CN113804886A - 抗fam131a自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 - Google Patents
抗fam131a自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113804886A CN113804886A CN202111297701.2A CN202111297701A CN113804886A CN 113804886 A CN113804886 A CN 113804886A CN 202111297701 A CN202111297701 A CN 202111297701A CN 113804886 A CN113804886 A CN 113804886A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- esophageal squamous
- serum
- biomarker
- fam131a
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于医药生物技术领域,具体公开了一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物及检测试剂盒。本发明提供的用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物为抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体,该标志物在食管鳞癌患者血清中的表达水平高于正常人,且差异具有统计学意义。本发明还提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒,该试剂盒含有用于检测上述标志物的试剂,所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。本发明通过检测人血清中抗肿瘤相关抗原FAM131A的表达水平,可以有效区分食管鳞癌患者和正常人,可用于食管鳞癌的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,具体公开了一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物及检测试剂盒。
背景技术
食管鳞癌是常见消化道癌症之一,严重威胁着人类健康。全球癌症流行病学统计数据显示,2020年全球新增60.4万食管鳞癌病例,食管鳞癌发病率居恶性肿瘤第8位;有54.4万人因食管鳞癌而死亡,食管鳞癌死亡率居于恶性肿瘤第6位。中国是全球食管鳞癌发病率最高的国家之一,食管鳞癌发病率居恶性肿瘤第6位,死亡率居恶性肿瘤第4位。在中国,90%以上的食管鳞癌患者为食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma)患者,中国是食管鳞癌发病率最高的国家。
食管鳞癌起病隐匿,早期多无症状或症状不典型而易被忽视,大多数患者在出现典型症状就医时已到癌症中晚期,导致食管鳞癌患者预后差,5年生存率仅为19.9%。研究证实,食管鳞癌患者如能早期诊断、早期根治性治疗,5年生存率可达63.4%。目前食管鳞癌的检查手段主要有X线钡餐检查、CT/PET-CT扫描、电子内窥镜检查及病理组织活检,但由于早诊效果有限、费用较高或侵袭性操作限制了广泛用于筛查的可能性,因此急需建立一种非侵袭性的早期食管鳞癌诊断方法。血清肿瘤标志物的检测是经济适用的,并且可以作为某些癌症的早期诊断的准确补充。但是,在ESCC中,仍然没有特异性和有效的标记。
研究发现,随着肿瘤组织的发生发展,在肿瘤患者的血清中可以产生一些能够激活免疫系统的特异蛋白产物,这类蛋白被称为肿瘤相关抗原,同时机体通过免疫系统的级联放大效应针对这些异常表达的蛋白产生相应的抗体,这类抗体被称为肿瘤相关抗原自身抗体。这些自身抗体可出现于肿瘤患者的临床症状之前,可在患者的血液中存在较长时间,同时易于被检测以及检测过程对患者创伤性小,因此具有肿瘤早期免疫学诊断的潜力。为了提高食管鳞癌早期诊断的效率,提高食管鳞癌患者的生存率,亟需筛选能够用于食管鳞癌诊断的血清学自身抗体标志物。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足,本发明的目的之一是提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物,本发明的目的之二旨在提供一种用于检测上述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用,本发明的目的之三在于提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒。
基于上述目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明第一方面提供了一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物,所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体。抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平明显高于正常人,且差异具有统计学意义。
根据上述的生物标志物,优选地,所述抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体。
根据上述的生物标志物,优选地,所述抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体为受试者接受肿瘤治疗之前血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体。更加优选地,所述肿瘤治疗为化疗、放疗或肿瘤手术切除。
根据上述的生物标志物,优选地,所述受试者为哺乳动物,更加优选地,所述受试者为灵长类哺乳动物;最优选地,所述受试者为人。
本发明第二方面提供了用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用。
根据上述的应用,优选地,所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。
根据上述的应用,优选地,所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。
根据上述的应用,优选地,所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。更加优选地,所述试剂为FAM131A蛋白。
根据上述的应用,优选地,所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。
本发明第三方面提供了一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒,所述试剂盒包含用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂。
根据上述的试剂盒,优选地,所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。更加优选地,所述试剂盒通过抗原抗体反应对样本中的所述生物标志物进行检测。
根据上述的试剂盒,优选地,所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。更加优选地,所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的FAM131A蛋白。
根据上述的试剂盒,优选地,所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。
根据上述的试剂盒,优选地,所述ELISA检测试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
本发明中肿瘤相关抗原FAM131A的基本信息为:
FAM131A (Family With Sequence Similarity 131 Member A)中文名称为具有序列相似性的家族131成员A,属于FAM131系列,是一种蛋白质编码基因。已有的研究表明与FAM131A 相关的疾病包括子宫体混合癌,该基因的一个重要旁系同源物是FAM131B。FAM131A在NCBI中的蛋白序列号为:NP_653236.3。
与现有技术相比,本发明取得的积极有益效果为:
(1)本发明首次发现抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平明显高于正常人,且差异具有统计学意义,因此,抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体能够作为食管鳞癌辅助诊断的标志物;采用抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体诊断食管鳞癌的ROC曲线的AUC为0.635(95%CI:0.584-0.685),而且,当截断值为0.3225时,采用抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体诊断食管鳞癌的灵敏度达到39.74%,特异度达到了80.79%,因此,通过检测抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平,能够实现食管鳞癌的辅助诊断,为临床医生对食管鳞癌的诊断提供参考依据。
(2)本发明的试剂盒通过间接ELISA的方法检测人血清中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平,可以较准确地将食管鳞癌患者和健康对照,其检测灵敏度和特异度分别达到39.74%、80.79%,有利于无症状食管鳞癌高危人群筛查和早期发现,从而大大降低了食管鳞癌患者的死亡率,为食管鳞癌患者和家庭带来极大的福祉。
(3)本发明的试剂盒的检测样本为血清,可避免侵入性诊断,通过微创方式取血清检测即可在早期获得食管鳞癌的患病风险,需血量少,被检测人员痛苦小、依从性高;而且,操作简单,检测出结果时间短,具有广阔的市场前景和社会效益。
附图说明
图1为蛋白芯片检测抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体在食管癌血清和正常血清中的表达水平结果图;其中,EC表示食管鳞癌,NC表示正常对照;
图2为ELISA检测抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的血清表达水平结果图;
图3为抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体诊断食管鳞癌的ROC曲线图。
具体实施方式
以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使 用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,均采用本技术领域常规技术,或按照生产厂商所建议的条件;所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1:采用人类蛋白质组芯片筛选用于食管鳞癌诊断的标志物
1、实验样本:
收集来自河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库的30例食管鳞癌患者血清(食管鳞癌组)和24例正常人血清(正常对照组);其中,30例食管鳞癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的食管鳞癌患者;24例正常人血清来源于健康受试者,健康受试者的入组标准为:无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史,无急性或者慢性疾病,无自身免疫性疾病,无任何肿瘤相关的证据;而且,30例食管鳞癌患者和24例健康受试者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准,所有的研究对象均已签署知情同意书。
将30例食管鳞癌患者血清中每3例血清混合为1例混合食管鳞癌血清样本,共得到10例混合食管鳞癌血清样本;将21例正常人血清中每3例混合为1例混合正常血清样本,共得到7例混合正常血清样本。
血清采集:采集研究对象在空腹状态时的外周血液5 ml放于无抗凝剂的采血管中,室温静置1h后置于离心机中,设定为4℃,3000 rpm离心10 min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5 ml的EP管中,在 EP 管的顶部和侧面均标记样本编号,放于-80℃冰箱进行冷冻保存,记录采血日期以及储存位置。在使用之前,取出血清放于 4℃冰箱解冻并分装,避免反复冻融血清。
2、人类蛋白质组芯片检测
使用HuProt TM 人类蛋白质组芯片(购自广州博翀生物科技有限公司)检测10例混合食管鳞癌血清样本,7例混合正常血清样本和3例正常人血清样本中自身抗体的表达水平。每张芯片可以同时检测14个血清样本,固定在芯片上的蛋白与血清中的特异性抗体相互作用以结合。
(1)实验方法:
1)复温:将HuProtTM人类蛋白质组芯片从-80 ℃冰箱中取出,放置4°C 冰箱复温30min,随后室温继续复温15 min;
2)封闭:将已复温的芯片正面朝上置于芯片孵育盒中,并加入10 mL封闭液(3ml10% BSA,加入 7ml 1 ×PBS 溶液),放置于侧摆摇床中,50-60 rpm,室温封闭1 h;
3)血清样本孵育:封闭完成后,弃去封闭液,迅速加入预先稀释好的血清孵育液(用稀释液将血清样本按1:200的比例进行稀释,得到稀释后的血清孵育液,稀释液的成分组成为:1ml 10% BSA加入 9ml 1 × PBST 溶液 中制备而成),放置于侧摆摇床中,20rpm,4 ℃过夜孵育;
4)清洗:待孵育完成后,取出芯片放置于含有清洗液的芯片清洗盒,水平摇床,室温80 rpm,清洗3次,每次10 min;
5)二抗孵育:待清洗结束后,将芯片转移至孵育盒中,并加入按1:1000比例稀释的二抗孵育液(二抗为荧光标记的抗人 IgM 、 IgG抗体,稀释液成分组成为:1gBSA,100ml 1×PBST溶液,将二抗用稀释液按1:1000比例进行稀释得到二抗孵育液)3 mL,置于侧摆摇床40 rpm,避光,室温孵育1 h;
6)清洗:将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面),置于芯片清洗盒,并加入芯片清洗液(1 × PBST溶液),放置水平摇床上,80 rpm,清洗3次,每次10 min。完成后用ddH2O重复清洗2次,每次10 min;
7)干燥:待清洗完成后,将芯片放置于芯片干燥机进行离心干燥;
8)扫描:按照扫描仪的使用说明对干燥后的芯片进行规范性荧光扫描并记录荧光信号(荧光信号的强弱与相应抗体的亲和力以及数量具有正相关关系);
9)数据提取:打开对应的GAL文件,将GAL文件上的每个阵列与芯片图像整体对齐后,点击自动对齐按钮,提取数据并保存为GPR。
(2)数据处理:
F532 Median是指在532 nm通道下的信号点前景值的中位数,B532 Median是指在532nm 通道下的信号点背景值的中位数。为了消除由于背景值不一带来的样本间的偏差,对于每个血清样本提取的数据,进行背景归一化处理,即定义信噪比(signal-noiseratio,SNR)= F532 Median/B532 Median,按照SNR的计算公式进行计算,分别得到10例混合食管鳞癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本的SNR值。分别对10例混合食管鳞癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本的SNR值进行中位值线性归一化处理。对于任意一个自身抗体,计算食管鳞癌癌症组与正常对照组的差异倍数(差异倍数=食管鳞癌组中位值线性归一化后的SNR均值/正常对照组中位值线性归一化后的SNR均值),用以表示食管鳞癌组高于正常对照组的程度,进一步设置筛选条件:差异倍数>2、灵敏度≥60%、特异度=100%,从中筛选出符合条件的抗肿瘤相关抗原自身抗体。
(3)实验结果:
经筛选发现,抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的差异倍数(fold change)为3.3,灵敏度和特异度分别为60%和100%。进一步绘制抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体在食管鳞癌组和正常对照组的SNR值的柱状图,其结果如图1所示。由图1可知,抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体在食管鳞癌组血清中的表达水平显著高于正常对照组血清,且差异具有统计学意义。
实施例2:ELISA检测抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的血清表达水平
采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)进一步在大样本人群血清中检测抗-FAM131A自身抗体的表达水平。
1、实验样本:
本研究纳入的229例食管鳞癌患者(食管鳞癌组)和229例正常对照血清(正常对照组)样本均来源于河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库;其中,229例食管鳞癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的食管鳞癌患者;229例正常人血清来源于健康受试者,健康受试者的入组标准为:无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史,无急性或者慢性疾病,无自身免疫性疾病,无任何肿瘤相关的证据;而且,229例食管鳞癌患者和229例健康受试者在性别和年龄之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准,所有的研究对象均已签署知情同意书。
血清采集:采集研究对象在空腹状态时的外周血液5 ml放于无抗凝剂的采血管中,室温静置1h后置于离心机中,设定为4℃,3000 rpm离心10 min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5 ml的EP管中,在 EP 管的顶部和侧面均标记样本编号,放于-80℃冰箱进行冷冻保存,记录采血日期以及储存位置。在使用之前,取出血清放于4℃冰箱解冻并分装,避免反复冻融血清。
2、实验材料及试剂:
(1)FAM131A重组蛋白,购买于武汉华美生物工程有限公司;
(2)96孔酶标板(8行×12列);
(3)包被液:含0.15% 碳酸钠(Na2 CO3)和0.29%碳酸氢钠(NaHCO3)的水溶液;
(4)封闭液:含2%(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的0.2%(v/v)吐温20的PBST缓冲液;
(5)血清样本稀释液:含有1%(W/V)BSA的PBST缓冲液;
(6)酶标第二抗体:辣根过氧化物酶(HRP)标记小鼠抗人免疫球蛋白抗体(以下简称HRP标记小鼠抗人IgG抗体);
(7)抗体稀释液:含有1%(W/V)BSA的PBST缓冲液;
(8)洗涤液:含0.2%(v/v)吐温20的PBST缓冲液;
(9)显色液:显色液由显色液A和显色液B组成,其中,显色液A为20%四甲基联苯胺二盐酸的水溶液,显色液B:3.7% Na2HPO4•12H2O,0.92%柠檬酸,0.75%过氧化氢脲素的水溶液);使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀,现用现配;
(10)终止液:10%的硫酸。
3、实验方法:
(1)制备肿瘤相关抗原FAM131A包被的酶标板:
制备肿瘤相关抗原FAM131A包被的酶标板的具体操作步骤如下:
1)制备肿瘤相关抗原FAM131A溶液:将FAM131A重组蛋白溶解于包被液中,配制成浓度为0.125μg/mL的FAM131A蛋白溶液。
2)包被酶标板:将步骤1)制备的FAM131A蛋白溶液加入到96孔酶标板的每个反应孔中,加样量为50μL/孔,在4℃下包被过夜,然后将剩余的包被液甩出并拍干。
3)封闭:向包被后的96孔酶标板的反应孔中加入封闭液,加样量为100μL/孔,在37℃水浴中封闭2h,然后去除封闭液,用洗涤液洗涤3次并拍干,得到肿瘤相关抗原FAM131A包被的酶标板。
(2)血清样本中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体表达水平的检测:
采用上述制备的肿瘤相关抗原FAM131A包被的酶标板通过ELISA方法检测血清样本中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体表达水平。其具体操作步骤如下:
1)血清样本孵育:
将待检测的血清样本用血清样本稀释液按体积比1:100的比例进行稀释,然后将稀释后的血清样本加入已包被FAM131A重组蛋白的96孔酶标板第1~11列的反应孔中,加样量为50μl/孔;在已包被FAM131A重组蛋白的96孔酶标板的第12例的第1-6反应孔加入按照1:100稀释的质控血清,加样量为50μl/孔,质控血清是作为质控,用于对不同酶标板之间的归一;在第12例的第7-8反应孔加入不含血清的抗体稀释液(加样量为50μl/孔),作为空白对照;然后将96孔酶标置于37℃水浴孵育1h,然后弃去反应孔中液体,用洗涤液(加样量为300μl/孔)洗涤5次并拍干。
2)酶标二抗孵育:
将HRP标记小鼠抗人IgG抗体用抗体稀释液按1:10000(v/v)的比例进行稀释,然后将稀释后的HRP标记小鼠抗人IgG抗体加入96孔酶标板的反应孔中,加样量为50μl/孔,置于37℃水浴孵育1h,然后弃去反应孔中液体,用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)5次并拍干。
3)显色及终止反应:
将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀,然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中,加样量为50μl/孔,室温避光显色反应10min,然后向每个反应孔中再加入25μl终止液,终止显色反应;然后使用酶标仪读取其在450nm和620 nm波长处的吸光度(optical density,OD),其中,620 nm 波长的吸光度值为背景值,以450nm与620 nm波长处的吸光度的差值作为后续分析的吸光度值。
4、数据处理
对食管鳞癌组和正常对照组血清样本的吸光度值进行Kolmogorov-Smirnova检验,经Kolmogorov-Smirnova检验发现,研究对象血清样本中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平不符合正态分布(P<0.05),因此采用第25百分位数(P25)、中位数(P50)以及第75百分位数(P75)来描述抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平分布;然后采用非参数检验(Mann-Whitney U)比较食管鳞癌组和正常对照组中自身抗体的表达水平是否有差异。根据测得食管鳞癌组和正常对照组中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平,使用GraphPad Prism8.0绘制ROC曲线分析抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体对食管鳞癌的诊断价值;以特异度大于80%时,约登指数最大的OD值为截断值,同时计算相应的AUC以及95%置信区间、灵敏度和特异度。
5、实验结果
食管鳞癌组和正常对照组血清样本中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平如图2所示。由图2可知,食管鳞癌组血清样本中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平较高,其吸光度值中位数(P50)为0.286,正常对照组血清样本中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平较高,其吸光度值中位数(P50)为0.229,两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。由此说明,食管癌组患者血清中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体的表达水平显著高于正常对照组,抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体可以用于食管鳞癌的辅助诊断。
图3为抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体诊断食管鳞癌的ROC曲线图。由图3可知,采用抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体诊断食管鳞癌时,其AUC为0.635(95%CI:0.584-0.685),当截断值为0.3225时,相应的灵敏度、特异度分别是39.74%和80.79%。由此说明,抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体能够用于诊断区分食管鳞癌患者和正常人。
综上所述,本发明有效克服了现有技术中的不足,且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (10)
1.一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物,其特征在于,所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体。
2.根据权利要求1所述的生物标志物,其特征在于,所述抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原FAM131A的自身抗体。
3.用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。
6.根据权利要求5述的应用,其特征在于,所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。
8.一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒为ELISA检测试剂盒,所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的FAM131A蛋白。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111297701.2A CN113804886B (zh) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | 抗fam131a自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111297701.2A CN113804886B (zh) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | 抗fam131a自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113804886A true CN113804886A (zh) | 2021-12-17 |
CN113804886B CN113804886B (zh) | 2023-07-07 |
Family
ID=78938185
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111297701.2A Active CN113804886B (zh) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | 抗fam131a自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113804886B (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018215400A1 (en) * | 2017-05-22 | 2018-11-29 | Ait Austrian Institute Of Technology Gmbh | Method of detecting colitis ulcerosa |
CN110716044A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-01-21 | 郑州大学 | 一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法 |
US20200149009A1 (en) * | 2017-07-14 | 2020-05-14 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for modulating cytotoxic lymphocyte activity |
-
2021
- 2021-11-03 CN CN202111297701.2A patent/CN113804886B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018215400A1 (en) * | 2017-05-22 | 2018-11-29 | Ait Austrian Institute Of Technology Gmbh | Method of detecting colitis ulcerosa |
US20200149009A1 (en) * | 2017-07-14 | 2020-05-14 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for modulating cytotoxic lymphocyte activity |
CN110716044A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-01-21 | 郑州大学 | 一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CDI-LAB.COM: "HuProt v3", HTTPS://COLLECTION.CDI-LAB.COM/PUBLIC/GAL/3/1?PAGE=38, pages 1 * |
YANG LI;QI ZHANG;BO PENG;QING SHAO;WEI QIAN;JIAN-YING ZHANG: "Identification of glutathione S-transferase omega 1 (GSTO1) protein as a novel tumor-associated antigen and its autoantibody in human esophageal squamous cell carcinoma", TUMOR BIOLOGY, vol. 35, no. 11 * |
常爱敏;刘春霞;陈云昭;李锋;: "食管癌比较基因组杂交研究进展", 临床与实验病理学杂志, no. 11 * |
彭裕辉;陈建良;翁雪芬;方裕森;许镒洧: "血清 DKK1和 P53自身抗体联合检测对食管鳞状细胞癌的诊断价值", 国际肿瘤学杂志, no. 006 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113804886B (zh) | 2023-07-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109142755B (zh) | 一种诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒及应用 | |
WO2022083673A1 (zh) | 食管癌的生物标志物及其应用 | |
CN110187109B (zh) | 一种用于贲门腺癌早期筛查的自身抗体联合检测elisa试剂盒 | |
US11193934B2 (en) | Sample hepatocarcinoma classification with YKL-40 to MASP2 concentration ratio | |
CN108841954A (zh) | 生物标志物在卵巢癌评估中的应用 | |
CN113777311B (zh) | 一种用于食管鳞癌辅助诊断的elisa试剂盒 | |
CN110187111B (zh) | 一种用于早期贲门癌筛查elisa试剂盒 | |
WO2013154998A1 (en) | Serum biomarkers and pulmonary nodule size for the early detection of lung cancer | |
WO2016195051A1 (ja) | 膵がんを診断するための血漿バイオマーカーパネル | |
CN113671180B (zh) | Paip1自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 | |
CN111077312B (zh) | 一组肿瘤相关抗原在制备贲门癌早期筛查试剂盒中的应用 | |
CN109116023B (zh) | 一种肺癌标志物抗-mmp12自身抗体及其应用 | |
CN115078726A (zh) | 一种用于卵巢癌诊断的生物标志物及检测试剂盒 | |
CN111060688A (zh) | 胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法 | |
CN113804886B (zh) | 抗fam131a自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 | |
CN114814224A (zh) | 乳头溢液中的Hsp90α在乳腺癌中的应用 | |
CN115372616A (zh) | 胃癌相关的生物标志物及其应用 | |
CN113721021B (zh) | Prkcz自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 | |
CN114113611B (zh) | 一种用于肝癌诊断的生物标志物及检测试剂盒 | |
CN109696547B (zh) | 一种判断结直肠癌预后的标志物及其应用 | |
CN114167059B (zh) | 一种用于食管鳞癌诊断的生物标志物及检测试剂盒 | |
US20150004633A1 (en) | Assays and methods for the diagnosis of ovarian cancer | |
CN112083165A (zh) | 人血清REG Iα作为检测靶标或标准品在制备预测肿瘤的试剂或试剂盒中的应用 | |
CN112630432A (zh) | Flna、fbln1、tsp-1作为标志物在制备石棉相关疾病检测试剂盒中的应用 | |
JP5133842B2 (ja) | 癌が疑われる患者または癌患者由来の組織の癌部と非癌部との判別方法およびそれに用いる判別試薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |