ES2343426T3 - Ligandos de afinidad de union a anticuerpos. - Google Patents

Ligandos de afinidad de union a anticuerpos. Download PDF

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Abstract

Material de soporte sólido teniendo inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad, comprendiendo dicho ligando uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s), donde al menos un grupo funcional hidrofóbico está separado de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de entre 5 Å y 20 Å, donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da; y donde el ligando comprende o consiste en 3 residuos unidos covalentemente, X1-X2-X3, donde dichos residuos unidos covalentemente también están unidos covalentemente al enlazador L de la entidad L-PM, donde PM es el material de soporte sólido, donde X1 es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, donde X2 es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, con la condición de que X2 no sea un residuo de treonina, y donde X3 es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, donde al menos uno de X1, X2 y X3 comprende un grupo funcional catiónico, y donde al menos uno de X1, X2 y X3 comprende un grupo funcional hidrofóbico, donde X1 se selecciona de L-Arg, D-Lys, D-Phe, D-Pro, INA, PPC, DBHBA, 3HBA, 4HBA y SAA; donde X2 se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro, AIB, AHX, INA, NLE y PPC; y donde X3 se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro y PPC.

Description

Ligandos de afinidad de unión a anticuerpos.
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Campo de la invención
La presente invención se refiere a ligandos de afinidad unidos covalentemente a un material de soporte sólido, tal como una matriz de polímero, y usos de los mismos en la purificación y/o el aislamiento de biomoléculas, tales como proteínas, en particular anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales. Los ligandos de afinidad comprenden dos dominios diferentes o grupos funcionales: (i) un dominio hidrofóbico y (ii) un dominio catiónico.
Antecedentes de la invención
La cromatografía de afinidad habilita selectiva y reversiblemente sustancias biológicas de adsorción, tales como anticuerpos monoclonales, para una sustancia de enlace complementaria, tal como un ligando de afinidad inmovilizado en un material de soporte sólido contenido en una columna de afinidad.
Las columnas de afinidad frecuentemente contienen un material de soporte sólido, normalmente una matriz de polímero porosa, a la cual se une covalentemente un ligando adecuado directamente o mediante un enlazador. Una muestra conteniendo sustancias biológicas con una afinidad por el ligando puede ponerse en contacto con el ligando de afinidad inmovilizado covalentemente al material de soporte sólido bajo condiciones de enlace favorables que promueven un enlace específico entre el ligando y las sustancias biológicas con una afinidad por el ligando. La columna puede lavarse posteriormente con un regulador de pH para eliminar el material no enlazado, y en otra etapa las sustancias biológicas con una afinidad por el ligando pueden eluirse y obtenerse en una forma purificada o aislada. Por consiguiente, el ligando debería exhibir preferiblemente características de enlace específicas y reversibles para la sustancia biológica, tales como un anticuerpo, el cual se desee purificar o aislar.
Los anticuerpos tienen una o más copias de una unidad en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas de polipéptidos. Cada Y contiene dos copias idénticas de una cadena "pesada", y dos copias idénticas de una "cadena ligera", llamadas así por sus pesos moleculares relativos.
Los anticuerpos pueden dividirse en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, en base al número de unidades Y y al tipo de cadena pesada. La cadena pesada determina la subclase de cada anticuerpo. Las cadenas pesadas de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE se conocen como gamma, mu, alfa, delta, y epsilon, respectivamente. Las cadenas ligeras de cualquier anticuerpo pueden clasificarse o bien como de tipo kappa (\kappa) o lambda (\lambda) (una descripción de las características moleculares del polipéptido).
Para aplicaciones farmacéuticas, el anticuerpo más frecuentemente usado es IgG el cual puede dividirse en tres partes, dos regiones F(ab) y una región Fc, por la papaina de la enzima proteolítica, o en dos partes, una región F(ab')_{2} y una región Fc por la pepsina de la enzima proteolítica.
Las regiones F(ab) comprenden los "brazos" del anticuerpo, los cuales son críticos para la enlace de antígenos. La región Fc comprende la "cola" del anticuerpo y juega un papel en la respuesta inmunitaria, al igual que sirve como un "asa" útil para manipular el anticuerpo durante algunos procedimientos inmunoquímicos. El número de regiones F(ab) en el anticuerpo, se corresponde con su subclase, y determina la "valencia" del anticuerpo (dicho en términos generales, el número de "brazos" con los cuales el anticuerpo puede enlazar su antígeno).
El término "anticuerpo" significa una inmunoglobulina, producida sintéticamente o bien de forma natural o parcial o completa. Todos los fragmentos y derivados de los mismos que mantienen la capacidad de enlace específica también se incluyen en el término. Son fragmentos típicos FC, FAB, cadena pesada, y cadena ligera. El término también engloba cualquier polipéptido con un dominio de enlace homólogo o ampliamente homólogo, tal como al menos un 95% idéntico en comparación con la secuencia de aminoácidos, para un dominio de enlace de inmunoglobulina. Estos polipéptidos pueden derivarse de fuentes naturales, o producirse sintéticamente de forma parcial o completa. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un elemento de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. Los derivados de la clase IgG, no obstante, se prefieren en una forma de realización de la presente invención.
El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que tenga menos que su longitud completa. Preferiblemente, el fragmento de anticuerpo retiene al menos una parte significante de la capacidad de enlace específica del anticuerpo en toda su longitud. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')_{2}, scFv, FV, diacuerpo de dsFv, y fragmentos de Fd. El fragmento de anticuerpo puede producirse por cualquier medio. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede producirse enzimáticamente o químicamente por fragmentación de un anticuerpo intacto o puede producirse de manera recombinante a partir de un gen codificando la secuencia del anticuerpo parcial. De forma alternativa, el fragmento de anticuerpo puede producirse sintéticamente de forma completa o parcial. El fragmento de anticuerpo puede ser opcionalmente un fragmento de anticuerpo monocatenario. De forma alternativa, el fragmento puede comprender cadenas múltiples que se enlacen juntas, por ejemplo, por enlaces de disulfuro. El fragmento también puede opcionalmente ser un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional típicamente comprenderá al menos aproximadamente 50 aminoácidos y más típicamente comprenderá al menos aproximadamente 200 aminoácidos.
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Los "Fvs monocatenarios" (scFvs) son fragmentos de anticuerpo recombinantes que consisten sólo en la cadena ligera variable (V_{L}) y la cadena pesada variable (V_{H}) conectadas covalentemente la una a la otra por un enlazador del polipéptido. Tanto el dominio V_{L} como V_{H} pueden ser el dominio aminoterminal. El enlazador de polipéptidos puede tener una longitud y una composición variables mientras los dos dominios variables estén ligados sin interferencia estérica importante. Típicamente, los enlaces están compuestos principalmente por extensiones de glicina y residuos de serina con algún ácido glutámico o residuos de lisina intercalados para solubilidad. Los "diacuerpos" son scFvs diméricos. Los componentes de los diacuerpos típicamente tienen enlaces peptídicos más cortos que la mayoría de scFvs y muestran una preferencia para asociarse como dímeros. Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio V_{H} y un dominio V_{L} mantenidos juntos por interacciones no covalentes. El término "dsFv" se utiliza en este caso para referirse a un FV con un enlace de disulfuro creado genéticamente intermolecular para estabilizar el par V_{H} - V_{L}. Un fragmento "F(ab')_{2}" es un fragmento de anticuerpos esencialmente equivalente al obtenido a partir de inmunoglobulinas (típicamente IgG) por digestión con una pepsina enzimática a un pH 4.0-4.5. El fragmento puede producirse de forma recombinante. Un fragmento "Fab" es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido por reducción del puente o puentes de disulfuro que unen las dos partes de cadena pesada en el fragmento F(ab')_{2}. El fragmento Fab' puede producirse recombinantemente. Un fragmento "Fab" es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido mediante la digestión de inmunoglobulinas (típicamente IgG) con la papaína enzimática. El fragmento Fab puede producirse recombinantemente. El segmento de cadena pesada del fragmento Fab es la parte de Fd. Una región "Fc" es una región constante de una clase particular de anticuerpo.
El enlace entre antígenos y anticuerpos depende de enlaces de hidrógeno, enlaces hidrofóbicos, fuerzas electroestáticas, y fuerzas van der Waals. Estos son todos enlaces de una naturaleza débil no covalente, puesto que algunas asociaciones entre un antígeno y un anticuerpo pueden ser bastante fuertes. Por consiguiente, la constante de afinidad para la enlace antígeno-anticuerpo puede abarcar una gama amplia, extendiéndose desde menos de 10^{5} mol-^{1} a más de 10^{12} mol-^{1}. Las constantes de afinidad están afectadas por la temperatura, el pH y el solvente. Además de una afinidad de un anticuerpo por un ligando, la estabilidad global de un complejo de ligando-anticuerpo también se determina por la valencia del antígeno y del anticuerpo y la disposición estructural de las partes de interacción.
Las constantes de afinidad precisas sólo pueden determinarse para anticuerpos monoclonales los cuales son moléculas genéticamente idénticas que reconocen un único epítopo en el antígeno mientras que para anticuerpos policlonales una distribución amplia de afinidades puede contribuir a una aparente constante de afinidad. La aparente constante de afinidad también puede provocarse por el hecho de que los anticuerpos policlonales pueden reconocer más de un único epítopo en el mismo antígeno. Puesto que los anticuerpos normalmente portan más de un dominio de enlace por molécula, tienen lugar enlaces múltiples cooperativos entre anticuerpos y sus antígenos; este efecto se denomina avidez. Ya que los anticuerpos monoclonales reaccionan con sólo un único epítopo en el antígeno son más vulnerables a la pérdida del epítopo a través del tratamiento químico del antígeno, que los anticuerpos policlonales. Este puede derivarse al agrupar dos o más anticuerpos monoclonales para el mismo antígeno.
Los anticuerpos monoclonales pueden aumentar por fusión de linfocitos B con cultivos de células inmortales para producir hibridomas. Los hibridomas producirán muchas copias de exactamente el mismo anticuerpo (una característica esencial en el desarrollo de anticuerpos para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico).
Habitualmente, el ligando de afinidad más explorado para la purificación y el aislamiento de biomoléculas, tales como anticuerpos monoclonales, es la Proteína A. La Proteína A es un ligando ampliamente usado, no obstante, el ligando puede sufrir de diferentes desventajas, tales como problemas en relación a la inestabilidad concomitante con el lixiviado de la columna y la necesidad de eliminarla del producto final o al saneamiento insuficiente de la resina de cromatografía y además, la Proteína A es bastante costosa.
WO 03/019195 A expone un nonapéptido EBNA 3A que consiste en RPPIFIRRL el cual es fija sobre un soporte sólido.
WO 01/40265 A expone un hexapéptido que tiene la identidad de secuencia de FPNGGI el cual se acopla a un soporte sólido.
WO 2004/1003148 A expone diferentes péptidos no inmovilizados.
Fassina G. et al., "Protein A mimetic peptide ligand for affinity purification of antibodies" Journal of Molecular Recognition: JMR. 1996 SEP-DEC, Vol. 9, nº. 5-6, septiembre 1996 (1996-09), páginas 564-569, expone ligandos de péptidos miméticos de proteína A para la purificación de afinidad de anticuerpos.
US 5.260.373 expone preparaciones de proteína A inmovilizada para purificar anticuerpos monoclonales.
Por lo tanto, existe una necesidad de ligandos nuevos, estables y de poco coste para aislar anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, o análogos, derivados, fragmentos y precursores de los mismos, derivados de fuentes tanto naturales como recombinantes.
\newpage
Resumen de la invención
En un aspecto de la presente invención, se proporciona un material de soporte sólido teniendo un ligando de afinidad inmobilizado covalentemente sobre sí mismo, dicho ligando comprendiendo uno o más grupo(s) funcional(es)
hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),
donde al menos un grupo funcional hidrofóbico se separa de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia entre enlaces de entre 5 \ring{A} y 20 \ring{A},
donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da; y
donde el ligando comprende o consiste en los residuos unidos covalentemente X_{1}-X_{2}-X_{3},
donde dichos residuos unidos covalentemente también se unen covalentemente al enlazador L de la entidad L-PM, donde PM es el material de soporte sólido,
donde X_{1} es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,
donde X_{2} es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, con la condición de que X_{2} no sea un residuo de treonina, y
donde X_{3} es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,
donde al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} comprende un grupo funcional catiónico, y
donde al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} comprende un grupo funcional hidrofóbico,
donde X_{1} se selecciona a partir de L-Arg, D-Lys, D-Phe, D-Pro, INA, PPC, DBHBA, 3HBA, 4HBA y SAA;
donde X_{2} se selecciona a partir de L-Arg, L-Asn, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro, AIB, AHX, INA, NLE y PPC; y
donde X_{3} se selecciona a partir de L-Arg, L-Asn, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro y PPC.
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En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un material de soporte sólido teniendo un ligando de afinidad inmovilizado covalentemente sobre el mismo, dicho ligando comprendiendo uno o más grupo(s) funcional(es)
hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),
donde al menos un grupo funcional hidrofóbico se separa de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia entre enlaces de entre 5 \ring{A} y 20 \ring{A},
donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da; y
donde el ligando de afinidad comprende o consiste en los residuos unidos covalentemente X_{1}-X_{2}-X_{3}, donde opcionalmente X_{1}, X_{2} y/o X_{3}, se enlaza con un residuo de enlazador, L; y
donde
el residuo X_{1} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Phe, PPC, DBHBA, SAA, DAP, DAB, (DBHBA)_{2}-DAP, (MDCA)_{2}-DAP, DPBBA, DBBA, PCAA, DPPAA, Trp, TMPPA, y DBHPA,
El residuo X_{2} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Leu, Lys, Phe, Pro, PPC, DAP, DAB, His, Trp, Tyr, y Ser, y
el residuo X_{3} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Pro, PPC, Asp, Orn, y (1H2NA)Dap.
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En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un material de soporte sólido teniendo un ligando de afinidad inmovilizado covalentemente sobre el mismo, dicho ligando comprendiendo uno o más grupo(s) funcional(es)
hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),
donde al menos un grupo funcional hidrofóbico se separa de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia entre enlaces de entre 5 \ring{A} y 20 \ring{A},
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donde dicho ligando consiste en 3 residuos seleccionados del grupo que consiste en D-Leu; D-Lys; D-Phe; D-Pro; L-Arg; L-Asn; L-Pro; AHX; AIB; DBHBA; INA; NLE; PPC; SAA; 3HBA y 4HBA, y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da.
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En otro aspecto ulterior de la presente invención, se proporciona un método para el aislamiento de biomoléculas, tales como proteínas, p. ej. anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, o derivados de los mismos, incluyendo el método las etapas de (i) proporcionar un material de soporte sólido teniendo un ligando de afinidad inmovilizado covalentemente sobre el mismo tal y como se define aquí, (ii) proporcionar una muestra conteniendo putativamente un anticuerpo con una afinidad por dicho ligando, (iii) poner en contacto dicho ligando con dicha muestra conteniendo putativamente dicho anticuerpo, (iv) enlazar selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra y (v) aislar selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Análisis de selectividad en resina B2. 1 = sobrenadante de fermentación, 2 = corriente paralela (ciclo 1), 3 = elución (ciclo 1), 4 = regeneración/saneamiento (ciclo 1), 5 = lavado (ciclo 2), 6 = elución (ciclo 2), 7 = sin proteína, 8 = muestra de referencia de mAb.
Figura 2: Análisis de selectividad en resina B3. 1 = sobrenadante de fermentación, 2 = corriente paralela (ciclo 1), 3 = elución (ciclo 1), 4 = regeneración/saneamiento (ciclo 1), 5 = lavado (ciclo 2), 6 = elución (ciclo 2), 7 = regeneración/saneamiento (ciclo 2), 8 = muestra de referencia de mAb.
Figura 3: Análisis de selectividad en resina Di. 1 = muestra de referencia de mAb, 2 = sobrenadante de fermentación, 3 = corriente paralela (ciclo 1), 4 = elución (ciclo 1), 5 = regeneración/saneamiento (ciclo 1), 6 = lavado (ciclo 2), 7 = elución (ciclo 2), 8 = regeneración/saneamiento (ciclo 2).
Figura 4: Análisis de selectividad en resina D2. 1 = muestra de referencia de mAb, 2 = sobrenadante de fermentación, 3 = corriente paralela (ciclo 1), 4 = elución (ciclo 1), 5 = regeneración/saneamiento (ciclo 1), 6 = lavado (ciclo 2), 7 = elución (ciclo 2), 8 = regeneración/saneamiento (ciclo 2).
Descripción detallada de la invención
Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se refiere a nuevos materiales de soporte sólidos que tienen inmovilizados covalentemente sobre los mismos un ligando de afinidad, donde el ligando comprende un conjunto particular de grupos funcionales. Los materiales de este tipo son particularmente útiles para la purificación y el aislamiento de biomoléculas, tales como proteínas, p. ej. anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, o derivados de los mismos.
Ligandos
Cuando se usa aquí, el término "ligando" significa una molécula que puede enlazarse a un compuesto objetivo, por ejemplo un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal. Los ligandos preferiblemente se enlazan a sus compañeros de enlace al menos de una manera sustancialmente específica ("enlace específico").
"Enlace específico" se refiere a la propiedad de un ligando para: (1) enlazarse a un compañero de enlace, p. ej. un anticuerpo monoclonal, (2) preferentemente de manera que la masa relativa del compañero de enlace enlazado p. ej., un anticuerpo monoclonal, sea de al menos dos veces, tal como 50 veces, por ejemplo 100 veces, tal como 1000 veces, o mayor que la masa relativa de otra especie enlazada que no sea el compañero de enlace, p. ej. un anticuerpo monoclonal. Por masa relativa de compuesto enlazado se entiende la masa del compuesto enlazado menos la masa del compuesto no enlazado dividido entre la masa total del compañero de enlace, es decir Masa relativa de compuesto enlazado = (masa de compuesto enlazado - masa de compuesto no enlazado)/(masa de compuesto enlazado + masa de compuesto no enlazado), siendo el compuesto compañero de enlace u otra especie.
El término "compañero de enlace" se refiere a cualquier molécula biológica que se enlaza mediante un ligando particular, preferiblemente de una manera sustancialmente específica. Un compañero de enlace puede compartirse por más de un ligando. Los compañeros de enlace preferidos son los anticuerpos incluyendo los anticuerpos policlonales y los anticuerpos monoclonales. Otros compañeros de enlace preferidos son fragmentos de anticuerpos de anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales.
Los ligandos según la invención incluyen isómeros ópticos enriquecidos o resueltos en cualquiera o todos los átomos asimétricos como son aparentes de la descripción o dibujo aquí. Ambas mezclas racémica y diasteromérica, al igual que los isómeros ópticos individuales pueden aislarse o sintetizarse para que de esta manera queden sustancialmente libres de sus compañeros enantioméricos o diastereoméricos, y éstos están todos dentro del campo de la invención.
Los experimentos han mostrado sorprendentemente que ciertas clases de ligandos de afinidad, es decir, una donde los ligandos comprenden uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es)
catiónico(s) se enlazan selectivamente a mAbs.
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Se observó también además que al menos un grupo funcional hidrofóbico debería separarse de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de 5 \ring{A} a 20 \ring{A}, así como una distancia a través de enlaces de 5 a 19 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 5 a 18 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 5 a 17 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 5 a 16 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 5 a 15 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 5 a 14 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 5 a 13 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 5 a 12 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 5 a 11 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 5 a 10 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 6 a 14 \ring{A}, o tal como una distancia a través de enlaces de 7 a 20 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 7 a 19 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 7 a 18 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 7 a 17 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 7 a 16 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 7 a 15 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 7 a 14 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 7 a 13 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 7 a 12 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 7 a 11 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 7 a 10 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 8 a 12 \ring{A}, o por ejemplo una distancia a través de enlaces de 9 a 20 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 9 a 18 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 9 a 16 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 9 a 14 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de 9 a 12 \ring{A}, tal como una distancia a través de enlaces de 9 a 11 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de enlaces de aproximadamente 10 \ring{A}.
La distancia a través de enlaces es la distancia a través de enlaces intramolecular más corta entre entidades químicas unidas covalentemente a lo largo de los enlaces químicos. Se calcula sumando las distancias de enlace átomo-átomo individuales a lo largo de la trayectoria intramolecular más corta. Las distancias de enlace átomo-átomo típicas son 1,2 \ring{A} a 1,4 \ring{A}.
La distancia a través del espacio entre el al menos un grupo funcional hidrofóbico y el al menos un grupo funcional catiónico del ligando es preferiblemente de menos de 20 \ring{A}, por ejemplo menos de 18 \ring{A}, tal como aproximadamente o menos de 16 \ring{A}, por ejemplo menos de 15 \ring{A}, tal como aproximadamente o menos de 14 \ring{A}, por ejemplo menos de 13 \ring{A}, tal como aproximadamente o menos de 12 \ring{A}, por ejemplo menos de 11 \ring{A}, tal como aproximadamente o menos de 10 \ring{A}, por ejemplo aproximadamente o menos de 8 \ring{A}, tal como aproximadamente 6 \ring{A}, por ejemplo en el rango de 5 a 20 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 5 a 19 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 5 a 18 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 5 a 17 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 5 a 16 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 5 a 15 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 5 a 14 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 5 a 13 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 5 a 12 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 5 a 11 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 5 a 10 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 7 a 20 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 7 a 19 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 7 a 18 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 7 a 17 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 7 a 16 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 7 a 15 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 7 a 14 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 7 a 13 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 7 a 12 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 7 a 11 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 7 a 10 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 9 a 20 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 9 a 18 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 9 a 16 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 9 a 14 \ring{A}, por ejemplo una distancia a través de espacios de 9 a 12 \ring{A}, tal como una distancia a través de espacios de 9 a 11 \ring{A}.
Las distancias a través de enlaces y las distancias a través de espacios pueden calcularse o determinarse por el experto en la técnica según las técnicas del estado de la técnica. El modelado molecular también puede usarse para determinar la distancia mínima entre átomos de diferentes grupos funcionales de ligando. El modelado molecular puede realizarse p. ej. con Sybyl/Mendyl 5.4 (Tripos Associates, St. Louis, Mo.) usando una computadora gráfica Evans y Sutherland PS390 equipada con un visor estereográfico. Las estructuras de ligando adecuadas pueden proporcionarse mediante construcción con el programa Concord o a partir de las bibliotecas seguida por la minimización de energía. Los cálculos de energía pueden hacerse con el campo de fuerza de Sybyl/Mendyl y un parámetro de van der Waals de 1.2 para hidrógeno. Las cargas pueden calcularse usando el método de Gasteigner-Huckel que incluye enlace sigma y enlace pi.
El ligando tiene un peso molecular inferior a 1.000 Da.
Adicionalmente, el ligando tiene un peso molecular de más de 120 Da, tal como más de 140 Da, por ejemplo más de 160 Da, tal como más de 180 Da, por ejemplo más de 200 Da, tal como más de 220 Da, por ejemplo un peso molecular de más de 240 Da.
Para reducir el grado de enlace no específico para los grupos catiónicos, el ligando puede comprender además uno o más grupos aniónicos para compensar cierta carga positiva en el ligando. Los grupos aniónicos incluyen, pero no se limitan a, carboxilato, sulfonato, sulfato, fosfato y otros grupos ionizables cargados negativamente, y pueden p. ej. disponerse sobre grupos pendientes del ligando.
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Grupos funcionales de ligando
En el grupo de ligandos adecuados, cada ligando comprende uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s).
Como se utiliza en este caso, un grupo funcional catiónico es un grupo orgánico que tiene una carga positiva en el rango de pH 3-7. Las aminas primarias, secundarias, y terciarias son ejemplos típicos de grupos catiónicos. La guanidina es otro ejemplo relevante. Otros ejemplos de grupos funcionales catiónicos se dan en la sección "Grupos funcionales catiónicos" abajo.
Un grupo funcional hidrofóbico es un grupo orgánico capaz de unirse a la superficie de una biomolécula principalmente por interacción hidrofóbica. Grupos funcionales hidrofóbicos se caracterizan por ser esencialmente no polares y no cargados en condiciones fisiológicas normales. Los residuos hidrofóbicos se repelen por solución acuosa para de esta manera buscar las posiciones internas en la conformación de un ligando cuando el ligando esté en un medio acuoso. Asimismo, los residuos hidrofóbicos buscarán cavidades o ranuras hidrofóbicas de compañeros de enlace de ligandos cuando el ligando esté asociado con un compañero de enlace bajo condiciones fisiológicas normales.
Cuando se usa en la presente, el término "condición fisiológica normal" se refiere a condiciones que son típicas dentro de un organismo vivo o una célula. Aunque se reconoce que algunos órganos u organismos proporcionan condiciones extremas, el ambiente intra-organismo e intra-celular varía normalmente alrededor de un pH 7 (es decir, de un pH 6.5 a un pH 7.5), contiene agua como solvente predominante, y existe a una temperatura superior a 0ºC e inferior a 50ºC. Se reconocerá que la concentración de diferentes sales depende del órgano, organismo, célula, o compartimiento celular usado como referencia.
Los grupos hidrofóbicos orgánicos generalmente tienen un alto contenido de átomos de carbono. Ejemplos típicos de grupos hidrofóbicos son alcanos lineales y ramificados, hidrocarburos cíclicos, compuestos aromáticos, y combinaciones de alcanos lineales y ramificados, hidrocarburos cíclicos, y compuestos aromáticos. También las variantes sustituidas de esos grupos se considera que son hidrofóbicas siempre y cuando el contenido relativo de carbono esté por encima de cierto límite. No obstante, el porcentaje de átomos de carbono no es el único parámetro, el cual influye sobre la hidrofobicidad. También la posición y naturaleza de otros átomos juegan un papel importante. Por ejemplo, un éter es típicamente más hidrofóbico que un alcohol con el mismo número de átomos de carbono y átomos de oxígeno, y un éster es más hidrofóbico que un diol con la misma composición elemental. Cuando uno o más átomos que no son carbono y no son hidrógeno posibles de un grupo orgánico están en posiciones primarias, el número relativo de átomos de carbono debe ser más alto para que el grupo sea hidrofóbico que cuando sea posible átomos no de carbono y no de hidrógeno estén en posiciones secundarias, terciarias o cuaternarias. Teniendo eso en mente, se define un grupo hidrofóbico con grupos orgánicos con un 75% o más de sus átomos que no son hidrógeno siendo átomos de carbono, tal como un 80% o más, preferentemente un 85% o más de sus átomos que no son de hidrógeno siendo átomos de carbono. Por ejemplo, el valor inferior, un 75%, se aplica a éteres y ésteres, el valor intermedio, un 80%, se aplica a amidas y a aminas secundarias y terciarias, mientras que el valor superior, un 85%, se aplica a alcoholes y aminas primarias. Ejemplos de grupos funcionales hidrofóbicos se dan en la sección "grupos funcionales de ligandos" abajo.
El al menos un grupo hidrofóbico funcional puede comprender o consistir en uno o más grupos seleccionados de, "alquilo" "alquilo cíclico", "alquilo sustituido", "arilo", "arilo sustituido", "alquenilo", "alquenilo sustituido", "alquinilo", "alquinilo sustituido", "aralquilo", "aralquilo sustituido", "heterociclilo", "heterociclilo sustituido", "heterociclilalquilo", "heterociclilalquilo sustituido", "alquiloaminoalquilo", "alquiloaminoalquilo sustituido", "heterociclilalquilo", "alquilaminoalquilo", "alquilaminoalquilo sustituido", "dialquilaminoalquilo", "dialquilaminoalquilo sustituido", "heterocicliloxialquilo", "heterocicliloxialquilo sustituido", "arilaminoalquilo", "arilaminoalquilo sustituido", "heterociclilaminoalquilo", "heterociclilaminoalquilo sustituido", "alquilaminoalcoxi", "alquilaminoalcoxi sustituido", "dialquilaminoalcoxi", "dialquilaminoalcoxi sustituido", "heterocicliloxi", "heterocicliloxi sustituido", "dialquilaminoalcoxi", "dialquilaminoalcoxi sustituido", "heterocicliloxi", y "heterocicliloxi sustituido", como se define abajo en la presente.
Grupos funcionales hidrofóbicos comprendiendo residuos alifáticos
Al menos un grupo funcional hidrofóbico puede comprender o consiste en un residuo alifático opcionalmente sustituido y/o un residuo aromático opcionalmente sustituido. Los residuos alifáticos generalmente se refieren a hidrocarburos tales como p. ej. alquilo, alquileno y residuos de alquinilo los cuales pueden sustituirse o no sustituirse.
"Alquilo" como se utiliza en este caso incluye grupos alquilo de cadena lineal tales como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo y similares. "Alquilo" también incluye isómeros de cadena ramificada de grupos alquilo de cadena lineal, incluyendo pero no limitándose a, los siguientes que se proporcionan a modo de ejemplo: -CH(CH_{3})_{2}, -CH(CH_{3})(CH_{2}CH_{3}), -CH(CH_{2}CH_{3})_{2}, -C(CH_{3})_{3},
-C(CH_{2}CH_{3})_{3}, -CH_{2}CH(CH_{3})_{2}, -CH_{2}CH(CH_{3})(CH_{2}CH_{3}), -CH_{2}CH(CH_{2}CH_{3})_{2}, -CH_{2}C(CH_{3})_{3}, -CH_{2}C(CH_{2}CH_{3}), -CH(CH_{3})CH(CH_{3})(CH_{2}CH_{3}), -CH_{2}CH_{2}CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CH_{2}CH(CH_{3})(CH_{2}CH_{3}), -CH_{2}CH_{2}CH(CH_{2}CH_{3})_{2}, -CH_{2}CH_{2}C
(CH_{3})_{3}, -CH_{2}CH_{2}C(CH_{2}CH_{3})_{3}, -CH(CH_{3})CH_{2}CH(CH_{3})_{2}, -CH(CH_{3})CH(CH_{3})CH(CH_{3})CH(CH_{3})_{2} ó -CH(CH_{2}CH_{3})CH(CH_{3})CH(CH_{3})(CH_{2}CH_{3}).
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El residuo alifático puede ser un residuo alifático lineal opcionalmente sustituido o un residuo alifático ramificado opcionalmente sustituido. El residuo alifático también puede ser un alquilo cíclico opcionalmente sustituido. "Alquilo cíclico" incluye grupos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, y ciclooctilo y anillos de este tipo sustituidos por grupos alquilo de cadena recta y ramificada como los definidos anteriormente, y también incluye grupos alquilo policíclicos tales como, pero no limitándose a, adamantilo norbornil, y biciclo[2.2.2]octil y anillos de este tipo sustituidos por grupos alquilo de cadena recta y ramificada tales como los definidos anteriormente. Así, los grupos alquilo no sustituidos incluyen grupos alquilo primarios, grupos alquilo secundarios, y grupos alquilo terciarios. Grupos alquilo no sustituidos pueden unirse a uno o más átomo(s) de carbono, átomo(s) de oxígeno, átomo(s) de nitrógeno, y/o átomo(s) de azufre en un ligando.
El residuo cíclico alifático puede p. ej. comprender o consistir en un grupo cicloalquilo C_{5}-C_{16}. Longitudes de cadena más cortas también pueden ocurrir, típicamente cuando el cicloalquilo se sustituye con un residuo arilo o heteroarilo.
"Alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo no sustituido como el definido arriba en el cual uno o más enlaces a un carbono o hidrógeno se reemplaza(n) por un enlace a un átomo que no es hidrógeno y no es carbono tal como, pero no limitado a, un átomo de halógeno en haluros tales como F, Cl, Br, y I; y un átomo de oxígeno en grupos tales corno grupos hidroxilo, grupos alcoxi, grupos ariloxi y grupos éster; un átomo de azufre en grupos tales como grupos tiol, grupos de sulfuro alquilo y arilo, grupos sulfona, grupos sulfonilo, y grupos sulfóxido; un átomo de nitrógeno en grupos tales como aminas, amidas, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas y enaminas; un átomo de silicio en grupos tales como grupos trialquilsililo, grupos dialquilarilsililo, grupos alquildiarilsililol y grupos trialilsililo.
Los grupos alquilo sustituidos incluyen también grupos en los cuales uno o más enlaces a un átomo de carbono e hidrógeno se reemplaza por un enlace a un heteroátomo tal como oxígeno en los grupos carbonilo, carboxilo y éster; nitrógeno en grupos tales como ¡minas, oximas, hidrazonas y nitrilos. Los grupos alquilo sustituidos también incluyen, entre otros, grupos alquilo en los cuales uno o más enlaces a un átomo de carbono o hidrógeno se reemplaza por uno o más enlaces a un átomo de halógeno. Otros grupos alquilo sustituidos incluyen aquellos en los cuales uno o más enlaces a un átomo de carbono o hidrógeno se reemplaza por un enlace a un átomo de oxígeno de tal forma que el grupo alquilo sustituido contiene un grupo hidroxilo, alcoxi, ariloxi o heterocicliloxi. Otros grupos alquilo más incluyen grupos alquilo que tienen un grupo amina, alquilamina, dialquilamina, arilamina, (alquil)(aril)amina, diarilamina, heterociclilamina, (alquil)(heterociclil)amina, (aril)(heterociclil)amina, o diheterociclilamina.
En una forma de realización, un grupo alifático funcional se sustituye preferiblemente por un grupo del arilo tal como un grupo arilo (C_{6}-C_{12}) mencionado en la presente abajo, el cual a su vez también puede sustituirse, como también se describe aquí. Un ejemplo de un grupo arilo sustituido incluye un "grupo aralquilo", que puede sustituirse o no sustituirse.
Por consiguiente, "aralquilo" se refiere a grupos alquilo no sustituidos tales como los definidos anteriormente en los cuales un enlace de hidrógeno o carbono del grupo alquilo no sustituido se sustituye por un enlace a un grupo arilo tal como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, metilo (-CH_{3}) es un grupo alquilo no sustituido. Si un átomo de hidrógeno del grupo metilo se sustituye por un enlace a un grupo fenilo, tal como si el carbono del metilo estuviera enlazado a un carbono de benceno, entonces el compuesto es un grupo aralquilo no sustituido (es decir, un grupo bencilo). Así incluye, pero no está limitado a, grupos tales como bencilo, difenilmetilo, y 1-feniletilo (-CH(C_{6}H_{5})(CH_{3})), grupo 2-feniletilo o grupo 2-naftiletilo.
"Aralquilo sustituido" tiene el mismo significado con respecto a los grupos aralquilo no sustituidos que los grupos arilo sustituidos tuvieron con respecto a los grupos arilo no sustituidos. No obstante, un grupo aralquilo sustituido también incluye grupos en los cuales un enlace de carbono o hidrógeno de la parte alquilo del grupo se sustituye por un enlace a un átomo que no es carbono o no es hidrógeno. Ejemplos de grupos aralquilo sustituidos incluyen, pero no se limitan a, -CH_{2}C(=O)(C_{6}H_{5}), y -CH_{2}(2-metilfenilo) entre otros.
En una forma de realización, el residuo alifático opcionalmente sustituido comprende o consiste en un grupo alquilo C_{5}-C_{20}. Longitudes de cadena más cortas también pueden ocurrir, típicamente cuando el alquilo se sustituye por un residuo de arilo o heteroarilo. Otros ejemplos de grupos alquilo sustituidos por arilo o heteroarilo incluyen, por ejemplo, un grupo lineal (C_{1}-C_{10}), ramificado (C_{4}-C_{10}) o cíclico (C_{5}-C_{10}), tal como un grupo metilo, grupo etilo, grupo propilo, tal como un grupo n-propilo y un grupo isopropilo, grupo butilo, tal como un grupo n-butilo, grupo isobutilo, grupo t-butilo, grupo n-amilo, grupo pentilo, tal como grupo neopentilo, grupo ciclopentilo, grupo hexilo, tal como grupo n-hexilo, grupo ciclohexilo, grupo heptilo, grupo octilo, tal como grupo n-octilo, grupo nonilo, tal como grupo n-nonilo, grupo decilo, tal como grupo n-decilo, grupo no-decilo, grupo dodecilo, grupo mentilo, grupo 2,3,4-trimetil-3-pentilo o grupo 2,4-dimetil-3-pentilo.
En una forma de realización, un grupo alquilo C_{5}-C_{20} también puede sustituirse, por ejemplo por un átomo de halógeno, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo alquiltio, o un grupo ariltio. Ejemplos del átomo de halógeno son un átomo de flúor, un átomo de clorina, un átomo de bromina, y un átomo de yodo. Ejemplos del grupo alkoxil Incluyen, por ejemplo, un grupo alcoxi (C_{1}-C_{4}) tal como grupo metoxi, grupo etoxi, grupo n-propoxi, grupo t-butoxi o similar. Ejemplos del grupo alquiltio incluyen, por ejemplo, estos compuestos del grupo alquilo (C_{1}-C_{10}), como se ha descrito anteriormente, y el grupo tio, y ejemplos específicos de los mismos incluyen, por ejemplo, el grupo n-propiltio, el grupo t-butiltio o similar. Ejemplos del grupo ariltio incluyen, por ejemplo, estos compuestos del grupo arilo (C_{6}-C_{12}), como se ha descrito anteriormente, y un grupo tio, y ejemplos específicos de los mismos incluyen, por ejemplo, un grupo feniltio o similar. Ejemplos del grupo ariloxi, que pueden estar presentes en los grupos arilo, heteroarilo, y de hidrocarburo saturado, por ejemplo, los comprendidos del grupo arilo (C_{6}-C_{12}), como se ha descrito anteriormente, y un grupo oxi, y ejemplos específicos de los mismos incluyen, por ejemplo, un grupo fenoxi.
Los grupos alquilo descritos en la presente arriba pueden contener uno o más enlaces dobles carbono-carbono (grupos alquenilos) o uno o más enlaces triples carbono-carbono (grupos alquinilos).
"Alquenilo" se refiere a grupos de cadena lineal y ramificada y cíclicos tales como los descritos con respecto a los grupos alquilo no sustituidos tales como los definidos anteriormente, excepto que al menos existe un enlace doble entre dos átomos de carbono. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a vinilo, -CH=C(H)(CH_{3}), -CH=C(CH_{3})_{2}, -C(CH_{3})=C(H)_{2}, -C(CH_{3})=C(H)(CH_{3}), -C(CH_{2}CH_{3})=CH_{2}, ciclohexenilo, ciclopentenilo, ciclohexadienilo, butadienilo, pentadienilo y hexadienilo.
"Alquenilo sustituido" tiene el mismo significado con respecto a los grupos alquenilo no sustituidos que tuvieron los grupos alquilo sustituidos con respecto a los grupos alquilo no sustituidos. Un grupo alquenilo sustituido incluye grupos alquenilo en los cuales un átomo que no es carbono o que no es hidrógeno se enlaza a un carbono doblemente enlazado a otro carbono y a aquellos en los cuales uno de los átomos que no son carbono o de los que no son hidrógeno se enlaza a un carbono no implicado en un enlace doble a otro carbono. "Alquinilo" se refiere a grupos de cadena lineal y ramificada tales como los descritos con respecto a los grupos alquilo tal como se ha definido anteriormente, excepto que al menos existe un enlace triple entre dos átomos de carbono. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a CC(H), -CC(CH_{3}), -CC(CH_{2}CH_{3}), -C(H_{2})CC(H), -C(H)_{2}CC(CH_{3}), y -C(H)_{2}CC(CH_{2}CH_{3}).
"Alquinilo sustituido" tiene el mismo significado con respecto a los grupos alquinilo no sustituidos que tuvieron grupos alquilo sustituidos con respecto a los grupos alquilo no sustituidos. Un grupo alquinilo sustituido incluye grupos alquinilo en los cuales un átomo que no es carbono ni hidrógeno se enlaza a un carbono triple enlazado a otro carbono y aquellos en los cuales un átomo que no es carbono ni hidrógeno se enlaza a un carbono no implicado en un enlace triple a otro carbono.
Otros ejemplos de grupos alquilo sustituidos se describen en la presente abajo.
"Alquilaminoalquilo" se refiere a un grupo alquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente en el cual un enlace de carbono o de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de nitrógeno que a su vez se enlaza a un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, metilo (-CH_{3}) es un grupo alquilo no sustituido. Si un átomo del hidrógeno del grupo metilo se sustituye por un enlace a un átomo de nitrógeno que se enlaza a un átomo de hidrógeno y un grupo etilo, entonces el compuesto resultante es -CH_{2}-N(H)(CH_{2}CH_{3}) que es un grupo alquilaminoalquilo no sustituido.
"Alquilaminoalquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilaminoalquilo no sustituido como el definido arriba excepto cuando uno o más enlaces a un átomo de carbono o hidrógeno en uno o ambos de los grupos alquilo se sustituye por un enlace a un átomo que no es carbono o no es hidrógeno como el descrito arriba con respecto a grupos alquilo sustituidos excepto que el enlace al átomo de nitrógeno en todos los grupos alquiloaminoalquilo no por sí mismo califica a todos los grupos alquiloaminoalquilo como siendo sustituidos. Sin embargo, los grupos alquiloaminoalquilo sustituidos sí incluyen grupos en los cuales el hidrógeno enlazado al átomo de nitrógeno del grupo se sustituye por un átomo que no es carbono y no es hidrógeno.
"Dialquilaminoalquilo" se refiere a un grupo alquilo no sustituido como el definido arriba en el cual un enlace de carbono o enlace de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de hidrógeno que está enlazado a otros dos grupos alquilo no sustituidos similares o diferentes como los definidos arriba.
"Dialquilaminoalquilo sustituido" se refiere a un grupo dialquilaminoalquilo sustituido como el definido arriba en el cual uno o más enlaces a un átomo de carbono o hidrógeno en uno o más de los grupos alquilo se sustituye por un enlace a un átomo que no es carbono y no es hidrógeno como el descrito con respecto a los grupos alquilo sustituidos. El enlace al átomo de nitrógeno en todos los grupos dialquilaminoalquilo no en sí mismo califica a todos los grupos dialquilaminoalquilo como siendo sustituidos.
"Heterocicliloxialquilo" se refiere a un grupo alquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente en el cual un enlace de carbono o enlace de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de oxígeno que está enlazado a un grupo heterociclilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente.
"Heterocicliloxialquilo sustituido" se refiere a un grupo heterocicliloxialquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente en el cual un enlace a un grupo de carbono o de hidrógeno del grupo alquilo del grupo heterocicliloxialquilo se enlaza a un átomo que no es carbono y no es hidrógeno como se ha descrito anteriormente con respecto a los grupos alquilo sustituidos o en el cual el grupo heterociclilo del grupo heterocicliloxialquilo es un grupo heterociclilo sustituido tal como se ha definido anteriormente.
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"Arilaminoalquilo" se refiere a un grupo alquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente en el cual un enlace de carbono o enlace de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de nitrógeno que se enlaza por lo menos a un grupo arilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente.
"Arilaminoalquilo sustituido" se refiere a un grupo arilaminoalquilo no sustituido como el definido arriba excepto cuando sea o bien el grupo alquilo del grupo arilaminoalquilo es un grupo alquilo sustituido como el definido arriba o bien el grupo arilo del grupo arilaminoalquilo es un grupo arilo sustituido excepto porque los enlaces al átomo de nitrógeno en todos los grupos arilaminoalquilo por sí mismos no califican a todos los grupos arilaminoalquilo como siendo sustituidos. No obstante, grupos arilaminoalquilo sustituidos incluyen grupos en los cuales el hidrógeno enlazado al átomo de nitrógeno del grupo se sustituye por un átomo que no es carbono y no es hidrógeno.
"Heterociclilaminoalquilo" se refiere a un grupo alquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente en el cual un enlace de carbono o de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de nitrógeno que se enlaza por lo menos a un grupo heterociclilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente.
"Heterociclilaminoalquilo sustituido" se refiere a grupos heterociclilaminoalquilo no sustituidos como los definidos arriba en los cuales el grupo heterociclilo es un grupo heterociclilo como el definido arriba y/o el grupo alquilo es un grupo alquilo sustituido como el definido arriba. Los enlaces al átomo de nitrógeno y todos los grupos heterociclilaminoalquilo por sí mismos no califican a todos los grupos heterociclilaminoalquilo como siendo sustituidos. Sin embargo, los grupos heterociclilaminoalquilo sustituidos sí incluyen grupos en los cuales el hidrógeno enlazado al átomo de nitrógeno del grupo se sustituye por un átomo que no es carbono y no es hidrógeno.
"Alquilaminoalcoxi" se refiere a un grupo alquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente en el que un enlace de carbono o de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de oxígeno que se enlaza al compuesto parental y en el cual otro enlace de carbono o de hidrógeno del grupo alquilo no sustituido se enlaza a un átomo de nitrógeno que se enlaza a un átomo de hidrógeno y un grupo alquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente.
"Alquilaminoalcoxi sustituido" se refiere a grupos alquilaminoalcoxi no sustituidos como los definidos arriba en los cuales un enlace a un átomo de carbono o hidrógeno del grupo alquilo enlazado al átomo de oxígeno que está enlazado al compuesto de origen se sustituye por uno o más enlaces a átomos que no son carbono y no son hidrógeno como los descritos arriba con respecto a grupos alquilo sustituidos y/o si el hidrógeno enlazado al grupo amino está enlazado a un átomo que no es carbono y no es hidrógeno y/o si el grupo alquilo enlazado al nitrógeno de la amina está enlazado a un átomo que no es carbono y no es hidrógeno como se describió arriba con respecto a los grupos alquilo sustituidos. La presencia de la funcionalidad amina y alcoxi en todos los grupos alquilaminoalcoxi en sí misma no califica a todos estos grupos como grupos alquilaminoalcoxi sustituidos.
"Dialquilaminoalcoxi no sustituido" se refiere a un grupo alquilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente en el cual un enlace de carbono o de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de oxígeno que se enlaza al compuesto de origen y en el cual otro enlace de carbono o de hidrógeno del grupo alquilo no sustituido se enlaza a un átomo de nitrógeno que se enlaza a otros dos grupos alquilo similares o diferentes no sustituidos tal como se ha definido anteriormente.
"Dialquilaminoalcoxi" se refiere a un grupo dialquilaminoalcoxi no sustituido tal como se ha definido anteriormente en el cual un enlace a un átomo de carbono o de hidrógeno del grupo alquilo enlazado al átomo de oxígeno que se enlaza al compuesto de origen se sustituye por uno o más enlaces a un átomo que no es carbono y no es hidrógeno como se ha mencionado anteriormente con respecto a los grupos alquilo sustituidos y/o si uno o más de los grupos alquilo enlazados al nitrógeno de la amina se enlaza a un átomo que no es carbono y no es hidrógeno como se ha descrito anteriormente con respecto a los grupos alquilo sustituidos. La presencia de la funcionalidad amina y alcoxi en todos los grupos dialquilaminoalcoxi no por sí misma califica a todos los grupos de este tipo como grupos dialquilaminoalcoxi sustituidos.
"Heterocicliloxi" se refiere a un grupo hidroxilo (-OH) en el cual el enlace al átomo del hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de anillo de un grupo heterociclilo no sustituido tal como se ha definido anteriormente.
"Heterocicliloxi sustituido" se refiere a un grupo hidroxilo (-OH) en el cual el enlace al átomo de hidrógeno se sustituye por un enlace a un átomo de anillo de un grupo heterociclilo sustituido tal como se ha definido anteriormente.
Grupos hidrofóbicos funcionales comprendiendo residuos aromáticos
Los residuos aromáticos pueden ser opcionalmente residuos de arilo o de heteroarilo sustituidos. "Arilo" incluye, pero no está limitado a, grupos tales como fenilo, bifenilo, antracenilo, naftenilo, por ejemplo. Aunque "arilo" incluye grupos conteniendo anillos condensados tales como naftaleno, no incluye grupos arilo que tienen otros grupos tales como grupos alquilo o halo enlazados a uno de los elementos de anillo, ya que grupos arilo tales como tolilo se consideran en la presente como grupos arilo sustituidos como los descritos en la presente abajo. Los grupos arilo pueden enlazarse a uno o más átomo(s) de carbono, átomo(s) de oxígeno, átomo(s) de nitrógeno, y/o átomo(s) de azufre en el ligando.
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"Grupo arilo sustituido" tiene el mismo significado con respecto a los grupos arilo no sustituidos que los grupos alquilo sustituidos tuvieron con respecto a los grupos alquilo no sustituidos. No obstante, un grupo arilo sustituido también incluye grupos arilo en los cuales uno de los carbonos aromáticos se enlaza a uno de los átomos que no son carbono o no son hidrógeno anteriormente descritos y también incluye grupos arilo en los cuales uno o más carbonos aromáticos del grupo arilo se enlaza a un grupo alquilo, alquenilo, o de alquinilo sustituido y/o no sustituido tal y como se define en la presente. Esto incluye disposiciones de enlace en las cuales dos átomos de carbono y un grupo arilo están enlazados a dos átomos de un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo para definir un sistema de anillos fusionados (por ejemplo, dihidronaftilo o tetrahidronaftilo).
Ejemplos de arilo y heteroarilo incluyen, por ejemplo, un grupo arilo (C_{6}-C_{12}) tal como un grupo fenilo, grupo tolilo, grupo naftilo, grupo bifenilo o similar, y un grupo heteroarilo (C_{4}-C_{5}), o grupo piridilo.
Asimismo, cuando el al menos un grupo funcional hidrofóbico comprende o consiste en un residuo aromático opcionalmente sustituido, el residuo aromático puede seleccionarse del grupo que consiste en residuos aromáticos que comprenden o que consisten en fluorenilo, pirroilo, furanilo, tienilo, tiofenilo, tiazolilo, isoindolilo, quinoleínilo, isoquinoleínilo, oxazolilo, y purinilo. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a tetrahidrotiofenil, tetrahidrotiofenilo oxidado con azufre, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolenilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2 pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H.6H-1,5,2-ditiazinilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, chromenilo, xantenilo, fenoxatiinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazoli, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, \beta-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenacinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isochromanil, chromanil, imidazolidinil, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperacinilo, indolinilo, quinuclidinilo, morfinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, e isatinoilo.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos enlazados a carbono pueden unirse en la posición 2, 3, 4, 5, ó 6 de una piridina, la posición 3, 4, 5, ó 6 de una piridazina, la posición 2, 4, 5, ó 6 de una pirimidina, la posición 2, 3, 5, ó 6 de una pirazina, la posición 2, 3, 4, ó 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrole, la posición 2, 4, ó 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, la posición 3, 4, ó 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol, la posición 2 ó 3 de una aziridina, la posición 2, 3, ó 4 de una azetidina, la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, ó 8 de una quinolina o la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, ó 8 de una isoquinolina. Todavía más típicamente, los heterociclos enlazados a carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5 piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, ó 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos enlazados a nitrógeno se enlazan en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, la posición 2 de un isoindol, o isoindolina, la posición 4 de una morfolina, y la posición 9 de un carbazole, o \beta-carbolina. Típicamente, los heterociclos enlazados a nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo, y 1-piperidinilo.
Como estará claro a partir de lo anterior, el grupo heteroaromático también puede seleccionarse del grupo que consiste en los grupos heteroaromáticos que comprenden o que consisten en compuestos heteroaromáticos fundidos opcionalmente sustituidos. Ejemplos incluyen p. ej. indol, benzotiofeno, benzotriazeno y quinolina.
En una forma de realización, el residuo aromático puede sustituirse por uno o más grupos alifáticos opcionalmente sustituidos, tales como los grupos alifáticos opcionalmente sustituidos mencionados en la presente justo arriba tal como el grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico (C_{1}-C_{10}), por ejemplo un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo isopropilo, un grupo n-butilo, un grupo t-butilo, un grupo n-amilo o un grupo n-hexilo.
El residuo aromático puede sustituirse por uno o más heteroátomos, o sustituirse por uno o más grupos aromáticos, o sustituirse por uno o más grupos heteroaromáticos.
Asimismo, el residuo aromático puede p. ej. sustituirse por un alquilo o arilo o heteroarilo sustituido, donde el residuo aromático, o el alquilo o el arilo o el heteroarilo se sustituye por un heteroátomo seleccionado de O, N, S y halógeno, o sustituido por uno o más grupos seleccionados de hidróxilo, amino, tiol, halógeno, carbonilo, ácido carboxílico, éter y éster.
Los grupos arilo y heteroarilo también pueden sustituirse, por ejemplo, por un átomo de halógeno, un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo alquiltio, o un grupo ariltio. Ejemplos del átomo de halógeno son un átomo de flúor, un átomo de clorina, un átomo de bromina, y un átomo de yodo. Ejemplos del grupo alkoxilo incluyen, por ejemplo, un grupo alcoxi (C_{1}-C_{4}) tal como un grupo metoxi, grupo etoxi, grupo n-propoxi, grupo t-butoxi o similar. Ejemplos del grupo alquiltio incluyen, por ejemplo, los compuestos del grupo alquilo (C_{1}-C_{10}), como se ha descrito anteriormente, y grupo tio, y ejemplos específicos de los mismos incluyen, por ejemplo, el grupo n-propiltio, el grupo butiltio o similar. Ejemplos del grupo ariltio incluyen, por ejemplo, estos compuestos del grupo arilo (C_{6}-C_{12}), como se ha descrito anteriormente, y un grupo tio, y ejemplos específicos de los mismos incluyen, por ejemplo, un grupo feniltio o similar. Ejemplos del grupo ariloxi, el cual puede estar presente en los grupos arilo, heteroarilo, e hidrocarburo saturado, por ejemplo, los comprendidos del grupo arilo (C_{6}-C_{12}), como se ha descrito anteriormente, y un grupo oxi, y ejemplos específicos de los mismos incluyen, por ejemplo o un grupo fenoxi.
El término "heterociclilo" como se utiliza en este caso se refiere a ambos compuestos de anillo aromáticos y no aromáticos incluyendo compuestos de anillo monocíclicos, bicíclicos, y policíclicos tales como, pero no limitados a, quinuclidilo, conteniendo 3 o más elementos de anillo de los cuales uno o más son un heteroátomo tal como, pero no limitado a, N, O, y S. Aunque "heterociclilo" incluye anillos heterocíclicos condensados tales como benzimidazolilo, no incluye grupos heterociclilo que tengan otros grupos tales como grupos alquilo o halo enlazados a uno de los elementos de anillo como compuestos tales como 2-metilbenzimidazolilo son grupos heterociclilo sustituido. Ejemplos de grupos heterociclilo incluyen, pero no se limitan a: anillos de 3 a 8 miembros insaturados que contienen de 1 a 4 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a pirrolilo, pirrolinilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, dihidropiridilo, pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo, triazolilo (por ejemplo 4H-1,2,4-triazolilo, 1H-1,2,3-triazolilo, 2H-1,2,3-triazolilo, etc.), tetrazolilo, (por ejemplo 1H-tetrazolilo, 2H-tetrazolilo, etc.); anillos de 3 a 8 miembros saturados que contienen de 1 a 4 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, pirrolidinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo; grupos heterocíclicos condensados insaturados que contienen de 1 a 4 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, indolilo, isoindolilo, indolinilo, indolizinilo, bencimidazolilo, quinolilo, isoquinolilo, indazolilo, benzotrazolilo; anillos de 3 a 8 miembros insaturados que contienen de 1 a 2 átomos de oxígeno y de 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, oxazolilo, sioxazolilo, oxadiazolilo (por ejemplo 1,2,4-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, etc.); anillos de 3 a 8 miembros saturados que contienen de 1 a 2 átomos de oxígeno y de 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, morfolinilo; grupos heterocíclicos condensados insaturados conteniendo de 1 a 2 átomos de oxígeno y de 1 a 3 átomos de nitrógeno, por ejemplo, benzoxazolilo, benzoxadiazolilo, benzoxazinilo (p. ej. 2H-1,4-benzoxazinilo, etc.); anillos de 3 a 8 miembros insaturados que contienen de 1 a 3 átomos de azufre y de 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo (por ejemplo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, etc) y anillos de 3 a 8 miembros saturados que contienen de 1 a 2 átomos de azufre y de 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, tiazolodinilo; anillos de 3 a 8 miembros insaturados y saturados que contienen de 1 a 2 átomos de azufre tales como, pero no limitados a, tienilo, dihidroditilinilo, dihidroditionilo, tetrahidrotiofeno, tetrahidrotiopiranol; anillos heterocíciclos condensados insaturados que contienen de 1 a 2 átomos de azufre y de 1 a 3 átomos de nitrógeno tales como, pero no limitados a, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzotiazinilo (por ejemplo 2H-1,4-benzotiazinilo), dihidrobenzotiazinilo (por ejemplo 2H-3,4-dihidrobenzotiazinilo, etc.), anillos de 3 a 8 miembros insaturados que contienen átomos de oxígeno tales como, pero no limitados a furilo; anillos insaturado condensados heterocíclicos contienen 1 a 2 átomos de oxígeno tal como benzodioxolil (p. ej. 1,3-benzodioxoil, etc.); anillos heterocíclicos condensados insaturados que contienen de 1 a 2 átomos de oxígeno tales como benzodioxolilo (por ejemplo, 1,3-benzodioxoilo, etc.); anillos de 3 a 8 miembros insaturados que contienen un átomo de oxígeno y de 1 a 2 átomos de azufre tales como, pero no limitados a, dihidrooxatiinilo; anillos de 3 a 8 miembros saturados que contienen 1 a 2 átomos de oxígeno y 1 a 2 átomos de azufre tales como 1,4-oxatiano; anillos condensados insaturados que contienen de 1 a 2 átomos de azufre tales como benzotienilo, benzoditiinilo y anillos heterocíclicos condensados insaturados que contienen un átomo de oxígeno y de 1 a 2 átomos de oxígeno tales como benzoxatiinilo. El grupo heterociclilo también incluye los anteriormente descritos en los cuales uno o más átomos S en el anillo está enlazado doblemente a uno o dos átomos de oxígeno (sulfóxidos y sulfonas). Por ejemplo, los grupos heterociclilo incluyen tetrahidrotiofeno, óxido de tetrahidrotiofeno, y 1,1-dioxido de tetrahidrotiofeno. Los grupos heterociclilo preferidos contienen 5 ó 6 elementos de anillo. Los grupos heterociclilo que más se prefieren incluyen morfolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, imidazol, pirazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, tetrazol, tiomorfolina, tiomorfolina en los cuales el átomo S de la tiomorfolina está enlazado a uno o más átomos O, pirrol, homopiperazina, oxazolidin-2-ona, pirrolidin-2-ona, oxazol, quinuclidina, tiazol, isoxazol, furano y tetrahidrofurano.
"Heterociclilo sustituido" se refiere a un grupo heterociclilo no sustituido como el definido arriba en el cual uno de los miembros de anillo está enlazado a un átomo que no es hidrógeno tal como el anteriormente descrito con respecto a los grupos alquilo sustituidos y grupos arilo sustituidos. Ejemplos, incluyen, pero no se limitan a, 2-metilbenzimidazolilo, 5-metilbenzimidazolilo, 5-clorobenztiazolilo, 1-metilpiperacinilo y 2-cloropiridilo.
"Heterociclilalquilo" se refiere a grupos alquilo no sustituidos tales como se ha definido anteriormente en los cuales un enlace de hidrógeno o carbono del grupo alquilo no sustituido se sustituye por un enlace a un grupo heterociclilo tal como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, el metilo (-CH_{3}) es un grupo alquilo no sustituido. Si un átomo de hidrógeno del grupo metilo se reemplaza por un enlace heterociclilo, tal como si el carbono de metilo estuviera enlazado al carbono 2 de piridina (uno de los carbonos enlazados al N de la piridina) o carbonos 3 ó 4 de la piridina, entonces el compuesto es un grupo heterociclilalquilo no sustituido.
"Heterociclilalquilo sustituido" tiene el mismo significado con respecto a grupos heterociclilalquilo no sustituidos que los grupos aralquilo sustituidos tuvieron con respecto a los grupos aralquilo no sustituidos. Sin embargo, un grupo heterociclilalquilo sustituido incluye también grupos en los cuales un átomo que no es hidrógeno se enlaza a un heteroátomo en el grupo heterociclilo del grupo heterociclilaquilo tal como, pero no limitado a, un átomo de nitrógeno en el anillo de piperidina de un grupo piperidinilalquilo.
En una forma de realización particular, el residuo aromático opcionalmente sustituido puede seleccionarse del grupo que consiste en residuos aromáticos y heteroaromáticos comprendiendo o que consisten en fenilo, naftilo, fluorenilo, piridina, furano, tiofeno, indol, isoindol, quinolina, isoquinolina, oxazol, piramidina y purina.
Los residuos aromáticos sustituidos también pueden sustituirse por uno o más grupos alifáticos, o sustituirse por uno o más heteroátomos, o sustituirse por uno o más grupos aromáticos, o sustituirse con uno o más grupos heteroaromáticos.
El al lo menos un grupo funcional hidrofóbico también puede comprender o consistir en un residuo heteroaromático opcionalmente sustituido, por ejemplo, un residuo heteroaromático seleccionado del grupo que consiste en residuos heteroaromáticos que comprenden o consisten en furano, pirrol y tiofeno, o un residuo heteroaromático seleccionado del grupo que consiste en residuos heteroaromáticos que comprenden o consisten en compuestos heteroaromáticos fusionados, tales como un compuesto heteroaromático fusionado seleccionado del grupo que consiste en indol, benzotiofeno, benzotriazeno y quinolina.
En las formas de realización anteriores, el residuo aromático puede sustituirse por alquilo o arilo o heteroarilo.
Asimismo, el residuo aromático, o el alquilo, o el arilo o el heteroarilo pueden sustituirse por un heteroátomo seleccionado de O, N, S y halógeno y/o el residuo aromático, o el alquilo o el arilo o el heteroarilo pueden sustituirse por uno o más grupos seleccionados de hidroxilo, amino, tiol, halógeno, carbonilo, ácido carboxílico, éter y éster.
En una forma de realización, el ligando comprende al menos un residuo de aminoácido comprendiendo un grupo hidrofóbico, p. ej. un grupo hidrofóbico que comprende o consiste en un grupo aromático, o un grupo hidrofóbico que comprende o consiste en un grupo alifático.
Grupos funcionales catiónicos
Los grupos funcionales catiónicos están cargados positivamente ya sea debido a una carga positiva permanente o debido a una asociación con un ión de H bajo condiciones fisiológicas normales. Los grupos funcionales catiónicos son atraídos por solución acuosa para de esta manera buscar las posiciones en la superficie en conformación de un ligando cuando el ligando está en un medio acuoso bajo condiciones fisiológicas normales. Los grupos funcionales catiónicos buscarán grupos aniónicos de compañeros de enlace a ligando cuando el ligando esté enlazado con un compañero de enlace bajo condiciones fisiológicas normales.
El grupo catiónico funcional se selecciona preferiblemente de grupos catiónicos comprendiendo uno o más nitrógeno(s) cargado(s) positivamente, uno o más átomo(s) de fósforo y/o uno o más átomo(s) de azufre.
Los grupos catiónicos que se prefieren comprenden un nitrógeno permanente cargado positivamente de grupos tales como por ejemplo alquilamonio, tal como trimetilamonio, o trietilamonio, o dimetilamonio, o bencildimetilamonio, o guanidinio, o un nitrógeno cargado positivamente de heterociclos cargados positivamente, tales como imidazolinio, piperidinio y pirrolidinio. El guanidinio se prefiere particularmente.
Otros grupos catiónicos que se prefieren son las aminas mono- y disustituidas, tales como monoalquilaminas, dialquilaminas, aminas heterocíclicas y aminas aromáticas las cuales tienen una carga positiva parcial en soluciones acuosas con pH en la escala de 3-8, en particular en la escala de 3-7.
El nitrógeno cargado positivamente también puede donarse por un residuo de aminoácido, tal como lisina, arginina, histidina, ornitina, citrulina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopropiónico, ácido diaminopentanoico, ácido diaminohexanoico, ácido diaminopimélico, homoarginina, homocitrullina, p-aminofenilalanina y 3-aminotirosina. La arginina es particularmente preferida.
La cadena lateral de un aminoácido puede proporcionar uno o más grupo(s) hidrofóbico(s) funcional(es) y uno o más grupo(s) catiónico(s) funcional(es). Normalmente, cuando los aminoácidos están suministrando dichos grupos funcionales, al menos un grupo funcional hidrofóbico y al menos un grupo funcional catiónico se proporcionan por diferentes aminoácidos del ligando. Además de los aminoácidos, el ligando puede comprender otros residuos de ligando como se describe en este caso abajo más detalladamente.
El término "aminoácido" dentro del campo de la presente invención se usa en su sentido más amplio y se entiende que incluye L-aminoácidos que ocurren naturalmente o residuos de los mismos. En la presente se usan las abreviaturas comúnmente usadas de una y tres letras para los aminoácidos que ocurren naturalmente (Lehninger, Biocheistry, 2Aed., págs. 71 92, (Worth Publishers: Nueva York, 1975). El término también incluye D-aminoácidos (y residuos de los mismos) al igual que aminoácidos modificados químicamente, así como análogos de aminoácidos, incluyendo los aminoácidos que ocurren de forma natural que no se suelen incluir en proteínas, tales como norleucina, así como compuestos sintetizados químicamente teniendo propiedades conocidas en la técnica por ser características de un aminoácido.
Por ejemplo, los análogos o miméticos de fenilalanina o prolina, los cuales permiten la misma restricción conformacional de un ligando como Phe o Pro naturales, se incluyen dentro de la definición de aminoácido. Estos análogos y miméticos se denominan en la presente como "equivalentes funcionales" de un aminoácido. Otros ejemplos de aminoácidos están catalogados por Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5, p. 341 (Academic Press, Inc.: N.Y. 1983).
Los aminoácidos están enlazados típicamente por enlaces de amida, pero otros enlaces tales como p. ej. cualquiera o más enlaces seleccionados de -NHN(R)CO-; -NHC(R)CO-; -NHC(RR')CO-; -NHC(=CHR)CO-; -NHC_{6}H_{4}Co;
-NHCH_{2} CHRCO-; -NHCHRCH_{2}Co; -COCH_{2}-; -COS-; -CONR-; COO; -CSNH-; -CH_{2}NH-; -CH_{2}CH_{2}-; -CH_{2}S;
-CH_{2}SO; -CH_{2}SO_{2}-; -CH(CH_{3})S-; -CH=CH-; -NHCO-; -NHCONH-; -CONHO-; -C(=CH_{2})CH_{2}-; -PO_{2}^{-}NH-; -PO_{2}^{-}
CH_{2}-; -PO_{2}^{-}CH_{2}N^{+}-; -SO_{2}NH- también pueden enlazar residuos de aminoácidos de los ligandos según la invención. R (y R') significa un grupo funcional, tal como p. ej. un grupo funcional hidrofóbico o un grupo catiónico, u otra entidad estructural que enlace dichos grupos anteriormente mencionados. El enlace que más se prefiere actualmente entre "aminoácidos" es el enlace de amida.
Ejemplos de aminoácidos que son generalmente capaces de incorporarse en ligandos según la presente invención están catalogados en la presente abajo:
Glicilo; ácidos aminopolicarboxílicos, por ejemplo, ácido aspártico, ácido p-hidroxiaspártico, ácido glutámico, ácido \beta-hidroxibutámico, ácido \beta-metilaspártico, ácido \beta-metilglutámico, ácido \beta,\beta-dimetilaspártico, ácido \gamma-hidroxiglutámico, ácido \beta,\gamma-dihidroxiglutámico, ácido \beta-fenilglutámico, ácido \gamma-metilenglutámico, ácido 3-aminoadípico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2-aminosubérico y residuos de ácido 2-aminosebácico; amidas de aminoácidos tales como glutaminilo y asparaginilo; ácidos monocarboxílicos poliamino o polibásicos tales como arginina, lisina, \beta-aminoalanina, \gamma-aminobutirina, ornitina, citrulina, 5-hidroxi-2,6-homoarginina, diaminohexanoico homocitrulina, (comúnmente, ácido hidroxilisina, incluyendo alohidroxilisina) y residuos de ácido diaminobutírico; otros residuos de aminoácido básicos tales como histidinilo; ácidos diaminodicarboxílicos tales como residuos de ácido \alpha,\alpha'-diaminosuccínico, ácido \alpha,\alpha'-diamonoglutárico, ácido \alpha,\alpha'-diaminoadípico, ácido \alpha,\alpha'-diamonopimélico, ácido \alpha,\alpha'-diamino-\beta-hydroxypimeiico, ácido \alpha,\alpha'-diaminosubérico, ácido \alpha,\alpha'-diaminoazelaico y ácido \alpha,\alpha'-diaminosebácico; iminoácidos tales como prolina, ácido 4- ó 3-hidroxi-2-pirrolidin-carboxílico (comúnmente, hidroxiprolina, incluyendo alohidroxiprolina), \gamma-metilprolina, ácido pipecólico, ácido 5-hidroxipipecólico, -N([CH_{2}]_{n}COOR_{RR})_{2}, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 y R_{PR} es -H o un grupo protector y ácido acetidin-2-carboxílico; un mono- o dialquilaminoácido (típicamente de C_{1}-C_{25} ramificado o normal) tal como alanina, valina, leucina, alilglicina, butirina, norvalina, norleucina, heptilina, \alpha-metilserina, ácido \alpha-amino-\alpha-metil-y-hidroxivalérico, ácido \alpha-amino-\alpha-metil-6-hidroxivalérico, ácido \alpha-amino-\alpha-metil-\varepsilon-hidroxicaproico, isovalina, ácido \alpha-metilglutámico, ácido \alpha-aminoisobutírico, ácido \alpha-aminodietilacético, ácido \alpha-aminodiisopropilacético, ácido \alpha-aminodi-n-propilacético, ácido \alpha-aminodiisobutilacético, ácido \alpha-aminodi-n-butilacético, ácido \alpha-aminoetilisopropilacético, ácido \alpha-amino-n-propilacético, ácido \alpha-aminodiisoamiacético, ácido \alpha-metilaspártico, ácido \alpha-metilglutámico, ácido 1-aminociclopropan-1-carboxílico; isoleucina, aloisoleucina, ter-leucina, \beta-metiltriptófano y residuos de ácido \alpha-amino-o-etil-\beta-fenilpropiónico; \beta-fenilserinilo; ácidos alifáticos \alpha-amino-\beta-hidroxi tales como residuos de serina, \beta-hidroxileucina, \beta-hidroxinorleucina, \beta-hidroxinorvalina y ácido \alpha-amino-\alpha-hidroxiesteárico; ácidos \alpha-Amino, \alpha-, \gamma-, \delta- ó \varepsilon-hidroxi tales como residuos de homoserina, \gamma-hidroxinorvalina, hidroxinorleucina, \alpha-hidroxinorvalina y \varepsilon-hidroxinorleucina; canavinilo y canalinilo; \gamma-hidroxiornitinilo; ácidos 2-hexosamínicos tales como residuos de ácido D-glucosamínico o ácido D-galactosamínico; \alpha-amino-\beta-tioles, tales como residuos de penicilamina, \beta-tiolnorvalina o \beta-tiolbutirina; otros residuos de aminoácido que contienen azufre incluyendo residuos de cisteína; homocisteína; \beta-fenilmetionina; metionina; sulfóxido de S-alil-(L)-cisteína; 2-tiolhistidina; cistationina; y éteres tiólicos de cisteína u homocisteína; fenilalanina, triptófano y aminoácidos de anillo sustituidos tales como los fenil- o ciclohexilaminoácidos, ácido \alpha-aminofenilacético, ácido \alpha-aminociclohexilacético y ácido \alpha-amino-\beta-ciclohexilpropiónico; análogos de fenilalanina y derivados que comprenden arilo, alquilo inferior (C_{1}-C_{6}), hidroxi, guanidino, oxialquiléter, nitro, azufre o fenilo sustituido con halo (por ejemplo, tirosina, metiltirosina y o-cloro, p-cloro, 3,4-dicloro, o-, m- o p-metil-, 2,4,6-trimetil-, 2-etoxi-5-nitro, 2-hidroxi-5-nitro y p-nitro-fenilalanina); furil-, enil-, piridil-, pirimidinil-, purina o naftilalaninas; y análogos y derivados de triptófano incluyendo quinurenina, 3-hidroxiquinurenina, 2-hidroxitriptófano y 4-carboxitriptófano; residuos de aminoácidos \alpha-amino sustituidos incluyendo residuos de sarcosina (N-metilglicina), N-bencilglicina, N-metilalanina, N-bencilalanina, N-metilfenilalanina, N-bencilfenilalanina, N-metilvalina y N-bencilvalina; y residuos de aminoácidos \alpha-hidroxi y \alpha-hidroxi sustituidos incluyendo serina, treonina, alotreonina, fosfoserina y residuos de fosfotreonina. También son de interés los aminoácidos hidrofóbicos tales como mono- o di-alquilo o arilaminoácidos o cicloalquilaminoácidos.
Ligandos preferidos
Se indican los residuos de ligando seleccionado como los listados a continuación en la presente:
PPC: ácido 4-fenilpiperidino-4-carboxílico
DAP: ácido diaminopropiónico
L-Om: L-Ornitina
DPA: ácido 2,4-di-ter-pentilfenoxiacético
DMBA: ácido 3,5-dimetoxibenzoico
TMPPA: ácido 3-(3,4,5-trimetoxifenil)propiónico
DBHPA: ácido 3-(3,5-di-ter-butil-4hidrox¡fenil)propiónico
IH2NA: ácido 1-hidroxi-2-naftoico
DPPA: ácido 3,3-difenilpropiónico
SAA: ácido salicílico
DBBA: ácido 3,5-di-ter-butilbenzoico
DPPBA: ácido 4-(2,4-di-ter-pentilfenoxi)butírico
TEBA: ácido 3,4,5 trietoxibenzoico
PCAA: ácido \alpha-fenilciclopentanoacético
MDCA: ácido 3,4-(metilendioxi)cinnámico
Gly: glicina
L-Phe: L-Fenilalanina
L-Arg: L-Arginina
L-His: L-Histidina
L-Trp: L-Triptófano
L-Pro: L-Prolina
L-Asn: L-Asparagina
L-Lys: L-Lisina
L-Asp: ácido L-Aspártico
D-Phe: D-Fenilalanina
D-Arg: D-Arginina
D-Tyr: D-Tirosina
D-Ser: D-Serina
D-Trp: D-Triptófano
D-Pro: D-Prolina
D-Leu: D-Leucina
AHX: ácido 6-aminohexanoico
AIB: ácido o-aminoisobutírico
DBHBA: ácido 3,5-di-ter-butil-4-hidroxibenzoico
INA: ácido isonipectoico
Nle: L-Norleucina
PPC: ácido 4-fenil-piperidin-4-carboxílico
SAA: ácido salicílico
3HBA: ácido 3-hidroxibenzoico
4HBA: ácido 4-hidroxibenzoico
Cada ligando comprende uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s), donde al menos un grupo funcional hidrofóbico se separa de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlace de 5 \ring{A} a 20 \ring{A}, y donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da.
El ligando de afinidad comprende o consiste en los residuos unidos covalentemente X_{1}-X_{2}-X_{3}, donde opcionalmente X_{1}, X_{2} y/o X_{3}, en particular X_{1} y/o X_{3}, se enlaza con un enlazador, L.
Preferiblemente X_{1}, X_{2}, X_{3}, y el enlazador opcional son preferiblemente moléculas altamente estables, las cuales pueden soportar una exposición repetida a condiciones químicas agresivas (p. ej. 1 M de ácido fuerte o 1 M de base fuerte) y condiciones biológicas (p. ej. alta actividad proteasa). Asimismo, los enlaces respectivos entre cada uno de X_{1}, X_{2}, X_{3}, y el enlazador opcional son altamente estables y pueden soportar condiciones químicas y biológicas agresivas.
El residuo X_{1} preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en Arg, Phe, PPC, DBHBA, SAA, DAP, DAB, (DBHBA)_{2}-DAP, (MDCA)_{2}-DAP, DPBBA, DBBA, PCAA, DPPAA, Trp, TMPPA, DBHPA, donde cada elemento opcionalmente se selecciona además de un residuo aislado y ópticamente activo y una mezcla racémica comprendiendo ambos isómeros ópticamente activos del mismo residuo. En una variante preferida, X_{1} se selecciona del grupo que consiste en L-Arg, D-Lys, D-Phe, D-Pro, INA, PPC, DBHBA, 3HBA, 4HBA y SAA.
El residuo X_{2} preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Leu, Lys, Phe, Pro, PPC, DAP, DAB, His, Trp, Tyr, Ser, donde cada elemento se selecciona opcionalmente además de un residuo aislado y ópticamente activo y una mezcla racémica comprendiendo ambos isómeros ópticamente activos del mismo residuo. En una variante preferida, X_{2} se selecciona del grupo que consiste en L-Arg, L-Asn, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro, AIB, AHX, INA, Nle y PPC.
El residuo X_{3} se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en Arg, Asn, Pro, PPC, Asp, Orn, (1H2NA)DAP donde cada elemento se selecciona opcionalmente además de un residuo aislado y ópticamente activo y una mezcla racémica comprendiendo ambos isómeros ópticamente activos del mismo residuo. En particular, X_{3} se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en L-Arg, L-Asn, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro y PPC.
Un conjunto actualmente prometedor de ligandos que tienen afinidad para un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, son los ligandos que comprenden o consisten en uno o más de los conjuntos (que corresponden a X_{1}-X_{2}-X_{3}):
D-Phe-(L)Arg-(L)Arg
L-Arg-D-Phe-(L)Arg
PPC-D-Pro-(L)Arg
PPC-D-Leu-PPC
INA-D-Phe-PPC
PPC-Aib-PPC
D-Phe-(L)Arg-(L)Arg
L-Arg-D-Phe-(L)Arg
L-Arg-(L)Arg-D-Phe
PPC-(L)Arg-D-Pro
D-Pro-PPC-(L)Arg
L-Arg-D-Pro-PPC
D-Lys-INA-(L)Arg
INA-(L)Arg-D-Lys
PPC-AHX-PPC
PPC-Nle-PPC
SAA-(L)Arg-(L)Pro
SAA-(L)Pro-(L)Arg
DBHBA-(L)Arg-(L)Asn
DBHBA-(L)Asn-(L)Arg
3HBA-(L)Arg-(L)Pro
3HBA-(L)Pro-(L)Arg
4HBA-(L)Arg-(L)Pro
4HBA-(L)Pro-(L)Arg
\vskip1.000000\baselineskip
El ligando consiste en menos de 5, así como menos de 4 residuos, por ejemplo 3 residuos seleccionados del grupo que consiste en D-Leu; D-Lys; D-Phe; D-Pro; L-Arg; L-Asn; L-Pro; AHX; AIB; DBHBA; INA; Nle; PPC; SAA; 3HBA y 4HBA. El ligando puede de esta manera consistir en 3 residuos, X_{1}-X_{2}-X_{3}, seleccionados individualmente del grupo que consiste en D-Leu; D-Lys; D-Phe; D-Pro; L-Arg; L-Asn; L-Pro; AHX; AIB; DBHBA; INA; Nle; PPC; SAA; 3HBA y 4HBA.
Cuando el ligando comprende o consiste en 3 residuos, X_{1}-X_{2}-X_{3},
X_{1} se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en D-Lys; D-Phe; D-Pro; L-Arg; DBHBA; INA; PPC; SAA; 3HBA y 4HBA,
X_{2} se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en D-Leu; D-Lys; D-Phe; D-pro; L-Arg; L-Asn; L-Pro; AHX; AIB; INA; Nle y PPC; y
X_{3} se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en D-Lys; D-Phe; D-Pro; L-Arg; L-Asn; L-Pro y PPC.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización, el ligando comprende o consiste en 3 residuos unidos covalentemente, X_{1}-X_{2}-X_{3},
donde dichos residuos unidos covalentemente además se unen covalentemente al residuo de enlazador L de la entidad L-PM, donde PM es el material de soporte sólido, preferiblemente una matriz de polímero opcionalmente en una forma reticulada y/o granulada,
donde X_{1} es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,
donde X_{2} es un aminoácido natural o no natural ya sea en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, con la condición de que X_{2} no sea un residuo de treonina, y
donde X_{3} es un aminoácido natural o no natural ya sea en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,
donde al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} comprende un grupo funcional catiónico, y
donde al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} comprende unos grupos funcionales hidrofóbicos
donde X_{1} se selecciona de L-Arg, D-Lys, D-Phe, D-Pro, INA, PPC, DBHBA, 3HBA, 4HBA y SAA;
donde X_{2} se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro, AIB, AHX, INA, NLE y PPC; y
donde X_{3} se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro y PPC.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización prometedora, el ligando comprendiendo o consistiendo en 3 residuos unidos covalentemente, X_{1}-X_{2}-X_{3},
donde dichos residuos unidos covalentemente están unidos covalentemente a un enlazador L de la entidad L-PM,
donde X_{1} es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,
\newpage
donde X_{2} es un aminoácido natural o no natural ya sea en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, con la condición de que X_{2} no sea un residuo de treonina, y
donde X_{3} es un aminoácido natural o no natural ya sea en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,
donde al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} comprende un grupo funcional catiónico, y
donde al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} comprende unos grupos funcionales hidrofóbicos
donde X_{1} se selecciona de L-Arg, D-Lys, D-Phe, D-Pro, INA, PPC, DBHBA, 3HBA, 4HBA y SAA;
donde X_{2} se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro, AIB, AHX, INA, NLE y PPC; y
donde X_{3} se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro y PPC.
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En una forma de realización, el enlazador L fijado a la matriz de polímero es divisible por ácidos, bases, temperatura, luz, o por contacto con un reactivo químico. Como se explicó antes, el enlazador fijado a la matriz de polímero puede ser uno seleccionado de ácido (3-formilindol-1-il)acético, 2,4-Dimetoxi-4'-hidroxi-benzofenona, HMPA, HMPB, HMPPA, ácido de Rink, amida de Rink, enlazador de Knorr, enlazador de PAL, enlazador de DCHD, enlazador de Wang y enlazador de Tritilo. Los ligandos enlazados a una matriz de polímero mediante un enlazador divisible pueden usarse con objetivos analíticos, p. ej. para aplicaciones de diagnóstico.
En una forma de realización de la presente invención, X_{1}, X_{2}, y X_{3} se seleccionan del grupo de aminoácidos naturales y sus estereoisómeros.
Se ha descubierto que la inclusión de al menos un aminoácido comprendiendo un grupo guanidino o amino de cadena lateral, en particular grupos de guanidino, proporcionan típicamente propiedades ventajosas con respecto a la capacidad enlazante. Por lo tanto, los aminoácidos particularmente pertinentes para incluir en los ligandos son arginina, homoarginina, lisina, homolisina y omitina, en particular arginina y homoarginina.
Una subclase de ligandos particularmente prometedora es una en la que los ligandos comprendan dos fracciones de arginina. Por tanto, los ligandos particularmente favorecidos dentro de esta forma de realización son,
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1 
\vskip1.000000\baselineskip
H_{2}N-(D)Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH
y
2
H_{2}N-(L)Arg-(D)Phe-(L)Arg-Gly-OH.
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En otra forma de realización X_{1}, X_{2}, y X_{3} se seleccionan del grupo de aminoácidos naturales y no naturales.
Por tanto, para otra subclase de ligandos también prometedora,
X_{1} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Phe, PPC, DBHBA, SAA, DAP, DAB, (DBHBA)_{2}-DAP, (MDCA)2-DAP, DPBBA, DBBA, PCAA, DPPAA, Trp, TMPPA, y DBHPA,
X_{2} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Leu, Lys, Phe, Pro, PPC, DAP, DAB, His, Trp, Tyr, y Ser,
X_{3} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Pro, PPC, Asp, Orn, y (1H2NA)Dap.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ligando particularmente favorecido dentro de esta subclase es:
3
HN-PPC-(D)Pro-(L)Arg-Gly-OH
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En otra subclase de ligandos, cada ligando comprende uno o más grupos fenilo o naftilo sustituidos o no sustituidos y una o más aminas o guanidinas primarias.
Los ligandos particularmente favorecidos dentro de esta forma de realización son,
4
DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH,
DBBA-His-Arg-Gly-OH,
5
DPPBA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH,
6
PCAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH,
7
DPPBA-(L)Lys-(L)Arg-Gly-OH
8
SAA-(L)Arg-(L)Pro-Gly-OH
9
SAA-(L)Pro-(L)Arg-Gly-OH
10
DBHBA-(L)Arg-(L)Asn-Gly-OH
\vskip1.000000\baselineskip
11
DBHBA-(L)Asn-(L)Arg-Gly-OH
\vskip1.000000\baselineskip
12
DPPBA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH
\vskip1.000000\baselineskip
13
(MDCA)_{2}-DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH
\vskip1.000000\baselineskip
14
(MDCA)_{2}-DAP-(L)Arg-(L)Asp-Gly-OH
\vskip1.000000\baselineskip
15
DPPAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH
16
DPPAA-PPC-(L)Arg-Gly-OH
17
DBHBA-(D)Phe-(D)Arg-Gly-OH
18
DPPAA-(D)Tyr-(D)Arg-Gly-OH
19
(DPPA)_{2}-DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH
20
(DBHBA)_{2}-DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH,
DBHBA-DAP-Arg-Gly-OH,
DBHBA-DAP-Arg-Arg-Gly-OH,
(DBHBA)_{2}-DAP-Arg-Gly-OH,
(DBHBA)_{2}-DAP-Arg-Arg-Gly-OH,
21
TMPPA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH
22
DBHPA-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH
Material de soporte sólido
Los ligandos según la invención se inmovilizan covalentemente a un material de soporte sólido, tal como una resina de polímero, una superficie de un material polimérico, una superficie de vidrio, etc, y pueden utilizarse para depurar y/o aislar anticuerpos, así como anticuerpos monoclonales.
El material de soporte sólido típicamente comprende una matriz de polímero, p. ej. una matriz de polímero reticulada. Muy a menudo, la matriz de polímero se granula, de forma alternativa, la matriz de polímero se prepara como una unidad monolítica. Preferiblemente, al menos la superficie de la matriz de polímero granulada comprende fracciones hidrofílicas.
\newpage
Por tanto, el material de soporte sólido está típicamente en forma de una resina, un monolito, un filtro, una placa, así como una microdisposición, una fibra, un sensor, así como un cantiléver, un sensor de resonancia plasmódica de superficie, o una microbalanza de cristal de cuarzo.
Una resina es un material sólido poroso usado para separar compuestos en un fluido. Las resinas pueden ser polímeros reticulados, materiales cerámicos, así como óxidos inorgánicos, p. ej. óxido alumínico, óxido silíceo. Las resinas se proporcionan como partículas, tales como partículas esféricas o partículas irregulares.
Los ligandos se caracterizan por una capacidad enlazante que es preferiblemente mayor que 5 mg de anticuerpo por ml de resina mojada, tal como mayor que 6 mg de anticuerpo por ml de resina, por ejemplo mayor que 7 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 8 mg de anticuerpo por mi de resina, por ejemplo mayor que 9 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 10 mg de anticuerpo por ml de resina, por ejemplo mayor que 12 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 14 mg de anticuerpo por ml de resina, por ejemplo mayor que 16 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 18 mg de anticuerpo por ml de resina, por ejemplo mayor que 20 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 22 mg de anticuerpo por ml de resina, por ejemplo mayor que 24 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 26 mg de anticuerpo por ml de resina, por ejemplo mayor que 28 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 30 mg de anticuerpo por ml de resina, por ejemplo mayor que 35 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 40 mg de anticuerpo por ml de resina, por ejemplo mayor que 45 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como mayor que 50 mg de anticuerpo por ml de resina, tal como p. ej. como máximo 500 mg de anticuerpo por ml de resina.
La expresión "capacidad de enlace" denota la capacidad de la resina para enlazar un compuesto objetivo, tal como p. ej. un anticuerpo. La capacidad de enlace se da en mg de objetivo (p. ej. de anticuerpo) por ml de resina (u otra forma de material granulado), y puede medirse pasando una solución objetivo pura con una concentración conocida a través de la resina y midiendo el volumen hasta la ruptura del compuesto objetivo. La capacidad de enlace se calcula entonces como el volumen de ruptura multiplicado por la concentración y dividido por el volumen de lecho. Como se utiliza en este caso, la capacidad de enlace designa la capacidad de la resina para unir un anticuerpo. La capacidad de enlace se da en mg de anticuerpo por mililitro de resina y puede medirse al pasar una solución regulada acuosa (50 mM de Na-Fosfato, a pH=7.0) del anticuerpo puro con una concentración conocida y registrando el desarrollo de la absorbancia de UV (280 nm) de la solución que sale de la resina. El volumen de ruptura es el volumen de solución que ha salido de la resina en el punto donde la absorbancia UV ha alcanzado un 5% de su valor terminal. La capacidad de enlace se calcula entonces como el volumen de ruptura multiplicado por la concentración del anticuerpo en la solución de alimentación y dividido por el volumen de lecho.
Cuando el ligando se fija a la superficie de un material esencialmente no poroso, tal como por ejemplo, una superficie de una disposición o una superficie de un sensor, la capacidad de enlace del ligando se mide como masa de enlace de proteína por área de superficie. Los ligandos se caracterizan por una capacidad de enlace que es preferiblemente mayor que 1 ng de anticuerpo por cm^{2}, tal como mayor que 5 ng de anticuerpo por cm^{2}, por ejemplo mayor que 10 ng de anticuerpo por cm^{2}, tal como mayor que 50 ng de anticuerpo por cm^{2}, por ejemplo mayor que 100 ng de anticuerpo por cm^{2}.
Ejemplos adecuados de resinas se describen en la presente abajo más detalladamente.
Matrices poliméricas
El ligando puede unirse covalentemente a un soporte sólido tal como una matriz porosa inorgánica o una matriz polimérica, opcionalmente en una forma reticulada y/o granulada o en una entidad porosa monolítica. Preferiblemente, los poros de la matriz polimérica son suficientemente amplios para que la proteína objetivo se difunda a través de dichos poros e interactúe con el ligando en la superficie interna de los poros. Para un anticuerpo monoclonal con masa molar de aprox. 150 kDa se prefiere un diámetro poroso medio de 50-200 nm, tal como de aprox. 100 nm. Están disponibles varias resinas poliméricas adecuadas disponibles comercialmente, p. ej. Sepharose^{TM}, Fractogel^{TM}, CIMGEL^{TM}, Toyopearl.
La matriz polimérica granulada y opcionalmente reticulada en una modalidad comprende una pluralidad de fracciones hidrofílicas. Las fracciones hidrofílicas pueden ser cadenas poliméricas que, cuando están reticuladas, forman la matriz polimérica reticulada. Ejemplos incluyen p. ej. fracciones de polietilenglicol, fracciones de poliamina, fracciones de polivinilamina, y fracciones de poliol.
En algunas formas de realización, el núcleo y/o la superficie de una matriz polimérica granulada comprende un material polimérico seleccionado del grupo que consiste en polivinilos, poliacrilatos, poliacrilamidas, poliestirenos, poliésteres y poliamidas.
La matriz polimérica granulada también puede seleccionarse del grupo que consiste en PS, POEPS, POEPOP, SPOCC, PEGA, CLEAR, Expansin, Poliamida, Jandagel, PS-BDODMA, PS-HDODA, PS-TTEGDA, PS-TEGDA, GDMA-PMMA, PS-TRPGDA, ArgoGel, resinas Argopore, ULTRAMINE, LUPAMINE reticulado, PEGA de alta capacidad, sílice, Fractogel, Sefadex, Sefarosa, perlas de vidrio, poliacrilatos reticulados, y derivados de lo mencionado anteriormente; en particular, la matriz polimérica se selecciona del grupo que consiste en SPOCC, PEGA, HYDRA, POEPOP, copolímeros de poliacrilato PEG, copolímeros de poliéter-poliamina, y diaminas de polietileno reticuladas.
Además de los ejemplos mencionados anteriormente, cualquier material capaz de formar una matriz polimérica puede usarse en principio en la producción de gránulos de la invención. Preferiblemente, el material básico de un gránulo es polimérico. En algunas formas de realización, el núcleo comprende o consiste en material hidrofílico polimérico. En otras formas de realización, el núcleo comprende o consiste en material hidrofóbico polimérico. En algunas formas de realización, la superficie de los gránulos comprende o consiste en el mismo material que el núcleo.
Resinas útiles para aplicaciones a gran escala pueden ser una de las mencionadas anteriormente u otras resinas comerciales tales como Sephadex^{TM}, Sepharose^{TM}, Fractogel^{TM}, CIMGEL^{TM}, Toyopearl, agarosa reticulada, y poliestireno o poliacrilato macroporoso. La matriz también puede ser de una naturaleza principalmente inorgánica, tal como vidrio macroporoso o minerales de arcilla, o combinaciones de resinas e inorgánicos, tal como Ceramic HyperD^{TM}.
Los gránulos poliméricos según la invención pueden obtenerse a partir de una variedad de monómeros polimerizables, incluyendo estírenos, acrilatos y cloruros insaturados, ésteres, acetatos, amidas y alcoholes, incluyendo, pero no limitándose a, poliestireno (incluyendo látex de poliestireno de alta densidad tal como poliestireno brominado), polimetilmetacrilato y otros ácidos poliacrílicos, poliacrilonitrilo, poliacrilamida, poliacroleina, polidimetilsiloxano, polibutadieno, poliisopreno, poliuretano, acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, polivinilpiridina, cloruro de polivinilbencilo, poliviniltolueno, cloruro de polivinilideno y polidivinilbenceno. En otras formas de realización, los gránulos se obtienen a partir de monómeros de estireno o macromonómeros a base de PEG. El polímero se selecciona en las formas de realización preferidas del grupo que consiste en poliéteres, polivinilos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacilamidas, poliuretanos, poliacrilamidas, poliestirenos, policarbonatos, poliésteres, poliamidas, y combinaciones de los mismos. La superficie y las fracciones de núcleo altamente preferidas incluyen fracciones de PEG reticuladas, fracciones de poliamina, fracciones de polivinilamina, y fracciones de poliol.
Un polímero hidrofóbico preferido para su uso en la producción de gránulos de la composición de la invención es PS-DVB (poliestireno divinilbenceno). Se ha usado ampliamente PS-DVB para la síntesis peptídica de fase sólida (SPPS), y ha demostrado recientemente más utilidad para la preparación de soportes poliméricos de moléculas orgánicas particulares (Adams et al. (1998) J. Org. Chem. 63:3706-3716). Cuando se preparan adecuadamente (Grøtli et al. (2000) J. Combi. Chem. 2:108-119), los soportes de PS-DVB muestran propiedades excelentes para la síntesis química tales como carga alta, hinchamiento razonable en solventes orgánicos y estabilidad física.
En una forma de realización de la presente invención, el ligando se enlaza a la superficie de un sensor o una placa de disposición conjunto y se usa para detectar y/o cuantificar anticuerpos en una muestra biológica.
Cuando se usa en la presente, el término "muestra biológica" incluye muestras naturales o muestras obtenidas a partir de procesos industriales, p. ej. procesos recombinantes, e incluyen "fluido corporal", es decir cualquier sustancia líquida extraída, excretada, o segregada de un organismo o tejido de un organismo. Un fluido corporal no contiene necesariamente células. Los fluidos corporales de relevancia para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, plasma, fluido cerebroespinal cerebral, lágrimas, leche, fluido sinovial, y fluido amniótico.
En otra forma de realización, una pluralidad de ligandos se enlazan a la superficie de una placa de disposición y se colocan en una pluralidad de puntos, con cada punto representando un ligando. Tal disposición funcional puede utilizarse para detectar la presencia de anticuerpos en una solución. Tal disposición puede usarse para aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos determinados en una muestra biológica.
En otra forma de realización, una pluralidad de ligandos se enlazan a la superficie de enlace de un sensor cantiléver para la detección y opcionalmente la cuantificación de anticuerpos. Una pluralidad de ligandos de afinidad pueden asociarse a una pluralidad de cantileveres con cada cantiléver representando un ligando. Tal disposición funcionalizada puede utilizarse para detectar la presencia de diferentes anticuerpos en una solución. Tal multi-sensor puede utilizarse para aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos determinados en una muestra biológica.
Enlazadores
El ligando mencionado anteriormente se inmoviliza covalentemente a un material de soporte sólido, posiblemente a través de un enlazador. En formas de realización preferidas, el ligando se fija covalentemente a un enlazador el cual se fija covalentemente a la matriz polimérica. Técnicas generales para unir los ligandos de afinidad a materiales de soporte sólido pueden encontrarse en Hermanson, Krishna Mallia y Smith, Immobilized Affinity Ligand Techniques'', Academic Press, 1992.
Los enlazadores se usan para unir el ligando a un soporte sólido tal como p. ej. una matriz polimérica o un soporte inorgánico. Preferiblemente, el enlazador forma un enlace fuerte y duradero entre el ligando y el soporte sólido. Esto es particularmente importante, cuando el material de soporte sólido de la presente invención se va a usar para la purificación repetida de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos.
No obstante, en una forma de realización de la presente invención, los enlazadores se pueden dividir selectivamente. Esto puede ser útil cuando el soporte sólido se va a usar con objetivos analíticos.
Los aminoácidos y polipéptidos son ejemplos de enlazadores típicos. Otros posibles enlazadores incluyen carbohidratos y ácidos nucleicos.
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En una forma de realización, el enlazador L fijado a la matriz polimérica es divisible por ácidos, bases, temperatura, luz, o por contacto con un reactivo químico. En particular, el enlazador fijado a la matriz polimérica puede ser ácido (3-formilindol-1-il)acético, 2,4-dimetoxi-4'-hidroxibenzofenona, HMPA, HMPB, HMPPA, ácido de Rink, amida de Rink, enlazador de Knorr, enlazador de PAL, enlazador de DCHD, enlazador de Wang y enlazador de Trityl.
El ligando puede asociarse al soporte sólido a través de un enlazador con una longitud de preferiblemente menos de 50 \ring{A}, tal como una longitud de entre 3 y 30 \ring{A}, por ejemplo una longitud de entre 3 y 20 \ring{A}, tal como una longitud de entre 3 y 10 \ring{A}.
El enlazador puede fijarse a un grupo funcional hidrofóbico o a un grupo funcional catiónico, o a una entidad estructural del ligando juntando un grupo funcional hidrofóbico y un grupo funcional catiónico. En una forma de realización, el enlazador se fija a un grupo funcional catiónico. Preferiblemente, no obstante, el enlazador se fija al ligando de afinidad mediante un grupo de ácido carboxílico, o un grupo amino, en particular mediante un grupo de ácido carboxílico.
El enlazador también puede comprender una pluralidad de subunidades unidas covalentemente, p. ej. de manera que las subunidades se seleccionen a partir de subunidades de enlazador idénticas y no idénticas. En una variante, el enlazador es flexible y comprende de 3 a preferiblemente menos de 50 subunidades unidas covalentemente idénticas o no idénticas.
En una forma de realización preferida de la presente invención, el enlazador L se selecciona del grupo que consiste en glicina, alanina, ácido 3-aminopropionico, ácido 4-aminobutanoico, y HMBA.
El enlazador también puede seleccionarse del grupo que consiste en polietilenglicol polidispersado; polietilenglicol monodispersado, tal como trietilenglicol, tetraetilenglicol, pentaetilenglicol, hexaetilenglicol, heptaetilenglicol; un aminoácido; un dipéptido; un tripéptido; un tetrapéptido; un pentapéptido; un hexapéptido; un heptapéptido; octapéptido; un nonapéptido; un decapéptido, una polialanina; una poliglicina, unas polilisinas, una poliarginina, incluyendo cualquier combinación de los mismos.
Formas de realización preferidas
Una forma de realización preferida se refiere a un material de soporte sólido como se describe anteriormente
donde el ligando comprende uno o más aminoácidos teniendo grupos de guanidino de cadena lateral y uno o más aminoácidos teniendo fenilo sustituido de cadena lateral o grupos naftilo.
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En vista de lo anterior, se ha descubierto que los ligandos particularmente interesantes son los seleccionados del grupo que consiste en DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH y (DBHBA)_{2}-DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH.
Una composición
La presente invención también proporciona un material de soporte sólido teniendo inmovilizada covalentemente sobre sí mismo una pluralidad de diferentes ligandos de afinidad. Tal composición puede utilizarse para separar diferentes anticuerpos de una muestra biológica.
Método para el aislamiento de anticuerpos
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para el aislamiento de anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, incluyendo el método las etapas de (i) proporcionar un material de soporte sólido que tiene inmovilizado covalentemente en el mismo un ligando de afinidad tal y como se define aquí, (ii) proporcionar una muestra conteniendo putativamente un anticuerpo con una afinidad por dicho ligando, (iii) poner en contacto dicho ligando con dicha muestra conteniendo putativamente dicho anticuerpo, (iv) unir selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra y (V) aislar selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra.
En una variante, el método comprende las fases de proporcionar un ligando tal y como se define aquí, fijar dicho ligando a un soporte sólido, tal como p. ej. una matriz polimérica granulada y/o reticulada, proporcionar una muestra conteniendo putativamente un anticuerpo con una afinidad por dicho ligando, poner en contacto dicho ligando con dicha muestra conteniendo putativamente dicho anticuerpo, unir selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra y aislar selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra.
Preferiblemente, la capacidad enlazante del ligando es mayor que 5 mg de anticuerpo por ml de resina, o incluso mayor que lo descrito arriba en la sección "Material de Soporte Sólido".
Debe entenderse que la manipulación del material de soporte sólido y el procedimiento siguen esencialmente el de las técnicas cromatográficas de afinidad convencionales.
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Ejemplos
La presente invención se ilustra con mayor detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Los ejemplos describen cómo se pueden diseñar grandes bibliotecas y analizar su afinidad hacia anticuerpos monoclonales.
Materiales y métodos
Todos los reactivos y solventes se han obtenido de proveedores comerciales y usado sin purificación adicional. Todos los solventes usados fueron de grado HPLC mantenidos sobre tamices moleculares. Los aminoácidos Fmoc protegidos y el enlazador HMBA se obtuvieron de Bachem AG, Bubendorf, Suiza. Los PPC y ACC se compraron de Neosystem, Estrasburgo, Francia. Sepharose^{TM} se compró de Sterogene y Fractogel^{TM} se compró de Merck. Todos los ligandos se sintetizaron en resina PEGA1900 (Versabeads^{TM} A). Se usó un sintetizador de péptido de varias columnas de 20 pocilios para la síntesis de biblioteca combinatoria. Los espectros 1H RMN se registraron en soluciones CDCI3 con un espectrómetro Varian Unity Inova 500 MHz. Los cambios químicos se reportaron en valores \delta relativos al tetrametilsilano. Los espectros de masa ESI se registraron en un espectrómetro de masa Waters Global Ultima y los espectros MALDI-TOF se registraron en un espectrómetro de masa Bruker Reflex III usando ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico como matriz. Las separaciones HPLC de fase inversa analíticas y preparativas se llevaron a cabo en un sistema Waters HPLC usando columnas Zorbax 300SB-C_{18} (4,5 x 50 mm) y Delta PAIL (25 x 300 mm) C_{18} con una velocidad de flujo de 1 cm^{3}mín^{-1} y 10 cm^{3}min^{-1}, respectivamente. La detección fue a 215 nm en un detector de longitud de ondas múltiple (Waters 490E) para propósitos analíticos y se usó un detector de disposición de fotodiodo (Waters M991) para las separaciones preparativas. Se usó un sistema de solvente que consistía en A: 0,1% de TFA en agua y B: 0,1% de TFA en 90:10 acetonitrilo/agua.
Marcación del fragmento Fc
El fragmento Fc de un anticuerpo se purificó por diálisis en regulador de pH de bicarbonato (pH 8). El fragmento Fc purificado se trató con colorante Oregon Green (50 x) en DMF y se mantuvo durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo hidroxilamina (1,5 m, pH 8.5). El polipéptido marcado se purificó por diálisis en regulador de pH de bicarbonato (pH 8).
Ejemplo 1 Síntesis de ligandos
La síntesis de fase sólida siguió el esquema:
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Todos los compuestos se sintetizan sobre una resina amino funcional con base en polietilenglicol-acrilamida, PEGA1900. Los ligandos se fijaron a la resina derivada de glicina mediante un enlazador HMBA de ácido p-hidroximetilbenzoico lábil de base.
Se añadió el bloque de construcción (ácido/aminoácido; 3 equiv) disuelto en DMF y N-etilmorfolina (4 equiv) y TBTU (2,88 equiv). La mezcla reactiva se mantuvo durante 5 min y se añadió a la resina hinchada en DMF durante 2 h. La resina se lavó con DMF, EtOH-DMF y DCM.
Incubación de compuestos sintetizados en fragmento Fc marcado
Los gránulos (10 mg) se lavaron con agua (10 X), regulador de pH de bicarbonato (pH 8, 10 X), y se suspendieron en regulador de pH de bicarbonato durante 1 h. El polipéptido marcado se añadió entonces a la resina y se mantuvo durante toda la noche a temperatura ambiente. La resina se lavó con regulador de pH de bicarbonato (pH 8) y agua.
La fluorescencia en los gránulos se registró usando un microscopio de fluorescencia y una cámara digital. Una lámpara de mercurio equipada con un filtro de emisión proporcionó excitación en la escala azul visible. Las imágenes de los gránulos se registraron en agua.
Las fórmulas de abajo ilustran las unidades estructurales que se usaron para la síntesis.
La tabla de abajo lista los ligandos y el nivel aparente correspondiente de fluorescencia determinado por la observación simple de las muestras y la comparación de las intensidades de color aparentes entre las muestras. En una escala arbitraria de 0 a 3, donde 0 indica ninguna fluorescencia y 3 indica el nivel más alto de fluorescencia observado.
24
Ejemplo 2 Evaluación cromatográfica de ligandos (del Ejemplo 1) Preparación de la columna cromatográfica
Las resinas nuevas se evaluaron en modo empacado. Se empacó 1 ml de cada resina en una columna cromatográfica HR5 (GE Healtcare) aplicando condiciones estándar.
Después de empacar, la columna tenía una altura de lecho de 3,9 cm y un volumen total de 0,76 ml.
Equilibrado, Carga, Elución
Antes de cargar la matriz con el anticuerpo monoclonal, la columna se equilibró con 6 reguladores de pH de equilibrio de volumen de columna conteniendo 50 mM de Na-fosfato (pH 7.0; cond. 9 MS cm^{-1}). Después de equilibrar una solución de anticuerpo monoclonal en regulador de pH de equilibrio (conc. de proteína 1,14 mg/ml) se cargó a la columna. Posteriormente, la columna se lavó con 6 volúmenes de columna del regulador de pH de equilibrio y se eluyó con 6 volúmenes de columna del regulador de pH de elución 1 (25 mM de acetato sódico, pH 5.5; cond. 1,8 mS cm^{-1}) y 6 volúmenes de columna del regulador de pH de elución 2 (25 mM de regulador de pH de acetato sódico, pH 3.8; 0,5 mS cm^{-1}). La columna se almacenó en etanol al 20%. Después, la matriz se regeneró con 40 mM de ácido fosfórico y 20 mM de hidróxido de sodio. La velocidad de flujo para el equilibrado, la carga y el lavado fue de 60 cm/h, la elución y la regeneración se realizaron a una velocidad de flujo de 30 cm/h.
Resultados para el ligando 55 acoplado en Fractoqel
25 
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Resultados para el ligando 16 acoplado en Fractogel
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Resumen y resultados
El enlace y la elución de los mAbs se mostraron con ambos ligandos aplicando condiciones de operación no optimizadas. Para el ligando 55, sólo hay material limitado a través del flujo mientras que no se detectó nada a través del flujo con el ligando 16.
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Ejemplo 3
Los ligandos TMPPA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH, DBHPA-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH, (DPPA)_{2}-DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH y (DBHBA)_{2}-DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH se sintetizaron sobre resina Toyopearl activada con amino (suministrada por Tosoh). La capacidad de enlace de cada una de las resinas de afinidad resultantes (B2, B3, D1, y D2 respectivamente) hacia mAb se evaluó realizando la siguiente secuencia de etapas dos veces (ciclo 1 y ciclo 2),
1)
pasar una solución acuosa de mAb (50 mM de Na-Fosfato, pH=7.0) a través de una columna empacada con la resina mientras se registra el desarrollo de la absorbancia UV del permeado y se recoge la muestra líquida que sale la columna (a través del flujo),
2)
pasar un regulador de pH de elución acuoso (25 mM de acetato, pH=3.7) a través de la columna y recoger la muestra líquida que sale de la columna (elución),
3)
pasar un regulador de pH de saneamiento acuoso (1 M de ácido acético) a través de la columna y recoger la muestra líquida que sale de la columna (regeneración/saneamiento).
La masa de mAb, m_{i}, i=1,2,3, se determinó entonces para cada muestra en cada ciclo.
La "capacidad de enlace" se calcula como la masa total del mAb añadido a la columna, m_{0}, multiplicada por el volumen de regulador de pH añadido a la columna en el punto donde la absorbancia UV ha alcanzado un 5% de su valor terminal, V_{5%}, dividido por el volumen total de regulador de pH usado, V_{0}, y dividido por el volumen de resina mojada, V_{resin}.
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La tabla de abajo da los resultados para B2, B3, D1, y D2 (excluido = m_{1}/m_{0}, elución = m_{2}/m_{0}, y lavado = m_{3}/m_{0})
29
Está claro a partir de la tabla que todos los ligandos evaluados tienen capacidades de enlace mayores que 5 mg/ml.
Para determinar la selectividad de las resinas B2 y B3 hacia mAb, se repitió el experimento, pero esta vez se usó el sobrenadante de fermentación crudo en la etapa 1. Después del experimento, la pureza de las muestras se determinó mediante Página SDS. Los resultados se muestran para B2, B3, D1, y D2 en las Figuras 1, 2, 3, y 4, respectivamente.
Se puede observar en las Figuras 1-4 que los cuatro ligandos evaluados mostraron selectividad hacia mAb con B2 y D1 siendo especialmente selectivos en las condiciones dadas.
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Documentos citados en la descripción
Esta lista de documentos citados por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documentos de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores y omisiones.
Documentos de patente citados en la descripción
\bullet WO 03019195 A [0015]
\bullet WO 20041003148 A [0017]
\bullet WO 0140265 A [0016]
\bullet US 5260373 A [0019]
Bibliografía fuera de la patente citada en la descripción
\bulletFassina G. et al. Protein A mimetic peptide ligand for affinity purification of antibodies Journal of Molecular Recognition: JMR, 1996, vol. 9, no. 5-6. 564-569 [0018]
\bulletLehninger Biochemistry Worth Publishers 1975. 71-92 [0104]
\bullet Roberts Vellaccio The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology Academic Press, Inc. 1983. vol. 5, 341- [0105]
\bulletAdams et al. J. Org. Chem., 1998, vol. 63, 3706-3716 [0144]
\bulletGrøtli et al. J. Combi. Chem., 2000, vol. 2, 108-119 [0144]
\bulletHermanson Krishna Mallia Smith Immobilized Affinity Ligand Techniques Academic Press 1992. [0149]

Claims (9)

1. Material de soporte sólido teniendo inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad, comprendiendo dicho ligando uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),
donde al menos un grupo funcional hidrofóbico está separado de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de entre 5 \ring{A} y 20 \ring{A},
donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da; y
donde el ligando comprende o consiste en 3 residuos unidos covalentemente, X_{1}-X_{2}-X_{3}, donde dichos residuos unidos covalentemente también están unidos covalentemente al enlazador L de la entidad L-PM, donde PM es el material de soporte sólido,
donde X_{1} es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,
donde X_{2} es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, con la condición de que X_{2} no sea un residuo de treonina, y
donde X_{3} es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico
comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,
donde al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} comprende un grupo funcional catiónico, y
donde al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} comprende un grupo funcional hidrofóbico,
donde X_{1} se selecciona de L-Arg, D-Lys, D-Phe, D-Pro, INA, PPC, DBHBA, 3HBA, 4HBA y SAA;
donde X_{2} se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro, AIB, AHX, INA, NLE y PPC; y
donde X_{3} se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro y PPC.
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2. Material de soporte sólido teniendo inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad, comprendiendo dicho ligando uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),
donde al menos un grupo funcional hidrofóbico se separa de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de entre 5 \ring{A} y 20 \ring{A},
donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da; y
donde el ligando de afinidad comprende o consiste en los residuos unidos covalentemente X_{1}-X_{2}-X_{3}, donde opcionalmente X_{1}, X_{2} y/o X_{3}, se enlaza con un residuo de enlazador, L; y
donde
el residuo X_{1} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Phe, PPC, DBHBA, SAA, DAP, DAB, (DBHBA)_{2}-DAP, (MDCA)_{2}-DAP, DPBBA, DBBA, PCAA, DPPAA, Trp, TMPPA, y DBHPA,
el residuo X_{2} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Leu, Lys, Phe, Pro, PPC, DAP, DAB, His, Trp, Tyr, y Ser, y
el residuo X_{3} se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Pro, PPC, Asp, Orn, y (1H2NA)Dap.
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3. Material de soporte sólido que tiene inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad, comprendiendo dicho ligando uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),
donde al menos un grupo funcional hidrofóbico se separa de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de entre 5 \ring{A} y 20 \ring{A},
donde dicho ligando consiste en 3 residuos seleccionados del grupo que consiste en D-Leu; D-Lys; D-Phe; D-Pro; L-Arg; L-Asn; L-Pro; Ahx; Aib; DBHBA; INA; Nle; PPC; SAA; 3HBA y 4HBA, y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da.
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4. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 y 3, donde dicha resina de afinidad tiene una capacidad de enlace mayor que 5 mg de anticuerpo monoclonal por ml de resina de afinidad.
5. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el ligando comprende o consiste en uno o más de:
D-Phe-(L)Arg-(L)Arg,
L-Arg-D-Phe-(L)Arg,
PPC-D-Pro-(L)Arg,
PPC-D-Leu-PPC,
INA-D-Phe-PPC,
PPC-AIB-PPC,
L-Arg-(L)Arg-D-Phe,
PPC-(L)Arg-D-Pro,
D-Pro-PPC-(L)Arg,
L-Arg-D-Pro-PPC,
D-Lys-INA-(L)Arg,
INA-(L)Arg-D-Lys,
PPC-AHX-PPC,
PPC-Nle-PPC,
SAA-(L)Arg-(L)Pro,
SAA-(L)Pro-(L)Arg,
DBHBA-(L)Arg-(L)Asn,
DBHBA-(L)Asn-(L)Arg,
3HBA-(L)Arg-(L)Pro,
3HBA-(L)Pro-(L)Arg,
4HBA-(L)Arg-(L)Pro, y
4HBA-(L)Pro-(L)Arg,
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6. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el ligando es uno seleccionado del grupo que consiste en
H_{2}N-(D)Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH,
H_{2}N-(L)Arg-(D)Phe-(L)Arg-Gly-OH,
HN-PPC-(D)Pro-(L)Arg-Gly-OH,
DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH,
DBBA-His-Arg-Gly-OH,
DBBA-His-Arg-Arg-Gly-OH,
DPPBA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH,
PCAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH,
DPPBA-(L)Lys-(L)Arg-Gly-OH,
SAA-(L)Arg-(L)Pro-Gly-OH,
SAA-(L)Pro-(L)Arg-Gly-OH,
DBHBA-(L)Arg-(L)Asn-Gly-OH,
DBHBA-(L)Asn-(L)Arg-Gly-OH,
DPPBA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH,
(MDCA)_{2} DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH,
(MDCA)_{2} DAP-(L)Arg-(L)Asp-Gly-OH,
DPPAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH,
DPPAA-PPC-(L)Arg-Gly-OH,
DBHBA-(D)Phe-(D)Arg-Gly-OH,
DPPAA-(D)Tyr-(D)Arg-Gly-OH,
(DPPA)_{2} DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH,
(DBHBA)_{2} DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH,
DBHBA-DAP-Arg-Gly-OH,
DBHBA-DAP-Arg-Arg-Gly-OH,
(DBHBA)_{2} DAP-Arg-Gly-OH,
(DBHBA)_{2} DAP-Arg-Arg-Gly-OH,
TMPPA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH, y
DBHPA-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH.
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7. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el ligando es uno seleccionado del grupo que consiste en
D-Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly,
L-Arg-D-Phe-(L)Arg-Gly,
PPC-D-Pro-(L)Arg-Gly,
PPC-D-Leu-PPC-Gly,
INA-D-Phe-PPC-Gly,
PPC-AIB-PPC-Gly,
L-Arg-(L)Arg-D-Phe-Gly,
PPC-(L)Arg-D-Pro-Gly,
D-Pro-PPC-(L)Arg-Gly,
L-Arg-D-Pro-PPC-Gly,
D-Lys-INA-(L)Arg-Gly,
INA-(L)Arg-D-Lys-Gly,
PPC-AHX-PPC-Gly,
PPC-Nle-PPC-Gly,
SAA-(L)Arg-(L)Pro-Gly,
SAA-(L)Pro-(L)Arg-Gly,
DBHBA-(L)Arg-(L)Asn-Gly,
DBHBA-(L)Asn-(L)Arg-Gly,
3HBA-(L)Arg-(L)Pro-Gly,
3HBA-(L)Pro-(L)Arg-Gly,
4HBA-(L)Arg-(L)Pro-Gly, y
4HBA-(L)Pro-(L)Arg-Gly.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el ligando se selecciona del grupo que consiste en DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH y (DBHBA)_{2}-DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH.
9. Método para el aislamiento de anticuerpos o derivados de los mismos, incluyendo el método las etapas de (i) proporcionar un material de soporte sólido teniendo inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, (ii) proporcionar una muestra conteniendo un anticuerpo con una afinidad por dicho ligando, (iii) poner en contacto dicho ligando con dicha muestra conteniendo dicho anticuerpo, (iv) enlazar selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra y (v) aislar selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra.
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