CN104932092B - 基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法 - Google Patents

基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104932092B
CN104932092B CN201510330496.3A CN201510330496A CN104932092B CN 104932092 B CN104932092 B CN 104932092B CN 201510330496 A CN201510330496 A CN 201510330496A CN 104932092 B CN104932092 B CN 104932092B
Authority
CN
China
Prior art keywords
image
sample
focusing
radius
defocusing amount
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510330496.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104932092A (zh
Inventor
谷朝臣
李钦
吴开杰
胡洁
关新平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN201510330496.3A priority Critical patent/CN104932092B/zh
Publication of CN104932092A publication Critical patent/CN104932092A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104932092B publication Critical patent/CN104932092B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/361—Optical details, e.g. image relay to the camera or image sensor
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes

Abstract

本发明公开了一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法，硬件构成包括偏心光束离焦量探测模块、显微成像模块、压电物镜驱动器、XY载物台及计算机处理系统。离焦量探测模块发射半圆形激光束照射样本表面，并获取样本反射形成的半圆形光斑图像；计算机处理系统经过自适应中值滤波、基于OSTU的Canny边缘检测、最小二乘法拟合等算法处理灰度化的光斑图像可得到光斑半径，根据半径‑离焦量的线性关系模型，可计算该视场下样本离焦量；压电物镜驱动器带动物镜补偿离焦量；对焦完成后，显微成像模块获取清晰的样本图像。本发明具有对焦速度快、对焦精度高，线性范围大的优点，可满足显微镜在高倍物镜下快速、精确对焦的要求。

Description

基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法
技术领域
本发明涉及显微镜对焦技术领域，具体是一种采用偏心光束法作为离焦量检测光路、配合光斑图像处理算法计算样本离焦量的自动对焦装置及方法。
背景技术
偏心光束法是一种典型的显微镜主动对焦方法，通常结合灰度重心法处理激光光斑图像以计算样本离焦量。但是灰度重心法要求光斑有良好的对称性且光强分布均匀，而样本表面的凹凸情况非常复杂，并且受光源光强分布不均匀、第二和第三分光棱镜分光效果不理想、刀口处的衍射、样本不同细胞组织间反射率的差异等原因，对焦相机获取的光斑图像中残留大量的噪声及畸变，光斑的光强分布也严重背离高斯分布，以上原因导致使用线性模型拟合灰度重心的坐标偏移量与离焦量的数据，在实际应用中会带来超出了显微镜物镜景深的误差，导致自动对焦效果很差，获取的样本显微成像质量不能满足应用需求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述不足，提供一种对焦速度快、对焦精度高、线性范围大的基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法，可满足显微镜在高倍物镜下快速、精确对焦的要求。
本发明是通过以下技术方案实现的：
根据本发明的一个方面，提供了一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜，包括自动对焦装置和XY载物台，所述自动对焦装置包括偏心光束离焦量探测模块、显微成像模块和压电物镜驱动器；其中：
所述偏心光束离焦量探测模块用于发射偏心激光束照射样本表面，并获取反射回的半圆形光斑图像，所述半圆形光斑图像的半径与样本离焦量在一定范围内成线性关系；
所述XY载物台用于移动样本，实现样本的扫描运动；
所述显微成像模块，用于获取对焦完成后清晰的样本图像；
所述压电物镜驱动器用于补偿当前视场的离焦量，完成对焦。
优选地，所述显微成像模块包括成像相机、第二聚焦透镜组、第三分光棱镜、物镜；其中：样本的照明光线依次经物镜、第三分光棱镜、第二聚焦透镜组，最后在成像相机上获取样本的显微图像。
进一步地，所述的压电物镜驱动器，与物镜通过螺纹套筒刚性连接，且压电物镜驱动器的最大负载(额定负载)不小于物镜和螺纹套筒的总重量。
优选地，所述偏心光束离焦量探测模块内部包括集成的近红外激光器、激光扩束器、刀口、第一分光棱镜、第二分光棱镜、第一聚焦透镜组以及对焦相机；其中：
所述近红外激光器、激光扩束器、刀口、第一分光棱镜、第三分光棱镜以及物镜形成偏心光束法的激光发射光路；
所述物镜、第三分光棱镜、第二分光棱镜、第一聚焦透镜组、对焦相机形成偏心光束法的光斑反射光路；
所述激光发射光路与光斑反射光路光轴重合，对焦相机与成像相机视场一致。
优选地，所述偏心光束离焦量探测模块的近红外激光器嵌入圆柱凸轮结构的激光器衬套中，通过拨动与激光器衬套连接的拨杆可改变近红外激光器调整沿光轴方向的位置，进而调整控制对焦相机获取的光斑图像的大小；
优选地，所述偏心光束离焦量探测模块的反射成像光路中第二分光棱镜固定于蜗轮蜗杆旋转安装座上，通过蜗轮蜗杆旋转安装座可改变第二分光棱镜与光轴之间的夹角，进而调整光斑图像在对焦相机上的成像位置。
优选地，所述自动对焦装置还包括计算机处理系统，所述偏心光束离焦量探测模块、显微成像模块、压电物镜驱动器以及XY载物台分别与计算机处理系统连接，用于：
控制XY载物台运动；
调整对焦相机和成像相机；
运行图像处理算法；
计算样本离焦量；
控制压电物镜驱动器完成对焦。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述基于偏心光束法的自动对焦显微镜的自动对焦方法，包括如下步骤：
a、偏心光束离焦量探测模块发射半圆形偏心激光束照射样本表面，并获取样本反射形成的半圆形光斑图像；
b、计算机处理系统对半圆形光斑图像运行图像处理算法，计算当前视场下样本离焦量；
c、压电物镜驱动器5补偿离焦量，完成对焦；
d、显微成像模块获取清晰的样本图像；
e、XY载物台移动样本至下一视场。
优选地，所述图像处理算法包括如下步骤：
(1)将成像相机获取的半圆形光斑图像image(x，y)M×N转化为二维灰度图gray(x，y)M×N，(x，y)表示图像像素坐标，M×N表示图像分辨率；
(2)使用自适应窗口中值滤波算法平滑二维灰度图gray(x，y)M×N，输出图像
(3)使用基于OSTU的Canny边缘检测算法：该算法首先使用OSTU算法计算图像的二值化阈值T，并以此阈值T对图像进行二值化，可输出光斑二值化图像binary(x，y)M×N，然后使用Canny边缘检测处理得到的光斑二值化图像binary(x，y)M×N的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N；
(4)将获取的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N作为掩膜处理光斑二值化图像binary(x，y)M×N，可得边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N；使用完整边缘轮廓edge(x，y)M×N减去边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N可得边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N；
(5)使用最小二乘法分别拟合边缘轮廓A edgeA(x，y)M×N、边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N，得到对应的边缘轮廓A的拟合圆半径rA、边缘轮廓B的rB；
(6)比较拟合圆半径rA与拟合圆半径rB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓部分为非半圆轮廓，较小者对应的边缘轮廓部分为半圆轮廓；
(7)分别计算边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N、边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N的灰度重心点pointA(xA，yA)及pointB(xB，yB)，(xA，yA)表示边缘轮廓A的灰度重心点的像素坐标，(xB，yB)表示表示边缘轮廓B的灰度重心点的像素坐标；
(8)比较xA与xB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓部分在图像上位于较小者对应的边缘轮廓部分的右侧；据此得到非半圆轮廓与半圆轮廓的相对位置，相对位置只有两种情况：非半圆轮廓位于半圆轮廓的左侧或右侧，与样本的两种离焦状态——正离焦和负离焦——相对应，该对应关系可事先进行实验确定；正离焦是指样本超出物镜焦距的离焦情况，负离焦是指样本在物镜焦距内的离焦情况；
(9)样本判定为正离焦状态时，将rA、rB中的较小者直接代入光斑半径-离焦量线性关系模型；样本判定为负离焦状态时，将rA、rB中的较小者乘以-1代入光斑半径-离焦量关系模型；计算当前样本离焦量；
所述光斑半径-离焦量关系模型具体为：
光斑半径绝对值超出数值rmax时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径绝对值小于数值rmin时，样本处于准焦状态下，，rmax表示线性关系区间内的光斑半径最大值，rmin表示线性关系区间内的光斑半径最小值；样本处于正离焦状态或负离焦状态时，根据δ＝k·r+b计算离焦量，δ表示离焦量，k表示线性模型的斜率，r表示当前光斑半径，b表示样本在物镜景深范围内时上述图像处理算法计算所得的光斑半径；其中正离焦时k＞0，负离焦时k＜0，r＝min{rA，rB}，k、b的具体数值由实验数据进行线性回归分析得到。
优选地，在对基于偏心光束法的自动对焦显微镜自动对焦前，还需要对自动对焦装置进行检查和调试，包括如下步骤：
首先，调整激光发射光路、光斑反射光路、显微成像光路，使三者光轴重合，保证对焦相机和成像相机的视场一致；对焦相机能够获取激光光斑图像，成像相机能够获取激光聚焦点处的样本图像；
其次，观察对焦相机上的激光光斑，调整偏心光束离焦量探测模块中的刀口韧边恰好经过光斑圆心点，遮挡住激光束的一半，形成半圆形光斑图像。
本发明提供的基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法，偏心光束离焦量探测模块发射半圆形激光束照射样本表面，并获取样本反射形成的半圆形光斑图像；计算机处理系统经过自适应中值滤波、基于OSTU的Canny边缘检测、最小二乘法拟合等算法处理灰度化的光斑图像可得到光斑半径，根据半径-离焦量的线性关系模型，可计算该视场下样本离焦量；压电物镜驱动器带动物镜补偿离焦量；对焦完成后，显微成像模块获取清晰的样本图像。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、偏心光束离焦量探测模块可将样本离焦量转化为与之线性相关的光斑半径，而通过计算光斑重心偏移量推算离焦量的传统的灰度重心法，仅适用于反射光斑光强分布均匀、光斑畸变少的表面，本发明提供的图像处理算法建立的光斑半径-离焦量的线性关系模型的精确度更高，且抗噪能力强，可有效消除光斑光强分布不均、光斑畸变严重的情况，尤其适合处理显微镜下样本离焦量的探测，使得显微镜能在高倍物镜下快速、精确对焦。
2、本发明使用偏心光束法结合光斑图像半径检测法，具体使用自适应窗口的中值滤波、基于OSTU阈值分割的Canny边缘检测、最小二乘法拟合等算法，计算光斑半径实现对焦，具有如下优势：
(1)线性范围大：根据偏心光束法的基本原理，光斑半径与离焦量成线性关系，而光斑灰度重心偏移量与离焦量并非线性关系，而且光斑图像存在的大量衍射导致灰度重心法线性范围很小，使用光斑图像半径检测法线性范围很大；
(2)精度高：光斑图像内部存在大量衍射造成的波纹状缺陷，边缘则存在大量毛刺、噪声，灰度重心法对这些缺陷非常敏感，而本发明提出的光斑图像半径检测法主要针对光斑图像的边缘进行分析，可屏蔽光斑图像内部缺陷，使用最小二乘法处理拟合光斑边缘，也可消除大部分边缘毛刺、噪声的影响。
3、本发明具有对焦速度快、对焦精度高，线性范围大的优点，可满足显微镜在高倍物镜下快速、精确对焦的要求。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是本发明的硬件组成图；
图2是本发明的压电物镜驱动器；
图3是本发明的偏心光束离焦量探测模块；
图4是本发明的近红外激光器的圆柱凸轮调整机构；
图5是本发明的安装第二分光棱镜的高精度蜗轮蜗杆安装座；
图6是本发明的光斑半径-离焦量线性关系模型；
图7是本发明的图像处理算法流程图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例：
本实施例提供了一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法。
基于偏心光束法的自动对焦显微镜，其硬件构成包括自动对焦装置和XY载物台，所述自动对焦装置包括偏心光束离焦量探测模块、显微成像模块、压电物镜驱动器；所述的偏心光束离焦量探测模块用于发射偏心激光束照射样本表面，并获取反射回的半圆形光斑图像，且其半径与样本离焦量成线性关系；所述的XY载物台用于移动样本，实现样本的扫描运动；所述的显微成像模块用于获取对焦完成后清晰的样本图像；所述的压电物镜驱动器用于补偿当前视场的离焦量，完成对焦。
所述自动对焦装置还包括计算机处理系统，所述的计算机处理系统用于控制XY载物台、对焦相机、成像相机，以及运行光斑图像处理算法，计算样本离焦量，控制压电物镜驱动器完成对焦。
进一步地，所述的压电物镜驱动器，与物镜通过螺纹套筒刚性连接，且压电物镜驱动器的最大负载(额定负载)不小于物镜和螺纹套筒的总重量。
进一步地，所述显微成像模块包括成像相机、第二聚焦透镜组、第三分光棱镜、物镜；其中：
样本的照明光线依次经物镜、第三分光棱镜、第二聚焦透镜组，可在成像相机上获取其显微图像。
进一步地，所述的显微成像模块，其硬件构成包括成像相机、第二聚焦透镜组、物镜，第二聚焦透镜组内置于一镜筒中，且通过接口转换器与成像相机连接。
进一步地，所述的偏心光束离焦量探测模块，内部集成了由近红外激光器、激光扩束器、刀口、第一分光棱镜、物镜构成偏心光束法的激光发射光路和由物镜、第二分光棱镜、第一聚焦透镜组、对焦相机组成偏心光束法的反射光成像光路；为避免与显微成像模块中的照明光线相串扰，使用的激光器波长在近红外区，第一分光棱镜为带阻型且涵盖激光器波长范围，第二分光棱镜为半反半透型；激光发射光路中刀口可遮挡一半的光束，使得入射于样本表面的光斑为半圆形光斑。
进一步地，所述的基于偏心光束法的自动对焦显微镜，其特征在于，所述偏心光束离焦量探测模块的近红外激光器嵌入圆柱凸轮结构的激光器衬套中，通过拨动与激光器衬套连接的拨杆可改变近红外激光器调整沿光轴方向的位置，进而调整控制对焦相机获取的光斑图像的大小；
进一步地，所述偏心光束离焦量探测模块的反射成像光路中第二分光棱镜固定于蜗轮蜗杆旋转安装座上，通过蜗轮蜗杆旋转安装座可改变第二分光棱镜与光轴之间的夹角，进而调整光斑图像在对焦相机上的成像位置。
进一步地，所述对焦相机获取的半圆形激光光斑半径与样本离焦量成线性关系，当样本处于准焦位置时，半圆形光斑半径最小，甚至由于衍射的存在，近似于完整的圆斑；当样本处于正离焦和负离焦状态时，对应的半圆形激光光斑的形状的方向不同，对应的线性关系的模型的斜率不同，且离焦量越大，光斑半径越大：可综合通过图像处理算法判断光斑形状的方向、计算光斑半径求解当前视场的离焦量。
基于偏心光束法的自动对焦显微镜自动对焦方法，通过自动对焦装置实现；使用自动对焦装置前需要对自动对焦装置的光路系统进行检查、调试：首先，调整近红外激光发射光路、样本反射光光路、显微成像光路使其三者光轴重合，保证对焦相机、成像相机的视场一致，对焦相机可获取激光光斑图像，成像相机可获取激光聚焦点处的样本图像；其次，通过观察计算机显示的对焦相机上的激光光斑，调整偏心光束离焦量探测模块中的刀口韧边恰好经过光斑圆心点，遮挡住圆形激光束的一半。
所述一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜的自动对焦方法，其工作过程为：
(1)离焦量探测模块发射半圆形激光束照射样本表面，并获取样本反射形成的半圆形光斑图像；
(2)计算机处理系统对光斑图像运行图像处理算法计算该视场下样本离焦量；
(3)压电物镜驱动器补偿离焦量，完成对焦；
(4)显微成像模块获取清晰的样本图像；
(5)XY载物台移动样本至下一视场。
所述的图像处理算法包括如下步骤：
(1)将成像相机获取的半圆形光斑图像image(x，y)M×N转化为二维灰度图gray(x，y)M×N，(x，y)表示图像像素坐标，M×N表示图像分辨率；
(2)使用自适应窗口中值滤波算法平滑二维灰度图gray(x，y)M×N，输出图像
(3)使用基于OSTU的Canny边缘检测算法：
首先使用OSTU算法计算图像的二值化阈值T，并以此阈值T对图像进行二值化，输出光斑二值化图像binary(x，y)M×N；
然后使用Canny边缘检测处理得到光斑二值化图像binary(x，y)M×N的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N；
(4)将获取的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N作为掩膜处理光斑二值化图像binary(x，y)M×N，得边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N；使用完整边缘轮廓edge(x，y)M×N减去边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N，得边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N；
(5)使用最小二乘法分别拟合边缘轮廓A edgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N，得到对应的边缘轮廓A的拟合圆半径rA和边缘轮廓B的拟合圆半径rB；
(6)比较拟合圆半径rA与拟合圆半径rB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓为非半圆轮廓，较小者对应的边缘轮廓为半圆轮廓；
(7)分别计算边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N的灰度重心点pointA(xA，yA)及pointB(xB，yB)，(xA，yA)表示边缘轮廓A的灰度重心点的像素坐标，(xB，yB)表示表示边缘轮廓B的灰度重心点的像素坐标；
(8)比较xA与xB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓在图像上位于较小者对应的边缘轮廓的右侧；据此得到非半圆轮廓与半圆轮廓的相对位置；
所述相对位置包括如下两种情况：
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的左侧，与样本的正离焦状态相对应；所述正离焦状态是指样本超出物镜焦距的离焦情况；
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的右侧，与样本的负离焦状态相对应；所述负离焦状态是指样本在物镜焦距内的离焦情况；
(9)样本判定为正离焦状态时，将拟合圆半径rA拟合圆半径rB中的较小者直接代入光斑半径-离焦量线性关系模型；样本判定为负离焦时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者乘以-1代入光斑半径-离焦量关系模型；计算当前样本离焦量；
所述光斑半径-离焦量关系模型具体为：
光斑半径绝对值超出数值rmax时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径绝对值小于数值rmin时，样本处于准焦状态下，rmax表示线性关系区间内的光斑半径最大值，rmin表示线性关系区间内的光斑半径最小值；样本处于正离焦状态或负离焦状态时，根据δ＝k·r+b计算离焦量，δ表示离焦量，k表示线性模型的斜率，r表示当前光斑半径，b表示样本在物镜景深范围内时上述图像处理算法计算所得的光斑半径；其中正离焦状态时k＞0，负离焦状态时k＜0，r＝min{rA，rB}，k、b的具体数值由实验数据进行线性回归分析得到。
以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的详细说明。
如图1所示，一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜，硬件构成包括自动对焦装置和XY载物台8，所述自动对焦装置包括偏心光束离焦量探测模块19、显微成像模块1、压电物镜驱动器5、计算机处理系统10；所述的偏心光束离焦量探测模块19用于发射偏心激光束照射样本7表面，并获取反射回的半圆形光斑图像，且其半径与样本离焦量成线性关系；所述的XY载物台8用于移动样本7，实现样本7的扫描运动；所述的显微成像模块1用于获取对焦完成后清晰的样本图像；所述的压电物镜驱动器5用于补偿当前视场的离焦量，完成对焦；所述的计算机处理系统10用于控制XY载物台8、对焦相机18、成像相机2，以及运行光斑图像处理算法，计算样本离焦量，控制压电物镜驱动器5完成对焦。
如图2所示，所述的压电物镜驱动器5，下面以使用的物镜6的型号为Plan N20x/0.40∞/0.17/FN22，底部为RMS(0.800英寸-36)螺纹，使用的压电驱动器21闭环行程为100微米(±20％)，重复定位精度为10纳米，最大负载为300g为例。物镜6与压电驱动器21通过RMS螺纹套筒22刚性连接，且压电驱动器21的最大负载不小于物镜6和螺纹套筒22的总重量。
如图1、图3所示，所述的偏心光束离焦量探测模块13，内部集成了由近红外激光器14、激光扩束器13、刀口12、第一分光棱镜11构成的偏心光束法的激光发射光路和由第二分光棱镜16、第一聚焦透镜组17、对焦相机18组成偏心光束法的反射光成像光路；其中激光扩束器13、刀口12、第一分光棱镜11均安装于镜筒25内部，近红外激光器14通过圆柱凸轮调整机构26安装于镜筒25一端，而第一聚焦透镜组17安装于镜筒28内部，对焦相机18安装于壳体27一侧，与镜筒一端同心，镜筒25与镜筒28均固定于壳体27内；为避免与显微成像模块1中的照明光源20光线相串扰，使用的激光器为近红外光纤激光器14，且波长为850nm，功率为0～50mw，且激光器的功率、开关均由控制电路板24控制，该电路板可通过隔离柱固定于盖板23上；第一分光棱镜11为850nm带阻型，第二分光棱镜16为半反半透型；激光发射光路中刀口12为截面为三边长度比例为10∶16∶25的直角三角形的铝合金块，可遮挡一半的光束，使得入射于样本7表面的光斑为半圆形光斑。
如图4所示，近红外激光器的圆柱凸轮调整机构26，激光器衬套31包裹近红外激光器14，且激光器衬套14中部有螺纹孔可与拨杆33链接，拨杆33透过圆柱凸轮32的曲线凹槽插入激光器衬套14，同时激光器衬套14一端的法兰盘可与镜筒25连接，通过拨动拨杆33在曲线凹槽里的位置，即可改变近红外激光器14沿光轴方向的位置，调整控制对焦相机18获取的光斑图像的大小。
如图5所示，本实施例的安装第二分光棱镜的高精度蜗轮蜗杆安装座29，反射成像光路中的第二分光棱镜16固定于立方安装座35中，立方安装座35与涡轮轴心相连，而涡轮外壳34通过螺纹连接壳体27固定，手动旋转调节旋钮30可第二分光棱镜16与光轴间的夹角，调整光斑图像在对焦相机18上的成像位置。
如图6所示，所述光斑半径与样本离焦量的线性关系模型，当样本7处于对焦完成的位置时，半圆形光斑半径最小，甚至由于衍射的存在，近似于完整的圆斑；当样本处于正离焦和负离焦状态时，对应的半圆形激光光斑的形状的方向不同，对应的线性关系的模型的斜率不同，且离焦量越大，光斑半径越大：可综合通过图像处理算法判断光斑形状的方向、计算光斑半径求解当前视场的离焦量。
所述一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法，使用自动对焦装置前需要对该装置的光路系统进行检查、调试：首先，调整近红外激光发射光路、样本反射光光路、成像相机光路使其三者光轴重合，保证对焦相机18、成像相机2的视场一致，对焦相机18可获取光斑图像，成像相机2可获取激光聚焦点处的样本图像；其次，通过观察计算机处理系统10显示的光斑图像，调整刀口12韧边恰好经过光斑圆心点，遮挡住圆形激光束的一半。
所述一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜的自动对焦方法，其工作过程为：
(1)偏心光束离焦量探测模块19发射半圆形激光束照射样本7表面，并获取样本7反射形成的半圆形光斑图像；
(2)计算机处理系统10对光斑图像运行图像处理算法计算该视场下样本离焦量；
(3)压电物镜驱动器5补偿离焦量，完成对焦；
(4)显微成像模块1获取清晰的样本图像；
(5)XY载物台8移动样本至下一视场。
所述的图像处理算法包括如下步骤：
(1)将成像相机获取的半圆形光斑图像image(x，y)M×N转化为二维灰度图gray(x，y)M×N，(x，y)表示图像像素坐标，M×N表示图像分辨率；
(2)使用自适应窗口中值滤波算法平滑二维灰度图gray(x，y)M×N，输出图像
(3)使用基于OSTU的Canny边缘检测算法：
首先使用OSTU算法计算图像的二值化阈值T，并以此阈值T对图像进行二值化，输出光斑二值化图像binary(x，y)M×N；
然后使用Canny边缘检测处理得到光斑二值化图像binary(x，y)M×N的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N；
(4)将获取的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N作为掩膜处理光斑二值化图像binary(x，y)M×N，得边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N；使用完整边缘轮廓edge(x，y)M×N减去边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N，得边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N；
(5)使用最小二乘法分别拟合边缘轮廓A edgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N，得到对应的边缘轮廓A的拟合圆半径rA和边缘轮廓B的拟合圆半径rB；
(6)比较拟合圆半径rA与拟合圆半径rB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓为非半圆轮廓，较小者对应的边缘轮廓为半圆轮廓；
(7)分别计算边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N的灰度重心点pointA(xA，yA)及pointB(xB，yB)，(xA，yA)表示边缘轮廓A的灰度重心点的像素坐标，(xB，yB)表示表示边缘轮廓B的灰度重心点的像素坐标；
(8)比较xA与xB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓在图像上位于较小者对应的边缘轮廓的右侧；据此得到非半圆轮廓与半圆轮廓的相对位置；
所述相对位置包括如下两种情况：
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的左侧，与样本的正离焦状态相对应；所述正离焦状态是指样本超出物镜焦距的离焦情况；
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的右侧，与样本的负离焦状态相对应；所述负离焦状态是指样本在物镜焦距内的离焦情况；
(9)样本判定为正离焦状态时，将拟合圆半径rA拟合圆半径rB中的较小者直接代入光斑半径-离焦量线性关系模型；样本判定为负离焦时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者乘以-1代入光斑半径-离焦量关系模型；计算当前样本离焦量；
所述光斑半径-离焦量关系模型具体为：
光斑半径绝对值超出数值rmax时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径绝对值小于数值rmin时，样本处于准焦状态下，rmax表示线性关系区间内的光斑半径最大值，rmin表示线性关系区间内的光斑半径最小值；样本处于正离焦状态或负离焦状态时，根据δ＝k·r+b计算离焦量，δ表示离焦量，k表示线性模型的斜率，r表示当前光斑半径，b表示样本在物镜景深范围内时上述图像处理算法计算所得的光斑半径；其中正离焦状态时k＞0，负离焦状态时k＜0，r＝min{rA，rB}，k、b的具体数值由实验数据进行线性回归分析得到。
所述光斑半径-离焦量关系模型具体根据实验为：
光斑半径绝对值超出数值rmax＝472pixel时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径绝对值小于数值rmin＝42.6pixel时，样本处于准焦状态下；样本处于正离焦、负离焦时，可根据δ＝k·r+b计算离焦量δ(单位微米)，其中正离焦时k＝1.045，b＝-42.6，负离焦时k＝-1.024，b＝42.4pixel，r＝min{rA，rB}。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (2)

1.一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜的自动对焦方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、偏心光束离焦量探测模块发射半圆形偏心激光束照射样本表面，并获取样本反射形成的半圆形光斑图像；
b、计算机处理系统对半圆形光斑图像运行图像处理算法，计算当前视场下样本离焦量；
c、压电物镜驱动器补偿离焦量，完成对焦；
d、显微成像模块获取清晰的样本图像；
e、XY载物台移动样本至下一视场；
所述图像处理算法包括如下步骤：
(1)将成像相机获取的半圆形光斑图像image(x，y)M×N转化为二维灰度图gray(x，y)M×N，(x，y)表示图像像素坐标，M×N表示图像分辨率；
(2)使用自适应窗口中值滤波算法平滑二维灰度图gray(x，y)M×N，输出图像
(3)使用基于OSTU的Canny边缘检测算法：
首先使用OSTU算法计算图像的二值化阈值T，并以此阈值T对图像进行二值化，输出光斑二值化图像binary(x，y)M×N；
然后使用Canny边缘检测处理得到光斑二值化图像binary(x，y)M×N的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N；
(4)将获取的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N作为掩膜处理光斑二值化图像binary(x，y)M×N，得边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N；使用完整边缘轮廓edge(x，y)M×N减去边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N，得边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N；
(5)使用最小二乘法分别拟合边缘轮廓A edgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N，得到对应的边缘轮廓A的拟合圆半径rA和边缘轮廓B的拟合圆半径rB；
(6)比较拟合圆半径rA与拟合圆半径rB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓为非半圆轮廓，较小者对应的边缘轮廓为半圆轮廓；
(7)分别计算边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N的灰度重心点pointA(xA，yA)及pointB(xB，yB)，(xA，yA)表示边缘轮廓A的灰度重心点的像素坐标，(xB，yB)表示表示边缘轮廓B的灰度重心点的像素坐标；
(8)比较xA与xB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓在图像上位于较小者对应的边缘轮廓的右侧；据此得到非半圆轮廓与半圆轮廓的相对位置；
所述相对位置包括如下两种情况：
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的左侧，与样本的正离焦状态相对应；所述正离焦状态是指样本超出物镜焦距的离焦情况；
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的右侧，与样本的负离焦状态相对应；所述负离焦状态是指样本在物镜焦距内的离焦情况；
(9)样本判定为正离焦状态时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者直接代入光斑半径-离焦量线性关系模型；样本判定为负离焦时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者乘以-1代入光斑半径-离焦量关系模型；计算当前样本离焦量；
所述光斑半径-离焦量关系模型具体为：
光斑半径绝对值超出数值rmax时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径绝对值小于数值rmin时，样本处于准焦状态下，rmax表示线性关系区间内的光斑半径最大值，rmin表示线性关系区间内的光斑半径最小值；样本处于正离焦状态或负离焦状态时，根据δ＝k·r+b计算离焦量，6表示离焦量，k表示线性模型的斜率，r表示当前光斑半径，b表示样本在物镜景深范围内时上述图像处理算法计算所得的光斑半径；其中正离焦状态时k＞0，负离焦状态时k＜0，r＝min{rA，rB}，k、b的具体数值由实验数据进行线性回归分析得到。
2.根据权利要求1所述的基于偏心光束法的自动对焦显微镜的自动对焦方法，其特征在于，在对基于偏心光束法的自动对焦显微镜自动对焦前，还需要对自动对焦装置进行检查和调试，包括如下步骤：
首先，调整激光发射光路、光斑反射光路、显微成像光路，使三者光轴重合，保证对焦相机和成像相机的视场一致使得对焦相机能够获取激光光斑图像，成像相机能够获取激光聚焦点处的样本图像；
其次，观察对焦相机上的激光光斑，调整偏心光束离焦量探测模块中的刀口韧边恰好经过光斑圆心点，遮挡住激光束的一半，形成半圆形光斑图像。
CN201510330496.3A 2015-06-15 2015-06-15 基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法 Active CN104932092B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510330496.3A CN104932092B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510330496.3A CN104932092B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104932092A CN104932092A (zh) 2015-09-23
CN104932092B true CN104932092B (zh) 2017-09-08

Family

ID=54119329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510330496.3A Active CN104932092B (zh) 2015-06-15 2015-06-15 基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104932092B (zh)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3374817B1 (en) * 2015-11-11 2020-01-08 Scopio Labs Ltd. Autofocus system for a computational microscope
CN106772983A (zh) * 2015-11-23 2017-05-31 大连光耀辉科技有限公司 一种自动对焦的显微镜
CN106772923B (zh) * 2015-11-24 2021-01-01 睿励科学仪器（上海）有限公司 基于倾斜狭缝的自动对焦方法和系统
CN106094194B (zh) * 2016-08-17 2019-06-14 江浩 显微镜下样本图片的获取方法、成像装置及其获取样本图片的方法
TWI607253B (zh) * 2016-08-24 2017-12-01 由田新技股份有限公司 自動對焦系統、方法及影像檢測儀器
BR112019005787A2 (pt) * 2016-10-06 2019-06-18 Iris Int Inc sistema e métodos de foco dinâmico
CN108422079B (zh) * 2016-11-08 2020-04-10 中国人民解放军空军工程大学航空机务士官学校 一种激光切割系统的控制装置
DE102016122528A1 (de) * 2016-11-22 2018-05-24 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zum Steuern oder Regeln einer Mikroskopbeleuchtung
CN106488138A (zh) * 2016-12-13 2017-03-08 苏州坤镥光电科技有限公司 基于fpga和niosⅱ的显微成像自动对焦系统
CN107144934B (zh) * 2017-06-12 2022-12-27 中国科学院西安光学精密机械研究所 光轴指示调节机构及其指示调节方法
CN107390356A (zh) * 2017-08-28 2017-11-24 电子科技大学 基于激光光斑图像自动聚焦的方法
CN111386439B (zh) * 2017-09-18 2022-07-12 安盟生技股份有限公司 干涉成像设备及其应用
WO2019068045A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Leica Biosystems Imaging, Inc. FIXED Z SCANNING IN TWO AND THREE DIMENSIONS
CN107655872B (zh) * 2017-10-09 2023-11-03 茂莱（南京）仪器有限公司 一种用于基因测序仪的对焦模块及其自动对焦方法
CN107621356B (zh) * 2017-10-31 2024-05-03 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种显微镜焦点偏移测量设备
CN111999878B (zh) * 2017-11-16 2022-04-19 宁波舜宇仪器有限公司 一种显微成像系统及其实时对焦方法
CN107941775B (zh) * 2017-12-28 2020-07-28 清华大学 多光谱显微成像系统
CN108490596A (zh) * 2017-12-29 2018-09-04 三英精控（天津）仪器设备有限公司 一种高速面阵扫描的大视场切片显微成像系统
CN108254853B (zh) * 2018-01-17 2023-08-11 宁波舜宇仪器有限公司 一种显微成像系统及其实时对焦方法
CN108827920B (zh) * 2018-03-21 2022-05-27 苏州国科医工科技发展(集团)有限公司 一种低荧光漂白共聚焦成像方法及系统
CN108646396B (zh) * 2018-04-27 2020-10-02 合肥工业大学 自动对焦显微镜系统
CN108490574B (zh) * 2018-05-11 2023-05-26 中国科学院西安光学精密机械研究所 一种光轴五维指示调节机构及调节方法
CN108731960A (zh) * 2018-05-18 2018-11-02 湖南乾康科技有限公司 一种医疗设备调试检测系统及方法
CN108519665A (zh) * 2018-07-04 2018-09-11 殷跃锋 一种细胞检测显微镜
CN109407299B (zh) * 2018-12-21 2020-12-22 北方工业大学 一种智能光学显微图像采集设备
CN109752832A (zh) * 2019-03-25 2019-05-14 南京泰立瑞信息科技有限公司 一种显微镜镜筒在z轴上的运动控制方法及自动显微镜
CN110260783B (zh) * 2019-07-10 2020-11-10 中国工程物理研究院机械制造工艺研究所 一种干涉显微镜自动对焦装置及方法
CN112399070B (zh) * 2019-08-19 2022-04-19 生昊 一种辅助相机快速聚焦的方法、装置、设备及存储介质
WO2021184169A1 (zh) * 2020-03-16 2021-09-23 中国科学院深圳先进技术研究院 一种用于显微镜的实时自动对焦系统
CN111290112A (zh) * 2020-04-11 2020-06-16 江苏医像信息技术有限公司 一种基于双光源显微镜的控制方法
CN111443477B (zh) * 2020-04-13 2022-12-20 腾讯科技（深圳）有限公司 显微镜自动对焦方法、显微镜系统、医疗设备和存储介质
CN111443476B (zh) * 2020-04-13 2023-04-14 腾讯科技（深圳）有限公司 显微镜自动对焦方法、显微镜系统、医疗设备和存储介质
CN111679418B (zh) * 2020-07-01 2022-06-14 湖南国科智瞳科技有限公司 基于激光图像的显微镜自动聚焦方法、系统及计算机设备
CN112240883B (zh) * 2020-09-30 2021-08-10 华中科技大学 一种自动对正对焦的libs系统
CN113433682B (zh) * 2021-05-24 2022-12-02 南京工程学院 基于偏振差分图像的显微成像自动对焦装置及其方法
CN113655610B (zh) * 2021-07-14 2024-04-26 中国电子科技集团公司第十三研究所 用于光热反射显微热成像的自动对焦方法及控制装置
CN114199884B (zh) * 2021-12-09 2023-06-13 合肥御微半导体技术有限公司 一种晶圆背检设备及其检测方法
CN114459736B (zh) * 2021-12-21 2023-06-09 浙江大学 一种激光对焦成像系统及系统的偏移量的自动化检测方法
CN114778543A (zh) * 2022-05-23 2022-07-22 杭州迪安生物技术有限公司 基于玻片扫描成像的主动对焦模块及其应用
CN115202027A (zh) * 2022-08-26 2022-10-18 徕卡显微系统科技(苏州)有限公司 双相机切换装置、切换方法及显微镜系统
CN116045841B (zh) * 2022-11-23 2023-08-04 深圳市中图仪器股份有限公司 聚焦曲线的拟合方法、拟合装置及测量系统
CN116300129B (zh) * 2023-03-01 2023-09-26 浙江大学 光学镜头定心装置、图像获取装置及方法
CN116026806B (zh) * 2023-03-30 2023-06-09 山东德渡生物技术有限公司 一种荧光显微系统
CN116540393B (zh) * 2023-07-07 2024-01-30 睿励科学仪器（上海）有限公司 自动对焦系统及方法、半导体缺陷检测系统及方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN2051359U (zh) * 1989-07-08 1990-01-17 清华大学 内光路偏心光束自动调焦仪
US7297910B2 (en) * 2005-12-30 2007-11-20 General Electric Company System and method for utilizing an autofocus feature in an automated microscope
TWI428654B (zh) * 2010-11-23 2014-03-01 Ind Tech Res Inst 自動聚焦模組與其方法
CN104317041B (zh) * 2014-09-30 2016-11-02 无锡微焦科技有限公司 一种自聚焦光路系统

Also Published As

Publication number Publication date
CN104932092A (zh) 2015-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104932092B (zh) 基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法
CN107065159A (zh) 一种基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置及迭代重构方法
CN103293162B (zh) 用于球面光学元件表面疵病暗场检测的照明系统及方法
CN101660894B (zh) 基于平行光照明的多目视觉检测装置及方法
CN113568153B (zh) 一种显微成像设备以及纳米尺度三维形貌测量系统
CN109712072B (zh) 基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法
CN105472265B (zh) 一种获取高动态范围图像的装置和方法
CN103226234A (zh) 别汉棱镜光轴的调试方法
CN105222725B (zh) 一种基于光谱分析的高清图像动态采集方法
CN110646933A (zh) 基于多深度平面显微镜的自动聚焦系统和方法
CN116594168A (zh) 一种基于可变焦透镜的快速大景深显微成像系统及方法
CN111912835A (zh) 一种具备烧蚀量测量功能的libs装置及方法
CN110763153A (zh) 多光谱大视场微观三维形貌测量装置及方法
CN110579869A (zh) 一种幅值调制径向偏振照明共焦显微成像方法及装置
CN108305290B (zh) 一种动目标的精确测谱方法
CN108007382B (zh) 基于结构光照明的面形测量装置和方法
TWI521295B (zh) 斜軸式顯微自動對焦系統及方法
CN112595497A (zh) 一种基于机器视觉的数字化刀口仪检验方法及系统
CN109945803B (zh) 横向相减激光差动共焦柱面曲率半径测量方法
CN101251643B (zh) 具有角分辨率的长焦距反射式显微望远镜
CN105596088B (zh) 基于皮肤共焦系统的可调节三轴成像机构
CN114185151A (zh) 一种具有长入瞳距的双波段像方远心扫描物镜
CN202393582U (zh) 一种光学元件反射率检测仪
CN201173989Y (zh) 具有角分辨率的长焦距反射式显微望远镜
CN115826075B (zh) 白天强天光背景暗弱目标识别装置及识别方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant