MX2013010469A

MX2013010469A - Variantes de fc.

Info

Publication number: MX2013010469A
Application number: MX2013010469A
Authority: MX
Inventors: Wei Yang; Gunasekaran Kannan; Zhi Liu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2014-02-06
Also published as: US11198732B2; US20200010545A1; EP2686345B1; AU2012229048B2; JP2014509857A; ES2668895T3; US20140112926A1; WO2012125850A1; JP5972915B2; JP2016172729A; AU2012229048A1; MX348071B; CA2830254C; CA2830254A1; EP2686345A1

Abstract

.

Description

VARIANTES DE Fe CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a polipéptidos que comprenden regiones Fe variantes que pueden ser heterodiméricas y contienen sustituciones de aminoácidos. La invención también se refiere a métodos para elaborar y usar los polipéptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los anticuerpos monoclonales terapéuticos han sido usados exitosamente en varias indicaciones oncológicas. Véase, por ej . , Reichert et ál . (2007), Nature Rev. Drug Discovery 6: 349-356. La eficacia puede depender de funciones efectoras del anticuerpo, tales como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o fagocitosis mediados por células dependientes del anticuerpo (ADCP) o tras la formación de complejos inducida por anticuerpos del antígeno en la superficie celular del tumor, que puede, en algunos casos, inducir apoptosis. Véase, por ej . , Deans et ál . (2002), Immunology 107: 176-182. La actividad antitumoral de algunos anticuerpos depende de las interacciones entre el anticuerpo terapéutico y los receptores gamma de Fe (FcyR) de Haij et ál. (2010), Cáncer Res. 70(8): 3209-3217. Existe una cantidad de FcyR diferentes, algunos de los cuales median los eventos de señalización intracelular que llevan a la Ref.:243556 activación celular, que conduce a citotoxicidad, liberación de citocina y fagocitosis/endocitosis seguido de la presentación de antígeno. Otros FeyR median las actividades a través de proteínas accesorias. Existe una necesidad en la técnica de anticuerpos que pueden provocar más eficazmente funciones que incluyen ADCC, CDC y/o ADCP.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se describe en la presente una proteína que contiene Fe que contiene una región Fe heterodimérica alterada que puede tener una función efectora potenciada en comparación con una proteína similar que tiene una región Fe no alterada. En una modalidad, la invención incluye una proteína que contiene Fe que comprende una región Fe de IgG humana heterodimérica, que comprende una cadena A y una cadena B, cada una comprende de 1 a 10 sustituciones de aminoácido con relación a una cadena de polipéptidos de Fe humana de tipo silvestre, donde la proteína que contiene Fe se une a FCYRIIIA-158V y/o FcyRIIIA-158F humana con una KD menor o igual a un quinto de la KD con la cual una segunda proteína se une a FCYRIIIA-158V y/o FCYRIIIA-158F humana, donde la segunda proteína es igual a la proteína que contiene Fe salvo que contiene una región Fe de IgG humana de tipo silvestre sin sustituciones. La región Fe de IgG humana puede ser una región Fe de IgGl o IgG3. En algunas modalidades, la proteína que contiene Fe se puede unir a FCYRIIIA-158V y/o FcyRIIIA- 158F humana con una KD menor o igual a un décimo o veintésimo de la KD con la que la segunda proteína se une a FCYRIIIA- 158V y/o FCYRIIIA-158F humana. La región Fe de IgG de la proteína que contiene Fe puede ser una región Fe de IgGl, y la región Fe puede estar desfucosilada . En algunas modalidades, cada una de la cadena A y la cadena B de la proteína que contiene Fe comprende de 1 a 6 sustituciones de aminoácido con relación a una cadena de polipéptidos de Fe humana de tipo silvestre. Al menos una de estas sustituciones puede ser una alteración de heterodimerización . Cada una de la cadena A y la cadena B contiene al menos dos sustituciones de aminoácido que son alteraciones de heterodimerización y puede, por ejemplo, contener dos o tres sustituciones que son alternaciones de heterodimerización. Las alteraciones de heterodimerización pueden ser mutaciones de pares de carga, tales como las sustituciones K392D y K409D en la cadena A y las sustituciones E356K y D399K en la cadena B o viceversa. De manera alternativa, las alteraciones de heterodimerización pueden ser pares de sustituciones de salientes y orificios.

En aspectos adicionales, la proteína que contiene Fe puede comprender una región Fe donde están presentes las siguientes sustituciones: (a) la cadena A comprende sustituciones Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L e Y296W o viceversa; (b) la cadena A comprende sustituciones E233L, Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L e Y296W o viceversa; (c) la cadena A comprende sustituciones L234I, Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L e Y296W o viceversa; (d) la cadena A comprende sustituciones S298T y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296W o viceversa; (e) la cadena A comprende sustituciones A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296W o viceversa; (f) la cadena A comprende sustituciones A330F y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296W o viceversa; (g) la cadena A comprende sustituciones Q311M, A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L e Y296W o viceversa; (h) la cadena A comprende sustituciones Q311M, A330F y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L e Y296 o viceversa; (i) la cadena A comprende sustituciones S298T, A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296W o viceversa; (j) la cadena A comprende sustituciones S298T, A330F y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296W o viceversa; (k) la cadena A comprende sustituciones S239D, A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296 o viceversa; (1) la cadena A comprende sustituciones S239D, S298T y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296 o viceversa; (m) la cadena A comprende una sustitución K334V y la cadena B comprende sustituciones Y296 y S298C o viceversa; (n) la cadena A comprende una sustitución K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296 y S298C o viceversa; (o) la cadena A comprende sustituciones L235S, S239D y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296W, o viceversa; (p) la cadena A comprende sustituciones L235S, S239D y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296W y S298C o viceversa; (q) la cadena A comprende sustituciones Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, F243V e Y296W o viceversa; (r) la cadena A comprende sustituciones Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K296W y S298C o viceversa; (s) la cadena A comprende sustituciones S239D y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296W o viceversa; (t) la cadena A comprende sustituciones S239D y 334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296W y S298C o viceversa; (u) la cadena A comprende sustituciones F243V y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296W, o viceversa; (v) la cadena A comprende sustituciones F243V y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296 y S298C o viceversa; (w) la cadena A comprende sustituciones E294L y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y e Y296 o viceversa; (x) la cadena A comprende sustituciones E294L y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296W y S298C o viceversa; (y) la cadena A comprende sustituciones A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y e Y296W o viceversa; o (z) la cadena A comprende sustituciones A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones K290Y e Y296W o viceversa.

En algunas modalidades, la cadena A puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 37 y la cadena B puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 18, 39 o 41. En algunas modalidades, la cadena B puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 34 y la cadena A puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 10 o 18.

Cualquiera de las proteínas que contienen Fe descritas anteriormente o a continuación puede estar desfucosilada .

La proteína que contiene Fe puede comprender una de las siguientes combinaciones de secuencias de aminoácidos: las SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39; O SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 41.

Cualquiera de las proteínas que contienen Fe descritas anteriormente puede ser un anticuerpo o una proteína de fusión Fe y puede estar en una célula CHO, una célula HEK 293, o célula NSO . Tal anticuerpo puede ser un anticuerpo IgGl humano de longitud completa, que puede ser monoespecífico, biespecífico, triespecífico o multiespecífico y/o puede ser monovalente o multivalente, incluido bivalente o tetravalente. La proteína que contiene Fe se puede unir a una o más moléculas diana que se seleccionan del grupo que consiste en WT1, MUC1, LMP2 , EGFRvIII, HER-2/neu, MAGE-A3, NY-ESO-1, PSMA, GM2/GD2 sintasa, CEA, MLANA/MART1, gplOO, survivina, antígeno específico de la próstata (PSA) , transcriptasa inversa telomerasa (hTERT) , rupturas de translocación de sarcoma, EPHA2 , fosfatasa de ácido prostático (PAP) , melanoma inhibidor de apoptosis (ML-IAP) , o¡-fetoproteína (AFP) , molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) , ERG, péptido NA17.A2 (VLPDVFIRC) , caja par 3 (PAX3), cinasa de linfoma anaplásico (ALK) , receptor de andrógeno, claudina 3, claudina 4, claudina 6, claudina 9, ciclina Bl, ácido polisiálico, proteína RhoC de unión a GTP relacionado con rho, oncogén relacionado con v-myc mielocitomatosis viral (MYCN) , TRP-2, gangliósido GD3 , fucosil GM1, mesotelina, antígeno de células madre de próstata (PSCA) , MAGE-A1, CYP1B1, PLACI, GM3 , BORIS, tetranectina (TN) , ETV6-AML1 (especialmente péptidos que incluyen la ruptura), NY-BR-1, RGS5, SART3 , STn, anhidrasa carbónica IX, PAX5, precursor sp32 de proteína de unión a proacrosina (OY-TES-1) , proteína de esperma 17 (Spl7) , LCK, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA, también conocido como proteoglicano de condroitín sulfato de melanoma), AKAP-4, SSX2, XAGE-1, B7H3 (también conocido como CD276) , legumaína, TIE2, proteína del gen 4 asociado a próstata (PAGE-4) , receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR2), protamina 2 (también conocida como MAD-CT-1) , glomulina (también conocida como FAP) , PDGFR-ß, SSX2, SSX5, antígeno relacionado a Fos 1, CD20, integrina a?ß3, antígeno oncofetal 5T4 , CA IX, CD5, CD19, CD22 (también conocido como Siglec-2) , CD30 (también conocido como TNFRSF8) , CD33 (también conocido como Siglec-3) , CD38, CD138,CD40, CD44V6 , CD55, CD56 (también conocido como NCAM) , CTLA-4 (también conocido como CD152) , EGFR, GD2 , HER2 , HLA-DR10 (MHC II), IGF1R, IL-6, sialilo Lewis Y, mesotelina, TAG-72, TAL6 , TRAILR2, VEGF, CD52 (también conocido como CA PATH-1), CD4, CD73, CA125 (también conocido como MUC16) , CD66e, CD80 (también conocido como B7-1) , PDGF ß , antígeno de la membrana específico de próstata (PSMA, también conocido como glutamato carboxipeptidasa 2, entre muchos otros nombres), proteína LMP2 del virus 4, proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano, y glicoceramida globo H, la subunidad OÍ4 de integrinas 4ß1 y a4ß7, la integrina a4ß7, BAFF, APRIL, CD2, CD3, CD20, CD52, CD80, CD86, la proteína de complemento C5, IgE, IL-?ß, IL-5, IL-6R, IL-12, IL-23, y factor de necrosis tumoral a (TNF a). En modalidades particulares, las proteínas que contienen Fe descritas en la presente se pueden unir a HER-2/neu o mesotelina o se pueden unir a CD38 y CD138, CDH19, CDH3 , BCMA e IL13RA2.

En una modalidad adicional, la invención incluye una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las proteínas que contienen Fe descritas anteriormente y a continuación además de un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, se describen en la presente ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las proteínas que contienen Fe descritas anteriormente y a continuación además de una célula hospedadora que contiene los ácidos nucleicos. En algunas modalidades, una cadena A y una cadena B se codifican mediante moléculas de ácido nucleico separadas, mientras en otras modalidades una cadena A y una cadena B se pueden codificar en la misma molécula de ácido nucleico. La célula hospedadora puede ser una célula CHO, una célula HEK 293, o una célula NSO . Además, se describe en la presente un método para crear una proteína que contiene Fe que comprende una región Fe heterodimérica que comprende cultivar la célula hospedadora en condiciones de forma tal que se exprese la proteína que contiene Fe y, en algunas modalidades, recuperar el polipéptido de la masa celular o el medio de cultivo.

También se describe en la presente un método para crear una composición farmacéutica que comprende una proteína que comprende Fe que contiene una región Fe heterodimérica que comprende los siguientes pasos: (a) cultivar una célula hospedadora que contiene uno o más ácidos nucleicos que codifican una proteína que contiene Fe heterodimérica tal como se describe en la presente en condiciones de forma tal que se expresará la proteína que contiene Fe; (b) recuperar la proteína que contiene Fe de la masa celular o medio de cultivo; y (c) formular la proteína que contiene Fe con un portador farmacéuticamente aceptable.

También se describe en la presente un método para crear una proteína que contiene Fe que contiene una región Fe heterodimérica que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una célula hospedadora que contiene uno o más ácidos nucleicos que codifican una proteína que contiene Fe que comprende una región Fe de IgG humana heterodimérica y una región de unión, donde la región Fe comprende una cadena A y una cadena B, cada una comprende de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos con relación a la cadena de polipéptidos de Fe humana de tipo silvestre, donde la proteína que contiene Fe se une a FCYRIIIA-158F y/o FCYRIIIA-158V humanos con una KD menor o igual a un quinto de la KD con la que una segunda proteína se une a FCYRIIIA-158F O FCYRIIIA- 158V humana, donde la segunda proteína es igual a la proteína que contiene Fe salvo que esta contiene región Fe de IgG humana de tipo silvestre sin sustituciones; (b) cultivar la célula hospedadora que contiene uno o más ácidos nucleicos que codifican la proteína que contiene Fe heterodimérica en condiciones de forma tal que se expresará la proteína que contiene Fe; y (c) recuperar la proteína que contiene Fe de la masa celular o el medio de cultivo. Además, la proteína que contiene Fe se puede formular con un portador farmacéuticamente aceptable para crear una composición farmacéutica .

En otro aspecto, se describe en la presente un método para tratar cáncer que comprende administrarle a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína que contiene Fe o composición farmacéutica descrita anteriormente o a continuación, donde la proteína que contiene Fe se une a una molécula que se presenta en las células cancerosas. Se puede administrar un agente quimioterapéutico o antineoplásico no quimioterapéutico al paciente antes, después o junto con la administración de la proteína que contiene Fe. El cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en mesotelioma, carcinoma de células escamosas, mieloma, osteosarcoma, glioblastoma, glioma, carcinoma, adenocarcinoma, melanoma, sarcoma, leucemia aguda y crónica, linfoma, meningioma, enfermedad de Hodgkin, síndrome de Sézary, mieloma múltiple, y cánceres de pulmón, de pulmón no microcítico, de pulmón microcítico, de laringe, de mama, de cabeza y cuello, de vejiga, de ovario, de piel, de próstata, cervical, vaginal, gástrico, de células renales, de riñon, pancreático, colorrectal, endometrial, esofágico, hepatobiliar, de hueso, de piel, y hematológicos, así como cánceres de la cavidad nasal y senos paranasales, nasofaringe, cavidad oral, orofaringe, laringe, hipolaringe, glándulas salivales, mediastino, estómago, intestino delgado, colon, recto y región anal, uréter, uretra, pene, testículos, vulva, sistema endocrino, sistema nervioso central y células plasmáticas .

En otro aspecto, se describen en la presente usos de la proteína que contiene Fe o composición farmacéutica descrita anteriormente o a continuación en el tratamiento de una enfermedad humana, por ejemplo enfermedades autoinmunitarias, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades infecciosas, o enfermedades de proliferación celular tales como cáncer, o en la manufactura de un medicamento, donde el médicamente puede ser para tratar cáncer, asma, lupus eritematoso sistémico, o una enfermedad infecciosa.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Diagrama de la estructura terciaria de FCYRIIIB unida una región Fe. Esta figura es una representación de una estructura cristalina de rayos x del complejo Fc-FcyRIIIB (código del banco de datos de proteínas: 1T83), que incluye la región extracelular de FCYRIIIB y una región Fe dimérica. La estructura FcyRIIIB se muestra en un modelo de alambre más arriba. La cadena de Fe A y la cadena de Fe B se muestran a continuación en modelos de cinta. Se espera que las estructuras terciarias de las regiones extracelulares de FCYRIIIA y FCYRIIIB sean similares dado que solo cinco de los 176 aminoácidos en estas dos regiones extracelulares difieren. Una estructura determinada posteriormente de un complejo Fe-FCYRIIIA (código de banco de datos de proteínas: 3SGK) es muy similar a esta estructura de complejo FC-FCYRIIIB.

Figura 2: Secuencia de aminoácidos de un polipéptido de Fe de IgGl humano. La secuencia de aminoácidos de una región Fe de IgGl humana, que comienza por la región bisagra y terminar con el extremo carboxilo de la región CH3 , se muestra con la escritura de una sola letra y se enumera de acuerdo con el sistema EU de Edelman et ál . (1969), Proc . Nati. Acad. Sci. 63: 78-85. Los aminoácidos subrayados y en negrita se separaron de forma aleatoria en la construcción de bibliotecas tal como se describe en el Ejemplo 1. Debajo de cada uno de estos aminoácidos hay un "1", un "2", o un "3", lo que indica que los ADN que codifican variantes en el sitio correspondiente se incluyeron en una biblioteca de nivel 1, 2, o 3 tal como se describe en el Ejemplo 1.

Figura 3: Diagrama que muestra el análisis inicial primario y el análisis combinatorio inicial para sustituciones que potencian la unión a FCYRIIIA. El rectángulo marcado "SIG" representa un polinucleótido que codifica una secuencia de señal que facilita la secreción de proteína desde células de mamífero. Una región que codifica una región bisagra se representa con una línea horizontal marcada "bisagra". Un rectángulo marcado "polipéptido Fe" representa un polinucleótido que codifica una cadena de polipéptidos Fe. Las estrellas de cinco puntas y de cuatro puntas significan que los polinucleótidos que codifican las cadenas de polipéptidos Fe contienen un codón aleatorizado en cada molécula en posiciones seleccionadas tal como se explica en el Ejemplo 1. Los círculos marcados "VH" y "VL" representan regiones que codifican una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, respectivamente. Los signos "+ +" y en los rectángulos marcados "polipéptido Fe" significan que estas regiones incluyen mutaciones de forma tal que la cadena de polipéptidos Fe codificada tendrá las sustituciones E356K, D399K y K392D, K409D, respectivamente.

Figura 4: Porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® como una función de la concentración del competidor. Los diversos competidores, que son anticuerpos IgGl humanos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada competidor se indican en la Tabla 3.

Figura 5: Porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® como una función de la concentración del competidor. Los diversos competidores, que son anticuerpos IgGl humanos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada competidor se indican en la Tabla 3.

Figura 6: Porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® como una función de la concentración del competidor. Los diversos competidores, que son anticuerpos IgGl humanos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada competidor se indican en la Tabla 3.

Figura 7: Porcentaje de destrucción celular mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de células destruidas en un ensayo para citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (% de ADCC) en comparación con concentración de anticuerpo. Los diversos anticuerpos IgGl humanos usados en estos ensayos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada anticuerpo se indican en la Tabla 3.

Figura 8: Porcentaje de destrucción celular mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de células destruidas en un ensayo para citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (% de ADCC) en comparación con concentración de anticuerpo. Los diversos anticuerpos IgGl humanos usados en estos ensayos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada anticuerpo se indican en la Tabla 3.

Figura 9: Porcentaje de destrucción celular mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de células destruidas en un ensayo para citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (% de ADCC) en comparación con concentración de anticuerpo. Los diversos anticuerpos IgGl humanos usados en estos ensayos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada anticuerpo se indican en la Tabla 3.

Figura 10: Porcentaje de inhibición de señal AlphaLISA® para unión a la variante alélica de FcyR IIIA (158F) humana mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® como una función del log de la concentración del competidor. Los diversos competidores, que son anticuerpos IgGl humanos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada competidor se indican en las Tablas 3 y 4. La denominación "AFUCO" antes de un alias significa que el anticuerpo carece de fucosa.

Figura 11: Porcentaje de inhibición de señal AlphaLISA® para unión a la variante alélica de FcyR IIIA (158V) humana mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® como una función del log de la concentración del competidor. Los diversos competidores, que son anticuerpos IgGl humanos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada competidor se indican en las Tablas 3 y 4. La denominación "AFUCO" antes de un alias significa que el anticuerpo carece de fucosa.

Figura 12: Porcentaje de lisis celular de células que expresan altos niveles de antígeno mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de células destruidas en un ensayo para citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (% de lisis específica) en comparación con el log de la concentración de anticuerpo (pM) . Los diversos anticuerpos IgGl humanos usados en estos ensayos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada competidor se indican en las Tablas 3 y 4.

Figura 13: Porcentaje de lisis celular de células que expresan niveles moderados de antígeno mediante anticuerpos IgGl de longitud completa que contienen regiones Fe variantes. La gráfica muestra el porcentaje de células destruidas en un ensayo para citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (% de lisis específica) en comparación con el log de la concentración de anticuerpo (pM) . Los diversos anticuerpos IgGl humanos usados en estos ensayos se indican con alias en la gráfica, y las sustituciones contenidas en cada competidor se indican en las Tablas 3 y 4.

Figura 14: Comparación de actividad de ADCC de preparaciones fucosiladas y desfucosiladas de anticuerpos IgGl que contienen una región Fe variante o de tipo silvestre. Las gráficas muestran el porcentaje de células destruidas en un ensayo para citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (% de lisis específica) en comparación con el log de la concentración de anticuerpo [pM] . En el panel superior, una línea celular que expresa altos niveles del antígeno al que se une el anticuerpo, se usó como célula diana (SKBR3) . En el panel inferior, una línea celular que expresa niveles moderados del antígeno, se usó como célula diana (JIMT1) . Los diversos anticuerpos IgGl humanos usados en estos ensayos se indican en la gráfica de la siguiente manera: "M01" indica un anticuerpo IgGl que contiene una región Fe de tipo silvestre que se une al antígeno; "AFUCO-M01" indica una preparación del mismo anticuerpo IgGl que no contiene fucosa; "W117" indica un anticuerpo IgGl que se une al antígeno y contiene una región Fe variante W117; "AFUC0-W117" indica una preparación de W117 que no contiene fucosa; "W125" indica un anticuerpo IgGl que se une al antígeno y contiene una región Fe variante W125; y "AFUCO-W125" indica una preparación de "W125" que no contiene fucosa .

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones E356K y D399K (que codifican un polipéptido Fe de variante M04) SEQ ID NO: 6 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, Q311M y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variantes M75, M77 y M78) .

SEQ ID NO: 8 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones E356K, D399K, L234Y, E294L e Y296W (que codifican un polipéptido Fe de variantes M77, M138, 142, W157 y 160) .

SEQ ID NO: 10 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, E233L, Q311M y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante M138) SEQ ID NO: 12 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, L234I, Q311M, y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante M142) SEQ ID NO: 14 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 15 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, S298T y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante W23) SEQ ID NO: 16 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones E356K, D399K, L234Y, K290Y e Y296 (que codifican un polipéptido Fe de variantes 23, W141, W144, W165, W168, W187 y W189) .

SEQ ID NO: 18 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 19 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, A330M y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante 141) SEQ ID NO: 20 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 21 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, A330F y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante W144) SEQ ID NO: 22 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipépt dos Fe codificada por SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 23 Secuencia de nucleotidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, Q311M, A330M y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante W157) SEQ ID NO: 24 Secuencia de aminoácidos de la región Fe codificada por SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25 Secuencia de nucleotidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, Q311M, A330F y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante W160) SEQ ID NO: 26 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 27 Secuencia de nucleotidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, S298T, A330M y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K392D, K409D, S239D, S298T y K334V (que codifican un polipéptido Fe de variante W189) SEQ ID NO 34 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO 35 Secuencia de aminoácidos de la proteína FcvRIIIA-158V humana madura SEQ ID NO 36 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones A330M, K334V, K392D y 409D (que codifican una cadena de polipéptidos Fe variante que es parte de W117 y W125) SEQ ID NO 37 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO 38 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones L234Y, Y296W, E356K y D399K (que codifican un polipéptido Fe de variante W117) SEQ ID NO: 39 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 40 Secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de polipéptidos Fe de IgGl humana que contiene las sustituciones K290Y, Y296W, E356K y D399K (que codifican un polipéptido Fe de variante W125) SEQ ID NO: 41 Secuencia de aminoácidos de la cadena de polipéptidos Fe codificada por SEQ ID NO: 40 DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Existe una necesidad en la técnica de polipéptidos terapéuticos que se unen a una molécula diana y que tienen actividad mejorada como productos terapéuticos debido a funciones efectoras potenciadas asociadas con las proteínas que contienen Fe, tales como ADCC, CDC y/o ADCP. Las proteínas pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de cáncer, enfermedades autoinmunitarias e infecciosas, y cualquier afección donde la destrucción selectiva de células que expresan una molécula diana particular es beneficiosa. ADCC depende de la interacción de los receptores Fcy (FCYR) , especialmente FCYRIIIA en humanos, con la región Fe de un anticuerpo o proteína que contiene Fe. Tal como se muestra en la Figura 1, la interacción de FCYRIIIA humana con una región Fe humana es asimétrica, es decir, FCYRIIIA entra en contacto con diferentes residuos de aminoácidos en las dos cadenas de polipéptidos que componen la región Fe. Véase también Sondermann et ál . (2000), Nature 406: 267-273. Los sitios de unión de FcyR en una región Fe de IgG fueron mapeados con bastante detalle. Shields et ál . (2001), J. Biol. Chem. 276(9) : 6591-6604. Específicamente, las porciones de FCYRIIIA se encuentran entre 5.0 Á de residuos de aminoácidos L235, S239, D265, L328, P329, A330 y 1332 en una cadena de polipéptidos Fe y residuos de aminoácidos L235, P238, S239, D265, S267, D270, Y296, N297, S298, T299 y A327 en la otra tal como se determina por cristalografía de rayos X. Por lo tanto, las alteraciones asimétricas en la región Fe puede ser necesaria para potenciar al máximo la interacción de FcyRIIIA con la región Fe de una proteína que contiene Fe y, por lo tanto, potenciar ADCC. En otro aspecto, las regiones Fe heterodiméricas también pueden tener diferentes regiones de unión unidas a cada cadena de polipéptidos Fe, creando así una molécula que puede tener diferentes especificidades de unión en cada uno de sus brazos de unión. La presente invención proporciona proteínas que contienen Fe que comprenden las sustituciones asimétricas en sus regiones Fe y que tienen unión aumentada a FcyRIIIA y actividad de ADCC potenciada. En algunos casos, los polipéptidos también pueden ser biespecíficos , o multiespecífieos , es decir, se pueden unir a dos o más moléculas diana diferentes.

Definiciones Toda la enumeración de residuos de aminoácidos en una región constante IgG se realiza de acuerdo con el sistema de enumeración EU tal como se usa en Edelman et ál . (1969) , Proc . Nati. Acad. Sci. 63: 78-85. Las partes de esta referencia que describen y/o ilustran este sistema de enumeración se incorporan a la presente mediante esta referencia. Este sistema es una enumeración secuencia de aminoácidos de un anticuerpo IgGl humano. La Figura 2 muestra la secuencia de la región Fe de un anticuerpo IgGl humano enumerado de acuerdo con el sistema EU. Los residuos de aminoácidos particulares en una región constante IgGl de un anticuerpo se anotan usando el código de una sola letra para los aminoácidos y el sistema de enumeración EU. Por ejemplo, "D399" se refiere a un ácido aspártico que está presente en IgG de tipo silvestre en la posición 399. Las mutaciones en un residuo particular se anotan de forma similar. Por ejemplo, "D399K" se refiere al ácido aspártico que está presente en un IgGl de tipo silvestre en la posición 399 se cambió a lisina.

"ADCC" se refiere al proceso denominado citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, que es una respuesta inmunitaria mediada principalmente por linfocitos citolíticos naturales (NK) en humanos. En ADCC, FCYRIII en la superficie de una célula NK reconoce la región Fe del anticuerpo que se une al antígeno expuesto en la superficie de una célula diana. Esto activa la célula NK, que libera perforinas y granzimas, lo que lleva a lisis y apoptosis de las células diana.

"CDC" se refiere al complejo denominado citotoxicidad dependiente del complemento que puede llevar a destrucción celular a través de la acción de una cascada de proteínas que pueden actuar a través de cualquiera de las dos sendas importantes. Véase, por ej . , Liszewski and Atkinson, Ch. 26 in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3a ed., Paul, ed.f Raven Press, Nueva York, 1993, pp . 917-940, cuyas partes que describen CDC se incorporan en la presente mediante esta referencia.

"ADCP" se refiere al proceso denominado fagocitosis mediada por célula dependiente de anticuerpo. En este proceso mediado por el receptor de Fe, las células diana a las que se unen los anticuerpos se hunden con células fagocíticas, tales como macrófagos, monocitos, neutrófilos y células dendríticas. Múltiples receptores Fe están implicados en este proceso. Richards et ál . , Mol .Cáncer Ther. 7(8): 2517-2527 (2008) describen un ensayo in vi tro para ADCP. La parte de Richards et ál . que describe este ensayo se incorpora a la presente mediante esta referencia.

Un "anticuerpo" tal como se usa en la presente, es una proteína que contiene al menos una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada, en muchos casos una región variable de cadena ligera y una pesada. Por lo tanto, el término "anticuerpo" comprende anticuerpos Fv de cadena simple (scFv, que contienen regiones variables de cadena pesada y ligera unidos mediante un enlazador) , anticuerpos Fab, F(ab)2', Fab' , scFv:Fc (tal como se describe en Carayannopoulos and Capra, Cap. 9 en FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3a., Paul, ed. , Raven Press, Nueva York, 1993, pp. 284-286) o anticuerpos de longitud completa que contienen dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, tal como anticuerpos IgG de origen natural encontrados en mamíferos. Id. Tales anticuerpos IgG pueden ser del isotipo IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 y pueden ser anticuerpos humanos. Las porciones de Carayannopoulos y Capra que describieron la estructura de anticuerpos se incorporan en la presente mediante esta referencia. Además, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos diméricos que contienen dos cadenas pesadas y ninguna cadena ligera como los anticuerpos de origen natural encontrados en camellos y otras especies de dromedarios y tiburones. Véase, por ej . , Muldermans et ál . , 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et ál . , 2001, J. Biol . Chem. 276:26285-90; Streltsov et ál . (2005) , Protein Science 14: 2901-2909. Un anticuerpo puede ser monoespecíf ico (es decir, que se une a solo un tipo de antígeno) o tnultiespecífico (es decir, que se une a más de un tipo de antígeno) . En algunas modalidades, un anticuerpo puede ser biespecífico (es decir, que se une a dos tipos diferentes de antígeno) . Además, un anticuerpo puede ser monovalente, bivalente o multivalente , lo que significa que puede unirse a uno o dos o más moléculas de antígeno a la vez. Algunos de los posibles formatos para los anticuerpos incluyen anticuerpos monoespecífieos o biespecíficos de longitud completa, anticuerpos monovalentes monoespecíficos (tal como se describe en la Solicitud Internacional W0 2009/089004 y Publicación estadounidense 2007/0105199, las porciones relevantes de lo que se incorpora en la presente mediante esta referencia) , que pueden inhibir o activar la molécula a la que se unen, Fv-Fc, scFv-Fc dimérico biespecífico o monoespecífico bivalente, o diacuerpo Fe, scFv-Fc/Fc monovalente monoespecífico y las proteínas de unión multiespecíficas e inmunoglobulinas de dominio variable duales descritas en la Publicación estadounidense 2009/0311253 (las partes relevantes de lo que se incorpora en la presente mediante esta referencia) , entre muchos otros formatos de anticuerpo posibles.

Una "proteína de fusión Fe" tal como se indica en la presente, es una proteína que contiene una cadena de polipéptidos Fe fusionada a otro polipéptido, que comprende una región variable que se une a una molécula diana, y que no comprende una región variable de cadena ligera de un anticuerpo. La región de unión de una proteína de fusión Fe puede comprender un polipéptido no inmunoglobulina tal como una parte soluble de un receptor o uno o más péptidos que se unen a una molécula diana (tales como, por ejemplo, un "dominio monómero" tal como se define en la patente estadounidense 7,820,790 que se une a una proteína diana, que se puede seleccionar tal como se describe en la patente estadounidense 7,820,790), u otros polipéptidos . Las partes de la patente estadounidense 7,820,790 que describen los dominios de monómero y cómo se seleccionan se incorporan en la presente mediante esta referencia. Otros polipéptidos que pueden ser parte de una región de unión de una protéína de fusión Fe incluyen polipéptidos que comprenden dominios de andamiaje que se aleatorizaron en determinadas posiciones y se sometieron a selección por unión a determinadas molécula diana. Los dominios de andamiaje incluyen, por ejemplo, proteína 4 asociada a T-linfocito (CTLA-4; Nuttall et ál . (1999), Proteins 36: 217-227), el dominio Z de proteína estafilocóccica 1 (Nord et ál . (1995), Protein Eng. 8: 601-608), proteína fluorescente verde, y el décimo tipo del dominio III de fibronectina humana (FN3; Koide et ál . (1998), J. Mol. Biol. 284: 1141-1151; Karatan et ál . (2004), Chem. & Biol . 11: 835-844) . Las partes de estas referencias que describen los dominios de andamiaje y su uso para generar dominios de unión se incorporan a la presente mediante esta referencia. Las proteínas de fusión Fe, como otras proteínas que contienen cadena de polipéptidos Fe por lo general forman multímeros, que pueden ser dímeros . Dado que las regiones Fe descritas en la presente son generalmente heterodiméricas, las proteínas de fusión FC pueden formar heterodímeros . En tal caso, el polipéptido fusionado a la cadena de polipéptidos Fe puede ser diferente en cada una de las cadenas de polipéptidos, que juntas forman el heterodímero. Por lo tanto, una proteína de fusión Fe puede ser heterodimérica y biespecífica o monoespecífica o multiespecífica .

Una "región de unión", tal como se indica en la presente, es una región de una proteína que contiene Fe descrita en la presente que se une a una molécula diana, tal como, por ejemplo, una proteína que se expresa en altos niveles en una célula cancerosa, en una célula que media una afección autoinmunitaria o inflamatoria, en una célula infectada, en un agente infeccioso, o en una célula que media una función efectora inmune, por ejemplo, una célula NK. Una región de unión puede contener una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada o un polipéptido no inmunoglobulina .

Un "scFv-Fc," tal como se indica en la presente, es un polipéptido que consiste en una región variable de cadena ligera y pesada de un anticuerpo unida por un enlazador, que está seguida por una cadena de polipéptidos Fe de un anticuerpo, opcionalmente la región Fe de un anticuerpo IgG humano, tal como un anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4.

Una "cadena pesada" de longitud completa, tal como se indica en la presente, comprende una región variable de cadena pesada (VH) , un primer dominio constante de cadena pesada (¾1) , un dominio bisagra, un segundo dominio constante de cadena pesada (CH2) , y tercer dominio constante de cadena pesada (CH3) .

Una "cadena ligera" de longitud completa tal como se indica en la presente, comprende una región variable de cadena ligera (VL) y un dominio constante de cadena ligera (CL) .

Tal como se indica en la presente, una "región Fe" es un dimero que consiste en dos cadenas de polipéptidos unidas por uno o más enlaces disulfuro, cada cadena comprende parte o todo un dominio bisagra más un dominio ¾2 y CH3. Cada una de las cadenas de polipéptidos se denomina "cadena de polipéptidos Fe". Para distinguir las dos cadenas de polipéptidos Fe, una se denomina en la presente "cadena A" y la otra se denomina "cadena B" . Más específicamente, las regiones Fe contempladas para su uso con la presente invención son las regiones Fe de IgG, que pueden ser regiones Fe de IgGl, IgG2, IgG3 , o IgG4 humanas o de mamífero. Entre las regiones Fe de IgGl, se conocen al menos dos tipos alélicos. Un tipo alélico tiene la secuencia tal como se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) . Otro tiene dos sustituciones con relación a la secuencia en la Figura 2, a saber E356D y M358L. En otra IgGl humana de origen natural, la alanina en la posición 431 (correspondiente a la posición 216 en SEQ ID NO: 2) es una glicina. Una región Fe de IgGl humana tal como se indica en la presente puede contener cualquiera de estas variaciones de la secuencia de aminoácidos .

Una "proteína que contiene Fe" tal como se indica en la presente es una proteína que comprende una región Fe tal como se describe en la presente y una región de unión que se une a una molécula diana. El término "proteína que contiene Fe" comprende un anticuerpo o una proteína de fusión Fe que contiene una región Fe.

"FcvRIIIA-158V" se refiere a la variante alélica de FCYRIIIA humana que tiene una valina en la posición 158 en la secuencia de aminoácidos de FCYRIIIA tal como en SEQ ID NO: 35. De manera similar, "FcvRIIIA-158F" se refiere a la variante alélica de FcyRIIIA humana que tiene una fenilalanina en la posición 158 en la secuencia de aminoácidos de FcyRIIIA. La secuencia de FcyRIIIA-158F humana, que incluye el péptido de señal de 17 aminoácidos, se informa con el número de acceso NCBI NP_001121065, que se incorpora a la presente mediante esta referencia. Dado que esta secuencia incluye el péptido de señal, que se encuentra ausente en la proteína madura, la posición 158 es equivalente al aminoácido 176. SEQ ID NO: 35 contiene la secuencia de aminoácidos de la forma madura de FCYRIIIA-158V.

Una región Fe "heterodimérica" tal como se indica en la presente es una en la que la cadena A y la cadena B de la región Fe tienen diferentes secuencias de aminoácidos en vez de secuencias de aminoácidos idénticas. "scFv-Fc/Fc" es una proteína dimérica que consiste esencialmente en scFv-Fc más una cadena de polipéptidos Fe (denominada en la presente "Fe vacía") . scFv-Fc se puede unir a la Fe vacía mediante uno o más puentes disulfuro. Además, la región Fe puede contener "alteraciones de heterodimerización" en los dominios CH3 , tales como uno, dos, tres o más pares de sustituciones pares de carga, tal como se describe a continuación.

La "interfaz CH3-CH3" consiste en aquellos aminoácidos en la región CH3 que entra en contacto próximo con residuos de la otra región CH3 en el contexto de una región Fe y/o un anticuerpo de longitud completa. Más específicamente estos residuos se encuentran entre 4.5 Á de un residuo de aminoácidos en la otra región CH3 en el contexto de una región Fe. En un anticuerpo IgGl , estos son los residuos en las siguientes posiciones (con el número de residuo EU seguido de la posición en SEQ ID NO : 2 entre paréntesis) : 347 (132), 349 (134), 350 (135), 351 (136), 352 (137), 353 (138), 354 (139), 355 (140), 356 (141), 357 (142), 360 (145), 364 (149), 366 (151), 368 (153), 370 (155), 390 (175), 392 (177), 393 (178), 394 (179), 395 (180), 397 (182), 398 (183), 399 (184), 400 (185), 405 (190), 407 (192), 408 (193), 409 (194), y 439 (224) .

"Quimioterapia" tal como se usa en la presente, se refiere al tratamiento de un paciente con cáncer con un "agente quimioterapéutico" que tiene efectos citotóxicos o citoestáticos sobre las células cancerosas. Un "agente quimioterapéutico" se dirige específicamente a las células comprendidas en la división celular y no a las células que no están comprendidas en la división celular. Los agentes quimioterapéuticos interfieren directamente con los procesos que están unidos íntimamente con la división celular tales como, por ejemplo, replicación del ADN, síntesis de AR , síntesis de proteínas, armado, desarmado o función del huso mitótico y/o la síntesis o estabilidad de las moléculas que cumplen una función en estos procesos, tales como nucleótidos o aminoácidos. Por lo tanto, un agente quimioterapéutico tiene efectos citotóxicos o citoestáticos sobre células cancerosas y las otras células que se encuentran comprendidas en la división celular. Los agentes quimioterapéuticos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo: agentes alquilantes (por ej . , busulfán, temozolomida, ciclofosfamida, lomustina (CC U) , metillomustina, estreptozotocina, cis-diamminedi-cloroplatino, aziridinilbenzo-quinona, y tiotepa) ; iones inorgánicos (por ej . , cisplatino y carboplatino) ; mostazas de nitrógeno (por ej . , melfalán clorhidrato, ifosfamida, clorambucilo, y mecloretamina HC1) ; nitrosoureas (por ej . , carmustina (BCNU) ) ; antibióticos antineoplásicos (por ej . , adriamicina (doxorubicina) , daunomicina, mitomicina C, daunorubíciña, idarubicina, mitramicina, y bleomicina) ; derivados vegetales (por ej . , vincristina, vinblastina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, vindesina, VP-16, y VM-26) ; antimetabolitos (por ej . , metotrexato con o sin leucovorina, 5-fluorouracilo con o sin leucovorina, 5-fluorodesoxiuridina, 6-mercaptopurina, 6 -tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, gemcitabina, y fludarabina) ; podofilotoxinas (por ej . , etopósido, irinotecán, y topotecán) ; así como actinomicina D, dacarbazina (DTIC) , mAMSA, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, L-asparaginasa, y mitoxantrona, entre muchos otros conocidos en la técnica. Véase, por ej . , Cáncer: Principies and Practice of Oncology, 4a edición, DeVita et ál., eds.( J.B. Lippincott Co. , Filadelfia, PA (1993), cuyas partes relevantes se incorporan en la presente mediante esta referencia. Los agentes alquilantes y las mostazas de nitrógeno actúan mediante ADN alquilante, que limita el desenrollado y la replicación de cadenas. Metotrexato, citarabina, 6-mercaptopurina, 5-fluorouracilo y gemcitabina interfieren con la síntesis de nucleótidos. Los derivados vegetales tales como paclitaxel y vinblastinas son venenos del huso mitótico. Las podofilotoxinas inhiben topoisomerasas , lo que interfiere con la replicación del ADN. Los antibióticos doxorubicina, bleomicina, y mitomicina interfieren con la síntesis de ADN intercalando entre las bases de ADN (inhibiendo el desenrollado) , lo que provoca la ruptura de cadenas, y ADN alquilante, respectivamente. Otros mecanismos de acción incluyen la carbamilación de aminoácidos (lomustina, carmustina) y el agotamiento de grupos de asparagina (asparaginasa) . Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17a edición, apartado 11, Hematology and Oncology, 144. Principies of Cáncer Therapy, Tabla 144-2 (1999). Entre los agentes quimioterapéuticos se incluyen específicamente los que afectan directamente los mismos procesos celulares que se ven afectados directamente por los agentes quimioterapéuticos enumerados anteriormente.

"Agentes anti-neoplásicos no quimioterapéuticos" son agentes químicos, compuestos o moléculas que tienen efectos citotóxicos o citostáticos en células cancerosas que no son agentes quimioterapéuticos. Los agentes antineoplásicos no quimioterapéuticos pueden, sin embargo, dirigirse para interactuar directamente con moléculas que afectan indirectamente la división celular tal como los receptores de la superficie celular, que incluyen los receptores de hormonas o factores de crecimiento. Sin embargo, los agentes antineoplásicos no quimioterapéuticos no interfieren directamente con procesos que están íntimamente vinculados a la división celular tales como, por ejemplo, replicación del ADN, síntesis de ARN, síntesis de proteína o función del huso mitótico, armado o desarmado. Los ejemplos de agentes antineoplásicos no quimioterapéuticos incluyen los inhibidores de Bcl2, inhibidores de farnesiltransferasa, agentes anti-estrogénicos tales como tamoxifeno, compuestos anti-androgénicos, interferón, arsénico, ácido retinoico, derivados de ácido retinoico, anticuerpos dirigidos a antígenos específicos de tumores e inhibidores de Bcr-Abl tirosina cinasa (por ej . la molécula pequeña STI-571 comercializada con el nombre comercial GLEEVEC™ por Novartis, Nueva York y Nueva Jersey, EUA y Basilea, Suiza) , entre muchos otros agentes anti -neoplásicos no quimioterapéuticos posibles .

Las "alteraciones de heterodimerización" se refieren generalmente a alteraciones en las cadenas A y B de una región Fe que facilitan la formación de regiones Fe heterodiméricas , es decir, regiones Fe donde la cadena A y la cadena B de la región Fe no tienen secuencias de aminoácidos idénticas. Las alteraciones de heterodimerización pueden ser asimétricas, es decir, una cadena A que tiene una determinada alteración puede emparejarse con una cadena B que tiene una alteración diferente. Estas alteraciones facilitan la heterodimerización y desfavorecen la homodimerización . El hecho de que los hetero- u homo-dímeros se formaron o no puede evaluarse mediante diferencias de tamaño según se determina por electroforesis en gel de poliacrilamida en situaciones donde una cadena de polipéptidos es una Fe vacía y la otra es un scFv-Fc. Un ejemplo de las alteraciones de heterodimerización emparejadas son las denominadas sustituciones de "salientes y orificios". Véase, por ej . , la patente estadounidense 7,695,936 y publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0078385, cuyas partes que describen las mutaciones se incorporan en la presente mediante esta referencia. Según la presente, una región Fe que contiene un par de sustituciones de salientes y orificios, contiene una sustitución en la cadena A y otra en la cadena B. Por ejemplo, se encontró que las siguientes sustituciones de salientes y orificios en las cadenas A y B de una región Fe de IgGl aumentan la formación de heterodímeros en comparación con las encontradas con cadenas A y B no modificadas: 1) Y407T en una cadena y T366Y en la otra; 2) Y407A en una cadena y T366W en la otra; 3) F405A en una cadena y T394W en la otra; 4) F405W en una cadena y T394S en la otra; 5) Y407T en una cadena y T366Y en la otra; 6) T366Y y F405A en una cadena y T394W e Y407T en la otra; 7) T366 y F405W en una cadena y T394S e Y407A en la otra; 8) F405W e Y407A en una cadena y T366 y T394S en la otra; y 9) T366W en un polipéptido de la Fe y T366S, L368A, e Y407V en la otra. De manera alternativa o además de las alteraciones, sustituciones que crean nuevos puentes de disulfuro pueden facilitar la formación de heterodímeros . Véase, por ej . , la publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0078385, cuyas partes que describen las mutaciones se incorporan en la presente mediante esta referencia. Las alteraciones en una región Fe de IgGl incluyen, por ejemplo, las siguientes sustituciones: Y349C en una cadena de polipéptido Fe y S354C en la otra; Y349C en una cadena de polipéptido Fe y E356C en la otra; Y349C en una cadena de polipéptido Fe y E357C en la otra; L351C en una cadena de polipéptido Fe y S354C en la otra; T394C en una cadena de polipéptido Fe y E397C en la otra; o D399C en una cadena de polipéptido Fe y K392C en la otra. De manera similar, las sustituciones que cambian la carga de uno o más residuos, por ejemplo, en la interfaz CH3-CH3, pueden potenciar la formación de heterodímeros tal como se explica en la O 2009/089004, cuyas partes que describen las sustituciones se incorporan en la presente mediante esta referencia. Las sustituciones se denominan en la presente "sustituciones de pares de carga", y una región Fe que contiene un par de sustituciones de pares de carga contiene una sustitución en la cadena A y una sustitución diferente en la cadena B. Los ejemplos generales de sustituciones de pares de carga incluyen los siguientes: 1) K409D o K409E en una cadena más D399K o D399R en la otra; 2) K392D o K392E en una cadena más D399K o D399R en la otra; 3) K439D o K439E en una cadena más E356K o E356R en la otra; y 4) K370D o K370E en una cadena más E357K o E357R en la otra. Además, las sustituciones R355D, R355E, K360D o K360R en ambas cadenas pueden estabilizar heterodímeros al usarse con otras alteraciones de heterodimerización . Las sustituciones de pares de carga específicas pueden usarse ya sea solas o con otras sustituciones de pares de carga. Los ejemplos específicos de pares simples de sustituciones de pares de carga y combinaciones de estos incluyen los siguientes: 1) K409E en una cadena más D399K en la otra; 2) K409E en una cadena más D399R en la otra; 3) K409D en una cadena más D399K en la otra; 4) K409D en una cadena más D399R en la otra; 5) ?392? en una cadena más D399R en la otra; 6) K392E en una cadena más D399K en la otra; 7) K392D en una cadena más D399R en la otra; 8) K392D en una cadena más D399K en la otra; 9) K409D y K360D en una cadena más D399K y E356K en la otra; 10) K409D y K370D en una cadena más D399K y E357K en la otra; 11) K409D y K392D en una cadena más D399K, E356K, y E357K en la otra; 12) K409D y K392D en una cadena y D399K en la otra; 13) K409D y K392D en una cadena más D399K y E356K en la otra; 14) K409D y K392D en una cadena más D399K y D357K en la otra; 15) K409D y K370D en una cadena más D399K y D357K en la otra; 16) D399K en una cadena más K409D y K360D en la otra; y 17) K409D y K439D en una cadena más D399K y E356K en la otra. Puede usarse cualquiera de estas alteraciones de heterodimerización en polipéptidos que comprenden las regiones F variantes descritas en la presente, que se unen a FCYRIIIA con una KD inferior de lo que lo hace un polipéptido similar con una región Fe inalterada.

Una "molécula diana", según la presente, es una molécula a la cual se une la región de unión de una proteína que contiene Fe descrita en la presente. En algunas modalidades, una molécula diana es una proteína que se expresa a altos niveles, por ejemplo, en una célula cancerosa, en una célula que media una afección autoinmunitaria o inflamatoria, en una célula infectada, en un agente infeccioso o en una célula que media una función efectora inmunitaria, por ejemplo, una célula NK.

"Carga tumoral" se refiere a la cantidad de células cancerosas viables, la cantidad de sitios de tumor y/o el tamaño del tumor o tumores en un paciente que padece cáncer. Se puede observar una reducción en la carga tumoral, por ejemplo, como una reducción en la cantidad de una proteína o antígeno asociado a tumores en la sangre u orina de un paciente, una reducción en la cantidad de células tumorales o sitios de tumor y/o una reducción en el tamaño de uno o más tumores .

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una proteína que comprende una región Fe variante tal como se describe en la presente es una cantidad que tiene el efecto de, por ejemplo, reducir o eliminar la carga tumoral de un paciente con cáncer o reducir o eliminar los síntomas de cualquier estado patológico que la proteína trata. Una cantidad terapéuticamente eficaz no necesita eliminar por completo todos los síntomas de la afección, pero puede reducir la gravedad de uno o más síntomas o relentecer el inicio de síntomas más graves o una enfermedad más grave que puede ocurrir con frecuencia tras la afección tratada.

El "tratamiento" de cualquier enfermedad mencionada en la presente comprende un alivio de al menos un síntoma de la enfermedad, una reducción de la gravedad de la enfermedad o el retardo o prevención de la evolución de la enfermedad a síntomas más graves que pueden, en algunos casos, acompañar la enfermedad o provocar al menos otra enfermedad. Tratamiento no debe significar que la enfermedad se cura totalmente. Un agente terapéutico útil necesita no solo reducir la gravedad de una enfermedad, reducir la gravedad de uno o más síntomas relacionados con la enfermedad o su tratamiento, o relentecer el inicio de síntomas más graves o una enfermedad más grave que puede ocurrir con frecuencia tras la afección tratada.

Proteínas que contienen regiones Fe variantes La presente invención comprende proteínas que contienen Fe que comprenden una región de unión que se une a una molécula diana y una región Fe variante. Estas incluyen anticuerpos y proteínas de fusión Fe, que contienen regiones Fe de IgG humanas o no humanas, que pueden ser las regiones Fe de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 , que se alteran en residuos de aminoácidos seleccionados en comparación con una región Fe humana o no humana no cambiada y que se une a FCYRIIIA con afinidad potenciada en comparación con la región Fe humana o no humana no cambiada. Debido a que FCYRIIIA interactúa con una región Fe de forma asimétrica, es decir, contactando diferentes residuos de aminoácidos en las dos cadenas de polipéptidos Fe que conforman la región Fe, las regiones Fe alteradas asimétricamente descritas en la presente pueden ser particularmente eficaces en potenciar la afinidad a FCYRIIIA y, por ende, ADCC. Las regiones Fe humanas alteradas descritas en la presente pueden alterarse de modo que las secuencias de las dos cadenas de polipéptidos Fe que conforman una región Fe, es decir, la cadena A y la cadena B, difieren. Para facilitar la formación de las regiones Fe alteradas asimétricamente, estas regiones Fe pueden también contener alteraciones de heterodimerización, que son diferentes en las cadenas A y B, que desalientan la formación de proteínas que contienen Fe homodiméricas y alientan la formación de proteínas que contienen Fe heterodiméricas. Las proteínas que contienen las regiones Fe alteradas pueden ser más eficaces en la unión a FCYRIIIA y al provocar ADCC en comparación con proteínas que comprenden una región Fe inalterada, o a una región Fe que contiene solo alteraciones de heterodimerización, y pueden tener eficacia aumentada como terapéuticos in vivo, por ejemplo en indicaciones oncológicas o neoplásicas y/o al tratar afecciones autoinmunitarias o infecciosas. Entre los anticuerpos y proteínas de fusión Fe descritos en la presente se incluyen heterodímeros donde cada cadena de polipéptidos Fe se fusiona a una proteína diferente. Las proteínas de fusión Fe son bivalentes y biespecíficas . También se incluyen proteínas de fusión Fe bivalentes y monoespecíficas . De manera similar, los anticuerpos de longitud completa monoespecíficos o biespecíficos , anticuerpos monovalentes y scFv-Fc monoespecífieos o biespecíficos se encuentran entre los diversos tipos de proteínas que pueden contener las regiones Fe alteradas descritas en la presente. La invención también comprende ácidos nucleicos que codifican las cadenas de polipéptidos Fe en las regiones Fe alteradas y proteínas que contienen estas cadenas de polipéptidos Fe. También se proporcionan métodos para realizar estas proteínas y métodos para usar estas proteínas para tratar varias afecciones humanas.

Existen tres clases diferentes de receptores gamma Fe humanos (FcyR) para anticuerpos IgG, FcyRI , FcyRII y FCYRIII. Abes et ál . (2009), Expert Rev. Clin. Immunol . 5(6): 735-747. Se caracterizaron siete subclases, es decir, FcyRIA, FCYRIB, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, FCYRIIIA y FCYRIIIB. Id. Estas subclases pueden dividirse además en isoformas provocadas por el empalme alternativo, y también se encontraron diversas variantes alélicas que tienen distintas capacidades para unirse a varias subclases de IgG y provocar funciones efectoras. Id. La mayoría de estos receptores activan células tras su vínculo por anticuerpos IgG, especialmente anticuerpos IgGl o IgG3 , provocando citotoxicidad, liberación de citocinas y fagocitosis/endocitosis seguido por presentación de antígenos. La activación es mediada a través de un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (????) presente ya sea en el dominio intracelular de FcyR o en la parte intracelular de una proteína de señalización accesoria. Id. Los receptores FcyRIIB son los únicos FcyR inhibidores humanos conocidos y contienen un motivo de inhibición del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) en el dominio intracelular que media la inhibición de la activación celular. Id.

La afinidad potenciada de un anticuerpo con FcyRIIIA puede ser indicativa de la eficacia clínica potenciada en indicaciones oncológicas. Las variantes alélicas de FcyRIIIA que tienen ya sea una valina o una fenilalanina en el aminoácido 158 se han asociado con mayor o menor afinidad de unión a IgG, respectivamente. Koene et ál. (1997), Blood 90(3): 1109-1114. Estas diferencias alélicas también se correlacionan de forma significativa con la eficacia clínica observada en pacientes con linfoma folicular tratados con rituximab (un anticuerpo monoclonal IgGl anti-CD20) y en pacientes con tumores sólidos tratados ya sea con cetuximab (un anticuerpo monoclonal del receptor del factor de crecimiento anti epidérmico IgGl quimérico) o trastuzumab (un anticuerpo monoclonal del receptor 2 del factor de crecimiento anti epidérmico IgGl) . Abes et ál . (2009), Expert Rev. Clin. Immunol . 5(6): 735-747. En la presente se proporcionan proteínas que contienen Fe que tienen actividad potenciada para ambos alelos de FCYRIIIA y por ende pueden tener también eficacia potenciada como terapéuticos en indicaciones oncológicas.

Cada una de las cadenas de polipéptidos Fe, es decir, la cadena A y la cadena B que juntas componen una región Fe alterada de la invención, pueden tener secuencias de aminoácidos que difieren debido a sustituciones de aminoácidos con relación a la secuencia de una cadena de polipéptidos Fe de IgG humano. Una cadena de polipéptidos Fe puede ser de un polipéptido Fe de IgGl o IgG3 humano. En algunas modalidades, cada cadena de polipéptidos Fe comprende una a veinte, una a diez o una a cinco sustituciones de aminoácidos con relación a una secuencia Fe humana de origen natural. En otras modalidades, una cadena de polipéptidos Fe puede comprender cero, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación a una cadena de polipéptidos Fe humana de origen natural. En algunas modalidades, una cadena de polipéptidos Fe puede comprender no más de 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones pueden ocurrir, por ejemplo, en uno o más de los siguientes sitios en una cadena de polipéptidos Fe : E233, L234, L235, S239, F241, F243, K246, K248, D249, L251, M252, 1253 , S254, R255, T256, E258, T260, V264 , D265, S267, H268, E269, D270, E272, K274, F275, N276, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, R292, E293, E294, Q295, Y296, S298, Y300, R301, V302, V303, V305, T307, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, K317, E318, K320, K322, S324, K326, A327, L328, A330, 1332, E333, K334, T335, 1336, S337, K338, A339, K340, R355, E356, D356, E357, K360, K362, K370 K392, D399, K409, D413 , y/o K439. Las sustituciones individuales iguales o diferentes enumeradas anteriormente o combinaciones de estas sustituciones pueden usarse en una cadena A y una cadena B de una región Fe . Una región Fe variante puede comprender alteraciones en sitios además de los enumerados anteriormente.

En particular, los anticuerpos o proteínas de fusión Fe descritos en la presente, que comprenden una región Fe, pueden contener una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos particulares en una o ambas de la cadena A y la cadena B que componen la región Fe : E233L, L234I, L234Y, L235S, G236Y, S239D, S239E, S239N, S239T, F243M, F243L, F243V, F243I, K246 , K246E, K246S, K246V, K248Y, K248L, M252D, I253V, I253K, R255S, R255N, T256V, T256Q, E258S, E258V, H268E, H268K, A287F, K288T, K288I, K290G, K290F, K290S, K290W, K290Q, K290Y, E294L, Y296 , Y296L, S298A, S298C, S298T, V302Q, T307P, T307S, T307E, T307G, L309C, L309S, L309K, L309E, Q311M, N315A, N315S, A330H, A330F, A330M, I332E, K334L, K334V, K334A, K334M, A339T, K340N, R355D, R355E, E356K, E356R, D356K, D356R, E357K, E357R, K360D, K360E, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, D399R, K409D, K409E, D413N, K439D, y K439E. Además , cualquiera de las proteínas anteriores puede comprender alteraciones adicionales tales como alteraciones de heterodimerización . Por ejemplo, pueden comprender K392D y K409D en una cadena de polipéptidos Fe y E356K y D399K en la otra.

Más particularmente, las proteínas de la invención pueden comprender una región Fe donde las cadenas A y B comprenden las siguientes sustituciones: (1) K334V en una cadena de polipéptidos Fe e Y296W más S298C en la otra; (2) K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296W, y S298C en la otra; (3) L235S, S239D, y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296 en la otra; (4) L235S, S239D, y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296W, y S298C en la otra; (5) Q311M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, F243V, e Y296W en la otra; (6) Q311M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, E294L, e Y296W en la otra, como en, por ejemplo, SEQ ID NO : 8 y SEQ ID NO: 10, respectivamente; (7) Q311M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296W, y S298C en la otra; (8) S239D y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (9) S239D y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296 , y S298C en la otra; (10) F243V y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (11) F243V y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296W, y S298C en la otra; (12) E294L y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (13) E294L y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296W, y S298C en la otra; (14) K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y e Y296 en la otra; (15) K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y y S298C en la otra; (16) K334V en una cadena de polipéptidos Fe y E294L e Y296 en la otra; (17) K334V y S298C en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y e Y296W en la otra; (18) K334V y S298I en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y e Y296 en la otra; (19) K334V y S298T en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y e Y296W en la otra; (20) K334V y S298V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y e Y296 en la otra; (21) K334V y S298C en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296W, y K290Y en la otra; (22) K334V y S298I en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296W, y K290Y en la otra; (23) K334V y S298T en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296W, y K290Y en la otra; (24) K334V y S298V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, Y296 , y K290Y en la otra; (25) S298T y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra, como en, por ejemplo, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18, respectivamente; (26) A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296 en la otra; (27) A330F y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (28) Q311M y A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, E294L, e Y296W en la otra; (29) Q311M y A330F y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, E294L, e Y296W en la otra; (30) S298T y A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (31) S298T y A330F y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (32) S239D y A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (33) S239D y S298T y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (34) A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y K290Y, e Y296W en la otra; (35) A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y E294L e Y296W en la otra; (36) A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y e Y296W en la otra; (37) E233L y Q311M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, E294L, e Y296W en la otra; (38) L234I y Q311M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, E294L, e Y296W en la otra; (39) E233L y A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, K290Y, e Y296W en la otra; (40) L234I y Q311M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y, 290Y, e Y296W en la otra; (41) A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y L234Y e Y296W en la otra; o (42) A330M y K334V en una cadena de polipéptidos Fe y K290Y e Y296W en la otra. Cualquiera de las proteínas anteriores también comprende una alteración de heterodimerización tal como se describe anteriormente. En algunas modalidades, pueden comprender además K392D y K409D en una cadena de polipéptidos Fe y E356K y D399K en la otra.

Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de cadena de polipéptidos Fe, tal como se describe en la presente, incluyen SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 37, 39 y 41. Estas secuencias contienen alteraciones y sustituciones de heterodimerización que potencian la unión a FCYRIIIA.

Las proteínas que contienen Fe de la invención pueden contener regiones Fe de IgGl humanas heterodiméricas . Es decir, las dos cadenas de polipéptidos Fe que, juntas, conforman la región Fe tienen cada una secuencia de aminoácidos diferente. En algunas modalidades una región Fe heterodimérica de la invención contiene alteraciones de heterodimerización (tal como se define anteriormente) , de esta forma facilitando en gran medida la producción de proteínas que contienen la Fe heterodimérica.

Una región Fe de IgG está generalmente glicosilada en N297 cuando se produce por una célula de mamífero, y la ausencia de fucosa en este carbohidrato puede aumentar la unión a FCYRIII y la capacidad de un anticuerpo IgG de provocar ADCC. Malphettes et ál . (2010), Biotechnol . Bioeng. 106(5) : 774-783. Se han explorado una cantidad de enfoques para producir anticuerpos desfucosilados que incluyen el uso de la línea de células CHO Lecl3 para producir anticuerpos, uso de una línea celular para la producción de anticuerpos donde el gen de alfa-1 , 6-fucosiltransferasa (FUT8) o el gen transportador de GDP-fucosa (GFT) se ha alterado, uso de una línea celular para la producción de anticuerpos que contiene un ARN pequeño de interferencia contra el gen FUT8 o el gen GDP-manosa 4 , 6-deshidratasa, o coexpresión en una línea celular de producción de anticuerpos de ß-1,4-?-acetilglucoaminiltransferasa III (GnT-III) y Golgi OÍ-manosidasa II (Manll). Ishiguro et ál . (2010), Cáncer Sci 101: 2227-2233. Las proteínas que contienen Fe, que incluyen anticuerpos y proteínas de fusión Fe, descritas en la presente pueden estar "desfucosiladas " , es decir, básicamente sin fucosa o que contienen solo cantidades menores de fucosa. Según la presente, al menos alrededor de 85%, 90% o 95% de los glicanos liberados de una preparación de proteína desfucosilada no contiene fucosa. Los términos "desfucosilado" y "afucosilado" se usan de manera intercambiable en la presente. Las proteínas pueden producirse tal como se describe anteriormente, por ejemplo, en células CHO FUT8~/~ o GFT"/-. El contenido de fucosa de una proteína puede determinarse tal como se describe en Ishiguro et ál. (2010) , Cáncer Sci 101: 2227-2233, en 2228-2229, la parte relevante de la cual se incorpora a la presente mediante esta referencia.

Se sabe que varias proteínas se expresan a altos niveles en células cancerosas, en células que median una afección autoinmunitaria o inflamatoria o en agentes infecciosos o células infectadas. Las proteínas son potenciales moléculas diana para proteínas que contienen Fe terapéuticas descritas en la presente. Los anticuerpos o proteína de fusión Fe que se unen a las proteínas diana potenciales son particularmente adecuadas para usar con la presente invención. Las proteínas diana potenciales que se sabe se expresan en células cancerosas humanas incluyen las siguientes proteínas humanas: WT1, MUC1, LMP2 , EGFRvIII, HER-2/neu, MAGE-A3, NY-ESO-1, PSMA, GM2/GD2 sintasa, CEA, MLA A/MARTl, gplOO, survivina, antígeno prostático específico (PSA) , telomerasa transcriptasa inversa (hTERT) , puntos de ruptura de translocación de sarcoma, EPHA2 , fosfatasa ácida prostética (PAP) , inhibidor de melanoma de la apoptosis (ML-IAP) , a-fetoproteína (AFP) , molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) , ERG, NA17.A2 péptido (VLPDVFIRC) , caja par 3 (PAX3), cinasa de linfoma anaplásico (ALK) , receptor de andrógenos, ciclina Bl, ácido polisiálico, proteína RhoC de unión a GTP relacionada a rho, oncogén viral relacionado con mielocitomatosis v-myc (MYCN) , TRP-2, gangliósido GD3 , fucosilo GM1, mesotelina, antígeno de células madre de próstata (PSCA) , MAGE-A1, CYP1B1, PLACI, GM3 , BORIS, tetranectina (TN) , ETV6-AML1 (especialmente péptidos que incluyen el punto de ruptura), NY-BR-1, RGS5, SART3 , STn, anhidrasa carbónica IX, PAX5, precursor de proteína de unión a proacrosina sp32 (OY-TES-1) , proteína de esperma 17 (Spl7) , LCK, antígeno asociado con melanoma de alto peso molecular (HMWMAA, también denominado proteoglicano de condroitín sulfato de melanoma), AKAP-4, SSX2 , XAGE-1, B7H3 (también denominado CD276) , legumaína, TIE2 , proteína 4 del gen asociado con la próstata (PAGE-4) , receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) , protamina 2 (también denominado MAD-CT-1) , glomulina (también denominado FAP) , PDGFR-ß, SSX2 , SSX5 , antígeno 1 relacionado con Fos, CD20, integrina ?ß3, antígeno oncofetal 5T4 , CA IX, CD5, CD19, CD22 (también denominado Siglec-2) , CD30 (también denominado TNFRSF1) , CD33 (también denominado Siglec-3), CD40, CD44V6, CD55, CD56 (también denominado NCA ) , CTLA-4 (también denominado CD152) , EGFR, GD2 , HER2 , HLA-DR10 (MHC II), IGF1R, IL-6, sialilo Lewis Y, TAG-72, TAL6 , TRAILR2, VEGF, CD52 (también denominado CA PATH-1) , CD4, CD73, CA125 (también denominado MUC16) , CD66e, CD80 (también denominado B7-1) , PDGFR , antígeno de la membrana específica de la próstata (PSMA, también denominado glutamato carboxipeptidasa 2, entre muchos otros nombres) . Los antígenos de cáncer también incluyen la proteína de herpes virus 4 humano LMP2 , las proteínas de papillomavirus humano E6 y E7, y la glicoceramida globo H (tal como se describe en Gilewski et ál. (2001), Proc. Nati. Acad. Sci. 98(6): 3270-3275, cuyas partes que describen globo H se incorporan a la presente mediante esta referencia) , la subunidad a4 de las integrinas a4ß1 y a4ß7, la integrina a4ß7, BAFF, APRIL, CD2 , CD3 , CD20, CD52, CD73, CD80, CD86, la proteína de complemento C5, IgE, IL-?ß, IL-5, IL-6R, IL-12, IL-23, y necrosis tumoral factor . (TNF a) .

Otras dianas incluyen proteínas u otras moléculas descritas en la superficie de organismos patogénicos que incluyen virus, bacterias (que incluyen las especies Borrelia, Staphylococcus, Escherichia, entre muchas otras especies) , hongos (que incluyen levadura) , giardia, ameba, protistas eucariotas del género Plasmodium, ciliatos, tripanosomas , nematodos y otros parásitos eucariotas.

En modalidades donde la proteína que contiene Fe es monoespecífica o biespecífica o multiespecífica, la proteína que contiene Fe puede unirse a una o dos moléculas diana múltiples, que pueden ser moléculas diana idénticas o diferentes y pueden ser monómeros o multímeros, en las mismas células o diferentes tipos de células, para antagonizar o agonizar la vía de señalización; o para aumentar la avidez o especificidad de una interacción entre una molécula diana y otra molécula (que puede o no ser una molécula diana) . En otro aspecto, una proteína que contiene Fe biespecífica o multiespecífica puede unirse a una molécula diana, tal como las mencionadas en los párrafos anteriores, y otra molécula, que puede ser también una molécula diana, expresada a niveles elevados en una célula implicada en mediar una respuesta citotóxica por el sistema inmunitario, tal como, por ejemplo, NKG2D en células NK o CD3 o receptor de células T en células T. Tal como se explica anteriormente, la molécula diana podría ser, por ejemplo, uno de los siguientes: (1) una proteína humana que se expresa selectivamente en células cancerosas; (2) una proteína de un virus u otro patógeno que se expresa altamente en la superficie del patógeno o en la superficie de una célula hospedadora infectada con patógeno; o (3) una proteína humana que se expresa selectivamente en la superficie de un tipo de célula humana que media una afección tal como una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. Ácidos nucleicos que codifican proteínas que contienen regiones Fe alteradas También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican las cadenas de polipéptidos Fe de las proteínas que contienen Fe descritas en la presente. En un aspecto, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican polipéptidos Fe y/o proteínas que contienen Fe que los comprenden, que comprenden una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 37, 39 o 41. Los ejemplos de secuencias que codifican las cadenas de polipéptidos Fe incluyen las SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, 38 y 40. Estos ácidos nucleicos codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 37, 39 y 41, respectivamente. Muchas secuencias de ácido nucleico adicionales, que codifican las muchas cadenas de polipéptidos Fe variantes descritas en la presente, también están comprendidas en la presente invención. Estos ácidos nucleicos son útiles para, entre otras cosas, producir proteínas recombinantes que contienen cadenas de polipéptidos Fe alteradas, tal como se describe en la presente. Estas cadenas de polipéptidos Fe alteradas pueden ser parte de una región Fe heterodimérica que se une a FCYRIIIA con afinidad potenciada, tal como se muestra por la unión con una KD inferior que una región Fe de tipo silvestre. Los ácidos nucleicos también codifican una secuencia de señal que facilita la secreción de una proteína en células de mamífero y/o una región de unión que se una a una molécula diana. Debe entenderse en la técnica que las secuencias de señal se escinden del resto de una proteína durante la maduración y no son parte de una proteína madura, a pesar de que se codifican en un ácido nucleico que codifica la proteína. Las secuencias de señal pueden identificarse fácilmente, por ej . , tal como se describe en Kertein et ál . (2000), Bioinformatics 16(8): 741-742, Nielsen and Krogh (1998), Proc . Sixth Int. Conf . on Intelligent Systems for Molecular Biol (AAAI Press) : 122-130, Nielsen et ál . (1997), Protein Eng. 10(1) : 1-6, y Nielsen et ál. (1997), Int. J. Neural Systems 8(5&6) : 581-599. Las partes relevantes de estas referencias se incorporan a la presente mediante esta referencia. Los ácidos nucleicos de la invención incluyen ADN y ARN en formas de cadena simple y doble. En algunas modalidades, ambas cadenas de polipéptidos de una proteína que contiene Fe heterodimérica se codifican en una única molécula de ácido nucleico. En otras modalidades, una proteína que contiene Fe heterodimérica puede codificarse en dos, tres o más moléculas de ácido nucleico .

Un "ácido nucleico aislado", según la presente, es un ácido nucleico que se separó de secuencias adyacentes presentes en el genoma del organismo del cual el ácido nucleico se aisló inicialmente . Por ejemplo, si el ácido nucleico codifica una región Fe de IgGl humana alterada, las secuencias adyacentes serían las secuencias adyacentes a las secuencias que codifican una Fe de IgGl en el genoma humano. Debe entenderse que los ácidos nucleicos sintetizados químicamente o producidos enzimáticamente por PCR son "ácidos nucleicos aislados", según la presente. Una molécula de ácido nucleico aislada se refiere a una molécula de ácido nucleico en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de ácido nucleico mayor.

Métodos para realizar proteínas que contienen Fe con regiones Fe variantes Las proteínas que contienen Fe, tales como anticuerpos y proteínas de fusión, comprendidas por la invención pueden realizarse mediante métodos conocidos en la técnica. Más específicamente, un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene Fe que incluye una cadena de polipéptidos Fe alterada, tal como se describe en la presente, puede introducirse en un vector, que puede introducirse en una célula hospedadora. Debido a que las proteínas que contienen Fe heterodiméricas descritas en la presente contienen necesariamente al menos dos cadenas de polipéptidos, los ácidos nucleicos que codifican estas cadenas pueden estar presentes ya sea en un único vector o en dos o más vectores. Si se usa más de un vector, estos vectores pueden introducirse juntos en una célula hospedadora. Los vectores y células hospedadoras que comprenden ácidos nucleicos que codifican la proteína están comprendidos en la invención. La célula hospedadora que contiene los ácidos nucleicos que codifican la proteína que contiene Fe puede cultivarse en condiciones de modo que la proteína pueda expresarse. La proteína expresada puede luego obtenerse del medio donde se cultivan las células o de las células mismas y purificarse mediante cualquiera de los medios adecuados conocidos en la técnica. Además, los métodos de ingeniería genética para la producción de proteínas incluyen la expresión de las moléculas de polinucleótidos en sistemas de expresión sin células, en hospedadores celulares, en tejidos y en modelos animales, de acuerdo con métodos conocidos.

El vector puede incluir un marcador seleccionadle y un origen de replicacion, para la propagación en un hospedador. El vector puede además incluir secuencias reguladoras de transcripción o traducción adecuadas, tales como las derivadas de genes de mamífero, de ave, microbianos, virales, vegetales o de insecto, unidos operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína. Los ejemplos de las secuencias reguladoras incluyen promotores de transcripción, operadores o potenciadores, sitios de unión ribosómica de ARNm y secuencias adecuadas que controlan la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos están unidas operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con el ADN que codifica la proteína diana. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos promotora está unida operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos si la secuencia de nucleótidos promotora dirige la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de los anticuerpos o proteínas de fusión Fe descritos en la presente incluyen células procariotas, células de levadura, células vegetales, células de insectos y células eucariotas superiores, que incluyen células de mamífero o de ave. Las secuencias reguladoras en el vector se escogerán de modo que sean operables en la célula hospedadora . Las células hospedadoras procariotas adecuadas incluyen bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus y Salmonella, así como también miembros de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus . Para la expresión en células procariotas, por ejemplo, en E. coli, la molécula de polinucleótido que codifica la proteína incluye preferentemente un residuo de metionina de extremo N para facilitar la expresión del polipéptido recombinante . La metionina de extremo N puede opcionalmente escindirse del polipéptido expresado. Las células hospedadoras de levadura adecuadas incluyen células de los géneros que incluyen Saccharomyces , Pichia y Kluveromyces . Las hospedadoras de levadura preferidas son S. cerevisiae y P. pastoris. Un sistema adecuado para la expresión de una célula hospedadora de insecto se describe, por ejemplo, en el análisis de Luckow and Summers ((1988), BioTechnology 6: 47), cuyas partes relevantes se incorporan en la presente mediante esta referencia. Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen la línea COS 7 de células de riñon de mono (Gluzman et ál . (1981), Cell 23: 175-182) , células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de ovario de hámster chino (CHO) (Puck et ál. (1958), PNAS USA 60: 1275-1281), CV-1 (Fischer et ál . (1970), Int. J. Cáncer 5: 21-27), células HEK 293 de riñon embrionario humano (American Type Culture Collection (ATCC®) catálogo no. CRL-1573), y células de carcinoma cervical humanas (HELA) (ATCC® CCL 2) . Las partes relevantes de las referencias mencionadas se incorporan a la presente mediante esta referencia. En la técnica se conocen muchas otras células hospedadoras.

Los vectores de expresión para usar en hospedadores celulares comprenden generalmente uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicos. Los genes codifican, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que suministra un requisito auxotrófico. Una gran variedad de los vectores están fácilmente disponibles de fuentes comerciales. Los ejemplos incluyen vectores pGEM® (Promega) , vectores pSPORT y vectores pPROEX™ (InVitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) , vectores Bluescript (Stratagene) y vectores pQE (Qiagen) . Los vectores de levadura contendrán frecuentemente un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura de 2µ, una secuencia de replicación autónoma (ARS) , una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción y gen marcador seleccionable . También pueden usarse vectores replicables tanto en levadura como en E. coli (denominados vectores transportadores) . Además de los rasgos mencionados anteriormente de vectores de levadura, un vector transportador también incluirá secuencias de replicación y selección de E. coli. La secreción directa de los polipéptidos diana expresados en hospedadores de levadura puede lograrse mediante la inclusión de secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia líder factor OÍ de levadura en el extremo 5' de la proteína que contiene Fe. Brake (1989), Biotechnology 13: 269-280.

Los ejemplos de vectores de expresión adecuados para usar en células hospedadoras de mamífero incluyen pcDNA3. l/Hygro+ (Invitrogen) , pDC409 (McMahan et ál . (1991), EMBO J. 10: 2821-2832), y pSVL (Pharmacia Biotech) . Los vectores de expresión para usar en células hospedadoras de mamífero pueden incluir secuencias de control de transcripción y traducción derivadas de genomas virales. Las secuencias promotoras y secuencias potenciadoras comúnmente usadas que pueden usarse para promover la transcripción de ARN que codifica las proteínas descritas en la presente incluyen, de modo no taxativo, las derivadas de citomegalovirus humano (CMV) , Adenovirus 2, Polioma virus y Simian virus 40 (SV40) . Los métodos para la construcción de vectores de expresión de mamífero se describen, por ejemplo, en Okayama and Berg ((1982) Mol. Cell . Biol. 2:161-170), Cosman et ál . ((1986) Mol. Immunol . 23:935 941), Cosman et ál. ((1984) Nature 312: 768 771), EP-A-0 367 566, y WO 91/18982. Las partes relevantes de estas referencias se incorporan a la presente mediante esta referencia.

Usuarios de proteínas que contienen Fe con unión de FCYRIIIA potenciada Las proteínas que contienen Fe de la invención, tales como anticuerpos y proteínas de fusión Fe, pueden usarse como terapéuticos, particularmente en contextos de enfermedad donde se desea la muerte selectiva de células donde se muestra una molécula diana particular. Sin embargo, las proteínas que contienen Fe de la invención pueden también ser útiles para eliminar ligandos solubles, virus o células patógenas extrañas. Por ejemplo, en pacientes con cáncer, se desea matar células cancerosas, que pueden expresar selectivamente determinadas proteínas que pueden estar dirigidas por las proteínas que contienen Fe descritas en la presente. Por lo tanto, los anticuerpos o proteínas de fusión Fe que se unen a las proteínas diana cancerosas y tienen propiedades potenciadas para matar células pueden ser terapéuticos deseables en indicaciones para el cáncer. Además, puede ser también útil acercar células cancerosas y células citotóxicas entre sí usando proteínas que contienen Fe biespecíficas tal como se describe en la presente que se unen a una proteína diana cancerosa, es decir, una proteína expresada en una célula cancerosa y una proteína expresada en una célula citotóxica. Por ejemplo, CD16, que se expresa en células NK, o NKG2D, que se expresa en células NK y células T citotóxicas, son proteínas expresadas en células citotóxicas que pueden ser proteínas diana. En el asma, una afección inflamatoria, puede ser útil matar eosinófilos, que median el daño de células en las vías respiratorias e inducen hiperreactividad e hipersecreción de moco. Kolbeck et ál. (2010), J. Allergy Clin. Immunol . 125: 1344-1353. Por lo tanto, las proteínas que contienen Fe con propiedades potenciadas para matar células contra antígenos expresados preferentemente en eosinófilos pueden ser útiles en el asma. De manera similar, los virus, células patógenas extrañas o células hospedadoras infectadas pueden también estar dirigidos por los anticuerpos o proteínas de fusión Fe descritos en la presente.

La invención contempla métodos para tratar pacientes que padecen una enfermedad de proliferación celular, que incluye varias formas de cáncer, con las proteínas que contienen Fe descritas en la presente o con combinaciones que incluyen proteínas que contienen Fe que comprenden una región Fe alterada más otros agentes terapéuticos. El paciente puede ser un humano, pero los métodos pueden aplicarse a cualquier mamífero, que incluyen animales domésticos tales como mascotas y animales de granja. También se proporcionan composiciones para usar en los métodos que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de una protexna que contiene una región Fe alterada y, en algunos casos, una cantidad eficaz de otro agente terapéutico, más un diluyente, excipiente o portador adecuado.

Las proteínas que contienen Fe descritas en la presente pueden administrarse con una variedad de fármacos, y se ha empleado una gran variedad de tratamientos para tratar el cáncer tales como, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos , agentes no quimioterapéuticos, agentes anti-neoplásicos y/o radiación. Por ejemplo, la quimioterapia y/o radiación puede ocurrir antes, durante y/o después de cualquiera de los tratamientos descritos en la presente. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, de modo no taxativo, cisplatina, taxol, etopósido, mitoxantrona (Novantrone®) , actinomicina D, cicloheximida, camptotecina (o derivados de estos solubles en agua) , metotrexato, mitomicina (por ej . , mitomicina C) , dacarbazina (DTIC) , antibióticos anti-neoplásicos tales como adriamicina (doxorubicina) y daunomicina, y todos los agentes quimioterapéuticos mencionados anteriormente.

Entre los textos que proporcionan una guía para la terapia contra el cáncer se encuentra Cáncer, Principies and Practice of Oncology, 4° Edición, DeVita et ál . , Eds . J. B. Lippincott Co., Filadelfia, PA (1993). Un enfoque terapéutico adecuado se elige de acuerdo con el tipo particular de cáncer y otros factores tales como estado general del paciente, como se reconoce en el campo pertinente. Los tratamientos descritos en la presente usando los anticuerpos o proteínas de fusión Fe descritos en la presente pueden agregarse a un régimen de terapia usando otros agentes anti-neoplásicos al tratar el paciente con cáncer.

Las proteínas que contienen Fe descritas en la presente pueden usarse para tratar enfermedades de proliferación celular, que incluyen cáncer, que implica la proliferación celular no regulada y/o inadecuada, a veces acompañada por la destrucción de tejido adyacente y crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, que permiten la invasión de células cancerosas en nuevas áreas, es decir, metástasis. En las condiciones tratables con las proteínas descritas en la presente se incluyen afecciones no malignas que implica el crecimiento celular inadecuado, que incluye pólipos colorrectales , isquemia cerebral, enfermedad quística macroscópica, enfermedad renal poliquística, hiperplasia prostética benigna y endometriosis . Otras enfermedades de proliferación celular que pueden tratarse usando las proteínas de la presente invención son, por ejemplo, cánceres que incluyen mesoteliomas , carcinomas de células escamosas, mielomas, osteosarcomas , glioblastomas , gliomas, carcinomas, adenocarcinomas, melanomas, sarcomas, leucemias agudas y crónicas, linfornas y meningiomas, enfermedad de Hodgkin, síndrome de Sézary, mieloma múltiple, y cánceres de pulmón, de pulmón no microcítico, de pulmón microcítico, de laringe, de mama, de cabeza y cuello, de vejiga, de ovario, de piel, de próstata, cervical, vaginal, gástrico, de células renales, de riñon, pancreático, colorrectal, endometrial y esofágico, hepatobiliar, de hueso, de piel, y hematológicos , así como cánceres de la cavidad nasal y senos paranasales, nasofaringe, cavidad oral, orofaringe, laringe, hipolaringe, glándulas salivales, mediastino, estómago, intestino delgado, colon, recto y región anal, uréter, uretra, pene, testículos, vulva, sistema endocrino, sistema nervioso central, y células plasmáticas .

Las proteínas que contienen Fe descritas en la presente pueden usarse además en otros tipos de afecciones donde es beneficioso destruir determinados tipos de células. Por ejemplo, puede ser beneficiosa la destrucción de eosinófilos humanos en asma, células B humanas en exceso en lupus eritematoso sistémico, células T Th2 humanas en exceso en afecciones autoinmunitarias o células infectadas con patógenos en enfermedades infecciosas.

Composiciones farmacéuticas La invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas que contienen Fe descritas en la presente, tales como anticuerpos o proteínas de fusión Fe. Las composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína que contiene Fe que tiene una región Fe alterada con uno o más componentes adicionales tales como un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Los componentes adicionales pueden incluir amortiguadores, carbohidratos, polioles, aminoácidos, agentes quelantes, estabilizadores y/o conservantes, entre muchas posibilidades .

Dosificación y métodos de administración Las composiciones que comprenden proteínas que contienen Fe que comprenden una región Fe alterada descrita anteriormente pueden administrarse mediante cualquier método adecuado que incluye, de modo no taxativo, administración parenteral, tópica, oral, nasal, vaginal, rectal o pulmonar (por inhalación) . Si se inyectan, las composiciones pueden administrarse por vía intraarticular, intravenosa, intraarterial , intramuscular, intraarticular, intraperitoneal , subcutánea por inyección en bolo o infusión continua. Se contempla la administración localizada, es decir, en el sitio de la enfermedad, tal como la inyección directa en un tumor, así como la administración transdérmica y la liberación sostenida de implantes o parches de piel. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal u oral, uso de un nebulizador, inhalación en forma de aerosol y similares. La administración mediante un supositorio insertado en una cavidad corporal puede lograrse, por ejemplo, al insertar una forma sólida de la composición en una cavidad corporal elegida y permitir que se disuelva. Otras alternativas incluyen gotas oculares; preparaciones orales tales como pastillas, pildoras, jarabes y goma de mascar; y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, aerosoles y ungüentos. En la mayoría de los casos, las moléculas terapéuticas que son polipéptidos tales como los descritos en la presente pueden administrarse tópicamente o por inyección o inhalación.

Las proteínas que contienen Fe descritas en la presente pueden administrarse en cualquier dosificación, frecuencia y duración que pueden ser eficaces para tratar la afección a tratar. La dosificación terapéuticamente eficaz depende de la naturaleza molecular de la proteína que contiene Fe y la naturaleza del trastorno a tratar. El tratamiento puede continuar lo que sea necesario para lograr los resultados deseados. La proteína que contiene Fe puede administrarse como una dosificación única o una serie de dosificaciones administradas periódicamente, que incluyen múltiples veces por día, diariamente, cada día por medio, dos veces por semana, tres veces por semana, semanalmente, semana por medio, mensualmente, cada seis semanas, cada dos meses, cada tres, cuatro, cinco o seis meses, entre otros regímenes de dosificación posibles. La periodicidad de tratamiento puede o no ser constante a lo largo de la duración del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir inicialmente en intervalos semanales y luego ocurrir semana por medio o en intervalos más prolongados según se menciona anteriormente. Los tratamientos que tienen duraciones de días, semanas, meses o años están comprendidos en la invención. El tratamiento puede discontinuarse y luego reanudarse. Las dosis de mantenimiento pueden administrarse tras un tratamiento inicial.

La dosificación puede calcularse como miligramos por kilogramo de peso corporal (mg/kg) o como miligramos por metro cuadrado de superficie de piel (mg/m2) o como una dosis fija, independientemente de la altura o peso. Todas estas son unidades de dosificación estándar conocidas en la técnica. El área de superficie de piel de una persona se calcula a partir de su altura y peso usando una fórmula estándar. Con respecto a las proteínas que contienen una región Fe alterada descrita en la presente, las dosificaciones pueden variar de alrededor de 0.01 mg/kg a alrededor de 70 mg/kg, opcionalmente de alrededor de 0.1 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg, de alrededor de 0.1 mg/kg a alrededor de 5 mg/kg, de alrededor de 0.3 mg/kg a alrededor de 3 mg/kg, o alrededor de 2.5 mg/kg. De manera alternativa, las pacientes de todos los tamaños pueden recibir la misma dosificación, que varía de alrededor de 1 mg a alrededor de 500 mg, opcionalmente de alrededor de 10 mg a alrededor de 100 mg, de alrededor de 25 mg a alrededor de 50 mg, de alrededor de 100 mg a alrededor de 300 mg, o de alrededor de 100 mg a alrededor de 200 mg. De manera alternativa, la dosificación puede ser de alrededor de 5 mg/m2 a alrededor de 800 mg/m2, de alrededor de 10 mg/m2 a alrededor de 600 mg/m2, o de alrededor de 25 mg/m2 a alrededor de 500 mg/m2. La dosificación puede o no ser constante a lo largo de la duración del tratamiento. Por ejemplo, la dosificación puede aumentar a un ritmo constante a lo largo de la duración del tratamiento. De manera alternativa, una primera dosis puede ser superior que las dosis posteriores. Como otra alternativa, la dosificación puede reducirse en las etapas posteriores de tratamiento.

La siguiente descripción de las modalidades específicas revela la naturaleza general de la invención de modo que otros puedan fácilmente modificar y/o adaptar las modalidades para varias aplicaciones sin apartarse de los conceptos genéricos presentados en la presente. Cualquiera de las adaptaciones o modificaciones pretenden estar comprendidas dentro del significado e intervalo de equivalentes de las modalidades descritas. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance de la presente solicitud. La fraseología y terminología de estos ejemplos se emplea a efectos descriptivos y no taxativos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN Y ANÁLISIS DE BIBLIOTECAS DE REGIONES FC ALTERADAS COMO HETERODIMEROS FC CONSTRUCCIÓN DE BIBLIOTECA Y ANÁLISIS PRIMARIO Las bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican ya sea scFv-Fc que contiene las sustituciones de pares de carga E356K y D399K o una cadena de polipéptidos Fe ("Fe vacía") que contiene las sustituciones de pares de carga K392D y K409D, con alteraciones adicionales en sitios seleccionados dentro de las regiones que codifican Fe, se crearon usando PCR. Para cada sitio dentro de la Fe seleccionada para sustitución, el ácido nucleico cambió de modo que se generarían regiones Fe con los veinte aminoácidos diferentes en el sitio seleccionado. Cada codón en el ácido nucleico se aleatorizó independientemente de modo que las moléculas de ácido nucleico en la biblioteca resultante se modificaron potencialmente dentro de un codón solamente. Un grupo de sitios estuvo completamente dentro de la región bisagra inferior (residuos 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, y 238; véase la Figura 2) . La biblioteca que contenía ácidos nucleicos con mutaciones en sitios que codifican estos residuos se denominó biblioteca de "Nivel 1". Otro grupo de sitios estuvo dentro de la región CH2 y estaban cerca o eran parte del área en contacto con FCYRIIIA (239, 241, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 280, 285, 286, 290, 294, 295, 296, 298, 300, 307, 309, 315, 326, 327, 328, 330, 332, 333, 334, 337 y 339; véase Figura 2) . La biblioteca que contenía ácidos nucleicos con mutaciones en sitios que codifican estos residuos se denominó biblioteca de "Nivel 2". Un tercer grupo incluyó sitios dentro de la región C¾2 que estaban expuestos a solventes, pero que no estaban cerca o no eran parte del área en contacto con FCYRIIIA (243, 246, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 260, 274, 275, 278, 279, 282, 283, 284, 287, 288, 289, 292, 293, 301, 302, 303, 305, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 318, 320, 322, 324, 335, 336, 338 y 340; véase Figura 2) . La biblioteca que contenía ácidos nucleicos con mutaciones en sitios que codifican estos residuos se denominó biblioteca de "Nivel 3". La Figura 2 muestra las posiciones de estos sitios dentro de una región Fe de IgGl humana .

En más detalle, un fragmento de ADN que codifica el scFv del anticuerpo M315 (un anticuerpo NKG2D de rata anti- ratón) fusionado a un polipéptido Fe de IgGl humano con mutaciones de pares de carga E356K y D399K en el dominio CH3 se subclono en el vector de expresión de mamífero pTT5. Zhang et ál. (2009), Protein Expression and Purification 65(1) : 77-82. Un fragmento de ADN que codifica un polipéptido Fe de huIgGl con mutaciones de pares de carga K392D y K409D en el dominio C½3 también se subclono en pTT5. Las seis bibliotecas Fe pequeñas descritas anteriormente se realizaron usando SPLICE OVERHA G EXTENSION por reacción en cadena de la polimerasa (SOE por PCR) tal como se describe a continuación. Véase, por ej . , arrens et ál . (1997) , Gene 186: 29-35, cuyas partes que describen este método se incorporan a la presente mediante esta referencia.

Las bibliotecas se realizaron de la siguiente manera. Para cada uno de los 82 codones seleccionados dentro de cada región que codifica Fe, se realizó un oligonucleótido aleatorizado en las primeras dos posiciones del codón y que tiene G o C en la tercera posición (un "codón NNG/C") (un "oligonucleótido NNG/C") . Este codón NNG/C se colocó en el medio del oligonucleótido NNG/C con alrededor de 21 bases que se extienden en sentido ascendente y descendente. El oligonucleótido NNG/C se orientó de modo que su extremo 5' estaba arriba de su extremo 3' en la región que codifica Fe. Por consiguiente, los "oligonucleótidos inversos" que coinciden con las 21 bases ascendentes de los oligonucleótidos NNG/C se sintetizaron de forma individual. Un cebador descendente universal se combinó con cada uno de los oligonucleótidos NNG/C y se sometió a reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para producir fragmentos descendentes. De manera similar, un oligonucleótido ascendente universal y cada uno de los oligonucleótidos inversos se combinaron y sometieron a reacciones PCR para realizar fragmentos de ADN ascendentes. De manera alternativa, el oligonucleótido NNG/C puede apuntar hacia arriba y el cebador inverso puede apuntar hacia abajo. En este caso las reacciones PCR iniciales descritas anteriormente incluían el oligonucleótido NNG/C más el oligonucleótido ascendente en una reacción PCR para producir un fragmento ascendente y el oligonucleótido inverso y el oligonucleótido descendente en otra reacción PCR para producir un fragmento descendente. Los fragmentos PCR ascendente y descendente se purificaron usando geles de agarosa, y las cantidades de estos productos PCR se cuantificaron . Las mismas cantidades molares de fragmentos de ADN ascendentes y descendentes individuales se combinaron con los cebadores ascendentes y descendentes universales para una segunda reacción PCR para montar el producto PCR de longitud completa. Los fragmentos PCR de longitud completa se purificaron luego de geles de agarosa y se combinaron cantidades iguales de fragmentos de longitud completa individuales de un nivel, se digirieron con enzimas de restricción Sal I y BamH I y se insertaron en un vector de expresión .

Se realizó un total de seis bibliotecas. Se realizaron tres bibliotecas, una biblioteca de Nivel 1, de Nivel 2 y de Nivel 3, con mutaciones en un ácido nucleico que codifica un scFv-Fc. De manera similar, se realizó una biblioteca de Nivel 1, de Nivel 2 y de Nivel 3 con mutaciones en las mismas posiciones dentro de la región que codifica Fe en un ácido nucleico que codifica una Fe vacía. Tal como se ilustra diagramáticamente en la Figura 3, se realizó un análisis inicial de la siguiente manera. Las bibliotecas se introdujeron en Escherichia coli, y se recogieron suficientes colonias individuales de modo que al menos tres veces se recogieron tantas colonias como variantes hubiera en la biblioteca. Por ejemplo, cada biblioteca de Nivel 1 contenía veinte aminoácidos diferentes en cada uno de los nueve sitios, por un total de 180 variantes diferentes. En este caso, se recogieron diez placas de microtitulación de colonias (96 pocilios/placa por un total de alrededor de 960) y se cultivaron. Se aisló ADN de plásmido. Cada biblioteca de Nivel 2 y Nivel 3 contenía veinte aminoácidos diferentes en cada uno de los 34 y 39 sitios por un total de 680 y 780 variantes diferentes, respectivamente. Por consiguiente, se recogieron 45 placas de colonias (por un total de 4320) por cada biblioteca de Nivel 2 y Nivel 3, y se aisló ADN de plásmido. Estos ADN de plásmido mutados se combinaron con ADN inalterados (si el ADN alterado fuera scFv-Fc, el ADN inalterado fuera Fe vacía, y viceversa, tal como se muestra en la Figura 2) y se usaron para transfectar células HEK 293 (una línea de células de riñon embriónicas humanas transformadas) . Los transíectantes se cultivaron y el medio de cultivo se sometió a ensayo usando un ensayo AlphaLISA® usando reactivos comprados en Perkin Elmer (números de catálogo 6760002 y AL109M) .

Brevemente, el ensayo AlphaLISA® se realizó de la siguiente manera. El medio de cultivo celular de las células HEK 293 transfectadas se agregó a pocilios que contenían cuentas de la donante recubiertas con estreptavidina (Perkin Elmer número de catálogo 6760002) , un anticuerpo IgG humano biotinilado (que se une a las cuentas de la donante mediante la interacción de estreptavidina-biotina) , cuentas del aceptor (Perkin Elmer número de catálogo AL109M) conjugadas con anticuerpo anti-glutationa S-transferasa (GST) , una versión etiquetada a GST de FCYRIIIA humano (que se une a las cuentas del aceptor mediante la interacción del anticuerpo GST-anti-GST y que se une a las cuentas de la donante mediante la interacción de FCYRIIIA con el anticuerpo IgG humano biotinilado) . En ausencia de un competidor (tal como scFv-Fc/Fc) , cuando los pocilios se iluminan con luz a 680 nm, las cuentas de la donante se activan. Si las cuentas de la donante están físicamente próximas a las células activadas de la donante, estas serán activadas por las cuentas de la donante para que emitan fluorescencia a alrededor de 615 nm. En presencia de un competidor que se une a FCYRIIIA (tal como un scFv-Fc/Fc) , esta señal disminuirá debido a que las cuentas de la donante y del aceptor podrán separarse poco a poco cuando el competidor, en vez del anticuerpo IgG humano biotinilado, se una a FCYRIIIA, particularmente si el competidor se une más eficazmente a FCYRIIIA que el anticuerpo IgG humano biotinilado.

Los sobrenadantes de cultivo celular que inhibieron la señal en un mayor grado que los sobrenadantes de células transíectadas con versiones no mutadas (excepto por las mutaciones de pares de carga que también se incluyeron en las bibliotecas) de scFv-Fc y Fe vacío se volvieron a analizar dos veces para confirmar que eran positivos. En la tercera vuelta de análisis, las pruebas se realizaron en duplicado. Las regiones que codifican Fe de los plásmidos que codifican estos scFv-Fc o Fe vacíos que proporcionaron una señal positiva se secuenciaron .

Las Tablas 1 y 2 a continuación muestran los datos solo de estos transíectantes positivos que resultan de las bibliotecas de Nivel 1, 2 y 3 que mutaron en los ácidos nucleicos que codifican Fe vacío y scFv-Fc, respectivamente.

Tabla 1: Aciertos positivos primarios de bibliotecas scFv-Fc Tabla 2: Aciertos positivos primarios de bibliotecas vacíos Según el cálculo, se incluyó un total de alrededor de 1640 variantes diferentes en las bibliotecas de Nivel 1, 2 y 3 scFv-Fc combinadas. Se incluyó la misma cantidad de variantes en las bibliotecas de Nivel 1, 2 y 3 que codifican Fe vacío combinadas. Dada la cantidad de variantes analizadas, era probable que todas las variantes estuvieran representadas al menos una vez entre los transíectadores analizados. Sin embargo, solo 37 scFv-Fc diferentes y 34 Fe vacíos diferentes dieron una señal positiva en este análisis primario. Muchas de estas variantes se recuperaron múltiples veces. Por lo tanto, en total, solo alrededor de 2% de las 1640 variantes diferentes incluidas en las bibliotecas proporcionaron una señal positiva.

Análisis combinatorio de aciertos positivos .

Todas las sustituciones identificadas en el análisis primario en las bibliotecas Fe vacías (tal como se muestra en la Tabla 2) se combinaron con todas las sustituciones identificadas en el análisis primario de las bibliotecas scFv-Fc (tal como se muestra en la Tabla 1) para identificar combinaciones que pudieron unirse a FCYRIIIA más eficazmente. Por lo tanto, se analizó un total de 37 x 34 1258 combinaciones. Sorprendentemente, solo las siguientes 21 de las 1258 combinaciones analizadas mostraron una fuerte competencia a la interacción de biotina-huIgGl / FCYIIIA en un ensayo AlphaLISA®: (1) E294L en Fe vacío y E294L en scFv- Fe; (2) E294L en Fe vacío e Y296L en scFv-Fc; (3) E294L en Fe vacío y K290G en scFv-Fc; (4) E294L en Fe vacío y K290S en scFv-Fc; (5) E294L en Fe vacío y S298A en scFv-Fc; (6) E294L en Fe vacío y T307G en scFv-Fc; (7) T307P en Fe vacío y T307G en scFv-Fc; (8) T307P en Fe vacío y K290G en scFv-Fc; (9) T307P en Fe vacío e Y296L en scFv-Fc; (10) T307P en Fe vacío y K290S en scFv-Fc; (11) R255S en Fe vacío y S298C en scFv-Fc; (12) T307P en Fe vacío y S298C en scFv-Fc; (13) E294L en Fe vacío y S298C en scFv-Fc; (14) K334V en Fe vacío y K290Y en scFv-Fc; (15) T307P en Fe vacío y L309E en scFv-Fc; (16) E294L en Fe vacío y L309E en scFv-Fc; (17) T307P en Fe vacío y L234Y en scFv-Fc; (18) E294L en Fe vacío y L234Y en scFv-Fc; (19) Q311M en Fe vacío e Y296W en scFv-Fc; (20) Q311M en Fe vacío y L234Y en scFv-Fc; y (21) K334V en Fe vacío e Y296W en scFv-Fc. Por lo tanto, solo una muy pequeña cantidad de las combinaciones de mutantes Fe analizadas mostraron una unión altamente sinérgica a FCYIIIA.

EJEMPLO 2: CONSTRUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE VARIANTES DE COMBINACIÓN EN FORMATO IgG Para determinar si los anticuerpos de longitud completa que contienen sustituciones en sus regiones Fe funcionarían para unirse más eficazmente a FCYRIIIA, se realizaron combinaciones de sustituciones en un anticuerpo IgGl anti-proteína X humano de longitud completa usando las técnicas descritas anteriormente. Todos los aciertos primarios (véanse las Tablas 1 y 2) se mapearon en la estructura co-cristalina FC:FCYRIIIB usando Entorno Operativo Molecular (MOE) , un programa de modelado molecular de Chemical Computing Group, Inc. Montreal CA. Véase el código del Banco de Datos de Proteínas 1T83. Como se indica en la leyenda de la Figura 1 anterior, la región extracelular de FCYRIIIB que está en esta estructura (mostrada en la Figura 1) es muy similar en la secuencia de aminoácidos primaria a FCYRIIIA, de modo que se consideró probable que la información de la estructura Fe: FCYRIIIB co-cristal sería relevante para la interacción de Fe: FCYRIIIA. Las sustituciones candidatas que tuvieron mutaciones en la interfaz Fe ¡FCYRIIIB (es decir, en las posiciones de Nivel 2 que se muestran en la Figura 2) se seleccionaron para más ingeniería según los resultados del modelado molecular asistido por computadora y/o análisis primario. En un esfuerzo por potenciar adicionalmente la interacción de Fe : FCYRIIIA, se agregaron más sustituciones en otras partes del polipéptido Fe a las sustituciones de Nivel 2. Específicamente, las sustituciones dentro del sitio de N-glicosilación (N297-S298-T299) , y/o cerca del sitio P329 en cualquiera de las cadenas Fe se exploraron usando modelado molecular. Se habían encontrado sustituciones en ambas áreas (es decir, S298C, S298A, A330M y A330V) en el análisis primario. Las combinaciones que parecían ser favorables según el modelado molecular tal como se describe más adelante se construyeron y analizaron para detectar unión a FCYRIIIA y, en algunos casos, para detectar actividad en un ensayo ADCC.

Para obtener combinaciones de sustituciones candidatas y para eliminar sustituciones que podrían crear problemas de fabricabilidad (por e . , remplazar otro aminoácido con una cisteína) , se realizaron análisis estructurales usando las estructuras de cristal FC-FCYRIIIB (códigos del Banco de Datos de Proteínas: 1T83, 1T89 y 1E4K) , y los cálculos de la energía de unión se realizaron usando el Algoritmo Genético de Diseño de Proteínas (EGAD) . Pokala, N and Handel, TM, J Mol Biol. 347(1): 203-227. (2005), cuyas partes relevantes se incorporan en la presente mediante esta referencia. EGAD es un algoritmo de diseño de proteína computacional que predice cambios en la estabilidad de la proteína tras la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en una proteína.

Se identificaron sustituciones en las posiciones S298, A327 y A330 que podrían mejorar la unión de Fe a FCYRIII usando EGAD. Cada una de las tres posiciones cambió a todos los otros 19 aminoácidos en sílice, y se predijo el cambio en la estabilidad de la interacción de FC-FCYRIII. EGAD se usó también para analizar algunas de las combinaciones de mutaciones que se unieron bien a FcyR de acuerdo con los datos reportados anteriormente. Los ejemplos de sustituciones que EGAD predijo que podrían potenciar la unión a FcyRIIIA incluyen S298C, S298I, S298V, S298T, A327Y, A327 , A327F, A327H, A330H, A330F y A330M. El ensayo AlphaLISA® confirmó que algunas de las mutaciones prelas en las posiciones S298 y A330 mostraron una mejor unión a FCYR. Por ejemplo, la combinación designada "W23," que tiene mutaciones L234Y, K290Y e Y296W en una cadena y mutaciones S298T y K334V en la otra cadena resultó de este enfoque.

Se seleccionaron combinaciones beneficiosas y se incorporaron al ADN que codifica una cadena pesada de huIgGl de proteína X anti -humana usando técnica SOE por PCR descrita anteriormente. Los huIgGl heterodiméricos se realizaron mediante la transfección transitoria de células HEK 293 a pequeña escala. Se concentraron los sobrenadantes brutos y se intercambió el amortiguador. De tal modo, se creó un panel de anticuerpos hulgGl heterodiméricos que contiene variantes de Fe novedosas que tienen múltiples sustituciones.

Estos anticuerpos sustituidos se analizaron para detectar su capacidad de mediar ADCC in vitro y de unirse a FcyRIIIA usando el ensayo AlphaLISA® a varias concentraciones. Las Figuras 4-6 muestran el porcentaje de inhibición de la señal AlphaLISA® como una función de la concentración del anticuerpo competidor. En las Tablas 3 y 4 más adelante, los datos se presentan como "EC50" / que es la concentración de anticuerpo a la que se logra la mitad de la inhibición máxima del ensayo AlphaLISA®.

Los ensayos ADCC se realizaron de la siguiente manera. Se usaron líneas celulares que poseen expresión de Proteína X alta (línea de células tumorales SKBR3) , media (línea de células tumorales JIMT1) y baja (línea de células tumorales MCF7) . Estas células diana que expresan Proteína X se etiquetaron con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) y luego se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de depositarse en placas de microtitulación de 96 pocilios con pozos en forma de V. Las células NK purificadas de una donante FCYRIIIA 158F/158F se agregaron a cada pocilio. Los anticuerpos IgGl heterodiméricos humanos anti-Proteína X y un anticuerpo de control con isotipo equivalente se diluyeron en una serie 1:3 y se agregaron a cada pocilio. Las células se incubaron a 37°C con CO2 al 5% durante 3.5 hrs . Las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en amortiguador lx FACS (lx solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene suero fetal bovino al 0.5% (FBS) ) con el tinte T0-PR0®-3 yoduro (Molecular Probes, Inc. Corporation, Oregon, EUA) , que tiñe células muertas antes del análisis por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . El porcentaje de muerte celular se calculó al dividir la cantidad de células muertas (teñidas con TO-PRO®-3 yoduro) por la cantidad total de células (teñidas con CFSE) .

Las Figuras 7-9 muestran el porcentaje de células muertas como función de concentración de anticuerpo. Las EC50 determinadas de los datos se muestran en la Tabla 3. Estos datos indicaron que todos los catorce anticuerpos que contenían regiones Fe variantes eran muy potentes al matar células tumorales, cada uno con una EC50 de alrededor de 1 pM, que era muy inferior a la EC50 de un anticuerpo inalterado o un anticuerpo que contenía solo mutaciones de pares de carga. Tabla 3 . Asimismo, las EC50 inferiores para ADCC se correlacionaron generalmente con EC50 inferiores para la unión a FCYRIIIA, que se esperaría debido a que la unión a FCYRIIIA es un requisito previo para la actividad en este ensayo ADCC.

Tabla 3 : Unión a FCYRIIIA y actividad ADCC anticuerpos IgGl humanos que contienen variantes de Fe Tabla 4 : Unión a FCYRIIIA de anticuerpos IgGl humanos que contienen variantes de La unión de algunas de las variantes de Fe a FcyR recombinante de humano y murino se analizó usando tecnología Biacore™ al capturar FcyR etiquetado a His usando un anticuerpo anti-His de murino unido a un Chip Sensor CM5 (Biacore) . En experimentos separados, se analizó FCYRIIA con una histidina en la posición 131, FCYRIIIA con una valina en la posición 158 y FCYRIIIA con una fenilalanina en la posición 158. Los anticuerpos IgGl humanos que contenían regiones Fe variantes se inyectaron en la superficie del Chip Sensor CM5 al cual el receptor FCY se enlazó y dejó asociar y disociar del receptor Fcy durante períodos de tiempo definidos. Estos datos se usaron para determinar las constantes de unión, es decir, kon (1/Ms), k0ff (1/s) y KD (nM) , que se calcularon a partir de accesorios globales usando el modelo de unión de cinética 1:1 en software BIAevaluat ion™ . En general, los anticuerpos que contenían regiones Fe alteradas tuvieron valores de KD a dígitos dobles bajos nM para ambos alelos 158F y 158V de FCYRIIIA.

Tabla 5: Datos de unión de equilibrio y cinética *"ND" significa no determinado # Todas estas tasas se determinaron de forma independiente dos veces excepto por las de M7 5 , que se determinó solo una vez. Los valores mostrados para el resto de las muestras son el promedio de dos medidas .

Estos datos indican que la introducción de las sustituciones de pares de carga no significaron una diferencia detectable en la constante de disociación de equilibrio (KD) para la unión a cualquiera de los FcyR analizados. Compare la fila M01 con la fila M04. Asimismo, las varias alteraciones de Fe asimétricas analizadas se redujeron drásticamente (más de diez veces en todos los casos) la KD de unión a ambas variantes alélicas de FCYRIIIA, pero tuvieron poco o nada de efecto en la KD de unión a FCYRIIA O FCYRIIB. Por lo tanto, las sustituciones en las regiones Fe de los anticuerpos IgGl variantes enumerados en la Tabla 5 aumentaron de forma radical la avidez de unión de estas regiones Fe a FCYRIIIA.

EJEMPLO 3: ENSAYOS DE COMPETICIÓN DE VARIANTES DE FC ADICIONALES Para determinar la afinidad de unión relativa a las variantes alélicas 158V y 158L de FCYRIIIA de una cantidad de variantes de Fe adicionales, se llevaron a cabo ensayos AlphaLISA'" básicamente tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Los anticuerpos IgGl anti-Proteína X humanos de longitud completa analizados se purificaron de sobrenadantes de células HEK 293 transíectadas . En algunos casos las preparaciones de anticuerpo carecían de fucosa. Los resultados se muestran en las Figuras 10 (para la variante alélica 158F de FCYRIIIA) y 11 (para la variante alélica 158V de FcyRIIIA) .

Estos datos indican que todos los anticuerpos analizados que comprenden variantes de Fe compitieron con IgGl biotinilado por la unión a FcyRIIIA más eficazmente que un anticuerpo que comprende un Fe de tipo silvestre. Por ejemplo, la Figura 10 muestra que un Fe de IgGl humano de tipo silvestre (M01) inhibe su unión de IgGl a FCYRIIIA (158F) en solo alrededor de 25% a su concentración máxima analizada (360 nM) . M04, un anticuerpo IgGl que contiene alteraciones heterodimerizantes (K392D+K409D en una cadena de polipéptidos Fe y E356K+D399K en otra) , fue apenas más eficaz que M01. En comparación con M01 y M04, 117, W125 y un IgGl humano de tipo silvestre afucosilado compitieron con más fuerza, según lo prueba un giro a la izquierda en las curvas. Véase 117, 125 y AFUCO-M01 en la Figura 10. Las preparaciones afucosiladas de W117 y W125 (AFUCO-W117 y AFUCO-W125) mostraron una muy alta afinidad con FCYRIIIA 158F humano, debido a que estas dos preparaciones produjeron las curvas que se encuentran más a la izquierda de la Figura 10. Las variantes de Fe W157 y W165 también exhibieron competencia sólida.

En la Figura 11 se muestran resultados similares de unión a FCYRIIIA (158V) . M01 y 04 exhibieron una competencia débil para la unión a FCYRIIIA (158V) . Como en la Figura 10, AFUC0-W117 y AFUCO-W125 fueron los competidores más eficaces, seguido por W157 y W165. 117 y AFUCO-IgGl, seguido por 125, fueron menos eficaces, pero aun mucho más eficaces que M01 y M04. Estos datos muestran que puede lograrse una potenciación sinérgica de unión a FCYRIIIA usando preparaciones desfucosiladas de variantes heterodiméricas de IgGl .

EJEMPLO 4: ENSAYO ADCC DE ANTICUERPOS QUE CONTIENEN REGIONES DE FC VARIANTES Para determinar la actividad de ADCC de anticuerpos anti-Proteína X humanos de longitud completa que contienen regiones Fe variantes adicionales, se realizaron ensayos ADCC basados en células usando dos líneas celulares diferentes mencionadas anteriormente como células diana, una que expresa niveles elevados de Proteína X (SKBR3) y la otra que expresa niveles moderados de Proteína X (JIMT1) . Los ensayos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 2. Las Figuras 12 y 13 muestran los resultados obtenidos usando células SKBR3.

Los anticuerpos de control M01 (que tienen una región Fe de tipo silvestre) y M04 (que tienen una región Fe que contiene únicamente alteraciones heterodimerizantes) exhibieron alrededor de 60% y 75% de muertes a la concentración más alta de anticuerpo probado (2,667 pM) . La muerte celular disminuyó abruptamente a concentraciones de anticuerpo inferiores de M01 y M04. Sin embargo, los anticuerpos que contienen regiones Fe variantes, que incluyen 23, W117, 125, W141, W144, W165, W168 y 187, exhibieron niveles superiores de muerte celular que M01 o M04 a la mayoría de las concentraciones de anticuerpo. La variante 187 exhibió la mayor actividad en este ensayo, correlacionando con el hecho de que también exhibió la mayor afinidad de FCYRIIIA humano. Tabla 4. Las variantes W117, W125, 165 y W168 también provocaron la actividad de ADCC potente en este ensayo.

La Figura 14 muestra los resultados (porcentaje de lisis celular específica) de un ensayo ADCC realizado usando los anticuerpos anti-Proteína X IgGl humanos de longitud completa y células JIMT1, que expresan niveles moderados de Proteína X. Los anticuerpos M01 (que contienen una región Fe de tipo silvestre) lograron solo alrededor de 64 porciento de lisis celular a la concentración de anticuerpo más elevada analizada, y la EC50 de un anticuerpo M01 en este ensayo fue 98 pM. Una preparación desfucosilada de un anticuerpo M01 logró 86% de lisis celular específica a la mayor concentración analizada y tuvo una EC50 de 0.274 pM en este ensayo. Un anticuerpo que contiene variante 117 de Fe potenció la muerte de ADCC en comparación con el anticuerpo M01, logrando una lisis específica máxima de alrededor de 85% y que tiene 85.5 veces menos de EC50 (1.15 pM) . Una preparación desfucosilada del mismo anticuerpo (AFUCO-W117) mostró incluso más actividad destructora y tuvo una EC50 muy baja (0.015 pM) en este ensayo. Figura 14, panel superior.

Se observó un aumento similar en la actividad de ADCC en una preparación desfucosilada de un anticuerpo que contenía una región Fe variante W125 (EC50 fue 0.061 pM) en comparación con una preparación fucosilada (EC5o fue 3.99 pM) . Figura 14, panel inferior. Debido a que las versiones desfucosiladas de los anticuerpos IgGl que contiene una región Fe W117 o W125 ambas tuvieron actividad muy superior que las versiones fucosiladas de estos anticuerpos, estos datos indican una mejora sinérgica en la actividad de ADCC cuando la región Fe de un anticuerpo IgGl está desfucosilada y también contiene cambios de aminoácidos que aumentan su afinidad a FcyRIIIA.

EJEMPLO 5: CONSTANTES DE UNIÓN DE ANTICUERPOS QUE CONTIENEN REGIONES DE FC VARIANTES ADICIONALES Las tasas directas e inversas para la unión de una cantidad de anticuerpos IgGl humanos que tienen regiones Fe variantes adicionales a las variantes alélicas 158V y 158F de FCYRIIIA humano y FcyRIV murino se determinó usando tecnología Biacore™ tal como se describe en el Ejemplo 2. Brevemente, los FcyR, que se etiquetaron con poli histidina, se capturaron en un Chip Sensor CM5 (Biacore™) . Los anticuerpos IgGl humanos se inyectaron en la superficie del Chip CM5 al cual FcyR se enlazó y dejó asociar y disociar de Fcy durante tiempos definidos. Los datos resultantes se usaron para determinar las constantes de unión reportadas en la Tabla 6 del software BIAevaluation™. Estos datos se muestran en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6: Tasas directas e inversas de anticuerpos IgGl humanos que contienen regiones Fe variantes *La región Fe variante B50 tiene las alteraciones K392D, K409D, L234I, A330M y K334V en un polipéptido Fe y E356K, D399K, L234Y, K290Y e Y296 en el otro.

Los anticuerpos que contienen regiones Fe variantes tuvieron valores de KD para unión a FCYRIIIA humano, que incluye las variantes alélicas 158F y 158V, que varían de 6.4 n a 143 nM. Estos datos, combinados con el ensayo ADCC descrito anteriormente, mostraron que la muerte celular aumentada en un ensayo ADCC por preparaciones desfucosiladas de anticuerpos que contiene una región Fe W125 o W117, en comparación con preparaciones fucosiladas, se correlaciona con tasas directas y tasas inversas, es decir, una KD disminuida. Junto con los datos del Ejemplo 4, una disminución de aproximadamente 10 veces en D para la unión a FCYRIIIA humana (158F) para desfucosilado en comparación con el anticuerpo W125 fucosilado (comparando 15.0 nM con 143 nM) correlacionado con una disminución de aproximadamente 50 veces en EC50 en el ensayo ADCC descrito en el Ejemplo 4 (comparando 0.061 pM con 3.99 pM) . De manera similar para un anticuerpo 117, una preparación desfucosilada tuvo una KD para unión a FCYRIIIA humano (158F) alrededor de once veces inferior que el de una preparación fucosilada (comparando 9.0 nM a 105 nM) y tuvo una EC50 en el ensayo ADCC descrito en el Ejemplo 4 que fue alrededor de 100 veces inferior (comparando 0.015 pM a 1.15 pM) . Por lo tanto, los aumentos de la actividad en el ensayo ADCC de las preparaciones desfucosiladas en comparación con las fucosiladas de los anticuerpos W117 y 125 fueron sinérgicos debido a que superaron las expectativas basadas en los aumentos de la afinidad de unión a FCYRIIIA (158F) . De manera similar, el hecho de que las preparaciones desfucosiladas de W117 y W125 tuvieron actividad muy superior en el ensayo ADCC descrito en el Ejemplo 4 que las preparaciones fucosiladas de estos anticuerpos o una preparación desfucosilada de un anticuerpo que tiene una región Fe de tipo silvestre (M01) , fue un indicio de actividad sinérgica.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una proteína que contiene Fe que comprende una región Fe de IgG humana heterodimérica y una región de unión, caracterizada porque la región Fe comprende una cadena A y una cadena B, cada una comprende de 1 a 10 sustituciones de aminoácido con relación a una cadena de polipéptidos de Fe humana de tipo salvaje, donde la proteína que contiene Fe se une a FCYRIIIA-158F y/o FCYRIIIA-158V humana con una KD menor o igual a un quinto de la KD con la cual una segunda proteína se une a FCYRIIIA-158F y/o FCYRIIIA- 158V humana, donde la segunda proteína es igual a la proteína que contiene Fe salvo que contiene una región Fe de IgG humana de tipo salvaje sin sustituciones .

2. La proteína que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína que contiene Fe se une a FCYRIIIA-158F y/o FCYRIIIA-158V humana con una KD menor o igual a un décimo de la KD con la que la segunda proteína se une a FcyRIIIA- 158F y/o FcyRIIIA- 158V humana .

3. La proteína que contiene Fe de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque cada una de la cadena A y la cadena B comprende 1 a 6 sustituciones de aminoácidos con relación a una cadena de polipéptidos Fe humana de tipo salvaje.

4. La proteína que contiene Fe de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque comprende sustituciones de pares de carga.

5. La proteína que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la cadena A comprende las sustituciones K392D y K409D y la cadena B comprende las sustituciones E356K y D399K o viceversa.

6. La proteína que contiene Fe de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la región Fe de IgG es una región Fe de IgGl.

7. La proteína que contiene Fe de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque (a) la cadena A comprende sustituciones Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L, y Y296W o viceversa; (b) la cadena A comprende sustituciones E233L, Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L, e Y296W; (c) la cadena A comprende sustituciones L234I, Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L, e Y296W o viceversa; (d) la cadena A comprende sustituciones S298T y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296 o viceversa; (e) la cadena A comprende sustituciones A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296W o viceversa ; (f) la cadena A comprende sustituciones A330F y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296W o viceversa; (g) la cadena A comprende sustituciones Q311M, A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L, e Y296W o viceversa; (h) la cadena A comprende sustituciones Q311 , A330F y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, E294L, e Y296W o viceversa; (i) la cadena A comprende sustituciones S298T, A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296W o viceversa; (j) la cadena A comprende sustituciones S298T, A330F y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296W o viceversa; (k) la cadena A comprende sustituciones S239D, A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296 o viceversa; (1) la cadena A comprende sustituciones S239D, S298T y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296W o viceversa; (m) la cadena A comprende sustituciones K334V y la cadena B comprende sustituciones Y296W y S298C o viceversa; (n) la cadena A comprende sustituciones K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296W y S298C o viceversa ; (o) la cadena A comprende sustituciones L235S, S239D, y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296W o viceversa; (p) la cadena A comprende sustituciones L235S, S239D, y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296W, y S298C o viceversa; (q) la cadena A comprende sustituciones Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, F243V, e Y296W o viceversa; (r) la cadena A comprende sustituciones Q311M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K296W, y S298C o viceversa; (s) la cadena A comprende sustituciones S239D y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296W o viceversa; (t) la cadena A comprende sustituciones S239D y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296W, y S298C o viceversa; (u) la cadena A comprende sustituciones F243V y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296 o viceversa; (v) la cadena A comprende sustituciones F243V y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296W, y S298C o viceversa; (w) la cadena A comprende sustituciones E294L y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, K290Y, e Y296W o viceversa; (x) la cadena A comprende sustituciones E294L y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y, Y296W, y S298C o viceversa ; (y) la cadena A comprende sustituciones A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones L234Y e Y296W o viceversa; (z) la cadena A comprende sustituciones A330M y K334V y la cadena B comprende sustituciones K290Y e Y296W o viceversa .

8. La proteína que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la cadena A comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 37 y la cadena B comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 18, 39, o 41 o viceversa .

9. La proteína que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende un par de secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO : 8 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO:10; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO:18; SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO:10; SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO:18; SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO.:18; SEQ ID NO.:37 y SEQ ID NO.:39; y SEQ ID NO.:37 y SEQ ID NO. :41.

10. La proteína que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizada porque está desfucosilada, que está formada en una célula CHO, que es un anticuerpo y/o que es una proteína de fusión Fe.

11. La proteína que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la proteína que contiene Fe es un anticuerpo y donde el anticuerpo es biespecífico y/o es un anticuerpo IgGl humano de longitud completa .

12. La proteína que contiene Fe de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la proteína que contiene Fe se une a HER-2/neu, donde la proteína que contiene Fe es un anticuerpo biespecífico que se une a CD38 y CD138, o donde la proteína que contiene Fe se une a mesotelina.

13. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína que contiene Fe de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Uno o más ácidos nucleicos, caracterizados porque codifican la proteína que contiene Fe de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. El o los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizados porque comprenden las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, o 36 y SEQ ID NO : 9 , 17, 38, o 40.

16. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende el o los ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 14 o 15.

17. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es una célula CHO.

18. Un método para crear una proteína que contiene Fe que contiene una región Fe heterodimérica, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una célula hospedadora que contiene uno o más ácidos nucleicos que codifican una proteína que contiene Fe que comprende una región Fe de IgG humana heterodimérica y una región de unión, donde la región Fe comprende una cadena A y una cadena B, cada una comprende de 1 a 10 sustituciones de aminoácidos con relación a una cadena de polipéptidos de Fe humana de tipo salvaje, donde la proteína que contiene Fe se une a FCYRIIIA-158F y/o FcyRIIIA-158V humana con una KD menor o igual a un quinto de la KD con la cual una segunda proteína se une a FCYRIIIA-158F y/o FCYRIIIA-158V humana, donde la segunda proteína es igual a la proteína que contiene Fe salvo que contiene una región Fe de IgG humana de tipo salvaje sin sustituciones; (b) cultivar la célula hospedadora en condiciones tales que se expresará la proteína que contiene Fe; y (c) recuperar la proteína que contiene Fe de la masa celular o el medio de cultivo.

19. Uso de la proteína que contiene Fe o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para el tratamiento de cáncer.

20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, donde se usa quimioterapia y/o radiación antes, después o junto con el uso de la proteína que contiene Fe.