CN103175827B - 一种检测5-羟甲基脱氧尿苷的化学方法 - Google Patents

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本发明公开了一种检测5-羟甲基脱氧尿苷的化学方法，即5-羟甲基脱氧尿苷通过一步反应变成叠氮化的脱氧尿苷，然后用一个带炔基的没有荧光的探针与它反应，反应后的物质有很强的荧光，从而达到荧光从无到有的效果，进而检测出脱氧胸苷氧化突变的存在。该方法可以高效、灵敏、选择性强的检测5-羟甲基脱氧尿苷。

Description

一种检测5-羟甲基脱氧尿苷的化学方法
技术领域
本发明涉及一种检测5-羟甲基脱氧尿苷的化学方法，属于荧光探针领域。
背景技术
活细胞中的脱氧胸苷很容易被紫外线，电离辐射等产生的活性氧所氧化进而造成损伤，5-羟甲基脱氧尿苷就是脱氧胸苷氧化损伤的产物。所以一种简便灵敏的检测方法对疾病早期诊断以及生命科学都有重要的意义和应用价值。而荧光探针一直都是一种简便灵敏的检测方法，如果能够通过简单的荧光检测即可观测到核酸水平的突变对检测脱氧胸苷的氧化损伤具有战略性意义。
当今DNA损伤的检测领域具有一定的成果，也有很多有对脱氧胸苷的氧化损伤成5-羟甲基脱氧尿苷的检测报道。已有的一些报道包含了生物和化学检测两类，但是生物检测具有其复杂和代价高等缺点，化学方法有的不能做到简便敏捷，有的则是荧光对比性不强，选择性不强，亦或者检测用到的小分子探针不易得到或者是所需量比较大。所以能使荧光从无到有以及小分子探针且普遍容易获得的方法必然能成为高效敏捷的检测方法，进而成为灵敏高效的检测脱氧胸苷氧化损伤为5-羟甲基脱氧尿苷的最便捷方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效、灵敏、选择性强的荧光检测5-羟甲基脱氧尿苷的方法。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：一种检测5-羟甲基脱氧尿苷的化学方法，包括以下步骤：
1）配制5-羟甲基脱氧尿苷的二甲亚砜溶液和叠氮化钠的三氟乙酸（TFA）溶液，混合上述溶液，混合溶液中5-羟甲基脱氧尿苷与叠氮化钠的摩尔比为1:490，反应后除去三氟乙酸，反应时间≥24小时，得到叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷；
2）配制7-炔基香豆素（化合物D）的二甲亚砜溶液；
3）向步骤1）得到的叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷中加入水与N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基甲酰胺与水的比例为1:1，再加入步骤2）配制好的7-炔基香豆素的二甲亚砜溶液、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠（sodium ascorbate），7-炔基香豆素与叠氮化的5-羟甲基脱氧尿苷的摩尔比为1:1，室温下搅拌16～24小时后，用荧光仪检测5-羟甲基脱氧尿苷。
该方法的化学反应式如下：
5-羟甲基脱氧尿苷（化合物A）通过一步反应变成叠氮化的5-羟甲基脱氧尿苷（化合物B），然后用一个带炔基的没有荧光的探针与它反应，反应后的物质（化合物C）有很强的荧光，从而达到荧光从无到有的效果，进而检测出脱氧胸苷氧化突变的存在。检测结果发现5-羟甲基脱氧尿苷发生峰值位移在400nm左右出现新峰，并且峰值较高。
本发明也通过化学合成方法得到化合物C，路线如下：
上述荧光物质的合成方法，更具体地为：
把叠氮化钠和5-羟甲基脱氧尿苷按2:1的比例投料溶于三氟乙酸溶剂中，室温过夜之后，用饱和的碳酸氢钠中和三氟乙酸，薄板层析（TLC）检测反应结束后减压蒸出溶剂过柱纯化分别得到化合物B，化合物B与7-羟基香豆素(化合物D)按照1:1的投料比溶于水和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，水和N,N-二甲基甲酰胺的比例为1:1，然后加入催化当量的五水合硫酸铜与抗坏血酸钠，室温过夜，TLC检测反应结束后减压蒸出溶剂过柱纯化分别得到化合物C。
本发明具有以下优点：
（1）本发明中的步骤1）仅需一步即可将5-羟甲基脱氧尿苷变成叠氮取代的脱氧尿苷。现有技术中用到的方法都不止一步，而且需要保护糖环上的羟基。
（2）本发明通过原子产率为100%的“click”反应实现了一个荧光增强的荧光变化。
（3）本发明可以选择性的检测5-醛基脱氧尿苷的存在。
附图说明
图1为实施例1中检测5-羟甲基脱氧尿苷的荧光光谱，其中dA为脱氧腺苷，dG为脱氧鸟苷，dC为脱氧胞苷，dT为脱氧胸苷，5-hmdU为5-羟甲基脱氧尿苷，mixture为混合溶液。
图2实施例2检测5-羟甲基脱氧尿苷的线性荧光光谱，浓度按照箭头方向依次为0，50，100，150，200和250μM。
图3实施例3中化合物C与7-羟基香豆素在水中的荧光对比图，上面一条谱线是反应后的物质C，下面一条谱线是7-炔基香豆素，图中用D表示。
具体实施方式
以下以具体实例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
检测5-羟甲基脱氧尿苷并测荧光
1）配制浓度为10mM的5-羟甲基脱氧尿苷的二甲亚砜（DMSO）溶液，配制浓度为100mM的叠氮化钠的三氟乙酸溶液，取2μL10mM的5-羟甲基脱氧尿苷溶液与98μL100mM的叠氮化钠溶液混合，反应后旋干除掉三氟乙酸，得到叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷；
2）配制浓度为10mM7-炔基香豆素的DMSO溶液，向步骤1）得到的叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷中加入195μL的水与195μL的N,N-二甲基甲酰胺（DMF），再加入10μL的7-炔基香豆素的溶液和1mg的五水合硫酸铜与1mg的抗坏血酸钠，室温下反应16h后测荧光。
对照试验：
检测脱氧腺苷（dA）并测荧光，方法同检测5-羟甲基脱氧尿苷。
检测脱氧鸟苷(dG)并测荧光，方法同检测5-羟甲基脱氧尿苷。
检测脱氧胞苷(dC)并测荧光，方法同检测5-羟甲基脱氧尿苷。
检测脱氧胸苷(dT)并测荧光，方法同检测5-羟甲基脱氧尿苷。
取上述脱氧腺苷（dA）、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)和脱氧胸苷(dT)的二甲亚砜溶液（10mM）各0.5μL配成混合溶液并测荧光，方法同检测5-羟甲基脱氧尿苷。
对5-羟甲基脱氧尿苷的选择性检测的荧光光谱图如图1所示，可以看出，该方法具有很高的选择性。
实施例2
对梯度浓度的5-羟甲基脱氧尿苷的检测
1）配制浓度为10mM的5-羟甲基脱氧尿苷的DMSO溶液，配制浓度为100mM的叠氮化钠的三氟乙酸溶液，分别取0，1，2，3，4，5μL的5-羟甲基脱氧尿苷分别加入到100，99，98，97，96，95μL的叠氮化钠的三氟乙酸溶液中反应后旋干除掉三氟乙酸，得到不同梯度浓度的叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷；
2）配制浓度为10mM7-炔基香豆素的DMSO溶液，向步骤1）得到的不同梯度浓度的叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷中分别加入195μL的水与195μL的DMF，再加入10μL的7-炔基香豆素的溶液和1mg的五水合硫酸铜与1mg的抗坏血酸钠，室温下反应24h后测荧光。浓度按照箭头方向依次为0，50，100，150，200和250μM。5-羟甲基脱氧尿苷的线性荧光光谱如图2所示
实例1～2都证明了该方法对5-羟甲基脱氧尿苷的选择性检测，对比了空白，脱氧腺苷，脱氧鸟苷，脱氧胞苷，脱氧胸苷。
实施例3
叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷的化学合成
把258mg的化合物A溶于15mL三氟乙酸溶剂中，室温搅拌15分钟之后，加入130mg叠氮化钠，并暴露于空气当中反应24小时后，TLC检测反应结束后用碳酸氢钠中和三氟乙酸，减压蒸出溶剂，用淋洗剂（氯仿：甲醇=10:1）过柱纯化得到241mg化合物B，产率为85%，为白色固体，1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.56(s,1H),8.03(s,1H),6.14(t,J=6.3Hz,1H),5.28(d,J=3.9Hz,1H),5.07(s,1H),4.23(s,1H),4.05(s,2H),3.78(q,J=2.7Hz,1H),3.52～3.62(m,2H),2.01～2.11(m,2H);13C NMR(DMSO-d6,75MHz)δ(ppm):162.82,150.11,139.83,108.19,87.35,84.11,70.14,61.09,46.77,40.13;HRMS(ESI)calcd for C10H13N5O5[M-H]-:282.0838;found:282.0841。
化合物C的化学合成
把28.3mg5-叠氮乙基脱氧尿苷和17mg7-炔基香豆素（化合物D）溶于5mL DMF和5mL水的混合溶剂中，加入催化当量的五水合硫酸铜和抗坏血酸钠，室温搅拌并暴露于空气当中反应，TLC检测反应结束后析出固体，过滤得到35.8mg化合物C，产率为96%，为白色固体，1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.62(s,1H),8.68(s,1H),8.23(s,1H),8.07(d,J=9.6Hz,1H),7.70～7.90(m,3H),6.48(dd,J=9.6Hz,1H),6.17(t,J=3Hz,1H),5.20～5.32(m,3H),5.07(s,1H),4.26(s,1H),3.80(s,1H),3.58(m,2H),2.10～2.20(m,2H);13C NMR(DMSO-d6,75MHz)δ(ppm):162.57,159.96,154.08,150.27,144.68,143.97,141.43,141.40,134.25,129.12,122.71,121.18,118.17,115.81,112.15,107.04,87.56,84.54,70.15,61.09,46.58;HRMS(ESI)calcd for C21H19N5O7[M+H]+:454.1363,found:454.1359,[M+Na]+:476.1182found:476.1178。配制合成的化合物C与7-炔基香豆素的混合水溶液并测荧光
把合成的化合物C与7-炔基香豆素配置成100mM的水溶液，测荧光，化合物C与7-羟基香豆素在水中的荧光对比如图3所示。

Claims (1)

1.一种检测5-羟甲基脱氧尿苷的化学方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)配制5-羟甲基脱氧尿苷的二甲亚砜溶液和叠氮化钠的三氟乙酸溶液，混合上述溶液，混合溶液中5-羟甲基脱氧尿苷与叠氮化钠的摩尔比为1:490，反应后除去三氟乙酸，反应时间≥24小时，得到叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷；
2)配制7-炔基香豆素的二甲亚砜溶液；
3)向步骤1)得到的叠氮取代的5-羟甲基脱氧尿苷中加入水与N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为1:1，再加入步骤2)配制好的7-炔基香豆素的二甲亚砜溶液、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠，7-炔基香豆素与叠氮化的5-羟甲基脱氧尿苷的摩尔比为1:1，室温下搅拌16～24小时后，用荧光仪检测5-羟甲基脱氧尿苷。
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