CN105277709A - Aldoa自身抗体及其在诊断食管鳞状细胞癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术和医学领域，涉及一种能区分食管鳞状细胞癌患者和正常人的标志物ALDOA自身抗体及其检测方法和用途。本发明应用血清蛋白质组研究技术，鉴定出一种新的食管鳞状细胞癌标志物ALDOA自身抗体。本发明通过纯化的ALDOA蛋白进行ELISA分析，检测食管鳞状细胞癌患者血清和正常人血清中的ALDOA自身抗体的表达水平，结果显示ALDOA自身抗体在食管鳞状细胞癌患者血清中的水平显著高于正常人。本发明所提供的ALDOA自身抗体可以作为食管鳞状细胞癌的标志物，用于食管鳞状细胞癌的诊断。

Description

ALDOA自身抗体及其在诊断食管鳞状细胞癌中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域。更具体地说，涉及一种能区分食管鳞状细胞癌患者和正常人的标志物ALDOA(aldolaseA,fructose-bisphosphate)自身抗体及其检测方法和用途。

背景技术

食管癌是一种常见的上消化道恶性肿瘤，在全球范围的各种癌症中，其发病率和死亡率分别排在第八位和第六位。组织病理学检查结果表明，食管癌主要包括食管鳞癌和食管腺癌两种组织病理类型。我国的食管癌病例90%以上是食管鳞癌；食管腺癌主要发生在美国等西方国家。目前食管癌总的5年生存率不足15%，严峻情形十分令人担忧。找寻新的食管癌早期诊断、疗效监测和预后预警的分子标志物，特别是血清分子标志物，让食管癌患者能够及时有效的早查、早诊、早治，是提高食管癌患者生存率、降低死亡率的关键科学问题。

关于食管鳞癌的特异性血清分子标志物，长期以来临床上一直十分缺乏。目前临床上对可疑食管鳞癌患者所检测的肿瘤血清分子标志物，比如CEA(CarcinomaEmbryonicAntigen，癌胚抗原)和SCCA(SquamousCellCarcinomaAntigen，鳞状细胞癌抗原)等均不是特异性针对食管鳞癌的，利用这些肿瘤血清分子标志物难以对食管鳞癌患者开展准确的早期诊断、疗效监测和预后评估。按照肿瘤免疫监视理论，正常情况下，人体的免疫监视系统可以及时识别体内癌变的细胞，并进行有效的清除或抑制。肿瘤的自身抗体是机体对肿瘤免疫监视反应的产物，它在肿瘤患者出现临床症状的前几年就可能产生，表明癌症患者肿瘤自身抗体在癌症发生的早期阶段就已经产生。有研究发现，乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等癌症的患者，在不同病期，尤其是早期，均可以检测到血清中肿瘤自身抗体水平升高，这突显出了检测自身抗体在恶性肿瘤早期诊断方面的潜在应用价值。在食管癌方面，抗Bmi-1自身抗体、抗ABCC3自身抗体等在食管鳞癌患者的水平显著高于正常人。这些研究提示，肿瘤自身抗体在食管鳞癌患者的血清中是存在的，并且有希望作为一种有效的食管鳞癌早期诊断方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种食管鳞状细胞癌标志物，具体涉及一种能区分食管鳞癌患者和正常人的蛋白标志物ALDOA(aldolaseA,fructose-bisphosphate)自身抗体。

本发明的另一目的是提供该蛋白标志物ALDOA自身抗体的ELISA检测方法。

本发明的另一目的是提供ALDOA自身抗体可作为食管鳞状细胞癌诊断标志物的用途，以解决目前对食管鳞癌没有灵敏有效的无创性诊断方法的问题。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明采用血清蛋白质组研究技术（如图1所示），通过双向电泳以及蛋白印迹法，以8个食管鳞癌患者和8个正常人的血清为样本，筛选有用的肿瘤自身抗原，经对比分析，仅出现在患者血清中的蛋白点被进一步分析（如图2所示）。

本发明采用质谱方法对上述蛋白点进行分析，经检测鉴定为ALODA。

本发明为进一步确认ALODA自身抗体是否可作为食管鳞状细胞癌诊断标志物，应用ELISA分析，检测患者血清中ALODA自身抗体的表达水平，其包括步骤：用大肠杆菌表达该蛋白并进行纯化，用该纯化蛋白包被96孔板，并检测95例食管鳞癌患者和57例正常人在内的152例临床样本，结果显示，ALODA自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平高于正常人，差别具有统计学意义（p<0.001，如图4所示）。

为检测ALODA自身抗体对于食管鳞癌的诊断能力，本发明通过食管鳞癌患者组对于正常人组进行ROC分析，结果显示（图5），曲线下面积为0.718（95%CI:0.636-0.800），诊断敏感度和特异度分别为45.3%和89.5%。

结果表明，本发明提供ALDOA自身抗体标志物可作为食管鳞癌标志物，本发明提供了所述ALDOA自身抗体标志物的ELISA检测方法；本发明提供的ALDOA自身抗体可用于食管鳞癌的诊断。

附图说明

图1筛选和鉴定食管鳞状细胞癌ALDOA自身抗体的技术路线。

图2血清标本的双向电泳-免疫印迹检测结果，其中A为EC1O9食管癌细胞系经双向电泳后用考马斯亮蓝染色的结果，B为食管鳞癌患者血清的双向电泳-免疫印迹结果，C为正常人血清的双向电泳-免疫印迹结果。

图3ALDOA肽段的质谱鉴定结果。

图4ELISA检测食管癌患者和正常人血清中ALDOA自身抗体的滴度水平。

图5ROC分析ALDOA自身抗体对食管鳞癌的诊断效能。

具体实施方式

本发明结合实施例和附图做进一步说明。

1.食管鳞癌患者和正常人血清收集

食管鳞癌患者和正常人血清样本收集来自汕头大学医学院附属肿瘤医院，此项研究获得了汕头大学医学院附属肿瘤医院伦理委员会认可。血液标本于1250g离心5分钟，收集血清，所有样本均于-80℃冰箱保存。所有患者均经病理学诊断为食管鳞状细胞癌，正常人样本来自医院医务人员，年龄与性别与食管鳞癌患者相匹配。采用血清蛋白质组研究技术（如图1所示），8例食管鳞癌患者血清和8例正常人血清被用于筛选自身抗体。使用95例食管鳞癌患者和57例正常人，共152例临床样本来检测和验证ALDOA自身抗体的存在及用途。

2.双向电泳-蛋白印迹分析

使用单去污裂解剂（8M尿素，4%CHAPS，2%两性载体Pharmalyte溶液，40mMDTT，100μg/mlPMSF）充分裂解EC109食管癌细胞并收集，再测定蛋白浓度。取5微克蛋白稀释于水化上样缓冲液（8M尿素，4%CHAPS，65mMDTT，0.2%Bio-Lyte，0.001%溴酚蓝），并装置于IPG胶条上（7cmpH3-10）。使用ProteinIEFCell(Bio-Rad)进行第一向等电聚焦。聚焦结束的胶条，立即进行平衡及第二向SDS-PAGE电泳。分离出来的蛋白采用ThermoScientificImperial蛋白试剂（即用型考马斯亮蓝染料）染色显示或者用60v电压1小时转移至PVDF膜上。将膜用含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液在4℃过夜封闭，洗膜后，再用患者或正常人血清（1:250稀释）作为一抗孵育1.5小时。再洗膜，用1:6000稀释的goatanti-humanIgG-HRPconjugated(SantaCruz)作为二抗进行检测。洗膜后进行化学发光反应。

3.质谱鉴定

通过对比经ThermoScientificImperial蛋白试剂染色的2D胶和免疫印迹的PVDF膜确定蛋白点的相应位置。将仅出现在患者血清中的蛋白点进行挖点，酶切，肽段提取，点靶，质谱仪检测。

挖点：取一块棉花用75%乙醇润湿后擦干净针备用。从4℃冰箱中拿出胶，挖出相应的点，挖点时用针在相应点的边缘划一圈，将胶粒挑到EP管中，挖出的点在MilliQ水中涮洗一下。

酶切：每管加入120μlMilliQ水洗涤两次,水洗第二次后用枪头将胶粒切成1mm³大小的颗粒。每管加入120μl50%甲醇，于37℃摇床震荡30min。此时绝大多数斑点可以脱至无色，少数为脱尽颜色的斑点再加入120μl50%甲醇，直至脱完色为止。然后脱水，再将稀释好胰酶溶液迅速加至干胶粒上，将加入胰酶的EP管插入冰中泡胀30min，吸出多余的胰酶。每管加入10μl覆盖液，将EP管转移至EP管盒中，盖上盖子后反扣置于37℃培养箱中酶切12-16h。

肽段提取：取出酶切完的胶粒，在超声清洗机中超声处理15min。吸出覆盖液至对应的0.2mlEP管中。在EP管中加入60μl抽提液对胶粒进行脱水，震荡10min，吸出抽提液至对应的0.2mlEP管中。真空干燥，直至EP管中液体完全挥发为止，合上管盖，-20℃保存。

点靶：抽干的样品每管加入1.5μl的重溶液，震荡1min，将管壁上的肽段充分溶解。吸取0.8uL点在钢靶的小孔内，点样时枪头不能碰到钢靶，将钢靶放在干净的地方风干。等到小孔内液滴完全干燥后，再把剩下的重溶液点到相同的小孔内。最后一次点样后，当液滴挥发到原体积的1/3左右时，加入0.5μl基质在样品上，等到完全干燥后即可送入质谱仪检测。

质谱仪检测：利用德国布鲁克（BrukerDalton）Autoflexspeed?MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析。UV波长为355nm，重复速率为200HZ，加速电压为20000V，最优质量分辨率为1500Da。扫描质量范围为700-3200Da，收集信号。胰酶自切峰为内标校正质谱仪。所有实验样品的质谱图均以用默认模式获得。数据库检索：利用软件flexAnalysis（BrukerDalton）过滤基线峰、识别信号峰。利用BioTools（BrukerDalton）软件搜索NCBI数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，来明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。

4.ALDOA的克隆及纯化

将ALDOA用同源重组的方法克隆至pdest17，pdest17-ALDOA转化rosetta2大肠杆菌菌株，使用Ni柱纯化his-ALDOA蛋白。

5.阳性对照和阴性对照的制备：将筛选获得的ALDOA自身抗体阳性血清按1000U/ml加入青霉素和链霉素，按万分之一的比例加入硫柳汞，无菌过滤，作为阳性对照；将筛选获得的ALDOA自身抗体阴性血清按1000U/ml加入青霉素和链霉素，按万分之一的比例加入硫柳汞，无菌过滤，作为阴性对照。

6.ELISA分析ALDOA自身抗体的表达水平

用蛋白定量试剂盒检测ALDOA蛋白浓度。

包被：用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原蛋白质含量为0.4μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次1分钟。(简称洗涤，下同)。

封闭：每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1小时，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次1分钟。

加样：将食管鳞癌患者和正常人血清、阳性对照和阴性对照作1:110稀释后加入0.1ml于上述反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤同上。

加酶标抗体：于各反应孔中，加入goatanti-humanIgG-HRPconjugatedantibody（1:10000稀释）0.1ml。37℃孵育1小时，洗涤。

加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1ml，37℃15分钟。

终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05ml。

结果判定：用酶标仪双波长450/630nm测定各孔OD值。

7.数据分析，评价特异度和敏感度

本发明使用Mann-WhitneyUtest（SPSS17.0）分析95例食管鳞癌患者和57例正常人血清中ALDOA自身抗体的水平，结果显示ALDOA自身抗体在食管鳞癌患者中的表达水平显著高于正常人（图4,p<0.001）。采用ROC分析ALDOA自身抗体在食管鳞癌患者中的诊断效能，如图5所示，本发明所提供的ALDOA自身抗体诊断食管鳞癌的敏感度为45.3%，特异度为89.5%。

Claims (4)

1.人食管鳞状细胞癌标志物ALDOA自身抗体，其特征在于，为下述所示的蛋白，其基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定的特征为：AccessionNumber：BC004333；ProteinName：aldolaseA,fructose-bisphosphate；MW：39420；pI：8.30；Coverage：27%。

2.人食管鳞状细胞癌标志物ALDOA自身抗体，其特征在于，所述的ALDOA自身抗体通过下述方法获得：

采用血清蛋白质组研究技术，分析了食管癌EC109细胞系分别与食管鳞状细胞癌患者和正常人血清样本进行Westernblot所获得的反应图谱差异，经分析对比，仅出现在患者血清中的蛋白点被选中用于进一步分析；

采用MALDI-TOF-MS对差异反应的蛋白点进行鉴定，其中一个被确定为所述的ALDOA。

3.一种检测权利要求1的人食管鳞状细胞癌标志物ALDOA自身抗体的方法，其特征在于，采用间接ELISA分析方法检测ALDOA自身抗体表达水平，其包括步骤：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将纯化的人ALDOA抗原稀释为0.4μg/ml后，于96孔板中每孔加入0.1ml，4℃过夜包被；洗涤后，加入含1%BSA的PBST溶液后37℃封闭；洗涤后，加入1：110稀释的待测血清样品、阳性对照和阴性对照37℃孵育1小时；洗涤后，再加入1:10000稀释的goatanti-humanIgG-HRPconjugatedantibody，37℃孵育1小时；洗涤后，加入TMB底物反应以显色15分钟，加入2M硫酸终止反应，在450/630nm双波长下检测各孔吸光度。

4.权利要求1的人食管鳞状细胞癌标志物ALDOA自身抗体在诊断食管鳞状细胞癌中的应用。