WO2010084720A1 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents

蛍光検出装置及び蛍光検出方法 Download PDF

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Abstract

 測定対象物が発する自家蛍光を除去するために、まず、強度変調したレーザ光の照射を受けた測定対象物が発する蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する自家蛍光の強度に比べて高くなるように、第1の波長帯域で測定対象物の蛍光を受光し、さらに、第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で自家蛍光を受光する。生成した第1の蛍光の蛍光信号と自家蛍光の蛍光信号を、レーザ光の変調信号とミキシングすることにより、第1の蛍光データおよび自家蛍光の蛍光データを生成する。この自家蛍光の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成する。この第3の蛍光データを用いて蛍光強度を算出する。

Description

蛍光検出装置及び蛍光検出方法
 本発明は、測定対象物がレーザ光の照射を受けることにより発する蛍光を受光し、このとき得られる複数の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。
 医療、生物分野では、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光をフォトマルチプライヤやアバランシュフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の測定対象物の種類や頻度や特性を分析するフローサイトメータが広く用いられている。
 具体的には、フローサイトメータは、懸濁液中の細胞、DNA、RNA、酵素、蛋白等の生体物質等を含んだ測定対象物を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒10m以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してラミナーシースフローを形成する。フローサイトメータは、このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで生体物質等を特定する。
 このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のDNA、RNA、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
 これの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。
 例えば、細胞や人工的に作製されたマイクロビーズ等のサンプルを計測する場合、測定したい情報は、サンプルに標識した蛍光色素の蛍光の情報(蛍光色や蛍光強度)である。しかし、照射するレーザ光によって発する蛍光は、標識に用いた蛍光色素のみが発するのではなく、細胞やマイクロビーズ等のサンプル自体が発し、あるいは、これらのサンプルを懸濁しているバッファー液自体も発する。これらサンプル自体あるいはバッファー液の発する蛍光の波長帯域は広く、蛍光色素が発する蛍光の波長帯域と重なる場合が多い、このため、サンプル自体あるいはバッファー液の発する蛍光は、除去すべき自家蛍光である。
 自家蛍光は、通常、蛍光色素の発する蛍光に比べて蛍光強度は極めて弱いが、場合によっては強い蛍光強度を持つ。この場合、蛍光色素の発する蛍光に比べて依然として蛍光強度が十分に弱ければ、蛍光色素の発する蛍光を十分なSN比で計測することができる。しかし、蛍光色素の発する蛍光の蛍光強度が十分に強くない場合、SN比が低下し、この蛍光の計測が難しくなる。自家蛍光が弱くても、同様に蛍光色素の発する蛍光が弱ければ同様の問題が発生する。
 下記特許文献1では、以下の蛍光強度算出方法が記載されている。
 すなわち、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに照射し、このときの標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集する。レーザ光を照射した標識サンプルの蛍光が1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列を作成する。各検出センサから収集された、位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、このベクトルに、作成された補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプルが発する蛍光の蛍光強度を求める。
特開2007-127415号公報
 上記方法では、正確な蛍光強度を算出することができるが、補正変換行列を作成し、その行列の逆行列を計算する必要があるため、迅速かつ容易に蛍光強度を求めることは難しい。
 そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物がレーザ光の照射を受けることにより発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行うとき、迅速かつ容易に蛍光強度を求めることのできる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
 本発明の一態様は、測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
(A)測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射する光源部と、
(B)照射光に照射された測定対象物が発する第1の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第2の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第1の蛍光に対応して設定された第1の波長帯域で前記第1の蛍光を受光し、第1の蛍光信号を出力する第1の受光素子と、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で測定対象物の発する第2の蛍光を受光し、第2の蛍光信号を出力する第2の受光素子とを含む受光部と、
(C)出力した前記第1の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第1の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第1の蛍光データを生成するとともに、出力した前記第2の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第2の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第2の蛍光データを生成する第1の処理部と、
(D)生成した前記第2の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成する蛍光除去部と、生成された前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光強度を算出する蛍光強度算出部とを含む第2の処理部と、を有する。
 さらに、本発明の別の態様は、測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
(E)測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射するステップと、
(F)照射光に照射された測定対象物が発する第1の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第2の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第1の蛍光に対応して設定された第1の波長帯域で前記第1の蛍光を受光し、第1の蛍光信号を生成するとともに、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で測定対象物の発する第2の蛍光を受光し、第2の蛍光信号を生成するステップと、
(G)生成した前記第1の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第1の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第1の蛍光データを生成するとともに、生成した前記第2の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第2の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第2の蛍光データを生成するステップと、
(H)生成した前記第2の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成し、生成された前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光強度を算出するステップと、を有する。
 上述の蛍光検出装置および蛍光検出方法は、従来に比べて、第1の蛍光について迅速かつ容易に蛍光強度を算出することができる。
本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 図1に示すフローサイトメータに用いる光源部の一例を示す概略構成図である。 図1に示すフローサイトメータに用いる受光部の一例を示す概略構成図である。 蛍光蛋白の発する蛍光のスペクトラムSと、レーザ光Lの波長と、第1の波長帯域と、第2の波長帯域と、の関係を示す図である。 図1に示すフローサイトメータに用いる制御・処理部を中心に示したフローサイトメータの主要部の概略構成図である。 図1に示すフローサイトメータに用いる分析装置の一例を示す概略構成図である。 自家蛍光の除去方法を説明する模式図である。
 10 フローサイトメータ
 12 試料
 20 信号処理装置
 22 レーザ光源部
 22a 光源
 23a,26b ダイクロイックミラー
 23b.26a レンズ系
 24,26 受光部
 26c1,26c2 バンドパスフィルタ
 27a,27b 光電変換器
 28 制御・処理部
 30 管路
 32 回収容器
 34 レーザドライバ
 48a,48b パワースプリッタ
 40 信号生成部
 42 信号処理部
 44 システムコントローラ
 46 発振器
 50,52,54a,54b,64 アンプ
 58a,58b IQミキサ
 62 ローパスフィルタ
 66 A/D変換器
 80 分析装置
 81 CPU
 82 メモリ
 83 分析部
 86 自家蛍光除去部
 90 蛍光強度算出部
 92 位相遅れ算出部
 94 蛍光緩和時間算出部
 以下、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
 図1は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ10の概略構成図である。
 フローサイトメータ10は、レーザ光を測定対象とする試料12に照射し、試料12が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理する信号処理装置20と、信号処理装置20で得られた処理結果から蛍光強度や蛍光緩和時間を算出する分析装置(コンピュータ)80とを有する。
 以降では、試料12として細胞に蛍光蛋白Xが付着したものを用いて以降説明する。試料12は、バッファー液に浸された状態で、シース液とともに流されてラミナーシースフローを作り、フローセルを流れ、レーザ光に照射される。しかし、本発明では、試料12の替わりに、2つ以上の蛍光色素が発する蛍光に対してこれらの蛍光色素が付着している各細胞やバッファー液等が発する自家蛍光を除去することもできる。
 信号処理装置20は、レーザ光源部22と、受光部24,26と、制御・処理部28と、管路30と、を有する。
 制御・処理部28は、レーザ光源部22からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料12からの蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路30は、高速流を形成するシース液に含ませて試料12を流してラミナーシースフローを形成する。
 管路30の出口には、回収容器32が設けられている。フローサイトメータ10には、レーザ光の照射により短時間内に試料12中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
 レーザ光源部22は、所定の波長のレーザ光、例えばλ=408nmのレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路30中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料12の測定点が形成される。
 図2は、レーザ光源部22の構成の一例を示す図である。
 レーザ光源部22は、可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する部分である。
 レーザ光源部22は、光源(レーザダイオード)22aを有する。光源22aは、波長408nmのレーザ光LをCW(連続波)レーザ光として出射し、かつこのCWレーザ光Lの強度を所定の周波数で強度変調しながら出射する。さらに、レーザ光源部22は、レンズ系23と、レーザドライバ34と、を有する。
 レンズ系23は、レーザ光Lを管路30中の測定点に集束させる。レーザドライバ34は、レーザ光源部22を駆動する。
 このレーザ光Lを出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光Lは、例えば5~100mW程度の出力である。レーザ光Lの強度変調に用いる周波数(変調周波数)は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば10~200MHzである。
 レーザ光源部22は、レーザ光Lが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Lによって励起される蛍光蛋白Xは細胞に付着(結合)されている。この試料12が管路30の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Lの照射を受けて特定の波長で、蛍光蛋白Xが蛍光を発する。
 受光部24は、管路30を挟んでレーザ光源部22と対向するように配置されており、光電変換器を備える。光電変換器は、測定点を通過する試料12によってレーザ光が前方散乱することにより、試料12が測定点を通過する旨の検出信号を出力する。この受光部24から出力される検出信号は、制御・処理部28および分析装置80に供給され、試料12が管路30中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号、処理開始のON信号、OFF信号として用いられる。
 一方、受光部26は、レーザ光源部22から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路30中の試料12の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料12が発する蛍光を受光する複数の光電変換器を備える。
 図3は、受光部26の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
 図3に示す受光部26は、試料12からの蛍光信号を集束させるレンズ系26aと、ダイクロイックミラー26bと、バンドパスフィルタ26c,26cと、光電子増倍管等の光電変換器(受光素子)27a,27bと、を有する。
 レンズ系26aは、受光部26に入射した蛍光を光電変換器27a,27bの受光面に集束させるように構成されている。
 ダイクロイックミラー26bは、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ26c,26cでフィルタリングして光電変換器27a,27bで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー26bの反射波長帯域およびバンドパスフィルタ26c,26cの透過波長帯域が設定されている。
 バンドパスフィルタ26c,26cは、各光電変換器27a,27bの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光蛋白Xの発する蛍光に対応して設定されている。波長帯域は、例えばレーザ光源部22から出射した408nmのレーザ光Lの照射によって蛍光蛋白Xが発する蛍光を主に受光するための494nm~535nmの第1の波長帯域FL1である。また、415nm~440nmの第2の波長帯域FLbである。第1の波長帯域FL1は、レーザ光Lで照射された試料12のうち、蛍光蛋白Xの発する蛍光の蛍光強度が、細胞やバッファー液自体が発する自家蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Xに対応して設定されている。同様に、第2の波長帯域FLbは、レーザ光Lで照射された試料12のうち、自家蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Xが発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように設定されている。なお、第2の波長帯域FLbは、後述するように自家蛍光の蛍光データを効果的に除去するために、蛍光蛋白Xが発する蛍光の持つ波長の範囲から外れた領域に設定されることが好ましい。
 図4には、一例として、蛍光蛋白Xの発する蛍光のスペクトラムSと、レーザ光Lの波長408nmと、第1の波長帯域FL1と、第2の波長帯域FLbと、を示している。
 自家蛍光は、極めて幅の広いブロードなスペクトル分布を成しており、第1の波長帯域FL1および第2の波長帯域FLbにも分布している。したがって、第1の波長帯域FL1では、蛍光蛋白Xの発する蛍光と自家蛍光が受光される。一方、蛍光蛋白Xの発する蛍光は、自家蛍光の蛍光スペクトル分布に比べてスペクトル分布が狭い。このため、波長帯域FL1で支配的となる蛍光蛋白Xの蛍光の蛍光強度が、細胞やバッファー液の自家蛍光の蛍光強度に比べて小さくなる領域、あるいは、蛍光蛋白Xの蛍光の波長が存在しない領域が存在する。この領域が波長帯域FLbとして設定の対象となる。
 光電変換器27a,27bは、例えば光電子増倍管等のセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換する受光素子である。ここで、受光する蛍光は、所定の周波数で強度変調を受けたレーザ光の励起により基づくものなので、出力される蛍光信号も所定の周波数で強度が変動する信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部28に供給される。
 制御・処理部28は、図5に示すように、信号生成部40と、信号処理部42と、制御部であるシステムコントローラ44と、を有する。
 信号生成部40は、レーザ光Lの強度を所定の周波数fで変調するための変調信号を生成する。
 具体的には、信号生成部40は、発振器46、パワースプリッタ48及びアンプ50,52を有する。信号生成部40は、生成されパワースプリッタ48で分割された変調信号をアンプ50で増幅した後、レーザ光源部22のレーザドライバ34に供給するとともに、パワースプリッタ48で分割されアンプ52で増幅した変調信号を信号処理部42に供給する。信号処理部42に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機27a,27bから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の信号であり、10~200MHzの範囲の周波数に設定される。発振器46は、周波数fの信号を発振し変調信号を生成する。
 信号処理部42は、光電変換器27a,27bから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により蛍光蛋白Xが発する蛍光の蛍光データと細胞等の発する自家蛍光の蛍光データを抽出する。アンプ54a,54b,64と、パワースプリッタ56と、IQミキサ58a,58bと、ローパスフィルタ62と、を有する。
 アンプ54a,54bは、光電変換器27a,27bから出力される蛍光信号を増幅する。IQミキサ58a,58bは、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部40から供給された正弦波信号である変調信号を参照信号として、蛍光信号とミキシングする。
 パワースプリッタ56は、信号生成部40から供給された変調信号を2分割し、IQミキサ58a,58bに分配する。
 IQミキサ58a,58bは、光電変換器27a,27bから供給される蛍光信号を、信号生成部40から供給される変調信号を参照信号としてミキシングするデバイスである。具体的には、IQミキサ58a,58bのそれぞれは、参照信号を蛍光信号(RF信号)と乗算して、蛍光信号の、変調信号と同相の成分を含む信号と、蛍光信号の、変調信号に対して90度位相のシフトした成分を含む信号とを生成する。同相の成分を含む信号は、変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成され、90度位相のシフトした成分を含む信号は、90度位相のシフトした変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成される。
 ローパスフィルタ62は、IQミキサ58a,58bで生成された信号の低周波信号をろ過する部分である。このろ過により、蛍光信号の、変調信号と同相の成分(Re成分)と、蛍光信号の、変調信号に対して90度位相のシフトした成分(Im成分)が、蛍光データとして取り出される。取り出されたRe成分およびIm成分は、アンプ64で増幅された後、分析装置80に送られる。Re成分およびIm成分は、光電変換器27a,27bに設定された第1の波長帯域、第2の波長帯域毎に得られるので、第1の波長帯域のRe成分およびIm成分の組と、第2の波長帯域のRe成分およびIm成分の組とが分析装置80に送られる。
 システムコントローラ44は、信号生成部40に所定の周波数の変調信号を生成させるように制御する他、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ10の全動作を管理する。
 分析装置80は、信号処理部42から供給されたRe成分およびIm成分をA/D変換し、AD変換されたRe成分、Im成分から、蛍光強度を求め、さらに、蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求め、この位相遅れ角度から蛍光緩和時定数(蛍光緩和時間)を求める。分析装置80は、具体的に、A/D変換器66と、分析部83とを有する。分析装置80は、CPU81とメモリ82を有するコンピュータで構成され、メモリ82に記憶されたプログラムを読み出して起動することにより、分析部83がソフトウェアモジュールとして形成される。勿論、分析部83の各部分を専用回路で構成することもできる。
 図6は、分析部83の概略の構成を示す図である。
 分析部83は、自家蛍光除去部86と、蛍光強度算出部90と、位相遅れ算出部92と、蛍光緩和時間算出部94とを有する。
 自家蛍光除去部86は、制御部44から供給されたRe成分、Im成分を複素表示で表した蛍光データを用いて、第1の波長帯域FLおよび第2の波長帯域FLbにおける蛍光の情報から、試料12中の細胞やバッファー液が自ら発する自家蛍光の情報を除去する部分である。具体的には、生成した第2の波長帯域FLbの蛍光データに、予め設定された第1の定数(複素数)を乗算し、この乗算結果を、第1の波長帯域FLの蛍光データから減算することにより、第1の波長帯域FLの蛍光データから自家蛍光の蛍光データを除去する。
 ここで、第1の定数は、蛍光蛋白Xが付着していない細胞について、光源部22と受光部24と制御・処理部28とを用いて得られる。この第1の定数は、上記細胞の発する自家蛍光の第1の波長帯域FL1における蛍光データを、上記細胞の発する自家蛍光の第2の波長帯域FLbにおける蛍光データで除算して得られる比の値である。
 例えば、自家蛍光の第1の波長帯域FLにおける蛍光データを複素数表示でa1iθ1とし、自家蛍光FLbの第2の波長帯域における蛍光データを複素数表示でabiθbとしたとき、上記第1の定数は、a1/ab・ei(θ1-θb)となる。
 また、試料12を計測したとき求められる第2の波長帯域FLbにおける蛍光データを複素数表示でAbiΘbとし、第1の波長帯域FLにおける蛍光データを複素数表示でA1iΘ1とする。このとき、A1iθ1-a1/ab・ei(θ1-θb)・AbiΘbが計算される。この計算結果が第1の波長帯域FLの蛍光データから自家蛍光の蛍光データが除去された蛍光データとなる。
 このように、試料12の測定で得られる第2の波長帯域FLbの蛍光データに第1の定数を乗算して、a1/ab・ei(θ1-θb)・AbiΘbを得ることで、第1の波長帯域FL1に含まれる自家蛍光の蛍光データを推定することができる。この第1の定数は、分析装置80のメモリ84に記憶されている。
 図7は、自家蛍光の除去方法を説明する模式図である。図中、縦軸をIm成分、横軸をRe成分にとり、ベクトル表示で示している。第1の波長帯域FL1における自家蛍光の蛍光データB1は、第2の波長帯域FLbにおける蛍光データに第1の定数を乗算して得られたものである。この蛍光データB1を、計測により得られた第1の波長帯域FL1の蛍光データA1’から差し引くことで、図中点線で表される求めるべき蛍光データA1が算出される。
 こうして、自家蛍光の蛍光データが除去された蛍光データは蛍光強度算出部90.位相遅れ算出部92に供給される。
 蛍光強度算出部90は、蛍光データA1について、複素数の絶対値を求めることで、蛍光強度を算出する部分である。
 位相遅れ算出部92は、蛍光データA1について、複素数の偏角(tan-1(蛍光データのIm成分/蛍光データのRe成分))を、位相遅れθとして算出する部分である。
 蛍光緩和時間算出部94は、位相遅れ算出部92で算出されたθを用いて、蛍光緩和時間τをτ=1/(2πf)・tan(θ)の式にしたがって算出する部分である。ここで、fは、レーザ光Lの強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ=1/(2πf)・tan(θ)の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、1次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
 算出された蛍光強度、位相遅れθおよび蛍光緩和時間τは、図示されないプリンタやディスプレイに結果情報として出力される。また、この結果情報は、試料12が管路30の測定点を通過する度に測定される結果として、統計処理の対象とされる。
 フローサイトメータ10は以上のように構成される。
 次に、フローサイトメータ10で行われる蛍光検出方法について説明する。
 まず、蛍光蛋白Xがレーザ光Lを吸収し、自家蛍光に対して強い強度で蛍光するような波長を持つレーザ光Lを用意し、周波数fで強度変調して、光源部22から出射する。
 次に、照射光に照射された蛍光蛋白Xが発する蛍光に対して、蛍光蛋白Xの発する蛍光の蛍光強度が自家蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Xに対応して設定された第1の波長帯域FL1を用いて受光部26で受光するとともに、第1の波長帯域FL1と異なる第2の波長帯域FLで細胞等の発する自家蛍光を受光する。これにより、第1の波長帯域FL1及び第2の波長帯域FLに対応した蛍光信号を出力する。
 出力した蛍光信号のそれぞれを、制御・処理部28において、周波数fの変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データA1’を生成する。さらに、第2の波長帯域FLbの蛍光信号を、周波数fの変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データB1’を生成する。
 生成した蛍光データA1’および蛍光データB1’は、さらに、分析装置80において、自家蛍光の除去処理が行われる。この処理では、蛍光データB1’に、上述の第1の定数(複素数)が乗算され、この乗算結果である蛍光データB1が、蛍光データA1’から減算されることにより、自家蛍光除去後の蛍光データA1が算出される。この蛍光データA1が蛍光強度算出部90および位相遅れ算出部92に送られ、蛍光強度および位相遅れθが算出される。さらに、算出された位相遅れθを用いて蛍光緩和時間算出部94において蛍光緩和時間τが算出される。
 なお、第1の定数は、細胞の発する自家蛍光の波長帯域FL1における蛍光データを、細胞の発する自家蛍光の第2の波長帯域FLbにおける蛍光データで除算して得られる比の値(複素数)である。上記蛍光データは、蛍光蛋白Xが付着(結合)していない細胞について、フローサイトメータ10を用いて予め得られたものである。
 このように、本実施形態の蛍光検出装置および蛍光検出方法は、第1の蛍光の強度が第2の蛍光の強度に比べて高くなるように設定された第1の波長帯域で第1の蛍光と第2の蛍光を受光して第1の蛍光信号を生成するとともに、第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で第2の蛍光を受光して第2の蛍光信号を生成する。自家蛍光による蛍光データを除去するとき、試料12の測定で得られる第2の波長帯域FLbの蛍光データに第1の定数を乗算することで、第1の波長帯域FL1に含まれる自家蛍光の蛍光データを推定し、この蛍光データを除算する演算を行うだけで済むので、迅速かつ容易に自家蛍光を除去することができる。
 特に、第2の蛍光を、測定対象粒子の発する、波長帯域の広いブロードなスペクトル分布を持つ自家蛍光とすることにより、第1の蛍光から迅速かつ容易に自家蛍光を除去することができる。
 以上、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

Claims (10)

  1.  測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
     測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射する光源部と、
     照射光に照射された測定対象物が発する第1の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第2の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第1の蛍光に対応して設定された第1の波長帯域で前記第1の蛍光を受光し、第1の蛍光信号を出力する第1の受光素子と、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で測定対象物の発する第2の蛍光を受光し、第2の蛍光信号を出力する第2の受光素子とを含む受光部と、
     出力した前記第1の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第1の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第1の蛍光データを生成するとともに、出力した前記第2の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第2の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第2の蛍光データを生成する第1の処理部と、
     生成した前記第2の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成する蛍光除去部と、生成された前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光強度を算出する蛍光強度算出部とを含む第2の処理部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。
  2.  前記測定対象物は、蛍光色素が測定対象粒子に付着して構成され、
     前記第1の蛍光は、前記蛍光色素が発する蛍光であり、
     前記第2の蛍光は、前記測定対象粒子が発する自家蛍光、あるいは、前記測定対象粒子を懸濁する溶液の自家蛍光である、請求項1に記載の蛍光検出装置。
  3.  前記第2の波長帯域は、前記第1の蛍光の持つ波長の範囲から外れた領域に設定される請求項2に記載の蛍光検出装置。
  4.  前記蛍光除去部で用いる前記定数は、蛍光色素が付着していない測定対象粒子について、前記光源部と前記受光部と前記第1の処理部とを用いて得られる、測定対象粒子の発する自家蛍光の前記第1の波長帯域における蛍光データを、測定対象粒子の発する自家蛍光の前記第2の波長帯域における蛍光データで除算して得られる比の値である請求項2または3に記載の蛍光検出装置。
  5.  前記第2の処理部は、蛍光強度の他、前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光緩和時間を算出する蛍光緩和算出部を含む請求項1~4のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。
  6.  測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
     測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射するステップと、
     照射光に照射された測定対象物が発する第1の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第2の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第1の蛍光に対応して設定された第1の波長帯域で前記第1の蛍光を受光し、第1の蛍光信号を生成するとともに、前記第1の波長帯域と異なる第2の波長帯域で測定対象物の発する第2の蛍光を受光し、第2の蛍光信号を生成するステップと、
     生成した前記第1の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第1の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第1の蛍光データを生成するとともに、生成した前記第2の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第2の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第2の蛍光データを生成するステップと、
     生成した前記第2の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第1の蛍光データから減算して、第3の蛍光データを生成し、生成された前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
  7.  前記測定対象物は、蛍光色素が測定対象粒子に付着して構成され、
     前記第1の蛍光は、前記蛍光色素が発する蛍光であり、
     前記第2の蛍光は、前記測定対象粒子が発する自家蛍光、あるいは、前記測定対象粒子を懸濁する溶液の自家蛍光である、請求項6に記載の蛍光検出方法。
  8.  前記第2の波長帯域は、前記第1の蛍光の持つ波長の範囲から外れた領域に設定される請求項7に記載の蛍光検出方法。
  9.  前記定数は、蛍光色素が付着していない測定対象粒子を用いた処理方法により得られ、
     前記処理方法は、
     前記レーザ光を、前記周波数で強度変調して、前記測定対象物の照射光として出射するステップと、
     前記第1の波長帯域で前記自家蛍光を受光し、第1の自家蛍光信号を生成するとともに、前記第2の波長帯域で前記自家蛍光を受光し、第2の自家蛍光信号を生成するステップと、
     生成された前記第1の自家蛍光信号の、前記第2の自家蛍光信号に対する比率を前記定数として算出するステップと、を含む請求項7または8に記載の蛍光検出方法。
  10.  さらに、蛍光強度の他、前記第3の蛍光データを用いて前記第1の蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップを含む請求項6~9のいずれか1項に記載の蛍光検出方法。
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