DE202013102039U1

DE202013102039U1 - STED-Vorrichtung

Info

Publication number: DE202013102039U1
Application number: DE201320102039
Authority: DE
Original assignee: PicoQuant GmbH
Current assignee: PicoQuant GmbH
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2014-05-15
Anticipated expiration: 2023-05-11

Abstract

Vorrichtung (10), insbesondere STED-Fluoreszenzlichtmikroskop, mit: – einer gepulsten Anregungslichtquelle (16) zum Einstrahlen von gepulstem Anregungslicht auf eine Probe (12), wobei das Anregungslicht zur Fluoreszenz-Anregung von in der Probe (12) enthaltenden fluoreszierenden Einheiten in einem Fokusbereich (22) fokussiert ist, – einer Abregungslichtquelle (32), zum Einstrahlen von Abregungslicht auf eine einen zentralen Bereich (38) innerhalb des Fokusbereichs (22) umgebenden Region (39) der Probe (12), um die um diesen zentralen Bereich (38) herum angeregten fluoreszierenden Einheiten abzuregen, wobei der zentrale Bereich (38) selbst vom Einstrahlen des Abregungslichts ausgenommen ist, – mindestens einem Detektor (30), der von den angeregten fluoreszierenden Einheiten in der Probe (12) spontan emittiertes Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Auflösung nach jedem Puls des Anregungslichts von der Anregungslichtquelle (16) registriert, gekennzeichnet durch eine Analyseeinrichtung (42) zur Bestimmung eines zeitabhängigen Intensitätsverlaufs des vom Detektor (30) mit zeitlicher Auflösung registrierten Fluoreszenzlichts und zur Durchführung einer Pattern-Matching-Analyse der Intensitätsmuster dieses zeitabhängigen Intensitätsverlaufs.

Description

Die Erfindung betrifft eine STED-Vorrichtung, insbesondere ein STED-Fluoreszenzlichtmikroskop, mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Anspruchs 1.
Das Dokument WO 2012/069076 A1 beschreibt ein STED Fluoroszenzlicht-Mikroskopieverfahren sowie ein STED Fluoroszenzlicht-Mikroskop, bei denen eine gepulsten Anregungslichtquelle Pulse von Anregungslicht auf eine Probe strahlt, wobei das Anregungslicht in der Probe enthaltende fluoreszierende Einheiten zu Fluoreszenz anregt und auf mindestens einen Fokusbereich fokussiert wird. Weiterhin bringt eine Abregungslichtquelle kontinuierliches Abregungslicht auf die Probe auf, wobei das Abregungslicht die angeregten fluoreszierenden Einheiten abregt und die Intensität dieses Abregungslichts eine Nullstelle in dem mindestens einen Fokusbereich aufweist. Ein Detektor registriert das von den angeregten fluoreszierenden Einheiten in der Probe spontan emittierte Fluoreszenzlicht nach jedem Puls des Anregungslichts mit zeitlicher Auflösung überlappend mit dem Einstrahlen des Abregungslichts durch die Abregungslichtquelle. Der Detektor wird so betrieben, dass ein von dem Puls des Anregungslichts ausgelöstes Zeitfenster definiert wird, in dem der Detektor das Fluoreszenzlicht detektiert. Dieses Zeitfenster wird so eingestellt, dass es erst, nachdem der angeregte Zustand der fluoreszierenden Einheiten in der Umgebung der Nullstelle zerfallen ist, öffnet und dann, wenn im Wesentlichen alle durch den vorangegangenen Puls des Anregungslichts angeregten fluoreszierenden Einheiten ihr Fluoreszenzlicht emittiert haben, schließt. Durch diese Maßnahme kommt das im Zeitfenster vom Detektor registrierte Fluoreszenzlicht vollständig aus dem zentralen Bereich innerhalb des Fokusbereichs und kann so diesem zentralen Bereich eindeutig zugeordnet werden.
Durch die Beschränkung des nutzbaren Fluoreszenzlichts auf das im ausgewählten Zeitfenster detektierte Fluoreszenzlicht ist die Nutzung der Lichtausbeute durch die Vorrichtung insgesamt jedoch vergleichsweise gering.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung mit besserer Nutzung der Lichtausbeute anzugeben.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch die Merkmale des unabhängigen Anspruchs 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die erfindungsgemäße STED-Vorrichtung (STED: Stimulated Emission Depletion) weist eine Analyseeinrichtung zur Bestimmung eines zeitabhängigen Intensitätsverlaufs des vom Detektor mit zeitlicher Auflösung registrierten Fluoreszenzlichts und für eine Pattern-Matching-Analyse der Intensitätsmuster dieses zeitabhängigen Intensitätsverlaufs auf. Pattern Matching (zu Deutsch Musterabgleich) oder musterbasierte Suche ist ein Begriff für ein Vorgehen, bei dem anhand eines vorgegebenen Musters diskrete Teilstrukturen oder Teilmengen einer diskreten Struktur identifiziert werden. Bei diesem Vorgehen wird davon ausgegangen, dass sich die diskrete Struktur aus einer Superposition einer bestimmten Zahl diskreter Teilstrukturen ergibt. Die diskrete Struktur ist im vorliegenden Fall der zeitabhängige Intensitätsverlauf des registrierten Fluoreszenzlichts.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat den Vorteil, dass sie bei Verwendung in bildgebenden Verfahren wie der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie oder bei der STED-Korrelationsspektroskopie für dynamische Anwendungen besonders rauscharme Ergebnisse und/oder besonders kurze Messzeiten ermöglicht. Bei Einzelphotonendetektion (Einzelphotonenregistrierung) hat die erfindungsgemäße Vorrichtung eine besonders gute Photonenstatistik.
Erfindungsgemäß werden also Pulse von Anregungslicht auf die Probe gestrahlt, wobei das Anregungslicht auf mindestens einen Fokusbereich fokussiert wird und dort in der Probe enthaltende fluoreszierende Einheiten zu Fluoreszenz anregt. Weiterhin wird in einem Gebiet Abregungslicht auf die Probe eingestrahlt, das die angeregten fluoreszierenden Einheiten abregt. Die Intensität des Abregungslichts weist eine Nullstelle innerhalb des mindestens einen Fokusbereichs auf, d. h. in dem zentralen Bereich innerhalb des Fokusbereichs wird kein Abregungslicht auf die Probe eingestrahlt. Mindestens ein Detektor registriert das von den angeregten fluoreszierenden Einheiten in der Probe spontan emittierte Fluoreszenzlicht nach jedem Puls des Anregungslichts mit zeitlicher Auflösung überlappend mit dem Einstrahlen des Abregungslichts durch die Abregungslichtquelle. Weiterhin wird der zeitabhängige Intensitätsverlaufs des vom Detektor mit zeitlicher Auflösung registrierten Fluoreszenzlichts bestimmt und anschließend eine Pattern-Matching-Analyse der Intensitätsmuster dieses zeitabhängigen Intensitätsverlaufs durchgeführt. Dazu ist in der STED-Vorrichtung die Analyseeinrichtung vorgesehen. Durch dieses Vorgehen kann die effektiv nutzbare Information deutlich erhöht werden.
Die Ausdehnung der Region der Probe, auf die die Abregungslichtquelle das Abregungslicht einstrahlt, geht über den Fokusbereich des Anregungslichts hinaus. Bevorzugt ist die Region dabei ringscheibenförmig („Donut-förmig”) ausgebildet.
Mit Vorteil ist vorgesehen, dass der Detektor das von den angeregten fluoreszierenden Einheiten spontan emittierte Fluoreszenzlicht mit einer zeitlichen Auflösung registriert, die mindestens 80 Picosekunden (80 ps) beträgt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Analyseeinrichtung eingerichtet ist, mittels der Pattern-Matching-Analyse (a) die Intensität des aus dem zentralen Bereich (innerhalb des Fokusbereichs) emittierten Fluoreszenzlichts und/oder (b) die Intensität des aus dem restlichen Fokusbereichs emittierten Fluoreszenzlichts zu ermitteln. Bei dieser Ausgestaltung der Erfindung wird (a) die Intensität des aus dem zentralen Bereich emittierten Fluoreszenzlichts und/oder (b) die Intensität des aus dem restlichen Fokusbereichs emittierten Fluoreszenzlichts mittels der Pattern-Matching-Analyse ermittelt.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass der Detektor einen Einzelphotonendetektor aufweist oder als ein Einzelphotonendetektor ausgebildet ist. Der Detektor registriert/detektiert bei dieser Ausgestaltung der Erfindung die einzelnen Photonen des Fluoreszenzlichts zeitaufgelöst relativ zum Anregungspuls und/oder zeitaufgelöst zum Zeitpunkt der Registrierung der weiteren registrierten Photonen.
Sollen einzelne Photonen mittels des Einzelphotonendetektors registriert/detektiert werden, so wird bevorzugt für jedes der Photonen der Zeitpunkt der Registrierung dieses Photons im Detektor relativ zum Zeitpunkt des die Fluoreszenz auslösenden Ereignisses, nämlich des Aussenden des Anregungspulses, ermittelt. Der zeitabhängige Intensitätsverlaufs des vom Detektor mit zeitlicher Auflösung registrierten Fluoreszenzlichts wird dann als Histogramm der detektierten/registrierten Photonen mit zeitlichem Bezug zu den entsprechenden Anregungspulsen bestimmt.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Analyseeinrichtung eingerichtet ist, jedem einzelnen vom Detektor detektierten/registrierten Photon mehrere auf den ermittelten Intensitätsverläufen beruhende Wichtungen zuzuordnen, mit denen dieses Photon (i) aus dem zentralen Bereich innerhalb des Fokusbereichs oder (ii) aus dem restlichen Fokusbereich oder (iii) aus mindestens einem Zwischenbereich zwischen den zentralem Bereich im Fokusbereich und dem restlichen Fokusbereich stammt. Durch dieses Vorgehen wird jedem einzelnen registrierten/detektierten Photon – wenn auch nur statistisch – eine räumliche Herkunft zugeordnet. Diese mittels Pattern Matching erhaltenen Wichtungen können beispielsweise in der Fluoreszenzkorrelationspektroskopie verwendet werden, um Intensitätsfluktuationen selektiv aus unterschiedlichen räumlichen Bereichen des Anregungsfokus zu bestimmen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist die Vorrichtung eine Raster-Einheit zum Überfahren der Probe mit dem Fokus des Anregungslichts und der entsprechenden Region des Abregungslichts um den zentralen Bereich innerhalb des Fokusbereichs herum auf.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Vorrichtung als Vorrichtung zur Durchführung von STED-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ausgebildet. Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (englisch fluorescence correlation spectroscopy, FCS) ist eine hochempfindliche optische Messmethode, die aus Fluktuationen in der Fluoreszenzintensität Informationen gewinnt. Mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) werden beispielsweise Diffusionskonstanten, Konzentrationen und Bindungen zwischen verschiedenen diffundierenden Einheiten in der Probe gemessen. Bei einer solchen Vorrichtung kann die Analyseeinrichtung auch als Analyseeinrichtung zur Durchführung einer Pattern-Matching-Analyse des zeitabhängigen Intensitätsverlaufs des vom Detektor mit zeitlicher Auflösung registrierten Fluoreszenzlichts zur Separierung der Intensitätsanteile, die verschiedenen Positionen des Emitters im Fokus zugeordnet werden können, aufgefasst werden.
Mit Vorteil ist die Vorrichtung zur Unterscheidung unterschiedlicher Arten von fluoreszierenden Einheiten mit unterschiedlichem zeitlichen Fluoreszenz-Intensitätsverlauf eingerichtet.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die STED-Vorrichtung eine weitere gepulste Anregungslichtquelle zum Einstrahlen von weiterem gepulsten Anregungslicht zur Fluoreszenz-Anregung von in der Probe enthaltenden fluoreszierenden Einheiten aufweist, wobei die weitere gepulste Anregungslichtquelle ebenfalls in dem mindestens einen Fokusbereich fokussierbar ist. Die Pulse der gepulsten Anregungslichtquellen lassen sich mittels einer übergeordneten Steuer- und/oder Regeleinrichtung insbesondere aufeinander abstimmen (synchronisieren). Bei der Verwendung von zwei Anregungslichtquellen ist bevorzugt vorgesehen, dass das weitere gepulste Anregungslicht eine andere Polarisationseigenschaft und/oder eine andere Wellenlänge aufweist als das Anregungslicht der einen gepulsten Anregungslichtquelle.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen anhand bevorzugter Ausführungsformen näher erläutert.
Es zeigen:
1 den Grundaufbau einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen STED-Vorrichtung und
2 eine Draufsicht auf die mit Anregungs- und Abregungslicht bestrahlte Probe.
1 zeigt eine als STED-Fluoreszenzlichtmikroskop (STED: Stimulated Emission Depletion) ausgebildete Vorrichtung 10. Das Mikroskop kann zur Bildaufnahme und für Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (englisch fluorescence correlation spectroscopy, FCS) verwendet werden. Die fluoreszierenden Einheiten in der Probe 12 werden mit Anregungslicht (in 1 repräsentiert durch den Anregungs-Lichtstrahl 14) zur Fluoreszenz angeregt, wobei das Anregungslicht in Pulsen von einer Anregungslichtquelle 16 emittiert wird. Das Anregungslicht wird von einem dichroitischen oder teildurchlässigen Spiegel 18 zu einem Objektiv 20 hin reflektiert, das das Anregungslicht in einem in 2 gezeigten Fokusbereich 22 innerhalb der Probe 12 fokussiert. Zwischen dem Spiegel 18 und dem Objektiv 20 tritt das Anregungslicht durch einen weiteren dichroitischen oder Teildurchlässigen Spiegel 24 und durch weitere optische Elemente 26 hindurch. Der Fokusbereich 22 des Anregungslichts, das durch das Objektiv 20 in die Probe 12 fokussiert wird, weist minimale Abmessungen auf, die durch die Beugungsgrenze definiert sind. Das heißt, Fluoreszenzlicht (in 1 repräsentiert durch einen Fluoreszenz-Lichtstrahl 28), das von den angeregten fluoreszierenden Einheiten in der Probe spontan emittiert wird und mit einem Detektor 30 registriert wird, kann einem bestimmten Ort der Probe 12 nur mit einer im Bereich der Optik üblichen räumlichen Auflösung zugeordnet werden. Als Ergebnis weist ein Bild der interessierenden Struktur in der Probe 12, das durch Abtasten der Probe 2 mit dem fokussierten Anregungslicht aufgenommen wird (eine hierzu benötigte Raster-Einheit ist nicht dargestellt), nur eine räumliche Auflösung auf, die durch die Beugungsgrenze beschränkt ist.
Um die Beugungsgrenze zu überwinden, weist das STED-Fluoreszenzlichtmikroskop eine weitere Lichtquelle in Form einer kontinuierlichen Abregungslichtquelle 32 auf, die kontinuierliches STED- oder Abregungslicht 12 (repräsentiert durch einen Abregungs-Lichtstrahl 34) bereitstellt. Mittels einer Phasenmaske 36 werden die Wellenfronten des Abregungslichts derart deformiert, dass die Intensitätsverteilung des von dem Objektiv 20 fokussierten Abregungslichts eine Nullstelle in dem Fokusbereichs des Anregungslichts auf der Probe 12 bzw. einen in 2 gezeigten zentralen Bereich 38 aufweist, der selbst vom Einstrahlen des Abregungslichts ausgenommen ist.
2 zeigt eine Draufsicht auf die Oberfläche der Probe 12. Ein erster kreisförmiger Bereich stellt den Fokusbereich 22 des Anregungs-Lichtstrahls 14 dar. Innerhalb dieses Fokusbereichs 22 ist das Anregungslicht auf der Probe 12 fokussiert. Die Abregungslichtquelle 32 strahlt Abregungslicht auf eine den zentralen Bereich 38 innerhalb des Fokusbereichs 22 umgebende Region 39 der Probe 12. Diese Region 39 ist in 2 als gepunktete Fläche dargestellt. Ein zweiter kreisförmiger Bereich stellt diesen die Nullstelle repräsentierenden zentralen Bereich 38 des Anregungs-Lichtstrahls 34 dar. Außerhalb dieser Nullstelle bzw. dieses zentralen Bereichs 38 veranlasst das Abregungslicht die fluoreszenten Einheiten, die von dem Anregungslicht angeregt wurden, zu stimulierter Emission. Die Ausdehnung der Region 39, auf die die Abregungslichtquelle 32 das Abregungslicht einstrahlt, geht über den Fokusbereich 38 des Anregungslichts hinaus. Die Region 39 ist dabei ringscheibenförmig („Donut-förmig”) ausgebildet. Das stimulierte Licht hat dieselbe Wellenlänge wie das Abregungslicht, die sich von der Wellenlänge des spontan emittierten Fluoreszenzlichts unterscheidet, und kann so durch einen Filter 40, der vor dem Detektor 30 angeordnet ist, abgeblockt werden. Teile des Anregungslichts und des Abregungslichts, die von der Probe 12 reflektiert werden, werden ebenfalls vor dem Detektor 30 durch den Filter 38 abgeblockt. Als Ergebnis registriert der Detektor 30 nur Fluoreszenzlicht, das spontan aus der Probe 12 emittiert wird.
Die gewünschte erhöhte räumliche Auflösung beim Zuordnen des Signals des in 1 gezeigten Detektors 30 zum zentralen Bereich (der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Abregungslichts) wird hier tatsächlich dadurch erreicht, dass der Detektor 30 eine hohe zeitliche Auflösung beim Detektieren des spontan emittierten Fluoreszenzlichts aufweist und durch eine dem Detektor 30 nachgeschaltete Analyseeinrichtung 42 zur Bestimmung eines zeitabhängigen Intensitätsverlaufs des vom Detektor 30 mit zeitlicher Auflösung registrierten Fluoreszenzlichts. Die Analyseeinrichtung 42 führt weiterhin eine Pattern-Matching-Analyse der Intensitätsmuster dieses zeitabhängigen Intensitätsverlaufs aus.
Die Analyseeinrichtung 42 ist weiterhin dazu eingerichtet, mittels der Pattern-Matching-Analyse die Intensität des aus dem zentralen Bereich 38 emittierten Fluoreszenzlichts und die Intensität des aus dem restlichen Fokusbereich (also dem Fokusbereich 22 abzüglich des zentralen Bereichs 38 innerhalb des Fokusbereichs 22) emittierten Fluoreszenzlichts zu ermitteln. Dazu erhält die Analyseeinrichtung ein Triggersignal 44 von der Anregungslichtquelle 16 über eine Signalleitung 46. Der Detektor 30 registriert einzelne Photonen des Fluoreszenzlichts. Die Analyseeinrichtung 42 ist weiterhin eingerichtet, jedem einzelnen der vom Detektor 30 mittels des Einzelphotonendetektors detektierten/registrierten Photonen auf den ermittelten Intensitätsverläufen beruhende Wichtungen zuzuordnen, mit denen dieses Photon entweder aus dem zentralen Bereich 38 innerhalb des Fokusbereichs 22 oder aus dem restlichen Fokusbereich oder aus einem Zwischenbereich zwischen den zentralem Bereich 38 im Fokusbereich 22 und dem restlichen Fokusbereich stammt.
Durch diese Maßnahme ist es möglich, die Nutzung der Lichtausbeute durch die Vorrichtung 10 stark zu erhöhen, da nun alle Photonen des Fluoreszenzlichts zur örtlichen Zuordnung der einzelnen Photonen beitragen und keines der Photonen durch festgelegte Analyse-Zeitfenster von der Analyse ausgenommen wird.
Die Vorrichtung 10 kann auch durch mindestens ein optisches Element dahingehend erweitert werden, dass das von den angeregten fluoreszierenden Einheiten in der Probe 12 spontan emittierte Fluoreszenzlicht anhand seiner spektralen Eigenschaften und/oder Polarisationseigenschaften weiter aufgetrennt und mittels nachgeschalteter Detektoren gemäß dieser Trennung separat detektiert werden kann. Auf diese Weise ist es möglich einen Intensitätsverlauf des Fluoreszenzlichts nicht nur zeitaufgelöst, sondern auch spektral und/oder polarisationsaufgelöst zu rekonstruieren. Mit der Analyseeinrichtung 42 kann diese mehrdimensionale (als Funktion der Zeit, spektraler und Polarisationseigenschaften) Information dann mittels einer mehrdimensionalen Pattern-Matching Analyse ebenfalls spezifisch separiert werden.
Bezugszeichenliste

10: Vorrichtung
12: Probe
14: Anregungs-Lichtstrahl
16: Anregungslichtquelle
18: dichroitischer Spiegel
20: Objektiv
22: Fokusbereich
24: dichroitischer Spiegel
26: optisches Element
28: Fluoreszenz-Lichtstrahl
30: Detektor
32: Abregungslichtquelle
34: Abregungs-Lichtstrahl
36: Phasenmaske
38: Zentraler Bereich
39: Region
40: Filter
42: Analyseeinrichtung
44: Triggersignal
46: Signalleitung

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2012/069076 A1 [0002]

Claims

Vorrichtung (10), insbesondere STED-Fluoreszenzlichtmikroskop, mit: – einer gepulsten Anregungslichtquelle (16) zum Einstrahlen von gepulstem Anregungslicht auf eine Probe (12), wobei das Anregungslicht zur Fluoreszenz-Anregung von in der Probe (12) enthaltenden fluoreszierenden Einheiten in einem Fokusbereich (22) fokussiert ist, – einer Abregungslichtquelle (32), zum Einstrahlen von Abregungslicht auf eine einen zentralen Bereich (38) innerhalb des Fokusbereichs (22) umgebenden Region (39) der Probe (12), um die um diesen zentralen Bereich (38) herum angeregten fluoreszierenden Einheiten abzuregen, wobei der zentrale Bereich (38) selbst vom Einstrahlen des Abregungslichts ausgenommen ist, – mindestens einem Detektor (30), der von den angeregten fluoreszierenden Einheiten in der Probe (12) spontan emittiertes Fluoreszenzlicht mit zeitlicher Auflösung nach jedem Puls des Anregungslichts von der Anregungslichtquelle (16) registriert, gekennzeichnet durch eine Analyseeinrichtung (42) zur Bestimmung eines zeitabhängigen Intensitätsverlaufs des vom Detektor (30) mit zeitlicher Auflösung registrierten Fluoreszenzlichts und zur Durchführung einer Pattern-Matching-Analyse der Intensitätsmuster dieses zeitabhängigen Intensitätsverlaufs.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyseeinrichtung (42) eingerichtet ist, mittels der Pattern-Matching-Analyse – die Intensität des aus dem zentralen Bereich (38) emittierten Fluoreszenzlichts und/oder – die Intensität des aus dem restlichen Fokusbereichs emittierten Fluoreszenzlichts zu ermitteln.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (30) einen Einzelphotonendetektor aufweist oder als ein Einzelphotonendetektor ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyseeinrichtung (42) eingerichtet ist, für jedes der Photonen den Zeitpunkt der Registrierung dieses Photons im Detektor relativ zum Zeitpunkt des Aussenden des Anregungspulses zu ermitteln und den zeitabhängigen Intensitätsverlauf des vom Detektor (30) mit zeitlicher Auflösung registrierten Fluoreszenzlichts anschließend als Histogramm der detektierten/registrierten Photonen mit zeitlichem Bezug zu den entsprechenden Anregungspulsen zu bestimmen.
Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyseeinrichtung (42) eingerichtet ist, jedem einzelnen vom Detektor (30) registrierten Photon mehrere auf den ermittelten Intensitätsverläufen beruhende Wichtungen zuzuordnen, mit denen dieses Photon – aus dem zentralen Bereich (38) innerhalb des Fokusbereichs oder – aus dem restlichen Fokusbereich oder – aus einem Zwischenbereich zwischen den zentralem Bereich im Fokusbereich und dem restlichen Fokusbereich stammt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (10) eine Raster-Einheit zum Überfahren der Probe (12) mit dem Fokusbereich (22) des Anregungslichts und der entsprechenden Region (39) des Abregungslichts um den zentralen Bereich (38) herum aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (10) als Vorrichtung zur Durchführung von STED-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (10) zur Unterscheidung unterschiedlicher Arten von fluoreszierenden Einheiten mit unterschiedlichem zeitlichen Fluoreszenz-Intensitätsverlauf eingerichtet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch mindestens ein optisches Element zur Auftrennung des von den angeregten fluoreszierenden Einheiten in der Probe (12) spontan emittierten Fluoreszenzlichts anhand seiner spektralen Eigenschaften und/oder Polarisationseigenschaften.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine weitere gepulste Anregungslichtquelle zum Einstrahlen von weiterem gepulsten Anregungslicht zur Fluoreszenz-Anregung von in der Probe (12) enthaltenden fluoreszierenden Einheiten, die ebenfalls in dem mindestens einen Fokusbereich (22) fokussierbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (10) zur zeitlichen Koordinierung der Anregungspulse der unterschiedlichen Anregungslichtquellen eingerichtet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere gepulste Anregungslicht eine andere Polarisationseigenschaft und/oder eine andere Wellenlänge aufweist als das Anregungslicht der einen gepulsten Anregungslichtquelle (16).