CN102621114A

CN102621114A - 五位醛基脱氧尿苷的荧光检测方法

Info

Publication number: CN102621114A
Application number: CN2012100448771A
Authority: CN
Inventors: 周翔; 郭璞; 翁小成
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2032-02-27
Also published as: CN102621114B

Abstract

本发明涉及一种检测脱氧胸苷氧化突变成五位醛基脱氧尿苷的化学方法：将4-甲氧基邻苯二胺或邻苯二胺作为检测试剂，二硫苏糖醇作为抗氧化剂，并溶解于10mM的pH=4.5的醋酸缓冲液中作为检测试样；检测试样在有氧的室温条件下反应3小时后，用荧光光度分析仪检测空白试样和检测试样，发现：4-甲氧基邻苯二胺作为检测试剂时，峰值发生位移至475nm，或邻苯二胺作为检测试剂时，峰值发生位移至430nm。本发明用简单易得的4-甲氧基邻苯二胺和邻苯二胺与5-醛基脱氧尿苷在醋酸缓冲液中生成可发出荧光的化合物，从而荧光检测出脱氧胸苷氧化突变的存在。

Description

五位醛基脱氧尿苷的荧光检测方法

技术领域

本发明涉及一种脱氧胸苷氧化突变成五位醛基脱氧尿苷的荧光检测方法，属于生物检测领域。

背景技术

活细胞中的脱氧胸苷很容易被紫外线，电离辐射等产生的活性氧所氧化进而造成损伤，五位醛基脱氧尿苷就是脱氧胸苷氧化损伤的产物。所以一种简便灵敏的检测五位醛基脱氧尿苷的方法对疾病早期诊断乃至生命科学都有重要的意义和应用价值。荧光探针一直都是一种简便灵敏的检测方法，如果能够通过简单的荧光检测即可观测到核酸水平的突变，对检测脱氧胸苷的氧化损伤具有重要意义。

当今DNA损伤的检测领域具有一定的成果，但是很少有对脱氧胸苷的氧化损伤的检测报道。已有的一些报道包含了生物和化学检测两类，但是生物检测具有其复杂和代价高等缺点，化学方法有的不能做到简便敏捷，有的则是荧光对比性不强，选择性不强，亦或者检测用到的小分子探针不易得到或者是所需量比较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效、灵敏、选择性强的荧光检测脱氧胸苷氧化成五位醛基脱氧尿苷的方法。

本发明所提供的检测五位醛基脱氧尿苷的方法，是以4-甲氧基邻苯二胺或邻苯二胺和5-醛基脱氧尿苷混合，以pH=4.5的醋酸缓冲液作为溶剂，在有氧的条件下室温反应，得到带有荧光发射的化合物A和B，其中的反应原理涉及如下化学反应：

Figure 2012100448771100002DEST_PATH_IMAGE001

。

上述方法可以高效，灵敏并且选择性强的检测出五位醛基脱氧尿苷的存在。

上述检测方法，更具体为：

将4-甲氧基邻苯二胺或邻苯二胺作为检测试剂，二硫苏糖醇作为抗氧化剂，按检测试剂：待测化合物为1:5、检测试剂：抗氧化剂为1:1的摩尔比例配比，并溶解于10mM的pH=4.5的醋酸缓冲液中作为检测试样，同时制备不含待测化合物的空白试样；

检测试样在有氧的室温条件下反应3小时后，用荧光光度分析仪检测空白试样和检测试样，发现：4-甲氧基邻苯二胺作为检测试剂时，峰值发生位移至475nm，或邻苯二胺作为检测试剂时，峰值发生位移至430nm。

如果检测试样中含有100mM盐酸荧光强度会增强很多。

本发明还用化学合成得到化合物A和B，然后用核磁共振和质谱分析A和B的结构，和本发明上述方法检测结果一致，证明了上述方法的可靠性。

通过化学合成方法获得A和B的过程如下：

把邻苯二胺类化合物和五位醛基脱氧尿苷按1:1的比例投料溶于DMF溶剂中，室温一个小时之后，加入催化剂三氟甲磺酸钪和氧化剂双氧水（30wt%），并暴露于空气当中反应，TLC检测反应结束后减压蒸出溶剂过柱纯化分别得到化合物A和B，实施例3、4，为化学合成的范例。其中的化学反应如下：

本发明提到的方法中使用的邻苯二胺类化合物的量仅为被检测化合物五位醛基脱氧尿苷的五分之一。已经报道的方法中用到的检测物量一般都对被检测物五位醛基脱氧尿苷大大过量，所以我们的方法还可以通过增加邻苯二胺类化合物的量（一般可为被检测物的0.2~1倍）而达到增强荧光响应的效果。

本发明提到的方法还可以在检测试样中加入100mM盐酸从而达到放大荧光信号的作用，从而可以提高荧光检测五位醛基脱氧尿苷的灵敏度和效率。荧光产生的原因可认为是：脱氧尿苷本身是一个共轭体系并带有一定的吸电子能力，而邻苯二胺类化合物和醛基反应后的苯并咪唑结构更是广泛使用的Hoechst荧光分子重要的荧光发色团，而且从带甲氧基和不带甲氧基的荧光位移和强度对比看，苯环上的强给电子基团可以有效的增强荧光的观测效率，实施例5和6体现了酸碱度对荧光强度和灵敏度的影响。

本发明提到的方法可以选择性的检测五位醛基脱氧尿苷的存在，实施例1和2都例证了两个邻苯二胺类化合物对五位醛基脱氧尿苷的选择性检测，对比了空白，脱氧胞苷，五位醛基脱氧胞苷。

本发明方法用简单易得的4-甲氧基邻苯二胺和邻苯二胺与5-醛基脱氧尿苷在醋酸缓冲液中生成可发出荧光的化合物，从而荧光检测出脱氧胸苷氧化突变的存在。本发明方法具有灵敏、高效、选择性强的特点。

附图说明

图1 4-甲氧基邻苯二胺检测五位醛基脱氧尿苷的荧光光谱。

图2 邻苯二胺检测五位醛基脱氧尿苷的荧光光谱。

图3 化合物A分别在100mM盐酸，pH=7.0缓冲液，100mM氢氧化钠溶液中荧光对比图。

图4 化合物B分别在100mM盐酸，pH=7.0缓冲液，100mM氢氧化钠溶液中荧光对比图。

具体实施方式

以下以具体实例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例1：用4-甲氧基邻苯二胺分别与脱氧胞苷，五位醛基脱氧胞苷和五位醛基脱氧尿苷反应并测其荧光光谱。

把4-甲氧基邻苯二胺，五位醛基脱氧尿苷和二硫苏糖醇分别用DMSO（二甲基亚砜）配制成10mM的溶液。然后把10mM的4-甲氧基邻苯二胺稀释成1mM的溶液备用，用醋酸铵和醋酸配制pH=4.5的醋酸缓冲液浓度为1M。

取8μL 1mM的4-甲氧基邻苯二胺溶液，4μL 10mM的10mM的二硫苏糖醇溶液，4μL 10mM的五位醛基脱氧尿苷溶液，4μL 1M的醋酸缓冲液，加380μL高纯水配制成400μL混合液并在反应3小时后检测其荧光光谱，在475nm处出现新峰，对比图三中化合物A的峰值确定了反应的发生。

把4-甲氧基邻苯二胺，五位醛基脱氧胞苷和二硫苏糖醇分别用DMSO（二甲基亚砜）配制成10mM的溶液。然后把10mM的4-甲氧基邻苯二胺稀释成1mM的溶液备用，用醋酸铵和醋酸配制pH=4.5的醋酸缓冲液浓度为1M。

取8μL 1mM的4-甲氧基邻苯二胺溶液，4μL 10mM的10mM的二硫苏糖醇溶液，4μL 10mM的五位醛基脱氧胞苷溶液，4μL 1M的醋酸缓冲液，加380μL高纯水配制成400μL混合液并在反应3小时后检测其荧光光谱。

把4-甲氧基邻苯二胺，脱氧胞苷和二硫苏糖醇分别用DMSO（二甲基亚砜）配制成10mM的溶液。然后把10mM的4-甲氧基邻苯二胺稀释成1mM的溶液备用，用醋酸铵和醋酸配制pH=4.5的醋酸缓冲液浓度为1M。

取8μL 1mM的4-甲氧基邻苯二胺溶液，4μL 10mM的10mM的二硫苏糖醇溶液，4μL 10mM的脱氧胞苷溶液，4μL 1M的醋酸缓冲液，加380μL高纯水配制成400μL混合液并在反应3小时后检测其荧光光谱。

以上见图1所示，只有4-甲氧基邻苯二胺和五位醛基脱氧尿苷同时存在才会有显著的荧光响应，体现了本方法的选择性。

实施例2：用邻苯二胺分别与脱氧胞苷，五位醛基脱氧胞苷和五位醛基脱氧尿苷反应并测其荧光光谱

把邻苯二胺，五位醛基脱氧尿苷和二硫苏糖醇分别用DMSO（二甲基亚砜）配制成10mM的溶液。然后把10mM的邻苯二胺稀释成1mM的溶液备用，用醋酸铵和醋酸配制pH=4.5的醋酸缓冲液浓度为1M。

取8μL 1mM的邻苯二胺溶液，4μL 10mM的10mM的二硫苏糖醇溶液，4μL 10mM的五位醛基脱氧尿苷溶液，4μL 1M的醋酸缓冲液，加380μL高纯水配制成400μL混合液并在反应3小时后检测其荧光光谱，在430nm处出现新峰，对比图四中化合物B的峰值确定了反应的发生。

把邻苯二胺，五位醛基脱氧胞苷和二硫苏糖醇分别用DMSO（二甲基亚砜）配制成10mM的溶液。然后把10mM的邻苯二胺稀释成1mM的溶液备用，用醋酸铵和醋酸配制pH=4.5的醋酸缓冲液浓度为1M。

取8μL 1mM的邻苯二胺溶液，4μL 10mM的10mM的二硫苏糖醇溶液，4μL 10mM的五位醛基脱氧胞苷溶液，4μL 1M的醋酸缓冲液，加380μL高纯水配制成400μL混合液并在反应3小时后检测其荧光光谱。

把邻苯二胺，脱氧胞苷和二硫苏糖醇分别用DMSO（二甲基亚砜）配制成10mM的溶液。然后把10mM的邻苯二胺稀释成1mM的溶液备用，用醋酸铵和醋酸配制pH=4.5的醋酸缓冲液浓度为1M。

取8μL 1mM的邻苯二胺溶液，4μL 10mM的10mM的二硫苏糖醇溶液，4μL 10mM的脱氧胞苷溶液，4μL 1M的醋酸缓冲液，加380μL高纯水配制成400μL混合液并在反应3小时后检测其荧光光谱。

以上见图2所示，只有邻苯二胺和五位醛基脱氧尿苷同时存在才会有显著的荧光响应，体现了本方法具有选择性。

实施例3：化合物A的化学合成

把17mg 4-甲氧基邻苯二胺和30mg五位醛基脱氧尿苷溶于2mL DMF溶剂中，室温搅拌一个小时之后，加入6mg催化剂三氟甲磺酸钪和12μL氧化剂双氧水（30%），并暴露于空气当中反应，TLC检测反应结束后减压蒸出溶剂，用淋洗剂（氯仿：甲醇=20:1）过柱纯化得到29.8mg化合物A，产率为68%，为棕黄色固体，¹H NMR(300MHz DMSO-d₆) δ 2.213（s，2H），3.596（s，2H），3.744（s，3H），3.856（s，1H），4.269（s，1H），5.061（s，1H），5.331（s，1H），6.197（t，J=6.3Hz，1H），6.755（d，J=8.4Hz，1H）,7.093（d，J=19.2Hz，1H），7.439（t，J=8.1Hz，1H）,8.743（d，J=12Hz，1H）,11.910（s，1H），12.021（s，1H）; ¹³C NMR (300MHz DMSO-d₆) δ 19.222, 55.990, 56.083, 56.701, 62.069, 71.168,71.225,85.834，88.429，88.529，104.731, 104.930, 111.676, 112.088, 113.162, 119.084, 135.577, 141.136, 143.994, 145.821,150.172,162.570；HRMS (ESI) C₁₇H₁₈N₄O₆ [M+Na]⁺：397.1114.

实施例4：化合物B的化学合成

把13mg邻苯二胺和30mg五位醛基脱氧尿苷溶于2mL DMF溶剂中，室温搅拌一个小时之后，加入6mg催化剂三氟甲磺酸钪和12μL氧化剂双氧（30%），并暴露于空气当中反应，TLC检测反应结束后减压蒸出溶剂，用淋洗剂（氯仿：甲醇=20:1）过柱纯化得到35.8mg化合物B，产率为89%，为棕黄色固体，¹H NMR (300MHz DMSO-d₆) δ 2.225（d，J=5.4Hz，2H），3.594（s，2H），3.855（d，J=2.4Hz，1H）,4.267（s，1H），5.051（d，J=4.8Hz，1H）,5.028（d，J=4.2Hz，1H）,6.192（t，J=6.6Hz，1H）,7.116（m，J=3.15Hz，2H）,7.561（m，J=3.3Hz，2H）,8.802（s，1H），11.938（s，1H），12.186（s，1H）; ¹³C NMR (300MHz DMSO-d₆) δ 19.201，56.701, 62.047, 71.147, 71.218，85.920, 86.034，88.451, 88.550, 104.645, 112.892, 118.892, 122.240, 134.973, 141.556,143.155,146.746, 150.186,162.549； HRMS (ESI) C₁₆H₁₆N₄O₅ [M+H]⁺：345.1196.

实施例5：化合物A荧光强度受酸碱性影响的讨论

取化合物A配制成10mM的DMSO（二甲基亚砜）溶液，稀释成为1mM的溶液。然后分别配制1M的氢氧化钠溶液，1M的盐酸溶液，10mM的pH=7.0的磷酸缓冲液。分三次取4μL的1mM化合物A溶液，并分别加入40μL 1M的氢氧化钠溶液，40μL 1M的盐酸溶液，396μL 10mM的磷酸缓冲液。加入氢氧化钠和盐酸的样品继续加入356μL高纯水配制成400μL的溶液，并分别检测这三个400μL样品的荧光强度，见图三所示，体现了化合物A在100mM的盐酸存在的条件下可以大大增强荧光的响应强度及在此检测方法中溶液酸性越强荧光强度越强。

实施例6：化合物B荧光强度受酸碱性影响的讨论

取化合物B配制成10mM的DMSO（二甲基亚砜）溶液，稀释成为1mM的溶液。然后分别配制1M的氢氧化钠溶液，1M的盐酸溶液，10mM的pH=7.0的磷酸缓冲液。分三次取4μL的1mM化合物B溶液，并分别加入40μL 1M的氢氧化钠溶液，40μL 1M的盐酸溶液，396μL 10mM的磷酸缓冲液。加入氢氧化钠和盐酸的样品继续加入356μL高纯水配制成400μL的溶液，并分别检测这三个400μL样品的荧光强度，见图四所表，体现了化合物B在100mM的盐酸存在的条件下可以大大增强荧光的响应强度及在此检测方法中溶液酸性越强荧光强度越强。

Claims

1.一种检测五位醛基脱氧尿苷的方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测试样中含有100mM盐酸。