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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe, bei dem mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl während einer ersten Verweildauer ein Zielbereich einer Probe beleuchtet wird, um zumindest eine erste Teilmenge von in der Probe vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand zu überführen. Diese erste Teilmenge der Fluorophore emittiert beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenzphotonen, die zum Erzeugen eines ersten Rohbildes genutzt werden. Es wird mit einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl, der eine von der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedenes Strahlprofil hat, während einer zweiten Verweildauer der Zielbereich der Probe beleuchtet, um zumindest eine zweite Teilmenge der in der Probe vorhandenen Fluorophore aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand zu überführen. Diese zweite Teilmenge der Fluorophore emittiert beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenzphotonen, die zum Erzeugen eines zweiten Rohbildes genutzt werden. Ferner wird aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbild ein hochaufgelöstes Bild der Probe erzeugt. Die Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe.
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In
DE 10 2005 027 896 B4 ist ein Verfahren offenbart, bei dem Fluoreszenzfarbstoffe in einer Probe mit gepulstem Laserlicht angeregt werden. Der zeitliche Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Laserpulsen wird so eingestellt, dass er länger ist als die Lebensdauer eines angeregten Zustands, in den der Fluoreszenzfarbstoff durch den Laserpuls aus dem Grundzustand heraus angeregt wird.
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In Enderlein, Appl. Phys. Lett. 87, 094105 (2005) wird ein Verfahren zur Auflösungserhöhung durch eine zeitliche Analyse eines Fluoreszenzsignals offenbart. Das Verfahren wird mit einem konfokalen Rastermikroskop durchgeführt. Bei dem Verfahren werden die ersten Mikrosekunden nach Beginn der Bestrahlung der Fluorophore mit gepulstem Licht analysiert.
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In Fujita et al., Phys. Rev. Lett. 99, 228105 (2007) wird ein Verfahren beschrieben, das auf der Untersuchung einer Abhängigkeit einer Fluoreszenzausbeute von der Intensität von Laserlicht basiert, das einen in einer Probe angeordneten Fluoreszenzfarbstoff zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt. Eine beobachtete Sättigung wird zur Überauflösung verwendet. Bei dem Verfahren wird die Beleuchtungsstärke des Lichts mit einer Frequenz f im kHz-Bereich moduliert und mit einer höheren Frequenz detektiert, die ein ganzzahliges Vielfaches der Frequenz f ist, d.h. 2f, 3f, usw., was auch als harmonische Demodulation bezeichnet wird. Das Verfahren erfordert schnelle Detektoren mit Auslesegeschwindigkeiten im kHz-Bereich. Durch die demodulierte Detektion wird ein großer Teil des Fluoreszenzlichts überhaupt nicht detektiert. Das Verfahren hat außerdem eine unvorteilhaft lange Aufnahmezeit. Die Autoren berichten, dass bei Mikropartikeln, sogenannten „Beads“, eine Verweildauer pro Pixel von 0,2 ms beträgt. Dies entspricht bei einem Bild mit 512x512 Pixeln einer Aufnahmezeit von 52s. Ferner wird bei diesem Verfahren starke Photobleichung bemängelt, d.h. der durch Bestrahlung versachte Verlust an Fluoreszenzfähigkeit eines Fluoreszenzfarbstoffs.
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In Yamanaka et al., Journal of Biomedical Optics 13, 050507 (2008) und Yamanaka 2011, Biomed. Opt. Express 2, 1946 (2011) wird ein weiteres Verfahren beschrieben, das auf dem vorstehend beschriebenen Verfahren nach Fujita et al. aufbaut. Als wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens wird ebenfalls Photobleichung genannt.
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In Humpolickova et al., Biophys. J. 97, 2623 (2009) wird ein Verfahren beschrieben, das auf einer direkten Messung einer Sättigungskurve eines Fluoreszenzsignals basiert. Bei diesem Verfahren wird ebenfalls eine zeitlich modulierte Beleuchtung verwendet.
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In Kuang, C. et al., Sci. Rep. 3, 1441 (2013) ist ein Verfahren beschrieben, bei dem aus zwei bei unterschiedlicher Intensität und unterschiedlichem Strahlprofil eines gepulsten Lasers aufgenommenen Rohbildern ein hochaufgelöstes Bild einer Probe erzeugt wird. Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Aufnahmegeschwindigkeit nicht hoch genug ist, um bestimmte dynamische Prozesse beobachten zu können.
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In Zhao, Optica 4, 633 (2017) wird ein Verfahren beschrieben, das als „gesättigte Absorptionskonkurrenzmikroskopie“ (saturated absorption competition microscopy) bezeichnet wird. Bei diesem Verfahren wird ein erster Lichtstrahl, der einen gaußförmigen Querschnitt hat, mit einem zweiten Lichtstrahl gleicher Wellenlänge überlagert, der einen Donut-förmigen Querschnitt hat. Eine Probe wird mit den beiden Lichtstrahlen punktweise abgerastert, wobei an jedem Punkt der erste Lichtstrahl Fluoreszenz anregt und der zweite Lichtstrahl bei vergleichsweise hoher Intensität zur Sättigung von Fluorophoren im Randbereich des ersten Lichtstrahls verwendet wird. Um den Effekt der Sättigung aus dem überlagerten Fluoreszenzsignal extrahieren zu können, wird der erste Lichtstrahl zeitlich moduliert und das Signal über einen Lock-In-Verstärker gemessen. Die im Randbereich des Fokus durch den zweiten Lichtstrahl angeregten Fluorophore müssen relaxiert haben, bevor dort sinnvoll gemessen werden kann. Das bedeutet, dass entsprechende Wartezeiten eingeplant werden müssen, sollen benachbarte Punkte in der Probe nacheinander abgescannt werden, so dass sich die Aufnahmezeit verlängert.
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In
Zhang et al., arXiv 10.1.2018 ist ein Verfahren der „schrittweisen optischen Sättigung" (stepwise optical saturation), auch kurz als SOS bezeichnet, beschrieben. Bei dem Verfahren wird eine Anzahl von M Bildern aufgenommen, um eine Auflösungssteigerung um einen Faktor von
zu erreichen. Hierzu werden die M Bilder mit einander verrechnet.
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Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe anzugeben, das eine höhere Auflösung und einen besseren Bildkontrasts als bisher bekannte Verfahren ermöglicht und dabei schneller durchführbar ist. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, ein Mikroskop anzugeben, mit dem das vorgenannte Verfahren durchführbar ist.
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Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 12 gelöst.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe wird mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl während einer ersten Verweildauer ein Zielbereich einer Probe beleuchtet, um zumindest eine erste Teilmenge von in der Probe vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand zu überführen. Diese erste Teilmenge der Fluorophore emittiert beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenzphotonen, die zum Erzeugen eines ersten Rohbildes genutzt werden. Es wird mit einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl, der eine von der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedenes Strahlprofil hat, während einer zweiten Verweildauer der Zielbereich der Probe beleuchtet, um zumindest eine zweite Teilmenge der in der Probe vorhandenen Fluorophore aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand zu überführen. Diese zweite Teilmenge der Fluorophore emittiert beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenzphotonen, die zum Erzeugen eines zweiten Rohbildes genutzt werden. Ferner wird aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbild ein hochaufgelöstes Bild der Probe erzeugt. Die erste Verweildauer und die zweite Verweildauer sind kürzer als die Lebensdauer eines dritten Zustands der Fluorophore, in den eine dritte Teilmenge der Fluorophore durch die Beleuchtung des Zielbereichs der Probe mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl überführt wird und dessen Lebensdauer um einen Faktor von mindestens 2 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands.
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Unter Verweildauer wird in der vorliegenden Anmeldung der maximale Zeitraum verstanden, in dem der jeweilige Zielbereich durch den ersten bzw. zweiten Beleuchtungslichtstrahl beleuchtet wird. Unter Bestrahlungsleistung (oder kurz Leistung) wird in dieser Anmeldung die zeitlich gemittelte und über die beleuchtete Fläche integrierte Bestrahlungsstärke (Intensität) des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls verstanden. Mit Strahlprofil ist in der vorliegenden Anmeldung das transversale Intensitätsprofil des ersten bzw. zweiten Beleuchtungslichtstrahls gemeint. Mögliche Strahlprofile sind insbesondere durch Gauß-Strahlen, Bessel-Strahlen und Airy-Strahlen realisiert.
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Die beiden Teilmengen der Fluorophore können identisch oder verschieden sein. Insbesondere können sich die beiden Teilmengen auch überlappen.
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Die vorliegende Erfindung basiert auf der Nutzung der nichtlinearen Abhängigkeit der beim Übergang aus dem zweiten Zustand in den ersten Zustand emittierten Fluoreszenzphotonen von der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls am Ort des Fluorophors. Insbesondere basiert die Erfindung darauf, dass einer der beiden Beleuchtungslichtstrahlen, der Fluorophore für eine Zeitdauer beleuchtet, die kürzer ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands, maximal jedes in dem Zielbereich angeordnete Fluorophor anregen kann. Hierdurch sinkt die Anzahl an Fluorophoren, die durch eine höhere Leistung des Beleuchtungslichtstrahls noch zusätzlich anregbar sind, da schon bei geringerer Leistung ein Großteil der Fluorophore in einen angeregten Zustand überführt worden ist.
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Erfindungsgemäß werden wenigstens zwei Rohbilder der Probe zur Erzeugung eines hochaufgelösten Bildes der Probe erzeugt. Die beiden Rohbilder werden jeweils erzeugt, indem der Zielbereich der Probe mit einem der beiden Beleuchtungslichtstrahlen beleuchtet wird. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen weisen dabei unterschiedliche Strahlparameter auf, d.h. sie unterscheiden sich insbesondere in ihrer Leistung und/oder ihrem Strahlprofil voneinander. Da die Leistungen der beiden Beleuchtungslichtstrahlen jeweils nicht gleichmäßig über den Querschnitt des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls verteilt sind, wird jeweils nicht der gesamte Zielbereich mit der gleichen Beleuchtungsstärke beleuchtet. Somit ist die Anzahl an emittierten Fluoreszenzphotonen auch nicht gleichmäßig über den Zielbereich verteilt. Der Zielbereich wird hierdurch gleichsam in verschiedene Bereiche aufgeteilt. Diese Aufteilung lässt sich insbesondere durch Auswahl der Strahlparameter beeinflussen.
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Da die Anzahl der in den verschiedenen Bereichen des Zielbereichs emittierten Fluoreszenzphotonen nichtlinear von der Beleuchtungsstärke des Beleuchtungslichtstrahls in den verschiedenen Bereichen abhängt, können, beispielsweise durch Subtraktion des ersten Rohbildes von dem zweiten Rohbild oder umgekehrt, die verschiedenen Bereiche voneinander getrennt werden. Da die verschiedenen Bereiche kleiner sind als der jeweilige Strahldurchmesser der beiden Beleuchtungslichtstrahlen, entspricht dies einer Verbesserung der Auflösung und des Bildkontrasts. Bei Lichtblattmikroskopen entspricht dies wiederum einer Verbesserung der axialen Auflösung.
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Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt anstelle einer Sättigung des dritten Zustands eine Sättigung des zweiten Zustands aus. Die Lebensdauer des zweiten Zustands ist kürzer als die Lebensdauer des dritten Zustands. Somit können die erste Verweildauer und die zweite Verweildauer wesentlich kürzer als die Lebensdauer des dritten Zustands gewählt werden, da zwischen zwei aufeinanderfolgenden Aufnahmen nicht gewartet werden muss, bis der Großteil der Fluorophore aus dem dritten Zustand wieder in den ersten Zustand übergegangen ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit schneller durchführbar als bisher bekannte Verfahren, die auf einer Sättigung des dritten Zustands beruhen.
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Vorzugsweise ist die Lebensdauer des dritten Zustands der Fluorophore um einen Faktor von mindestens 10, mindestens 50 oder mindestens 100 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands. Vorzugsweise ist die Lebensdauer des dritten Zustands der Fluorophore um einen Faktor von höchstens 10, höchstens 100 oder höchstens 1000 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands, wobei in diesen Fällen die untere Grenze vorzugsweise 2, für eine obere Grenze von 10, 2 oder 10, für eine obere Grenze von 100, und 2, 10 oder 100 für eine obere Grenze von 1000 beträgt.
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Es versteht sich von selbst, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch mehr als zwei Rohbilder erzeugt werden können, aus denen das hochaufgelöste Bild der Probe erzeugt wird. Jedem weiteren Rohbild ist dabei einer der beiden Beleuchtungslichtstrahlen oder ein weiterer Beleuchtungslichtstrahl zugeordnet.
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Vorzugsweise sind die erste Verweildauer und/oder die zweite Verweildauer kürzer als die Lebensdauer des zweiten Zustands. Das bedeutet, dass der Zielbereich durch die beiden Beleuchtungslichtstrahlen jeweils für einen Zeitraum beleuchtet wird, der kürzer ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands. Hierdurch können alle in dem Zielbereich angeordneten Fluorophore maximal einmal aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand angeregt werden, wodurch unerwünschte phototoxische Effekte vermieden werden.
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Es ist vorteilhaft, wenn der Zielbereich der Probe wiederholt mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl beleuchtet wird. Insbesondere wird der Zielbereich zur Aufnahme weiterer Rohbilder mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl beleuchtet. Hierdurch kann insbesondere eine Folge von hochaufgelösten Bildern der Probe gewonnen werden, mit deren Hilfe sich dynamische Vorgänge in der Probe beobachten lassen. Vorzugsweise ist der zeitliche Abstand zwischen zwei Wiederholungen größer als die Lebensdauer des dritten Zustands. Dies stellt sicher, dass sich möglichst wenige Fluorophore in dem dritten Zustand befinden, wenn der Zielbereich erneut beleuchtet wird. Hierdurch tritt keine Sättigung der Fluorophore in dem dritten Zustand auf, welche die Ausbeute an Fluoreszenzphotonen verringern würde.
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Vorzugsweise werden der erste Beleuchtungslichtstrahl und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl durch eine gepulste Lichtquelle erzeugt, wobei die Pulslänge jeweils der ersten Verweildauer bzw. der zweiten Verweildauer entspricht. Dies ist eine besonders einfache Art und Weise, die beiden Verweildauern zu realisieren.
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Es ist vorteilhaft, wenn der zeitliche Abstand zwischen zwei Pulsen des ersten Beleuchtungslichtstrahls und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands. Der zeitliche Abstand ist hierdurch so gewählt, dass zwischen zwei Pulsen ein Großteil der in dem Zielbereich angeordneten Fluorophore aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand übergeht. Hierdurch wird eine ungewollte Sättigung der Fluorophore vermieden.
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Vorzugsweise ist der zeitliche Abstand zwischen zwei Pulsen des ersten Beleuchtungslichtstrahls und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls kürzer als die Lebensdauer des dritten Zustands.
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Vorzugsweise wird aus dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl ein den Zielbereich der Probe beleuchtendes Lichtblatt gebildet. Durch das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich insbesondere ein Lichtblatt bilden, das eine hohe axiale Auflösung besitzt.
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Alternativ oder zusätzlich wird aus dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl ein den Zielbereich der Probe beleuchtendes Punktmuster gebildet. Mit diesen Punktmustern wird jeweils der Zielbereich abgerastert. Hierdurch wird die Geschwindigkeit erhöht, mit der der Zielbereich mit den beiden Beleuchtungslichtstrahlen beleuchtet wird, da mehrere Punkte in dem Zielbereich gleichzeitig beleuchtet werden.
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Es ist vorteilhaft, wenn auf das erste Rohbild und das zweite Rohbild eine Rauschminderungsoperation angewendet wird. Hierdurch wird die Bildqualität des aus den beiden Rohbildern erzeugten hochaufgelösten Bildes der Probe weiter verbessert.
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Vorzugsweise werden im Rahmen der Weiterverarbeitung das erste Rohbild mit der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls und das zweite Rohbild mit der Leistung des zweiten Beleuchtungslichtstrahls normiert oder gewichtet. Hierdurch wird die weitere Verarbeitung der beiden Rohbilder zu dem hochaufgelösten Bild der Probe wesentlich vereinfacht.
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Vorzugsweise wird das hochaufgelöste Bild der Probe erzeugt, indem das erste Rohbild von dem zweiten Rohbild subtrahiert wird. Eine Subtraktion hat insbesondere den Vorteil, dass sensorspezifisches Rauschen, das auch als „fixed pattern noise“ bezeichnet wird und beispielsweise bei CMOS-Elementen auftritt, einfach entfernt wird.
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Alternativ oder zusätzlich werden zur Erzeugung des hochaufgelösten Bildes der Probe vorverarbeitete Bilder verwendet, die aus den beiden Rohbildern erzeugt worden sind. Die vorverarbeiteten Bilder werden durch eine oder mehrere Bildverarbeitungsoperationen aus den beiden Rohbildern gewonnen. Bei den Bildverarbeitungsoperationen kann es sich insbesondere um die vorgenannte Rauschminderungsoperation, eine digitale Filteroperation, eine Entfaltung und/oder die Subtraktion eines Hintergrundbildes, d.h. eines Bildes, das mit dem verwendeten Sensor aufgenommen wurden, ohne dass Licht auf den Sensor fällt, bzw. eine Vielzahl solcher Bilder, handeln.
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Die Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop zur hochaufgelösten lichtmikroskopischen Abbildung einer Probe. Das Mikroskop hat eine Beleuchtungseinrichtung, die ausgebildet ist, mit einem ersten Beleuchtungslichtstrahl während einer ersten Verweildauer einen Zielbereich einer Probe zu beleuchten, um zumindest eine erste Teilmenge von in der Probe vorhandenen Fluorophoren aus einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand zu überführen, wobei diese erste Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenzphotonen emittiert, und mit einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl, der eine von der Leistung des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedene Leistung und/oder ein von dem Strahlprofil des ersten Beleuchtungslichtstrahls verschiedenes Strahlprofil hat, während einer zweiten Verweildauer den Zielbereich der Probe zu beleuchten, um zumindest eine zweite Teilmenge der in der Probe vorhandenen Fluorophore aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand zu überführen, wobei diese zweite Teilmenge der Fluorophore beim Übergang aus dem zweiten Zustand zurück in den ersten Zustand Fluoreszenzphotonen emittiert. Das Mikroskop hat außerdem eine Bilderzeugungseinrichtung, die ausgebildet ist, aus den von der ersten Teilmenge der Fluorophore emittierten Fluoreszenzphotonen ein erstes Rohbild und aus den von der zweiten Teilmenge der Fluorophore emittierten Fluoreszenzphotonen ein zweites Rohbild zu erzeugen; und mit einer Bildverarbeitungseinrichtung, die ausgebildet ist, aus dem ersten Rohbild und dem zweiten Rohbild ein hochaufgelöstes Bild der Probe zu erzeugen. Die erste Verweildauer und die zweite Verweildauer sind kürzer als die Lebensdauer eines dritten Zustands der Fluorophore, in den eine dritte Teilmenge der Fluorophore durch die Beleuchtung des Zielbereichs der Probe mit dem ersten Beleuchtungslichtstrahl und/oder dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl überführt wird und dessen Lebensdauer um einen Faktor von mindestens 2 länger ist als die Lebensdauer des zweiten Zustands.
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Das Mikroskop ist beispielsweise ein Lichtblattmikroskop oder ein Konfokalmikroskop.
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Vorzugsweise umfasst die Beleuchtungseinrichtung eine gepulste Lichtquelle. Mit einer solchen gepulsten Lichtquelle lassen sich die beiden Verweildauern besonders einfach realisieren. Alternativ oder zusätzlich umfasst die Beleuchtungseinrichtung eine Strahlablenkungseinheit zum Bewegen des Beleuchtungsstrahls über die Probe. Vorzugsweise wird der erste Beleuchtungslichtstrahl mit einer ersten Geschwindigkeit und der zweite Beleuchtungslichtstrahl mit einer zweiten Geschwindigkeit über die Probe bewegt, wobei die erste Geschwindigkeit und die zweite Geschwindigkeit größer sind als der Quotient aus dem Durchmesser des ersten Beleuchtungslichtstrahls und der Lebensdauer des zweiten Zustands.
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Vorzugsweise umfasst die Bilderzeugungseinrichtung ein Flächensensorelement zum Erfassen des ersten Rohbildes und des zweiten Rohbildes. Das Flächensensorelement ist beispielsweise ein CCD- oder CMOS-Element.
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Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren näher erläutert.
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Es zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops als Ausführungsbeispiel;
- 2 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Mikroskops als weiteres Ausführungsbeispiel;
- 3a eine schematische Darstellung eines Beleuchtungsobjektivs und eines Detektionsobjektivs des erfindungsgemäßen Mikroskops nach den 1 und 2;
- 3b eine schematische Darstellung eines Beleuchtungslichtstrahls des erfindungsgemäßen Mikroskops nach den 1 und 2;
- 3c eine schematische Darstellung eines ersten Beleuchtungslichtstrahls und eines zweiten Beleuchtungslichtstrahls des erfindungsgemäßen Mikroskops nach den 1 und 2 als Ausführungsbeispiel;
- 3d eine schematische Darstellung des ersten Beleuchtungslichtstrahls und des zweiten Beleuchtungslichtstrahls des erfindungsgemäßen Mikroskops nach den 1 und 2 als weiteres Ausführungsbeispiel;
- 4a ein Diagramm, in dem eine nichtlineare Abhängigkeit einer Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen von der Intensität der Beleuchtungslichtstrahlen in linearer Skalierung verdeutlicht wird;
- 4b ein Diagramm, in dem die nichtlineare Abhängigkeit der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen von der Intensität der Beleuchtungslichtstrahlen in doppeltlogarithmischer Skalierung verdeutlich wird;
- 4c ein Diagramm, in dem die ortsabhängige Verteilung der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit von der ortsabhängigen Intensität gaußförmiger Beleuchtungslichtstrahlen verdeutlicht wird;
- 4d ein Diagramm, in dem die nichtlineare Abhängigkeit der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen von der Intensität besselförmiger Beleuchtungslichtstrahlen gezeigt ist;
- 5a ein Diagramm, in dem eine räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen bei einer Beleuchtung mit den gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahlen als Ausführungsbeispiel gezeigt sind;
- 5b ein Diagramm, in dem eine räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen bei einer Beleuchtung mit den besselförmigen Beleuchtungslichtstrahlen als Ausführungsbeispiel gezeigt ist;
- 6a 6a ist ein Diagramm, in dem Intensitätsprofile des ersten Teillichtstrahls und des zweiten Teillichtstrahls gezeigt sind;
- 6b ein Diagramm, in dem zwei Intensitätsprofile beispielhafter Überlagerungen des ersten und des zweiten Teillichtstrahls nach 6a zur Erzeugung von zwei Beleuchtungslichtstrahlen gezeigt sind;
- 6c ein Diagramm, in dem die effektiven Intensitätsprofile der Fluoreszenz der Probe bei Beleuchtung mittels der beiden Beleuchtungslichtstrahlen nach 6b gezeigt sind;
- 6d ein Diagramm, in dem beispielhaft effektive Fluoreszenz-Intensitätsprofile gezeigt sind, wie sie sich bei einer Durchführung des Verfahrens wie in den 6a bis 6c gezeigt ergeben;
- 7 ein Diagramm, in dem die Position eines Beleuchtungslichtstrahls in einem Zielbereich einer Probe und die Geschwindigkeit des Beleuchtungslichtstrahls in Abhängigkeit der Zeit dargestellt sind; und
- 8 ein vereinfachtes Energieniveauschema von Fluorophoren.
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1 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops 10 als Ausführungsbeispiel. Das Mikroskop 10 umfasst eine Beleuchtungseinrichtung 12, eine Bilderzeugungseinrichtung 14 und eine Bildverarbeitungseinrichtung 16.
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Die Beleuchtungseinrichtung 12 umfasst eine Lichtquelle 18 zum Erzeugen von Beleuchtungslicht 20, eine Strahlformungseinheit 22, eine Strahlablenkeinheit 26 und eine Beleuchtungsoptik 28. Die Strahlformungseinheit 22 wird insbesondere durch eine oder mehrere Zylinderlinsen, Gitter, Axikon-Lasertrahlformer, räumliche Lichtmodulatoren (SLM), digitale Mikrospiegelanordnungen (DMD) oder deformierbare Spiegel (DM, deformable mirrors) gebildet. Die Beleuchtungsoptik 28 umfasst ein aus einer Scan- und einer Tubuslinse bestehendes telezentrisches System 30 und ein Beleuchtungsobjektiv 32.
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Die Bilderzeugungseinrichtung 14 umfasst eine Detektionsoptik 40 und ein Sensorelement 48. Die Detektionsoptik 40 umfasst ein Detektionsobjektiv 42, eine Tubuslinse 44 und einen Emissionsfilter 46. Bei dem Sensorelement 48 handelt es sich beispielsweise um einen Flächensensor, insbesondere ein CCD- oder CMOS-Element, ein EMCCD-Element (EMCCD: electron multiplying charge-coupled device), oder eines der vorgenannten Elemente mit einem vorgeschaltetem, zeitlich hochfrequent modulierbarem Verstärker oder einen Punktsensor mit einer hohen zeitlichen Auflösung.
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Aus dem Beleuchtungslicht 20 wird durch die Strahlformungseinheit 22 ein erster Beleuchtungslichtstrahl und zeitlich auf den ersten Beleuchtungslichtstrahl folgend ein zweiter Beleuchtungslichtstrahl geformt, die der Einfachheit halber in 1 mit dem gemeinsamen Bezugszeichen 24 bezeichnet sind. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24 werden durch die Strahlablenkeinheit 26 und die Beleuchtungsoptik 28 der Beleuchtungseinrichtung 12 auf oder in einen Zielbereich 34 einer Probe 36 gerichtet. Durch die Strahlablenkeinheit 26 können die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24 auf oder innerhalb der Probe 36 bewegt werden.
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Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24 regen im Zielbereich 34 angeordnete Fluorophore aus einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten Zustand Z2 an. Diese Anregung ist weiter unten anhand von 8 näher beschrieben. Beim Übergang aus dem zweiten Zustand Z2 zurück in den ersten Zustand Z1 emittieren die Fluorophore Fluoreszenzphotonen, die Fluoreszenzlicht 38 bilden. Das Fluoreszenzlicht 38 wird durch die Detektionsoptik 40 zur Erzeugung von jeweils einem der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24 zugeordneten Rohbildern auf das Sensorelement 48 gerichtet.
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Die Bildverarbeitungseinrichtung 16 erzeugt aus den beiden Rohbildern ein hochaufgelöstes Bild der Probe 34.
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2 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops 50 als weiteres Ausführungsbeispiel. Das in 2 gezeigte Mikroskop 50 unterscheidet sich von dem in 1 gezeigten Mikroskop 10 im Wesentlichen dadurch, dass die Beleuchtungseinrichtung 52 eine Einheit 54 zum Erzeugen von zwei Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b mit unterschiedlichen Strahlprofilen umfasst. Gleiche oder gleich wirkenden Elemente sind in den 1 und 2 mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet.
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Die Einheit 54 umfasst zwei Strahlformungseinheiten 56, 58, zwei Strahlteiler 60, 62 und zwei Umlenkspiegel 64, 66. Durch den ersten Strahlteiler 60 wird ein Teil des Beleuchtungslichts 20 aus dem Strahlengang der Beleuchtungseinheit 52 ausgekoppelt und über den ersten Umlenkspiegel 64 zum Erzeugen des ersten Beleuchtungslichtstrahls 24a auf eine erste Strahlformungseinheit 56 gelenkt. Nach Verlassen der ersten Strahlformungseinheit 56 wird der erste Beleuchtungslichtstrahl 24a durch den zweiten Umlenkspiegel 66 auf den zweiten Strahlteiler 62 gelenkt, der den ersten Beleuchtungslichtstrahl 24a wieder in den Strahlengang der Beleuchtungseinrichtung 52 eingekoppelt. Der nichtausgekoppelte Teil des Beleuchtungslichts 20 wird durch den zweiten Strahlformungseinheit 58 zu dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl 24b geformt. Nach Verlassen der Einheit 54 sind die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b in 2 der Einfachheit halber wieder mit den gemeinsamen Bezugszeichen 24 bezeichnet. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b können zeitgleich oder aufeinander folgend erzeugt werden.
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Bei Verwendung einer breitbandigen Lichtquelle kann insbesondere eine spektrale Strahlteilung durch die beiden Strahlteiler 60, 62 erfolgen. Die Leistungen der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b hängen dann von der spektralen Breite der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b ab.
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Alternativ können zwei Lichtquellen genutzt werden, deren Wellenlängen geringfügig, beispielsweise um einige nm, insbesondere im Bereich von 1 nm bis 100 nm, beispielsweise 20 nm, gegeneinander versetzt sind, wobei die beiden Wellenlängen innerhalb des Absorptionsspektrums der Fluorophore liegen.
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Insbesondere kann es sich bei den beiden Strahlteilern 60, 62 auch um akustooptische Deflektoren (AOD) handeln. In dieser Ausgestaltung können die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b zudem eine unterschiedliche Wellenlänge und/oder Polarisation aufweisen.
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Es kann sich bei den beiden Strahlteilern 60, 62 auch um Strahlteiler mit einem farb- und/oder polarisationsabhängigen Teilungsverhältnis handeln. Hierdurch können z.B.
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Interferenzeffekte der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b in der Probe 36 ausgenutzt werden. Alternativ können die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b bei Verwendung einer gepulsten Lichtquelle auch so gegeneinander verzögert werden, dass sie sich zeitlich nicht überlappen. Die Verzögerung liegt dabei vorzugsweise innerhalb der Lebensdauer des zweiten Zustand Z2, idealerweise deutlich darunter.
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3a zeigt eine schematische Darstellung des Beleuchtungsobjektivs 32 und des Detektionsobjektivs 42 des erfindungsgemäßen Mikroskops 10, 50. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen sind der Einfachheit halber in 3a wieder mit dem gemeinsamen Bezugszeichen 24 bezeichnet.
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Das Beleuchtungsobjektiv 32 und das Detektionsobjektiv 42 sind auf den Zielbereich 34 gerichtet und derart angeordnet, dass ihre optischen Achsen senkrecht zueinander liegen. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24 werden so bewegt, dass sich den gesamten Zielbereich 34 abrastern, was durch einen Doppelpfeil P1 angedeutet ist.
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3b zeigt eine schematische Darstellung eines der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b des Mikroskops 10, 50. Der Beleuchtungslichtstrahl ist in dem Ausführungsbeispiel nach 3b ein Besselstrahl. Der linke Teil der 3b zeigt eine Ansicht des Beleuchtungslichtstrahls von dem Beleuchtungsobjektiv 32 her gesehen. Die durchgezogenen Linien deuten dabei Bereiche gleicher Beleuchtungsstärke an. Der rechte Teil der 3b zeigt eine Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichtstrahls senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 32.
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In 3b ist durch einen Doppelpfeil P2 eine Abrasterbewegung längs des Zielbereichs 34 angedeutet. Durch einen Doppelpfeil P3 ist eine Zuordnung der Bereiche gleicher Beleuchtungsstärke im linken Teil der 3b zu der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichtstrahls im rechten Teil der 3b angedeutet.
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3c zeigt in schematischer Darstellung eine beispielhafte Realisierung des ersten Beleuchtungslichtstrahls 24a und des zweiten Beleuchtungslichtstrahls 24b des Mikroskops 10, 50. Der linke Bereich der 3c zeigt die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b von dem Beleuchtungsobjektiv 32 her gesehen. Der rechte Teil der 3c zeigt jeweils die Intensitätsverteilung der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 32. Der erste Beleuchtungslichtstrahl 24a nach 3c ist ein Gaußstrahl und weist ein einziges Intensitätsmaximum auf. Der zweite Beleuchtungslichtstrahl 24b nach 3c weist zwei Intensitätsmaxima auf, die in der Darstellung nach 3c ober- und unterhalb des Intensitätsmaximums des ersten Beleuchtungslichtstrahls 24a liegen. Wie sich dies zur Steigerung der axialen Auflösung nutzen lässt, ist weiter unten anhand der 5a und 5b weiter unten beschrieben.
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In 3c ist durch einen Doppelpfeil P4 ist eine Abrasterbewegung längs des Zielbereichs 34 angedeutet. Durch einen Doppelpfeil P5 ist eine Zuordnung der Bereiche gleicher Beleuchtungsstärke im linken Teil der 3c zu den Intensitätsverteilungen der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b im rechten Teil der 3b angedeutet.
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3d zeigt in schematische Darstellung eine weitere beispielhafte Realisierung des ersten Beleuchtungslichtstrahls 25a und des zweiten Beleuchtungslichtstrahls 25b des Mikroskops 10, 50. Die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 25a, 25b nach 3d unterscheiden sich von den beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b nach 3c im Wesentlichen dadurch, dass sie jeweils als ein Lichtblatt bilden. Im Ausführungsbeispiel nach 3d erfolgt daher auch keine Abrasterbewegung durch die beiden Beleuchtungslichtstrahlen 25a, 25b.
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4a ist ein Diagramm, in dem eine nichtlineare Abhängigkeit einer Anzahl F emittierter Fluoreszenzphotonen von der Intensität I der Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b in linearer Skalierung verdeutlicht wird. Für die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen F wird dabei angenommen, dass F ∝ 1 / (1 + ISat / I) gilt, wobei ISat die Sättigungsintensität der Fluorophore ist. In der Darstellung nach 4a sind deshalb die Werte der Funktion 1 / (1 + ISat / I) gegenüber der normierten Intensität I/ISat aufgetragen. Es ist ein erster Bereich 68 zu erkennen, in dem die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen annähernd linear mit der ebenfalls eingezeichneten normierten Intensität I/ISat und damit mit der Intensität I der Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b skaliert. In einem zweiten Bereich 70 skaliert die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen deutlich nichtlinear mit der Intensität I/ISat und der Intensität I der Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b.
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4b ist ein Diagramm, in dem die nichtlineare Abhängigkeit der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen F von der Intensität I der Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b in doppeltlogarithmischer Skalierung verdeutlich wird. In der Darstellung nach 4b sind wie in 4a die Werte der Funktion 1 / (1 + ISat / I) gegenüber der normierten Intensität I/ISat aufgetragen.
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4c ist ein Diagramm, in dem die ortsabhängige Verteilung der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit von der ortsabhängigen Intensität gaußförmiger Beleuchtungslichtstrahlen verdeutlicht wird. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse sind die Werte der Funktion 1 / (1 + ISat / I(z)) aufgetragen, die proportional zu der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen F(z) an der Position z ist. I(z) ist die Intensität eines Gauß‘schen Beleuchtungsstrahls an der Position z. Eine erste Kurve G1 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität an der Position z=0 von I(z=0)=ISat/2. Eine zweite Kurve G2 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=ISat. Eine dritte Kurve G3 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=2ISat. Eine vierte Kurve G4 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=3ISat. Eine fünfte Kurve G5 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=4ISat. Aus der Zusammenschau der Kurven G1 bis G5 wird deutlich, dass die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen nichtlinear von der Intensität der gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahlen abhängig ist, da das Signal F um z=0 herum für eine weitere Steigerung der Intensität weniger stark ansteigt als im Randbereich z»0 oder z<<0, wo die gleiche relative Steigerung der Intensität für deutlich niedrigere absolute Werte zu deutlich weniger stark ausgeprägten Saturierungseffekten führt, F(z) also eher linear mit I(z) ansteigt.
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4d ist ein Diagramm, in dem die nichtlineare Abhängigkeit der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen von der Intensität besselförmiger Beleuchtungslichtstrahlen gezeigt ist. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse sind die Werte der Funktion 1 / (1 + ISat / I(z)) aufgetragen, die proportional zu der Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen F(z) an der Position z ist. Eine erste Kurve B1 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=ISat/2. Eine zweite Kurve B2 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=ISat. Eine dritte Kurve B3 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=2ISat. Eine vierte Kurve B4 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=3ISat. Eine fünfte Kurve B5 zeigt die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität von I(z=0)=4ISat. Aus der Zusammenschau der Kurven B1 bis B5 wird deutlich, dass die Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen nichtlinear von der Intensität der besselförmigen Beleuchtungslichtstrahlen abhängig ist.
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5a ist ein Diagramm, in dem die räumliche Verteilung der emittierten Fluoreszenzphotonen bei einer Beleuchtung mit den gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahlen verdeutlicht wird. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist die auf die Intensität des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls normierte Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen F(z) aufgetragen. Eine erste Kurve G6 zeigt die räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität in einem Bereich, in dem die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen linear mit der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls skaliert, also I(z=0) < Isat. Eine zweite Kurve G7 zeigt die räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen für einen gaußförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Intensität in einem Bereich, in dem deutliche Sättigungseffekte auftreten und die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen nichtlinear mit der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls skaliert, d.h. I(z=0) > Isat. Die Differenz zwischen den beiden Kurven G6, G7 ist eine vorteilhafte Messgröße, da sie nur in einem engen Bereich um z = 0 einen Wert annimmt, der signifikant von Null verschieden ist. Die Differenz kann durch Subtraktion eines dem ersten Beleuchtungslichtstrahl zugeordneten ersten Rohbildes von einem dem zweiten Beleuchtungslichtstrahl zugeordneten zweiten Rohbild ermittelt werden. In dem in den 1 und 2 beschriebenen Mikroskop 10, 50 entspricht der Bereich um z = 0 einem dünnen Bereich um die Fokusebene des Detektionsobjektivs 42. Somit wird durch eine Subtraktion der beiden Rohbilder eine verbesserte axiale Auflösung und ein höherer Bildkontrast erreicht, mit anderen Worten ein hochaufgelöstes und kontrastreiches Bild der Probe 36 erzeugt.
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5b zeigt ein Diagramm, in dem die räumliche Verteilung der emittierten Fluoreszenzphotonen bei einer Beleuchtung mit den besselförmigen Beleuchtungslichtstrahlen gezeigt ist. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist die auf die Intensität des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls normierte Anzahl emittierter Fluoreszenzphotonen aufgetragen. Eine erste Kurve B6 zeigt die räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer Gesamtleistung, die dazu führt, dass auch im Bereich vergleichsweise hoher Intensitäten des Hauptmaximums um z=0 herum die Intensität in einem Bereich liegt, in dem die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen linear mit der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls skaliert, da I(z) < ISat auch in diesem Bereich gilt. Eine zweite Kurve B7 zeigt die räumliche Verteilung emittierter Fluoreszenzphotonen für einen besselförmigen Beleuchtungslichtstrahl mit einer höheren Gesamtleistung, so dass im Bereich vergleichsweise hoher Intensitäten, also an der Position des Hauptmaximums (z = 0) deutliche Sättigungseffekte auftreten und die Anzahl der emittierten Fluoreszenzphotonen nichtlinear mit der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls skaliert. Auch hier ist die Differenz zwischen den beiden Kurven B6, B7 ist eine vorteilhafte Messgröße, da sie wie in dem Ausführungsbeispiel nach 5a in einem engen Bereich um z = 0 konzentriert ist, d.h. nur dort einen Wert annimmt, der signifikant von Null verschieden ist.
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Die 6a bis 6d zeigen ein spezielles Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel wird die Auflösung erhöht, indem die zwei Rohbilder der Probe 36 miteinander verrechnet werden, die bei gleichzeitiger Überlagerung eines ersten Teillichtstrahls und eines zweiten Teillichtstrahls aufgenommen worden sind, wobei die Verhältnisse der Leistungen dieser Teillichtstrahlen zueinander von der Aufnahme des ersten Rohbildes zur Aufnahme des zweiten Rohbildes variiert werden. Die beiden Rohbilder werden in dem gezeigten Ausführungsbeispiel für verschiedene Leistungen des schwächeren, zweiten Strahls und identische Leistung des stärkeren, ersten Teillichtstrahls aufgenommen.
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6a ist ein Diagramm, in dem Intensitätsprofile I1, I2 (und damit die Strahlprofile) des ersten Teillichtstrahls (mit Intensitätsprofil I1) und des zweiten Teillichtstrahls (mit Intensitätsprofil 12) gezeigt sind. Die Profile der beiden Teillichtstrahlen sind in der Darstellung in 6a auf ihre jeweiligen Intensitätsmaxima normiert. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Teillichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist die auf einen maximalen Wert von 1 normierte Intensität des jeweiligen Teillichtstrahls aufgetragen. Der erste Teillichtstrahl weist ein Intensitätsmaximum bei z = 0 auf. Der zweite Teillichtstrahl weist eine von zwei Intensitätsmaxima umgebene Nullstelle bei z = 0 auf. Die beiden Teillichtstrahlen werden in dem Zielbereich 34 der Probe 36 zur Erzeugung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls überlagert (siehe 1).
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6b ist ein Diagramm, in dem zwei Intensitätsprofile E1, E2 beispielhafter unterschiedlicher Überlagerungen (im Sinne von Linearkombinationen) des ersten und des zweiten Teillichtstrahls nach 6a zur Beleuchtung der Probe 36 bei der Aufnahme des ersten bzw. zweiten Rohbildes gezeigt sind. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Lichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist das Intensitätsprofil zweier Beleuchtungslichtstrahlen gezeigt, die sich aus zwei unterschiedlichen Überlagerungen der beiden Teillichtstrahlen mit den beiden in 6a gezeigten normierten Intensitätsprofilen I1, I2 ergeben. Es gilt: E1 = a1·I1 + b1·I2, E2 = a2·I1 + b2·I2. Die Koeffizienten ai, bi geben jeweils die Wichtung der beiden normierten Intensitätsprofile I1, I2 zueinander in dem durch Überlagerung erzeugten Beleuchtungslichtstrahl an. Die Koeffizienten ai, bi sind somit auch ein Maß für die Leistung der jeweils zur Erzeugung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls verwendeten Teillichtstrahlen. Im gezeigten Ausführungsbeispiel unterscheiden sich die Beleuchtungslichtstrahlen nur in der Leistung des ersten verwendeten Teillichtstrahls -wobei die Leistung des ersten verwendeten Teillichtstrahls für den zweiten Beleuchtungslichtstrahl E2 sehr viel kleiner ist als für den ersten Beleuchtungslichtstrahl E1 (also a2 << a1). Dies führt zu einem unterschiedlichen resultierenden Intensitätsprofil insbesondere bei z = 0. Die Leistung des zweiten verwendeten Teillichtstrahls ist für den ersten und den zweiten Beleuchtungslichtstrahl gleich (also b1 = b2). Die beiden Intensitätsprofile der Beleuchtungslichtstrahlen E1, E2 sind in 6b jeweils auf die maximale Intensität des zweiten verwendeten Teillichtstrahls normiert. Die Leistung des zweiten verwendeten Teillichtstrahls - und damit die maximale Intensität - ist sowohl für den ersten als auch den zweiten Beleuchtungslichtstrahl wesentlich höher als die Leistung und damit die maximale Intensität des ersten verwendeten Teillichtstrahls. Der zweite verwendete Teillichtstrahl sorgt durch seine hohe Intensität in den Bereichen der beiden Maxima für eine weitgehende Sättigung der Fluorophore in der Probe 36.
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6c ist ein Diagramm, in dem die effektiven Intensitätsprofile F1, F2 der Fluoreszenz der Probe 36 bei Beleuchtung mittels der beiden Beleuchtungslichtstrahlen nach 6b gezeigt sind. Auf der Abszissenachse ist die Position z senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Lichtstrahls aufgetragen. Auf der Ordinatenachse ist das auf sein jeweiliges Maximum normierte Fluoreszenzsignal aufgetragen. In 6c ist gut zu erkennen, dass es bei der Aufnahme der beiden Rohbilder jeweils es zu einer Sättigung der Fluorophore in den Bereichen der beiden Maxima kommt, wodurch sich die unterschiedlichen Leistungen der verwendeten ersten Teillichtstrahlen kaum auf die in diesem Bereich angeregte Fluoreszenz auswirkt. Bei z = 0 hingegen, wo der zweite Teillichtstrahl eine Nullstelle aufweist und folglich trotz hoher Leistung nur wenige Fluorophore anregt, treten keine Sättigungseffekte auf, und eine Änderung der Leistung des ersten Teillichtstrahls wirkt sich stark auf die in diesem Bereich angeregte Fluoreszenz aus. Das erste Rohbild, welches vom ersten Beleuchtungslichtstrahl E1 angeregte Fluoreszenz erfasst, und das zweite Rohbild, welches vom zweiten Beleuchtungslichtstrahl E2 anregte Fluoreszenz erfasst, unterscheiden sich damit hauptsächlich in dem Bereich um z = 0 (also für z = 0 und nahe z = 0). Subtrahiert man folglich die mit den unterschiedlichen Beleuchtungslichtstrahlen E1, E2 erzeugten Rohbilder voneinander, führt dies zu einer Auflösungsverbesserung, wie im Folgenden anhand von 6d erläutert wird.
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6d ist ein Diagramm, in dem beispielhaft effektive Fluoreszenz-Intensitätsprofile D1, D2 gezeigt sind, wie sie sich bei einer Durchführung des Verfahrens wie in den 6a bis 6c gezeigt ergeben. Die beiden effektiven Fluoreszenz-Intensitätsprofile D1, D2 ergeben sich aus der Differenz der beiden in 6c gezeigten Intensitätsprofile F1, F2. Damit entsprechen diese der erfindungsgemäßen Differenzbildung zweier Rohbilder. Die beiden effektiven Fluoreszenz-Intensitätsprofile D1, D2 zeigen zwei verschiedene beispielhafte Fälle: Das erste Intensitätsprofil D1 zeigt den Fall, dass die Leistung des zweiten Teillichtstrahls (Bezugszeichen I2 in 6a) nicht so stark ist, dass der resultierende Beleuchtungslichtstrahl im Bereich seiner Intensitätsmaxima zu einer weitgehenden Saturierung führt. Das zweite Intensitätsprofil D2 hingegen ergibt sich für eine Leistung des zweiten Teillichtstrahls, bei der die Intensität im Bereich der Maxima ausreichend hoch zur Saturierung der Fluorophore ist. Die Leistungen der verwendeten ersten Teillichtstrahlen sind für die beiden effektiven Fluoreszenz-Intensitätsprofile D1, D2 identisch. Die beiden effektive Fluoreszenz-Intensitätsprofile D1, D2 weisen jeweils ein Maximum bei z = 0 auf. Die Form des zweiten effektiven Fluoreszenz-Intensitätsprofils D2 zeigt deutlich, dass sich für eine hohe Leistung des zweiten verwendeten Teillichtstrahlen das erste effektive Fluoreszenz-Intensitätsprofil D1 deutlich verschmälert. Diese Verschmälerung entspricht einer Steigerung der Auflösung längs der z-Achse.
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7 ist ein Diagramm, in dem die Position x eines Beleuchtungslichtstrahls 24a, 24b in dem Zielbereich 34 der Probe 36 und die Geschwindigkeit v des Beleuchtungslichtstrahls 24a, 24b in Abhängigkeit der Zeit t dargestellt sind. Die Position x des Beleuchtungslichtstrahls 24a, 24b senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des jeweiligen Beleuchtungslichtstrahls 24a, 24b ist als eine erste Kurve K1 gezeigt, die die Form einer Sinuskurve mit einer Periode P hat. Die Geschwindigkeit des Beleuchtungslichtstrahls 24a, 24b ist als eine zweite Kurve K2 gezeigt, die die Form einer Sinuskurve hat, die um ein Viertel der Periode P der ersten Kurve K1 gegenüber der ersten Kurve K1 versetzt ist. In dem Ausführungsbeispiel nach 7 beträgt die Amplitude der ersten Kurve K1 100 µm. Die Frequenz der ersten Kurve ist f = 12 kHz. Somit kann der Zielbereich auf einer Länge von ca. 160 µm mit einer annähernd konstanten Geschwindigkeit durch den Beleuchtungslichtstrahl 24a, 24b abgerastert werden. Der Betrag der annähernd konstanten Geschwindigkeit ist >5 µm/µs. Die Probe 36 kann daher in einem Bereich von ca. 160 µm von einem Strahl beleuchtet werden, der mit einer Scangeschwindigkeit von mindestens 5µm/µs über die Probe bewegt wird. Die Beleuchtung der Probe 36 mit dem Beleuchtungslichtstrahl 24a, 24b kann entweder bidirektional oder unidirektional erfolgen. Im Fall der bidirektionalen Beleuchtung beträgt der Zeitabstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Beleuchtungen 15 µs. Im Fall der unidirektionalen Beleuchtung beträgt der Zeitabstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Beleuchtungen 83 µs. Ebenfalls ist möglich, dass die Probe 36 mit einem gepulsten Beleuchtungslichtstrahl beleuchtet wird, beispielsweise mit einer Frequenz von 1 Puls/µs = 1 MHz.
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8 zeigt ein vereinfachtes Energieniveauschema der Fluorophore, die in dem Zielbereich 34 der Probe 36 angeordnet sind. Das Energieniveauschema zeigt den ersten Zustand Z1, der einem Grundzustand der Fluorophore entspricht, den zweiten Zustand Z2, der einem angeregten Zustand der Fluorophore entspricht, und einen dritten Zustand Z3, der einem metastabilen Zustand der Fluorophore entspricht.
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Durch die Beleuchtung mit den beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24a, 24b werden die Fluorophore aus dem ersten Zustand Z1 in den Zweiten Zustand Z2 angeregt. Beim Übergang aus dem zweiten Zustand Z2 zurück in den ersten Zustand Z1 emittieren die Fluorophore Fluoreszenzphotonen, die das Fluoreszenzlicht 38 bilden. Dieser Übergang ist in 8 durch einen Pfeil Pd1 gekennzeichnet. Statt zurück in den ersten Zustand Z1 können die Fluorophore auch aus dem zweiten Zustand Z2 in den dritten Zustand Z3 übergehen. Dieser Übergang ist in 8 durch einen Pfeil Pd2 gekennzeichnet. Die Übergangswahrscheinlichkeit aus dem zweiten Zustand Z2 in den dritten Zustand Z3 ist jedoch deutlich, beispielsweise um einen Faktor von 100, vorzugsweise um einen Faktor von 1000, geringer als die Übergangswahrscheinlichkeit aus dem zweiten Zustand Z2 in den ersten Zustand Z1. Die Lebensdauer des zweiten Zustands Z2 beträgt beispielsweise zwischen 1 ns und 100 ns. Die Lebensdauer des dritten Zustands Z3 beträgt beispielsweise zwischen 10 µs und 1 ms. Aufgrund seiner vergleichsweise langen Lebensdauer wird der dritte Zustand Z3 auch als metastabiler Zustand bezeichnet.
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Bezugszeichenliste
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- 10
- Mikroskop
- 12
- Beleuchtungseinrichtung
- 14
- Bilderzeugungseinrichtung
- 16
- Bildverarbeitungseinrichtung
- 20
- Beleuchtungslicht
- 22
- Strahlformungseinheit
- 24, 24a, 24b, 25a, 25b
- Beleuchtungslichtstrahl
- 26
- Strahlablenkeinheit
- 28
- Beleuchtungsoptik
- 30
- telezentrisches System
- 32
- Beleuchtungsobjektiv
- 34
- Zielbereich
- 36
- Probe
- 38
- Fluoreszenzlicht
- 40
- Detektionsoptik
- 42
- Detektionsobjektiv
- 44
- Tubuslinse
- 46
- Emissionsfilter
- 48
- Sensorelement
- 50
- Mikroskop
- 52
- Beleuchtungseinrichtung
- 54
- Einheit
- 56, 58
- Strahlformungseinheit
- 60, 62
- Strahlteiler
- 64, 66
- Umlenkspiegel
- 68, 78
- Bereich
- B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7
- Kurve
- D1, D2, E1, E2, F1, F2,
- Intensitätsprofil
- I1, I2 I
- Intensität
- x, z
- Position
- V
- Geschwindigkeit
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102005027896 B4 [0002]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Enderlein, Appl. Phys. Lett. 87, 094105 (2005) [0003]
- Fujita et al., Phys. Rev. Lett. 99, 228105 (2007) [0004]
- Yamanaka et al., Journal of Biomedical Optics 13, 050507 (2008) [0005]
- Yamanaka 2011, Biomed. Opt. Express 2, 1946 (2011) [0005]
- Humpolickova et al., Biophys. J. 97, 2623 (2009) [0006]
- Kuang, C. et al., Sci. Rep. 3, 1441 (2013) [0007]
- Zhang et al., arXiv 10.1.2018 ist ein Verfahren der „schrittweisen optischen Sättigung“ [0009]