CN113721021A - Prkcz自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物及检测试剂盒。本发明提供的用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物为抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体，该标志物在食管鳞癌患者血清中的表达水平高于正常人，且差异具有统计学意义。本发明还提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒，该试剂盒含有用于检测上述标志物的试剂，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。本发明通过检测人血清中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的表达水平，可以有效区分食管鳞癌患者和正常人，可用于食管鳞癌的辅助诊断。

Description

PRKCZ自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了PRKCZ自身抗体在食管鳞癌辅助诊断中的应用。

背景技术

食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都相对较高。2020年发布的癌症统计数据显示，食管癌在全世界中以亚洲地区发病较高，尤其是东亚地区，且男性高于女性。而身处东亚地区的中国2018年癌症统计报告显示食管癌的新发病例数约为32.4万，约占全世界的50%；死亡数为30.1万，约占全世界的55%，这足以说明我国食管癌的流行已愈演愈烈，对食管癌的防治措施已刻不容缓。食管癌起病隐匿并且早期无明显临床症状，通常出现吞咽困难等症状确诊时已为中晚期而错过最佳治疗时机，严重影响其治疗效果。目前对食管癌的发病机制尚不清楚，晚期食管癌也缺少有效的治疗措施。根据临床组织病理类型，食管癌主要分为食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma, EAC）和食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma ,ESCC)，而我国主要以食管鳞癌为主。因此，发现一种能够早期诊断食管鳞癌的方法对提高患者的生存率是至关重要的，同时对攻克防治食管癌这一重大公共卫生问题也具有里程碑式的意义。

目前临床主要采用临床症状结合细胞学检查、内窥镜等影像学和“金标准”病理技术诊断食管鳞癌，由于早期确诊率和灵敏度低、费用高、有创等缺点均不适合食管鳞癌早期诊断。目前，对无症状人群进行内窥镜的普查，是发现早期食管鳞癌的主要技术手段，尽管内窥镜逐渐普及，但其用于食管鳞癌普查时，需要消耗大量的人力、物力资源，且患者接受度低。近年研究发现了一系列恶性肿瘤的相关抗原，其中一些已经应用于临床辅助诊断，比如甲胎蛋白（AFP）已作为肝癌诊断的一项生物学指标、CA125已应用于卵巢癌的普查和筛选，癌胚抗原(CEA)己作为早期诊断肠道腺癌特异性标志物。然而尚无针对食管鳞癌的特异性相关抗原。因此，寻找高效、特异的食管鳞癌分子标志物越来越受到国内外的重视，积极探索食管鳞癌早期诊断的新方法对提高其早期诊断率及改善患者预后具有重要的临床意义。

自身抗体是由肿瘤生长期间产生的肿瘤相关抗原（TAAs）引发人体免疫系统产生免疫反应而产生的自体抗体，是一类很有前景的肿瘤早期检测标志物。与传统的抗原类标志物相比，自身抗体肿瘤标志物有天然的高特异性与免疫生物放大信号系统等独特优势，已经成为肿瘤早期诊断临床应用的技术发展趋势。目前筛选肿瘤相关抗原的技术主要有重组cDNA表达文库血清学分析(Serological analysis of expression cDNA libraries ，简称SEREX) 、噬菌体展示技术、血清蛋白质组学技术 (Serological proteome analysis，简称SERPA)、蛋白质芯片技术等。蛋白质芯片技术作为蛋白质组学研究的新兴研究手段，以其高通量、并行、快速分析的优势在系统生物学研究中发挥着越来越重要的作用，必定能为癌症的诊断和治疗研究提供很好的技术支持，使人们能够较为系统地研究在癌症诊断和治疗过程中蛋白质的组成、变化规律。研究者通过比对肿瘤患者的血清、癌组织与正常人血清和组织之间的蛋白质组学，筛选出差异蛋白质，作为肿瘤早期诊断、预后监测和治疗效果评估的候选生物标志物，为临床治疗方案的指定及抗肿瘤药物的研发提供指导，最终降低肿瘤患者的死亡率，提高患者的生存率。

综上所述，为了最终实现降低食管鳞癌的死亡率，提高生存率，本领域迫切需要筛选和鉴定更加敏感、特异的血清学自身抗体标志物。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一是提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物，本发明的目的之二旨在提供一种用于检测上述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用，本发明的目的之三在于提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体。抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平明显高于正常人，且差异具有统计学意义。

根据上述的生物标志物，优选地，所述抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体。

根据上述的生物标志物，优选地，所述抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体为受试者接受肿瘤治疗之前血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体。更加优选地，所述肿瘤治疗为化疗、放疗或肿瘤手术切除。

根据上述的生物标志物，优选地，所述受试者为哺乳动物，更加优选地，所述受试者为灵长类哺乳动物；最优选地，所述受试者为人。

本发明第二方面提供了用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

根据上述的应用，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。更加优选地，所述试剂为PRKCZ蛋白。

根据上述的应用，优选地，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

本发明第三方面提供了一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。更加优选地，所述试剂盒通过抗原抗体反应对样本中的所述生物标志物进行检测。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。更加优选地，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的PRKCZ蛋白。

根据上述的试剂盒，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的试剂盒，优选地，所述ELISA检测试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

本发明中肿瘤相关抗原PRKCZ的基本信息为：

Protein kinase C zeta type(PRKCZ) 全名为蛋白激酶C，PRKCZ是丝氨酸/苏氨酸激酶PKC家族的成员，参与多种细胞过程，如增殖、分化和分泌。与依赖钙的经典PKC同工酶不同，PRKCZ表现出不依赖钙和二酰基甘油也不依赖磷脂酰丝氨酸的激酶活性且只有一个锌指组件。此外，它对典型的PKC抑制剂不敏感。目前发现PRKCZ主要在2型糖尿病以及肺癌的相关机制研究中发挥作用, 在NCBI中PRKCZ蛋白的蛋白序列号为NP_002735.3。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

（1）本发明首次发现抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平明显高于正常人，且具有显著差异，因此，抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体能够作为食管鳞癌辅助诊断的标志物；采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌组和健康对照组的ROC曲线的AUC为0.67(95%CI:0.61-0.74)，且当截断值为0.3474时，采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌的灵敏度达到了46.8%，特异度达到了85.1%；而且，采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌组与食管良性疾病组的曲线下面积为0.74(95%CI:0.69-0.79)，采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌组与健康对照组＋食管良性疾病组的曲线下面积为0.72(95%CI:0.66-0.77)，采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管良性疾病组与健康对照组的曲线下面积为0.61(95%CI:0.55-0.67)，因此，通过检测抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的表达水平，能够实现食管鳞癌的辅助诊断，为临床医生对食管鳞癌的诊断提供参考依据。

（2）本发明的试剂盒通过间接ELISA的方法检测人血清中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的表达水平，可以较准确地将食管鳞癌患者和健康对照诊断区分开来，其检测灵敏度和特异度分别达到46.8%、85.1%，有利于无症状食管鳞癌高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了食管鳞癌患者的死亡率，为食管鳞癌患者和家庭带来极大的福祉。

（3）本发明的试剂盒的检测样本为血清，可避免侵入性诊断，通过微创方式取血清检测即可在早期获得食管鳞癌的患病风险，需血量少，被检测人员痛苦小、依从性高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。

附图说明

图1为实施例2中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌组和健康对照组中自身抗体滴度的分布；

图2为实施例2中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断食管鳞癌的ROC曲线图；

图3为实施例3中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌组、健康对照组和食管良性疾病组中滴度水平的分布；

图4为实施例3中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体对食管鳞癌的诊断效能。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与3本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使 用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：采用人类蛋白质组芯片筛选用于食管鳞癌诊断的标志物

1、实验样本：

收集来自河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库的30例食管鳞癌患者血清（食管鳞癌组）和24例正常人血清（正常对照组）；其中，30例食管鳞癌患者血清来源于经病理学确诊且未经任何治疗的食管鳞癌患者；24例健康对照血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，30例食管鳞癌患者和24例健康受试者在性别之间没有差异，但在年龄之间有差异。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

将30例食管鳞癌患者血清中每3例血清混合为1例混合食管鳞癌血清样本，共得到10例混合食管鳞癌血清样本；将21例正常人血清中每3例混合为1例混合正常血清样本，共得到7例健康对照血清样本。

血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5 ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000 rpm离心10 min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5 ml的EP管中，在 EP 管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于 4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清 。

2、人类蛋白质组芯片检测

使用HuProt TM 人类蛋白质组芯片（购自广州博翀生物科技有限公司）检测10例混合食管鳞癌血清样本，7例混合正常血清样本和3例正常人血清样本中自身抗体的表达水平。每张芯片可以同时检测14个血清样本，固定在芯片上的蛋白与血清中的特异性抗体相互作用以结合。

（1）实验方法：

1）复温：将HuProt^TM人类蛋白质组芯片从-80℃冷冻冰箱中取出，置于 4℃冰箱30min，然后置于室温 15 min。

2）封闭：将已复温的芯片正面朝上置于芯片孵育盒中，并加入10 mL封闭液（3ml10% BSA，加入 7ml 1×PBS 溶液），放置于侧摆摇床中，50-60 rpm，室温封闭1 h。

3）血清样本孵育：封闭完成后，弃去封闭液，迅速加入预先稀释好的血清孵育液（用稀释液将血清样本按1:200的比例进行稀释，得到稀释后的血清孵育液，稀释液的成分组成为：1g BSA，100ml 1×PBST溶液），放置于侧摆摇床中，20 rpm，4 ℃过夜孵育。

4）清洗：待孵育完成后，取出芯片放置于含有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80 rpm，清洗3次，每次10 min；

5）二抗孵育：待清洗结束后，将芯片转移至孵育盒中，并加入按1：1000比例稀释的二抗孵育液（用稀释液将二抗按1:100的比例进行稀释，得到二抗孵育液，二抗为荧光标记的抗人 IgM 、 IgG抗体，稀释液成分组成为：1g BSA,，100ml 1×PBST溶液）3 mL，置于侧摆摇床40 rpm，避光，室温孵育1 h；

6）清洗：将芯片取出（注意不能触及或划破芯片的上表面），置于芯片清洗盒，并加入芯片清洗液（1 × PBST），放置水平摇床上，80 rpm，清洗3次，每次10 min。完成后用ddH₂O重复清洗2次，每次10 min；

7）干燥：待清洗完成后，将芯片放置于芯片干燥机进行离心干燥；

8）扫描：按照扫描仪的使用说明对干燥后的芯片进行规范性荧光扫描并记录荧光信号（荧光信号的强弱与相应抗体的亲和力以及数量具有正相关关系）；

9）数据提取：打开对应的GAL文件，将GAL文件上的每个阵列与芯片图像整体对齐后，点击自动对齐按钮，提取每个血清样本的数据并保存为GPR。

（2）数据处理：

F532 Median是指在532 nm通道下的信号点前景值的中位数，B532 Median是指在532nm 通道下的信号点背景值的中位数。为了消除由于背景值不一带来的样本间的偏差，对于每个血清样本提取的数据，进行背景归一化处理，即定义信噪比（signal-noiseratio，SNR）= F532 Median/B532 Median，按照SNR的计算公式进行计算，分别得到10例混合食管鳞癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本的SNR值。分别对10例混合食管鳞癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本的SNR值进行z-score标准化处理，使其服从N（0,1）的标准正态分布。对于任意一个自身抗体，计算食管鳞癌组与正常对照组的差异倍数，即差异倍数=食管鳞癌组z-score标准化后的SNR均值/正常对照组z-score标准化后的SNR均值，用以表示食管鳞癌组高于正常对照组的程度，进一步设置筛选条件：差异倍数>2、灵敏度≥20%、特异度=100%，从中筛选出符合条件的抗肿瘤相关抗原自身抗体。

（3）实验结果：

经筛选发现，抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平显著高于正常人血清，其差异倍数（fold change）为3.23，灵敏度和特异度分别为20%和100%。

实施例2：ELISA检测抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的血清表达水平

采用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）在大样本人群血清中检测抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的表达水平。

1、实验样本：

本研究纳入了90例食管鳞癌患者血清（食管鳞癌组）和90例健康对照血清（健康对照组）。其中，90例食管鳞癌患者血清（食管鳞癌组）来自2017—2018年郑州大学第一附属医院和河南省肿瘤医院的食管鳞癌患者，所有病例均经过组织病理学确诊，未经过任何手术和放化疗；90例健康对照血清（健康对照组）来自河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库，健康体检者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，90例食管鳞癌患者和90例健康体检者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

血清采集： 采集研究对象在空腹状态时的外周血液5 ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000 rpm离心10 min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5 ml的EP管中，在 EP 管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清。

2、实验材料及试剂：

（1）PRKCZ蛋白，购买于武汉云克隆科技服务有限公司；

（2）96孔酶标板（8行×12列）；

（3）包被液：含0.15% 碳酸钠（Na₂ CO₃）和0.29%碳酸氢钠（NaHCO₃）的水溶液；

（4）封闭液：含2%（v/v）牛血清白蛋白（BSA）的0.2%（v/v）吐温20的PBST缓冲液；

（5）血清样本稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

（6）酶标第二抗体：辣根过氧化物酶（HRP）标记的重组蛋白A；

（7）抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

（8）洗涤液：含0.2%（v/v）吐温20的PBST缓冲液；

（9）显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为20%四甲基联苯胺二盐酸的水溶液，显色液B为含3.7%Na₂HPO₄ •12H₂O、0.92%柠檬酸以及0.75％(V/V) 过氧化氢脲素水溶液；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，现用现配；

（10）终止液：10％的硫酸。

3、实验方法：

（1）制备肿瘤相关抗原PRKCZ包被的酶标板：

制备肿瘤相关抗原PRKCZ包被的酶标板的具体操作步骤如下：

1）制备肿瘤相关抗原PRKCZ溶液：将PRKCZ蛋白溶解于包被液中，配制成浓度为0.25μg/mL的PRKCZ蛋白溶液。

2）包被酶标板：将步骤1）制备的PRKCZ蛋白溶液加入到96孔酶标板的第1-11列反应孔中，加样量为50μl/孔；在96孔酶标板第12列的每个反应孔中均加入人IgG标准品（第12列不同反应孔中包被系列浓度梯度的人IgG标准品，包被的系列浓度梯度的人IgG标准品即可用于制作标准曲线，同时还能够保证实验操作的稳定性），加样量为50μl/孔，保鲜膜封闭防止挥发，在4℃下包被过夜，然后弃去反应孔中的包被液。

3）封闭：向包被后的96孔酶标板的每个反应孔中加入封闭液，加样量为100μl/孔，在37℃水浴中封闭2h，然后去除封闭液，用洗涤液洗涤3次并拍干，得到肿瘤相关抗原PRKCZ包被的酶标板。

（2）血清样本中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体表达水平的检测：

采用上述制备的肿瘤相关抗原PRKCZ包被的酶标板通过ELISA方法检测血清样本中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体表达水平。其具体操作步骤如下：

1）血清样本孵育：

将待检测的血清样本用血清样本稀释液按体积比1:100的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被PRKCZ蛋白的96孔酶标板第1～10列的反应孔中，加样量为50μl/孔；在已包被PRKCZ蛋白的96孔酶标板的第11列的第1-6反应孔加入按照1:100稀释的质控血清，加样量为50μl/孔，质控血清是作为质控，以进行不同酶标板之间的标化；在第11列的第7-8反应孔加入不含血清的抗体稀释液（作为空白对照），加样量为50μl/孔；在第12列的每个反应孔中均加入不含血清的抗体稀释液，加样量为50μl/孔；然后将96孔酶标置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液（加样量为300μl/孔）洗涤5次并拍干。

2）酶标二抗孵育：

将HRP标记的重组蛋白A用抗体稀释液按1:5000（v/v）的比例进行稀释，然后将稀释后的HRP标记重组蛋白A加入96孔酶标板的每个反应孔中，加样量为50μl/孔，置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤（加样量为300μl/孔）5次并拍干。

3）显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为50μl/孔，室温避光显色反应30min，再向每个反应孔中再加入25μl终止液，终止显色反应；然后使用酶标仪读取其在450nm和620 nm波长处的吸光度（optical density，OD），其中，620 nm 波长的吸光度值为背景值，以450nm与620 nm波长处的吸光度的差值作为后续分析的吸光度值，并用空白对照孔调零。

4、数据处理

对食管鳞癌组和健康对照组血清样本的吸光度值进行Kolmogorov-Smirnova检验，经检验发现，研究对象血清样本中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的滴度水平不符合正态分布（P<0.05），因此采用第25百分位数（P25）、中位数（P50）以及第75百分位数（P75）来描述抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的滴度水平分布；由于实验数据不符合正态分布，拟采用Mann-Whitney U检验比较食管鳞癌组和健康对照组中自身抗体的滴度水平是否有差异。进一步根据测得食管鳞癌组和健康对照组中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的滴度水平，使用GraphPad Prism8.0绘制抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌的ROC曲线；以特异度大于85%时，约登指数最大的OD值为截断值，高于此值判定为阳性，低于此值判定为阴性。所有统计分析使用SPSS 26.0软件进行，P<0.05为统计判断标准。

5、实验结果

食管鳞癌组和健康对照组血清样本中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体滴度水平如图1所示。由图1可知，食管鳞癌组血清样本中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的滴度水平显著高于健康对照组（P＜0.001），两组之间的差异具有统计学意义。由此说明，抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体可以用于食管鳞癌的辅助诊断。

图2为抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌组和健康对照组的ROC曲线图。由图2可知，采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断食管鳞癌时，其AUC为0.65（95%CI:0.57-0.73）。由此说明，抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体能够用于诊断区分食管鳞癌患者和正常人。

实施例3：抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体对食管鳞癌患者、健康对照和食管良性疾病的鉴别能力

为了进一步验证抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体鉴别区分食管鳞癌患者、健康对照者和食管良性疾病患者的能力，本发明采用ELISA检测大样本人群血清中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的表达水平

1、实验样本：

本研究纳入了126例食管鳞癌患者血清（食管鳞癌组）、126例健康对照血清（健康对照组）和237例食管良性疾病患者（食管良性疾病组）。其中，126例食管鳞癌患者血清（食管鳞癌组）来自2017-2018年郑州大学第一附属医院及河南省肿瘤医院的食管鳞癌患者，所有病例均经过组织病理学确诊，未经过任何手术和放化疗；126例健康对照血清（健康对照组）来自河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库，健康体检者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据；237例食管良性疾病患者（食管良性疾病组）来自郑州大学第一附属医院，经组织病理学确诊为食管良性疾病；而且，126例食管鳞癌患者、126例健康对照者和237例食管良性疾病患者在性别之间的差异没有统计学意义，所有研究对单项排除自身免疫性疾病及急慢性感染等影响蛋白表达的疾病。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

血清采集：血清采集的具体方法与实施例2相同，在此不再赘述。

2、实验材料及试剂：

实验材料和具体试剂与实施例2相同，在此不再赘述。

3、实验方法：

实验方法与实施例2相同，在此不再赘述。

4、数据处理

采用非参数检验(Kruskal-Wallis)比较验证食管鳞癌组、健康对照组和食管良性组自身抗体滴度水平的差异。进一步根据测得食管鳞癌组、健康对照组和食管良性组中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的滴度水平，使用GraphPad Prism8.0绘制抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌的ROC曲线；以特异度大于85%时，约登指数最大的OD值为截断值，高于此值判定为阳性，低于此值判定为阴性。所有统计分析使用SPSS 26.0软件进行，P<0.05为统计判断标准。

5、实验结果

食管鳞癌组、健康对照组和食管良性疾病组血清样本中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体滴度水平如图3所示。由图3可知，食管鳞癌组血清样本中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的滴度水平显著高于健康对照组（P＜0.000）和食管良性疾病组（P＜0.000）；而且食管良性疾病组血清样本中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体的滴度水平显著低于健康对照组（P＜0.001）。由此说明，抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体可以用于食管鳞癌的辅助诊断。

图4为抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌组、健康对照组和食管良性疾病组的ROC曲线图。由图4可知，采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌组和健康对照组时，其AUC为0.67(95%CI:0.61-0.74)，且当截断值为0.3474时，采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌的灵敏度达到了46.8%，特异度达到了85.1%；采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌组和食管良性疾病组时，其AUC为0.74(95%CI:0.69-0.79)；采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管鳞癌组与健康对照组＋食管良性疾病组时，其AUC为0.72(95%CI:0.66-0.77)；采用抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体诊断区分食管良性疾病组与健康对照组时，其AUC为0.61(95%CI:0.55-0.67)。由此说明，抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体能够将食管鳞癌组与健康对照组、食管良性疾病组区别开来。这也证明抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体能够用于食管鳞癌的辅助诊断。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体。

2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原PRKCZ的自身抗体。

3.用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌辅助诊断的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

6.根据权利要求5述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

8.一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的PRKCZ蛋白。

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