben jedoch den Nachteil, dass sie apparativ relativ aufwendig sind bzw. eine aufwendige Kalibrierung erfordern.
Objektives Problem
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und robustes Verfahren zur wiederholbaren und reproduzierbaren Bestimmung des Zeitpunkts des Eintreffens von Lichtpulsen auf eine Probe, die mit einem Lichtmikroskop analysiert wird, bereitzustellen.
Lösung
Dieses Ziel wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 (Verfahren), 11 (Lichtmikroskop) und 12 (Computerprogramm) erreicht. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen 2 bis 10 angegeben und im Folgenden beschrieben.
Beschreibung der Erfindung
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Referenzzeitpunkts, wobei eine Probe mittels einer ersten Lichtquelle eines Lichtmikroskops durch erste Lichtpulse beleuchtet wird, um lichtemittierende Einheiten in der Probe anzuregen, wobei ein mittels der ersten Lichtpulse erzeugtes Lichtsignal mittels eines Detektors des Lichtmikroskops detektiert wird, und wobei der Referenzzeitpunkt auf der Grundlage des detektierten Lichtsignals bestimmt wird. Dabei wird das Lichtsignal in mindestens zwei Messungen jeweils in einem ersten Detektionszeitfenster erfasst, wobei ein Startzeitpunkt des ersten Detektionszeitfensters für jede der Messungen, insbesondere in gleichen Schritten, angepasst wird. Insbesondere bleibt eine Länge des ersten Detektionszeitfensters in den mindestens zwei Messungen konstant.
Der Referenzzeitpunkt gibt insbesondere einen Zeitpunkt der ersten Lichtpulse an.
Insbesondere wird das Lichtsignal von den ersten Lichtpulsen erzeugt, muss aber nicht unbedingt von den lichtemittierenden Einheiten in der Probe stammen. Das Lichtsignal kann z. B. auch reflektiertes oder gestreutes Licht der ersten Lichtpulse sein. Insbesondere kann der Referenzzeitpunkt einen Zeitpunkt angeben, zu dem ein entsprechender erster Lichtpuls auf die Probe trifft, z. B. relativ zu einem Takt, der von der Lichtquelle, die die ersten Lichtpulse erzeugt, oder von einer externen Uhr erhalten wird.
Der auf Basis des Lichtsignals bestimmte Referenzzeitpunkt spiegelt die Situation in dem Lichtmikroskop, insbesondere in der Probe, besser wider als vergleichbare Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen ein Referenzzeitpunkt z. B. aus externen Taktpulsen oder Informationen von der Laserquelle geschätzt wird, und wird insbesondere weniger durch Umgebungsschwankungen beeinflusst. Daher ist die Methode direkt und sehr genau.
Erfindungsgemäß wird in mehreren Messungen das Lichtsignal der Probe in einem ersten Detektionszeitfenster erfasst, wobei ein Startzeitpunkt des ersten Detektionszeitfensters für jede der Messungen, insbesondere in gleichen Schritten, angepasst wird. Mit anderen Worten wird das erste Detektionszeitfenster zeitlich verschoben, bis das erfasste Lichtsignal den Referenzzeitpunkt anzeigt. Insbesondere bleibt eine Länge des ersten Detektionszeitfensters in der Mehrzahl der Messungen konstant.
Das erste Detektionszeitfenster wird zwischen den verschiedenen Messungen zeitlich verschoben. Beispielsweise anhand des Startzeitpunkts desjenigen ersten Detektionszeitfensters, in dem ein aus dem ersten Lichtpuls resultierendes Lichtsignal erfasst wurde, kann auf einfache Weise der Referenzzeitpunkt bestimmt werden. Diese Methode ist apparativ deutlich einfacher realisierbar als beispielsweise aus dem Stand der Technik bekannte Autokorrelationsverfahren auf Basis von Interferometern.
Das erste Detektionszeitfenster definiert ein Zeitintervall, in dem das Lichtsignal von einem Detektor (z. B. einem Punktdetektor wie einer Avalanche-Photodiode, einem Photomultiplier oder einem Hybriddetektor oder einer Kamera) erfasst oder aufgezeichnet wird, wobei das außerhalb des Zeitintervalls erfasste Lichtsignal bei der Bestimmung des Referenzzeitpunkts nicht berücksichtigt wird.
Die Erfassung des Lichtsignals in dem ersten Detektionszeitfenster kann insbesondere durch Abschatten oder Abschwächen des von der Probe ausgehenden Lichts zu bestimmten Zeiten erfolgen. Alternativ dazu kann ein sogenanntes elektronisches Gating durchgeführt werden, wobei insbesondere einzelne Photonen des Detektionslichts von dem Detektor erfasst werden, und wobei jedem Photon eine Zeitmarke zugewiesen wird. Auf der Grundlage dieser Zeitmarken kann das Gating durch Auswahl von Photonen aus bestimmten Zeitintervallen auf der Ebene der Datenverarbeitung durchgeführt werden.
Der erhaltene Referenzzeitpunkt kann als Referenz für die Synchronisierung mit anderen Ereignissen verwendet werden, z. B. mit der Detektoransteuerung oder zweiten Lichtpulsen, die z. B. von einer zweiten Lichtquelle erzeugt werden.
Der hier verwendete Begriff „lichtemittierende Einheiten“ bezeichnet Moleküle, Partikel oder molekulare Komplexe, die als Reaktion auf das Beleuchtungslicht Licht emittieren. Das emittierte Licht kann beispielsweise durch Reflexion oder Streuung des Beleuchtungslichts erzeugt werden, oder, falls das Beleuchtungslicht Anregungslicht ist, das die lichtemittierenden Einheiten anregen kann, kann das emittierte Licht Lumineszenzlicht, insbesondere Fluoreszenzlicht oder Phosphoreszenzlicht, sein. Bei den lichtemittierenden Einheiten kann es sich um einzelne Moleküle, Komplexe oder Aggregate von Molekülen oder Partikeln handeln.
Die lichtemittierende Einheit kann selbst Licht emittieren oder ein oder mehrere Moleküle enthalten, die in einem Komplex, Aggregat oder Partikel Licht emittieren. Bei der Fluoreszenzmikroskopie können die lichtemittierenden Einheiten beispielsweise Fluorophore (kleine Moleküle oder fluoreszierende Makromoleküle wie fluoreszierende Proteine) oder einzelne Moleküle sein, die mit einem oder mehreren Fluorophoren markiert sind (z. B. Proteine, die durch eine chemische Bindung zwischen Aminosäureseitenketten und Fluorophoren an ein oder mehrere Fluorophore gebunden sind, oder Proteine, die an einen Antikörper oder eine ähnliche Einheit gebunden sind, wobei der Antikörper mit einem Fluorophor markiert ist). Ein Beispiel für ein lichtreflektierendes Teilchen ist ein Gold-Nanopartikel. Fluoreszierende Partikel können z. B. sogenannte quantum beads sein.
Insbesondere wird das Lichtsignal von den lichtemittierenden Einheiten erzeugt. Alternativ kann das Lichtsignal auch durch andere mit der Probe verbundene oder separat von der Probe angeordnete Strukturen erzeugt werden. Beispiele hierfür sind Licht, das von einem Probenträger, wie einem Objektträger oder einem Deckglas, das die Probe bedeckt, reflektiert oder gestreut wird. Darüber hinaus kann die Probe mehr als eine Art von lichtemittierenden Einheiten enthalten, wobei eine erste Art zur Gewinnung des Lichtsignals für die Bestimmung des Referenzzeitpunkts und eine zweite Art zur Abbildung der Probe oder zur Lokalisierung bestimmter Strukturen in der Probe verwendet wird.
Ebenso ist es möglich, dass die ersten Lichtpulse an geeigneter Position im Strahlengang des Lichtmikroskops direkt von einem gatingfähigen Detektor erfasst werden, um das Lichtsignal zu erhalten. Umso dichter sich diese Position an der Position der Probe befindet, desto genauer wird das Lichtsignal die tatsächlichen Gegebenheiten in der Probe widerspiegeln.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Probe mit dem Lichtmikroskop abgebildet oder die lichtemittierenden Einheiten in der Probe werden mit dem Lichtmikroskop lokalisiert, insbesondere nach der Bestimmung des Referenzzeitpunkts.
Für die Durchführung der Methode kann jede Art von Lichtmikroskop verwendet werden. Beispiele sind Hellfeldmikroskope, Dunkelfeldmikroskope, Phasenkontrastmikroskope, Differentialinterferenzkontrastmikroskope (DIC), Fluoreszenzmikroskope, Weitfeldmikroskope, konfokale Rastermikroskope, Nahfeldmikroskope, Fernfeldmikroskope, Lichtblattmikroskope, Multiphotonenmikroskope, 4p-Mikroskope, Infrarotmikroskope, STED-Mikroskope, RESOLFT-Mikroskope, PALM/STORM-Mikroskope, MINFLUX-Mikroskope oder MINSTED-Mikroskope.
Bei der PALM- (photo activated localization microscopy) oder STORM- (stochastic optical reconstruction)-Mikroskopie wird die Probe mit photoschaltbaren oder blinkenden Fluorophoren unter Bedingungen markiert, die sicherstellen, dass die Emissionslichtsignale der einzelnen Emitter zu einem bestimmten Zeitpunkt einen solchen Abstand voneinander haben, dass sie voneinander unterscheidbar sind. Aus einer Zeitreihe von Bildern kann dann eine Lokalisierungskarte der Emitter rekonstruiert werden.
Der Begriff MINFLUX-Mikroskopie (manchmal auch MINFLUX-Nanoskopie genannt, beschrieben z.B., in Balzarotti F, Eilers Y, Gwosch KC, Gynna, A, Westphal V, Stefani F, Elf J, Hell SW „Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes", Science 355 (6325), 606-611 (2016)), bezeichnet eine lichtmikroskopische Technik zur Lokalisierung einzelner lichtemittierender Einheiten in einer Probe, wobei die Probe mit einer Lichtverteilung beleuchtet wird, die ein lokales Minimum an Positionen aufweist, die ein Muster in der Nähe einer erwarteten Position einer einzelnen lichtemittierenden Einheit bilden, Emissionslichtintensitäten oder Photonenzahlen für jede Position gemessen werden und eine neue Positionsschätzung auf der Grundlage der gemessenen Lichtintensitäten/Photonenzahlen und der entsprechenden Positionen bestimmt wird. Insbesondere ist die Lichtverteilung mit dem lokalen Minimum eine Anregungslichtverteilung. Alternativ kann die Lichtverteilung z. B. eine Verhinderungslichtverteilung (z. B. STED) mit einem lokalen Minimum sein, die insbesondere mit einer Anregungslichtverteilung mit einem lokalen Maximum überlagert ist.
Der Begriff MINSTED-Mikroskopie (veröffentlicht z.B. in Weber, M., Leutenegger, M., Stoldt, S. et al. MINSTED fluorescence localization and nanoscopy. Nat. Photonics 15, 361-366 (2021).https://doi.org/10.1038) beschreibt ein Lichtmikroskopieverfahren zur Lokalisierung einzelner lichtemittierender Einheiten in einer Probe, wobei die Probe mit einer Anregungslichtverteilung abgetastet wird, die ein lokales Maximum umfasst, und mit einer Verhinderungslichtverteilung (z.B., STED-Licht), die ein lokales Minimum aufweist, kreisförmig abgetastet wird, wobei bei der Detektion eines Photons von einer lichtemittierenden Einheit der Mittelpunkt des Kreises in Richtung des Ortes der Photonendetektion verschoben wird, während sein Radius verringert wird, und eine effektive Punktspreizfunktion der Detektion verengt wird, bis die Position des Mittelpunkts mit der Position einer einzelnen lichtemittierenden Einheit konvergiert. Insbesondere wird das Licht von den lichtemittierenden Einheiten konfokal zum Mittelpunkt des Kreises erfasst.
Die ersten Lichtpulse (und auch die weiter unten beschriebenen zweiten Lichtpulse) können jede für das mikroskopische Experiment geeignete Pulslänge haben, insbesondere im Femtosekunden-, Pikosekunden- oder Nanosekundenbereich. Die Lichtpulse können insbesondere durch einen triggerbaren oder nicht triggerbaren gepulsten Laser oder z. B. durch einen kontinuierlichen (CW) Laser mittels eines Pulsselektors oder Pulspickers erzeugt werden.
Das von der Probe zur Bestimmung des Referenzzeitpunkts erfasste Lichtsignal kann jede Art von Licht sein, insbesondere reflektiertes Licht, (RAMAN- oder Rayleigh-)Streulicht oder Lumineszenzlicht (d. h. Fluoreszenz oder Phosphoreszenz). Das Lichtsignal kann direkt durch die ersten Lichtpulse, insbesondere in der Probe, verursacht werden. Im Falle von reflektiertem oder gestreutem Licht kann das Lichtsignal das Licht der ersten Lichtpulse sein, das an Strukturen in der Probe reflektiert oder gestreut wird. Im Fall von Lumineszenzlicht können die ersten Lichtpulse Luminophore (z. B. Fluorophore) in der Probe anregen, die beim Abklingen aus ihrem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand das Lichtsignal aussenden.
Gemäß einer Ausführungsform wird aus dem detektierten Lichtsignal ein maximales Lichtsignal ermittelt, wobei der Referenzzeitpunkt auf Grundlage des Detektionszeitfensters bestimmt wird, in dem das maximale Lichtsignal erfasst wurde.
Durch die Bestimmung des maximalen Lichtsignals kann der Zeitpunkt, an dem das Lichtsignal aufgetreten ist, auf besonders einfache Weise ermittelt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das erste Detektionszeitfenster kürzer als eine Emissionslebensdauer der lichtemittierenden Einheiten in der Probe, wobei insbesondere das erste Detektionszeitfenster kürzer als 50 %, weiter insbesondere kürzer als 40 %, noch weiter insbesondere kürzer als 30 %, noch weiter insbesondere kürzer als 20 %, noch weiter insbesondere kürzer als 10 %, noch weiter insbesondere kürzer als 5 %, noch weiter insbesondere kürzer als 1 %, der Emissionslebensdauer der lichtemittierenden Einheiten in der Probe ist.
Dadurch wird sichergestellt, dass der ermittelte Referenzzeitpunkt auf der Zeitskala des Emissionsabfalls der lichtemittierenden Einheiten ausreichend genau ist.
Die Emissionslebensdauer der lichtemittierenden Einheiten ist ein Maß dafür, wie schnell Licht von den lichtemittierenden Einheiten als Reaktion auf die ersten Lichtpulse emittiert wird. Kann die Lichtemission z. B. als ein einzelner exponentieller Prozess beschrieben werden, so ist die Emissionslebensdauer insbesondere als der Kehrwert der Zeitkonstante eines einzelnen exponentiellen Abfalls definiert. Für ein Ensemble von Emittern beschreibt diese Emissionslebensdauer die Zeit, nach der die Lichtintensität der Lichtemission auf einen Bruchteil von 1/e des anfänglichen Intensitätswertes gesunken ist. Im Falle eines einzelnen Emitters folgt die Emission eines Photons nach Auslösung durch den Lichtpuls einer Wahrscheinlichkeitsverteilung, die z. B. durch einen einfachen exponentiellen Zerfall beschrieben werden kann, und die Emissionslebensdauer ist die Zeit, nach der die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmter Emitter ein Photon emittiert hat, gleich 1-1/e ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform hat das erste Detektionszeitfenster eine Länge von 500 ps oder weniger, insbesondere 200 ps oder weniger, weiter insbesondere 100 ps oder weniger, noch weiter insbesondere 50 ps oder weniger, noch weiter insbesondere 20 ps oder weniger, noch weiter insbesondere 10 ps oder weniger, noch weiter insbesondere 5 ps oder weniger, noch weiter insbesondere 1 ps oder weniger.
Wenn ein sehr kurzes Detektionszeitfenster gewählt wird, kann der Zeitpunkt des Lichtsignals und damit der Referenzzeitpunkt sehr genau bestimmt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das erste Detektionszeitfenster kürzer als ein Puls-zu-Puls-Zeitintervall der ersten Lichtpulse. Das Puls-zu-Puls-Zeitintervall ist der Kehrwert der Pulswiederholungsrate und liegt bei gepulsten Laserquellen typischerweise im Nanosekundenbereich. Durch die Einstellung des ersten Detektionszeitfensters auf Werte, die kürzer sind als das Puls-zu-Puls-Zeitintervall, wird sichergestellt, dass nur das von einem einzigen ersten Lichtpuls verursachte Lichtsignal in dem ersten Detektionszeitfenster erfasst wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die ersten Lichtpulse nach der Bestimmung des Referenzzeitpunktes zeitlich mit dem bestimmten Referenzzeitpunkt koordiniert bzw. synchronisiert. Das heißt, die ersten Lichtpulse erhalten einen definierten zeitlichen Abstand zu dem Referenzzeitpunkt, wobei der Abstand insbesondere auch den Wert Null haben kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Lichtsignal mittels eines Detektors erfasst, wobei von den lichtemittierenden Einheiten in der Probe emittiertes Licht mittels desselben Detektors erfasst wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Lichtsignal mittels eines ersten Detektors erfasst, wobei von den lichtemittierenden Einheiten in der Probe emittiertes Licht mittels eines separaten zweiten Detektors erfasst wird. Bei dem ersten Detektor kann es sich z.B. um eine Photodiode handeln.
Das Lichtsignal kann insbesondere selektiv zu dem ersten Detektor geleitet werden, z.B. dadurch, dass der erste Detektor selbst oder Spiegel zur Weiterleitung des Lichtsignals reversibel in einen Strahlengang des Lichtmikroskops eingeschwenkt werden. Auf diese Weise kann z.B. das Lichtsignal nur in einem Kalibrationsschritt erfasst werden, während das Lichtsignal während der eigentlichen mikroskopischen Messung nicht erfasst wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfasste Lichtsignal reflektiertes Licht. Insbesondere wird das reflektierte Licht von einem Objekt in der Probe reflektiert. Bei einem solchen Objekt kann es sich z. B. um ein annähernd kugelförmiges Teilchen, z.B. um ein kugelförmiges Nanopartikel, handeln. Solche Partikel können einen Durchmesser im Bereich der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie oder darunter haben. Alternativ kann das Licht insbesondere auch von Strukturen reflektiert werden, die mit der Probe in Kontakt stehen, z.B. von einem Probenträger, wie einem Glasobjektträger oder einem Deckglas.
In bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei dem erfassten Lichtsignal um Streulicht, insbesondere um Licht, das durch Raman-Streuung, insbesondere durch ein Objekt in der Probe, erzeugt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Emissionsfilter aus einem Detektionsstrahlengang des Lichtmikroskops entfernt, um das reflektierte oder gestreute Licht der ersten Lichtpulse zu detektieren, insbesondere durch einen Aktuator in Reaktion auf ein Steuersignal. Solche Emissionsfilter können zur Unterdrückung von Hintergrundlicht bei der Detektion von Emissionslicht, z. B. Fluoreszenzlicht, verwendet werden. Da reflektiertes oder Rayleigh-gestreutes Licht die gleiche Wellenlänge hat wie das einfallende Licht, würde ein Emissionsfilter das Lichtsignal blockieren.
Die Verwendung von reflektiertem oder gestreutem Licht als Detektionslicht hat den Vorteil, dass das Lichtsignal fast augenblicklich erzeugt wird, so dass der Referenzzeitpunkt sehr genau bestimmt werden kann. Außerdem ist die Reflexion und Streuung unabhängig von der Art der Lumineszenzmarkierung o.ä. und kann daher bei einer großen Vielfalt von Proben eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein zweites Detektionszeitfenster für eine mikroskopische Abbildung der Probe oder eine Lokalisierung einzelner lichtemittierender Einheiten in der Probe auf der Grundlage des ermittelten Referenzzeitpunkts eingestellt. Insbesondere wird der Beginn des zweiten Detektionszeitfensters auf der Grundlage des ermittelten Referenzzeitpunktes festgelegt. Im Gegensatz zum ersten Detektionszeitfenster wird das zweite Detektionszeitfenster bei der Detektion des Emissionssignals der lichtemittierenden Einheiten in der Probe verwendet. Insbesondere ist das zweite Detektionszeitfenster länger als das erste Detektionszeitfenster, insbesondere gleich der Emissionsdauer oder größer als die Emissionsdauer der lichtemittierenden Einheiten in der Probe. Das zweite Detektionszeitfenster kann z. B. verwendet werden, um Hintergrundsignale aus Streulicht oder direkter Anregung durch STED-Licht in der STED-Mikroskopie zu reduzieren oder um die räumliche Auflösung in der STED- oder RESOLFT-Mikroskopie zu verbessern, wie im Stand der Technik beschrieben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Probe zusätzlich mit zweiten Lichtpulsen beleuchtet. Die zweiten Lichtpulse können Licht mit der gleichen Wellenlänge wie die ersten Lichtpulse oder mit einer anderen Wellenlänge als die ersten Lichtpulse umfassen.
Der Referenzzeitpunkt gibt insbesondere den Zeitpunkt der ersten Lichtpulse und/oder der zweiten Lichtpulse an.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine Zeitverzögerung zwischen den ersten Lichtpulsen und den zweiten Lichtpulsen auf der Grundlage des erfassten Lichtsignals bestimmt, wobei der Referenzzeitpunkt der Zeitpunkt ist, für den die Zeitverzögerung gleich Null ist.
In bestimmten Ausführungsformen sind die zweiten Lichtpulse geeignet, die Lichtemission der lichtemittierenden Einheiten zu vermindern oder deaktivieren. Bei den zweiten Lichtpulsen kann es sich beispielsweise um STED-Pulse handeln, die den angeregten Zustand der lichtemittierenden Einheiten depletieren. Insbesondere kann aus den zweiten Lichtpulsen eine Verhinderungslichtverteilung mit einem lokalen Minimum im Fokus erzeugt werden, um den angeregten Zustand der lichtemittierenden Einheiten in einem Bereich um das lokale Minimum zu depletieren und dadurch eine Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze zu erreichen. Auf diese Weise kann z. B. die Probe durch STED-Mikroskopie abgebildet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Zeitverzögerung zwischen den ersten Lichtpulsen und den zweiten Lichtpulsen nach der Bestimmung des Referenzzeitpunktes, insbesondere auf Basis des Referenzzeitpunktes, angepasst, um die Auflösung der in der Probe abgebildeten Strukturen zu optimieren.
Dies kann z. B. angewandt werden, um die Zeitverzögerung zwischen Anregungspulsen und Verhinderungspulsen (z. B. STED-Pulsen) zu bestimmen und dann anzupassen. Diese Zeitverzögerung beeinflusst insbesondere die Wirksamkeit des Verhinderungslichts (d.h. die Wirksamkeit der Entvölkerung des angeregten Zustands) und damit die durch die STED-Mikroskopie erzielte Auflösungserhöhung.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft ein Lichtmikroskop, das dazu ausgebildet ist, einen Referenzzeitpunkt zu bestimmen, insbesondere durch das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt. Das Lichtmikroskop umfasst eine erste Lichtquelle, die dazu ausgebildet ist, eine Probe mit ersten Lichtpulsen zu beleuchten, um lichtemittierende Einheiten in der Probe anzuregen, mindestens einen Detektor, der dazu ausgebildet ist, ein Lichtsignal, insbesondere von der Probe, zu detektieren, und eine Datenverarbeitungsvorrichtung, die dazu ausgebildet ist, einen Referenzzeitpunkt basierend auf dem detektierten Lichtsignal zu bestimmen. Erfindungsgemäß ist der mindestens eine Detektor oder die Datenverarbeitungsvorrichtung dazu ausgebildet, in mindestens zwei Messungen das Lichtsignal jeweils in einem ersten Detektionszeitfenster zu erfassen, wobei das Lichtmikroskop eine Steuervorrichtung aufweist, die dazu ausgebildet ist, einen Startzeitpunkt des ersten Detektionszeitfensters für jede der Messungen anzupassen.
Gemäß einer Ausführungsform ist die Steuervorrichtung dazu ausgebildet, die ersten Lichtpulse zeitlich mit dem ermittelten Referenzzeitpunkt zu koordinieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Datenverarbeitungsvorrichtung dazu ausgebildet, ein maximales Lichtsignal aus dem erfassten Lichtsignal zu bestimmen, wobei der Referenzzeitpunkt auf der Grundlage des maximalen Lichtsignals bestimmt wird.
Insbesondere ist die Datenverarbeitungsvorrichtung dazu eingerichtet, den Referenzzeitpunkt auf Grundlage des Detektionszeitfensters zu bestimmen, bei dem das maximale Signal detektiert wurde.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Lichtmikroskop ein Emissionsfilter, das dazu ausgebildet ist, Hintergrundlicht während der Detektion des von den lichtemittierenden Einheiten emittierten Lichts zu entfernen, wobei das Emissionsfilter in einem Detektionsstrahlengang vor dem mindestens einen Detektor angeordnet ist, und wobei das Lichtmikroskop einen Aktuator umfasst, der dazu ausgebildet ist, das Emissionsfilter aus dem Detektionsstrahlengang zu entfernen, wenn der Aktuator ein Steuersignal von einer Steuervorrichtung, insbesondere der oben genannten Steuervorrichtung, empfängt. Insbesondere ist der Detektionsstrahlengang durch einen Strahlteiler von einem Beleuchtungsstrahlengang getrennt, entlang dem die ersten Lichtpulse von der ersten Lichtquelle zur Probe gelangen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die mit dem mindestens einen Detektor verbundene Steuervorrichtung dazu ausgebildet, ein zweites Detektionszeitfenster einzustellen, während dessen ein Emissionssignal von den lichtemittierenden Einheiten in der Probe durch den Detektor oder einen weiteren Detektor erfasst wird, wobei das Lichtmikroskop dazu ausgebildet ist, die Probe abzubilden oder einzelne lichtemittierende Einheiten in der Probe auf der Grundlage des bestimmten Referenzzeitpunkts zu lokalisieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Lichtmikroskop eine zweite Lichtquelle, die dazu ausgebildet ist, zweite Lichtpulse zu erzeugen, wobei das Lichtmikroskop ferner dazu ausgebildet ist, die Probe mit den zweiten Lichtpulsen zu beleuchten, wobei das Lichtmikroskop insbesondere einen Strahlkombinierer umfasst, der dazu ausgebildet ist, das Licht der ersten Lichtpulse und der zweiten Lichtpulse in einem gemeinsamen Strahlengang zu kombinieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop einen Lichtmodulator auf, der dazu ausgebildet ist, eine Lichtverteilung des Lichts der zweiten Lichtpulse zu erzeugen, wobei die Lichtverteilung ein lokales Intensitätsminimum in einem Fokus in der Probe aufweist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Datenverarbeitungsvorrichtung dazu ausgebildet, eine Zeitverzögerung zwischen den ersten Lichtpulsen und den zweiten Lichtpulsen auf der Grundlage des von dem mindestens einen Detektor erfassten Lichtsignals zu bestimmen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop eine erste Steuervorrichtung auf, die mit der ersten Lichtquelle verbunden ist, und/oder das Lichtmikroskop weist eine zweite Steuervorrichtung auf, die mit der zweiten Lichtquelle verbunden ist, wobei die erste Steuervorrichtung dazu ausgebildet ist, eine Pulsfolge der ersten Lichtpulse zu bestimmen, und/oder wobei die zweite Steuervorrichtung dazu ausgebildet ist, eine Pulsfolge der zweiten Lichtpulse zu bestimmen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop eine Verzögerungseinheit auf, die dazu ausgebildet ist, die Zeitverzögerung zwischen den ersten Lichtpulsen und den zweiten Lichtpulsen auf der Grundlage des erfassten Lichtsignals einzustellen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Detektor dazu ausgebildet, sowohl das Lichtsignal als auch von den lichtemittierenden Einheiten in der Probe emittiertes Licht zu erfassen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop einen ersten Detektor und einen separaten zweiten Detektor auf, wobei der erste Detektor dazu ausgebildet ist, das Lichtsignal zu erfassen, und wobei der zweite Detektor dazu ausgebildet ist, von den lichtemittierenden Einheiten in der Probe emittiertes Licht zu erfassen.
Ein dritter Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Computerprogramm, das Programmcode umfasst, der dazu ausgebildet ist, das Lichtmikroskop gemäß dem zweiten Aspekt zu veranlassen, das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt auszuführen.
Sämtliche Merkmale des Verfahrens nach dem ersten Aspekt gelten analog auch für das Lichtmikroskop nach dem zweiten Aspekt das Computerprogramm nach dem dritten Aspekt.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen zu den Zeichnungen. Die beschriebenen Vorteile von Merkmalen und / oder Merkmalskombinationen der Erfindung sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen.
Hinsichtlich des Offenbarungsgehalts (aber nicht des Schutzbereichs) der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents gilt Folgendes: Weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten relativen Anordnungen und Wirkverbindungen - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen, was aber nicht für die unabhängigen Patentansprüche des erteilten Patents gilt.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen

1 zeigt eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einer Lichtquelle zur Erzeugung erster Lichtpulse;
2 zeigt das Verschieben eines ersten Detektionszeitfensters zur Erfassung eines maximalen Lichtsignals gemäß einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
3 zeigt eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einer ersten Lichtquelle und einer zweiten Lichtquelle zur Erzeugung erster und zweiter Lichtpulse;
4 zeigt schematisch die Einstellung einer Zeitverzögerung zwischen ersten Lichtpulsen und zweiten Lichtpulsen gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
5 zeigt eine dritte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops;
6 zeigt eine vierte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops.

Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein erfindungsgemäßes Lichtmikroskop 1 zur mikroskopischen Analyse einer Probe 2, z. B. durch Abbildung von Strukturen in der Probe 2, insbesondere von Strukturen, die mit lichtemittierenden Einheiten (z.B. Fluorophoren) markiert sind, oder durch Lokalisierung einzelner lichtemittierender Einheiten in der Probe 2. Das in 1 dargestellte Lichtmikroskop 1 ist insbesondere ein konfokales Rastermikroskop.
Das Lichtmikroskop 1 umfasst eine erste Lichtquelle 3 (z. B. eine gepulste Laserquelle), die dazu ausgebildet ist, erste Lichtpulse P1 zu erzeugen, um die Probe 2 zu beleuchten. Die ersten Lichtpulse P1 werden an einem dichroitischen Spiegel 5 reflektiert und passieren anschließend einen Scanner 6 mit einem oder mehreren (typischerweise mindestens zwei) Scan-Spiegeln 61 und einer Scan-Linse 62 sowie eine Tubuslinse 7 und werden durch ein Objektiv 8 in die Probe 2 fokussiert.
Lichtemittierende Einheiten in der Probe 2 emittieren Licht (z. B. Fluoreszenzlicht) als Reaktion auf die ersten Lichtpulse P1. Dieses Licht wandert von der Probe 2 durch das Objektiv 8 und die Tubuslinse 7 zurück, wird vom Scanner 6 entscannt und aufgrund seiner Wellenlänge von dem dichroitischen Spiegel 5 transmittiert.
Zur erfindungsgemäßen Erfassung des Lichtsignals zur Bestimmung des Referenzzeitpunkts kann gemäß der in 1 gezeigten Ausführungsform mit einem Detektor 10, insbesondere einem Punktdetektor, wie einer Avalanche-Photodiode, einem Photomultiplier oder einem Hybriddetektor, von Strukturen in der Probe 2 reflektiertes oder gestreutes Licht der ersten Lichtpulse P1 erfasst werden, insbesondere dann, wenn der dichroitische Spiegel 5 einen gewissen Anteil des Reflexions- oder Streulichts transmittiert. Hierzu kann in einem Kalibrierungsschritt vor der eigentlichen Messung mit einem Aktuator 17 ein zwischen dem Detektor 10 und dem dichroitischen Spiegel 5 angeordneter Emissionsfilter 16 aus dem Strahlengang ausgeschwenkt werden. Das reflektierte oder gestreute Licht kann z. B. durch Reflexion oder Streuung der ersten Lichtpulse P1 an Strukturen (z. B. reflektierenden Partikeln, wie Goldkügelchen) in der Probe 2 oder einer Struktur, die mit einem Probenträger verbunden ist, der die Probe 2 hält, z. B. einem Glasträger oder einem Deckglas, entstehen. Reflektiertes oder gestreutes Licht ist vorteilhaft, da es fast unmittelbar nach dem Auftreffen der ersten Lichtpulse P1 auf die Probe 2 auftritt. Daher kann der Referenzzeitpunkt t₀ bei Verwendung von reflektiertem oder gestreutem Licht sehr genau bestimmt werden.
Das während eines Messschritts zur Abbildung von Strukturen in der Probe 2 von lichtemittierenden Einheiten in der Probe 2 ausgestrahlte und von dem dichroitischen Spiegel 5 transmittierte Emissionslicht passiert eine konfokale Lochblende 9 und wird von demselben Detektor 10, aufgenommen.
Alternativ kann der in 1 gezeigte Aufbau auch erfindungsgemäß verwendet werden, wenn das zur Bestimmung des Referenzzeitpunktes to verwendete Licht von Emittern in der Probe 2 ausgehendes Licht (z.B. Lumineszenzlicht) ist. Auch in diesem Fall kann derselbe Detektor 10 in einem Kalibrierschritt zur Bestimmung des Referenzzeitpunktes t₀ und in einem anschließenden Messschritt zur Detektion von Licht genutzt werden, das der mikroskopischen Abbildung von Strukturen in der Probe 2 oder der Lokalisierung von einzelnen Emittern in der Probe 2 dient, wobei der Emissionsfilter 16 nicht aus dem Strahlengang entfernt werden muss.
Mit dem Detektor 10 ist eine Datenverarbeitungsvorrichtung 12 gekoppelt. Die Datenverarbeitungsvorrichtung 12 ist dazu ausgebildet, das erfasste Lichtsignal auszuwerten. Das Lichtmikroskop 1 umfasst ferner eine erste Steuervorrichtung 13, die dazu ausgebildet ist, ein erstes Detektionszeitfenster G1 des Detektors 10 einzustellen. Die Datenverarbeitungsvorrichtung 12 bestimmt dann anhand des ersten Detektionszeitfensters G1 den Referenzzeitpunkt to, für den ein maximales Lichtsignal von dem Detektor 10 erfasst wurde.
Das erste Detektionszeitfenster G1 ist eine Zeitspanne, in der das erfasste Licht vom Detektor 10 erfasst oder aufgezeichnet wird. Dieses Detektionszeitfenster kann z. B. dadurch realisiert werden, dass das von der Probe 2 ausgehende Licht zu bestimmten Zeiten abgeschattet oder abgeschwächt wird, so dass das Licht den Detektor 10 nur während des festgelegten Zeitintervalls erreicht. Dies kann z. B. durch eine schnell steuerbare Blende, etwa einen akusto-optischen Modulator (AOM), vor dem Detektor 10 erreicht werden. Alternativ kann der Detektor 10 kontinuierlich Licht erfassen, und das erste Detektionszeitfenster G1 kann auf der Ebene der Datenverarbeitung implementiert werden. Die Datenverarbeitungsvorrichtung 12 kann beispielsweise eine Auswerteelektronik enthalten, die so konfiguriert ist, dass sie Signale des Detektors 10 nur in bestimmten Zeitintervallen erfasst oder auswertet. Zu diesem Zweck kann z. B. ein zeitkorreliertes Einzelphotonenzählmodul (TCSPC) eingesetzt werden, das für das sogenannte „elektronische Gating“ konfiguriert ist.
Das obere Diagramm in 2 zeigt die zeitliche Verschiebung des ersten Detektionszeitfensters G1, während in dem unteren Diagramm in 2 die detektierte Lichtintensität für einen einzelnen ersten Lichtpuls P1 gegen die Startzeit des ersten Detektionszeitfensters G1 aufgetragen ist. Durch die Verwendung eines schmalen ersten Detektionszeitfensters G1 wird eine relativ scharfe Spitze des detektierten Lichts mit einem einzigen Intensitätsmaximum (maximales Lichtsignal I_max) erzielt. Der Zeitpunkt des maximalen Lichtsignals I_max ist der Referenzzeitpunkt t₀.
Da die erste Lichtquelle 3 typischerweise eine kontinuierliche Pulsfolge von ersten Lichtpulsen P1 aussendet, variiert natürlich auch das detektierte Lichtsignal periodisch, und bei Betrachtung über ein längeres Zeitintervall ergeben sich mehrere Profile wie das in 2 (untere Grafik) gezeigte. Daher wird zur Bestimmung des Referenzzeitpunkts t₀ das erste Detektionszeitfenster G1 insbesondere um ein Zeitintervall verschoben, das dem Puls-zu-Puls-Zeitintervall (Kehrwert der Pulswiederholungsrate) der ersten Lichtpulse P1 oder weniger entspricht.
Insbesondere ist die Breite des ersten Detektionszeitfensters G1 deutlich kleiner als die Emissionsdauer der lichtemittierenden Einheiten in der Probe 2, so dass der Referenzzeitpunkt to genau auf der Zeitskala der Emissionsdauer bestimmt werden kann.
3 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1, insbesondere eines STED- oder RESOLFT-Mikroskops, mit einer ersten Lichtquelle 3 zur Erzeugung erster Lichtpulse P1 und einer zweiten Lichtquelle 4 zur Erzeugung zweiter Lichtpulse P2, wobei das Licht der ersten Lichtpulse P1 und der zweiten Lichtpulse P2 mittels eines ersten dichroitischen Spiegels 5a und eines zweiten dichroitischen Spiegels 5b in einem gemeinsamen Strahlengang zusammengeführt wird.
Das kombinierte Licht des ersten und zweiten Lichtpulses P2 passiert einen Scanner 6 mit einem oder mehreren Scan-Spiegeln 61 und einer Scan-Linse 62, eine Tubuslinse 7 und wird dann durch ein Objektiv 8 auf die Probe 2 fokussiert. Der kombinierte Fokus kann durch Drehen der Scan-Spiegel 61 des Scanners 6 über die Probe gescannt werden.
Die ersten Lichtpulse P1 umfassen insbesondere Anregungslicht, das lichtemittierende Einheiten in der Probe 2 anregt, so dass diese als Reaktion auf das Anregungslicht Licht emittieren. Dieses emittierte Licht läuft durch das Objektiv 8 und die Tubuslinse 7 zurück, wird vom Scanner 6 entscannt und von dem ersten dichroitischen Spiegel 5a und dem zweiten dichroitischen Spiegel 5b aufgrund seiner Wellenlänge transmittiert. Das emittierte Licht passiert dann eine konfokale Lochblende 9 und wird von einem Detektor 10, insbesondere einem Punktdetektor, wie einer Avalanche-Photodiode, einem Photomultiplier oder einem Hybriddetektor, erfasst.
Die zweiten Lichtpulse P2 umfassen insbesondere Verhinderungslicht, das den angeregten Zustand der lichtemittierenden Einheiten in der Probe 2 depletiert (z. B. durch stimulierte Emissionsdepletion, STED), oder Schaltlicht, das die lichtemittierenden Einheiten in einen nicht emittierenden Dunkelzustand (z.B. einen Triplett-Zustand) überführt (wie z. B. aus der RESOLFT-Mikroskopie bekannt).
Insbesondere ist zwischen der zweiten Lichtquelle 4 und dem zweiten dichroitischen Spiegel 5b ein Lichtmodulator 11 angeordnet, der den Fokus des Lichts der zweiten Lichtpulse P2 im Fokus zu einer hohlen, insbesondere donut- oder bottle-beam-förmigen Lichtverteilung mit einem lokalen Minimum formt. Dadurch erfolgt die Verhinderung der Emission oder Umschaltung der lichtemittierenden Einheiten nur in einem kleinen Bereich um den geometrischen Fokus, was zu einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze führt. Der Lichtmodulator 11 kann z. B. ein programmierbarer räumlicher Lichtmodulator mit Pixeln (z. B. betrieben im Beugungs- oder Reflexionsmodus oder im Transmissionsmodus) oder eine Phasenplatte sein, die ein Verzögerungsmuster zur Phasenmodulation des durch die zweiten Lichtpulse P2 gebildeten Lichtstrahls aufweist. So kann z. B. ein sogenanntes Vortex-Phasenmuster angezeigt werden, um einen donutförmigen Fokus zu bilden, und ein ringförmiges Phasenmuster mit einem Phasensprung um den Wert π kann angezeigt werden, um einen bottle-beam-förmigen Fokus zu bilden.
Wie in 3 weiter dargestellt, ist die erste Lichtquelle 3 mit einer ersten Steuervorrichtung 13 verbunden, welche die Pulsfolge der ersten Lichtpulse P1 bestimmt, und die zweite Lichtquelle 4 ist mit einer zweiten Steuervorrichtung 14 verbunden, welche die Pulsfolge der zweiten Lichtpulse P2 bestimmt. Die erste Steuervorrichtung 13 und die zweite Steuervorrichtung 14 sind beide mit einer Verzögerungseinheit 15 verbunden, die die Zeitverzögerung t_d zwischen den ersten Lichtpulsen P1 und den zweiten Lichtpulsen P2 einstellt.
Die Einstellung der Zeitverzögerung t_d zwischen den ersten Lichtpulsen P1 und den zweiten Lichtpulsen P2 gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 4 dargestellt. Dabei wird wie oben beschrieben aus dem detektierten Lichtsignal der Referenzzeitpunkt t₀ bestimmt und auf Basis des Referenzzeitpunkts t₀ die Zeitverzögerung t_d zwischen den ersten Lichtpulsen P1 und den zweiten Lichtpulsen P2 durch die Verzögerungseinheit 15 eingestellt.
Dabei kann die Zeitverzögerung t_d zunächst insbesondere auf Null eingestellt werden, wie im oberen Diagramm der 4 gezeigt. Anschließend kann die Zeitverzögerung t_d wieder erhöht werden, insbesondere um eine Emissions-Verhinderungseffizienz und damit eine resultierende Ortsauflösung der STED-Mikroskopie zu optimieren. Vorteilhafterweise kann durch die erfindungsgemäße vorherige Kalibrierung der ersten Lichtpulse P1 und der zweiten Lichtpulse P2 die optimierte Zeitverzögerung t_d sehr genau und reproduzierbar von Experiment zu Experiment eingestellt werden, was zu genauen und reproduzierbaren Abbildungsergebnissen führt.
5 und 6 zeigen weitere Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1 mit jeweils einem ersten Detektor 10a zur Erfassung des Lichtsignals zur Bestimmung des Referenzzeitpunkts to und einem zweiten Detektor 10b zur Erfassung von Licht, das von lichtemittierenden Einheiten in der Probe 2 ausgeht, um beispielsweise Strukturen in der Probe 2 mikroskopisch abzubilden oder einzelne lichtemittierende Einheiten zu lokalisieren. Komponenten, die auch in den Lichtmikroskopen 1 gemäß 1 und/oder 2 enthalten sind, sind dabei mit denselben Bezugszeichen bezeichnet, wie in 1 bzw.
2. Bezüglich deren Funktionsweise wird auf die Beschreibung zu 1 bzw. 2 verwiesen.
Das Lichtmikroskop gemäß 5 weist einen Strahlteiler 18 auf, der einen kleinen Anteil des von der ersten Lichtquelle 3 erzeugten Lichts der ersten Lichtpulse P1 aus dem Strahlengang auskoppelt, welches mit dem ersten Detektor 10a erfasst wird, um den Referenzzeitpunkt t₀ wie weiter oben beschrieben durch Anpassung des ersten Detektionszeitfensters G1 zu bestimmen. Der Strahlteiler 18 kann insbesondere als teildurchlässiger Spiegel, Prisma oder beam sampler ausgebildet sein. Das ausgekoppelte Licht wird insbesondere mittels in 5 nicht gezeigter Linsen auf den Detektor 10a, z.B. eine Photodiode, fokussiert.
Der Strahlteiler 18 befindet sich gemäß der in 5 gezeigten Ausführungsform zwischen dem dichroitischen Spiegel 5 und dem Scanner 6.
Das in 6 gezeigte Lichtmikroskop 1 weist ebenfalls einen Strahlteiler 18 auf. Hier befindet sich dieser jedoch im Strahlengang zwischen der Tubuslinse 7 und dem Scanner 6. Auf diese Weise wird von der Probe 2 ausgehendes Streulicht oder von der Probe reflektiertes Licht von dem ersten Detektor 10a detektiert. Auch hier können Linsen vorgesehen sein, um das ausgekoppelte Licht auf den ersten Detektor 10a zu fokussieren. Weiterhin kann ein Filter (nicht gezeigt) zwischen dem Strahlteiler 18 und dem ersten Detektor 10a angeordnet werden, um zu verhindern, dass neben Streu- oder Reflexionslicht auch von den lichtemittierenden Einheiten in der Probe 2 ausgehendes Licht (z.B. Lumineszenzlicht) zum ersten Detektor 10a gelangt.
Dadurch, dass der Detektor 10a sich in dem in 6 gezeigten Aufbau relativ nah an der Probe 2 befindet, entspricht der mittels des ersten Detektors 10a bestimmte Referenzzeitpunkt to vorteilhafterweise relativ genau dem Zeitpunkt, zu dem die ersten Lichtpulse P1 auf die Probe 2 auftreffen.
Die in 5 und 6 gezeigten Lichtmikroskope 1 können auch mit einer zweiten Lichtquelle 4, z.B. in der in 3 gezeigten Weise kombiniert werden, etwa um die Probe 2 für die STED- oder RESOLFT-Mikroskopie mit zusätzlichem Depletions- oder Schaltlicht zu beleuchten.
Liste der Bezugszeichen

1: Lichtmikroskop
2: Probe
3: Lichtquelle, erste Lichtquelle
4: Zweite Lichtquelle
5, 5a, 5b: Dichroitischer Spiegel
6: Scanner
7: Tubuslinse
8: Objektiv
9: Lochblende
10: Detektor
11: Lichtmodulator
12: Datenverarbeitungsvorrichtung
13: Erste Steuervorrichtung
14: Zweite Steuervorrichtung
15: Verzögerungseinheit
16: Emissionsfilter
17: Aktuator
18: Strahlteiler
61: Scan-Spiegel
62: Scan-Linse
P1: Erster Lichtpuls
P2: Zweiter Lichtpuls
G1: Erstes Detektionszeitfenster
t: Zeit
t0: Referenzzeitpunkt
td: Zeitverzögerung
I: Intensität
Imax: Maximales Lichtsignal

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 9372334 [0009]
US 9952155 B2 [0010]
WO 2015022635 A1 [0012]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Moneron, K. Han, et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods 8, 571-573 [0010]
Barry, L.P.; Bollond, P.G.; Dudley, J.M.; Harvey, J.D.; Leonhardt, R.: ‚Autocorrelation of ultrashort pulses at 1.5 µm based on nonlinear response of silicon photodiodes‘, Electronics Letters, 32 (20), 1922-1923 [0016]
Youngchan Kim, Steven S. Vogel, „Measuring finio-photon microscopy ultrafast laser pulse duration at the sample plane using time-correlated singlephoton counting,“ J. Biomed. Opt. 25 (1) 014516 [0016]
Shin SI, Lim SL: „Simple Autocorrelation Measurement by Using a GaP Photoconductive Detector,“ J. Opt. Soc. Korea 20, 435-440 [0016]
Wolleschensky R., Feurer T., Sauerbrey R., Simon U.: „Characterization and optimization of a laser-scanning microscope in the femtosecond regime“; Applied Physics B: Lasers and Optics 67(1), 87-94 [0016]
Hage CH, Billard F, Kibler B, Finot G, Millot G: „Direct temporal reconstruction of picosecond pulse by cross-correlation in semiconductor device“ Electronics Letters 48(13), 778-780 [0016]
Balzarotti F, Eilers Y, Gwosch KC, Gynna, A, Westphal V, Stefani F, Elf J, Hell SW „Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes“, Science 355 (6325), 606-611 [0036]
Weber, M., Leutenegger, M., Stoldt, S. et al. MINSTED fluorescence localization and nanoscopy. Nat. Photonics 15, 361-366 [0037]

Claims

Verfahren zur Bestimmung eines Referenzzeitpunkts (t₀), wobei eine Probe (2) mittels einer ersten Lichtquelle (3) eines Lichtmikroskops (1) durch erste Lichtpulse (P1) beleuchtet wird, um lichtemittierende Einheiten in der Probe (2) anzuregen, wobei ein mittels der ersten Lichtpulse (P1) erzeugtes Lichtsignal mittels eines Detektors (10) des Lichtmikroskops (1) detektiert wird, und wobei der Referenzzeitpunkt (t₀) auf der Grundlage des detektierten Lichtsignals bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtsignal in mindestens zwei Messungen jeweils in einem ersten Detektionszeitfenster (G1) erfasst wird, wobei ein Startzeitpunkt des ersten Detektionszeitfensters (G1) für jede der Messungen angepasst wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem detektierten Lichtsignal ein maximales Lichtsignal (I_max) ermittelt wird, wobei der Referenzzeitpunkt (t₀) auf Grundlage des Detektionszeitfensters bestimmt wird, in dem das maximale Lichtsignal (I_max) erfasst wurde.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Detektionszeitfenster (G1) kürzer ist als eine Emissionslebensdauer der lichtemittierenden Einheiten in der Probe (2), wobei insbesondere das erste Detektionszeitfenster (G1) kürzer ist als 50 %, weiter insbesondere kürzer als 40 %, noch weiter insbesondere kürzer als 30 %, noch weiter insbesondere kürzer als 20 %, noch weiter insbesondere kürzer als 10 %, noch weiter insbesondere kürzer als 5 %, noch weiter insbesondere kürzer als 1 %, der Emissionslebensdauer der lichtemittierenden Einheiten in der Probe (2).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Lichtpulse (P1) nach der Bestimmung des Referenzzeitpunktes (t₀) zeitlich mit dem Referenzzeitpunkt (t₀) koordiniert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtsignal mittels eines ersten Detektors erfasst wird und von den lichtemittierenden Einheiten in der Probe (2) emittiertes Licht mittels eines zweiten Detektors erfasst wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erfasste Lichtsignal reflektiertes Licht oder Streulicht umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Emissionsfilter (16) aus einem Detektionsstrahlengang des Lichtmikroskops (1) entfernt wird, um das reflektierte oder gestreute Licht der ersten Lichtpulse (P1) zu erfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites Detektionszeitfenster für die mikroskopische Abbildung der Probe (2) oder eine Lokalisierung einzelner lichtemittierender Einheiten in der Probe (2) auf Grundlage des ermittelten Referenzzeitpunkts (t₀) eingestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (2) zusätzlich mit zweiten Lichtpulsen (P2) beleuchtet wird, wobei auf der Grundlage des Referenzzeitpunkts (t₀) eine Zeitverzögerung (t_d) zwischen den ersten Lichtpulsen (P1) und den zweiten Lichtpulsen (P2) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten Lichtpulse (P2) geeignet sind, die Lichtemission der lichtemittierenden Einheiten zu vermindern oder zu deaktivieren, wobei die Zeitverzögerung (t_d) zwischen den ersten Lichtpulsen (P1) und den zweiten Lichtpulsen (P2) nach der Bestimmung des Referenzzeitpunkts (t₀) angepasst wird, um eine Auflösung von in der Probe (2) abgebildeten Strukturen zu optimieren.
Lichtmikroskop (1) zur Bestimmung eines Referenzzeitpunktes (t₀), insbesondere nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend - eine erste Lichtquelle (3), die dazu ausgebildet ist, eine Probe (2) mit ersten Lichtpulsen (P1) zu beleuchten, um lichtemittierende Einheiten in der Probe (2) anzuregen, - einen Detektor (10), der dazu ausgebildet ist, ein Lichtsignal zu detektieren, und - eine Datenverarbeitungsvorrichtung (12), die dazu ausgebildet ist, auf der Grundlage des detektierten Lichtsignals einen Referenzzeitpunkt (t₀) zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (10) oder die Datenverarbeitungsvorrichtung (12) dazu ausgebildet ist, in mindestens zwei Messungen das Lichtsignal jeweils in einem ersten Detektionszeitfenster (G1) zu erfassen, wobei das Lichtmikroskop (1) eine Steuervorrichtung (13) aufweist, die dazu ausgebildet ist, einen Startzeitpunkt des ersten Detektionszeitfensters (G1) für jede der Messungen anzupassen.
Computerprogramm umfassend Programmcode, der dazu ausgebildet ist, das Lichtmikroskop (1) gemäß Anspruch 11 zu veranlassen, das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 auszuführen.