CN107001456A - 抗ang2 抗体及使用方法 - Google Patents

抗ang2 抗体及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107001456A
CN107001456A CN201580060787.3A CN201580060787A CN107001456A CN 107001456 A CN107001456 A CN 107001456A CN 201580060787 A CN201580060787 A CN 201580060787A CN 107001456 A CN107001456 A CN 107001456A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
acid sequence
hvr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580060787.3A
Other languages
English (en)
Inventor
S·登勒
G·乔治斯
P·M·许尔斯曼
H·克腾伯格
J·莫莱肯
M·莫尔霍伊
J·T·雷古拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN107001456A publication Critical patent/CN107001456A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文中报告了抗ANG2抗体。特定的抗ANG2抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR‑H1、(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR‑H2和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR‑H3。

Description

抗ANG2 抗体及使用方法
发明领域
本发明涉及抗ANG2抗体及其使用方法。
背景技术
人血管生成素-2(ANG-2)(备选地缩写为ANGPT2或ANG2)(SEQ ID NO:106)在Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60和Cheung,A.H.等人,Genomics 48(1998)389-91中描述。血管生成素-1和-2(ANG-1(SEQ ID NO:107)和ANG-2(SEQ ID NO:106))作为Ties(血管内皮中选择性表达的酪氨酸激酶家族)的配体发现。Yancopoulos,G.D.等人,Nature 407(2000)242-48。目前存在4个确定的血管生成素家族成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可以代表小鼠和人中相同基因座的广泛多样的对应物。Kim,I.等人,FEBS Let,443(1999)353-56；Kim,I.等人,J.Biol.Chem.274(1999)26523-26528。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂鉴定(关于ANG-1，参见Davis,S.等人,Cell 87(1996)1161-69；并且关于ANG-2，参见Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60)。全部已知的血管生成素均主要与Tie2结合，并且Ang-1和-2均以亲和力3nM(Kd)与Tie2结合。Maisonpierre,P.C.等人,Science277(1997)55-60。显示Ang-1支持EC存活及促进内皮完整性，Davis,S.等人,Cell 87(1996)1161-69；Kwak,H.J.等人,FEBS Lett448(1999)249-53；Suri,C.等人,Science 282(1998)468-71；Thurston,G.等人,Science286(1999)2511-2514；Thurston,G.等人,Nat.Med.6(2000)460-63，而ANG-2具有相反作用并在生存因子VEGF或碱性成纤维细胞生长因子不存在的情况下促进血管去稳定化及退化。Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60。但是，ANG-2功能的许多研究已经提出更复杂的情形。ANG-2可能是一种在血管萌生和血管退化中发挥作用的复杂的血管重塑调节物。支持Ang-2的这类作用，表达分析揭示在生血管萌生的成年环境中快速诱导ANG-2以及VEGF，而在血管退化下不存在VEGF时诱导ANG-2。Holash,J.等人,Science 284(1999)1994-98；Holash,J.等人,Oncogene 18(1999)5356-62。与背景依赖性作用一致，ANG-2与受Ang-1激活的相同内皮特异性受体Tie-2特异性结合，但是对其激活具有背景依赖性影响。Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60。
角膜血管生成测定法已经显示，ANG-1和ANG-2均具有相似的作用，与VEGF协同作用以促进新血管生长。Asahara,T.等人,Circ.Res.83(1998)233-40。存在剂量依赖性内皮反应的可能性因观察到在体外高浓度时ANG-2也可以促血管生成而升高。Kim,I.等人,Oncogene 19(2000)4549-52。在高浓度，ANG-2借助PI-3激酶和Akt途径通过激活Tie2充当血清剥夺凋亡期间内皮细胞的凋亡幸存因子。Kim,I.等人,Oncogene 19(2000)4549-52。
其他体外实验提出，在持久的暴露期间，ANG-2的作用可以渐进地从Tie2的拮抗剂转变成其激动剂，并且在更晚的时间点，它可以直接促成血管小管形成和新血管稳定。Teichert-Kuliszewska,K.等人,Cardiovas.Res.49(2001)659-70。另外，如果在纤维蛋白凝胶上培育EC，则还观察到ANG-2激活Tie2，这或许显示ANG-2的作用可以取决于EC分化状态。Teichert-Kuliszewska,K.等人,Cardiovas.Res.49(2001)659-70。在三维胶原蛋白凝胶内培养的微血管EC中，ANG-2还可以诱导Tie2激活并促进毛细血管样结构的形成。Mochizuki,Y.等人,J.Cell.Sci.115(2002)175-83。使用三维球体共培养作为血管成熟的体外模型显示，EC和间充质细胞之间的直接接触消除了VEGF反应性，而VEGF和ANG-2的存在诱导萌生。Korff,T.等人,FASEB J.15(2001)447-457。Etoh,T.H.等人显示，组成型表达Tie2的EC中，MMP-1、-9和u-PA的表达在VEGF存在下被ANG-2强烈上调。EtOH,T.等人,CancerRes.61(2001)2145-53。采用体内瞳孔膜模型，Lobov,I.B.等人显示在内源VEGF存在下，ANG-2促进毛细血管直径快速增加、基膜重塑、内皮细胞增殖和迁移，并且刺激新血管萌生。Lobov,I.B.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)11205-10。相比之下，无内源VEGF时，ANG-2促进内皮细胞死亡和血管退化。Lobov,I.B.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)11205-10。类似地，采用体内肿瘤模型，Vajkoczy,P. 等人显示，借助宿主和肿瘤内皮同时表达VEGFR-2和ANG-2，多细胞聚集物通过生血管萌生过程启动血管生长。Vajkoczy,P.等人,J.Clin.Invest.109(2002)777-85。这个模型说明，正在生长的肿瘤的已建立微血管以连续重塑为特征，推定由VEGF和ANG-2表达介导(Vajkoczy,P.等人,J.Clin.Invest.109(2002)777-85)。
Tie-2和血管生成素-1的敲除小鼠研究显示了相似的表型并且表明，血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化介导了正在形成的血管的重塑和稳定，促进血管生成期的血管成熟及内皮细胞-支持细胞黏附维持(Dumont,D.J.等人,Genes&Development,8(1994)1897-1909；Sato,T.N.,Nature,376(1995)70-74；Thurston,G.等人,Nature Medicine 6(2000)460-463)。认为血管生成素-1的作用在成体中保守，其中它广泛地并且组成型表达(Hanahan,D.,Science,277(1997)48-50；Zagzag,D.等人,Exp.Neurol.159(1999)391-400)。与之相反，血管生成素-2表达主要限于血管重塑部位，其中认为它阻断血管生成素-1的组成性稳定或成熟功能，允许血管逆转至并保持可以更多响应于萌生信号的塑性状态(Hanahan,D.,1997；Holash,J.等人,Oncogene 18(199)5356-62；Maisonpierre,P.C.,1997)。病理性血管生成中的血管生成素-2表达研究已经发现许多肿瘤类型显示血管表达血管生成素-2(Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60)。功能研究显示，血管生成素-2涉及肿瘤血管生成并使血管生成素-2过量表达与小鼠异种移植模型中的肿瘤生长增加相关(Ahmad,S.A.等人,Cancer Res.,61(2001)1255-1259)。其他研究已经使血管生成素-2过量表达与肿瘤过度血管分布相关(Etoh,T.等人,Cancer Res.61(2001)2145-53；Tanaka,F.等人,Cancer Res.62(2002)7124-7129)。
近年来，已经提出血管生成素-1、血管生成素-2和/或Tie-2作为可能的抗癌治疗靶。例如，US6,166,185、US5,650,490和US5,814,464各自公开了抗Tie-2配体和受体的抗体。使用可溶性Tie-2的研究据报道减少啮齿类中肿瘤的数目和大小(Lin,1997；Lin1998)。Siemeister,G.等人,Cancer Res.59:3(1999)3185-91生成了表达Tie-2的胞外结构域的人黑色素瘤细胞系，将这些细胞系注入裸小鼠并且报告可溶性Tie-2导致明显的对肿瘤生长和肿瘤血管生成的抑制作用。鉴于血管生成素-1和血管生成素-2均与Tie-2结合，从这些研究中不明确血管生成素-1、血管生成素-2或Tie-2是否将成为有吸引力的抗癌治疗靶。但是，认为有效的抗血管生成素-2疗法有益于治疗疾病如癌症，其中进展取决于异常血管生成，其中阻断异常血管生成过程可以导致防止疾病进展(Folkman,J.,NatureMedicine.1(1995)27-31)。
此外，一些小组已经报告了与血管生成素-2结合的抗体和肽的用途。参见，例如，US 6,166,185和US 2003/10124129。WO 03/030833、WO 2006/068953、WO 03/057134或US2006/0122370。
研究血管生成素-2局限性表达的影响已经显示，拮抗血管生成素-1/Tie-2信号松弛紧绷的血管结构，因而使EC暴露于来自血管生成诱导物(例如VEGF)的激活信号(Hanahan,D.,Science,277(1997)48-50)。这种因抑制血管生成素-1产生的促血管生成作用表明，抗血管生成素-1疗法将不是有效的抗癌疗法。
ANG-2在血管形成期间在发生血管重塑的部位表达。Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60。在成年个体中，ANG-2表达限于血管重塑部位以及在高度血管化的肿瘤中，包括胶质瘤(Osada,H.等人,Int.J.Oncol.18(2001)305-09)；Koga,K.等人,Cancer Res.61(2001)6248-54)、肝细胞癌(Tanaka,S.等人,J.Clin.Invest.103(1999)341-45)、胃癌(Etoh,T.等人,Cancer Res.61(2001)2145-53；Lee,J.H.等人,Int.J.Oncol.18(2001)355-61)、甲状腺肿瘤(Bunone,G.等人,Am J Pathol 155(1999)1967-76)、非小细胞肺癌(Wong,M.P.等人,Lung Cancer 29(2000)11-22)和结肠癌(Ahmad,S.A.等人,Cancer 92(2001)1138-43)及前列腺癌(Wurmbach,J.H.等人,AnticancerRes.20(2000)5217-20)。发现一些肿瘤细胞表达ANG-2。例如，Tanaka,S.等人,J.Clin.Invest.103(1999)341-45在12份人肝细胞癌(HCC)标本中的10份检出ANG-2 mRNA。Ellis小组报告，ANG-2在肿瘤上皮中普遍表达。Ahmad,S.A.等人,Cancer 92(2001)1138-43。其他研究者报告了相似的研究结果。Chen,L.等人,J.Tongji Med.Univ.21(2001)228-35。通过检测归档的人乳腺癌标本中的ANG-2 mRNA水平，Sfiligoi,C.等人,Int.J.Cancer103(2003)466-74报告，ANG-2 mRNA与辅助淋巴结侵入、无疾病时间短和总生存期不良显著相关。Tanaka,F.等人, Cancer Res.62(2002)7124-29分别评述了总计236位病理学分期-I至-IIIA的非小细胞肺癌(NSCLC)患者。使用免疫组织化学，他们发现16.9％的NSCLC患者是ANG-2阳性。ANG-2阳性肿瘤的微血管密度显著地高于ANG-2阴性者。ANG-2的这种生血管作用仅在VEGF表达高时才见到。另外，ANG-2阳性表达是预测术后生存期不良的显著因素。Tanaka,F.等人,Cancer Res.62(2002)7124-7129。但是，他们未发现Ang-1表达和微血管密度之间的显著相关性。Tanaka,F.等人,Cancer Res.62(2002)7124-7129。这些结果表明，ANG-2是几个类型癌症患者的预后不良的指标。
最近，使用一个ANG-2敲除小鼠模型，Yancopoulos小组报告ANG-2是出生后对血管生成而言所需要的。Gale,N.W.等人,Dev.Cell 3(2002)411-23。他们显示，在ANG-2敲除小鼠中未出现眼中进行性编程的玻璃体血管系统退化并且它们的视网膜血管不能从视网膜中央动脉萌生。Gale,N.W.等人,Dev.Cell 3(2002)411-423。他们还发现，缺失ANG-2未出现导致淋巴血管系统的样式和功能的深刻缺陷。Gale,N.W.等人,Dev.Cell 3(2002)411-423。采用Ang-1的遗传挽救纠正了淋巴缺陷，但是未纠正血管生成缺陷。Gale,N.W.等人,Dev.Cell 3(2002)411-423。
Peter及其同事报告作为重组蛋白或在病毒表达载体中递送时，可溶性Tie2抑制小鼠模型中鼠乳腺癌和黑色素瘤的体内生长。Lin,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)8829-34；Lin,P.等人,J.Clin.Invest.100(1997)2072-78。如此处理的肿瘤组织中的血管密度大大降低。此外，可溶性Tie2阻断大鼠角膜中肿瘤细胞条件培养基刺激的血管生成。Lin,P.等人,J.Clin.Invest.100(1997)2072-78。另外，Isner和他的团队显示，添加ANG-2至VEGF比单独的VEGF促进显著更长和更多的环周新生血管分布。Asahara,T.等人,Circ.Res.83(1998)233-40。过量可溶性Tie2受体妨碍ANG-2调节VEGF诱导的血管新生。Asahara,T.等人,Circ.Res.83(1998)233-40。Siemeister,G.等人,Cancer Res.59:3(1999)3185-91用裸鼠异种移植物显示，异种移植物中的Flt-1或Tie2的胞外配体结合结构域过量表达导致明显的抑制途径，这不能由另一者代偿，从而显示VEGF受体途径和Tie2途径应当视为体内血管生成过程必需的两种独立中介物。Siemeister,G.等人,CancerRes.59:3(1999)3185-3191。这由White,R.,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(2003)5028-33的最近论文证明。在他们的研究中，显示特异性结合并抑制ANG-2的抗核酸酶的RNA适配体显著抑制大鼠角膜微囊袋血管生成模型中bFGF诱导的血管新生。
眼血管疾病如年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病变(DR)分别归因于脉络膜血管或视网膜血管异常新生。它们是工业化国家中视力丧失的主导病因。由于视网膜由充分确定的神经元要素层、神经胶质要素层和血管要素层组成，故相对小的扰动，如血管增生或水肿中所见的那些，可以导致明显的视觉功能丧失。遗传性视网膜变性，如视网膜色素病变(RP)，也与血管畸形如小动脉狭窄和血管萎缩相关。它们影响多达1/3500个体并且特征为渐进性夜盲、视野丧失、视神经萎缩、小动脉衰弱和中央视力减退，经常进展成完全失明。
缺血性视网膜病变的特征为视网膜血管系统损失或功能障碍，这导致血液流量减少和缺氧。视网膜通过产生长出新血管的信号而响应于缺氧，但是这些新血管通常脆弱和杂乱无章。正是这些异常新血管长出才对视力造成大部分视力威胁，因为它们可能泄漏，导致出血或导致可能造成视网膜脱离的瘢痕化。现有的缺血性视网膜病变疗法寻求制止病变血管生长，但是没有解决基础性的驱动其生长的局部缺血。另外，糖尿病性视网膜病变(一种影响数百万人的缺血性视网膜病变)的标准疗法涉及用激光破坏部分视网膜，力图终止新血管生长并保护中心视力。已经用各项策略来阻断血管内皮生长因子(VEGF)(血管生长的主要促进物)的功能。短期内，抗VEGF疗法可以改善视力，但是它没有解决基础性的局部缺血并且实际上可能加重这种状况，因为它抑制全部的血管生长，包括有益的附属物。在缺血的脑、心脏或肢体内可能需要新血管生长的老年和/或糖尿病患者中还严重顾虑这些药物的全身暴露。
一般对于采用玻璃体内施加法的眼病，经常使用较小的抗体片段如Fab或Fab2，因为它们具有小的血清半寿期并且全身性毒性风险较低。但是，这种较小片段一般也具有较低的玻璃体内半寿期(例如归因于更快扩散入血清)并且一般不得不更频繁地给药。
在一个结合臂中具有结构域替换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL) 在WO2009/080252和Schaefer,W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108(2011)11187-11191(所述文献作为参考并入本文)中详述。它们明确减少由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链错配引起的副产物(与没有这种结构域交换的方案相比)。但是，其制品并未完全不含副产物。主要的副产物基于Bence-Jones型相互作用。还参见Schaefer,W等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108(2011)11187-11191；在补充材料的图S1I中)。
在WO 2010/040508中，报告了双特异性抗VEGF/抗ANG-2抗体。WO 2014/177460中报告了FcRn结合作用经修饰的人抗体及使用方法。Thomas,M.等人报告了一种新的血管生成素-2选择性全人抗体，与泛血管生成素-1/-2抑制剂相比，其具有强力抗肿瘤和抗血管生成功效及优越的副作用特征(PLOS One 8(2013)E54923)。Papadopoulos,K.P.等人报告了晚期实体瘤恶性肿瘤患者中REGN910(SAR307746)(一种全人和选择性血管生成素-2(Ang2)单克隆抗体(MAb))I期人体首次研究(摘要2517，2013年ASCO年会)。
概述
本发明提供抗ANG2抗体及其使用方法。在具体实施方案中，抗体是亲和力成熟的抗体。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该抗体还包含了(a)包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该抗体还包含了(a)包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该抗体还包含了(a)包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个实施方案中，抗体包含了具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变结构域。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体
i)包含与SEQ ID NO:19具有多于70％、或85％、或90％、或95％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:6具有多于70％、或85％、或90％、或95％序列同一性的轻链可变结构域，
ii)在重链可变结构域中在位置28处具有氨基酸残基天冬酰胺(N)，在位置30处具有氨基酸残基丙氨酸(A)，在位置100b处具有氨基酸残基脯氨酸(P)和在位置100j处具有氨基酸残基丙氨酸(A)和在轻链可变结构域中在位置51处具有氨基酸残基苏氨酸(T)(根据Kabat编号)，并且
iii)与包含了具有SEQ ID NO:19的序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:33的序列的轻链可变结构域的抗体相比，使用Tie2磷酸化ELISA测定，所述抗体在使用稳定表达人Tie2的HEK293细胞的基于细胞的测定法中对抑制ANG2与其受体Tie2结合具有较低的EC50值。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗体属于人IgG1亚类或人IgG4亚类。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗体属于具有κ轻链的人IgG1亚类。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗体属于具有λ轻链的人IgG1亚类。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:19的VH序列和SEQ ID NO:24的VL序列的抗体。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:33的VL序列的抗体。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:37的VH序列和SEQ ID NO:42的VL序列的抗体。
在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。
在全部方面的一个实施方案中，人源化抗体通过抑制人ANG2与Tie2受体结合，阻断人ANG2的生物学活性。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的抗体Fab片段，其中抗体Fab片段包含了(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该抗体Fab片段还包含了(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的抗体Fab片段，其中抗体Fab片段包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该抗体Fab片段还包含了(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的抗体Fab片段，其中抗体Fab片段包含了(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该抗体Fab片段还包含了(a) 包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:19的VH序列和SEQ ID NO:24的VL序列的抗体Fab片段。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:33的VL序列的抗体Fab片段。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:37的VH序列和SEQ ID NO:42的VL序列的抗体Fab片段。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的scFv抗体片段，其中scFv抗体片段包含了(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该scFv抗体片段还包含了(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的scFv抗体片段，其中scFv抗体片段包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该scFv抗体片段还包含了(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是一种与人ANG2特异性结合的scFv抗体片段，其中scFv抗体片段包含了(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H3。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，该scFv抗体片段还包含了(a)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:19的VH序列和SEQ ID NO:24的VL序列的scFv抗体片段。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:33的VL序列的scFv抗体片段。
如本文报告的一个方面是包含SEQ ID NO:37的VH序列和SEQ ID NO:42的VL序列的scFv抗体片段。
如本文报告的一个方面是通过X射线晶体学测定时，作为本文报告的抗体是与至少90％的ANG2残基相互作用的抗ANG2抗体。
如本文报告的一个方面是通过X射线晶体学测定时，作为本文报告的抗体是与相同的ANG2残基相互作用的抗ANG2抗体。
如本文报告的一个方面是通过X射线晶体学测定时，作为本文报告的抗体是与至少90％的ANG2残基相互作用并且抑制ANG2与其受体结合的抗ANG2抗体。
如本文报告的一个方面是通过X射线晶体学测定时，作为本文报告的抗体是与相同的ANG2残基相互作用并且抑制ANG2与其受体结合的抗ANG2抗体。
如本文报告的一个方面是一种(分离)的核酸，其编码如本文报告的抗体。
如本文报告的一个方面是包含如本文报告的核酸的宿主细胞。
如本文报告的一个方面是一种产生如本文报告的抗体的方法，所述方法包括培养如本文报告的宿主细胞以产生抗体和从宿主细胞或培养基回收抗体。
如本文报告的一个方面是一种包含如本文报告的抗体和可药用载体的药物制剂。
在一个实施方案中，药物制剂还包含额外的治疗剂。在一个实施方案中，额外的治疗剂是抗VEGF抗体、抗IL-1β抗体或抗PDGF-B抗体。
如本文报告的一个方面是如本文报告的抗体用作药物。
如本文报告的一个方面是如本文报告的抗体用于治疗血管疾病。
如本文报告的一个方面是治疗血管疾病的药物组合物。
如本文报告的一个方面是如本文报告的抗体制造用于治疗血管疾病的药物的用途。
如本文报告的一个方面是通过以下方式治疗患有血管疾病的患者的方法：向需要这种治疗的患者施用如本文报告的抗体。
如本文报告的一个方面是如本文报告的抗体用于治疗血管疾病、优选地用于治疗癌症。
本发明的一个实施方案是如本文报告的抗体用于治疗癌症。
如本文报告的一个方面是用作治疗癌症的药物。
如本文报告的一个方面是如本文报告的抗体的用途，用于制造治疗癌症的药物。
如本文报告的一个方面是通过以下方式治疗患有癌症的患者的方法：向需要这种治疗的患者施用如本文报告的抗体。
如本文报告的一个方面是用作防止转移的药物。
如本文报告的一个方面是如本文报告的抗体制造用于防止转移的药物的用途。
如本文报告的一个方面是通过以下方式在患有原发癌症的患者中防止转移的方法：向需要这种预防性治疗的患者施用如本文报告的抗体。
如本文报告的一个方面是如本文报告的抗体用于治疗眼血管疾病、优选地用于黄斑变性。
如本文报告的抗体用于抑制ANG2和Tie2受体之间的相互作用。
如本文报告的一个方面是如本文报告的抗体在制造药物中的用途。
在一个实施方案中，药物用于治疗眼血管疾病、优选地用于治疗黄斑变性。
在一个实施方案中，药物是抑制ANG2和Tie2受体之间的相互作用。
如本文中报道的一个方面是一种治疗患有眼血管疾病、优选地黄斑变性的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文报告的抗体。
如本文报告的一个方面是一种在个体中抑制ANG2和Tie2受体之间的相互作用的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文报告的抗体以抑制ANG2和Tie2受体之间的相互作用。
本发明实施方案的详细描述
I.定义
出于本文目的，“接纳体人构架”是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架或如下文定义的人共有序列构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶物(例如，抗原)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。通常可以由解离常数(Kd)代表分子X对其配偶物Y的亲和力。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗ANG2抗体”和“与ANG2结合的抗体”指一种抗体，所述抗体能够以足够亲和力结合ANG2，从而该抗体可用作靶向ANG2的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗ANG2抗体与不相关的非ANG2蛋白结合的程度小于该抗体与ANG2结合的程度约10％，如通过ELISA或表面等离子体共振所测量。在某些实施方案中，与ANG2结合的抗体具有≤1μM、≤100nM或≤10nM(例如10-8M或更小)的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗ANG2抗体与来自不同物种的ANG2之间保守的ANG2表位结合。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
“与参考抗体结合相同表位的抗体”指至少与参考抗体所相互作用的相同氨基酸残基具有相互作用的抗体。这些相互作用例如是带电荷的氨基酸残基之间的离子相互作用或疏水性氨基酸残基之间的疏水相互作用。
术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
如本文所用，术语“癌症”指增殖性疾病，如淋巴瘤、淋巴细胞白血病、肺癌、非小细胞肺癌(NSCL)、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼球内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆道癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊柱轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤因肉瘤，包括前述任一癌症的难治形式或一种或多种上述癌症的组合。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“免疫缀合物”指抗体和非抗体部分之间的共价缀合物。这种非抗体部分可以是可检测标记物、效应分子或细胞毒性剂。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”指随抗体类别变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量、以实现前述结果的剂量和时间段。
术语“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酰-赖氨酸二肽(Gly446Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInteres,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所述的EU编号体系，也称作EU索引。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞相同的用于筛选或选择的功能或生物学活性。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将基本上包含至少1个、并且一般2个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。
本文中的HVR包括
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)出现在第27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨基酸残基处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外说明，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S.等人,J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗ANG2抗体的分离核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或分别的载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。
根据本发明，术语“转移”指癌细胞从原发肿瘤传播至患者中其他的一个或多个部位，在所述部位处随后形成继发肿瘤。确定癌是否已经转移的手段是本领域已知的并且包括骨扫描、X光胸片、CAT扫描、MRI扫描和肿瘤标记物试验。
如本文所用的术语“防止转移”或“防止继发肿瘤”具有相同意思并且指在患有癌症的患者中以抑制或减少癌细胞从原发肿瘤进一步传播至患者中其他一个或多个部位的这种方式，对抗转移的预防剂。这意味着防止、延迟或减少原发肿瘤或癌的转移并且因此防止、延迟或减少继发肿瘤的形成。优选地，防止和减少肺转移，即肺继发肿瘤，这意味着防止或减少癌细胞从原发肿瘤转移性传播至肺。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”表明该抗体的特征为从基本上均质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有不定结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻结构域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成称作κ(κ)和λ(λ)的两种类型之一。
术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的注意事项的信息。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得ALIGN-2程序或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物学活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，术语“ANG2”指人血管生成素-2(ANG-2)(备选地缩写为：ANGPT2或ANG2)(SEQ ID NO:54)，其例如在Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60和Cheung,A.H.等人,Genomics 48(1998)389-91中描述。血管生成素-1和-2作为血管内皮中选择性表达的酪氨酸激酶家族Tie的配体被发现(Yancopoulos,G.D.等人,Nature 407(2000)242-248)。目前存在4个确定的血管生成素家族成员。血管生成素-3和-4(ANG3和ANG4)可以代表小鼠和人中相同基因座的广泛多样的对应物(参见，例如，Kim,I.等人,FEBSLett.,443(1999)353-56；Kim,I.等人,J.Biol.Chem.274(1999)26523-26528)。ANG1和ANG2最初在组织培养实验中分别鉴定为激动剂和拮抗剂(关于ANG1，参见Davis,S.等人,Cell87(1996)1161-69；关于ANG2，参见Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60)。全部已知的血管生成素主要与Tie2结合，并且ANG1和ANG2均以3nM(Kd)亲和力与Tie2结合(Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60)。
如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以用于预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等人,KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。
术语“血管疾病”包括癌症、炎性疾病、动脉粥样硬化、局部缺血、外伤、脓毒症、COPD、哮喘、糖尿病、AMD、视网膜病、卒中、肥胖症、急性肺损伤、出血、血管泄漏例如细胞因子诱导的血管泄漏例、过敏、格雷病、桥本自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、巨细胞动脉炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、节段性回肠炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、尤其实体瘤、眼内新生血管性综合征，如增生性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎和银屑病(Folkman,J.等人,J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934；Klagsbrun,M.等人,Annu.Rev.Physiol.53(1991)217-239；和Garner,A.,Vascular diseases,引自:Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner,A.和Klintworth,G.K.,(编著),第2版,Marcel Dekker,New York(1994),第1625-1710页)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入宿主细胞中的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
II.组合物和方法
本文中报告了亲和力改善的抗ANG2抗体。
本发明的抗体例如可用于治疗血管疾病，如眼血管疾病，例如黄斑变性，或癌症。
本发明的抗体具有高度有价值的特性，所述特性带给患有这种疾病、尤其患有癌症或黄斑变性的患者获益。如本文报告的抗体高度有效抑制血管生成或血管疾病。
本发明的抗体将在以下方面有效
a)肿瘤生长抑制，和/或
b)抑制肿瘤血管生成或血管疾病，和/或
c)抑制黄斑变性。
A.如本文报告的示例性抗ANG2抗体
本文中报告了结合特性改善的抗ANG2抗体及其片段。
人ANG2结合动力学：
分子 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)* t1/2(s)
0009 1.92E+06 0.07565 39 9
0041 3.85E+06 3.17E-03 1 219
0075 2.22E+06 3.10E-02 14 22
0090 2.16E+06 2.53E-03 1 274
0098 1.56E+07 1.58E-04 10*
0099 2.61E+07 1.10E-04 4*
0100 2.06E+07 1.67E-04 8*
0101 1.83E+07 1.20E-04 7*
*亲合力
食蟹猴ANG2结合动力学：
分子 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)* t1/2(s)
0009 1.45E+06 8.81E-02 61 8
0041 2.14E+06 3.60E-03 2 193
0075 1.34E+06 3.25E-02 24 21
0090 2.02E+06 3.08E-03 2 225
在下表中给出如根据实施例6的测定法所测定的如本文报告的抗体的相对生物学活性。
分子 相对生物学活性[％]
0009 72
0041 838
0075 128
0090 706
0098 100
已经通过确定聚集起始温度(Tagg)和熔化温度(Tm)，评价不同抗体的热稳定性(参见下表)。
分子 Tagg[℃] Tm[℃]
0009 62.2 65.9
0041 63.1 66.0
0075 63.6 67.0
0090 64.0 67.4
此外，抗体在应力试验中显示良好的稳定性。结合活性已经使用表面等离子体共振法测定(参见下表)。
100％＝贮存在-80℃的样品
可以在CE-SDS分析中见到相同的稳定性(参见下表)。
下表概括如本文报告的抗体的特性。
如本文报告的各方面均是如上表中给出的重链和轻链的独立组合。
如本文报告的一个方面是一种人源化抗人ANG2抗体，所述抗体包含了(a)包含SEQID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体还包含了(d)包含SEQID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
如本文报告的一个方面是一种人源化抗人ANG2抗体，所述抗体包含了(a)包含SEQID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体还包含了(d)包含SEQID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗ANG2抗体，所述抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含了包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体包含了包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含了包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2。在又一个实施方案中，该抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，本发明提供提供一种抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的抗体包含了(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，抗ANG2抗体包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗ANG2抗体保留与ANG2结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ IDNO:28中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗ANG2抗体包含SEQ ID NO:28中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一个方面，提供一种抗ANG2抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗ANG2抗体保留与ANG2结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:33中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗ANG2抗体包含SEQ IDNO:33中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个具体实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗ANG2抗体，其中该抗体包含如上文提供的任一个实施方案中的VH和如上文提供的任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:33中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在本发明的又一个方面，根据任一个以上实施方案的抗ANG2抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗ANG2抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双体抗体(diabody)或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗ANG2抗体是效应子沉默抗ANG2抗体。在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗ANG2抗体是效应子沉默抗ANG2抗体并且不与人FcRn结合。在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗ANG2抗体属于人IgG1亚类并且在两条重链中具有突变L234A、L235A、P329G、I253A、H310A和H434A(根据Kabat索引编号)。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗ANG2抗体是双特异性抗体。
如本文报告的一个方面是一种双价双特异性抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
根据a)的抗体不含有如根据b)报告的修饰并且根据a)的重链和轻链是分离的链。
在根据b)的抗体中
在轻链内部
可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，
并且
在重链内部
可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换。
在一个实施方案中
i)根据a)的第一轻链的恒定结构域CL中位置124处的氨基酸(根据Kabat编号)被带正电荷的氨基酸置换，并且其中根据a)的第一重链的恒定结构域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电荷的氨基酸置换，
或
i)在根据b)的第二轻链的恒定结构域CL中位置124处的氨基酸(根据Kabat编号)被带正电荷的氨基酸置换，并且其中在根据b)的第二重链的恒定结构域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电荷的氨基酸置换。
在一个优选的实施方案中
i)根据a)的第一轻链的恒定结构域CL中位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立置换(根据Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立置换)，并且其中根据a)的第一重链的恒定结构域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立置换(根据Kabat EU索引编号)，
或
i)根据b)的第二轻链的恒定结构域CL中位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立置换(根据Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立置换)，并且其中根据b)的第二重链的恒定结构域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D) 独立置换(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，第二重链的恒定结构域CL中位置124和123处的氨基酸被K置换(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，第二轻链恒定结构域CH1中位置147和213处的氨基酸被E置换(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个优选的实施方案中，第一轻链的恒定结构域CL中位置124和123处的氨基酸被K置换，并且第一重链的恒定结构域CH1中位置147和213处的氨基酸被E置换(根据KabatEU索引编号)。
在一个实施方案中，第二重链的恒定结构域CL中位置124和123处的氨基酸被K置换，并且其中第二轻链的恒定结构域CH1中位置147和213处的氨基酸被E置换，并且第一轻链的可变结构域VL中位置38处的氨基酸被K置换，第一重链的可变结构域VH中位置39处的氨基酸被E置换，第二重链的可变结构域VL中位置38处的氨基酸被K置换，第二轻链的可变结构域VH中位置39处的氨基酸被E置换(根据Kabat EU索引编号)。
如本文报告的一个方面是一种双价双特异性抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换，并且其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
根据a)的抗体不含有如根据b)报告的修饰并且根据a)的重链和轻链是分离的链。
在根据b)的抗体中
在轻链内部
可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，并且恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；
并且
在重链内部
可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换，并且恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
如本文报告的一个方面是一种双价双特异性抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
根据a)的抗体不含有如根据b)报告的修饰并且根据a)的重链和轻链是分离的链。
在根据b)的抗体中
在轻链内部
恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；
并且在重链内部
恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
如本文报告的一个方面是一种多特异性抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，和
b)与一至四种其他抗原特异性结合(即，与第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，优选地与一种其他抗原，即第二抗原，特异性结合)的一个、两个、三个或四个单链Fab片段，
其中根据b)的所述单链Fab片段与根据a)的所述全长抗体借助肽接头在所述全长抗体的重链或轻链的C末端或N末端融合，
其中第一抗原或其他抗原之一是人ANG2。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同单链Fab片段与所述全长抗体借助肽接头在所述全长抗体的重链或轻链的C末端融合。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同单链Fab片段与所述全长抗体借助肽接头在所述全长抗体的重链的C末端融合。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同单链Fab片段与所述全长抗体借助肽接头在所述全长抗体的轻链的C末端融合。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同单链Fab片段与所述全长抗体借助肽接头在所述全长抗体的每个重链或轻链的C末端融合。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同单链Fab片段与所述全长抗体借助肽接头在所述全长抗体的每个重链的C末端融合。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同单链Fab片段与所述全长抗体借助肽接头在所述全长抗体的每个轻链的C末端融合。
如本文报告的一个方面是一种三价双特异性抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，
b)由以下组成的第一多肽
ba)抗体重链可变结构域(VH)，
或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述第一多肽用其VH结构域的N末端借助肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C末端融合，
c)由以下组成的第二多肽
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，
或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，
其中所述第二多肽用其VL结构域的N末端借助肽接头与所述全长抗体的两条重链中另一条重链的C末端融合，
并且
其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)共同形成与第二抗原特异性结合的抗原结合位点，
并且
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
在一个实施方案中，根据b)的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和根据c)的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过以下位置之间引入二硫键连接来借助链间二硫键连接和稳定：
i)重链可变结构域位置44至轻链可变结构域位置100，或
ii)重链可变结构域位置105至轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101至轻链可变结构域位置100(总是根据Kabat EU索引编号)。
引入非天然二硫键以起到稳定作用的技术例如在WO 94/029350；Rajagopal,V.等人,Prot.Eng.(1997)1453-59；Kobayashi,H.等人,Nuclear Medicine&Biology,Vol.25,(1998)387-393；或Schmidt,M.等人,Oncogene(1999)181711-1721中描述。在一个实施方案中，根据b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，根据b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(总是根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间无所述任选的二硫键稳定作用的三价双特异性抗体。
如本文报告的一个方面是一种三特异性或四特异性抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合的全长抗体的第一轻链和第一重链，和
b)与第二抗原特异性结合的全长抗体的第二(修饰的)轻链和第二(修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH相互替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1相互替换，并且
c)其中与一种或两种其他抗原(即与第三和/或第四抗原)特异性结合的一至四个抗原结合肽借助肽接头与a)和/或b)的轻链或重链的C末端或N末端融合，
其中第一抗原或第二抗原或其他抗原之一是人ANG2。
根据a)的抗体不含有如根据b)报告的修饰并且根据a)的重链和轻链是分离的链。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体包含根据c)的与一种或两种其他抗原特异性结合的一个或两个抗原结合肽。
在一个实施方案中，抗原结合肽选自scFv片段和scFab片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽是scFv片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽是scFab片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽与a)和/或b)的重链的C末端融合。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体包含根据c)的与一种其他抗原特异性结合的一个或两个抗原结合肽。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体包含根据c)的与第三抗原特异性结合的两个相同抗原结合肽。在一个优选的实施方案中，这两个相同的抗原结合肽均借助相同的肽接头与a)和b)的重链的C末端融合。在一个优选的实施方案中，两个相同的抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体包含根据c)的与第三和第四抗原特异性结合的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽均借助相同的肽接头与a)和b)的重链的C末端融合。在一个优选的实施方案中，所述两个抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
如本文报告的一个方面是一种双特异性四价抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合(并包含两个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链，
b)与第二抗原特异性结合的抗体的两个额外的Fab片段，其中所述额外的Fab片段均借助肽接头与a)的重链的C末端或N末端融合，
并且
其中在Fab片段中进行以下修饰
i)在a)的两个Fab片段中或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，和/或恒定结构域CL和CH1相互替换，
或
ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，并且恒定结构域CL和CH1相互替换，
并且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，或恒定结构域CL和CH1相互替换，
或
iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，或恒定结构域CL和CH1相互替换，
并且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，并且恒定结构域CL和CH1相互替换，
或
iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，并且在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1相互替换，
或
v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1相互替换，并且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
在一个实施方案中，所述额外的Fab片段均借助肽接头与a)的重链的C末端或与a)的重链的N末端融合。
在一个实施方案中，所述额外的Fab片段均借助肽接头与a)的重链的C末端融合。
在一个实施方案中，所述额外的Fab片段均借助肽接头与a)的重链的N末端融合。
在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，
和/或
恒定结构域CL和CH1相互替换。
在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，
和/或
恒定结构域CL和CH1相互替换。
在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1相互替换。
在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：
i)在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，
和/或
恒定结构域CL和CH1相互替换。
在一个实施方案中，在Fab片段中进行以下修饰：
i)在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1相互替换。
如本文报告的一个方面是一种双特异性四价抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合并且包含第一VH-CH1结构域对的第一抗体的(修饰)重链，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N末端借助肽接头与所述重链的C末端融合，
b)a)的所述第一抗体的两条轻链，
a)与第二抗原特异性结合并且包含第一VH-CL结构域对的第二抗体的(修饰)重链，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N末端借助肽接头与所述重链的C末端融合，并且
d)c)的所述第二抗体的两条(修饰)轻链，各自包含CL-CH1结构域对，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
如本文报告的一个方面是一种双特异性抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)与第二抗原特异性结合的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N末端借助肽接头与轻链的C末端连接。
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
根据a)的抗体不含有如根据b)报告的修饰并且重链和轻链是分离的链。
如本文报告的一个方面是一种双特异性抗体，其包含
a)与第一抗原特异性结合并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，和
b)与第二抗原特异性结合的包含VH2结构域和VL2结构域的Fv片段，其中两个结构域通过二硫键彼此连接，
其中仅VH2结构域或VL2结构域借助肽接头与特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
在双特异性抗体中，根据a)的重链和轻链是分离的链。
在一个实施方案中，VH2结构域或VL2结构域的另一者不借助肽接头与特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合。
在如本文报告的全部方面，第一轻链包含VL结构域和CL结构域，且第一重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在全部方面的一个实施方案中，如本文报告的抗体是多特异性抗体，其需要至少两条重链多肽异二聚化并且其中该抗体与人ANG2和第二非人ANG2抗原特异性结合。
几种修饰CH3以支持异二聚化的方案已经例如在下述文献中描述：WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291，所述文献通过参考方式并入本文。一般地，在本领域已知的方案中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域均以互补方式工程化，从而包含一个CH3工程化的结构域的重链不再可以与结构相同的另一条重链同型二聚化(例如CH3工程化的第一重链不再可以与另一CH3工程化的第一重链同型二聚化；并且CH3工程化的第二重链不再可以与另一CH3工程化的第二重链同型二聚化)。因而，强迫包含一个CH3工程化的结构域的重链与包含以互补方式工程化的CH3结构域的另一条重链异二聚化。对于本发明的这个实施方案，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域均以互补方式通过氨基酸置换工程化，从而强迫第一重链和第二重链异二聚化，而第一重链和第二重链不再可以同型二聚化(例如因为空间原因)。
构思了上文援引并且包括的本领域已知用于支持重链异二聚化的不同方案作为本发明多特异性抗体中使用的不同备选物，所述多特异性抗体包含衍生自与第一抗原特异性结合的第一抗体的“非交叉Fab区”，和衍生自与第二抗原特异性结合的第二抗体的“交叉Fab区”，它们与上文对本发明描述的特定氨基酸置换组合。
可以通过“结入扣(knob-into-hole)”技术改变如本文报告的多特异性抗体的CH3结构域，所述技术以例如WO 96/027011、Ridgway,J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中的几个例子详述。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用界面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域的一者可以是“结”，而另一者是“扣”。二硫键的引入进一步稳定异二聚体(Merchant,A.M等人,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。
在一个优选的实施方案中，如本文报告的多特异性抗体在“结链”的CH3结构域中包含T366W突变并且在“扣链”的CH3结构域中包含T366S、L368A、Y407V突变(根据Kabat EU索引编号)。也可以使用CH3结构域之间的额外链间二硫键(Merchant,A.M等人,NatureBiotech 16(1998)677-681)，例如通过向“结链”的CH3结构域引入Y349C突变并向“扣链”的CH3结构域引入E356C突变或S354C突变。因此在另一个优选的实施方案中，如本文报告的多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变及在两个CH3结构域的另一个结构域中包含E356C、T366S、L368A和Y407V突变，或者如本文报告的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变及在两个CH3结构域的另一个结构域中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变(在一个CH3结构域中的额外Y349C突变和在另一个CH3结构域中的额外E356C或S354C突变形成链间二硫键)(根据Kabat EU索引编号)。
还可以备选或额外地使用如EP 1 870 459A1所描述的其他的结入扣技术。在一个实施方案中，如本文报告的多特异性抗体在“结链”的CH3结构域中包含R409D和K370E突变并且在“扣链”的CH3结构域中包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，如本文报告的多特异性抗体在“结链”的CH3结构域中包含T366W突变并且在“扣链”的CH3结构域中包含T366S、L368A和Y407V突变以及额外地在“结链”的CH3结构域中包含R409D和K370E突变及在“扣链”的CH3结构域中包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，如本文报告的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变及在两个CH3结构域的另一结构域中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或者如本文报告的多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变及在两个CH3结构域的另一结构域中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变以及额外地在“结链”的CH3结构域中包含R409D和K370E突变及在“扣链”的CH3结构域中包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
除“结入扣技术”外，用于修饰多特异性抗体的重链CH3结构域以实行异二聚化的其他技术是本领域已知的。将这些技术，尤其在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中所述的那些技术，在本文构思作为与如本文报告的多特异性抗体组合的“结入扣技术”的备选物。
在如本文报告的多特异性抗体的一个实施方案中，EP 1870459中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。这种方法基于在第一重链和第二重链之间的CH3/CH3结构域界面中特定氨基酸位置处引入带相反电荷的带电荷氨基酸。
因此，这个实施方案涉及如本文报告的多特异性抗体，其中在抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于相应的抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域的相应氨基酸序列各自包含一组位于抗体三级结构中所述界面内部的氨基酸，其中从位于一条重链的CH3结构域中界面内的这组氨基酸中，第一氨基酸由带正电荷的氨基酸置换，并且从位于另一条重链的CH3结构域中界面内的这组氨基酸中，第二氨基酸由带负电荷的氨基酸置换，根据这个实施方案的多特异性抗体在本文中也称作“CH3(+/-)-工程化多特异性抗体”(其中缩写“+/-”代表在相应CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。
在如本文报告的所述CH3(+/-)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，并且带负电荷的氨基酸选自E或D。
在如本文报告的所述CH3(+/-)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K和R，并且带负电荷的氨基酸选自E或D。
在如本文报告的所述CH3(+/-)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸是K，并且带负电荷的氨基酸是E。
在如本文报告的所述CH3(+/-)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置409处的氨基酸R由D置换和位置处的氨基酸K由E置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置399处的氨基酸D由K置换及位置357处的氨基酸E由K置换(根据KabatEU索引编号)。
在如本文报告的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2013/157953中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在如本文报告的所述多特异性抗体的一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置366处的氨基酸T由K置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置351处的氨基酸L由D置换(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置366处的氨基酸T由K置换及位置351处的氨基酸L由K置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置351处的氨基酸L由D置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报告的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置366处的氨基酸T由K置换及位置351处的氨基酸L由K置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置351处的氨基酸L由D置换(根据Kabat EU索引编号)。另外，另一条重链的CH3结构域中包含至少一个以下置换：位置349处的氨基酸Y由E置换，位置349处的氨基酸Y由D置换及位置368处的氨基酸L由E置换(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，位置368处的氨基酸L由E置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报告的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2012/058768中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在如本文报告的所述多特异性抗体的一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置351处的氨基酸L由Y置换及位置407处的氨基酸Y由A置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置366处的氨基酸T由A置换及位置409处的氨基酸K由F置换(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，除前述置换之外，另一条重链的CH3结构域中置换下述位置处的至少一个氨基酸：411(原始为T)、399(原始为D)、400(原始为S)、405(原始为F)、390(原始为N)和392(原始为K)(根据Kabat EU索引编号)。优选的置换是：
-位置411处的氨基酸T由选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)，
-位置399处的氨基酸D由选自R、W、Y和K的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)，
-位置400处的氨基酸S由选自E、D、R和K的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)，
-位置405处的氨基酸F由选自I、M、T、S、V和W的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)；
-位置390处的氨基酸N由选自R、K和D的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)；并且
-位置392处的氨基酸K由选自V、M、R、L、F和E的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报告的所述多特异性抗体(根据WO 2012/058768工程化)的另一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置351处的氨基酸L由Y置换及位置407处的氨基酸Y由A置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置366处的氨基酸T由V置换及位置409处的氨基酸K由F置换(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置407处的氨基酸Y由A置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置366处的氨基酸T由A置换及位置409处的氨基酸K由F置换(根据Kabat EU索引编号)。在所述的前述最后的实施方案中，所述其他重链的CH3 结构域中位置392处的氨基酸K由E置换，位置411处的氨基酸T由E置换，位置399处的氨基酸D由R置换及位置400处的氨基酸S由R置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报告的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2011/143545中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在如本文报告的所述多特异性抗体的一个实施方案中，两条重链的CH3结构域中的氨基酸修饰在位置368和/或409处引入(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报告的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2011/090762中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。WO 2011/090762涉及根据“结入扣”技术的氨基酸修饰。在如本文报告的所述CH3(KiH)-工程化多特异性抗体的一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置366处的氨基酸T由W置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置407处的氨基酸Y由A置换(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的所述CH3(KiH)-工程化多特异性抗体的另一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置366处的氨基酸T由Y置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置407处的氨基酸Y由T置换(根据KabatEU索引编号)。
在如本文报告的多特异性抗体(其属于IgG2同种型)的一个实施方案中，WO 2011/090762中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。
在如本文报告的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2009/089004中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在如本文报告的所述多特异性抗体的一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置392处的氨基酸K或N由带负电荷的氨基酸置换(在一个优选的实施方案中，由E或D置换，在一个优选的实施方案中，由D置换)，并且另一条重链的CH3结构域中位置399处的氨基酸D、位置356处的氨基酸E或D或位置357处的氨基酸E由带正电荷的氨基酸置换(在一个优选的实施方案中，由K或R置换，在一个优选的实施方案中，由K置换，在一个优选的实施方案中位置399或356处的氨基酸均由K置换)(根据Kabat EU索引编号)。在又一个实施方案中，除前述置换之外，一条重链的CH3结构域中位置409处的氨基酸K或R由带负电荷的氨基酸置换(在一个优选的实施方案中，由E或D置换，在一个优选的实施方案中，由D置换)(根据Kabat EU索引编号)。在一个甚至进一步的实施方案中，除前述置换之外或作为其备选，一条重链的CH3结构域中位置439处的氨基酸K和/或位置370处的氨基酸K彼此独立地由带负电荷的氨基酸置换(在一个优选的实施方案中，由E或D置换，在一个优选的实施方案中，由D置换)(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报告的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2007/147901中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在如本文报告的所述多特异性抗体的一个实施方案中，一条重链的CH3结构域中位置253处的氨基酸K由E置换，位置282处的氨基酸D由K置换及位置322处的氨基酸K由D置换，并且另一条重链的CH3结构域中位置239处的氨基酸D由K置换，位置240处的氨基酸E由K置换及位置292处的氨基酸K由D置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报告的多特异性抗体的一个实施方案中，WO 2007/110205中所述的方法用来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。
在如本文报告的全部方面和实施方案的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在本发明的一个优选实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，抗体是双价或三价抗体。在一个实施方案中，抗体是双价抗体。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于人IgG1亚类或属于带突变L234A和L235A的人IgG1亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于人IgG2亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于人IgG3亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于人IgG4亚类或属于带额外突变S228P的人IgG4亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于人IgG1亚类或人IgG4亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于带突变L234A和L235A的人IgG1亚类(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于带突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于带突变S228P和L235E的人IgG4亚类(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体属于带突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，包含了包括如本文具体说明的CH3结构域的重链的抗体包含额外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的全部方面的一个实施方案中，包含了包括如本文具体说明的CH3结构域的重链的抗体包含额外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
在又一个方面，根据任一个以上实施方案的抗ANG2抗体可以单独或以组合方式合并如下文1-5部分中所述的任一特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM或≤10nM(例如10-8M或更小)的解离常数(KD)。
下文实施例中概述了用于测定KD值的方法。
当使用表面等离子体共振测定法时，KD值可以备选地如下测量：可以使用BIACORE T200仪(GE Healthcare)通过表面等离子体共振法研究抗体或抗体片段与人ANG2-RBD-Fc区融合物的结合。通过使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒在pH 5.0，在Series S CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联约4000RU抗人抗体(10μg/ml抗人IgG(Fc)抗体；订购代码BR-1008-39；GE Healthcare)。在固定操作期间，使用HBS-N(10mMHEPES，150mM NaCl pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于以下动力学表征，样品和运行缓冲液是HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20；GEHealthcare)。在动力学表征之前，将流动小室设定至25℃-并且将样品块设定至12℃-并用运行缓冲液填装2次。
通过以流速5μl/分钟注射1μg/ml溶液30秒，捕获ANG2-RBD-Fc区融合物。通过在溶液中以流速90μl/分钟注射多种浓度(始于300nM，以1:3连续稀释)的Cross-Fab持续90秒，测量结合作用。监测解离期直至600秒并通过样品溶液转换成运行缓冲液启动。通过用3MMgCl2溶液以流速5μl/分钟洗涤60秒，使全部表面再生。通过扣减从抗人IgG抗体(Fc)表面获得的响应值，修正本体折射率差异。还扣减空白注射(＝双参考)。为了计算KD和其他动力学参数，使用朗格缪尔1:1模型。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,引自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),(Springer-Verlag,New York(1994),第269-315页；还参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，见US 5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是双价或双特异性的。参见例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三体抗体和四体抗体还在Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134)中描述。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如US 6,248,516)。
可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)，如本文所述。
3.嵌合的和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在US 4,816,567；和Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合其片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人抗体(例如，从其衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法例如在Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且例如在Riechmann,I.等人,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods 36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua,W.F.等人,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn,J.等人,Methods 36(2005)61-68；以及Klimka,A.等人,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中进一步描述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”方法选择的构架区(例如，参见Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；从特定亚组的人抗体的轻链可变区或重链可变区的共有序列衍生的构架区(例如，参见Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(例如，参见Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选FR文库衍生的构架区(例如，参见Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
4.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，这些结合特异性之一针对ANG2，并且另一种特异性针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合ANG2的2个不同表位。双特异性抗体也可以用来使细胞毒性剂局限至表达ANG2的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO93/08829和Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“结入扣”工程化(例如，参见US5,731,168)。也可以通过以下方式制备多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，参见US 4,676,980和Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术以制备双特异性抗体片段(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，参见Gruber,M.等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)中所述那样。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(Octopus antibody)”(参见例如US 2006/0025576)。
本文的抗体或片段还包括“双重功能FAb(Dual Acting Fab)”或“DAF”，其包含与ANG2以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。
本文中的抗体或片段也包括在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中描述的多特异性抗体。
5.抗体变体
在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
a)置换变体、插入变体和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。下表中在“优选置换”的标题下显示保守性置换。表1中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更明显的变化。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合作用、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表
可以根据常见的侧链特性分组氨基酸：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些类别之一的成员交换为另一个类别的成员。
一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或接触抗原的残基中做出这类改变，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom,H.R.等人,引自Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种方法，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR导向的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR中发生置换、插入或缺失，只要这类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以例如是在HVR中的抗原接触残基外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不予改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常借助N联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297(例如，见Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。低聚糖可以包括多种糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状低聚糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生某些特性改善的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内部Asn297处岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约第297位置处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，Asn297也可以位于第297位置的上游或下游±3个氨基酸附近，即，第294和300位置之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖基化”或“缺乏岩藻糖的”抗体变体相关的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖基化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，特别在实施例11处)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(例如，参见Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。
还可以对抗体变体提供双分低聚糖，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状低聚糖由GlcNAc对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO 2003/011878；US6,602,684；和US 2005/0123546中描述。也提供低聚糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO 1997/30087；WO 1998/58964和WO1999/22764中描述。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。该Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的有利候选物，其中抗体的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/消耗。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞-NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在US 5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985) 1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性(参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(参见例如Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。
效应子功能减少的抗体包括置换一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(US 6,737,056)的那些。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(US 7,332,581)。
描述了具有FcR结合作用改善或削弱的某些抗体变体。(参见例如US 6,737,056；WO 2004/056312，和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区(例如，在Fc区的第298、333和/或334位置处的置换)(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
在US 2005/0014934中描述了半寿期增加和新生儿Fc受体(FcRn)结合作用改善的抗体，所述新生儿Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些(US 7,371,826)。
关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以例如如US 7,521,541中所述那样产生半胱氨酸工程化的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于定义情况下的疗法中等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部分加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如如US 4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗ANG2抗体的分离核酸。这种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种制备抗ANG2抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗体的核酸，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗ANG2抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。
克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于细菌中表达抗体片段和多肽，例如，参见US 5,648,237、U S5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,引自Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2003),第245-254页，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，可以将抗体从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化抗体。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定可以与昆虫细胞联合使用的许多杆状病毒毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主(例如，见US 5,959,177、US 6,040,498、US6,420,548,US 7,125,978和US 6,417,429(描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562)；如在例如Mather,J.P.等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，例如，见Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2004),第255-268页。
C.测定法
可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗ANG2抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。实施例中报告了示例性测定法。
D.免疫缀合物
本发明也提供免疫缀合物，所述缀合物包含如本文报告的抗ANG2抗体，所述抗ANG2抗体与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素)或放射性同位素缀合。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(参见US 5,208,020、US 5,416,064和EP 0 425 235B1)；澳瑞司他汀，如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483、US 5,780,588和US 7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；刺孢霉素或其衍生物(参见US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001和5,877,296；Hinman,L.M.等人,Cancer Res.53(1993)3336-3342；和Lode,H.N.等人,Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽环类如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz,F.等人,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等人,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D.等人,J.Med.Chem.45(2002)4336-4343；和US 6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇、紫杉醇、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和ortataxel；单端孢霉烯族化合物；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯类。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文所述的抗体与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如TC99m或I123，或核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，MRI)，再次例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta,E.S.等人,Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感的接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari,R.V.等人,Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。
在本文中明确地构思了免疫缀合物或ADC，但不限于采用交联试剂制备的这类缀合物，所述交联试剂包括但不限于可商业获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利诺伊州，美国)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任一种抗ANG2抗体可用于检测ANG2在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量性或定性检测。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗ANG2抗体。在又一个方面，提供一种检测ANG2在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括：使生物样品与如本文所述的抗ANG2抗体在允许抗ANG2抗体与ANG2结合的条件下接触，并且检测抗ANG2抗体和ANG2之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗ANG2抗体用来选择适于用抗ANG2抗体治疗的受试者，例如其中ANG2是选择患者的生物标志物。
在某些实施方案中，提供了标记的抗ANG2抗体。标记物包括但不限于，直接检出的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记物)，以及间接检出(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US 4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基等。
F.药物制剂
通过以下方式制备冻干制剂或水溶液形式的如本文所述的抗ANG2抗体的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(Baxter International,Inc.)。在US 2005/0260186和US 2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
在US 6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水质抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症的需要而含有多于一种有效成分，优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些有效成分。例如，可能想要进一步提供抗IL-1β抗体或抗PDGF-B抗体。这类有效成分以有效用于预期目的的量适当地存在。
有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳浊液(macroemulsion)中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗ANG2抗体可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供作为药物使用的抗ANG2抗体。在其他方面，提供用于治疗眼血管疾病、优选地治疗黄斑变性的抗ANG2抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的抗ANG2抗体。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有眼血管疾病、优选地黄斑变性的个体的方法中的抗ANG2抗体，所述方法包括向该个体施用有效量抗ANG2抗体。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗剂，例如，如下文描述的治疗剂。在其他实施方案中，本发明提供一种用于抑制血管生成的抗ANG2抗体。在某些实施方案中，本发明提供一种在抑制个体中血管生成的方法中使用的抗ANG2抗体，所述方法包括向该个体施用有效量的抗ANG2抗体以抑制血管生成。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”优选地是人。
在又一个方面，本发明提供抗ANG2抗体在制造或配制药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗眼血管疾病、优选地黄斑变性。在又一个实施方案中，该药物用于治疗眼血管疾病、优选地黄斑变性的方法中，所述方法包括向患有眼血管疾病、优选地黄斑变性的个体施用有效量的该药物。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗剂，例如，如下文描述的治疗剂。在又一个实施方案中，药物用于抑制血管生成。在又一个实施方案中，药物用于抑制个体内血管生成方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的抑制血管生成的药物。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于治疗眼血管疾病、优选地黄斑变性的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种眼血管疾病、优选地黄斑变性的个体施用有效量的抗ANG2抗体。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的如下文描述的至少一种额外治疗剂。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于抑制个体中血管生成的方法。在一个实施方案中，该方法包括向该个体施用有效量的抗ANG2抗体以抑制血管生成。在一个实施方案中，“个体”是人。
在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何抗ANG2抗体的药物制剂，例如，用于前述任一个治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文中提供的任何抗ANG2抗体和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗ANG2抗体和至少一种额外治疗剂(例如，如下文描述)。
本发明的抗体可以在疗法中单独或与其他药物组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种额外治疗剂共施用。在某些实施方案中，额外治疗剂是抗IL-1β抗体或抗PDGF-B抗体。
上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的一种治疗剂或多种治疗剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，抗ANG2抗体的施用和额外治疗剂的施用彼此相隔约一个月内，或约一周、两周或三周内，或约一、二、三、四、五或六日内进行。
本发明的抗体(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、静脉内、玻璃体内、肺内和鼻内以及(如果需要局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、推注施用(bolusadministration)和脉冲输注。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该抗体不是必需与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的抗体的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程，抗体是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对抗体的反应以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.5mg/kg-30mg/kg)抗体可以是施用至患者的起始候选剂量，无论例如是否通过一次或多次独立施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于疾病，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。抗体的一个示例性剂量将处于约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或50mg/kg(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周施用(例如，从而患者接受约2剂至约20剂或例如约6剂抗体)。可以施用较高的初始施用剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物替代抗ANG2抗体或除抗ANG2抗体之外还使用本发明的免疫缀合物来实施。
III.制造物
在本发明的另一个方面，提供一种制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造品包括容器和或在该容器上或与之相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的抗体。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的疾病。另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中，制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定疾病的包装插页。备选地或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，替代抗ANG2抗体或除抗ANG2抗体之外，前述任一者制造品可以包含本发明的免疫缀合物。
IV.具体实施方案
1.与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
2.与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
3.根据实施方案1至2中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
4.根据实施方案1至2中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
5.根据实施方案1至4中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含了(a)与SEQ IDNO:19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列，(b)与SEQ ID NO:06或SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。
6.与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H3。
7.与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H3。
8.根据实施方案6至7中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ IDNO:43的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L3。
9.根据实施方案6至8中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含了(a)与SEQ IDNO:37的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列，(b)与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列。
10.与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体
i)包含与SEQ ID NO:19具有多于70％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ IDNO:6具有多于70％序列同一性的轻链可变结构域，
ii)在重链可变结构域中在位置28处具有氨基酸残基天冬酰胺(N)，在位置30处具有氨基酸残基丙氨酸(A)，在位置100b处具有氨基酸残基脯氨酸(P)和在位置100j处具有氨基酸残基丙氨酸(A)和在轻链可变结构域中在位置51处具有氨基酸残基苏氨酸(T)(根据Kabat编号)，并且
iii)与包含了与SEQ ID NO:19具有序列同一性的重链可变结构域和与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:33具有序列同一性的轻链可变结构域的抗体相比，使用Tie2磷酸化ELISA测定，所述抗体在使用稳定表达人Tie2的HEK293细胞的基于细胞的测定法中对抑制ANG2与其受体Tie2结合具有较低的EC50值。
11.根据实施方案10的抗体，其中序列同一性大于80％、优选地大于90％、最优选地95％或更大。
12.根据实施方案1至11中任一个实施方案的抗体，其中抗体属于人IgG1 亚类或人IgG4亚类。
13.根据实施方案1至12中任一个实施方案的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
14.抗体，包含SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:33的VL序列。
15.抗体，包含SEQ ID NO:19的VH序列和SEQ ID NO:24的VL序列。
16.抗体，包含SEQ ID NO:37的VH序列和SEQ ID NO:42的VL序列。
17.根据实施方案1至16中任一个实施方案的抗体，其中抗体是双特异性抗体。
18.根据实施方案17的抗体，其中双特异性抗体是CrossMab。
19.根据实施方案1至18中任一个实施方案的抗体，其中抗体通过抑制人ANG2与人Tie2受体结合，阻断人ANG2的生物学活性。
20.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的双价双特异性抗体
a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
21.根据实施方案20的抗体，其中抗体包含
i)根据a)的第一轻链的恒定结构域CL中位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立置换(根据Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立置换)，并且其中根据a)的第一重链的恒定结构域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立置换(根据Kabat EU索引编号)，
或
ii)根据b)的第二轻链的恒定结构域CL中位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立置换(根据Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立置换)，并且其中根据b)的第二重链的恒定结构域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立置换(根据Kabat EU索引编号)。
22.根据实施方案20至21中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含在第二重链的恒定结构域CL中位置124和123处的氨基酸被K置换(根据Kabat EU索引编号)。
23.根据实施方案20至22中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含在第二轻链的恒定结构域CH1中位置147和213处的氨基酸被E置换(根据Kabat的EU索引编号)。
24.根据实施方案20至23中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含在第一轻链的恒定结构域CL中位置124和123处的氨基酸被K置换，并且在第一重链的恒定结构域CH1中位置147和213处的氨基酸被E置换(根据Kabat EU索引编号)。
25.根据实施方案20至24中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含在第二重链的恒定结构域CL中位置124和123处的氨基酸被K置换，并且其中第二轻链的恒定结构域CH1中位置147和213处的氨基酸被E置换，并且第一轻链的可变结构域VL中位置38处的氨基酸被K置换，第一重链的可变结构域VH中位置39处的氨基酸被E置换，第二重链的可变结构域VL中位置38处的氨基酸被K置换，第二轻链的可变结构域VH中位置39处的氨基酸被E置换(根据Kabat EU索引编号)。
26.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的双价双特异性抗体
a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换，并且其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
27.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的双价双特异性抗体
a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
28.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的多特异性抗体
a)与第一抗原特异性结合并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，和
b)与一至四种其他抗原特异性结合(即，与第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，优选地与一种其他抗原，即第二抗原，特异性结合)的一个、两个、三个或四个单链Fab片段，
其中根据b)的所述单链Fab片段与根据a)的所述全长抗体借助肽接头在所述全长抗体的重链或轻链的C末端或N末端融合，
其中第一抗原或其他抗原之一是人ANG2。
29.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的三价双特异性抗体
a)与第一抗原特异性结合并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，
b)由以下组成的第一多肽
ba)抗体重链可变结构域(VH)，
或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述第一多肽以其VH结构域的N末端借助肽接头与所述全长抗体的两条重链之一的C末端融合，
c)由以下组成的第二多肽
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，
或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，
其中所述第二多肽以VL结构域的N末端借助肽接头与所述全长抗体的两条重链中另一条重链的C末端融合，
并且
其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)共同形成与第二抗原特异性结合的抗原结合位点，
并且
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
30.根据实施方案29的抗体，其中根据b)的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和根据c)的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过以下位置之间引入二硫键连接并借助链间二硫键稳定：
i)重链可变结构域位置44至轻链可变结构域位置100，或
ii)重链可变结构域位置105至轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101至轻链可变结构域位置100(总是根据Kabat EU索引编号)。
31.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的三特异性或四特异性抗体
a)与第一抗原特异性结合的全长抗体的第一轻链和第一重链，和
b)与第二抗原特异性结合的全长抗体的第二(修饰的)轻链和第二(修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH相互替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1相互替换，并且
c)其中与一种或两种其他抗原(即与第三和/或第四抗原)特异性结合的一至四个抗原结合肽借助肽接头与a)和/或b)的轻链或重链的C末端或N末端融合，
其中第一抗原或第二抗原或其他抗原之一是人ANG2。
32.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的双特异性四价抗体
a)与第一抗原特异性结合(并包含两个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链，
b)与第二抗原特异性结合的抗体的两个额外的Fab片段，其中所述额外的Fab片段均借助肽接头与a)的重链的C末端或N末端融合，
并且
其中在Fab片段中进行以下修饰
i)在a)的两个Fab片段中或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，和/或恒定结构域CL和CH1相互替换，
或
ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，并且恒定结构域CL和CH1相互替换，
并且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，或恒定结构域CL和CH1相互替换，
或
iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，或恒定结构域CL和CH1相互替换，
并且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，并且恒定结构域CL和CH1相互替换，
或
iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，并且在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1相互替换，
或
v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1相互替换，并且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH相互替换，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
33.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的双特异性四价抗体
a)与第一抗原特异性结合并且包含第一VH-CH1结构域对的第一抗体的(修饰)重链，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N末端借助肽接头与所述重链的C末端融合，
b)a)的所述第一抗体的两条轻链，
a)与第二抗原特异性结合并且包含第一VH-CL结构域对的第二抗体的(修饰)重链，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N末端借助肽接头与所述重链的C末端融合，并且
d)c)的所述第二抗体的两条(修饰)轻链，各自包含CL-CH1结构域对，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
34.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的双特异性抗体
a)与第一抗原特异性结合的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)与第二抗原特异性结合的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N末端借助肽接头与轻链的C末端连接。
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
35.根据实施方案1至19中任一个实施方案的抗体，其中抗体是包含以下的双特异性抗体
a)与第一抗原特异性结合并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体，和
b)与第二抗原特异性结合的包含VH2结构域和VL2结构域的Fv片段，其中两个结构域通过二硫键彼此连接，
其中仅VH2结构域或VL2结构域借助肽接头与特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合，
其中第一抗原或第二抗原是人ANG2。
36.根据实施方案1至35中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽，并且
其中
i)第一Fc区多肽选自
-人IgG1 Fc区多肽，
-人IgG2 Fc区多肽，
-人IgG3 Fc区多肽，
-人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变P329G的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变P329G的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变K392D的人IgG1、IgG2或IgG4，和
-具有突变N392D的人IgG3，
并且
ii)第二Fc区多肽选自
-人IgG1 Fc区多肽，
-人IgG2 Fc区多肽，
-人IgG3 Fc区多肽，
-人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变S354C、T366W的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变Y349C、T366W的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366W的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变P329G的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366W的人IgG1 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S354C、T366W的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变Y349C、T366W的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366W的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变P329G的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366W的人IgG4 Fc区多肽，
-具有突变D399K、D356K和/或E357K的人IgG1，和
-具有突变D399K、E356K和/或E357K的人IgG2、IgG3或IgG4。
37.根据实施方案1至35中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽，并且
其中
i)第一Fc区多肽是人IgG1 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是人IgG1 Fc区多肽，或
ii)第一Fc区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc区多肽，或
iii)第一Fc区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1 Fc区多肽，或
iv)第一Fc区多肽是具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1Fc区多肽并且第二Fc区多肽是具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc区多肽，或
v)第一Fc区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc区多肽，或
vi)第一Fc区多肽是人IgG4 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是人IgG4 Fc区多肽，或
vii)第一Fc区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4 Fc区多肽，或
viii)第一Fc区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4 Fc区多肽，或
ix)第一Fc区多肽是具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc区多肽，或
x)第一Fc区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4 Fc区多肽并且第二Fc区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc区多肽。
38.根据实施方案1至37中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽，并且
其中抗体在第一Fc区多肽中和在第二Fc区多肽中包含以下突变组合
i)I253A、H310A和H435A，或
ii)H310A、H433A和Y436A，或
iii)L251D、L314D和L432D，或
iv)i)至iii)的组合。
39.根据实施方案1至37中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽，并且其中
a)第一和第二Fc区多肽属于人IgG1或人IgG4亚类(衍生自人来源)并且在第一Fc区多肽中包含选自以下群组的一个或两个突变：i)群组I253A、H310A和H435A，或ii)群组H310A、H433A和Y436A，或iii)群组L251D、L314D和L432D(根据Kabat EU索引编号体系编号)及在第二Fc区多肽中包含一个或两个选自突变L251D、I253A、H310A、L314D、L432D、H433A、H435A和Y436A中的突变(根据Kabat EU索引编号体系编号)，从而当一并考虑时，第一和第二Fc区多肽中的全部突变导致突变i)I253A、H310A和H435A，或ii)H310A、H433A和Y436A，或iii)L251D、L314D和L432D均包含于变异(人)IgG类Fc区中，
或
b)第一和第二Fc区多肽均属于人IgG1或人IgG4亚类(即衍生自人来源)并且均在Fc区中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或其组合(根据Kabat EU索引编号体系编号)，因而全部突变均在第一或第二Fc区多肽中，或一个或两个突变在第一Fc区多肽中并且一个或两个突变在第二Fc区多肽中，从而当一并考虑时第一和第二Fc区多肽中的全部突变导致突变i)I253A、H310A和H435A、或ii)H310A、H433A和Y436A、或iii)L251D、L314D和L432D均包含于该Fc区中。
或
c)第一和第二Fc区多肽均属于人IgG1或人IgG4亚类(即衍生自人来源)并且在第一Fc区多肽中以及在第二Fc区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D(根据Kabat EU索引编号体系编号)，或包含在第一Fc区多肽中的突变组合I253A/H310A/H435A和在第二Fc区多肽中的突变组合H310A/H433A/Y436A(根据Kabat EU索引编号体系编号)。
40.根据实施方案1至37中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽，并且其中
a)第一变体Fc区多肽衍生自第一亲本IgG类Fc区多肽并且第二变体Fc区多肽衍生自第二亲本IgG类Fc区多肽，因而第一亲本IgG类Fc区多肽与第二亲本IgG类Fc区多肽相同或不同，并且
b)第一变体Fc区多肽在除其中第一亲本IgG类Fc区多肽与第二亲本IgG类Fc区多肽不同的那些氨基酸残基之外的一个或多个氨基酸残基方面与第二变体Fc区多肽不同，并且
c)包含第一变体Fc区多肽和第二变体Fc区多肽的IgG类Fc区具有与包含a)的第一亲本IgG类Fc区多肽和a)的第二亲本IgG类Fc区多肽的IgG类Fc区不同的人Fc受体亲和力。
其中第一Fc区多肽或第二Fc区多肽或两种Fc区多肽彼此独立地包含一个以下突变或突变组合：
-T307H，或
-Q311H，或
-E430H，或
-N434H，或
-T307H和Q311H，或
-T307H和E430H，或
-T307H和N434A，或
-T307H和N434H，或
-T307Q和Q311H，或
-T307Q和E430H，或
-T307Q和N434H，或
-T307H和Q311H和E430H和N434A，或
-T307H和Q311H和E430H和N434H，或
-T307H和Q311H和E430H和N434Y，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434A，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434H，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434Y，或
-T307Q和V308P和N434Y和Y436H，或
-T307H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和M252Y和S254T和T256E，或
-Q311H和M252Y和S254T和T256E，或
-E430H和M252Y和S254T和T256E，或
-N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和Q311H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和E430H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和Q311H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和E430H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和Q311H和E430H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和Q311H和E430H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和Q311H和E430H和N434Y和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434Y和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和V308P和N434Y和Y436H和M252Y和S254T和T256E。
41.根据实施方案1至37中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽，
并且其中第一Fc区多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(扣链)并且第二Fc区多肽包含突变S354C和T366W(结链)，
并且其中第一Fc区多肽(扣链)包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
并且其中第一Fc区多肽和第二Fc区多肽由一个或多个二硫键连接，
并且其中第一多肽的CH3结构域和第二多肽的CH3结构域均与蛋白A结合或均与之不结合
(根据Kabat EU索引编号)。
42.根据实施方案41的抗体，其中抗体包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)T250Q，和/或
iv)T256E或T256A。
43.根据实施方案41至42中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)任选地a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G。
44.根据实施方案41至43中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含突变
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G。
v)任选地a)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或b)Q311H，和/或c)M252Y，和/或d)S254T。
45.根据实施方案41至44中任一个实施方案的抗体，其中抗体包含突变
i)T250Q，和/或
ii)M252Y，和/或
iii)S254T，和/或
iv)T256E或T256A，和/或
v)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或
vi)Q311H。
46.分离的抗体或分离的抗体Fab片段，包含
a)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
b)具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
c)具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
d)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
e)具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
f)具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
g)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
h)具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
i)具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
j)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链，或
k)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链，或
l)具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
m)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
n)具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
o)具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
p)具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
q)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
r)具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
s)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
t)具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
u)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
v)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
w)具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
x)具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
y)具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
z)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
aa)具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链，或
ab)具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
ac)具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
ad)具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链，或
ae)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的轻链，或
af)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链，或
ag)具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第二重链、具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第二轻链，或
ah)具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:81 的氨基酸序列的第二重链、具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第二轻链，或
ai)具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的第二重链、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的第二轻链，或
aj)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的第二重链、具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第一轻链和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的第二轻链，或
47.根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体，用作药物。
48.根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体，用于治疗眼血管疾病。
49.用途根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体，用于治疗眼病、尤其眼血管疾病。
50.根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体，用于治疗眼病。
51.根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体，用于治疗眼病、尤其眼血管疾病。
52.治疗患有眼血管疾病的个体的方法，包括向该个体施用有效量的根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体。
53.药物制剂，包含根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体。
54.药物制剂，包含用于治疗眼血管疾病的根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体。
55.根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体的用途，用于制造治疗眼血管疾病的药物。
56.通过以下方式治疗患有眼血管疾病的患者的方法：施用根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体至需要这种治疗的患者。
57.根据实施方案53至54中任一个实施方案的药物制剂，其中通过玻璃体内施加法施用抗体。
58.根据实施方案56至57中任一个实施方案的施用，其中施用是玻璃体内施加。
59.核酸，其编码根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体。
60.细胞，其包含一种或多种编码根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体的核酸。
61.用于产生根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体的方法，其中所述方法中包括以下步骤：
a)任选地用一种或多种编码根据实施方案1至46中任一个实施方案的抗体的核酸转染哺乳动物细胞，
b)培育细胞以表达抗体，和
c)从细胞或培养基回收抗体，并且由此产生该抗体。
V.实施例
以下是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
材料和方法
克隆：
使用QuikChange II XL位点定向诱变试剂盒(Agilent Technologies)引入了点突变。挑取一些单菌落并转移至4ml LB-Amp培养基中并在37℃培养16-18小时。通过离心收获2ml克隆，随后根据生产商说明书，用高纯度质粒分离试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国)制备质粒。通过测序确认后，将质粒在大肠杆菌细胞中再转化(AgilentTechnologies)。将单菌落转移至2ml LB-Amp培养基中并在37℃培养6-8小时。此后，200μl这种培养物用来接种摇瓶中的150ml LB-Amp培养基。将培养物在37℃温育，300转/分钟过夜并且随后通过离心收获细胞。用HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)根据生产商说明书进行质粒制备。
通过分别改变CrossFab和CrossMab的骨架质粒中的VH区和VL区，使用突变的CrossFab作为克隆模板限制性消化。用相同成对的限制性酶消化模板和骨架质粒后，将混合物添加至1％琼脂糖凝胶以分离提供者-DNA(VH-或VL-区域)和接受者-DNA(质粒骨架)。用高纯PCR产物纯化试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国)纯化琼脂糖小片。此后，通过rAPid碱性磷酸酶(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国)，使接受者-DNA去磷酸化，并且随后使用Rapid DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国)连接接受者-DNA和提供者-DNA。将连接的DNA转化入大肠杆菌细胞(Agilent Technologies)。
瞬时表达
在125ml摇瓶中解冻后，将HEK293F细胞(Invitrogen)通过稀释传代至少4次(体积30ml)(在37℃，7％CO2，85％湿度，135转/分钟温育/振摇)。
将细胞扩充至250ml体积中3x105个细胞/ml。三天后，将细胞分瓶并以7*105个细胞/ml的密度按250ml体积在1升摇瓶中新鲜接种。24小时后以约1.4－2.0x106个细胞/ml的细胞密度进行转染。
在转染前，将250μg质粒-DNA(122μg轻链质粒和128μg重链质粒)用终体积10ml的预加热的(水浴槽；37℃)Opti-MEM培养基(Gibco)稀释。将溶液轻轻混合并在室温温育不长于5分钟。此后，添加333.3μl无293转染试剂至DNA-OptiMEM-溶液。将溶液轻轻地混合并在室温温育15-20分钟。将全部体积的混合物添加至含250ml HEK细胞培养体积的1L摇瓶。将摇瓶在37℃，7％CO2，85％湿度，135转/分钟温育/振摇6或7天。通过2,000转/分钟，4℃，10分钟的第一离心步骤，收获上清液。将上清液转移至新的离心瓶，以进行4,000转/分钟，4℃，20分钟的第二离心步骤。此后，通过0.22μm瓶顶滤器过滤无细胞上清液并将其储存在冰箱(-20℃)中。
纯化
使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare，瑞典)(而使用KappaSelect-琼脂糖(针对不含Fc区的结合结构域)(GE Healthcare，瑞典)，纯化具有AAA突变的Fab、CrossFab和Ang2VEGF CrossMAb)，通过亲和色谱，随后使用丁基-琼脂糖凝胶(GEHealthcare，瑞典)的疏水相互作用色谱和Superdex200大小排阻(GE Healthcare，瑞典)色谱，从细胞培养上清液纯化抗体和CrossMAbCH1-CL。
简而言之，在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂上从无菌过滤的细胞培养上清液捕获抗体和CrossMAb，用平衡缓冲液洗涤并且用25mM pH 3.0柠檬酸钠洗脱。在用25mM Tris，50mM NaCl，pH 7.2平衡的KappaSelect树脂上捕获Fab，用平衡缓冲液洗涤并且用25mM pH 2.9柠檬酸钠洗脱。将洗脱抗体或含有的Fab级分汇集并用2M Tris，pH 9.0中和。通过添加1.6M硫酸铵溶液至终浓度0.8M硫酸铵，将抗体/Fab汇集物准备好用于疏水相互作用色谱。使用乙酸调节pH至pH 5.0。用35mM乙酸钠，0.8M硫酸铵，pH 5.0平衡丁基-琼脂糖凝胶树脂后，将抗体施加至树脂，用平衡缓冲液洗涤并且利用0至35mM乙酸钠pH 5.0的线性梯度洗脱。将含有双特异性抗体/抗体或Fab的级分汇集并且使用以20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex20026/60GL(GE Healthcare，瑞典)柱，通过大小排阻色谱进一步纯化。将分别含有抗体或Fab的级分汇集，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim BiotechS.A.，法国)浓缩至要求的浓度并贮存在-80℃。
CE-SDS分析
每种纯化步骤后使用微流体Labchip技术(Caliper Life Science，美国)通过CE-SDS分析纯度和抗体完整性。因此，根据制造商的说明书，使用HT蛋白质表达试剂盒，制备5μl分析物溶液，并使用HT Protein Express Chip，在LabChip GXII系统上分析。使用LabChip GX软件分析数据。
实施例1
与血管生成素2(ANG2)结合的交叉抗体(Crossed antibodies；CrossMab)和交叉抗体Fab片段(crossed antibody Fab fragments；CrossFab)。
通过如方法部分中所述的克隆过程，通过分子生物学技术并且如上文所述在HEK293细胞中瞬时表达产生交叉抗体(CrossMab)或交叉抗原结合片段(CrossFab)。
表1中给出所生成的在CDR中具有特定点突变的抗体和Fab的总体方案。使用表达质粒表达交叉抗体和交叉Fab，所述表达质粒含有编码如表1中所示的氨基酸序列的核酸。
表1：如本文报告的抗ANG2CrossFab的氨基酸序列。.
实施例2
在ANG2结合方面具有CL-CH1结构域交换(CrossMabCH1/CL)的与血管生成素-2(ANG2)和血管内皮生长因子(VEGF)结合的交叉双价双特异性抗体(CrossMab)
通过如上文所述的克隆过程，通过分子生物学技术并且如上文所述在HEK293细胞中瞬时表达产生ANG2 Fab臂中CH1-CL交叉互换的ANG2-VEGF CrossMabsCH1-CL。
表2中给出所生成的在CDR中具有特定点突变的ANG2-VEGF CrossMabsCH1-CL的总体方案。使用表达质粒表达ANG2-VEGF CrossMabsCH1-CL，所述表达质粒含有编码如表2中所示的氨基酸序列的核酸。
表2：如本文报告的抗ANG2/VEGF双特异性双价CrossMabsCH1-CL的氨基酸序列。
对于全部构建体，使用结入扣异二聚化技术，在第一CH3结构域中存在典型的结(T366W)突变和在第二CH3结构域中存在相应的扣突变(T366S、L368A和Y407V)(以及引入的两个额外半胱氨酸残基S354C/Y349C)(含于上述的各自相应重链(HC)序列中)。
实施例3
在HEK细胞中转染和瞬时表达结合ANG2的CrossFab、抗体和Ang2-VEGFCrossMabCH1-CL
采用无293转染试剂(Novagen)时悬浮适应型HEK293F(FreeStyle 293-F细胞；Invitrogen)细胞中抗体的瞬时表达。
在125ml摇瓶中解冻后，将细胞通过稀释传代至少4次(体积30ml)(在37℃，7％CO2，85％湿度，135转/分钟温育/振摇)。
将细胞扩充至250ml体积中3x105个细胞/ml。三天后，将细胞分瓶并以7*105个细胞/ml的密度按250ml体积在1升摇瓶中新鲜接种。24小时后，转染将以约1.4－2.0x106个细胞/ml的细胞密度进行。
在转染前，将250μg质粒-DNA(122μg轻链和128μg重链)用终体积10ml的预加热的(水浴槽；37℃)Opti-MEM培养基(Gibco)稀释。轻轻混合溶液并在室温温育不长于5分钟。此后，添加333.3μl无293转染试剂至DNA-OptiMEM溶液。轻轻混合并在室温温育15-20分钟。将全部体积的混合物添加至含250ml HEK细胞培养体积的1L摇瓶。
在37℃，7％CO2，85％湿度，135转/分钟温育/振摇6或7天。
通过2,000转/分钟，4℃，10分钟的第一离心步骤，收获上清液。将上清液转移至新的离心瓶，以进行4,000转/分钟，4℃，20分钟的第二次离心。此后，通过0.22μm瓶顶滤器过滤无细胞上清液并将其储存在冰箱(-20℃)中。
实施例4
从HEK上清液纯化Fab
将含有抗体的细胞培养上清液过滤并通过两个色谱步骤纯化。使用Kappa Select(GE Healthcare)通过亲和色谱捕获具有AAA突变的CrossFab和CrossMAb，并通过额外的HIC和SEC色谱步骤精制。详见上文的材料和方法。
实施例5
从HEK上清液纯化CrossMabCH1-CL
将培养上清液过滤并通过三个色谱步骤纯化。使用HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)通过亲和色谱捕获抗体，并通过HIC和SEC色谱步骤精制。将含有抗体的溶液用配备Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA)的Ultrafree-CL离心滤器装置浓缩并贮存在-80℃。
实施例6
CrossFab制备物和CrossMAbCH1-CL制备物的分析
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定制备物的蛋白质浓度。
使用LabChip GX II(PerkinElmer)以及Protein Express Chip和HT ProteinExpress Reagents试剂盒，通过CE-SDS分析抗体的纯度和完整性。
使用TSK-GEL G3000SWXL，使用2xPBS，pH 7.4作为运行缓冲液，通过高效SEC，或使用200mM K2HPO4/KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0作为运行缓冲液，使用BioSuite HighResolution SEC,5μm分析性大小排阻分析柱(Waters GmbH)，通过高效SEC测定抗体制备物的聚集物含量。
实施例7
从抗体制备Fab片段及分析
将12mg抗体(20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中1mg/ml)与240μl L-半胱氨酸溶液(Merck Millipore；20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中250mM)和327μl木瓜蛋白酶(Roche Life Science；0.001U/mg抗体)在37℃温育120分钟。在切割后，使用经PBS(1mMKH2PO4，10mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl)pH7.4平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)的亲和色谱法用于移除完整的IgG和Fc片段。随后，使用Superdex200TM(GEHealthcare)上的大小排阻色谱作为第二纯化步骤，进一步纯化MabSelectSuRe色谱的流通物。在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行大小排阻层析。将含有Fab片段的溶液用配备Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA)的Ultrafree-CL离心滤器装置浓缩并贮存在-80℃。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定Fab片段的蛋白质浓度。
在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下，通过SDS-PAGE(NuPAGE 4-12％Bis-Tris Gel,Invitrogen)并用Simply Blue Safe Stain(Invitrogen)染色，分析Fab片段的纯度和完整性。
使用200mM K2HPO4/KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0作为运行缓冲液，使用BioSuiteHigh Resolution SEC,5μm分析性大小排阻分析柱(Waters GmbH)，通过高效SEC测定Fab制备物的聚集物含量。
实施例8
成熟的Cross-Fabs的ANG2结合动力学和交叉反应性
使用BIACORE T200仪(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振法研究成熟的Cross-Fab与人ANG2-RBD-Fc区融合物的结合。通过使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒在pH 5.0，在Series S CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联约4000RU抗人抗体(10μg/ml抗人IgG(Fc)抗体；订购代码BR-1008-39；GE Healthcare)。在固定操作期间，使用HBS-N(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于以下动力学表征，样品和运行缓冲液是HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20；GE Healthcare)。在动力学表征之前，将流动小室设定至25℃-并且将样品块设定至12℃-并用运行缓冲液填装2次。
通过以流速5μl/分钟注射1μg/ml溶液30秒，捕获人或食蟹猴ANG2-RBD-Fc区融合物。通过在溶液中以流速90μl/分钟注射多种浓度(始于300nM，以1:3连续稀释)的Cross-Fab持续90秒，测量结合作用。监测解离期直至600秒并通过样品溶液转换成运行缓冲液启动。通过用3M MgCl2溶液以流速5μl/分钟洗涤60秒，使全部表面再生。通过扣减从抗人IgG抗体(Fc)表面获得的响应值，修正本体折射率差异。还扣减空白注射(＝双参考)。为了计算KD和其他动力学参数，使用朗格缪尔1:1模型。
实施例9
生物学活性
本方法测定抗体抑制ANG2与其受体Tie2结合的能力。为了在细胞表面上表达Tie2受体酪氨酸激酶，HEK293细胞系(人胚肾细胞系)用人Tie2的表达载体稳定转染，产生细胞系HEK293_Tie2。
将细胞用结合至Tie2受体并诱导受体自我磷酸化的ANG2刺激。可以通过添加如本文报告的抗ANG2抗体抑制与Tie2的结合。通过ELISA分析磷酸化的程度。OD值与磷酸化Tie2的数量相关并且对抗体浓度作图。测定EC50值并且将其相对于相同平板上的参比标准品报告为相对生物学活性(RBA)。
将多孔板用针对人Tie2受体的抗体包被(100μl 10μg/ml；R&D Systems，目录号MAB3132；96孔Maxisorb immuno平板，在室温温育过夜；洗涤包被的平板3次，体积250μl；此后在室温与200μl封闭液温育1－2小时)。
单独地，将HEK293_Tie2细胞(40μl；5x106个细胞/ml；DMEM/F12)添加至所讨论抗体的系列稀释物与ANG2(R&D Systems，目录号623-CF)的预温育混合物(80μl)。在10分钟后，将细胞裂解(添加60μl裂解缓冲液；温育15分钟)并将细胞裂解物转移至包被的平板以进行ELISA。
裂解物的Tie2受体与抗Tie2捕获抗体(100μl裂解物；在室温温育90分钟)结合。通过与生物素缀合的抗磷酸酪氨酸抗体(100μl；0.3μg/ml抗磷酸酪氨酸抗体，克隆生物素缀合物，Upstate，目录号16-103；在室温温育60分钟)，检测Tie2受体上的磷酸化酪氨酸。由链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(100μl；100mU/ml；Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国，目录号11089153001；在室温温育30分钟)结合生物素残基。添加过氧化物酶底物TMB(100μl；Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国，目录号11835033001)并且5-10分钟后在450nm测量光密度。
实施例10
化学降解试验
将样品分成三个等分试样并分别重新缓冲入20mM His/His*HCl，140mM NaCl，pH6.0或重新缓冲入PBS，并贮存在40℃(His/NaCl)或37℃(PBS)。对照样品贮存在-80℃。
在温育结束后，分析样品的相对有效浓度(BIAcore)、聚集(SEC)和片段化(毛细管电泳法或SDS-PAGE)并与未处理的对照比较。
实施例11
热稳定性
将样品以1mg/mL的浓度配制在20mM组氨酸/盐酸组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中，通过离心经0.4μm滤板转移入384孔光学平板并用石蜡油覆盖。将样品以0.05℃/分钟的速率从25℃加热至80℃的同时，通过动态光散射法在DynaPro平板读数仪(Wyatt)上重复测量流体动力学半径。
备选地，将样品转移入10μL微量比色皿阵列并且用Optim1000仪(Avacta Inc.)记录在266nm激光激发时静态光散射数据以及荧光数据，同时将它们以0.1℃/分钟的速率从25℃加热至90℃。
聚集起始温度定义为流体动力学半径(DLS)或散射光强度(Optim1000)开始增加的温度。
备选地，将样品转移至9μL多比色皿阵列中。在Optim1000仪(Avacta AnalyticalInc.)中，将多比色皿阵列以恒定速率0.1℃/分钟从35℃加热至90℃。仪器以大约每0.5℃的数据点连续记录266nm激光的散射光强度。将光散射强度对温度作图。聚集起始温度(T_agg)定义为散射光强度开始增加的温度。
熔化温度定义为荧光强度对波长图中的拐点。
虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述了前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入。

Claims (16)

1.与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体包含了(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
2.根据权利要求1所述的抗体，包含了(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-L3。
3.根据权利要求1所述的抗体，包含了(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-L3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中抗体包含了具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变结构域。
5.与人ANG2特异性结合的抗体，其中抗体
i)包含与SEQ ID NO:19具有多于70％序列同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:6具有多于70％序列同一性的轻链可变结构域，
ii)在重链可变结构域中在位置28处具有氨基酸残基天冬酰胺(N)，在位置30处具有氨基酸残基丙氨酸(A)，在位置100b处具有氨基酸残基脯氨酸(P)和在位置100j处具有氨基酸残基丙氨酸(A)和在轻链可变结构域中在位置51处具有氨基酸残基苏氨酸(T)(根据Kabat编号)，并且
iii)与包含了具有SEQ ID NO:19的序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:6或SEQID NO:33的序列的轻链可变结构域的抗体相比，使用Tie2磷酸化ELISA测定，所述抗体在使用稳定表达人Tie2的HEK293细胞的基于细胞的测定法中对抑制ANG2与其受体Tie2结合具有较低的EC50值。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中抗体是双特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中双特异性抗体是CrossMab。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中抗体属于人IgG1亚类或人IgG4亚类。
9.根据权利要求1至4和6至8中任一项所述的抗体，其中抗体通过抑制人ANG2与人Tie2受体结合，阻断人ANG2的生物学活性。
10.药物制剂，其包含权利要求1至9中任一项所述的抗体和任选地可药用载体。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，其还包含选自抗IL-1β抗体或抗PDGF-B抗体的额外治疗剂。
12.根据权利要求中1至9中任一项所述的抗体，其用作药物。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体的用途，用于制造药物。
14.根据权利要求12或13的用途，其中药物用于治疗眼血管疾病、优选地用于治疗黄斑变性。
15.根据权利要求12或13的用途，其中药物用于治疗癌症、优选地用于治疗新血管生成性癌症。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的用途，其中药物用于抑制ANG2和Tie2受体之间的相互作用。
CN201580060787.3A 2014-11-10 2015-11-06 抗ang2 抗体及使用方法 Pending CN107001456A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14192524 2014-11-10
EP14192524.8 2014-11-10
PCT/EP2015/075876 WO2016075035A1 (en) 2014-11-10 2015-11-06 Anti-ang2 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107001456A true CN107001456A (zh) 2017-08-01

Family

ID=51868115

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580060787.3A Pending CN107001456A (zh) 2014-11-10 2015-11-06 抗ang2 抗体及使用方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US10538585B2 (zh)
EP (1) EP3218398A1 (zh)
JP (2) JP2017534644A (zh)
KR (1) KR20170082594A (zh)
CN (1) CN107001456A (zh)
AR (1) AR102595A1 (zh)
AU (1) AU2015345321A1 (zh)
BR (1) BR112017009790A2 (zh)
CA (1) CA2963606A1 (zh)
IL (1) IL251477A0 (zh)
MX (1) MX2017005642A (zh)
SG (1) SG11201703458UA (zh)
TW (1) TW201630935A (zh)
WO (1) WO2016075035A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111491951A (zh) * 2017-12-22 2020-08-04 豪夫迈·罗氏有限公司 通过疏水相互作用色谱法耗尽轻链错配的抗体变体
CN115772544A (zh) * 2021-09-06 2023-03-10 合肥星眸生物科技有限公司 抗vegf-a和ang-2的aav载体
CN116925234A (zh) * 2022-04-02 2023-10-24 合肥星眸生物科技有限公司 一种编码抗vegf-a和ang-2双特异性抗体的aav载体
WO2024066377A1 (zh) * 2022-09-28 2024-04-04 科兴生物制药股份有限公司 Vegf和ang-2双特异性抗体及其应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
CN107148429B (zh) 2014-11-10 2021-12-03 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-pdgf-b抗体和使用方法
SG11201702550WA (en) 2014-11-10 2017-04-27 Hoffmann La Roche ANTI-IL-1beta ANTIBODIES AND METHODS OF USE
BR112017009764A2 (pt) 2014-11-10 2018-02-20 Hoffmann La Roche anticorpos biespecíficos e métodos de uso em oftalmologia
CN107001482B (zh) 2014-12-03 2021-06-15 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
KR102497171B1 (ko) 2018-02-20 2023-02-08 기초과학연구원 항-안지오포이에틴-2(Ang2) 항체 및 그의 용도
WO2019164219A1 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 Institute For Basic Science Anti-angiopoietin-2 antibodies and uses thereof
AU2021294703A1 (en) 2020-06-22 2023-02-23 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-ANG-2 antibody and use thereof
CN116209765A (zh) * 2020-08-19 2023-06-02 药物抗体公司 经修饰抗体及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101374522A (zh) * 2006-01-27 2009-02-25 安姆根有限公司 Ang2和vegf抑制剂的组合
WO2010040508A1 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies
CN102046657A (zh) * 2008-02-20 2011-05-04 安姆根有限公司 针对血管生成素-1和血管生成素-2的抗体及其用途
CN102257008A (zh) * 2008-12-16 2011-11-23 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对人血管生成素2的抗体
WO2014009465A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2014177460A1 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4935343A (en) 1986-08-08 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Monoclonal antibodies for interleukin-1β
GB0020685D0 (en) 2000-08-22 2000-10-11 Novartis Ag Organic compounds
US20050070692A1 (en) 2002-02-28 2005-03-31 Beals John Michael Anti-interleukin-1 beta analogs
ES2263984T3 (es) * 2002-06-28 2006-12-16 Domantis Limited Ligandos doble-especificos con una vida media serica aumentada.
EP1590369B1 (en) 2003-01-24 2016-03-16 Applied Molecular Evolution, Inc. Human il-1 beta antagonists
US20050282233A1 (en) 2004-03-05 2005-12-22 Ludwig Institute For Cancer Research Multivalent antibody materials and methods for VEGF/PDGF family of growth factors
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP5575636B2 (ja) 2007-05-07 2014-08-20 メディミューン，エルエルシー 抗ｉｃｏｓ抗体ならびに、腫瘍、移植および自己免疫疾患の治療におけるその使用
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PT2293816E (pt) 2008-06-06 2013-02-13 Xoma Technology Ltd Métodos para o tratamento da artrite reumatoide
RU2368359C1 (ru) 2008-07-22 2009-09-27 Государственное учреждение "УФИМСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ" Академии наук Республики Башкортостан (УфНИИ ГБ АН РБ) Способ лечения возрастной макулярной дегенерации
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
WO2012021773A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Genentech, Inc. Antibodies to il-1beta and il-18, for treatment of disease
WO2012034039A2 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Apexigen, Inc. Anti-il-1 beta antibodies and methods of use
WO2012125850A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Amgen Inc. Fc variants
AU2012275346B2 (en) * 2011-06-29 2016-03-17 Amgen Inc. Predictive biomarker of survival in the treatment of renal cell carcinoma
CN104508129A (zh) 2012-06-28 2015-04-08 分子伴侣公司 设计的与血小板衍生生长因子结合的锚蛋白重复序列蛋白
CA2883880A1 (en) * 2012-09-28 2014-04-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical combinations comprising dual angiopoietin-2 / dll4 binders and anti-vegf agents
MX2015003895A (es) * 2012-09-28 2015-07-17 Boehringer Ingelheim Int Combinaciones farmaceuticas que comprenden aglutinantes duales de angiopoyetina-2/dll4 y agentes anti-vegf-r.
EP2916827B1 (en) 2012-11-08 2020-06-10 Clearside Biomedical Inc. Methods for the treatment of ocular disease in human subjects
MX2015005874A (es) 2012-11-09 2015-09-10 Pfizer Anticuerpos especificos del factor de crecimiento b derivados de plaquetas y composiciones y usos de estos.
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
AU2014368695A1 (en) * 2013-12-20 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with an anti-ANG2 antibody and a CD40 agonist
JP6786392B2 (ja) * 2014-01-15 2020-11-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ＦｃＲｎ結合特性が改変され、プロテインＡ結合特性が保持されているＦｃ領域変異体
BR112017009764A2 (pt) * 2014-11-10 2018-02-20 Hoffmann La Roche anticorpos biespecíficos e métodos de uso em oftalmologia
CN107148429B (zh) 2014-11-10 2021-12-03 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-pdgf-b抗体和使用方法
SG11201702550WA (en) 2014-11-10 2017-04-27 Hoffmann La Roche ANTI-IL-1beta ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2016209972A1 (en) * 2015-06-26 2016-12-29 Amgen Inc. Biomarker of survival in the treatment of renal cell carcinoma with a vegfr inhibitor and an ang2 inhibitor
EP3630822A1 (en) * 2017-06-02 2020-04-08 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-cancer combination therapy

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101374522A (zh) * 2006-01-27 2009-02-25 安姆根有限公司 Ang2和vegf抑制剂的组合
CN102046657A (zh) * 2008-02-20 2011-05-04 安姆根有限公司 针对血管生成素-1和血管生成素-2的抗体及其用途
WO2010040508A1 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies
CN102257008A (zh) * 2008-12-16 2011-11-23 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对人血管生成素2的抗体
WO2014009465A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2014177460A1 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KYRIAKOS P. PAPADOPOULOS等: ""A phase I first-in-human study of REGN910 (SAR307746), a fully human and selective angiopoietin-2 (Ang2) monoclonal antibody (MAb),in patients with advanced solid tumor malignancies."", 《JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY》 *
MARKUS THOMAS等: ""A Novel Angiopoietin-2 Selective Fully Human Antibody with Potent Anti-Tumoral and Anti-Angiogenic Efficacy and Superior Side Effect Profile Compared to Pan-Angiopoietin-1/-2 Inhibitors"", 《PLOS ONE》 *
SEBASTIAN FENN等: ""Crystal structure of an anti-Ang2 CrossFab demonstrates complete structural and functional integrity of the variable domain"", 《PLOS ONE》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111491951A (zh) * 2017-12-22 2020-08-04 豪夫迈·罗氏有限公司 通过疏水相互作用色谱法耗尽轻链错配的抗体变体
CN111491951B (zh) * 2017-12-22 2024-05-24 豪夫迈·罗氏有限公司 通过疏水相互作用色谱法耗尽轻链错配的抗体变体
CN115772544A (zh) * 2021-09-06 2023-03-10 合肥星眸生物科技有限公司 抗vegf-a和ang-2的aav载体
CN115772544B (zh) * 2021-09-06 2024-04-26 合肥星眸生物科技有限公司 抗vegf-a和ang-2的aav载体
CN116925234A (zh) * 2022-04-02 2023-10-24 合肥星眸生物科技有限公司 一种编码抗vegf-a和ang-2双特异性抗体的aav载体
WO2024066377A1 (zh) * 2022-09-28 2024-04-04 科兴生物制药股份有限公司 Vegf和ang-2双特异性抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017009790A2 (pt) 2017-12-19
MX2017005642A (es) 2017-07-24
AU2015345321A1 (en) 2017-04-20
JP2017534644A (ja) 2017-11-24
US20170247441A1 (en) 2017-08-31
JP2021050229A (ja) 2021-04-01
EP3218398A1 (en) 2017-09-20
IL251477A0 (en) 2017-05-29
TW201630935A (zh) 2016-09-01
CA2963606A1 (en) 2016-05-19
WO2016075035A1 (en) 2016-05-19
SG11201703458UA (en) 2017-05-30
AR102595A1 (es) 2017-03-08
US10538585B2 (en) 2020-01-21
KR20170082594A (ko) 2017-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107001456A (zh) 抗ang2 抗体及使用方法
JP7023306B2 (ja) ＦｃＲｎ結合が変更されたＦｃ領域変種および使用方法
US20220324955A1 (en) Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
JP7077263B2 (ja) 二重特異性ｈｅｒ２抗体及び使用方法
CN107074941A (zh) 双特异性抗体和用于眼科学的方法
CN107849132A (zh) 人源化的和亲和力成熟的针对FcRH5的抗体和使用方法
CN105308069A (zh) 对fap和dr5特异性的双特异性抗体、对dr5特异性的抗体及使用方法
CN107148429B (zh) 抗-pdgf-b抗体和使用方法
CN106255705A (zh) 结合HER3β‑发夹和HER2域II的HER3/HER2双特异性抗体
CN107074942A (zh) 抗‑IL‑1β抗体和使用方法
CN109071635A (zh) Contorsbody－单链靶标结合物
CN108289951A (zh) 抗-因子d抗体和缀合物
CN109415435A (zh) 新型抗体形式
JP2015536336A (ja) Ｈｅｒ３のベータヘアピン及びｈｅｒ４のベータヘアピンに結合する抗ｈｅｒ３／ｈｅｒ４抗原結合タンパク質
CN107949570A (zh) 多特异性结合蛋白
CN106459207A (zh) 结合HER3β‑发夹的抗HER3抗体
CN106687476A (zh) 抗brdu抗体及使用方法
CN107002114A (zh) 用于确定cdc引发抗体的测定试验和方法
AU2017276604B2 (en) Fusion proteins for ophthalmology with increased eye retention
CN108602884A (zh) 筛选多特异性抗体的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1241384

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170801

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1241384

Country of ref document: HK