DE102019210421A1

DE102019210421A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Messung eines Lichtsignalparameters und nichtflüchtiges Speichermedium

Info

Publication number: DE102019210421A1
Application number: DE102019210421.5A
Authority: DE
Inventors: Holger Birk; Arnold GISKE
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2021-01-21
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: JP2022541036A; DE102019210421B4; WO2021008811A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung (43) zur Messung wenigstens eines Lichtsignalparameters (30), sowie ein nichtflüchtiges computerlesbares Speichermedium (111). Bekannte Verfahren haben den Nachteil, dass diese nicht mehr verwendet werden können, sobald sich die Signale der einzelnen Photonen (13), d.h. die Fluoreszenzphotonen-Ereignisse (15), überlagern. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst zum Verbessern der bekannten Verfahren die Verfahrensschritte: Beleuchten einer Probe (49) über einen vorbestimmten Messzeitraum (23) zur Anregung eines Lichtsignals, insbesondere von Fluoreszenz, in der Probe (49); Detektieren des von der Probe (49) ausgesandten Lichtsignals und Bereitstellen eines die zeitliche Variation des Lichtsignals repräsentierenden elektrischen Signals (3); Zählen einzelner Photonen-Ereignisse (15) auf Basis des elektrischen Signals (3), über den Messzeitraum (23) und Bereitstellen eines die Anzahl (15a) von Photonen-Ereignissen (15) repräsentierenden Zählerwertes (∑E); Integrieren des elektrischen Signals (3) über den Messzeitraum (23) und Bereitstellen eines integrierten Signals (∑P) und Bestimmen mindestens eines Lichtsignalparameters (30) mindestens anhand des Zählerwertes (∑E) und des integrierten Signals (∑P). Die erfindungsgemäße Vorrichtung (43) löst die obige Aufgabe dadurch, dass sie einen Detektor (1), ein Integrationsmodul (71), ein Zählmodul (61), sowie eine Logikeinheit (77) zur Bestimmung wenigstens eines Lichtsignalparameters (30) in Abhängigkeit vom integrierten Signal (∑P) und vom Zählerwert (∑E) umfasst.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung wenigstens eines Lichtsignalparameters, sowie ein nichtflüchtiges computerlesbares Speichermedium.
Die Verfahren aus dem Stand der Technik nutzen eine Lichtquelle zur Anregung eines Lichtsignals, wie beispielsweise ein Reflexions-Signal, ein Phosphoreszenzsignal, die zweite Harmonische oder Fluoreszenz. Rein beispielhaft wird im Falle von Fluoreszenz die Zeit zwischen dem Einschalten der Lichtquelle bzw. einem Anregungsimpuls und den emittierten Fluoreszenzphotonen gemessen, wobei beispielsweise ein TDC (time-to-digital-Converter) zum Einsatz kommen kann. Das Verfahren ist als „time-correlated single photon counting“ (TCSPC) bekannt. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass es auf Photonenraten begrenzt ist, bei denen im Wesentlichen ein Photon pro Laserpuls erzeugt wird. Mit komplizierteren und teureren Vorrichtungen umfassend parallele Auswerte-Elektroniken können Messungen bis zu Photonenraten von ca. 40 Mcts (megacounts; 10⁶ Ereignisse) pro Sekunde erreicht werden.
Andere Verfahren aus dem Stand der Technik tasten die Trigger-Signale der Lichtquelle und der generierten Photonen sehr schnell ab, d.h. mit Frequenzen größer gleich 10 GHz, sodass aus dem Datenstrom ein Lichtsignalparameter ermittelt werden kann.
Beide Verfahren haben gemeinsam, dass diese nur noch eingeschränkt verwendet werden können, sobald sich die Signale der einzelnen Photonen, d.h. die Fluoreszenzphotonen-Ereignisse, überlagern.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung eines Lichtsignalparameters zu schaffen, die apparativ einfach und kostengünstig sind, sowie eine Messung des Lichtsignalparameters bei großen Photonenraten (> 40 Mcts/s) ermöglicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren löst diese Aufgabe dadurch, dass es die folgenden Verfahrensschritte umfasst:

- Beleuchten einer Probe über einen vorbestimmten Messzeitraum zur Anregung eines Lichtsignals, insbesondere von Fluoreszenz in der Probe;
- Detektieren des von der Probe ausgesandten Lichtsignals und Bereitstellen eines die zeitliche Variation des Lichtsignals repräsentierenden elektrischen Signals;
- Zählen einzelner Photonen-Ereignisse auf Basis des elektrischen Signals über den Messzeitraum und Bereitstellen eines die Anzahl von Photonen-Ereignissen repräsentierenden Zählerwertes;
- Integrieren des elektrischen Signals über den Messzeitraum und Bereitstellen eines integrierten Signals; und
- Bestimmen mindestens eines Lichtsignalparameters, mindestens anhand des Zählerwertes und des integrierten Signals.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann insbesondere ein Mikroskop sein und löst die obige Aufgabe dadurch, dass sie einen Detektor zur Erzeugung und Ausgabe eines eine Abfolge eintreffender Photonen repräsentierenden elektrischen Signals an einem Detektorausgang, ein Integrationsmodul zum Integrieren des elektrischen Signals über einen Messzeitraum, wobei das Integrationsmodul zur Ausgabe eines daraus resultierenden Integrationswertes (auch: integrierten Wertes) ausgestaltet ist, ein Zählmodul zum Zählen einer Anzahl im Messzeitraum detektierter Photonen-Ereignisse auf Basis des elektrischen Signals über den Messzeitraum und zum Ausgeben eines diese Anzahl repräsentierenden Zählerwertes, sowie eine Logikeinheit zur Bestimmung wenigstens eines Lichtsignalparameters in Abhängigkeit vom Integrationswert und vom Zählerwert umfasst.
Ferner umfasst das erfindungsgemäße nichtflüchtige computerlesbare Speichermedium ein Programm mit Befehlen, die bei Ausführung durch einen Computer diesen veranlassen, das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung haben somit den Vorteil, dass keine aufwändige Zeitmessung zwischen dem Einschalten der Lichtquelle, d.h. beispielsweise dem anregenden Laserpuls und einem detektierten Photonen-Ereignisse notwendig ist. Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt eine zeitliche Überlappung zweier oder mehrerer Photonen-Ereignisse, die nicht mehr unterscheidbar sind, zur Messung des Lichtsignalparameters, d.h. es basiert auf der Tatsache, dass durch Überlappung mehrerer Photonen-Ereignisse der Zählerwert kleiner als der Integralwert ist. Vielmehr steigt die Genauigkeit der detektierten Fluoreszenzlebensdauer mit den Photonenraten. Insbesondere werden die mittleren Photonenraten betrachtet, d.h. die im Durchschnitt pro Zeiteinheit auftretenden Photonen.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung können durch weitere, jeweils für sich vorteilhafte Ausgestaltungen weiter verbessert werden. Dabei können die technischen Merkmale der einzelnen Ausgestaltungen beliebig miteinander kombiniert bzw. weggelassen werden, sofern es nicht auf den mit dem weggelassenen technischen Merkmal erzielten technischen Effekt ankommt.
Das Verfahren kann insbesondere mittels eines Mikroskops durchgeführt werden. Somit kann eine entsprechende Vorrichtung insbesondere ein Mikroskop sein.
Das Zählen einzelner Photonen-Ereignisse kann bevorzugt mittels eines Digitalisierers, weiter bevorzugt mittels eines Komperators durchgeführt erden. Dieser kann somit in der entsprechenden Vorrichtung vorgesehen sein.
Die Beleuchtung der Probe über den Messzeitraum kann zeitlich moduliert erfolgen, insbesondere mit periodischen Lichtimpulsen. Hierbei sind insbesondere Pulslaser, Kurzpulslaser oder Ultrakurzpulslaser geeignete Lichtquellen. Besonders bevorzugt können gepulste Diodenlaser verwendet werden, da diese eine (im Vergleich zu beispielsweise Festkörperlasern) geringere Größe aufweisen und leicht ansteuerbar sind. Ebenso können gepulste Faserlaser verwendet werden.
Eine Beleuchtungseinheit, die eine solche gepulste Lichtquelle umfasst, kann in der Vorrichtung vorgesehen sein, oder extern bereitgestellt werden. Als Messzeitraum kann eine beliebige Zeitdauer gewählt werden, wobei bevorzugt ein Messzeitraum gewählt werden kann, der mehrere Periodendauern der Lichtimpulse umfasst. Dies hat den Vorteil, dass ein Trigger auf einfache Weise von der gepulsten Lichtquelle abgreifbar ist.
Als Detektor bzw. Photonendetektor werden bevorzugt Detektoren eingesetzt, die einzelne eintreffende Photonen nachweisen können und für jedes eintreffende Photon ein Photonen-Ereignis in einem ausgegebenen elektrischen Signal des Detektors generieren. Im Folgenden wird lediglich von Fluoreszenzphotonen gesprochen, die im Detektor, insbesondere im ausgegebenen elektrischen Signal des Detektors, ein Fluoreszenzphotonen-Ereignis generieren. Die Beschreibung erfolgt zwar anhand von Fluoreszenzphotonen und entsprechender Fluoreszenzparameter, die Erfindung ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Ausführungen können auchauf Photonen und entsprechende Lichtsignalparameter übertragen werden, die auf anderem Wege, beispielsweise durch Reflexion, Phosphorenszenz oder zwei Photonen-Prozesse generiert wurden.
Es können spezielle Elektronenröhren verwendet werden, auch Photomultiplier oder Photoelektronenvervielfacher genannt (engl. photomultiplier tube, PMT). Diese können auch reine Halbleiterdetektoren oder PMT-Hybrid-Detektoren oder SiPM (Silizium-Photomultiplier) sein.
Der Detektor detektiert das von der Probe ausgesandte Licht, beispielsweise Fluoreszenzlicht und generiert ein elektrisches Signal, welches eine Abfolge bzw. Variation der eintreffenden Photonen, beispielsweise Fluoreszenzphotonen repräsentiert. Das elektrische Signal wird an einem Detektorausgang ausgegeben und kann eine Vielzahl von Photonen-Ereignissen, beispielsweise Fluoreszenzphotonen-Ereignissen umfassen, die zeitlich voneinander getrennt oder miteinander überlappt sein können.
Im Folgenden können mittels des Integrationsmoduls alle im Messzeitraum mit dem Detektor detektierten Photonen, beispielsweise Fluoreszenzphotonen aus dem Signal ermittelt und ein zu dieser Anzahl proportionales Signal zur Verfügung gestellt werden. Dieses Signal kann einen Gesamtphotonenwert repräsentieren.
Das elektrische Signal kann in einen Photonenzähl-Pfad, in welchem das elektrische Signal integriert wird, und in einen Ereigniszähl-Pfad aufgespalten werden, in welchem die einzelnen Photonen-Ereignisse des elektrischen Signals gezählt werden. Im Integrationsmodul wird das zu allen detektierten Photonen proportionale Signal ermittelt, wohingegen im Zählmodul die Anzahl der im Messzeitraum detektierten Photonen-Ereignisse ermittelt und in Form des diese Anzahl repräsentierenden Zählerwertes bereitgestellt wird.
In der Logikeinheit kann ferner der Lichtsignalparameter, bevorzugt ein Fluoreszenzparameter und besonders bevorzugt die Fluoreszenzlebensdauer anhand des integrierten Signals und des Zählerwertes bestimmt werden. Die Logikeinheit kann in Form eines einzelnen Logikbausteins bzw. Chips oder als sogenanntes Field Programmable Gate Array (FPGA) ausgestaltet sein. Ein FGPA ist ein integrierter Schaltkreis (IC), in welchen (vor Ort, beim Kunden) eine logische Schaltung geladen und auf diesem ausgeführt werden kann.
Das erfindungsgemäße nichtflüchtige computerlesbare Speichermedium umfasst ein Programm mit Befehlen zum Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens, beispielsweise auf einem Computer, welches vom Medium gelesen und in ein oben genanntes FPGA oder in den Speicher eines Computers geladen werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner das Zählen einzelner Photonen-Ereignisse, beispielsweise einzelner Fluoreszenzphotonen-Ereignisse des elektrischen Signals über den Messzeitraum und Bereitstellen eines die Anzahl von Photonen-Ereignissen, beispielsweise einzelnen Fluoreszenzphotonen-Ereignissen repräsentierenden Zählerwertes umfassen. Hierzu kann in der Vorrichtung ein Inkrementalgeber vorgesehen sein, der den Zählerwert ausgibt, wobei der Zählerwert in digitaler oder analoger Form vorliegen kann und die Anzahl der Photonen-Ereignisse, beispielsweise einzelner Fluoreszenzphotonen-Ereignisse repräsentiert. Insbesondere kann der Zählerwert am Ende des Messzeitraums, d.h. dem Beginn des nachfolgenden Messzeitraums, zurückgesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst das Integrieren des elektrischen Signals über den Messzeitraum und Bereitstellen eines integrierten Signals, welches eine im Messzeitraum akkumulierte Photonenzahl aller detektierten Fluoreszenzphotonen repräsentiert.
Die meisten Photonendetektoren erzeugen pro detektiertem Photon einen elektrischen Puls, dessen Höhe unabhängig von der Energie des Photons ist. Photonen unterschiedlicher Wellenlänge können anhand des Signals nicht unterschieden werden, allerdings addieren sich die Pulse zeitgleich auftreffender Photonen im Signal, so dass beispielsweise das integrierte Signal zweier zeitgleich auftreffender Photonen doppelt so groß ist wie das integrierte Signal eines einzelnen Photons.
Das integrierte Signal kann mittels eines Integrators oder Integrationsmoduls erhalten werden, das mit einer genügend großen Zeitkonstante nicht mehr die einzelnen Photonen-Ereignisse, beispielsweise einzelnen Fluoreszenzphotonen-Ereignisse des elektrischen Signals unterscheidet, sondern diese über den Messzeitraum integriert.
Mit anderen Worten erfolgt im Zählmodul ein Vergleich des elektrischen Signals mit einem Schwellenwert, wobei beim Überschreiten und darauffolgenden Unterschreiten des Schwellenwertes der Zählerstand um eins erhöht wird. Zeitgleich auftreffende Photonen, beispielsweise Fluoreszenzphotonen generieren somit sich zeitlich überlagernde Photonen-Ereignisse, beispielsweise sich zeitlich überlagernde Fluoreszenzphotonen-Ereignisse, die den Schwellenwert lediglich einmalig über- und unterschreiten und den Zähler der Photonen-Ereignisse, insbesondere der Fluoreszenzphotonen-Ereignisse lediglich um eins erhöhen.
Im integrierenden Pfad dagegen wird eine quantitative Größe, wie zum Beispiel eine Ladung, ausgewertet. Zwei zeitgleich eintreffende Fluoreszenzphotonen generieren somit im integrierenden Pfad ein doppelt so hohes Signal wie ein einzelnes eintreffendes Fluoreszenzphoton.
Ein innerhalb des Messzeitraums ermittelter Integrationswert (d.h. das integrierte Signal) repräsentiert somit die akkumulierte Photonenzahl aller detektierten Photonen, insbesondere der detektierten Fluoreszenzphotonen.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können das Integrieren und das Zählen parallel stattfinden. Ferner erfolgen das Integrieren und das Zählen bevorzugt zusätzlich zeitgleich.
Des Weiteren kann das Verfahren das Berechnen eines Verhältniswertes aus der Anzahl einzelner Fluoreszenzphotonen-Ereignisse, d.h. aus dem Zählerwert und dem integrierten Signal umfassen. In allen Ausgestaltungen des Verfahrens oder der Vorrichtung dieser Offenbarung können die drei Größen Zählerwert, integriertes Signal und Verhältniswert in beliebiger, z.B. Zweier-Paarung genutzt werden, um den Lichtsignalparameter, bevorzugt den Fluoreszenzparameter und besonders bevorzugt die Fluoreszenzlebensdauer zu ermitteln. Somit können (1) der Zählerwert und das integrierte Signal, (2) der Zählerwert und der Verhältniswert oder (3) das integrierte Signal und der Verhältniswert zum Lichtsignalparameter führen. Beschreibungen in dieser Offenbarung, die sich auf eine der Kombinationen (1), (2) oder (3), oder auf Kombinationen anderer Größen zur Ermittlung des Lichtsignalparameters beziehen, sind demnach - sofern im Text nicht explizit ausgeschlossen - auf jegliche andere Kombination dieser drei Größen übertragbar und nicht auf die jeweils genannte Kombination beschränkt.
Die Kalibrationsdaten zur Bestimmung des Lichtsignalparameters, bevorzugt eines Fluoreszenzparameters, wie beispielsweise der Fluoreszenz-Lebensdauer, können in einer Tabelle (LUT: look-up-table) oder in einer Formel hinterlegt sein. Beispielsweise kann für jedes Wertepaar von integriertem und gezähltem Signal (Zählerwert) eine zugehörige Fluoreszenzlebensdauer hinterlegt sein, so dass rein beispielhaft die Fluoreszenzlebensdauer bei Vorliegen der beiden Messwerte direkt angegeben werden kann (Kalibrations-LUT). Die zweidimensionale LUT kann auch weniger Stützstellen als mögliche Kombinationen aller Wertepaare beinhalten. Dann kann der Lichtsignalparameter, wie rein beispielhaft die Fluoreszenzlebensdauer aus den vorhandenen Stützstellen interpoliert werden.
Ferner kann es Signalpaare geben, für welche es nicht möglich ist, den Lichtsignalparameter, wie rein beispielhaft die Fluoreszenzlebensdauer zu ermitteln. Dies ist z.B. der Fall, wenn nur sehr kleine Signale vorliegen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann in einer weiteren Ausgestaltung mindestens ein weiterer Lichtsignalparameter bestimmt werden. So können beispielsweise, wenn Fluoreszenzparameter bestimmt werden, außer der Fluoreszenzlebensdauer noch weitere Signale generiert werden. Als Beispiel kann aus der Kombination beider Signale (integriert/gezählt) ein verbessertes Intensitätssignal generiert werden. Die Strukturen und die Datenpfade können unverändert sein, nur die Rechenvorschrift/Kalibrations-LUT können entsprechend an die Berechnung des Intensitätssignals angepasst sein. Eine solche Ausgestaltung hat den Vorteil, dass eine Redundanz zur Bestimmung der Intensität des elektrischen Signals vorgesehen ist, das beispielsweise durch Integration ermittelte, integrierte Signal auf seine Korrektheit überprüft und Abweichungen oder Fehler bei der Ermittlung erkannt werden können.
Eine Vorrichtung zur Ausführung dieser Ausgestaltung des Verfahrens kann somit das Integrationsmodul zum Integrieren des elektrischen Signals im Messzeitraum und zur Ausgabe eines Integrationswertes und das Zählmodul zum Zählen der Photonen-Ereignisse und zur Ausgabe des Zählerwertes sowie optional ein Divisionsmodul zur Berechnung eines Verhältniswertes aus dem Zählerwert des Zählmoduls und dem integrierten Signal des Integrationsmoduls und zur Ausgabe des Verhältniswertes vorsehen, wobei die Logikeinheit ausgestaltet sein kann, den Lichtsignalparameter, wie beispielsweise die Fluoreszenzlebensdauer in Abhängigkeit vom integrierten Signal und vom Zählerwert oder auch vom integrierten Signal (oder alternativ vom Zählerwert) und vom Verhältniswert zu bestimmen.
Das Verfahren kann folglich weiter verbessert werden, indem es das Bestimmen des Lichtsignalparameters, bevorzugt des Fluoreszenzparameters, wie beispielsweise der Fluoreszenzlebensdauer anhand des integrierten elektrischen Signals und des Zählerwertes umfasst. Optional kann der Verhältniswert in Kombination mit dem Zählerwert oder dem integrierten Signal zur Bestimmung des Lichtsignalparameters verwendet werden. Mit anderen Worten kann der Lichtsignalparameter, bevorzugt der Fluoreszenzparameter, wie z.B. die Fluoreszenzlebensdauer in verschiedenen Ausgestaltungen aus jeweils zwei Größen bestimmt werden. Diese Größen können beispielsweise das integrierte Signal und der Zählerwert sein, der Zählerwert und der Verhältniswert oder auch das integrierte Signal und der Verhältniswert.
Die Bestimmung des Lichtsignalparameters mittels des Zählerwertes und des integrierten Signals stellt die bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar, schließt aber die Kombination anderer Größen zur Bestimmung des Lichtsignalparameters nicht aus.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dieses das Berechnen des Lichtsignalparameters, bevorzugt des Fluoreszenzparameters wie beispielsweise der Fluoreszenzlebensdauer mit Hilfe des integrierten Signals und des Zählerwertes.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Ausführung dieser Ausgestaltung des Verfahrens kann somit eine Recheneinheit zur Berechnung des Lichtsignalparameters, bevorzugt des Fluoreszenzparameters wie beispielsweise der Fluoreszenzlebensdauer mit Hilfe des integrierten Signals und des Zählerwertes umfassen.
Ebenso kann die Recheneinheit in einer speziellen Ausgestaltung den Zählerwert (oder alternativ das integrierte Signal) und den Verhältniswert (das Verhältnis integriertes Signal zu Zählerwert) verwenden, um mittels einer vorab gespeicherten, analytischen Rechenvorschrift (analytische Kurve) den Lichtsignalparameter, bevorzugt den Fluoreszenzparameter, wie beispielsweise die Fluoreszenzlebensdauer zu berechnen.
Die Recheneinheit selbst kann ein Divisionsmodul umfassen und somit alle notwendigen Rechenschritte in einer Einheit vereinen.
Alternativ oder zusätzlich kann in einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ferner das Bestimmen des Lichtsignalparameters, insbesondere des Fluoreszenzparameters wie beispielsweise der Fluoreszenzlebensdauer mit Hilfe zuvor gespeicherter Daten in Abhängigkeit vom integrierten Signal und vom Zählerwert vorgesehen sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Ausführung dieser Ausgestaltung des Verfahrens kann somit mindestens ein Speichermodul zur Speicherung eines Datensatzes einander zugeordneter Referenzwerte des integrierten Signals, des Zählerwertes und des Lichtsignalparameters, insbesondere des Fluoreszenzparameters wie beispielsweise der Fluoreszenzlebensdauer umfassen.
Die zuvor gespeicherten Daten können in Form eines zweidimensionalen oder dreidimensionalen Datensatzes vorliegen. Dieser Datensatz bzw. diese Datenmatrix kann das integrierte elektrische Signal (d.h. der Integrationswert) und den Zählerwert (optional Zählerwert und Verhältniswert oder alternativ integriertes Signal und Verhältniswert) umfassen und bestimmten Kombinationen dieser Werte einen Lichtsignalparameter, bevorzugt einen Fluoreszenzparameter, wie z.B. eine Fluoreszenzlebensdauer zuordnen.
Mit anderen Worten kann im erfindungsgemäßen Verfahren eine Schar von Messkurven postuliert werden, die das integrierte Signal oder den Verhältniswert in Abhängigkeit des Zählerwertes (oder im Falle des integrierten Signals auch des Verhältniswerts) zeigen. Der Scharparameter ist in diesem Fall der Lichtsignalparameter, insbesondere der Fluoreszenzparameter wie beispielsweise die Fluoreszenzlebensdauer. Durch Kenntnis bzw. Berechnung des Zählerwertes und des integrierten Signals (oder des Verhältniswerts) kann ein Vertreter der Kurvenschar ermittelt und der zu diesem Vertreter der Kurvenschar zugehörige Lichtsignalparameter, insbesondere der Fluoreszenzparameter, wie beispielsweise die Fluoreszenzlebensdauer abgelesen werden.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann das Verfahren das Interpolieren der zuvor gespeicherten Daten umfassen, wobei anhand der interpolierten Daten der Lichtsignalparameter, insbesondere der Fluoreszenzparameter, wie beispielsweise die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt wird. Dies hat den Vorteil, dass die zuvor gespeicherten Daten, beispielsweise des integrierten Signals und des Zählerwertes, in einer festen Abstufung hinterlegt sein können. Selbst wenn detektierte integrierte Signale und/oder detektierte Zählerwerte bezüglich ihrer Zahlenwerte zwischen zwei zuvor gespeicherten integrierten Signalen und/oder Zählerwerten liegen, kann eine Bestimmung des Lichtsignalparameters, insbesondere des Fluoreszenzparameters, wie beispielsweise der Fluoreszenzlebensdauer erfolgen.
Eine Vorrichtung zur Ausführung dieser Ausgestaltung des Verfahrens kann folglich ein Interpolationsmodul zum Interpolieren der zuvor gespeicherten Daten umfassen.
Wie bereits oben erwähnt, kann die analytische Kurve, welche Grundlage der bereitgestellten Schar von Messkurven sein kann, benutzt werden, um den Lichtsignalparameter, insbesondere den Fluoreszenzparameter, wie z.B. die Fluoreszenzlebensdauer direkt aus dem Zählerwert und dem integrierten Signal (bzw. dem Verhältniswert) zu berechnen.
Hierbei kann in einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens das Ermitteln und/ oder Kalibrieren einer Impulsform und/oder Impulsdauer eines einzelnen Photonen-Ereignisses, wie beispielsweise eines einzelnen Fluoreszenzphotonen-Ereignisses vorgesehen sein.
Beim Zählen der Photonen-Ereignisse, wie beispielsweise der Fluoreszenzphotonen-Ereignisse kommt es aufgrund des stochastischen Verhaltens der Photonen, bevorzugt der Fluoreszenzphotonen bei der Fluoreszenz zwangsläufig mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch zur Überlagerung einzelner Photonen-Ereignisse, wie beispielsweise einzelner Fluoreszenzphotonen-Ereignisse und damit zu nicht gezählten Ereignissen. Die Wahrscheinlichkeit für nicht gezählten Ereignisse ist abhängig von:

1. der Pulsfrequenz der Anregungsbeleuchtung, die im Allgemeinen bekannt ist;
2. der mittleren Photonenrate, die mittels des integrierten Signals und der Pulsfrequenz berechnet werden kann;
3. der Pulsform und Impulsdauer eines einzelnen Photonen-Ereignisses, wie beispielsweise Fluoreszenzphotonen-Ereignisses;
4. dem Lichtsignalparameter, insbesondere dem Fluoreszenzparameter, wie z.B. der Fluoreszenzlebensdauer des angeregten Fluorophores; und
5. dem Gating des Detektors.

Insbesondere Punkt 3 der obigen Liste kann mit dieser Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelt werden oder (sofern Fluoreszenz betrachtet wird) mittels Vergleichsmessungen von Farbstoffen bekannter Fluoreszenzlebensdauer kalibriert werden. Dies erlaubt es, aus dem Verhältnis von zählendem und integrierendem Pfad, d.h. aus dem Verhältnis von Zählerwert und integriertem Signal direkt den Lichtsignalparameter, insbesondere den Fluoreszenzparameter, wie z.B. die Fluoreszenzlebensdauer des angeregten Farbstoffs zu erhalten.
Unter obigem Punkt 5 ist zu verstehen, dass die Empfindlichkeit des Detektors im zeitlichen Verlauf bezüglich des Anregungspulses eingestellt werden kann. Mit anderen Worten erlaubt es das Gating, bestimmte Zeitbereiche des zählenden Pfades (d.h. während des Integrierens) auszublenden, um beispielsweise dem Lichtsignal, wie beispielsweise dem Fluoreszenzpuls vorauseilendes, reflektiertes Anregungslicht zu unterdrücken.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dadurch verbessert werden, dass das Bestimmen des Lichtsignalparameters, insbesondere des Fluoreszenzparameters, wie z.B. der Fluoreszenzlebensdauer unter Berücksichtigung der Impulsform und/oder der Impulsdauer der einzelnen Photonen-Ereignisse, insbesondere der einzelnen Fluoreszenzphotonen-Ereignisse erfolgt.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren ferner das sequenzielle Rastern oder Scannen einer Probe und Erzeugen eines Abbildes von Lichtsignalparametern, insbesondere von Fluoreszenzparametern, wie z.B. von Fluoreszenzlebensdauern räumlich voneinander beabstandeter Bereiche der Probe umfassen.
Ein Sonderfall dieser Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt somit eine einfach umzusetzende Möglichkeit dar, eine Probe mittels Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (englisch: fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) zu untersuchen. Die entsprechende Vorrichtung kann ein Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskop (FLIM) sein.
In dieser Ausgestaltung kann eine Raster- oder Scanvorrichtung vorgesehen sein, welche das Anregungslicht in einer Scan- oder Rasterbewegung über die Probe bewegt. Ebenso ist es möglich, dass die Probe relativ zur Beleuchtung und zur Detektion bewegt wird. Somit kann Punkt für Punkt, d.h. pixelweise der Lichtsignalparameter, insbesondere der Fluoreszenzparameter, wie z.B. die Fluoreszenzlebensdauer des jeweils beleuchteten Bereichs der Probe ermittelt und als Bildinformation dargestellt werden.
Insbesondere kann die Ausgestaltung eines solchen Verfahrens in einem Rastermikroskop, insbesondere einem konfokalen Rastermikroskop, verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann insbesondere auf dem im Zählmodul (zur Ermittlung des Zählerwerts) auftretenden Sättigungsverhalten beruhen. Dieses wird durch die Überlagerung der zu zählenden Photonen-Ereignisse, wie z.B. der zu zählenden Fluoreszenzphotonen-Ereignisse hervorgerufen. Dieser Effekt der Überlagerung kann insbesondere vom Lichtsignalparameter, insbesondere vom Fluoreszenzparameter, wie z.B. von der Fluoreszenzlebensdauer abhängen, da die mittlere Photonenrate im Verlauf eines Pulses stark variiert. Der Effekt kann besonders ausgeprägt sein, wenn die Breite des zu zählenden Photonen-Ereignisses, wie z.B. des zu zählenden Fluoreszenzphotonen-Ereignisses in der gleichen Größenordnung wie der Lichtsignalparameter, insbesondere der Fluoreszenzparameter, wie z.B. die Fluoreszenzlebensdauer des beobachteten Farbstoffs ist.
Für die oben erwähnten Detektortypen sind die Impulsdauern (die Dauer bzw. Breite der Photonen-Ereignisse, wie z.B. der zu zählenden Fluoreszenzphotonen-Ereignisse) typischerweise im Bereich zwischen einer und zwei Nanosekunden. Typische Fluoreszenzlebensdauern der Farbstoffe betragen im Allgemeinen eine bis fünf Nanosekunden. In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Anpassung der elektronischen Impulsdauern durch geeignete Filterung oder durch die Anpassung des Schwellenwertes erfolgen. Dies kann einen besonders vorteilhaften Fluoreszenzlebensdauer-Kontrast erzielen.
Das erfindungsgemäße nichtflüchtige computerlesbare Speichermedium umfasst insbesondere ein Programm mit Befehlen, die bei der Ausführung durch eine Computer diesen veranlassen, das Verfahrens nach einer der zuvor genannten Ausgestaltungen auszuführen. Als Speichermedium ist jegliche Art von optischem, magnetischem oder Flash-Speicher basiertem Datenträger zu verstehen.
Im Folgenden werden das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung anhand beispielhafter, nicht einschränkender Figuren näher erläutert. Einzelne technische Merkmale können dabei gemäß den Unteransprüchen beliebig miteinander kombiniert und/oder weggelassen werden. Gleiche technische Merkmale und technische Merkmale gleicher Funktion werden der Übersichtlichkeit halber mit dem gleichen Bezugszeichen versehen.
Es zeigen:

1a eine schematische Darstellung des von einem Detektor generierten elektrischen Signals und der Ermittlung des Zählerwertes;
1b die Darstellung einer Simulation für eine gepulste Anregung mit vier Pulsen bei angenommener Fluoreszenzlebensdauer von 1,5 ns;
1c eine Darstellung der Simulation der 1b mit angenommener Fluoreszenzlebensdauer von 5 ns;
1d eine vereinfachte Darstellung der mittleren Photonenrate über die Zeit;
2a eine Look-up-Tabelle zur Ermittlung einer Fluoreszenzlebensdauer;
2b eine schematische Look-up-Tabelle zur Ermittlung einer Lichtintensität;
2c eine schematische Darstellung zuvor gespeicherter Daten zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer;
3a eine schematische Darstellung einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer;
3b eine schematische Darstellung einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer;
4 eine Schemazeichnung zum Anwendungsbereich des vorliegenden Verfahrens bzw. der vorliegenden Vorrichtung;
5 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens; und
6 eine schematische Darstellung des Gatings.

Die im Folgenden beschriebenen Figuren zeigen rein beispielhaft die Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer. Diese Beschreibung ist rein exemplarisch und kann auf die Ermittlung eines Fluoreszenzparameters, oder allgemeiner auf die Ermittlung eines Lichtsignalparameters übertragen werden. Da die folgenden Beschreibungen exemplarisch sind, schränken diese den Schutzumfang nicht ein. Das Lichtsignal kann beispielsweise durch Reflexion, Phosphoreszenz, Fluoreszenz oder zwei Photonen-Prozesse generiert werden.
Die 1a zeigt eine schematische Darstellung des von einem Detektor 1 (siehe Darstellung im Graphen rechts oben) generierten elektrischen Signals 3, welches zur Ermittlung eines Zählerwertes (siehe 3) verwendet wird. Der Detektor kann beispielsweise als PMT-hybrid-Detektor 1a oder als Silizium Photomultiplizierer 1b (englisch: Silicon photomultiplier, kurz SiPM) ausgestaltet sein.
Das elektrische Signal 3 kann beispielsweise den Verlauf einer Spannung 5 bzw. eines elektrischen Stroms 7 in Abhängigkeit der Zeit 9 darstellen, wobei im ideal angenommenen Fall ein vernachlässigbarer Dunkelstrom 11 gemessen wird.
Wenn ein Fluoreszenzphoton 13 mit der Photonenenergie E = h v auf den Detektor 1 trifft, generiert der Detektor 1 ein Fluoreszenzphotonen-Ereignis 15. Dies ist nur bei einer fiktiv angenommenen Quanteneffizienz von 1 der Fall. Tatsächlich geschieht die Erzeugung eines Fluoreszenzphotonen-Ereignisses 15 mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit entsprechend der Quanteneffizienz. In 1a sind der Übersichtlichkeit halber lediglich einige zeitlich isolierte Ereignisse 15c sowie zeitlich überlappende Ereignisse 15b gezeigt.
Die zeitlich isolierten Ereignisse 15c beeinflussen sich nicht gegenseitig, wohingegen die zeitlich überlappenden Ereignisse 15b, die in 1a eingezeichnet sind, zu einem Wert der Spannung 5 bzw. des elektrischen Stroms 7 führen, die/der deutlich größer (nahezu Faktor 2) des Wertes der Spannung bzw. des elektrischen Stroms 7 der zeitlich isolierten Ereignisse 15c ist.
Jedes Fluoreszenzphotonen-Ereignis 15 weist eine Impulsform 17, umfassend eine steile ansteigende Flanke 17a und eine exponentiell abfallende Flanke 17b, und eine Impulsbreite bzw. Impulsdauer 19 auf. Zu beachten ist, dass die Impulsform 17 sowie die Impulsdauer 19 einer Impulsantwortfunktion 21 eines Detektors 1 entspricht. Unterschiedliche Detektoren 1 weisen unterschiedliche Impulsantwortfunktionen 21 auf. Mit anderen Worten stellt das Fluoreszenzphotonen-Ereignis 15 die Änderung der Spannung 5 oder des elektrischen Stroms 7 dar, nachdem ein Fluoreszenzphoton 13 auf den Detektor 1 getroffen ist.
In realen Anwendungen sind ferner weitere Parameter wie die Quanteneffizienz oder der Füllfaktor des Detektors 1 zu beachten. Hier wird der Einfachheit halber angenommen, dass jedes eintreffende Fluoreszenzphoton 13 immer genau ein Fluoreszenzphotonen-Ereignis 15 im Detektor 1 generiert.
Im unteren Bereich der Kurve des elektrischen Signals 3 sind mit gestrichelten Linien die fünfzehn in Abhängigkeit der Zeit 9 innerhalb eines vorbestimmten Messzeitraums 23 auf den Detektor 1 auftreffenden Photonen 13 angedeutet. Diese können in einem integrierten Signal ∑_P , der die Anzahl der Photonen 13 repräsentiert zusammengezählt sein. Das integrierte Signal ∑_P ist schematisch als in einer Speichereinheit 25 gespeichert dargestellt.
Ferner zeigt die 1a schematisch zwei aufeinanderfolgende Lichtimpulse 27, die im gezeigten Ausführungsbeispiel den Messzeitraum 23 definieren. Dieser Sachverhalt zeigt deutlich, dass ein Großteil der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer in diesem Fall nicht anwendbar wären, da mehr als ein Fluoreszenzphoton 13 zwischen zwei Lichtimpulsen 27 detektiert wird. Ferner erfolgt im Stand der Technik häufig die Einschränkung auf ein Photon pro Messzeitraum (TCSPC). Eine Abfolge 26 der Lichtimpulse 27 kann insbesondere periodisch sein.
In 1a ist ein Schwellenwert 29 eingezeichnet, der zum Zählen der Fluoreszenzphotonen-Ereignisse 15 herangezogen wird. Sobald die Spannung 5 bzw. der elektrische Strom 7 diesen Schwellenwert 29 einmal überschreitet und einmal unterschreitet, wird ein Zählerwert ∑_E um eins erhöht. Auch der Zählerwert ∑_E ist schematisch als in einer Speichereinheit 25 gespeichert dargestellt. Der Zählerwert ∑_E repräsentiert die Anzahl im elektronischen Signal auftretender Fluoreszenzphotonen-Ereignisse 15a.
Allerdings führen insbesondere die zeitlich überlappenden Ereignisse 15b bei hinreichend großer Überlappung dazu, dass mehrere solche Ereignisse 15b den Zählerwert ∑_E lediglich um eins erhöhen. Eine hinreichend großer Überlappung bedeutet, dass die Spannung 5 oder der elektrische Strom 7 nach Überschreiten des Schwellenwertes 29 vor dem Eintreffen eines weiteren Fluoreszenzphotons 13 noch nicht wieder unter den Schwellenwert 29 gefallen ist.
Im Falle der drei gezeigten zeitlich überlappenden Ereignisse 15b fällt die Spannung 5 bzw. der elektrische Strom 7 erst nach dem dritten zeitlich überlappenden Ereignis 15b unter den Schwellenwert 29 und erhöht den Zählerwert ∑_E trotz drei eintreffender Fluoreszenzphotonen 13 lediglich um eins. Der Zählerwert ∑_E beträgt im gezeigten Messzeitraum 23 elf.
Die 1 b und 1c zeigen jeweils ein von einem Detektor 1 generiertes elektrisches Signal 3, wobei die zur Anregung dienenden Pulse 27 lediglich durch eine jeweils punktierte Linie dargestellt sind. In beiden Figuren ist die Abfolge 26 von insgesamt vier Lichtimpulsen 27 gezeigt.
In den gezeigten Simulationen wird eine mittlere Photonenrate 41 von 650 MHz angenommen. Der in den 1b und 1c gezeigte Messzeitraum 23 umfasst folglich einen Zeitraum der gepulsten Anregung von vier Periodendauern 115. Die Zeit 9 der gezeigten Messzeiträume 23 beträgt ca. 50 ns (das verwendete Lasersystem zur Anregung hat folglich eine Pulsfolgefrequenz 113 von ca. 75 MHz).
In den 1b und 1c ist bei einem Wert der Spannung 5 bzw. des elektrischen Stroms 7 (gezeigt in willkürlichen Einheiten) von 0,5 der Schwellenwert 29 eingezeichnet. Der Schwellenwert 29 ist mit einer strichpunktierten Linie eingezeichnet.
Die 1b und 1c unterscheiden sich lediglich in einer zugrundegelegten Fluoreszenzlebensdauer 33, die im Fall der 1b 1,5 ns und im Fall der 1c 5 ns beträgt. Die Fluoreszenzlebensdauer stellt einen Fluoreszenzparameter 30a bzw. einen Lichtsignalparameter 30 dar.
Dies hat zur Folge, dass im Falle einer kurzen Fluoreszenzlebensdauer 33 (1b) die Fluoreszenzphotonen-Ereignisse 15 (diese sind nicht jeweils einzeln gekennzeichnet, sondern als Gesamtheit mit einem auf sie zeigenden Pfeil markiert) mit einer großen Wahrscheinlichkeit unmittelbar nach dem jeweiligen Lichtimpuls 27 auftreten. Im Falle einer Fluoreszenzlebensdauer 33, die sich ca. im Bereich der Periodendauer 115 der Abfolge 26 von Lichtimpulsen 27 befindet (1c), verteilen sich dagegen die Fluoreszenzphotonen-Ereignisse 15 über die Periodendauer 115.
In beiden Fällen sind sich zeitlich überlappende Ereignisse 15b zu beobachten, wobei im Fall der 1b eine größere Überlappung auftritt.
Der Einfluss der Fluoreszenzlebensdauer 33 wird anhand der 2a-2c näher erläutert.
Die 2c zeigt eine schematische Darstellung zuvor gespeicherter Daten 31 zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer 33.
Rein exemplarisch sind in 2c fünf Kurven 35a bis 35e einer Kurvenschar 37 gezeichnet, wobei die gezeichneten Kurven 35 lediglich zur Anschauung des Verfahrens dienen und bei einer real durchgeführten Auswertung im Allgemeinen lediglich auf den vorab gespeicherten Datensatz zurückgegriffen wird.
Die Kurven 35a bis 35e sind die Ergebnisse einer Simulation für einen SiPM 16 mit einer Impulsdauer 19 (elektronische Impulsdauer) von 2 ns. Für unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauern 33 von 1 ns bis 5 ns wurde ein Verhältniswert 39 aus dem integrierten Signal ∑_P und dem Zählerwert ∑_E berechnet und über einer mittleren Photonenrate 41 aufgetragen.
Die mittlere Photonenrate 41 ergibt sich aus dem integrierten Signal ∑_P dividiert durch den Messzeitraum 23 und der Verhältniswert 39 ist bis ca. sechshundertfünfzig Mcts/s simuliert.
Liefert das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise eine gemessene mittlere Photonenrate 41a von fünfhundert Mcts/s und einen gemessenen Verhältniswert 39a von vier (beide Werte 39a und 41a sind durch gestrichelte Linien dargestellt), so wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung 43 (siehe 3) eine Fluoreszenzlebensdauer 33 von zwei Nanosekunden ermittelt.
Die 1d zeigt eine vereinfachte Darstellung, in welcher die Photonenrate 41, genauer gesagt die gemittelte Photonenrate 41 über der Zeit 9 dargestellt ist. Die Photonenrate 41 fällt exponentiell ab und ist über mehrere Fluoreszenzphotonen 13 gemittelt.
Im gezeigten Beispiel der 1d überlappen einige Fluoreszenzphotonen 13 miteinander, so dass der Zählerwert (nicht gezeigt) hier vier ergeben würde, anhand des integrierten Signals (ebenso nicht gezeigt) jedoch sechs Fluoreszenzphotonen 13 ermittelt werden würden. Der exponentielle Abfall der Photonenrate 41 ist umgekehrt proportional zur Fluoreszenzlebensdauer 33, d.h. dass eine kurze Fluoreszenzlebensdauer 33 zu einem raschen exponentiellen Abfall der mittleren Photonenrate 41 führt.
Die 2a und 2b zeigen jeweils eine Look-up-table 117, genauer gesagt zuvor in der Look-up-table 117 gespeicherte Daten 31 zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer 33.
Die 2a zeigt fünf Kurven 35a bis 35e einer Kurvenschar 37. Diese Kurven 35a bis 35e dienen lediglich zur Anschauung des Verfahrens und werden im erfindungsgemäßen Verfahren nicht dargestellt, sondern es wird auf den vorab gespeicherten Datensatz zurückgegriffen.
Die Kurven 35a bis 35e sind die Ergebnisse einer Simulation für einen SiPM 16 mit einer Impulsdauer 19 von 2 ns. In 2a wird der Zählerwert ∑_E über dem integrierten Signal ∑_P dargestellt. Ein im erfindungsgemäßen Verfahren ermittelter Satz bzw. ein ermitteltes Wertepaar für den Zählerwert ∑_E und das integrierte Signal ∑_P kann somit verwendet werden, um eine Fluoreszenzlebensdauer 33 zu ermitteln. Analog der Beschreibung zu Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer 33 der 2a kann aus der in 2c gezeigten Darstellung die Fluoreszenzlebensdauer 33 ermittelt werden.
In der 2b ist eine Look-up-table 117 gezeigt. Diese soll im Folgenden abgekürzt als LUT 117 bezeichnet werden. Die LUT 117 der 2b ist eine Intensitäts-LUT 119. In der 2b ist eine korrigierte Intensität 121 über der mittleren Photonenrate 41 dargestellt.
Die mittlere Photonenrate 41 kann aus der dem integrierten Signal ∑_P und dem Messzeitraum 23 berechnet werden.
Mittels der Intensitäts-LUT 119 kann somit die mittels Integration erhaltene Intensität (d.h. die Anzahl der detektierten Fluoreszenzphotonen) verifiziert und gegebenenfalls korrigiert werden.
Der in den 1b und 1c gezeigte Zusammenhang zwischen der Fluoreszenzlebensdauer 33 und dem Verhältniswert 39 ist ebenso in den 2a bis 2c gezeigt. Kommt es bei geringen Fluoreszenzlebensdauern 33, wie in 1b der Fall, zu einer größeren Wahrscheinlichkeit der Überlappung einzelner Fluoreszenzphotonen-Ereignisse 15, so wird ein geringerer Zählerwert ∑_E erhalten, als dies bei längeren Fluoreszenzlebensdauern 33, wie in 1c der Fall ist. Demzufolge kann für kürzere Fluoreszenzlebensdauern 33 bei gleichbleibender mittlerer Photonenrate 41 ein kleinerer Dividend und folglich ein größerer Verhältniswert 39 erhalten werden.
An dieser Stelle sei nochmals betont, dass die gezeigten Kurven 35a bis 35e rein beispielhaft zur Verdeutlichung gezeigt sind und im erfindungsgemäßen Verfahren die Daten 31 in einer feineren Abstufung bzw. mit kleinerer Schrittweite der Fluoreszenzlebensdauer 33 postuliert/simuliert und gespeichert sein können. Insbesondere können die bestimmten Fluoreszenzlebensdauern 33 (oder allgemeiner mindestens ein Lichtsignalparameter 30) aus den vorab gespeicherten Daten 31 interpoliert werden.
Mit anderen Worten können die Daten 31 als Referenzwerte 32 des integrierten Signals ∑_P , des Zählerwertes ∑_E und der Fluoreszenzlebensdauer 33 verstanden werden, die einander bevorzugt zugeordnet sind. Insbesondere können die Daten 31 als mindestens zweidimensionaler Datensatz 31a vorliegen.
Außer den Messwerten „integriertes Signal“ und „gezähltes Signal“ (Zählerwert) könnten auch noch weitere Signale generiert werden, die eine weitere Verbesserung des Ergebnissignals erlauben. So könnte beispielsweise die (mittlere) gemessene Impulsdauer, also die zeitliche Differenz zwischen steigender und fallender Flanke am Komparator verwendet werden. Bei einzelnen Pulsen entspräche dies der Pulsbreite bzw. Impulsdauer 19, bei überlagerten Pulsen wie z.B. in 1b wäre die gemessene Impulsdauer entsprechend größer. In diesem Fall wäre der Kalibrationsdatensatz dreidimensional, d.h. einer Kombination aus den 3 Eingangsgrößen („integriertes Signal“/„gezähltes Signal“/ „mittlere Impulsdauer“) würde ein Ergebnissignal (z.B. Fluoreszenzlebensdauer) zugeordnet.
Ferner zeigen die 2a bis 2c, dass das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Vorrichtung 43 insbesondere bei höheren mittleren Photonenraten 41 eine erhöhte Unterscheidbarkeit der simulierten Kurven 35 gewährleistet und somit bevorzugt in diesem Bereich verwendet werden kann.
In 3a ist eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung 43 zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer 33 gezeigt.
Eine Lichtquelle 45, insbesondere eine gepulste Laserlichtquelle 45a, emittiert Anregungslicht 47 in Form der Abfolge 26 von Lichtimpulsen 27, welches auf eine Probe 49 trifft. In dieser werden Fluoreszenzphotonen 13 (lediglich eines ist eingezeichnet) generiert, die auf den Detektor 1 fallen. Weitere optische Elemente, die zum Aufsammeln der Fluoreszenzphotonen 13 geeignet sind, sind nicht gezeigt, können allerdings im Allgemeinen in anderen Ausgestaltungen der Vorrichtung 43 verwendet werden.
An einem Detektorausgang 51 wird das elektrische Signal 3 ausgegeben und in einen Vorverstärker 53 eingespeist und verstärkt.
An einem Verstärkerausgang 55 liegt das verstärkte elektrische Signal 3a an, welches aufgeteilt wird und in Form zweier Signalreplika 3b in einen zählenden Pfad 57 und in einen integrierenden Pfad 59 eingespeist wird. In anderen Ausgestaltungen, die insbesondere einen SiPM 1b umfassen, kann die Aufteilung bereits auf dem Detektorchip erfolgen.
Der zählende Pfad 57 umfasst ein Zählmodul 61, welche an einem Zählausgang 63 den Zählerwert ∑_E ausgibt. Der Zählerwert ∑_E repräsentiert eine Anzahl von Fluoreszenzphotonen-Ereignissen 15.
Der integrierende Pfad 59 umfasst ein Integrationsmodul 71, welches die Anzahl 13a aller im Messzeitraum 23 auf den Detektor 1 auftreffender Fluoreszenzphotonen 13 ermittelt.
An einem Integratorausgang 75 wird das integrierte Signal ∑_P ausgegeben und in eine Logikeinheit 77 eingespeist. Das integrierte Signal ∑_P stellt aufgrund der Integration im Integrationsmodul 71 einen Integrationswert 79 dar, wobei dieser eine akkumulierte Photonenzahl ∑N repräsentiert. Ferner beschreibt der Zählerwert ∑_E eine Anzahl 15a aller im elektrischen Signal 3 im Messzeitraum 23 detektierter Fluoreszenzphotonen-Ereignisse 15, d.h. alle zeitlich isolierten Ereignisse 15e und alle sich zeitlich überlappenenden Ereignisse 15b.
In der in 3a gezeigten Ausgestaltung der Vorrichtung 43 werden das integrierte Signal ∑_P und der Zählerwert ∑_E an die Logikeinheit 77 übergeben. Die 3a stellt die bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar.
Die Logikeinheit 77 der in 3a gezeigten Ausgestaltung umfasst drei schematisch gezeigte miteinander verbundene Speichermodule 85, die ein Look-up-Tabellen-Modul 87 ausbilden. In diesen Speichermodulen 85 sind die Referenzwerte 32 des integrierten Signals ∑_P , des Zählerwertes ∑_E als auch der Fluoreszenzlebensdauer 33 gespeichert, die zur Unterscheidung der gemessenen Werte von diesen simulierten Werten durch die tiefgestellte Bezeichnung „sim“ gekennzeichnet sind.
Die Logikeinheit 77 vergleicht im erfindungsgemäßen Verfahren der in 3a gezeigten Ausgestaltung nunmehr das gemessene integrierte Signal ∑_P und den gemessenen Zählerwert ∑_E mit den im Look-up-Tabellen-Modul 87 gespeicherten Referenzwerten 32 des simulierten integrierten Signals ∑_P,sim und des simulierten Zählerwertes ∑_E,sim und stellt die simulierte Fluoreszenzlebensdauer 33_sim als Ergebnis zur Verfügung.
Die Logikeinheit 77 umfasst ferner ein Interpolationsmodul 89, welches es ermöglicht, eine begrenzte Anzahl gespeicherter Referenzwerte 32 zu interpolieren.
Die Logikeinheit 77 gibt an einem Intensitätsausgang 91 ein von einem Intensitätsmodul 93 zur Verfügung gestelltes Intensitätsergebnis 95 aus. Über einen Lebensdauerausgang 97 wird eine im Verfahren ermittelte Fluoreszenzlebensdauer 33det ausgegeben.
Die 3a zeigt ferner eine zweite Ausgestaltung der Logikeinheit 77a, welche eine Recheneinheit 107 umfasst, welche beispielsweise aus dem integrierten Signal ∑_P und dem Zählerwert ∑_E die Fluoreszenzlebensdauer 33det ermitteln und zusätzlich das Intensitätsergebnis 95 ausgeben kann.
Die in der 3b gezeigte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung unterscheidet sich von der Vorrichtung der 3a dadurch, dass der am Zählerausgang 63 ausgegebene Zählerwert ∑_E in einen Divisoreingang 67 eines Divisionsmoduls 69 eingespeist wird.
Das im Integratorausgang 75 ausgegebene integrierte Signal wird sowohl über einen Dividendeingang 65 in das Divisionsmodul 69, als auch, wie in der Ausgestaltung der 3a, in die Logikeinheit 77, eingespeist.
In der in 3b gezeigten Ausgestaltung der Vorrichtung 43 wird vom Divisionsmodul 69 ein Verhältniswert 39 berechnet, der über einen Verhältniswertausgang 83 vom Divisionsmodul 69 an die Logikeinheit 77 übergeben wird.
Die Logikeinheit 77 der Vorrichtung der 3b umfasst drei schematisch gezeigte miteinander verbundene Speichermodule 85, die ein Look-up-Tabellen-Modul 87 ausbilden. In diesen Speichermodulen 85 sind die Referenzwerte 32 des integrierten Signals ∑_P , des Verhältniswertes 39 als auch der Fluoreszenzlebensdauer 33 gespeichert, die zur Unterscheidung der gemessenen Werte von diesen simulierten Werten durch die tiefgestellte Bezeichnung „sim“ gekennzeichnet sind.
Die Logikeinheit 77 im erfindungsgemäßen Vorrichtung der 3b vergleicht im erfindungsgemäßen Verfahren nunmehr das gemessene integrierte Signal ∑_P und den aus dem integrierten Signal ∑_P und Zählerwert ∑_E berechneten Verhältniswert 39 mit den im Look-up-Tabellen-Modul 87 gespeicherten Referenzwerten 32 des simulierten integrierten Signals ∑_P,sim und des simulierten Verhältniswertes 39_sim , und stellt die simulierte Fluoreszenzlebensdauer 33_sim als Ergebnis zur Verfügung.
Auch die in 3b gezeigte Ausgestaltung kann ein Interpolationsmodul 89, ein Intensitätsmodul 93 und eine Recheneinheit 107 umfassen. Anstatt des Zählerwertes ∑_E wie in 3a wird in 3b der Verhältniswert 39 in die Recheneinheit 107 eingegeben.
Die Vorrichtungen 43 der 3a und 3b können, wie dies schematisch dargestellt ist, in einem Mikroskop 99, insbesondere einem (konfokalen) Rastermikroskop 99a, und besonders bevorzugt in einem Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskop 99b (FLIM) angeordnet sein. Im FLIM 99b wird die Probe 49 gescannt bzw. gerastert und ein Abbild 101 der Probe 49 generiert, in welchem die ermittelten Fluoreszenzlebensdauern 33det räumlich voneinander beabstandeter Bereiche 103a, 103b mit einer geeigneten Farb- oder Helligkeitsverteilung dargestellt sind.
Das Mikroskop 99 kann ferner mit einem Computer 109 verbunden sein, der ein nichtflüchtiges computerlesbares Speichermedium 111 einlesen kann, wobei auf dem Speichermedium 111 ein Programm zum Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens gespeichert sein kann. Das Speichermedium 111 kann ein optisches, magnetisches oder auf Flash-Speicher basierendes Speichermedium 111 sein.
Die 4 zeigt eine Schemazeichnung eines Anwendungsbereichs 105 des vorliegenden Verfahrens bzw. der vorliegenden Vorrichtung 43 und des Anwendungsbereichs 105 eines Vertreters der Verfahren aus dem Stand der Technik, des sogenannten time-correlated single photon counting (TCSPC).
Das TCSPC ist bis zu mittleren Photonenraten 41 von ca. 40 Mcts/s verwendbar, liefert für größere Photonenraten 41 allerdings keine verlässlichen Ergebnisse der Fluoreszenzlebensdauer 33 mehr.
Der Anwendungsbereich 105 des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung 43 liegt dagegen bei deutlich höheren mittleren Photonenraten 41 und erstreckt sich bevorzugt über mehr als eine Größenordnung von einhundert bis über eintausend Mcts/s.
In der 5 ist ein Ablaufdiagramm 123 einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung 43 gezeigt. Dieses kann anstelle der in 3a und 3b gezeigten schematischen Aufbauten zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer 33 verwendet werden.
Auch der schematische Aufbau der 5 umfasst einen Detektor 1, einen Vorverstärker 53, in welchen das elektrische Signal 3 eingespeist wird. Zwei Signalreplika 3b werden in das Integrationsmodul 71 bzw. in das Zählmodul 61 eingespeist. Jedoch werden in der in 5 gezeigten Ausgestaltung der Zählerwert ∑_E als auch das integrierte Signal ∑_P in zwei unterschiedliche Look-up-Tabellenmodule 87 eingespeist. Ein Lebensdauermodul 125 umfasst eine schematisch dargestellte Lebensdauer-LUT 127, deren Daten rein beispielhaft in 2a gezeigt sind. Ferner ist ein Intensitäts-Modul 129 vorgesehen, in welchem sich die Intensitäts-LUT 119 befindet. Das Lebensdauer-Modul 125 ermittelt mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Fluoreszenzlebensdauer 33, wohingegen das Intensitäts-Modul 129 das Intensitätsergebnis 95 ausgibt. In nicht gezeigten weiteren Ausgestaltungen kann mindestens ein anderer Lichtsignalparameter ermittelt werden.
Optional kann im Aufbau gemäß 3a oder gemäß 3b ferner ein Gating-Modul 131 vorgesehen sein, welches sowohl das elektrische Signal 3, die Signalreplika 3b als auch den Zählerwert ∑_E und das integrierte Signal ∑_P nur in einem bestimmten Zeitintervall berücksichtigt.
Die Funktionsweise des Gating-Moduls 131 ist schematisch in 6 dargestellt. Hier ist der Zählerwert ∑_E über der Zeit 9 dargestellt. Im erfindungsgemäßen Verfahren gemäß der Ausgestaltung, welche ein Gating-Modul 131 aufweist, werden lediglich Ereignisse betrachtet und berücksichtigt, welche in einem Gating-Zeitabschnitt 134 zwischen einem Gating-Start 133 und einem Gating-Ende 135 auftreten. Somit können beispielsweise ungewollte Reflexionen, die vor dem Gating-Start 133 auftreten können, unberücksichtigt bleiben und verfälschen nicht das Messergebnis.
Bezugszeichenliste

1: Detektor
1a: PMT-hybrid-Detektor
1b: Silizium-Photomultiplizierer (SiPM)
3: elektrisches Signal
3b: Signalreplik
5: Spannung
7: elektrischer Strom
9: Zeit
11: Dunkelstrom
13: Fluoreszenzphoton
13a: Anzahl auf den Detektor auftreffender Fluoreszenzphotonen
15: Fluoreszenzphotonen-Ereignis
15a: Anzahl im elektrischen Signal auftretender Fluoreszenzphotonen-Ereignisse
15b: zeitlich überlappendes Ereignis
15c: zeitlich isoliertes Ereignis
17: Impulsform
17a: ansteigende Flanke
17b: abfallende Flanke
19: Impulsdauer
21: Impulsantwortfunktion
23: Messzeitraum
25: Speichereinheit
26: Abfolge
27: Lichtimpuls
29: Schwellenwert
30: Lichtsignalparameter
30a: Fluoreszenzparameter
31: Daten
31a: Datensatz
32: Referenzwert
33: Fluoreszenzlebensdauer
33det: ermittelte Fluoreszenzlebensdauer
33_sim: simulierte Fluoreszenzlebensdauer
35: Kurve
35a-35e: erste bis fünfte Kurve
39: Verhältniswert
39a: gemessener Verhältniswert
39_sim: simulierter Verhältniswert
41: mittlere Photonenrate
41a: gemessene mittlere Photonenrate
43: Vorrichtung
45: Lichtquelle
45a: gepulste Laserlichtquelle
47: Anregungslicht
49: Probe
51: Detektorausgang
53: Vorverstärker
55: Verstärkerausgang
57: zählender Pfad
59: integrierender Pfad
61: Zählmodul
63: Zählerausgang
65: Dividendeingang
67: Divisoreingang
69: Divisionsmodul
71: Integrationsmodul
75: Intergratorausgang
77: Logikeinheit
77a: zweite Ausgestaltung der Logikeinheit
79: Integrationswert
83: Verhältniswertausgang
85: Speichermodul
87: Look-up-Tabellen-Modul
89: Interpolationsmodul
91: Intensitätsausgang
93: Intensitätsmodul
95: Intensitätsergebnis
97: Lebensdauerausgang
99: Mikroskop
99a: Rastermikroskop
99b: Fluoreszenzlebensdauermikroskop (FLIM)
101: Abbild
103a, 103b: räumlich voneinander beabstandete Bereiche
105: Anwendungsbereich
107: Recheneinheit
109: Computer
111: Speichermedium
113: Pulsfolgefrequenz
115: Periodendauer
117: Look-up-table / LUT
119: Intensitäts-LUT
121: korrigierte Intensität
123: Ablaufdiagramm
125: Labensdauer-Modul
127: Lebensdauer-LUT
129: Intensitäts-Modul
131: Gating-Modul
133: Gating-Start
134: Gating-Zeitabschnitt
135: Gating-Ende
E: Photonenenergie
∑N: akkumulierte Photonenzahl
∑_E: Zählerwert
∑_P: integriertes Signal
∑_E,sim: simulierter Zählerwert
∑_P,sim: simuliertes integriertes Signal

Claims

Verfahren zur Messung wenigstens eines Lichtsignalparameters (30), umfassend die folgenden Verfahrensschritte: - Beleuchten einer Probe (49) über einen vorbestimmten Messzeitraum (23) zur Anregung eines Lichtsignals, insbesondere von Fluoreszenz, in der Probe (49); - Detektieren des von der Probe (49) ausgesandten Lichtsignals und Bereitstellen eines die zeitliche Variation des Lichtsignals repräsentierenden elektrischen Signals (3); - Zählen einzelner Photonen-Ereignisse (15) auf Basis des elektrischen Signals (3), über den Messzeitraum (23) und Bereitstellen eines die Anzahl (15a) von Photonen-Ereignissen (15) repräsentierenden Zählerwertes (∑_E); - Integrieren des elektrischen Signals (3) über den Messzeitraum (23) und Bereitstellen eines integrierten Signals (∑_P) und - Bestimmen mindestens eines Lichtsignalparameters (30) mindestens anhand des Zählerwertes (∑_E) und des integrierten Signals (∑_P).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Beleuchten der Probe (49) über den Messzeitraum (23) zeitlich moduliert erfolgt, insbesondere mittels einer Abfolge von Lichtimpulsen (27).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Lichtsignalparameter (30) eine Fluoreszenzlebensdauer (33) oder Intensität (34) des Lichtsignales ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Integrieren und das Zählen parallel stattfinden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend das Berechnen des Lichtsignalparameters (30) mit Hilfe des Zählerwertes (∑_E) und des integrierten Signals (∑_P).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ferner umfassend das Bestimmen des Lichtsignalparameters (30) mit Hilfe zuvor gespeicherter Daten (31) in Abhängigkeit von dem Zählerwert (∑_E) und dem integrierten Signal (∑_P).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend das Ermitteln und/ oder Kalibrieren einer Impulsform (17) und/oder Impulsdauer (19) eines einzelnen Photonen-Ereignisses (15).
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Bestimmen des Lichtsignalparameters (30) unter Berücksichtigung der Impulsform (17) und/oder der Impulsdauer (19) der einzelnen Photonen-Ereignisse (15) erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ferner umfassend das sequenzielle Rastern oder Scannen der Probe (49) und Erzeugen eines Abbildes (101) von Lichtsignalparametern (30) räumlich voneinander beabstandeter Bereiche (103a, 103b) der Probe (49).
Vorrichtung zur Messung eines Lichtsignalparameters (30) umfassend einen Detektor (1) zur Erzeugung und Ausgabe eines, eine Abfolge (26) eintreffender Photonen (13) repräsentierenden elektrischen Signals (3) an einem Detektorausgang (51), ein Integrationsmodul (71) zum Integrieren des elektrischen Signals (3) über einen Messzeitraum (23), wobei das Integrationsmodul (71) zur Ausgabe eines daraus resultierenden integrierten Signals (∑_P) ausgestaltet ist, ein Zählmodul (61) zum Zählen einer Anzahl (15a) im Messzeitraum (23) detektierter Photonen-Ereignisse (15) auf Basis des elektrischen Signals (3) über den Messzeitraum (23) und zum Ausgeben eines diese Anzahl (15a) repräsentierenden Zählerwertes (∑_E), sowie eine Logikeinheit (77) zur Bestimmung wenigstens eines Lichtsignalparameters (30) in Abhängigkeit vom integrierten Signal (∑_P) und vom Zählerwert (∑_E).
Vorrichtung (43) nach Anspruch 10, ferner umfassend eine Recheneinheit (107) zur Berechnung des Lichtsignalparameters (30) mit Hilfe des integrierten Signals (∑_P) und des Zählerwertes (∑_E).
Vorrichtung (43) nach einem der Ansprüche 10 oder 11, ferner umfassend mindestens ein Speichermodul (85) zur Speicherung eines Datensatzes (31a) einander zugeordneter Referenzwerte (32) des integrierten Signals (∑_P), des Zählerwertes (∑_E) und des Lichtsignalparameters (30).
Nichtflüchtiges computerlesbares Speichermedium (111), umfassend ein Programm mit Befehlen, die bei Ausführung durch einen Computer diesen veranlassen, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 auszuführen.