DE102005020202A1

DE102005020202A1 - Hochauflösende optische Mikroskopie

Info

Publication number: DE102005020202A1
Application number: DE102005020202A
Authority: DE
Inventors: Jörg Dr. PD Enderlein
Original assignee: PicoQuant GmbH
Current assignee: PicoQuant GmbH
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2006-11-09
Also published as: DE502006001843D1; US20080192262A1; EP1875293A1; US7817269B2; WO2006114329A1; EP1875293B1; ATE411544T1

Abstract

Zur Verbesserung der Auflösung der Mikroskopie wird ein Anregungslaser in eine Probe fokussiert und plötzlich eingeschaltet. Der zeitliche Verlauf der sich ergebenden Transienten der Fluoreszenz wird erfasst, wobei dieser Verlauf eine Abhängigkeit von der Anregungsintensität aufweisen muss. Unterschiedliche Muster für den zeitlichen Verlauf unterschiedlicher Transienten für einzelne Werte der Anregungsintensität werden bestimmt und an die gemessene Transiente gefittet. Die Amplitude desjenigen Musters wird ermittelt, welches der Anregungsleistung im Fokus entspricht. Diese Amplitude wird als Wert eines Pixels genommen. Auf diese Art wird die Probe gescannt. Durch die Auswertung der Transienten wird die räumliche Auflösung unter die Abbe-Grenze verbessert.

Description

Gebiet der Erfindung
Fluoreszenz-Mikroskopie ist ein nicht mehr wegzudenkender Bestandteil moderner Life-Sciences.
Die wesentliche Beschränkung der Fluoreszenz-Mikroskopie liegt in ihrer begrenzten räumlichen Auflösung, die traditionell mit dem Abbe-Grenze angegeben wird und bei ca. 200 nm in lateraler Richtung liegt.
Stand der Technik
Die Verbesserung der räumlichen Auflösung der optischen Mikroskopie ist seit langem das Ziel vieler Arbeiten. Vorgeschlagen wurden u. a. die folgenden Ansätze:

– 4Pi-Mikroskopie [S. W. Hell und H. K. Stelzer, J. Opt. Soc. Am. A 9, 2159 (1992)], bei der mit zwei Objektiven gegenläufige Anregungsstrahlen auf eine Probe fokussiert werden.
– InM-Mikroskopie, bei der mit räumlich modulierter Lichtanregung gearbeitet wird [M.G.L. Gustafsson, J. Microsc. 198, 82 (2000)].
– Mehrphotonen-Anregung [W. Denk, J.H. Strickler und W.W. Webb, Science 248, 73 (1990)].
– RESOLFT, welches nichtlineare Sättigungseffekte nutzt [S.W. Hell, M. Dyba und S. Jakobs, Curr. Opin. Neurobiol. 14, 1 (2004)].
– STED (stimulated emission depletion) [S.W. Hell, in: Topics in Fluorescence Spectroscopy, 5^th Edn., Edited by J.R. Lakowicz (Plenum Press, New York, 1997) Seiten 361–422].

Aufgabe
Aufgabe der Erfindung ist es, die räumliche Auflösung von Mikroskopen weiter zu verbessern.
Lösung
Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Voraussetzung für die Anwendbarkeit der Erfindung ist, dass das an einem Ort der mikroskopierten Probe generierte Lichtsignal S bei einer Änderung der Anregungsintensität Transienten aufweist, deren zeitlicher Verlauf von der Anregungsintensität abhängt. Für die Erfindung ist es daher wichtig, die Lichtanregung zeitlich zu modulieren. Betrachten wir kurzzeitig die Verhältnisse an einem gegebenen Ort der mikroskopierten Probe. Die zeitlich modulierte Anregungsintensität A(t) kann dann allgemein geschrieben werden als A(t) = aα(t), wobei t die Zeit ist, α(t) die normierte zeitliche Modulation der Anregung und a die Amplitude der Anregung. Das aufgrund der Anregung durch die Probe generierte Signal wird gleichermaßen in normierte zeitliche Modulation und Amplitude unterteilt, S(t) = sσ(t).
Würde zwischen Anregung und Signal eine strikt lineare Beziehung bestehen, S(t) = cA(t),wobei c eine vom optischen Aufbau sowie von der Probenbeschaffenheit am gegebenen Ort abhängige Konstante ist (Probencharakteristik), z. B. die Konzentration eines Fluoreszenzfarbstoffs, dann wären die Amplituden von Anregung und Signal linear proportional zueinander, s = ca, und die normierten Zeitmodulationsfunktionen wären identisch, σ(t) = α(t).
Somit ließe sich durch die zeitliche Modulation der Anregung aus der Signalamplitude s keinerlei zusätzlicher gesonderter Erkenntnisgewinn über die Funktionen c und a gewinnen. Diese Aussage, dass aus dem Zeitverhalten nichts über die räumliche Struktur der Probe gelernt werden kann, gilt auch für die allgemeinere Beziehung
mit f als einer Intensitätsunabhängigen Responsefunktion (z. B. einer Fluoreszenzabklingkurve).
Bei einer allgemeinen nichtlinearen Abhängigkeit jedoch, S(t) = F[c, A(t)],erhält man u. a. die allgemeine Beziehung σ(t) = G[c, a, α(t)],so dass die zeitliche (normierte) Modulation des Signals σ eine Funktion auch der Anregungsamplitude a und der Probencharakteristik c wird.
Es lässt sich aus dem Zeitverhalten nichts über die räumliche Struktur der Probe lernen, sofern eine Zerlegung von G in folgende Anteile existiert: G[c, a, α(t)] = f(c, a) + g(c, a)·h(α(t)),
Die gewünschte Information lässt sich nur gewinnen, sofern auch h von a abhängt, also keine derartige Zerlegung von G existiert. In den noch zu schildernden bevorzugten Ausführungsbeispielen hat h z. B. die Form: h(α(t)) = h(j(a)·t)
G hat in diesen Ausführungsbeispielen stets die Form: G[c, a, α(t)] =c·{f(a) + g(a)·h(j(a)·t)}.
In jedem Verfahren optischer Mikroskopie ist das im Mikroskop durch einen Detektor (Punktdetektor oder Pixel auf einer Kamera, z. B. einer CCD-Kamera) gemessene Signal ein Integral über einen Raumbereich, der mindestens so groß ist wie die durch die Lichtbeugung definierte Auflösungsgrenze des Mikroskops. Dann verallgemeinert sich die letzte Gleichung zu σ(t)∝ ∫drU(r)G[c(r), a(r), α(t)],wobei U(r) eine Funktion ist, welche die Detektionseffizienz des Detektors für Licht vom Ort r der Probe beschreibt (z.B. die sog. Point-Spread-Funktion der Optik), und wobei die Integ ration über das gesamte Volumen der Probe erfolgt. Das fett gedruckte r steht für den dreidimensionalen Ortsvektor.
Kernpunkt der Erfindung ist es, durch Auswertung der zeitlichen Modulation σ(t) des Signals Informationen über die Probencharakteristik c(r) zu erhalten, mit einer räumlichen Auflösung, die unter der durch die Funktion U(r) bestimmten beugungsbegrenzten Auflösung liegt.
Im Folgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrieben. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden, und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen.
Zur Lösung der Aufgabe wird das folgende Verfahren vorgeschlagen:
Zum Bestimmen der räumlichen Struktur eines Objekts wird zunächst ein geeignetes Objekt derart ausgewählt, dass es mindestens eine Substanz enthält, die durch elektromagnetische Strahlung zur Emission elektromagnetischer Strahlung angeregt werden kann, wobei die Verteilung dieser Substanz im Objekt nachgewiesen wird.
Die räumliche Struktur eines Objekts, zweidimensional oder dreidimensional, lässt sich durch ein entsprechendes räumlich aufgelöstes Bild von zumindest Teilen der Probe aufklären.
Elektromagnetische Strahlung ist dabei insbesondere Licht, also elektromagnetische Strahlung im sichtbaren Bereich.
Objekte, die durch elektromagnetische Strahlung zur Emission elektromagnetischer Strahlung angeregt werden können sind z. B. solche, die mit einem Farbstoff markiert wurden. Typische Beispiele sind Zellen, in denen gewisse Strukturelemente selektiv durch Farbstoffmarkierung sichtbar gemacht wurden oder von sich aus z. B. fluoreszieren. Dabei kann ein Objekt auch mit mehreren Farbstoffen markiert sein, die mit derselben oder unterschiedlichen Anregungswellenlängen zur Emission angeregt werden können. Ferner gehören dazu selbstleuchtende Substanzen, d. h. solche, die ohne eine zusätzliche Farbstoffmarkierung zur Emission angeregt werden können.
Die Emission elektromagnetischer Strahlung nach elektromagnetischer Anregung umfasst alle Arten der Lichtstreuung durch Moleküle bzw. Objekte, sei sie spontan, wie bei der Raman-Streuung, oder verzögert, wie bei der Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, sei sie frequenzverschoben (inelastisch) oder bei der Anregungswellenlänge (elastisch). Im Folgenden wird in der Regel ohne Beschränkung der Allgemeinheit lediglich die bevorzugte Ausführungsform, die Fluoreszenz, näher erläutert.
Ein Anregungsstrahl wird derart in das Objekt eingekoppelt, dass sich eine räumlich inhomogene Verteilung der Anregung im Objekt ergibt. Dies kann z. B. im Fokus eines Strahls mit einer Gauß-Verteilung der Intensitätsverteilung erreicht werden, oder durch eine räumlich modulierte Verteilung der Anregungsintensität, etwa mittels Interferenz. Als Anregungsstrahl wird in der Regel der Strahl eines Lasers verwendet.
Der Wellenlängenbereich des Anregungsstrahls wird derart gewählt, dass der Anregungsstrahl die Substanz zur Emission anregen kann.
Die Intensität des Anregungsstrahls wird geändert, wodurch sich zeitliche Transienten der Emission elektromagnetischer Strahlung durch die Substanz ergeben. Typischerweise ist die Anregungsstrahlung zunächst ausgeschaltet und wird zu einem gegebenen Zeitpunkt möglichst momentan eingeschaltet und für eine gegebene Zeit konstant gelassen. Danach wird die Anregungsstrahlung wieder ausgeschaltet und für eine gegebene Zeit ausgeschaltet gelassen, so dass sich ein zeitliches Rechteckmuster ergibt mit Einschaltperioden und Ausschaltperioden. In der Regel wird nach dem plötzlichen Einschalten und während der Einschaltperioden die Emission gemessen. Die Emission zeigt unmittelbar nach dem plötzlichen Einschalten zeitlich verlaufende Transienten bis sich ein Steady-State einstellt, der der zum Beispiel phasenweise konstanten Anregungsleistung entspricht. In einem solchen Beispiel werden die Ein-/Ausschaltperioden des Anregungsstrahls an die Lebensdauer z. B. des Fluoreszenzfarbstoffs angepasst: die Einschaltperiode ist ca. gleich der Fluoreszenzlebensdauer, die Ausschaltperiode ca. 5 bis 10 mal länger, so das vor dem nächsten Einschalten alle Moleküle in den Grundzustand zurückkehren konnten.
Möglich ist jedoch auch eine andere, vorgegebene Art der Modulation der Intensität des Anregungsstrahls, der die Emission mit einem gewissen (transienten) Muster folgt, sofern sich aus ihr die im Folgenden geschilderten Schlüsse ziehen lassen. Denkbar ist z. B. eine sinusförmige Modulation der Anregungsintensität.
Die Substanz und der Anregungswellenlängenbereich werden derart aufeinander abgestimmt, dass die zeitlichen Transienten der Emission elektromagnetischer Strahlung nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls von der jeweiligen räumlichen Intensität des Anregungsstrahls abhängen.
Eine zeitliche Modulation der Anregungsleistung an jedem Ort der Probe kann auch durch eine zeitlich veränderliche räumliche Modulation der Anregungsintensität erreicht werden, z. B. durch eine in der Zeit erfolgende Relativbewegung von Objekt und Anregungsfokus.
Aus grundsätzlichen physikalischen Gründen heraus, hat ein Anregungsstrahl stets nicht nur eine Wellenlänge, sondern stets eine bestimmte Verteilung von Wellenlängen. Daher wird hier vom Anregungswellenlängenbereich gesprochen. Die Formulierung "Anregungswellenlänge" dient stets nur als abkürzende, vereinfachende Bezeichnung.
Der zeitliche Verlauf der Transienten nach einer Änderung der Intensität der Anregungsstrahlung wird gemessen.
Anschließend werden eben diese Transienten ausgewertet. Dazu werden unterschiedliche Muster für den zeitlichen Verlauf unterschiedlicher Transienten für einzelne Werte der Anregungsintensität bestimmt. Diese Muster werden mittels unterschiedlicher Amplituden an die gemessene Transiente der Emission angepasst, in der Regel durch eine lineare Überlagerung bzw. gewichtete Addition der Muster mit unterschiedlichen, anzupassenden Amplituden.
Die Amplitude desjenigen Musters wird ermittelt, welches der Anregungsleistung in einem räumlichen Bereich von Interesse entspricht. Wird der Anregungsstrahl in einen kleinen Bereich von Interesse fokussiert (Fokus), so ist die Anregungsleistung im Fokus am höchsten und es wird das Muster der Transiente für die höchste relevante Anregungsleistung bestimmt. Das ist typischerweise die schnellste oder langsamste Transiente, je nach dem, wie der zeitliche Verlauf der Transiente von der Anregungsleistung abhängt.
Diese Amplitude entspricht dem Fluoreszenzsignal, das am Ort höchster Anregungsleistung generiert wird, und ist das erfindungsgemäße Bildsignal für einen gegebenen Punkt. Daher wird die solcherart bestimmte Amplitude als Maß für die Konzentration der Substanz in dem räumlichen Bereich von Interesse genommen. Damit ist z. B. ein Bildpunkt bestimmt.
Der Anregungsstrahl wird dann solange räumlich geändert in das Objekt eingekoppelt, bis die räumliche Struktur von zumindest Teilen des Objekts bestimmt ist. Mit anderen Worten, das Objekt wird gescannt. Typischerweise wird dazu der Fokus versetzt und das Verfahren am neuen Fokuspunkt wiederholt. Es können jedoch auch z. B. die Interferenzstreifen verschoben werden.
Das Verfahren nutzt die Umsetzung zeitlicher Information in räumliche Information. Der so ausgelesene Raumbereich ist wesentlich kleiner als die Ausdehnung der gesamten Anregungsintensitätsverteilung. Das geschilderte Verfahren erreicht eine mindestens vierfach bessere räumliche Auflösung als herkömmliche Mikroskopie, also weit unter der beugungsdefinierten sog. Abbe-Grenze.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Abbe-Grenze prinzipiell unterschritten werden. Die involvierten Prinzipien heben die von Abbe (unter bestimmten, nicht mehr gegebenen Annahmen) abgeleitete Grenze auf.
Eine Möglichkeit, die Substanz und den Anregungswellenlängenbereich derart aufeinander abzustimmen, dass die zeitlichen Transienten der Emission elektromagnetischer Strahlung nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls von der jeweiligen räumlichen Intensität des Anregungsstrahls abhängen, besteht darin, Triplett-Zustands-Photophysik auszunutzen.
Eine andere Möglichkeit, die Substanz und den Anregungswellenlängenbereich derart aufeinander abzustimmen, dass die zeitlichen Transienten der Emission elektromagnetischer Strahlung nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls von der jeweiligen räumlichen Intensität des Anregungsstrahls abhängen, besteht darin, Fluoreszenz einzusetzen unter Ausnutzung der optischen Sättigung des angeregten Zustands.
In diesem Fall ist es messtechnisch vorteilhaft, mit Fluorophoren mit einer langen Fluoreszenz-Lebensdauer zu arbeiten, so dass eine zeitliche Auflesung des Fluoreszenzanstiegs nach Einschalten der Laseranregung leichter möglich ist. Als mögliche Kandidaten kommen fluoreszente Halbleiternanokristalle (sog. Quantendots), Diamant-Farbzentren, oder stabile Farbstoffe mit langer Fluoreszenzlebensdauer wie z. B. Europium oder Ruthenium-basierte Farbstoffe in Frage. Alle diese fluoreszenten Systeme haben Fluoreszenzabklingzeiten von etlichen Dutzend Nanosekunden bis Mikrosekunden.
Noch eine Möglichkeit besteht darin, als Substanz gekoppelte Paare von Fluorophoren zu wählen, welche Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ausführen.
Die Auflösung kann noch weiter gesteigert werden, wenn das geschilderte Verfahren kombiniert wird mit anderen Verfahren zur Steigerung der Auflösung in der Mikroskopie, z. B. wenn die Anregung der Probe mittels elektromagnetischer Strahlung mittels eines 4Pi-Mikroskops erfolgt.
Zur weiteren Verbesserung des Signal-zu-Rauschen-Verhältnisses und damit auch der räumlichen Auflösung kann ein Punkt auch mehrfach angefahren werden, so dass eine Mittelung über viele Zyklen pro Pixel erfolgen kann.
Statt mit nur einem Fokus kann auch mit mehreren Foki gleichzeitig gearbeitet werden, wodurch die Messung parallelisiert und beschleunigt wird.
Ferner wird die Aufgabe gelöst durch ein Computerprogramm, das bei Ablauf auf einer Recheneinheit, einem Mikrocontroller, DSP, FPGA oder Computer oder auf einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk die durch eine Recheneinheit ausführbaren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer seiner Ausgestaltungen ausführt.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Computerprogramm mit Programmcode-Mitteln, um die durch eine Recheneinheit ausführbaren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer seiner Ausgestaltungen durchzuführen, wenn das Programm auf einer Recheneinheit, einem Mikrocontroller, DSP, FPGA oder Computer oder auf einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk ausgeführt wird. Insbesondere können die Programmcode-Mittel auf einem computerlesbaren Datenträger gespeicherte Instruktionen sein.
Außerdem wird die Aufgabe gelöst durch einen Datenträger, auf dem eine Datenstruktur gespeichert ist, die nach einem Laden in einen Arbeits- und/oder Hauptspeicher einer Recheneinheit, eines Mikrocontrollers, DSPs, FPGAs oder Computers oder einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk die durch eine Recheneinheit ausführbaren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer seiner Ausgestaltungen ausführen kann.
Auch wird die Aufgabe gelöst durch ein Computerprogramm-Produkt mit auf einem maschinenlesbaren Träger gespeicherten Programmcode-Mitteln, um die durch eine Recheneinheit ausführbaren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer seiner Ausgestaltungen durchzuführen, wenn das Programm auf einer Recheneinheit, einem Mikrocontroller, DSP, FPGA oder Computer oder auf einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk ausgeführt wird.
Dabei wird unter einem Computer-Programmprodukt das Programm als handelbares Produkt verstanden. Es kann grundsätzlich in beliebiger Form vorliegen, so zum Beispiel auf Papier oder einem computerlesbaren Datenträger und kann insbesondere über ein Datenübertragungsnetz verteilt werden.
Schließlich wird die Aufgabe gelöst durch ein moduliertes Datensignal, welches von einer Recheneinheit, einem Mikrocontroller, DSP, FPGA oder Computer oder von einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk ausführbare Instruktionen zum Ausführen der durch eine Recheneinheit ausführbaren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer seiner Ausgestaltungen enthält.
Als Computersystem kommen sowohl ein Stand-alone Computer oder Mikrocontroller, DSPs oder FPGRs in Betracht, als auch ein Netzwerk von Mikrocontrollern, DSPs, FPGAs oder Rechnern, beispielsweise ein hausinternes, geschlossenes Netz, oder auch Rechner, die über das Internet miteinander verbunden sind. Ferner kann das Computersystem durch eine Client-Server-Konstellation realisiert sein, wobei Teile der Erfindung auf dem Server, andere auf einem Client ablaufen.
Schließlich wird die Aufgabe durch eine Vorrichtung gelöst, die geeignet ist, das geschilderte Verfahren durchzuführen. Diese Vorrichtung enthält:

a) eine elektromagnetische Strahlungsquelle zum Erzeugen eines Anregungsstrahls mit einem vorgegebenen Wellenlängenbereich; hierzu eignen sich besonders Laser, z. B. Halbleiterlaser;
b) Mittel zum Einkoppeln des Anregungsstrahls in das Objekt derart, dass sich eine räumlich inhomogene Verteilung der Anregung im Objekt ergibt;
c) Mittel zum Ändern der Intensität des Anregungsstrahls; hierzu eignen sich Chopper, Modulatoren, z. B. Akusto-Optische-Modulatoren (AOM) oder eine geeignete elektronische Ansteuerung der Strahlungsquelle, insbesondere, wenn diese ein Halbleiterlaser ist;
d) Mittel zum Messen des zeitlichen Verlaufs (Transienten) der Emission elektromagnetischer Strahlung durch das Objekt nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls; hierzu eignen sich verschiedene Arten von zeitlich genügend auflösenden Detektoren in Verbindung mit einer geeigneten Elektronik zur Signalverarbeitung; typischerweise erfolgt eine Wandlung der optischen Signale in digitale Abtastwerte erfolgen; diese werden durch dedizierte oder programmierbare Hardware oder Mikrocontroller oder Computer algorithmisch verarbeitet; bei letzterer kann es sich z. B. um einen DSP (digitalen Signalprozessor) oder ein FPGA handeln, die die Messwerte des Detektors i. d. R. digitalisieren und verarbeiten;
e) Mittel zum Bestimmen unterschiedlicher Muster für den zeitlichen Verlauf unterschiedlicher Transienten für einzelne Werte der Anregungsintensität;
f) Mittel zum Anpassen der Muster mittels unterschiedlicher Amplituden an die gemessene Transiente der Emission; dies er folgt in der Regel in einer Recheneinheit, die Teil der genannten Elektronik sein kann;
g) Mittel zum Bestimmen der Amplitude desjenigen Musters, welches der Anregungsleistung in einem räumlichen Bereich von Interesse entspricht;
h) Mittel zum Auswählen der solcherart bestimmten Amplitude als Maß für die Konzentration der Substanz in dem räumlichen Bereich von Interesse; und
i) Mittel zum räumlich geänderten Einkoppeln des Anregungsstrahls in das Objekt solange, bis die räumliche Struktur von zumindest Teilen des Objekts bestimmt ist.

Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt.
Die Ausführungsbeispiele sind in den Figuren schematisch dargestellt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt:
1 eine schematische Darstellung des zeitlichen Verlaufs der Anregungsintensität und des Fluoreszenzsignals;
2 den zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzsignals an verschiedenen Positionen einer Gaußschen Anregungskurve;
2A den zeitlichen Verlauf des räumlichen Fluoreszenzprofils;
2B die zeitliche Fluoreszenzabnahme für verschiedene Positionen außerhalb des Zentrums des Fokus; und
3 den Verlauf des Signals beim senkrechten Scannen über eine unendlich schmale Linienverteilung eines Fluoreszenzfarbstoffs.
Ausführungsbeispiel 1:
Konfokale Fluoreszenzmikroskopie unter Ausnutzung von Triplett-Zustands-Photophysik
Als Mikroskopie-Meßsystem wird ein konfokales Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskop verwendet. Die Anregung erfolgt mit einem beugungsbegrenzt fokussierten Laser.
Die Anregung erfolgt jetzt aber nicht mit konstanter Anregungsleistung, und die Probe wird nicht kontinuierlich gescannt, sondern die Optik wird bei ausgeschaltetem Laser jeweils fest auf einen Punkt der Probe fokussiert, dann der Laser für wenige Mikrosekunden eingeschaltet und wieder abgeschaltet, dann die Optik zum nächsten Punkt in der Probe gefahren und der ganze Prozess wiederholt, bis ein komplettes Bild aufgenommen ist.
Die Ein-/Ausschaltperioden des Anregungslasers sind in diesem Ausführungsbeispiel an die Lebensdauer des Triplett-Zustands angepasst: die Einschaltperiode ist ca. gleich der Triplett-Zustands-Lebensdauer (häufig einige Mikrosekunden), die Ausschaltperiode ca. 5 bis 10 mal länger, so dass beim nächsten Einschalten alle Moleküle in den Grundzustand zurückkehren konnten.
Gemessen wird vorzugsweise das Fluoreszenzsignal, nicht das Phosphoreszenz-Signal. Das detektierte Fluoreszenzsignal wird von jedem angefahrenen Punkt mit hoher zeitlicher Auflösung detektiert, so dass schlussendlich für jeden angefahrenen Bild punkt der zeitliche Verlauf des Fluoreszenzsignals nach dem jeweiligen plötzlichen Einschalten des Lasers während der Einschaltperiode gemessen ist.
Zwischen zwei Einschaltungsperioden des Anregungslichtes wird im ausgeschalteten Zustand des Lasers so lange gewartet, bis alle fluoreszierenden Moleküle in der Probe wieder in den Grundzustand zurückkehren konnten. Alternativ kann die Probe in großen räumlichen Intervallen gescannt werden (große Punktabstände, bei denen sich die Laserfoki nicht überlappen), und der Scan wird leicht versetzt mehrmals wiederholt, um schließlich die gewünschte räumliche Dichte an gescannten Punkten zu erreichen.
Grundsätzlich sollte bei einer vollständigen Messung der Abstand zwischen einzelnen, angefahrenen Punkten höchstens so groß sein, wie die räumliche Auflösung, die mit dem geschilderten Verfahren erreicht werden kann, z. B. 40 nm. Je nach Anwendung wird man auch deutlich kleinere räumliche Abstände zwischen den einzelnen Punkten des Scans wählen, z. B. 2.5 nm.
Viele Fluoreszenzfarbstoffe zeigen mehr oder weniger ausgeprägte Triplett-Zustands-Photophysik. Dazu betrachte man ein Molekül mit einem Grundzustand S₀, einem angeregten Zustand S₁ und einem Triplett-Zustand T₁. Es wird angenommen, dass die Übergangsrate vom angeregten Zustand zum Grundzustand, das Inverse der Fluoreszenzlebensdauer τ, wesentlich größer ist als die Übergangsrate vom angeregten Zustand in den Triplett-Zustand, welche als Intersystem-Crossing-Rate k_isc bezeichnet wird. Die folgenden Gleichungen enthalten entsprechende Vernachlässigungen.
Wird ein fluoreszierendes Molekül mit einer räumlich inhomogenen Intensitätsverteilung beleuchtet, so ergibt sich die ortsabhängige Wahrscheinlichkeit s(r), das Molekül im Grundzustand oder angeregten Zustand zu finden, aus der Lösung der kinematischen Gleichung
wobei a(r) die ortsabhängige Anregungsrate des Moleküls ist, also die Wahrscheinlichkeit, pro Zeiteinheit vom Grundzustand in den angeregten Zustand überzugehen. a(r) ist gegeben durch
wobei σ hier der Absorptionswirkungsquerschnitt des Moleküls bei der Anregungswellenlänge v_ex ist, welcher mit dem Extinktionskoeffizienten durch die Beziehung σ[cm2] = 103ln10ε[1 × cm–1 × mol–1]/NA verknüpft ist, wobei N_A die Avogadrokonstante ist. h ist die Plancksche Konstante und I(r) ist die ortsabhängige Intensität der Anregungsstrahlung bei der Anregungswellenlänge. k_ph ist die inverse Lebensdauer des Triplett-Zustands, also die Phosphoreszenzrate.
Wird das anregende Laserlicht zum Zeitpunkt t = 0 plötzlich eingeschaltet, und sind alle Moleküle zu diesem Zeitpunkt im Grundzustand, ist also s(r, t = 0) = 1, so ist die explizite Lösung dieser Gleichung gegeben durch:
Dabei steht f(r) für
Die abgeleitete Gleichung bezieht sich auf eine Zeitskala, nach der das sog. Antibunching, also das schnelle Ansteigen der Fluoreszenz nach Einschalten des Lasers, abgeklungen ist, was ca. genauso lange dauert wie die Fluoreszenzabklingzeit, als ca. 1–10 ns. Das heißt, die obige Gleichung gilt für Zeiten jenseits der Fluoreszenzabklingzeit nach dem plötzlichen Einschalten.
Ein Beispiel der plötzlich eingeschalteten Anregungsintensität und des daraus resultierenden Fluoreszenzsignals zeigt 1.
Dann ist, nach Einschalten des Lasers, das messbare Fluoreszenzsignal von einem Punkt gegeben durch
mit folgenden Abkürzungen: U(r – r') die Point-Spread-Funktion (PSF) des Mikroskops, c(r) die Konzentrationsverteilung des Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe.
Der erste, zeitlich konstante, Teil des Signals,
ist das, was herkömmliche Mikroskopie mit zeitlich konstanter Anregung als Nutzsignal misst und auswertet. Herkömmliche Mikroskopie kann dann durch Verwendung der genauen Kenntnis der PSF und der Anregungsintensitätsverteilung, d. h. a(r), versuchen, über Entfaltung eine bessere Kenntnis der unbekannten Funktion c(r) zu erhalten. Allerdings wird limitierend immer die beugungsbedingt endliche Ausdehnung der Anregung a(r) sein.
Bei dem vorgeschlagenen Verfahren wird eine räumlich besser aufgelöste Kenntnis der Funktion c(r) durch die Auswertung der zeitlichen Änderung des Signals der Transiente, d. h. durch die Auswertung des zeitlichen Anteils
des Signals gewonnen. Wie aus der letzten Gleichung direkt ersichtlich, ist das zeitlich abhängige Fluoreszenzsignal eine Überlagerung von exponentiellen Zerfällen, wobei die Rate des exponentiellen Zerfalls eine direkte Funktion der Anregungsintensität ist, nämlich k_ph + τk_iscf(r).
Diesen Zusammenhang zeigt 2, welche den zeitlichen Verlauf des Fluoreszenzsignals an verschiedenen Positionen einer Gaußschen Anregungskurve zeigt.
2A zeigt den zeitlichen Verlauf des räumlichen Fluoreszenzprofils bei Gauß-förmiger Laseranregung eines homogen verteilten Fluorophors. Die verwendeten photophysikalischen Parameter sind: Fluoreszenzlebensdauer 1 ns, Triplett-Zustands-Lebensdauer 10 μs, Intersystem-Crossing-Rate 10^8/s. Als Farbstoff wurde Acridinorange gewählt, mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm. Die Leistung des Lasers während der Einschaltperiode betrug 50 μW. Die Fokussierung erfolgte beugungsbegrenzt durch ein Öl-Immersions-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1.4. Die Berechnung der Verteilung der Anregungsleistung im Fokus erfolgte gemäß [B. Richards und E. Wolf, Proc. Roy. Soc. London A 253, 358 (1959)]. Der Fokusdurchmesser im Zentrum betrug ca. 180 nm. Die Leistungsdichte oder Intensität im Fokus betrug somit 51 kW/cm^2. Der Absorptionswirkungsquerschnitt beträgt 2·10^ – 16 cm^2 bei der Anregungswellenlänge. Damit ergibt sich eine maximale Anregungsrate a im Zentrum von 10 MHz.
2B zeigt die zeitliche Fluoreszenzabnahme für verschiedene Positionen außerhalb des Zentrums des Fokus, wie angezeigt. Je höher die Anregungsintensität, umso schneller werden die Moleküle in den Triplett-Zustand gepumpt und umso schneller fällt das Fluoreszenzsignal auf sein Steady-State-Niveau zurück.
Die gemessene Emission ist die Emission aus dem Singulett-Zustand heraus, d. h. die Fluoreszenz. Sie kann selektiv durch eine Filterung der Wellenlängen des emittierten Lichts detektiert werden. Dazu werden typischerweise geeignete dielektrische Bandpassfilter verwendet. Typische Wellenlängen für Fluoreszenz-Signale von Farbstoffen sind um ca. 20 bis 100 nm gegenüber der Anregungswellenlänge rotverschoben.
Mit dem zeitlichen Verlauf des gemessenen Fluoreszenzzerfalls eines jeden Punktes wird ein multiexponentieller Fit durchgeführt und die Amplitude der schnellsten Komponente bestimmt. Diese Amplitude entspricht dem Fluoreszenzsignal, das am Ort höchster Anregungsleistung generiert wird, und ist das erfindungsgemäße Bildsignal für einen gegebenen Punkt.
Dadurch gelingt die Umsetzung zeitlicher Information in räumliche Information.
Der so ausgelesene Raumbereich ist wesentlich kleiner als die Ausdehnung der gesamten Anregungsintensitätsverteilung. Dies demonstriert für einen eindimensionalen Scan 3, wobei der Verlauf des Signals beim senkrechten Scannen über eine unendlich schmale Linienverteilung eines Fluoreszenzfarbstoffs gezeigt ist. In 3 ist ein Vergleich der räumlichen Auflösung des vorgeschlagenen Verfahrens und der Steady-State-Fluoreszenzintensität beim senkrechten Scannen einer Gaußförmigen Anregung über eine unendlich schmale Linie eines fluoreszierenden Stoffes gezeigt. Die breitere Kurve entspricht direkt dem Gaußprofil der Anregung und bestimmt das räumliche Auflösungsvermögen herkömmlicher Mikroskopie. Die schmale Kurve entspricht dem Profil des hier geschilderten bildgebenden Signals, der Amplitude der schnellsten gefitteten Komponente. Gezeigt sind auch die 1/e^2-Breiten der Verteilungen (waagerechte Linie bei einer relativen Amplitude von 1/e^2 = 0,13).
In diesem Beispiel wurde angenommen, dass der Laser je Pixel für 3.2 μs angeschaltet ist. Nach dem Einschalten wurde der Laser während der zehnfachen Einschaltperiode ausgeschaltet, also für 32 μs.
Die Fluoreszenzintensität wurde in sechs unterschiedlich breiten Zeitfenstern gemessen. Die Zeitintervalle lagen logarithmisch gestaffelt zwischen den Zeiten 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6 und 3.2 μs. Die Zeitintervalle wurden entsprechend gewählt, um die Datenmenge zu reduzieren, ohne entscheidende Informationen zu verlieren.
Der zeitliche Verlauf der pro Pixel gemessenen Intensität wurde durch einen biexponentiellen Zerfall mit den Zerfallsdauern 0.75 und 1.5 μs gefittet. Das bildgebende Signal ist die Amplitude der schnellen Komponente (0.75 μs).
In 3 erkennt man, dass das geschilderte Verfahren (Linie mit der Bezeichnung "TM", TM steht für Transienten-Mikroskopie) eine ca. fünffach bessere räumliche Auflösung erreicht als herkömmliche Mikroskopie (Linie mit der Bezeichnung "Gauss"), also weit unter der beugungsdefinierten sog. Abbe-Grenze. Dazu sind in 3 bei den jeweiligen Kurven auch die Intensitätsverteilungsbreiten und die Wurzel des mit der Intensitätsverteilung gewichteten Mittelwerts des Positionsquadrats x² angegeben.
Ausführungsbeispiel 2:
Konfokale Fluoreszenzmikroskopie unter Ausnutzung optischer Sättigung des angeregten Zustands
Das Meßsystem ist identisch mit dem im ersten Ausführungsbeispiel beschriebenen. Allerdings sind die Ein-/Ausschaltperioden des Anregungslasers jetzt an die Lebensdauer des Fluoreszenzfarbstoffs angepasst: die Einschaltperiode ist ca. gleich der Fluoreszenzlebensdauer, die Ausschaltperiode ca. 5 bis 10 mal länger, so dass beim nächsten Einschalten alle Moleküle in den Grundzustand zurückkehren konnten.
Die Anregungsleistung sollte hinreichend groß sein, so dass im Anregungsmaximum merkliche optische Sättigung des angeregten Zustands erfolgt bzw. eine merkliche Entvölkerung des Grundzustands. Dann ist das messbare Fluoreszenzsignal unmittelbar nach dem Einschalten des Anregungslichts und während der Dauer desselben gegeben durch: S(r, t) = ∫dr'U(r – r')c(r')f(r'){1 – exp{ – [τ–1 + f(r')]t}}mit den gleichen Abkürzungen wie im ersten Ausführungsbeispiel. Man erkennt, dass sich umso schneller ein Steady-State der Fluoreszenz einstellt, je stärker die Anregungsintensität ist. Im Steady-State kehren zu jeder Zeit genauso viele Moleküle in den Grundzustand zurück wie Moleküle in den angeregten Zustand gepumpt werden. Nur ganz am Anfang der Einschaltperiode sind alle Moleküle im Grundzustand.
Wiederum besteht das Signal aus einem zeitlich konstanten Term und einem, diesmal ansteigenden, zeitlich abhängigen Term. Der zeitlich abhängige Term ist wieder die Überlagerung exponentieller Funktionen, mit der exponentiellen Rate abhängig von der Anregungsintensität. Er kann analog zum ersten Ausführungsbeispiel ausgewertet und zur Verbesserung der räumlichen Auflösung verwendet werden.
Ausführungsbeispiel 3:
Konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit Zweifarbenanregung unter Ausnutzung von Förster-Resonanz-Energie-Transfer
Das Meßsystem ist identisch mit dem im ersten Ausführungsbeispiel beschriebenen, allerdings erfolgt die Anregung jetzt mit zwei Lasern auf zwei verschiedenen Wellenlängen. Als Signalgeber werden gekoppelte Paare von Farbstoffen oder anderen fluoreszierenden Substanzen (Fluorophoren) verwendet, welche effizient Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ausführen.
Die beiden Anregungswellenlängen regen effizient den Donor und den Akzeptor des FRET-Paares an. Die Akzeptoranregung kann zeitlich kontinuierlich erfolgen. Der Akzeptor wird durch die Anregung in eben den Zustand gebracht, der die Energie des Donors aufnehmen könnte. Nach der Anregung des Akzeptors ist dies jedoch nicht mehr möglich, der Akzeptor ist blockiert. Die Donoranregung erfolgt wieder diskontinuierlich, wie in den vorangehenden Ausführungsbeispielen.
Gemessen wird nur die Donorfluoreszenz, der Akzeptor kann ein nichtfluoreszenter Quencher sein. Das durch die Akzeptoranregung erzeugte Profil nichtangeregter Akzeptormoleküle sei mit b(r) bezeichnet. b(r) bezeichnet dabei die Wahrscheinlichkeit, dass ein Akzeptormolekül am Ort r nicht angeregt ist. b(r) ist eine Zahl zwischen 0 und 1. k_F bezeichnet die FRET-Rate und hat die Einheit 1/s. Es ist angenommen, dass die FRET-Paare chemisch gekoppelt sind, also ein Akzeptor immer an einem Donor hängt, im Verhältnis 1:1, und zwar in gemittelt gleicher Anordnung, so dass die FRET-Rate im Mittel für alle FRET-Paare die gleiche ist. Dann ist das messbare Signal nach wiederum stufenförmigem Einschalten des Lasers für die Donoranregung gegeben durch
Anschaulich gesprochen, startet man mit allen Donormolekülen im Grundzustand. Je mehr anregbare Akzeptormoleküle da sind, die Energie vom Donor akzeptieren können, umso schneller kann der Donor wieder abgeregt werden. Die Physik ist vollkommen identisch mit dem vorherigen Ausführungsbeispiel, nur dass zur strahlenden Abregung des Donors jetzt noch die Abregung via FRET zum Akzeptor dazukommt.
Der Vorteil ist, dass man einen messbaren Effekt auch dann bekommt, wenn die Anregung a(r) noch sehr klein ist, so dass noch keine merkliche Entvölkerung des Grundzustands (Ground State Depletion) des Donors wie im vorherigen Ausführungsbeispiel zu beobachten ist. Die Anregungs- bzw. Ortsabhängigkeit wird durch die Entvölkerung des Grundzustands des Akzeptors erreicht. Im Gegensatz zum zweiten Ausführungsbeispiel kann hier die Anregung des Donors weit unter der optischen Sättigungsintensität erfolgen, a(r)≪τ' Die FRET-Rate k_F sollte hinreichend groß sein, und der Akzeptor sollte durch den zweiten Laser hinreichend stark in den Zustand gepumpt werden, in dem er keine Energie vom Donor akzeptieren kann. Dieses Vorgehen sollte besonders gut mit langlebigen Akzeptoren funktionieren, bei denen sich der angeregte Zustand gut bevölkern lässt.
Das erfindungsgemäß auswertbare Signal, der zeitliche Verlauf der Fluoreszenz, wird dann (bei Vernachlässigung von a(r)) durch die räumlich abhängige Rate τ^–1 + k_Fb(r) bestimmt. b(r), das Wahrscheinlichkeitsprofil nichtangeregter Akzeptormoleküle, ist im Fokus des Laserstrahls für die Akzeptoranregung am kleinsten, so dass die längste Donor-Fluoreszenzlebensdauer dem Ort höchster Akzeptoranregung (geringste Wahrscheinlichkeit b(r) nichtangeregter Akzeptoren) entspricht und umgekehrt.
Das vorgeschlagene Verfahren besteht jetzt im Fitten der Fluoreszenzlebensdauer der gemessenen Donorfluoreszenz in jedem Punkt durch einen multiexponentiellen Fit. Das bildgebende Signal ist dann die Amplitude der Komponente mit der längsten Lebensdauer. In diesem Ausführungsbeispiel wird die räumliche Auflösung durch das räumliche Profil der Akzeptoranregung dominiert aber nicht begrenzt oder bestimmt. Die Grenze der räumlichen Auflösung ist ein Bruchteil der räumlichen Auflösung der Akzeptoranregung.
Ausführungsbeispiel 4:
4Pi-Mikroskopie
Das messtechnische System für dieses Ausführungsbeispiel ist ein 4Pi-Mikroskop [S. W. Hell und H. K. Stelzer, J. Opt. Soc. Am. A 9, 2159 (1992)] wie in der Literatur ausführlich be schrieben. Anregung, Detektion und Signalauswertung erfolgt analog zu den ersten drei Ausführungsbeispielen. Wesentlich ist hier, dass durch die erfindungsgemäße Auswertung des zeitlichen Verlaufs der gemessenen Fluoreszenz auf das erfindungsgemäße bildgebende Signal hin nur Raumbereiche erfasst werden, in denen die Anregungsintensität über einem gewissen Grenzwert liegt, realistischerweise bei über 80 % der maximalen Anregungsintensität im Fokuszentrum. Damit hat das Fluoreszenzsignal, welches in den bekannten Nebenmaxima der Anregung eines 4Pi-Mikroskops entsteht, keinen Einfluss auf das erfindungsgemäß bildgebende Signal.
Ausführungsbeispiel 5:
Weitfeld- Fluoreszenzmikroskopie mit räumlich modulierter Anregung
In diesem Ausführungsbeispiel erfolgt die Fluoreszenzanregung großflächig aber räumlich moduliert (z. B. durch Erzeugen eines Gitters auf der Probe), und die Detektion erfolgt mit einer Kamera, welche die Verfolgung zeitlich schneller Prozesse zulässt, z. B. mit einer gate-baren CCD-Kamera im Boxcar-Verfahren. Die Fluoreszenzanregung wird wiederum stufenförmig für kurze Zeit eingeschaltet und wieder abgeschaltet. Wenn die Detektion im Boxcar-Verfahren erfolgt, wird bei jedem Einschalten mit der Kamera ein anderes Zeitfenster des Fluoreszenzabfalls (oder -anstiegs, wie im zweiten Ausführungsbeispiel) gemessen. Analog wie in den ersten drei Ausführungsbeispielen wird das Signal dann pixelweise ausgewertet. Durch Verschiebung oder Drehung der räumlichen Modulation der Anregung kann die räumliche Auflösung weiter verbessert werden.
Liste der zitierten Literatur:

S. W. Hell und H. K. Stelzer, J. Opt. Soc. Am. A 9, 2159 (1992)
M.G.L. Gustafsson, J. Microsc. 198, 82 (2000)
W. Denk, J.H. Strickler und W.W. Webb, Science 248, 73 (1990)
S.W. Hell, M. Dyba und S. Jakobs, Curr. Opin. Neurobiol. 14, 1 (2004)
S.W. Hell, in: Topics in Fluorescence Spectroscopy, 5^th Edn., Edited by J.R. Lakowicz (Plenum Press, New York, 1997) Seiten 361–422
M.G.L. Gustafsson, Curr. Opin. Struct. Biol. 9, 627 (1999)
B. Richards und E. Wolf, Proc. Roy. Soc. London A 253, 358 (1959)

Claims

Verfahren zum Bestimmen der räumlichen Struktur eines Objekts mit folgenden Schritten: a) das Objekt wird derart ausgewählt, dass es mindestens eine geeignete Substanz enthält, die durch elektromagnetische Strahlung zur Emission elektromagnetischer Strahlung angeregt werden kann, wobei die Verteilung dieser Substanz im Objekt nachgewiesen wird; b) ein Anregungsstrahl wird derart in das Objekt eingekoppelt, dass sich eine räumlich inhomogene Verteilung der Anregung im Objekt ergibt; c) der Wellenlängenbereich des Anregungsstrahls wird derart gewählt, dass der Anregungsstrahl die Substanz zur Emission anregen kann; d) die Intensität des Anregungsstrahls wird geändert, wodurch sich zeitliche Transienten der Emission elektromagnetischer Strahlung durch die Substanz ergeben; e) die Substanz und der Anregungswellenlängenbereich werden derart aufeinander abgestimmt, dass die zeitlichen Transienten der Emission elektromagnetischer Strahlung nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls von der jeweiligen räumlichen Intensität des Anregungsstrahls abhängen; f) der zeitliche Verlauf der Transienten nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls wird gemessen; g) unterschiedliche Muster für den zeitlichen Verlauf unterschiedlicher Transienten für einzelne Werte der Anregungsintensität werden bestimmt; h) die Muster werden mittels unterschiedlicher Amplituden an die gemessene Transiente der Emission angepasst; i) die Amplitude desjenigen Musters wird ermittelt, welches der Anregungsleistung in einem räumlichen Bereich von Interesse entspricht; j) die solcherart bestimmte Amplitude wird als Maß für die Konzentration der Substanz in dem räumlichen Bereich von Interesse genommen; und k) der Anregungsstrahl wird solange räumlich geändert in das Objekt eingekoppelt, bis die räumliche Struktur von zumindest Teilen des Objekts bestimmt ist.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz und der Anregungswellenlängenbereich derart aufeinander abgestimmt werden, dass die zeitlichen Transienten der Emission elektromagnetischer Strahlung nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls aufgrund von Triplett-Zustands-Photophysik von der jeweiligen räumlichen Intensität des Anregungsstrahls abhängen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als elektromagnetische Emission die Fluoreszenz gewählt wird; und dass die Substanz und der Anregungswellenlängenbereich derart aufeinander abgestimmt werden, dass die zeitlichen Transienten der Emission elektromagnetischer Strahlung nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls aufgrund der Ausnutzung optischer Sättigung des angeregten Zustands von der jeweiligen räumlichen Intensität des Anregungsstrahls abhängen.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Substanz für die Fluoreszenz mindestens ein Fluorophor mit einer langen Fluoreszenzlebensdauer gewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Substanz gekoppelte Paare von Fluorophoren gewählt werden, welche Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ausführen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung der Probe mittels elektromagnetischer Strahlung mittels eines 4Pi-Mikroskops erfolgt.
Computerprogramm, dadurch gekennzeichnet, dass es bei Ablauf auf einer Recheneinheit, einem Mikrocontroller, DSP, FPGA oder Computer oder auf einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk die Schritte d) und f) bis k) des Verfahrens nach Anspruch 1 ausführt.
Computerprogramm mit Programmcode-Mitteln, um die Schritte d) und f) bis k) des Verfahrens nach Anspruch 1 durchzuführen, wenn das Computerprogramm auf einer Recheneinheit, einem Mikrocontroller, DSP, FPGA oder Computer oder auf einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk ausgeführt wird.
Computerprogramm mit Programmcode-Mitteln gemäß dem vorhergehenden Anspruch, die auf einem computerlesbaren Datenträger gespeichert sind.
Datenträger, auf dem eine Datenstruktur gespeichert ist, die nach einem Laden in einen Arbeits- und/oder Hauptspeicher einer Recheneinheit, eines Mikrocontrollers, DSPs, FPGAs oder Computers oder einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk die Schritte d) und f) bis k) des Verfahrens nach Anspruch 1 ausführt.
Computerprogramm-Produkt mit auf einem maschinenlesbaren Träger gespeicherten Programmcode-Mitteln, um die Schritte d) und f) bis k) des Verfahrens nach Anspruch 1 durchzuführen, wenn das Programm auf einer Recheneinheit, einem Mikrocontroller, DSP, FPGA oder Computer oder auf einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk ausgeführt wird.
Moduliertes Datensignal, welches von einer Recheneinheit, einem Mikrocontroller, DSP, FPGA oder Computer oder von einer Mehrzahl davon in einem Netzwerk ausführbare Instruktionen zum Ausführen der Schritte d) und f) bis k) des Verfahrens nach Anspruch 1 enthält.
Computersystem oder Computernetzwerk mit Mitteln zum Ausführen der Schritte d) und f) bis k) des Verfahrens nach Anspruch 1.
Vorrichtung zum Bestimmen der räumlichen Struktur eines Objekts: a) mit einer elektromagnetischen Strahlungsquelle zum Erzeugen eines Anregungsstrahls mit einem vorgegebenen Wellenlängenbereich; b) mit Mitteln zum Einkoppeln des Anregungsstrahls in das Objekt derart, dass sich eine räumlich inhomogene Verteilung der Anregung im Objekt ergibt; c) mit Mitteln zum Ändern der Intensität des Anregungsstrahls; d) mit Mitteln zum Messen des zeitlichen Verlaufs (Transienten) der Emission elektromagnetischer Strahlung durch das Objekt nach einer Änderung der Intensität des Anregungsstrahls; e) mit Mitteln zum Bestimmen unterschiedlicher Muster für den zeitlichen Verlauf unterschiedlicher Transienten für einzelne Werte der Anregungsintensität; f) mit Mitteln zum Anpassen der Muster mittels unterschiedlicher Amplituden an die gemessene Transiente der Emission; g) mit Mitteln zum Bestimmen der Amplitude desjenigen Musters, welches der Anregungsleistung in einem räumlichen Bereich von Interesse entspricht; h) mit Mitteln zum Auswählen der solcherart bestimmten Amplitude als Maß für die Konzentration der Substanz in dem räumlichen Bereich von Interesse; und i) mit Mitteln zum räumlich geänderten Einkoppeln des Anregungsstrahls in das Objekt solange, bis die räumliche Struktur von zumindest Teilen des Objekts bestimmt ist.