CN111290112A - 一种基于双光源显微镜的控制方法 - Google Patents

一种基于双光源显微镜的控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于双光源显微镜的控制方法，包括以下步骤：S1、开启位于载物台下方的下光源，位于载物台上方的CCD相机拍摄样本的阴影图片；关闭所述下光源；S2、处理模块获取阴影图片并对其进行图像识别，识别出多个目标物并确定它们的中心位坐标和目标物所在的最小圆形区域；S3、水平运动模块根据中心位坐标控制物镜移动到一个目标物的上方并且使物镜的光轴穿过目标物的中心位；这种基于双光源显微镜的控制方法针对透明不规则的目标物采用双光源来进行对焦，下光源从下方照射样本，CCD相机采集的阴影图片更适于处理模块来进行图像识别，上光源产生的半圆形光速能够快速确定目标物所在中心位的离焦量，拍摄多张最小圆形区域中目标物的清晰图片。

Description

一种基于双光源显微镜的控制方法
技术领域
本发明涉及电子生物显微镜技术领域，尤其涉及一种基于双光源显微镜的控制方法。
背景技术
生物显微镜是一种用来观察生物切片、生物细胞、细菌以及活体组织培养、流质沉淀等也可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体的精密光学仪器。生物显微镜用来供医疗卫生单位、高等院校、研究院所用于微生物、细胞、细菌、组织培养、悬浮体、沉淀物等的观察，可连续观察细胞、细菌等在培养液中繁殖分裂的过程等。在细胞学、寄生虫学、肿瘤学、免疫学、遗传工程学、工业微生物学、植物学等领域中应用广泛。
现有技术中，一般通过手动或自动的方式进行对焦，手动对焦的方式存在效率低、准确度低的缺陷，利用显微镜进行自动对焦的方式能够提高对焦效率，例如公开号为CN104932092B的中国专利公开了一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法，硬件构成包括偏心光束离焦量探测模块、显微成像模块、压电物镜驱动器、XY载物台及计算机处理系统。离焦量探测模块发射半圆形激光束照射样本表面，并获取样本反射形成的半圆形光斑图像；计算机处理系统经过自适应中值滤波、基于OSTU的Canny边缘检测、最小二乘法拟合等算法处理灰度化的光斑图像可得到光斑半径，根据半径-离焦量的线性关系模型，可计算该视场下样本离焦量；压电物镜驱动器带动物镜补偿离焦量；对焦完成后，显微成像模块获取清晰的样本图像。由于离焦量探测模块发射半圆形激光束照射样本表面，并获取样本反射形成的半圆形光斑图像，所以这种对焦方法较适用于比较规则的目标，例如细胞、病毒这样的个体，但是对于透明的、不规则的，例如染色体，要想获得清晰的样本图像则较为困难。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为了解决现有技术中生物显微镜在面对透明的、不规则的样本时难以对焦的问题，本发明提供了一种基于双光源显微镜的控制方法来解决上述问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于双光源显微镜的控制方法，包括以下步骤：
S1、开启位于载物台下方的下光源，位于载物台上方的CCD相机拍摄样本的阴影图片；关闭所述下光源；
S2、处理模块获取阴影图片并对其进行图像识别，识别出多个目标物并确定它们的中心位坐标和目标物所在的最小圆形区域；
S3、水平运动模块根据中心位坐标控制物镜移动到一个目标物的上方并且使物镜的光轴穿过目标物的中心位；
S4、开启上光源，CCD相机拍摄目标物的半圆光斑图片；
S5、处理模块获取半圆光斑图片并对图像进行处理，计算出物镜当前位置的离焦量并转换成物镜的对焦运动量；
S6、竖直运动模块根据对焦运动量控制物镜运动至准确对焦；
S7、水平运动模块控制物镜在最小圆形区域内平移，同时竖直运动模块控制物镜在(-a，a)之间上下运动，CCD相机拍摄多张目标物的图像；
S8、水平运动模块根据另一个中心位坐标控制物镜移动到另一个目标物的上方并且使物镜的光轴穿过目标物的中心位；
S9、循环执行步骤S4-S8，直至获取阴影图片中所有目标物的清晰图像。
作为优选，0≤a≤0.2μm。
作为优选，还包括以下步骤：
处理模块对每个目标物的多个图像从中心位向外圆周的顺序进行排列。
具体的，将半圆光斑图片image(x，y)M×N转化为二维灰度图gray(x，y)M×N，(x，y)表示图像像素坐标，M×N表示图像分辨率；
使用自适应窗口中值滤波算法平滑二维灰度图gray(x，y)M×N，输出图像
Figure BDA0002446996810000031
使用基于OSTU的Canny边缘检测算法：
首先使用OSTU算法计算图像
Figure BDA0002446996810000032
的二值化阈值T，并以此阈值T对图像
Figure BDA0002446996810000033
进行二值化，输出光斑二值化图像binary(x，y)M×N；
然后使用Canny边缘检测处理得到光斑二值化图像binary(x，y)M×N的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N；
将获取的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N作为掩膜处理光斑二值化图像binary(x，y)M×N，得边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N；使用完整边缘轮廓edge(x，y)M×N减去边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N，得边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N；
使用最小二乘法分别拟合边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N，得到对应的边缘轮廓A的拟合圆半径rA和边缘轮廓B的拟合圆半径rB；
比较拟合圆半径rA与拟合圆半径rB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓为非半圆轮廓，较小者对应的边缘轮廓为半圆轮廓；
分别计算边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N的灰度重心点pointA(xA，yA)及pointB(xB，yB)，(xA，yA)表示边缘轮廓A的灰度重心点的像素坐标，(xB，yB)表示表示边缘轮廓B的灰度重心点的像素坐标；
比较xA与xB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓在图像上位于较小者对应的边缘轮廓的右侧；据此得到非半圆轮廓与半圆轮廓的相对位置；
所述相对位置包括如下两种情况：
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的左侧，与目标物的正离焦状态相对应；所述正离焦状态是指目标物超出物镜焦距的离焦情况；
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的右侧，与目标物的负离焦状态相对应；所述负离焦状态是指目标物在物镜焦距内的离焦情况；
目标物判定为正离焦状态时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者直接代入光斑半径-离焦量线性关系模型；目标物判定为负离焦时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者乘以-1代入光斑半径-离焦量关系模型；计算当前目标物离焦量；
所述光斑半径-离焦量关系模型具体为：
光斑半径绝对值超出数值rmax时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径绝对值小于数值rmin时，样本处于准焦状态下，rmax表示线性关系区间内的光斑半径最大值，rmin表示线性关系区间内的光斑半径最小值；样本处于正离焦状态或负离焦状态时，根据δ＝k·r+b计算离焦量，δ表示离焦量，k表示线性模型的斜率，r表示当前光斑半径，b表示目标物在物镜景深范围内时上述图像处理算法计算所得的光斑半径；其中正离焦状态时k＞0，负离焦状态时k＜0，r＝min{rA，rB}，k、b的具体数值由实验数据进行线性回归分析得到。
具体的，所述上光源为激光光源，所述下光源为LED光源。
本发明的有益效果是，这种基于双光源显微镜的控制方法针对透明不规则的目标物采用双光源来进行对焦，下光源从下方照射样本，CCD相机采集的阴影图片更适于处理模块来进行图像识别，上光源产生的半圆形光速能够快速确定目标物所在中心位的离焦量，然后再拍摄多张最小圆形区域中目标物的清晰图片。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的一种基于双光源显微镜的控制方法的最优实施例的流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。此外，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
流程图中或在此以其他方式描述的任何过程或方法描述可以被理解为，表示包括一个或更多个用于实现特定逻辑功能或过程的步骤的可执行指令的代码的模块、片段或部分，并且本发明的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所示出或讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能，这应被本发明的实施例所属技术领域的技术人员所理解。
如图1所示，本发明提供了一种基于双光源显微镜的控制方法，包括以下步骤：
S1、开启位于载物台下方的下光源，位于载物台上方的CCD相机拍摄样本的阴影图片；关闭下光源；下光源为LED光源；
S2、处理模块获取阴影图片并对其进行图像识别，识别出多个目标物并确定它们的中心位坐标和目标物所在的最小圆形区域；对于图像识别，可以利用现有技术中的图片深度学习方法将目标物作为对象进行深度学习，然后使用训练完成后的模型对阴影图片进行识别。
S3、水平运动模块根据中心位坐标控制物镜移动到一个目标物的上方并且使物镜的光轴穿过目标物的中心位；
S4、开启上光源，CCD相机拍摄目标物的半圆光斑图片；上光源为激光光源；
S5、处理模块获取半圆光斑图片并对图像进行处理，计算出物镜当前位置的离焦量并转换成物镜的对焦运动量；此实例中，处理模块对半圆光斑图像的处理方式为：
将半圆光斑图片image(x，y)M×N转化为二维灰度图gray(x，y)M×N，(x，y)表示图像像素坐标，M×N表示图像分辨率；
使用自适应窗口中值滤波算法平滑二维灰度图gray(x，y)M×N，输出图像
Figure BDA0002446996810000071
使用基于OSTU的Canny边缘检测算法：
首先使用OSTU算法计算图像
Figure BDA0002446996810000072
的二值化阈值T，并以此阈值T对图像
Figure BDA0002446996810000073
进行二值化，输出光斑二值化图像binary(x，y)M×N；
然后使用Canny边缘检测处理得到光斑二值化图像binary(x，y)M×N的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N；
将获取的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N作为掩膜处理光斑二值化图像binary(x，y)M×N，得边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N；使用完整边缘轮廓edge(x，y)M×N减去边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N，得边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N；
使用最小二乘法分别拟合边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N，得到对应的边缘轮廓A的拟合圆半径rA和边缘轮廓B的拟合圆半径rB；
比较拟合圆半径rA与拟合圆半径rB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓为非半圆轮廓，较小者对应的边缘轮廓为半圆轮廓；
分别计算边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N的灰度重心点pointA(xA，yA)及pointB(xB，yB)，(xA，yA)表示边缘轮廓A的灰度重心点的像素坐标，(xB，yB)表示表示边缘轮廓B的灰度重心点的像素坐标；
比较xA与xB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓在图像上位于较小者对应的边缘轮廓的右侧；据此得到非半圆轮廓与半圆轮廓的相对位置；
相对位置包括如下两种情况：
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的左侧，与目标物的正离焦状态相对应；正离焦状态是指目标物超出物镜焦距的离焦情况；
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的右侧，与目标物的负离焦状态相对应；负离焦状态是指目标物在物镜焦距内的离焦情况；
目标物判定为正离焦状态时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者直接代入光斑半径-离焦量线性关系模型；目标物判定为负离焦时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者乘以-1代入光斑半径-离焦量关系模型；计算当前目标物离焦量；
光斑半径-离焦量关系模型具体为：
光斑半径绝对值超出数值rmax时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径绝对值小于数值rmin时，样本处于准焦状态下，rmax表示线性关系区间内的光斑半径最大值，rmin表示线性关系区间内的光斑半径最小值；样本处于正离焦状态或负离焦状态时，根据δ＝k·r+b计算离焦量，δ表示离焦量，k表示线性模型的斜率，r表示当前光斑半径，b表示目标物在物镜景深范围内时上述图像处理算法计算所得的光斑半径；其中正离焦状态时k＞0，负离焦状态时k＜0，r＝min{rA，rB}，k、b的具体数值由实验数据进行线性回归分析得到。
S6、竖直运动模块根据对焦运动量控制物镜运动至准确对焦；
S7、水平运动模块控制物镜在最小圆形区域内平移，同时竖直运动模块控制物镜在(-a，a)之间上下运动，此实例中，a＝0.1μm。CCD相机拍摄多张目标物的图像；处理模块获取目标物的多张图像后，按照从中心位向外圆周的顺序进行排列，方便后期人员的筛选和观察。
S8、水平运动模块根据另一个中心位坐标控制物镜移动到另一个目标物的上方并且使物镜的光轴穿过目标物的中心位；
S9、循环执行步骤S4-S8，直至获取阴影图片中所有目标物的清晰图像。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对所述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (5)

1.一种基于双光源显微镜的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、开启位于载物台下方的下光源，位于载物台上方的CCD相机拍摄样本的阴影图片；关闭所述下光源；
S2、处理模块获取阴影图片并对其进行图像识别，识别出多个目标物并确定它们的中心位坐标和目标物所在的最小圆形区域；
S3、水平运动模块根据中心位坐标控制物镜移动到一个目标物的上方并且使物镜的光轴穿过目标物的中心位；
S4、开启上光源，CCD相机拍摄目标物的半圆光斑图片；
S5、处理模块获取半圆光斑图片并对图像进行处理，计算出物镜当前位置的离焦量并转换成物镜的对焦运动量；
S6、竖直运动模块根据对焦运动量控制物镜运动至准确对焦；
S7、水平运动模块控制物镜在最小圆形区域内平移，同时竖直运动模块控制物镜在(-a，a)之间上下运动，CCD相机拍摄多张目标物的图像；
S8、水平运动模块根据另一个中心位坐标控制物镜移动到另一个目标物的上方并且使物镜的光轴穿过目标物的中心位；
S9、循环执行步骤S4-S8，直至获取阴影图片中所有目标物的清晰图像。
2.如权利要求1所述的一种基于双光源显微镜的控制方法，其特征在于：
0≤a≤0.2μm。
3.如权利要求2所述的一种基于双光源显微镜的控制方法，其特征在于，还包括以下步骤：
处理模块对每个目标物的多个图像从中心位向外圆周的顺序进行排列。
4.如权利要求3所述的一种基于双光源显微镜的控制方法，其特征在于：
处理模块将半圆光斑图片image(x，y)M×N转化为二维灰度图gray(x，y)M×N，(x，y)表示图像像素坐标，M×N表示图像分辨率；
使用自适应窗口中值滤波算法平滑二维灰度图gray(x，y)M×N，输出图像
Figure FDA0002446996800000021
使用基于OSTU的Canny边缘检测算法：
首先使用OSTU算法计算图像
Figure FDA0002446996800000022
的二值化阈值T，并以此阈值T对图像
Figure FDA0002446996800000023
进行二值化，输出光斑二值化图像binary(x，y)M×N；
然后使用Canny边缘检测处理得到光斑二值化图像binary(x，y)M×N的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N；
将获取的完整边缘轮廓edge(x，y)M×N作为掩膜处理光斑二值化图像binary(x，y)M×N，得边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N；使用完整边缘轮廓edge(x，y)M×N减去边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N，得边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N；
使用最小二乘法分别拟合边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N，得到对应的边缘轮廓A的拟合圆半径rA和边缘轮廓B的拟合圆半径rB；
比较拟合圆半径rA与拟合圆半径rB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓为非半圆轮廓，较小者对应的边缘轮廓为半圆轮廓；
分别计算边缘轮廓AedgeA(x，y)M×N和边缘轮廓BedgeB(x，y)M×N的灰度重心点pointA(xA，yA)及pointB(xB，yB)，(xA，yA)表示边缘轮廓A的灰度重心点的像素坐标，(xB，yB)表示表示边缘轮廓B的灰度重心点的像素坐标；
比较xA与xB的大小，其中较大者对应的边缘轮廓在图像上位于较小者对应的边缘轮廓的右侧；据此得到非半圆轮廓与半圆轮廓的相对位置；
所述相对位置包括如下两种情况：
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的左侧，与目标物的正离焦状态相对应；所述正离焦状态是指目标物超出物镜焦距的离焦情况；
-非半圆轮廓位于半圆轮廓的右侧，与目标物的负离焦状态相对应；所述负离焦状态是指目标物在物镜焦距内的离焦情况；
目标物判定为正离焦状态时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者直接代入光斑半径-离焦量线性关系模型；目标物判定为负离焦时，将拟合圆半径rA、拟合圆半径rB中的较小者乘以-1代入光斑半径-离焦量关系模型；计算当前目标物离焦量；
所述光斑半径-离焦量关系模型具体为：
光斑半径绝对值超出数值rmax时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径绝对值小于数值rmin时，样本处于准焦状态下，rmax表示线性关系区间内的光斑半径最大值，rmin表示线性关系区间内的光斑半径最小值；样本处于正离焦状态或负离焦状态时，根据δ＝k·r+b计算离焦量，δ表示离焦量，k表示线性模型的斜率，r表示当前光斑半径，b表示目标物在物镜景深范围内时上述图像处理算法计算所得的光斑半径；其中正离焦状态时k＞0，负离焦状态时k＜0，r＝min{rA，rB}，k、b的具体数值由实验数据进行线性回归分析得到。
5.如权利要求4所述的一种基于双光源显微镜的控制方法，其特征在于：
所述上光源为激光光源，所述下光源为LED光源。
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