CN110036328B - 用于控制或调节显微镜照明的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于调节显微镜(10)的用于将物体(12)照明的光源(16)的方法，包括以下步骤：确定物体(12)上的照明辐射的能量参数的额定值；借助光源(16)产生照明辐射；提供用于将照明辐射聚焦到物体(12)上的物镜(14)；确定物镜(14)对于照明辐射的透射特性；将物镜(14)前面的一定比例的照明辐射作为测量辐射耦合输出并测量测量辐射的能量参数的实际值；提供测量辐射的能量参数与物体(12)上的照明辐射的能量参数之间的关系，其中该关系依赖于物镜(14)透射特性和所述比例的大小；并设定光源(16)，使得对于测量辐射测量的能量参数的实际值按照该关系在公差范围内对应于能量参数的额定值。

Description

用于控制或调节显微镜照明的方法

技术领域

本发明涉及一种用于控制或调节显微镜的用于将物体照明的光源的方法。

背景技术

在显微镜、基于激光的方法例如激光扫描显微镜以及光学操纵技术例如光学镊子中，通常希望能够精确地设定照明辐射的强度。这支持测量的可重复性。已知通过布置辐射检测器而不是样品来确定光源的强度，并且以这种方式确定在物体处预期的照明辐射的强度。这样的方法公开于例如EP 2458420 B1或US 8619252 B2中。由于强度的这种测量只能在样品中的测量之后或之前进行，因此EP 1260848 B1或EP 1353210 B1提出在光源附近在照明光路中提供强度检测器。以这种方式，还可以在物体的测量期间确定由光源发出的照明辐射的强度。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于控制将物体照明的显微镜照明机制的方法，通过该方法可以特别精确地设定物体上的照明辐射的能量参数。

本发明在权利要求1中定义。优选实施方案是从属权利要求的主题。

本发明提供了一种控制或调节显微镜光源的方法，所述光源用于以照明辐射将物体照明，该方法包括以下步骤：确定物体上的照明辐射的能量参数的额定值，借助光源产生照明辐射，提供用于将照明辐射聚焦到物体上的物镜，耦合输出一定份额的照明辐射作为测量辐射，特别是在物镜前方，并测量测量辐射的能量参数的实际值，确定物镜对于照明辐射的透射特性，提供测量辐射的能量参数与物体上的照明辐射的能量参数之间的关系，其中，该关系依赖于所述份额的大小和透射特性，以及光源的设定，使得针对测量辐射测量的能量参数的实际值在公差范围内根据该关系对应于在物体上的照明辐射的能量参数的额定值。

该关系用于由测量辐射的能量参数的测得的实际值确定物体上的能量参数的相关当前值。因此，该关系的使用是将测量辐射转换为物体照明的步骤。任选地可以进行逆转换，因为该关系通常在数学上是可逆的(使用等式)或者可以容易地创建相应的逆表。

能量参数可以是强度或功率或能量密度。

由于通过确定物镜的透射特性而已知物镜实际透射的照明辐射的份额，因此可以由测量辐射的能量参数的实际值更精确地确定物体上的照明辐射的能量参数的值。由此也可以对于能量参数精确地设定物体上的照明辐射。

该方法可以对于荧光显微术和基于激光的技术实施，特别是在宽视场中。此外可以在实现光学操纵技术如FRAP(光漂白后的荧光恢复)或FLIP(光漂白中的荧光损失)或激光烧蚀中采用该方法。此外，该方法可以在不同波长下进行并同时用于实验。这减少了用户交互，由此简化了实验并且变得更加可重复。获得的测量数据可以与记录的图像关联。

该方法可以例如借助于分配给显微镜的控制装置来实施。例如，控制装置可以设计为微处理器、电路、计算机或任何其他可编程设备。物体可以是任何旨在通过显微镜成像或操纵的样品或实体。特别地，显微镜还可以用作旨在用于固定物体的光学镊子。

在显微镜是反射光显微镜的情况下，将照明辐射与成像辐射反向地耦合输入到成像光路中，然后通过物镜引导到物体(通常是样品)中。在该耦合输入位置和物体之间，成像光路因此包含照明光路。在此，照明辐射朝向物体行进，并且成像辐射远离物体。该部分通常也称为公共光路。该术语也用于以下描述中。

光源可包括激光器、白光源例如卤素灯或汞灯，或发光二极管(LED)，或其组合。特别地，光源可以产生一个波长范围内的照明辐射或具有各个离散波长或波长范围的照明辐射；优选地，光源包括多个单独光源，这些光源分别产生不同的例如离散的波长范围内的辐射。优选地，光源与控制装置连接，所述控制装置控制照明辐射的强度或功率。光源可以提供平行化的照明辐射，或者在光源前面布置透镜或透镜系统，例如微透镜阵列，通过其可以将由光源提供的辐射平行化。或者，可以在照明光路中以非平行化的方式引导照明辐射。照明辐射是否以平行化方式行进至少依赖于用显微镜执行的成像方法。在激光扫描显微镜的情况下和在光学操纵技术的情况下，通常照明辐射将以平行化方式行进；与此相对，在宽视场成像或TIRF实验(全内反射荧光)的情况下，照明辐射通常通过照明光路以会聚方式行进。

监测装置确定入射在其上的辐射的能量参数，例如测量辐射的强度或功率。监测装置可以配置为光电检测器、CCD传感器等，并且尤其设计用于检测355nm至700nm波长范围内的辐射；它还具有例如10⁵的动态范围。优选地，监测装置与控制装置连接，使得监测装置向控制装置提供与入射在监测装置上的测量辐射的能量参数相对应的信号。由监测装置确定的测量辐射的能量参数的值在此称为实际值。

分束器装置可以设计为具有预定的透射和反射特性的分束器。此外可行的是，分束器装置是布置在成像光路中的玻璃板。特别地，将分束器装置配置成使得耦合输出到监测装置上的照明辐射的份额与进一步行进至物镜/物体的照明辐射的份额相比较小。例如，仅有15％、10％、5％或1％的照明辐射作为测量辐射耦合输出到监测装置上。分束器装置优选地设置在照明光路的一部分中，该部分将照明辐射从光源引导到物体中，在该部分中照明辐射以平行化的方式行进。因此，分束器装置布置在位于物镜和管状透镜之间的成像光路中的无限空间中。无限空间是物镜和管状透镜之间的空间。

在该方法的一个步骤中，优选在第一步骤中，确定物体上的照明辐射的能量参数的额定值。这可以例如在物体成像开始之前进行。额定值尤其表示用以照明物体的强度或功率。在这种情况下，优选地将额定值选择为使得在物体中不发生辐射损害和/或额定值高于某一极限值，需要超过该极限值以便对物体成像，例如利用预定的信噪比。然而，也可以将额定值选择为使得它与已经执行的对象的成像一致，从而再现先前实验的条件。可以为用照明辐射照明的物体的整个区域设置额定值，或者为来自物体上的照明区域的某一部分设置额定值。对此的一个例子是将额定值确定在具有最大照明强度的区域中，例如在照明辐射具有依赖于位置的强度分布的情况下。

借助光源产生的照明辐射通过物镜聚焦到物体上。聚焦可以使得照明辐射以衍射受限的方式聚焦到物体中，例如以点状方式，这在例如在共焦成像的情况下是常见的。然而也可以以面状方式照明物体，尤其是在宽视场成像的情况下。

此外，确定物镜的透射特性，例如入射在物镜上的辐射的透射强度比例(透射率)，以及反射和/或吸收的比例。对于所使用的每种类型的物镜，可以单独进行透射特性的确定。此外，可以针对每个单独使用的物镜确定透射特性。所述确定可以例如通过识别当前使用的物镜并从例如存储在控制装置的存储器中存储的数据库中读出透射特性来进行。识别当前使用的物镜也可以通过手动输入来进行，其中，透射特性的读出也可以通过在线数据库、外部存储器等来进行。例如，如果在显微镜中在转台上布置多个物镜，则例如可以读出转台的当前位置。此外，可以例如利用读取的RFID(射频识别)芯片来标记物镜。物镜的透射特性的确定可以进行一次，或者从物镜的制造商获得数据。此外可以在对物体进行测量或成像之前，在单独的步骤中确定物镜的透射特性，例如通过校准，其中，借助附加的检测器和精确设定的光源以已知的方式确定透射特性。

基于关于物镜和分束器装置的信息，可以优选地由测量辐射的能量参数的检测值来计算物体中存在的照明辐射的能量参数的值。例如，物体中存在的功率LO、测量的功率L、测量辐射占耦合输出之前的照明辐射的比例A以及物镜的透射率T通过以下等式相关联：

如果要使用强度而不是功率作为能量参数，则功率还除以监测装置上的辐射面积。该面积可以是已知的，或者监测装置是空间分辨的，因此允许同时测量辐射的横截面的面积测量。

该关系特别存储在控制装置的存储器中。优选地，如果将表用于该关系，则对表的值进行插值以便提供连续的关系。该关系给出对于测量辐射的能量参数的给定值，物体上的能量参数的值是多少。

在照明光路中，优选地，在分束器装置和物镜之间的区域中不布置可以改变诸如入射在物体中的照明辐射的能量参数的光学成像元件。举例来说，在分束器装置和物镜之间的成像光路中不提供滤光器、透镜、光阑、针孔或光学单元。这是因为光学成像元件将具有这样的效果：物体中的照明辐射的能量参数将被改变，并且监测装置将不会检测到这种改变。因此，监测装置将不能直接检测物体中存在的照明辐射的能量参数。优选地，分束器装置在公共光路中与物镜直接相邻地布置。例外的是快门，其在关闭状态下阻挡照明辐射并在用显微镜检查期间打开。当然，它在显微镜检查期间无效。

关于照明辐射的能量参数设定光源，使得通过所述关系转换的测量辐射的能量参数的实际值在公差范围内对应于能量参数的预先确定的额定值。这可以例如通过由与光源连接的控制装置改变由光源产生的照明辐射的强度或功率来进行。优选地，还可以设定公差范围，并且该公差范围例如依赖于期望的额定值的精度。公差范围例如是10％、5％或1％。

设定照明辐射的能量参数的步骤可以在实验开始时进行一次，或者连续地进行，在一个变型中在光源的调节中进行。

照明辐射的能量参数的设定可以例如以这样的方式进行：通过所述关系由照明辐射的能量参数的额定值确定测量辐射的能量参数的目标值，并将实际值调节到目标值。或者，可以通过该关系由测量辐射的能量参数的实际值确定物体上的照明辐射的能量参数的当前值，并且可以将当前值设定为使得它在公差范围内对应于额定值。该关系允许选择调节变量或参考变量和/或操纵变量。

优选地，显微镜还具有用于自动聚焦装置的接口，所述自动聚焦装置用于确定物镜在物体中的焦点，其中，接口具有用于将自动聚焦辐射引导到物体的自动聚焦光路。于是分束器装置具有双重功能，这在于它一方面在物镜侧将自动聚焦辐射耦合输入和/或输出于公共光路，另一方面在光源侧将测量辐射耦合输出到监测装置。在一种配置中，反射光显微镜因此具有用于确定物镜对于物体的焦点的自动聚焦装置。自动聚焦装置具有自动聚焦光路，其用于将自动聚焦辐射引导到物镜。分束器装置具有双重功能，这在于它一方面在物镜侧将自动聚焦辐射耦合输入和/或输出于公共光路，另一方面在光源侧将测量辐射耦合输出到监测装置。在已知的反射光显微镜的情况下，在公共光路中缺少用于在其中适当地布置所有光学元件的空间。特别是在物镜和管状透镜之间的光路部分中，也就是说在无限空间中，在传统显微镜的情况下几乎没有空间。然而，由于分束器装置的双重功能，自动聚焦装置和监测装置都可以在空间受限的区域中移位，并且尽管结构空间不足，也可以提供监测装置和自动聚焦装置。关于物镜、光源、光学元件和/或监测装置，上述顾及到因素类似地适用于该改进方案。此外优选的是，耦合输出测量辐射的分束器装置和物镜之间的公共光路没有光学成像元件。该接口设计成使得自动聚焦装置可以连接于其上，同时可以引导与自动聚焦装置相关的辐射通过该接口。当然，自动聚焦设备可以具有用于监测装置的可选接口。此外还可行的是自动聚焦装置是由自动聚焦装置和监测装置组成的模块。接口例如是螺纹，并且自动聚焦光路可以包括通过引导自动聚焦辐射通过的横截面。自动聚焦装置可以是与显微镜分离的元件，并且可以如WO 2007/144197 A1、DE 102008018952 A1或DE102008018864 A1中所述设计。自动聚焦装置具有自动聚焦光源，其用于产生自动聚焦辐射。自动聚焦辐射通过自动聚焦光路经由分束器装置引导到物镜并因此引导到物体上。自动聚焦辐射被物体反射或散射，由物镜收集并经由分束器装置通过自动聚焦光路供给到自动聚焦检测器。为此，可以在自动聚焦装置中提供分束器，通过该分束器进行由自动聚焦光源产生的自动聚焦辐射的耦合输入和/或源自物体的自动聚焦辐射向自动聚焦检测器的耦合输出。由自动聚焦光源产生的自动聚焦照明辐射和引导到自动聚焦检测器的自动聚焦测量辐射在此处合并为术语“自动聚焦辐射”。它们通过分束器装置共同耦合输入或输出。然而还可行的是在成像光路中提供另外的分束器，通过该分束器将自动聚焦辐射耦合输入或输出于公共光路中。因此在该实施方案中可行的是将自动聚焦光源和自动聚焦检测器布置在显微镜中远离的不同位置。

在自动聚焦光路中可以例如安置倾斜放置的光栅，该光栅被成像到物体中，使得借助于自动聚焦检测器监测物体处的后向散射，并因此确定焦点的位置。在另一个实施方案中，自动聚焦光源可以在物体中产生点状光点，其锐度或范围借助于自动聚焦检测器测量，因此推断出关于焦点位置。特别地，自动聚焦装置与控制装置连接，其中，控制装置可以基于由自动聚焦装置确定的焦点位置的值来设置或修正。因此，可以借助于自动聚焦装置补偿焦点位置的漂移。自动聚焦辐射优选地在不用于物体成像的波长范围内。例如，自动聚焦辐射处于红外波长范围内，并且照明辐射处于可见波长范围内。

为了提高物体上的照明辐射的能量参数的设定精度，优选的是以依赖于波长的方式给出透射特性和/或以波长分辨的方式测量测量辐射的能量参数的实际值和/或以依赖于波长的方式给出所述关系。例如，所述参数是针对多个波长或者在一个或多个波长范围内确定的。物镜的透射特性和/或能量参数的实际值可以根据波长而不同。例如，物镜的透射特性在可见波长范围内是不同于红外波长范围内的。

监测装置可以具有一个或多个检测器，其检测特定波长范围的辐射。然而，为了检测多个波长范围，可以提供用于根据波长范围分割照明光束的装置，例如棱镜和/或光栅。于是将它们沿照明方向布置在监测装置的检测器的前面。此外可行的是监测装置包括光谱仪。检测多个波长范围和/或多个波长的可能性使得能够更精确地确定测量辐射的能量参数的实际值。例如，如果使用具有不同波长范围的多个光源，则可以单独监测并单独调节各个光源。由于优选地物镜的透射特性和所述关系都是依赖于波长的，因此可以更精确地确定物体上的能量参数。此外，用于特定波长范围或波长的多个检测器使得监测装置的结构更简单，因为低成本的元件例如光电二极管可用于各个检测器。

为了进一步提高所述关系的精确性并因此进一步提高转换的精确性，从而改善物体中能量参数的设置，在一个改进方案中优选的是为了顾及到物镜的透射特性，对于所述关系，确定位于照明辐射路径中的光源的类型和/或激发滤光器。照明辐射的波长范围可以通过激发滤光器来修改，其作为具有510nm至550nm的透射范围的带通滤光器。例如，为了确定激发滤光器，可以手动输入透射光谱。此外可行的是，控制装置检测其上布置有多个激发滤光器的转台的位置。为了确定激发滤波器的特性，可以提出控制装置使用数据库，所述数据库中存储所使用的透射滤光器的透射光谱。

光源的类型、特别是其发射光谱优选地由控制装置确定，例如由于通过控制装置控制多个光源中的哪一个。此外可行的是还手动输入光源的类型，特别是其发射光谱。如果光源以宽带方式配置，则仅监测一个波长范围或一个特定波长就足以推断出关于光源可用的整个波长范围内的能量参数。这种关系可以例如通过校准或由数据库来确定。

因此，通过知晓所使用的激发滤光器和/或照明辐射的一个或多个波长，得知照明辐射覆盖的波长范围。如果该关系同时以依赖于波长的方式存在，则用以照明物体的能量参数可以相对于照明辐射的波长范围进行适配。

为了进一步更简单地配置监测装置，优选的是，在照明辐射的预定波长范围内测量测量辐射的能量参数，并且确定光源和/或激发滤光器的类型，其中，从这些信息得出整个波长范围内物体上的能量参数。为此，还可以以依赖于波长的方式检测物镜的透射特性。光源和/或激发滤光器的类型的确定可以如上所述进行。如果光源具有多个宽带光产生单元，则可以选择预定波长范围，使得其位于所有可用的宽带波长范围内。以这种方式，相对窄的波长范围足以监测所有光产生装置，其中，从各个光产生装置提供的能量参数的分布确定物体上的能量参数的值。为了避免测量误差，可以在分束器装置和监测装置之间提供带通滤光器，所述带通滤光器传输由监测装置检测的波长范围或波长。以这种方式可以避免来自其他波长范围的辐射的串扰。

如果显微镜的组件的设定(例如激光源、激发滤光器、物镜、照明场光阑等)是手动输入并因此被检测到的，则控制装置足以实现对测量辐射的能量参数的实际值的调节。由此可以简化显微镜的结构，因为控制装置与各个组件(光源除外)的连接不是必需的。在该实施方案中，不需要用于确定各个组件的设定的传感器。

为了更精确地确定物体上的照明辐射的能量参数，优选的是所述关系还顾及到布置在物镜和分束器装置之间的光学元件和/或存在于物体和物镜之间的浸没介质，在所述分束器装置上将测量辐射从照明辐射分离。

可以类似于物镜的透射特性来检测透射特性。于是，光学元件的透射特性给出了另一个因子，物体上的照明辐射的能量参数以该因子减小。对物体和物镜之间的浸没介质的顾及到可以用于更精确地确定物体上的由显微镜照明的面积，因为浸没介质对物镜的焦距具有影响。为此目的所需的关系在现有技术中是已知的。浸没介质例如是油或水。

为了能够更精确地设定存在于物体上的照明辐射的能量参数，优选的是在测量辐射的光路中设置监测光阑。监测光阑的开口横截面设定成使得该开口与物镜的有效孔径一致。如果照明辐射在分束器装置之前和/或之后平行行进，则可以通过调节监测光阑的孔径使测量辐射的范围适应于穿过物镜的照明辐射的范围。以这种方式，在不同物镜情况下的实际值可以更精确地调整到物体上的额定值。可以借助控制装置来进行监测光阑的开度的改变，该控制装置例如控制驱动器。物镜的孔径可以类似于所用物镜的透射特性来确定。

此外，可以提供具有开口的照明场光阑，通过该开口可以限定物平面中的照明辐射的范围，该物平面是由显微镜成像的物体中的平面。照明场光阑可选地布置在照明光路中的与物平面共轭的平面中，使得通过照明场光阑也可以改变物体中的照明辐射的范围。例如，照明场光阑布置在光源的后面。

为了提高借助于显微镜的测量的可再现性，优选的是连续监测实际值，其中，通过所述关系转换实际值并存储与额定能量参数的偏差。以这种方式可行的是，在物体的图像记录持续时间内记录实际存在于物体上的能量参数的值。所述存储尤其在控制装置的存储器中进行。实际存在于物体上的能量参数的值的记录使得可以识别与额定值的偏差，以便例如在偏差过大的情况下不采纳记录或测量结果。特别是当照明辐射的能量参数的波动如此快速或强烈地发生以致于通过控制回路的再调节不充分可能时，使用这一点。

由于优选地在分束器装置和物镜之间不提供另外的光学成像元件，因此不必顾及到诸如滤光器、针孔或透镜的其他参数以及其透射和/或反射特性。此外，控制装置可以具有检测装置，通过该检测装置确定布置在成像光路中的物镜的类型或种类，并且知道关于布置在成像光路中的各个物镜的透射特性的信息。

优选的是，借助于空间分辨的监测装置确定测量辐射的光斑的范围，并且关于物镜的有效孔径和测量的光斑的范围来修正所述关系。借助于空间分辨的监测装置，可以确定光斑的面积。如果该面积例如直径小于物镜的孔径，则因此可以确定照明辐射的强度分布和/或形状和尺寸。例如，借助于空间分辨的监测装置可以测量照明辐射的强度的高斯分布。借助于这些结果，可以更精确地确定物体中存在的照明辐射的能量参数。空间分辨的监测装置包括例如CCD(电荷耦合器件)传感器。如果照明辐射的范围大于物镜的孔径，则在该关系中可以顾及到不由物镜透射的照明辐射的比例。例如，等式(1)在用于宽视场成像的局部恒定强度分布的情况下被修改如下：

在这里，DA是监测装置上的测量辐射的范围，例如直径，并且OA是物镜孔径，f表示修正因子，通过该修正因子顾及到照明场光阑的影响。修正因子f可以按经验方式确定，并且尤其依赖于照明场光阑中的开口的形状。可选地，f＝1成立。例如，开口可以是矩形或圆形的，其中，前者正好在矩形成像检测器的情况下使用，以便实现图像场与成像检测器的适当重叠。因此，借助于确定测量辐射的范围，可以更精确地确定实际到达物体的照明辐射的比例。因此，以这种方式可以更精确地设定物体上的强度。该关系不适用于照明辐射以点状聚焦到物体中的应用。

更准确地在物体上设定能量参数的另一种可能性是通过成像检测器产生物体的电子图像，其中，成像检测器的曝光时间与监测装置的曝光时间同步。优选地，控制装置既与成像检测器连接又与监测装置连接，并且特别是可以控制或检测其曝光时间。通过成像检测器和监测装置的曝光时间的同步可以实现的是，物体上的能量参数的值特别好地与测量值一致。在快速波动的光源的情况下，这能够更好地监测物体上的照明辐射的能量参数。

为了保护物体免受辐射损害，例如物体中荧光染料的漂白，优选的是在物镜和分束器装置之间设置快门，只有当实际值在顾及到所述关系情况下的转换后(在公差范围内)达到期望的额定值时才打开快门。例如，快门可以由控制装置控制。只要所确定的物体上的照明辐射的能量参数值与额定值不一致，快门就保持关闭。例如，可以等待光源升温，直到它以恒定的方式提供照明辐射。然后打开快门以进行测量。在该实施方案中可以提出，物体上的照明辐射的能量参数的设定只进行到可以打开快门为止。

在光学操纵实验如FRAP或FLIP、激光烧蚀或光学镊子的情况下，也可选地使用快门。这里，照明装置也部分地用于成像。在光学操纵实验的情况下，照明辐射具有显着更高的功率。这意味着例如用照明装置实现漂白，并且对物体进行成像以记录荧光。这些实验有时会以两种不同的波长进行，此时它们同时使用；一个波长范围用于漂白，另一个波长范围用于成像。为了在能量参数具有正确的值之前避免不希望的漂白或恒定地采取该正确值，可以任选地以二向色方式使用快门，即用于阻挡(仅)照明辐射。

为了提高测量的可再现性并借助显微镜精确地确定测量参数，优选的是存储能量参数的额定值和/或测量辐射的能量参数的实际值在物体上的时间分布，或由此计算的变量的时间分布，例如由该关系确定的物体上的能量参数值的时间分布。这些数据可以例如用物体的记录进行存储。这具有以下优点：物体的记录的准确参数是已知的，并且因此必要时可以再现测量。

显微方法可用于荧光显微术和基于激光的技术，特别是在宽视场中。此外可行的是在实现光学操作技术例如FRAP(光漂白后的荧光恢复)或FLIP(光漂白中的荧光损失)的照明辐射的情况下采用该方法。此外，可以使用不同的波长对物体进行照明和/或成像和/或处理，例如通过激光烧蚀。作为显微镜，可以使用共焦显微镜或用于在宽视场中对物体成像的显微镜。优选地，显微方法被设计成刺激物体中的荧光发射并检测由物体发射的荧光。为此，可以为物体提供例如荧光染料。该物体可以理解为旨在借助于显微镜成像的任何样品、实体或结构。特别地，该物体可包括生物样品。

物镜将照明辐射聚焦到物体中，并且在反射光显微镜的情况下同时用于对物体成像，即用于检测由物体产生或在物体处反射的辐射。物体的图像借助于成像光路产生，在其末端存在图像检测器，用于将由成像光路引导的辐射转换成电信号。控制装置可以例如将电信号转换成物体的电子图像，该电子图像例如在显示装置上呈现和/或存储。

控制装置可选地具有存储器，在其中存储测量辐射的能量参数与物体上的照明辐射的能量参数之间的关系。为此，控制装置控制光源，使得由光源产生的照明辐射的能量参数在公差范围内具有预定的额定值。此外，在该关系中可以存在由物镜吸收或反射的照明辐射的比例和/或由物镜透射的照明辐射的比例作为参数，例如以透射率的形式。该值可以对于相应的物镜为已知，或者可以在物体的实际测量之前确定。特别是，该值以依赖于波长的方式存储在存储器中；该关系可以是依赖于波长的。此外，在控制装置的存储器中存储从照明辐射作为测量辐射耦合输出的比例。该比例也可以是预知的或实际测量之前通过校准确定。

为了减小结构并降低显微镜的构成成本，优选的是将监视光学单元设置在分束器的后面，该监视光学单元将测量辐射聚焦到监测装置上，其中，监测装置优选地具有非空间分辨的检测器，例如光电二极管。于是可以与监测光阑一起使用非空间分辨的检测器并且仍然顾及到照明辐射的直径或有效孔径。由于非空间分辨的检测器的构造与空间分辨检测器相比通常更小且更简单，因此可以节省结构空间和成本。

所述的所有参数以及物镜和物体之间存在的浸没介质对物体中的照明辐射的能量参数具有影响。通过知晓一个、多个或所有这些参数，可以修改该关系，使得它提供测量辐射的能量参数和物体中的照明辐射的能量参数之间的更准确的关联。因此，所述的参数可以作为变量出现在所述关系中。

用于将测量辐射耦合输出到监测装置上的分束器装置布置在靠近物镜的公共光路中，使得由分束器装置耦合输出的测量辐射在关于由物镜聚焦在物体上的照明辐射的能量参数的关系中非常精确。因此，特别地，通过监测装置，由监测装置检测由先前穿过的滤光器、光学元件或其他效果引起的照明辐射的能量参数的所有改变。以这种方式，基于物镜处的分束器装置，监测装置检测到特别精确地与物体本身中的照明辐射的能量参数一致的信号。特别是，不必通过计算或其他顾及到来顾及到插入的滤光器、透镜或分束器的影响，因为仅当照明辐射穿过这些元件等时测量辐射才从照明光路耦合输出。同时，也可以在检查物体期间确定照明辐射的能量参数。这尤其允许将光源调节到物体中的照明辐射的恒定能量参数。这减少了用户交互，由此简化了实验。获得的关于物体的照明的测量数据可以与记录的图像相关联，使得可以获得关于照明条件的特别精确的记录。

当然，在不脱离本发明的范围的情况下，上述特征和下面还要说明的特征不仅可以以给定的组合使用，而且可以以其他组合或单独使用。

附图说明

下面示例性地参考附图更详细地解释本发明，附图还公开了本发明的基本特征。在图中：

图1示出用于显微方法的显微镜的第一实施方案的示意图；

图2示出显微镜的第二实施方案的示意图；

图3示出显微镜的第三实施方案的示意图；

图4示出显微镜的第四实施方案的示意图；以及

图5示出用于说明用于调节显微方法中的照明的方法的框图。

具体实施方式

根据图1中所示的实施方案的反射光显微镜10用于对物体12成像，特别是在宽视场中。物体12可包含荧光染料或在刺激后发出辐射的物质。显微镜10包括物镜14、光源16、光学元件18、监测装置20、分束器装置22、自动聚焦装置24、成像检测器26和控制装置28。

物镜14、分束器装置22、光学元件18和透镜元件30以及成像检测器26形成成像光路32。光源16、光学元件18、分束器装置22和物镜14形成照明光路34。成像光路32和照明光路34在物镜14和光学元件18之间在公共光路中延伸。

因此，物镜14既用于将照明光路34的照明辐射聚焦到物体12上，又用于通过成像光路32对物体12进行成像。物体12用物镜14和透镜元件30成像到成像检测器26上。透镜元件30也可以理解为管状透镜。在物镜14和透镜元件30之间存在无限空间。因此，分束器装置18布置在成像光路32的无限空间中。成像检测器26将入射在其上的辐射转换成电信号，该电信号例如通过线路被传送到控制装置28。控制装置28由电信号产生物体12的图像，其可以在未示出的显示装置上呈现。物体12的图像可以例如是荧光图像。

光源16可以设计为激光器、发光二极管(LED)或白光源。光源16可以优选地产生平行化的照明辐射；在图1和2中所示的实施方案中，光源发射非平行化的照明辐射，其通过透镜17平行化。根据所进行的实验类型，照明辐射以平行化或会聚的方式在照明光路34中引导。

通过例如设计为二向色镜的光学元件18，将照明辐射耦合输入到成像光路32中。照明辐射包括例如用于在物体12中刺激荧光辐射的波长范围。由物体12发射的辐射通常优选地具有与照明辐射的波长范围不同的波长范围，使得光学元件18通常是二向色的并且仅作用于照明辐射。

在光源16和分束器装置18之间设置激发滤光器33。所述激发滤光器可以插入照明光路34中，例如通过转台或滑块。控制装置28设计成用于确定激发滤光器33的类型，从而确定由激发滤光器33透射的波长范围。此外，激发滤光器33的类型也可以手动输入，使得由激发滤光器33透射的照明辐射的波长范围对于控制装置是已知的。

借助例如可以设计为分束器的分束器装置22，由照明辐射将测量辐射从公共光路中分离出来，特别是以与波长无关的方式，并且供给到监测装置20。例如，作为测量辐射，可以分离照明辐射的强度或功率的10％、5％或1％。在图1所示的显微镜10的实施方案中，将监测装置20设计为空间分辨检测器，例如CCD(电荷耦合器件)传感器，它以空间分辨的方式将入射到其上的辐射转换成电信号。由监测装置20产生的电信号通过线路传导到控制装置28。由监测装置20产生的电信号尤其与入射在监测装置20上的辐射的强度或功率成比例，使得控制装置28可以根据信号确定入射在监测装置20上的测量辐射的强度。强度是能量参数的一个例子；在下文中，针对作为能量参数的强度讨论了本发明，但不限于此。

优选地，控制装置28具有存储器36，其中，以依赖于波长的方式存储分束器装置22从公共光路耦合输出到监测装置20上的照明辐射的百分比。存储器36可以是例如可写或不可写的存储介质，例如RAM或ROM。基于由监测装置20检测的测量辐射的强度，控制装置28可以确定由光源16提供的照明辐射的强度。然而，更重要的是控制装置28确定物体12中的照明辐射的强度。为此，控制装置28可以与物镜14连接，以便例如检测当前在公共光路中提供何种类型的物镜14。例如，多个物镜14可以布置在转台上，并且控制装置28可以检测哪个物镜14当前位于公共光路中。

在存储器36中存储关系，该关系优选地以依赖于波长的方式给出物镜14的透射和/或反射特性。此外，还存储在显微镜10中使用的物镜14的孔径。基于物镜14的透射和/或反射特性和照明辐射强度的知识以及照明辐射的波长范围(其已经通过确定光源16或激发滤光器33的类型来检测)，控制装置28可以确定物体12中存在的照明辐射的强度。例如，物体12中存在的强度LO、由空间分辨监测装置20确定的强度L、由分束器装置22耦合输出的辐射A的比例和物镜14的透射率T通过以下等式关联：

由于监测装置20具有空间分辨检测器，因此控制装置28还确定测量辐射的光束横截面并因此确定其强度。如果照明辐射的范围大于物镜14的孔径，则不是所有的照明都穿过物镜14，并且不是所有可用的照明辐射都聚焦在物体12上。因此，借助空间分辨监测装置20，当确定物体中的照明辐射的能量参数时，可以顾及到未利用的照明辐射的比例，因为物镜14的孔径可选地存储在存储器36中。

可选的自动聚焦装置24用于检测物镜14的焦点位置。自动聚焦装置24例如如WO2007/144197 A1中所述配置。自动聚焦装置24产生自动聚焦照明辐射，其波长范围优选地不与照明辐射的波长范围或由物体12产生的荧光辐射的波长范围一致。因此，监测装置20从物体获得的自动聚焦测量辐射中检测物镜14的焦点位置，并将该信息传送给控制装置28。于是，控制装置28可以保持物镜14的焦点恒定。因此，通过对物镜的控制可以例如补偿漂移和其他影响。

在物镜侧，分束器装置22设置有二向色镜，该二向色镜反射自动聚焦辐射并透射照明辐射以及荧光辐射。在光源侧，分束器装置22具有用于耦合输出测量辐射的分束器。可选地，二向色镜和分束器的特性可以在单个光学分束器层中实现。分束器装置22优选地是一体元件，具有影响其反射或透射特性的涂层。

公共光路在物镜14和分束器装置22之间没有光学元件；在图1所示的实施方案中，在该区域中没有设置元件。辐射在那里以平行方式行进。

如图2所示的显微镜10的实施方案在基本结构方面与图1所示的实施方案一致。即使在图2中未示出自动聚焦装置24和激发滤光器33，它们同样可以在图2中提供。下面仅讨论根据图1和2的两个实施方案之间的其他差异：

在照明光路34中，在反射光显微镜的情况下在公共光路中，在物镜14和分束器装置22之间设置有快门38，和/或照明场光阑40。快门38经由线路与控制装置28连接，并且可由控制装置28切换到两个操作状态。在一个操作状态中，快门38阻挡公共光路，使得没有照明辐射可以到达物体12。在另一个操作状态中，快门38打开，使得公共光路是敞开的。

作为独立于快门的选择，在光源16的后面布置照明场光阑41，通过该照明场光阑可以改变照明辐射的场尺寸。照明场光阑41经由线路与控制装置28连接，其中，控制装置28可以控制和/或确定照明场光阑41的开口的位置和/或尺寸。以这种方式，可以改变公共光路前面的照明辐射的横截面。照明场光阑40布置在与物平面共轭的平面中；例如，照明场光阑40布置在光源透镜17和光源16之间。

作为另一个独立选择，图2中所示的实施方案中的监测装置20设计为非空间分辨检测器，例如光电二极管。与根据图1的空间分辨检测器相比，它占据更少的空间并且其结构更简单。为了将测量辐射聚焦到监测装置20上，监测光学单元42布置在分束器装置22和监测装置20之间。监测光学单元42可包括一个或多个透镜。监测光学单元42将从平行化照明辐射耦合输出的测量辐射聚焦到监测装置20上。

此外，在分束器装置22和监控装置20之间布置可选的可变光阑44和可选的滤光器46。可变光圈44与控制装置28连接，由此控制装置28可以改变和/或确定可变光阑的开口的尺寸。特别地，控制装置28控制可变光阑44，使得其开口与物镜14的有效孔径一致。以这种方式，测量辐射的横截面和穿过物镜14的照明辐射的横截面具有相同的尺寸。因此，可以更好地确定物体12中存在的照明辐射的强度。可选地，如上所述，物镜14的有效孔径由物镜14的类型或种类以及照明场光阑41的开口的尺寸确定。相应于物镜孔径设定监测光阑44，使得对于不同的物镜14，即使在较大的照明光束直径的情况下，也始终相应地将传输的比例引导到监测装置上。

一方面，可以提供滤光器46用于衰减测量辐射，特别是以与波长无关的方式，例如为了避免损坏监测装置20或者为了增加监测装置20在强度方面的测量范围。另一方面，滤光器46可以配置成使得它阻挡可能使照明辐射强度的测量结果失真的不需要的辐射。例如，阻挡了自动聚焦辐射或荧光的波长范围内的辐射。此外，滤光器46可以设计为带通滤光器，使得仅可以在监测装置20的前面检测到的该波长范围内的辐射入射在监测装置20上。如上所述，显微镜10可包括一个或多个滤光器46。特别地，显微镜10具有滤光器驱动器48，通过该滤光器驱动器可以在分束器装置22和监测装置20之间更换或移除滤光器46。特别地，控制装置28控制滤光器驱动器48，使得相应测量所需的滤光器46介于分束器装置22和监测装置20之间。

分束器装置22可以由公共光路形成。为此，可以提供驱动器49，例如电动机或线性驱动器。驱动器49通过未在图中示出的线路或通过无线电按数据技术方式与控制装置28连接。通过从公共光路或照明光路34移除分束器装置22，由光源16产生的最大强度在物体12处获得，因为在这种情况下没有耦合输出测量辐射。

除了提供光谱元件50而不是滤光器46之外，图3中所示的显微镜10的实施方案与图2中所示的显微镜10的实施方案一致。然而也可行的是，滤光器46和光谱元件50均设置在监测装置20和分束器装置22之间。光谱元件50以依赖于波长的方式偏转测量辐射。例如，光谱元件50包括衍射光栅或棱镜。此外，监测装置20具有多个特别是非空间分辨的检测器，每个检测器可以检测波长范围内的入射辐射。由光谱元件50以依赖于波长的方式偏转的辐射借助于监测光学单元42聚焦到监测装置20的相应检测器上。监测装置20设计成以这种方式进行光谱分析。这也可以以不同方式完成，例如使用光谱仪。

控制装置28被设计成连续地或在选定的时间点将检测到的照明辐射的强度存储在存储器36中，使得对于用显微镜10记录的物体12的图像给出照明辐射的强度。通过这种方式，可以更好地记录以及必要时再现测量结果。

除了是透射光显微镜的不同之处外，图4中所示的显微镜10的实施方案与图3中所示的显微镜10的实施方案一致。因此，在该实施方案中，照明光路34和成像光路32布置在物体12的不同侧上。透镜元件30用于将物体12成像到成像检测器26上。但是，图4中所示的结构也可以适应于根据图1和图2的照明光路34的实施方案。

图5示出了用于说明该方法的框图。在步骤S1中确定物体12上的照明辐射强度的额定值。额定值可以由显微镜10的用户手动输入，或者可以从先前进行的测量中自动采用。如果采用来自已进行的测量的数据，例如额定值，则在可选的中间步骤中，可以使用在该实验中使用的硬件组件，例如物镜14、光源16的类型、激发滤光器33、照明场光阑40等，特别是具有相应的设置。在可选步骤S2中，在步骤S3中由光源16发射照明辐射之前关闭快门38。在步骤S4中，借助于分束器装置22，一部分照明辐射作为测量辐射从照明光路34耦合输出到监测装置20上。在步骤S4中，确定测量辐射的强度的实际值，其中，该测量以依赖于波长的方式进行，例如借助于图3和4中所示的监测装置20。确定光源16的发射光谱，例如从存储器36读出，和/或由激发滤光器33透射的波长范围。基于测量的波长的强度，借助于已知的发射光谱计算照明辐射的总强度。监测装置20的曝光时间可选地与成像检测器26的曝光时间同步，使得检测到的强度与实际存在于物体12上的强度之间的由于光源16的波动而存在的偏差最小化。

在步骤S5中顾及到物镜14的透射特性以及可选地布置在分束器装置22和物镜14之间的光学成像元件的透射特性，例如针孔，和/或存在于物体12和物镜14之间的浸没介质。透射特性的检测，例如以透射率的形式，特别是以依赖于波长的方式进行。

在步骤S6中，由物镜14的透射特性，必要时由从照明辐射耦合输出之后穿过的光学元件的透射特性，建立测量辐射的强度与物体12上的照明辐射的强度之间的关系。在这种情况下关系到比例的大小，例如作为百分比值。该关系可以可选地顾及到布置在物镜14和分束器装置22之间的光学成像元件和/或存在于物体12和物镜14之间的浸没介质。一种可能的关系是例如上面描述的等式。该关系也可以以依赖于波长的方式建立。

在可选的步骤S7中，根据焦距和物体12与物镜14之间的距离设置监测光阑44，特别是根据由此确定的物体12上的照明辐射的范围，使得监测装置20上的测量辐射的面积与物体12上的照明辐射的面积一致。

在步骤S8中，连续监测实际值、额定值以及从实际值计算的实际强度并将其存储在存储器36中。在步骤S9中，设定光源16，使得在顾及到该关系的情况下由实际值计算出的物体上的实际强度在公差范围内与强度的额定值一致，其中，该设定可以通过调节进行。在可选的步骤S10中，打开快门38。

优选的是，对于实验中使用的所有波长范围执行步骤S4至S9，使得在打开快门38之前针对所有波长范围已设定强度。因此可以避免由于在实验期间重新调整各个波长范围的强度而导致的延迟。

Claims (11)

1.一种用于控制或调节显微镜(10)的光源(16)的方法，所述光源用于利用照明辐射将物体(12)照明，所述方法包括以下步骤：

确定物体(12)上的照明辐射的能量参数的额定值，

借助光源(16)产生照明辐射，

提供用于将照明辐射聚焦到物体(12)上的物镜(14)，

将物镜(14)前面的一定比例的照明辐射作为测量辐射耦合输出并测量测量辐射的能量参数的实际值，

确定物镜(14)对于照明辐射的透射特性，

提供测量辐射的能量参数与物体(12)上的照明辐射的能量参数之间的关系，所述关系依赖于物镜(14)透射特性和所述比例的大小，以及

以如下方式调整光源(16)，使得对于测量辐射测量的能量参数的实际值按照所述关系在公差范围内对应于物体(12)上的照明辐射的能量参数的额定值，

其中，所述显微镜(10)是反射光显微镜，并且所述反射光显微镜用于在宽视场中对物体(12)成像。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，确定透射特性和/或测量实际值是以依赖于波长的方式进行的和/或所述关系是依赖于波长的。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，为了对于所述关系顾及到物镜(14)的透射特性，确定过滤照明辐射的激发滤光器(33)和/或光源(16)的类型。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，测量辐射的能量参数的实际值在照明辐射的预定波长范围内测量，由在照明辐射的预定波长范围内测量到的测量辐射的能量参数的实际值，在顾及到激发滤光器(33)和/或光源(16)的类型的情况下，在整个波长范围内推断出关于物体(12)上的能量参数的当前值。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，对于所述关系，还对布置在物镜(14)与耦合输出位置之间的光学元件的透射特性和/或存在于物体(12)和物镜(14)之间的浸没介质的透射特性加以确定并顾及。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测量辐射被引导通过监测光阑(44)，所述监测光阑(44)的开口被设定为使得其对应于物镜(14)的有效孔径。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，对测量辐射的能量参数的实际值连续监测，并且调节光源(16)。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，确定测量辐射的光斑的面积，并且在物镜(14)的有效孔径和/或所述面积方面对所述关系加以修正。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，生成物体(12)的电子图像，其中，曝光时间与测量实际值的曝光时间同步。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，在物镜(14)与耦合输出测量辐射的分束器装置(22)之间提供快门(38)，并且当实际值在公差范围内对应于额定值时，打开快门(38)。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，存储额定值的时间分布和/或从其导出的值的实际值的时间分布。

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