WO2010084720A1 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
これの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。
自家蛍光は、通常、蛍光色素の発する蛍光に比べて蛍光強度は極めて弱いが、場合によっては強い蛍光強度を持つ。この場合、蛍光色素の発する蛍光に比べて依然として蛍光強度が十分に弱ければ、蛍光色素の発する蛍光を十分なSN比で計測することができる。しかし、蛍光色素の発する蛍光の蛍光強度が十分に強くない場合、SN比が低下し、この蛍光の計測が難しくなる。自家蛍光が弱くても、同様に蛍光色素の発する蛍光が弱ければ同様の問題が発生する。
すなわち、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに照射し、このときの標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集する。レーザ光を照射した標識サンプルの蛍光が1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列を作成する。各検出センサから収集された、位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、このベクトルに、作成された補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプルが発する蛍光の蛍光強度を求める。
(A)測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射する光源部と、
(B)照射光に照射された測定対象物が発する第1の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第2の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第1の蛍光に対応して設定された第1の波長帯域で前記第1の蛍光を受光し、第1の蛍光信号を出力する第1の受光素子と、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で測定対象物の発する第2の蛍光を受光し、第2の蛍光信号を出力する第2の受光素子とを含む受光部と、
(C)出力した前記第1の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第1の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第1の蛍光データを生成するとともに、出力した前記第2の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第2の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第2の蛍光データを生成する第1の処理部と、
(D)生成した前記第2の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成する蛍光除去部と、生成された前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光強度を算出する蛍光強度算出部とを含む第2の処理部と、を有する。
(E)測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射するステップと、
(F)照射光に照射された測定対象物が発する第1の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第2の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第1の蛍光に対応して設定された第1の波長帯域で前記第1の蛍光を受光し、第1の蛍光信号を生成するとともに、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で測定対象物の発する第2の蛍光を受光し、第2の蛍光信号を生成するステップと、
(G)生成した前記第1の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第1の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第1の蛍光データを生成するとともに、生成した前記第2の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第2の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第2の蛍光データを生成するステップと、
(H)生成した前記第2の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成し、生成された前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光強度を算出するステップと、を有する。
12 試料
20 信号処理装置
22 レーザ光源部
22a 光源
23a,26b ダイクロイックミラー
23b.26a レンズ系
24,26 受光部
26c1,26c2 バンドパスフィルタ
27a,27b 光電変換器
28 制御・処理部
30 管路
32 回収容器
34 レーザドライバ
48a,48b パワースプリッタ
40 信号生成部
42 信号処理部
44 システムコントローラ
46 発振器
50,52,54a,54b,64 アンプ
58a,58b IQミキサ
62 ローパスフィルタ
66 A/D変換器
80 分析装置
81 CPU
82 メモリ
83 分析部
86 自家蛍光除去部
90 蛍光強度算出部
92 位相遅れ算出部
94 蛍光緩和時間算出部
図1は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ10の概略構成図である。
制御・処理部28は、レーザ光源部22からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料12からの蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路30は、高速流を形成するシース液に含ませて試料12を流してラミナーシースフローを形成する。
管路30の出口には、回収容器32が設けられている。フローサイトメータ10には、レーザ光の照射により短時間内に試料12中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
レーザ光源部22は、可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する部分である。
レーザ光源部22は、光源(レーザダイオード)22aを有する。光源22aは、波長408nmのレーザ光LをCW(連続波)レーザ光として出射し、かつこのCWレーザ光Lの強度を所定の周波数で強度変調しながら出射する。さらに、レーザ光源部22は、レンズ系23と、レーザドライバ34と、を有する。
レンズ系23は、レーザ光Lを管路30中の測定点に集束させる。レーザドライバ34は、レーザ光源部22を駆動する。
図3は、受光部26の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
レンズ系26aは、受光部26に入射した蛍光を光電変換器27a,27bの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー26bは、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ26c1,26c2でフィルタリングして光電変換器27a,27bで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー26bの反射波長帯域およびバンドパスフィルタ26c1,26c2の透過波長帯域が設定されている。
図4には、一例として、蛍光蛋白Xの発する蛍光のスペクトラムSと、レーザ光Lの波長408nmと、第1の波長帯域FL1と、第2の波長帯域FLbと、を示している。
信号生成部40は、レーザ光Lの強度を所定の周波数fで変調するための変調信号を生成する。
具体的には、信号生成部40は、発振器46、パワースプリッタ48及びアンプ50,52を有する。信号生成部40は、生成されパワースプリッタ48で分割された変調信号をアンプ50で増幅した後、レーザ光源部22のレーザドライバ34に供給するとともに、パワースプリッタ48で分割されアンプ52で増幅した変調信号を信号処理部42に供給する。信号処理部42に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機27a,27bから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の信号であり、10~200MHzの範囲の周波数に設定される。発振器46は、周波数fの信号を発振し変調信号を生成する。
パワースプリッタ56は、信号生成部40から供給された変調信号を2分割し、IQミキサ58a,58bに分配する。
分析部83は、自家蛍光除去部86と、蛍光強度算出部90と、位相遅れ算出部92と、蛍光緩和時間算出部94とを有する。
また、試料12を計測したとき求められる第2の波長帯域FLbにおける蛍光データを複素数表示でAbeiΘbとし、第1の波長帯域FL1における蛍光データを複素数表示でA1eiΘ1とする。このとき、A1eiθ1-a1/ab・ei(θ1-θb)・AbeiΘbが計算される。この計算結果が第1の波長帯域FL1の蛍光データから自家蛍光の蛍光データが除去された蛍光データとなる。
このように、試料12の測定で得られる第2の波長帯域FLbの蛍光データに第1の定数を乗算して、a1/ab・ei(θ1-θb)・AbeiΘbを得ることで、第1の波長帯域FL1に含まれる自家蛍光の蛍光データを推定することができる。この第1の定数は、分析装置80のメモリ84に記憶されている。
こうして、自家蛍光の蛍光データが除去された蛍光データは蛍光強度算出部90.位相遅れ算出部92に供給される。
位相遅れ算出部92は、蛍光データA1について、複素数の偏角(tan-1(蛍光データのIm成分/蛍光データのRe成分))を、位相遅れθとして算出する部分である。
蛍光緩和時間算出部94は、位相遅れ算出部92で算出されたθを用いて、蛍光緩和時間τをτ=1/(2πf)・tan(θ)の式にしたがって算出する部分である。ここで、fは、レーザ光Lの強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ=1/(2πf)・tan(θ)の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、1次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
算出された蛍光強度、位相遅れθおよび蛍光緩和時間τは、図示されないプリンタやディスプレイに結果情報として出力される。また、この結果情報は、試料12が管路30の測定点を通過する度に測定される結果として、統計処理の対象とされる。
フローサイトメータ10は以上のように構成される。
まず、蛍光蛋白Xがレーザ光Lを吸収し、自家蛍光に対して強い強度で蛍光するような波長を持つレーザ光Lを用意し、周波数fで強度変調して、光源部22から出射する。
出力した蛍光信号のそれぞれを、制御・処理部28において、周波数fの変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データA1’を生成する。さらに、第2の波長帯域FLbの蛍光信号を、周波数fの変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データB1’を生成する。
特に、第2の蛍光を、測定対象粒子の発する、波長帯域の広いブロードなスペクトル分布を持つ自家蛍光とすることにより、第1の蛍光から迅速かつ容易に自家蛍光を除去することができる。
Claims (10)
- 測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射する光源部と、
照射光に照射された測定対象物が発する第1の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第2の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第1の蛍光に対応して設定された第1の波長帯域で前記第1の蛍光を受光し、第1の蛍光信号を出力する第1の受光素子と、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で測定対象物の発する第2の蛍光を受光し、第2の蛍光信号を出力する第2の受光素子とを含む受光部と、
出力した前記第1の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第1の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第1の蛍光データを生成するとともに、出力した前記第2の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第2の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第2の蛍光データを生成する第1の処理部と、
生成した前記第2の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成する蛍光除去部と、生成された前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光強度を算出する蛍光強度算出部とを含む第2の処理部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。 - 前記測定対象物は、蛍光色素が測定対象粒子に付着して構成され、
前記第1の蛍光は、前記蛍光色素が発する蛍光であり、
前記第2の蛍光は、前記測定対象粒子が発する自家蛍光、あるいは、前記測定対象粒子を懸濁する溶液の自家蛍光である、請求項1に記載の蛍光検出装置。 - 前記第2の波長帯域は、前記第1の蛍光の持つ波長の範囲から外れた領域に設定される請求項2に記載の蛍光検出装置。
- 前記蛍光除去部で用いる前記定数は、蛍光色素が付着していない測定対象粒子について、前記光源部と前記受光部と前記第1の処理部とを用いて得られる、測定対象粒子の発する自家蛍光の前記第1の波長帯域における蛍光データを、測定対象粒子の発する自家蛍光の前記第2の波長帯域における蛍光データで除算して得られる比の値である請求項2または3に記載の蛍光検出装置。
- 前記第2の処理部は、蛍光強度の他、前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光緩和時間を算出する蛍光緩和算出部を含む請求項1~4のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。
- 測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射するステップと、
照射光に照射された測定対象物が発する第1の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第2の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第1の蛍光に対応して設定された第1の波長帯域で前記第1の蛍光を受光し、第1の蛍光信号を生成するとともに、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で測定対象物の発する第2の蛍光を受光し、第2の蛍光信号を生成するステップと、
生成した前記第1の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第1の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第1の蛍光データを生成するとともに、生成した前記第2の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第2の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第2の蛍光データを生成するステップと、
生成した前記第2の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成し、生成された前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。 - 前記測定対象物は、蛍光色素が測定対象粒子に付着して構成され、
前記第1の蛍光は、前記蛍光色素が発する蛍光であり、
前記第2の蛍光は、前記測定対象粒子が発する自家蛍光、あるいは、前記測定対象粒子を懸濁する溶液の自家蛍光である、請求項6に記載の蛍光検出方法。 - 前記第2の波長帯域は、前記第1の蛍光の持つ波長の範囲から外れた領域に設定される請求項7に記載の蛍光検出方法。
- 前記定数は、蛍光色素が付着していない測定対象粒子を用いた処理方法により得られ、
前記処理方法は、
前記レーザ光を、前記周波数で強度変調して、前記測定対象物の照射光として出射するステップと、
前記第1の波長帯域で前記自家蛍光を受光し、第1の自家蛍光信号を生成するとともに、前記第2の波長帯域で前記自家蛍光を受光し、第2の自家蛍光信号を生成するステップと、
生成された前記第1の自家蛍光信号の、前記第2の自家蛍光信号に対する比率を前記定数として算出するステップと、を含む請求項7または8に記載の蛍光検出方法。 - さらに、蛍光強度の他、前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップを含む請求項6~9のいずれか1項に記載の蛍光検出方法。
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