TW201420605A - 具有ｐＨ－依賴性結合特性之抗－ＰＣＳＫ９抗體 - Google Patents

具有ｐＨ－依賴性結合特性之抗－ＰＣＳＫ９抗體 Download PDF

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Abstract

本發明係提供在中性pH比在酸性pH具較大親和力之專一地與前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9(PCSK9)結合的抗體及其抗原結合片段。本發明之抗體相較於不具有pH-依賴性結合特性之抗體，係具有一或多個胺基酸改變。例如，本發明包括抗-PCSK9抗體，其在一或多個互補決定區具有一或多個組胺酸取代，本發明之具有pH-依賴性結合性質之抗體，相較於不具有pH-依賴性結合性質之抗-PCSK9抗體，其續留在動物對象的循環中並展現長期降膽固醇之活性。本發明之抗體因此可用於治療與升高的HDL膽固醇有關之疾病和病症，其中本發明之抗體，相較於不具有pH-依賴性結合性質之抗體，可以較低劑量及/或較低頻率投予病患。

Description

具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體 相關申請案之交叉參照
本申請案係請求2012年8月13日申請的美國臨時申請案第61/682,349號，及於2012年9月20日申請的61/703,342；於2012年12月7日申請的61/734,398；於2013年2月6日申請的61/761,383；以及於2013年5月29日申請的61/828,258於35U.S.C.§ 119(e)下之利益，其揭示文係以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於專一地與前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)相互作用之抗原結合分子，及此等分子治療高膽固醇血症及其他特徵為膽固醇量升高之相關病症的用途。
前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)為一種前蛋白轉化酶，係屬於分泌性枯草桿菌酶枯草桿菌酶家族之蛋白酶K亞家族。此編碼的蛋白被合成一可溶性酶原，其係在內質網中經過自身催化的分子內處理。循環的PCSK9與肝細胞表面上的低密度脂前蛋白受體(LDLR)結合並以將其破壞為目標。此過程降低了肝之結合力並移除LDL膽固醇(LDL-C)而因此造成LDL-C量增加。專一與PCSK9結合並阻斷其與LDL受體之相互 作用的抗體已顯示對於降低人類對象中血漿LDL-C量為治療上有效用的。(參見，例如Stein等人，New Engl.J.Med. 2012；366：1108-1118)。
產生治療效用所需的抗體之給劑量及/或給藥頻率一般係按可被單一抗體分子中和之抗原數目而定。例如，在此抗體於宿主內成為降解目標前，若抗體僅可結合及中和一抗原，則必須投予相當大量的抗體以產生治療效用及/或必須相當頻繁地投予抗體。換言之，若單一抗體在降解前能重複地與多抗原結合，則所需投予的抗體減少，且可以較低的頻率給藥，產生有效的治療反應。
在本項技術中對於能結合PCSK9，可於較長時期產生有效治療反應及/或以低於目前已知和可取得的PCSK9拮抗劑所要求的給劑量之新的治療分子存有需求。
本發明係提供對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)具有pH-依賴性結合特性之抗體和其抗原結合片段。例如，本發明係包括在中性pH比在酸性pH以較大親和力與PCSK9結合的抗體及其抗原結合片段(亦即，在酸性pH時結合親和力降低)。如文中所述之實例中所示，在酸性pH時結合親和力降低之抗-PCSK9抗體，相較於在酸性pH時不具有結合親和力降低之抗體，係具有各種改良/增進的生物特性。例如在酸性pH時結合親和力降低之本發明抗-PCSK9抗體，當投予動物對象(包括人類病患)時，相較於在酸性pH時不具有結合親和力降低之抗-PCSK9抗體，其在循環中具有較長的半衰期。換言之，在酸性pH時結合親和力降低之本發明抗-PCSK9抗體，從循環中清除比缺乏pH-依賴性結合之抗-PCSK9抗體更緩慢。更緩慢的抗體清除(亦即 較長的循環半衰期)係與本發明抗體較長的降膽固醇效力相關。因此，本發明之抗體可以較低頻率及/或較低劑量投予一對象，然而將比在酸性pH時不具有結合親和力降低之抗-PCSK9抗體具有相等(或更佳)的效力。
不受限於理論，咸信，相較於中性pH，在酸性pH時具有較低結合親和力之抗-PCSK9抗體，係在酸性的核內體環境中與抗原解離並再循環到血漿，在該處其能進行另外回合的治療抗原結合。此現象稱為「抗體的再循環」或「捕捉和釋放」且能大大地改善活體內的抗體效力，因為單一抗體分子可結合或中和多抗原。相反地，相較於中性pH，在酸性pH時以相等或較大的親和力與PCSK9結合之抗體，僅在單次抗體-抗原結合後藉由其在核內體中與抗原的強力連結，循著單一路徑到溶小體進行降解。
抗-PCSK9抗體之結合特性可在活體外藉由表面電漿子共振來定量，其係提供抗體與PCSK9在中性pH和酸性pH結合時之結合性質的數值(例如ka、kd 、KD 、t½等)。這些參數可用於測定抗體與PCSK9結合是否帶有pH-依賴性結合特性。本發明因此係包括，如表面電漿子共振所測，係以在中性pH時比酸性pH時高至少5倍的親和力與PCSK9結合之抗體或其抗原結合片段(或反言之，如表面電漿子共振所測，抗體係以在酸性pH時比中性pH時低至少5倍的親和力與PCSK9結合)。本發明亦包括抗體或其抗原結合片段，其如表面電漿子共振所測，在酸性pH時與PCSK9結合之t½比中性pH時抗體與PCSK9結合之t½短至少5倍(或反言之，如表面電漿子共振所測，在中性pH時抗體與PCSK9結合之t½比酸性pH時抗體與PCSK9結合之t½長至少5倍)。根據特定的實施例，係提供其在中性pH時比在酸性pH時以高至少5倍之親和力與PCSK9結合，及其在酸性pH時與PCSK9結合之t½比中性pH時抗體與PCSK9結合之t½短至少5倍之抗-PCSK9抗 體。
根據本發明特定的實施例，係提供抗-PCSK9抗體，當其以約10mg/kg之劑量投予一對象時，與基線相比降低血清LDL-C至少25%並維持此降低的血清LDL-C至少20天。
本發明之抗-PCSK9抗體可藉由使不具有pH-依賴性結合或僅具有中間型pH-依賴性結合之母源抗-PCSK9抗體之胺基酸序列突變，藉此產生具有pH-依賴性結合之變體抗-PCSK9抗體。例如，在母源抗-PCSK9抗體之一或多個互補決定區(CDR)內的一或多個胺基酸可變為組胺酸殘基且此生成的組胺酸變體抗體可就pH-依賴性結合進行試驗(例如相較於中性pH，在酸性pH時對PCSK9親和力降低)。
根據本發明，一示例性母源抗-PCSK9抗體，其可在胺基酸序列層級作修飾，產生帶有增進的pH-依賴性結合性質之變體抗-PCSK9抗體，為定名300N之抗體。另外，任何包含抗體300N之重鏈和輕鏈可變區(HCVR/LCVR)(亦即包括SEQ ID NO：218/226)或包括抗體300N之重鏈和輕鏈CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)(亦即包括SEQ ID NOs：220-222-224-228-230-232)的抗-PCSK9抗體，可用作為母源抗體，經由組胺酸取代的致突變作用從其衍生帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體。此外，任何包括如文中表1中所述之HCVR/LCVR胺基酸序列，或HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列的抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，可用作為母源抗體，經由組胺酸取代的致突變作用從其衍生帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體。
本發明包括治療疾病和病症之方法，其中該疾病和病症藉由拮抗PCSK9，例如藉由阻斷PCSK9與LDL受體(LDLR)之相互作用為可治療及/或改善的。根據本發明此方面之方法係包 括於一有此需要之對象中投予一包含具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物。根據本發明此方面之方法可用於治療，例如高膽固醇血症和如文中他處所揭示的其他相關疾病或病症。
本發明亦包括治療性給藥療法，其包括於一有此需要之對象中投予多劑量之具有pH-依賴性結合特性的抗-PCSK9抗體。根據本發明此方面中的特定實施例，具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體的個別劑量可用低於一個月一次之頻率投予一對象(例如每二個月一次、每三個月一次、每四個月一次等)。
從確認詳細說明之論述中其他的實施例將變得顯而易見。
詳細說明
在描述本發明之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。如文中所用，術語「大約」當用於有關特定引述的數值時，係指該值可從該引述值做不大於1%的變化。例如，如文中所用，「約100」一詞包括99和101及所有介於之間的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然在施行或試驗本發明時可使用任何該等與文中所述的方法和物質類似或相當者，但較佳的方法和物質為目前所描述。本說明書中所提及之所有的專利、申請案和非專利申請案係以全文引用的方式併入本文中。
一般定義
詞語「前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型」、「PCSK9」或「PCSK9片段」及其類似詞語，除非有指出係來自非人類物種(例如「小鼠PCSK9」、「小鼠PCSK9片段」、「猴子PCSK9」、「猴子PCSK9片段」等)，否則如文中所用係指人類PCSK9蛋白。人類PCSK9(有時在文中縮寫為「hPCSK9」)具有如SEQ ID NO：755所述之胺基酸序列。
術語「抗體」如文中所用，係指包括至少一個與特定抗原(例如PCSK9)專一結合或相互作用之互補決定區(CDR)的任何抗原結合分子或分子複合物。術語「抗體」係包括：包含藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈，二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈之免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈係包括一重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH )及一重鏈恆定區。各重鏈恆定區係包括三個區，CH 1、CH 2和CH 3。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL )及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區係包括一個區(CL 1)。VH 和VL 區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為架構區(FR)。各VH 和VL 係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明不同的實施例中，抗體(或其抗原結合部分)之FR可與人類胚原系序列相同，或經自然或人工修飾。胺基酸共有序列可以二或多個CDR之並排(side-by-side)分析為基準來定義。
術語「抗體」，如文中所用，亦包括全抗體分子之抗原結合片段。術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等等，如文中所用，包括任何與抗原專一性結合形成複合物之天然生成、酵素製得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變區和視需要恆定區之DNA操作和表 現的重組基因工程技術，衍生自例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可容易地從例如市面來源、DNA資料庫(包括，例如噬菌體-抗體資料庫)取得或可合成的。此DNA可用化學或藉由使用分子生物技術來定序和操作，例如將一或多個可變及/或恆定區排列成適合的組態，或導入密碼子，產生半胱胺酸殘基、修飾、增添或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限定實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，例如CDR3胜肽)或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子，例如區域專一性抗體、單區抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-嫁接抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫醫藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區，亦涵蓋在文中所用的「抗原結合片段」之詞語內。
抗體之抗原結合片段典型地係包括至少一可變區。可變區可為任何大小或胺基酸組成之區域且一般應包括與一或多個架構序列相鄰或在其架構內之CDR。在具有VL 區與VH 區結合之抗原結合片段中，VH 和VL 區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有VH -VH 、VH -VL 或VL -VL 二聚體。另外，抗體之抗原結合片段可含有單體VH 或VL 區。
在特定的實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個可變區與至少一個恆定區共價連接。在本發明之抗體的抗原結合片段內可發現的可變區和恆定區之非限定、示例性組態包括：(i)VH -CH 1；(ii)VH -CH 2；(iii)VH -CH 3；(iv)VH -CH 1-CH 2；(v)VH -CH 1-CH 2-CH 3；(vi)VH -CH 2-CH 3；(vii)VH -CL ；(viii)VL -CH 1；(ix)VL -CH 2；(x)VL -CH 3；(xi)VL -CH 1-CH 2；(xii)VL -CH 1-CH 2-CH 3；(xiii) VL -CH 2-CH 3；及(xiv)VL -CL 。在任何可變區和恆定區之組態中，包括上列任何的示例性組態，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈區或連接子區相連。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所組成，使其在單一多肽分子中相鄰的可變及/或恆定區間產生柔性和半柔性連結。再者，在本發明之抗體的抗原結合片段可包括以非共價彼此相互連結及/或與一或多個單體VH 或VL 區相連結(例如以雙硫鍵)之任何上列的可變和恆定區組態之同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。
術語「人類抗體」，如文中所用，希望係包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變和恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由隨機或活體外位置專一性誘變所導入之突變或活體內體細胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術語「人類抗體」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已稼接在人類架構序列上之抗體。
術語「重組的人類抗體」，如文中所用，希望包括由重組方法，例如使用重組的表現載體轉染至宿主細胞(進一步詳述於下)所製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，由重組的組合人類抗體庫(進一步詳述於下)分離出之抗體，由經轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)分離出的抗體(參見，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列與DNA序列拼接之方法所製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組的人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區和恆定區。然而，在特定的實施例中，此等重組的人類抗體係在活體外經誘發突變(或當使用以人類Ig序列基 因轉殖之動物時，為活體內體細胞誘發突變)，且因此重組抗體之VH 和VL 區的胺基酸序列(當衍生自人類生殖系VH 和VL 序列或與其有關時)其為可能非天然存在於活體內人類抗體生殖系庫中之序列。
人類抗體可以二種與絞鏈異質性有關之形式存在。第一種形式，包括約150-160kDa之安定的四鏈結構之免疫球蛋白分子，其中此二聚體係藉由鏈間重鏈雙硫鍵聚集一起。第二種形式，二聚體並非經由雙硫鍵相連接且此約75-80kDa之分子係由共價偶合的輕鏈和重鏈(半抗體)所組成。這些形式極難分離，即使在親和純化後。
在各種完整的IgG同型中，第二種形式出現的頻率係因(但不限於)與抗體之絞鏈區同型有關之結構差異所致。在人類IgG4絞鏈之絞鏈區中單一胺基酸取代可顯著地降低第二種形式出現(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)至典型地使用人類IgG1絞鏈所觀察到的程度。本發明係涵蓋絞鏈、CH 2或CH 3區中具有一或多個突變之抗體，該突變例如在製造上可能為所希望的，用以改善所欲的抗體形式之產率。
「分離的抗體」，如文中所用，係指經鑑定及從至少一種其天然環境之組成份分離及/或回收之抗體。例如，從至少一種生物體，或從組織或細胞之組成份分離或移出之抗體，其中就本發明之目的，該存在自然界或為自然產生的抗體為一「分離的抗體」。分離的抗體亦包括重組細胞內原位抗體。分離的抗體為歷經至少一純化或分離步驟之抗體。根據特定的實施例，分離的抗體可能實質上無其他細胞物質及/或化學物。
「中和」或「阻斷」抗體，如文中所用，希望係指一抗體其與PCSK9之結合降低或可察覺的抑制PCSK9和LDL受體(LDLR)或LDLR之胞外片段間的相互作用.
相較於可從其衍生抗體之對應的生殖系序列，文中所揭示的抗-PCSK9抗體可在重鏈和輕鏈可變區之架構及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示之胺基酸序列與得自，例如公開的抗體序列資料庫之生殖系序列相比較，加以容易地確定。賦予本發明抗-PCSK9抗體pH-依賴性結合特性之特定的胺基酸改變係詳細論述於文中他處。本發明包括由任何文中所揭示的胺基酸序列所衍生之抗體及其抗原結合片段，其中在一或多個架構及/或CDR區中的一或多個胺基酸係突變成衍生抗體之生殖系序列的對應殘基，或另一種人類生殖系序列之對應殘基，或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此等序列之改變在文中共同稱為「生殖系突變」)。本項技術之一般技術者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區序列開始，可容易地製造許多包括一或多個個別的生殖系突變或其組合之抗體和抗原結合片段。在特定的實施例中，V H 及/或V L 區內的所有架構及/或CDR殘基係突變回到衍生此抗體之原始生殖系序列中所發現的殘基。在其他實施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖系序列，例如僅在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中發現突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發現突變的殘基。在其他的實施例中，一或多個架構及/或CDR殘基係突變成不同生殖系序列之對應殘基(亦即與最初衍生抗體之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本發明之抗體在架構及/或CDR區內可含有任何二或多個生殖系突變之組合，例如，其中特定的個別殘基係突變成特定生殖系序列之對應殘基，而與原始生殖系序列不同的其他殘基係維持原樣或突變成不同生殖系序列之對應殘基。一旦得到後，含有一或多個生殖系突變之抗體和抗原結合片段可容易地試驗其一或多種所欲的性質，例如結合專一性改善、結合親和力增加、拮抗或促效性生物性質改善或增進(視情況而定)、致免疫力 降低等。以此通用方法所得的抗體和抗原結合片段係涵蓋在本發明中。
本發明亦包括抗-PCSK9抗體，其包含任何具有一或多個保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，本發明包括抗-PCSK9抗體，其相對於文中所揭示之任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，係具有含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少之保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。
術語「表位」係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的表位。因此，不同的抗體可與抗原的不同區域結合並可具有不同的生物效應。表位可為構型或線性。構型表位係由直鏈多肽鏈不同線段之空間上並列的胺基酸所產生。線性表位係由多肽鏈中相鄰的胺基酸殘基所產生。在特定的情況下，表位可包括抗原上的醣類基團、磷醯基或磺醯基。
術語「實質上一致」或「實質上相同」當係指核酸或其片段時，係表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最佳化對齊時，以任何熟知的序列同一性演算法，例如下文所論述的FASTA、BLAST或Gap來測量，有至少約95%，及更佳地至少約96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基具核苷酸序列同一性。與參照核酸分子具有實質上同一性的核酸分子，在特定情況下，可編碼與參照核酸分子所編碼的多肽具有相同或實質上類似胺基酸序列之多肽。
如應用於多肽，術語「實質上類似性」或「實質上類似」係指二個胜肽序列，當以GAP或BESTFIT程式使用內建缺位權重最佳化對齊時，享有至少95%序列同一性，甚佳地至少98%或99%序列同一性。較佳地，不同的殘基位置係相差在保守性胺 基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白質的功能特性。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中，可調高序列同一性之百分比或類似程度以修正此保守性取代作用之性質。調整之方法已為熟習本項技術者所熟知。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，其係以引用的方式併入本文中。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括(1)脂系側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂系-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；(4)芳香側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另外，保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445(其係以引用的方式併入本文中)所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守性」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變化。
多肽之序列類似性，其亦指序列同一性，典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如，GCG軟體含有例如Gap和Bestfit程式，其可使用內定參數，測定密切相關的多肽間，例如來自不同生物物種之同源多肽，或野生型和其突變蛋白間之序列同源性或序列同一性。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內定或建議參數，一種GCG Version 6.1內的程式，作比較。FASTA(例如FASTA2 和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列同一性百分比(Pearson(2000)supra)。當本發明序列與含有較大量來自不同生物體的序列資料庫作比較時，另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402，其各自係以引用的方式併入本文中。
具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體
本發明係提供顯示pH-依賴性結合特性之抗體及其抗原結合片段。如文中所用，「帶有pH-依賴性結合特性」一詞係指抗體或其抗原結合片段，「相較於中性pH，在酸性pH時與PCSK9結合下降」(就本揭示文之目的，二個詞語可交互使用)。例如，「帶有pH-依賴性結合特性」係包括在中性pH比在酸性pH時以較大親和力與PCSK9結合的抗體及其抗原結合片段。在特定的實施例中，本發明之抗體及其抗原結合片段在中性pH時係以高於酸性pH時至少3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍的親和力與PCSK9結合。「具有pH-依賴性結合特性」抗體一詞亦括如文中他處所定義的帶有「中間pH-依賴性結合特性」之抗體。
抗體對抗原(例如PCSK9)之「親和力」，就本揭示文之目的，係以抗體的KD 表示。抗體的KD 係指抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。就抗體與其抗原結合而言KD 值越大，則抗體對於此特定抗原之結合親和力越弱。因此，如文中所用，「在中性pH比在酸性pH具更高親和力」(或等同詞語「pH-依賴性結合」)係指在酸性時抗體與PCSK9結合之KD 大於在中性時抗體與PCSK9結合之KD 。例如，在本發明內文中，若在酸性pH時抗體與PCSK9結合之KD 大於中性pH時抗體與PCSK9結合之KD 至少約3倍， 則此抗體係視為在中性pH比在酸性pH時以更高親和力與PCSK9結合。因此，本發明係包括在酸性pH時抗體及其抗原結合片段與PCSK9結合之KD 比中性pH時抗體與PCSK9結合之KD 大至少約3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍(其係指在中性pH時抗體或其抗原結合片段與PCSK9結合之親和力比在酸性pH時大至少約3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍)。
抗體對於特定抗原之結合性質亦可藉由抗體的kd 來表示。抗體的kd 係指抗體對於特定抗原之解離速率常數並以秒的倒數來表示(亦即sec-1 )。kd 值增加象徵著抗體對其抗原之結合越弱。本發明因此係包括相較於中性pH，在酸性pH時抗體與PCSK9結合具有較高kd 值。本發明包括在酸性pH時抗體及其抗原結合片段與PCSK9結合之kd 比在中性pH時抗體與PCSK9結合之kd 大至少約3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多倍。
抗體對於特定抗原之結合性質亦可藉由抗體的t½來表示。抗體之t½係指抗體-抗原相互作用之半衰期。因此，根據本發明，帶有「pH-依賴性結合特性」或同等詞「相較於中性pH，在酸性pH時與PCSK9結合降低」之抗體，包括與PCSK9結合之t½在酸性pH比在中性pH時更短之抗體。例如，本發明係包括在酸性pH時抗體或其抗原結合片段其與PCSK9結合之t½比中性pH時抗體與PCSK9結合之t½短至少5倍。例如，本發明係包括在酸性pH時抗體及其抗原結合片段與PCSK9結合之t½比在中性pH時抗體與PCSK9結合之t½短至少約5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60或更多倍。如實例中所示，若抗-PCSK9抗體在中性pH時具有21分鐘之t½，而在酸性pH時t½為3分鐘，則就本揭示文之目的，抗體與PCSK9結合在酸性pH時之t½比在中性pH時抗體與PCSK9結合之t½短7倍[亦即21分鐘除以3分鐘]。
在特定的情況下，「相較於中性pH，在酸性pH時與PCSK9結合降低」係以在酸性pH時抗體與PCSK9結合之KD 值與在中性pH時抗體與PCSK9結合之KD 值的比率來表示(或反之亦然)。例如，就本發明之目的，若抗體或其抗原結合片段具有約3.0或更大的酸性/中性KD 比率，則抗體或其抗原結合片段可被認為具有「相較於中性pH，在酸性pH時與PCSK9結合降低」。在特定的示例性實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段的酸性/中性KD 比率可為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
在特定的情況下，「相較於中性pH，在酸性pH時與PCSK9結合降低」係以在酸性pH時抗體與PCSK9結合之kd 值與在中性pH時抗體與PCSK9結合之kd 值的比率來表示(或反之亦然)。例如，就本發明之目的，若抗體或其抗原結合片段具有約3.0或更大的酸性/中性kd 比率，則抗體或其抗原結合片段可被認為具有「相較於中性pH，在酸性pH時與PCSK9結合降低」。在特定的示例性實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段的酸性/中性kd 比率可為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。
在特定的情況下，「相較於中性pH，在酸性pH時與PCSK9結合降低」之抗體係以在酸性pH時抗體與PCSK9結合之t½值與在中性pH時抗體與PCSK9結合之t½值的比率來表示(或反之亦然)。例如，就本發明之目的，若抗體或其抗原結合片段具有約0.2或更小的酸性/中性t½比率，則抗體或其抗原結合片段可被認為具有「相較於中性pH，在酸性pH時與PCSK9結合降低」。在特定的示例性實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段的酸性/中性t½比率可為約0.20、0.15、0.14.0.12、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更低。
在特定的情況下，本發明之抗體，相較於中性pH，在酸性pH時可以較低的親和力(亦即較高的KD )及較短的t½與PCSK9結合。例如，本發明係包括其在中性pH時係以比酸性pH時高至少5倍的親和力與PCSK9結合，及在酸性pH時t½比在中性pH時抗體與PCSK9結合之t½短至少5倍之抗體。然而，在特定的案例中，在中性pH時比在酸性pH時具有較高與PCSK9結合之親和力(如以KD 值表示)，與中性pH相比在酸性pH時可能並不一定具有較短的t½。
如文中所用，「酸性pH」一詞係指6.0或更低的pH(例如比約6.0更低，比約5.5更低，比約5.0更低，等等)。「酸性pH」一詞包括約6.0、5.95、5.90、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低的pH值。
如文中所用，「中性pH」一詞係指約7.0至約7.4的pH。「中性pH」一詞包括約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35及7.4之pH值。
KD 值、kd 值和t½時間，如文中所示，可使用表面電漿子共振為基礎的生物感測器來測定，用以定出抗體-抗原相互作 用之特性(參見，例如文中實例3)。KD 值、kd 值和t½時間可於25℃或37℃測定。
已發現，相較於中性pH，在酸性pH時具有與PCSK9結合下降之抗體及其抗原結合片段，相對於相較於中性pH在酸性pH時不具有與PCSK9結合下降之抗體及其抗原結合片段，係具有改良的藥物動力學性質。例如，如文中提供的操作實例所驗證，特定的本發明抗體，其相較於中性pH，在酸性pH時具有與PCSK9結合下降，當投予動物對象時，相較於不具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體，係具有較緩慢的循環清除率。根據本發明此方面，係提供帶有相較於中性pH在酸性pH時具有與PCSK9結合下降之抗體，其相對於相較於中性pH在酸性pH時不具有與PCSK9結合下降之抗體，係具有至少2倍慢的循環清除率。清除率可藉由抗體的半衰期來表示，其中越慢的清除率係與較長的半衰期相關。本發明亦包括帶有相較於中性pH在酸性pH時具有與PCSK9結合下降之抗-PCSK9抗體，其中該抗體，當以約1mg/kg之劑量投予表現人類PCSK9之動物時，在投予後至少30天在動物的血清中可偵測到大於約1.0μg/ml之濃度。
亦發現到，相較於中性pH，在酸性pH時具有與PCSK9結合下降之抗體及其抗原結合片段，其相對於相較於中性pH在酸性pH時不具有與PCSK9結合下降之抗體及其抗原結合片段，係具有改良及持久的降膽固醇活性。例如，本發明係提供：相較於在酸性pH時不具有與PCSK9結合下降之抗體及其抗原結合片段，提供持久的降LDL-C能力之抗-PCSK9抗體。根據本發明特定的實施例，係提供抗-PCSK9抗體，其當以約10mg/kg之劑量投予一對象時，與基線相比降低血清LDL-C量至少25%並維持此降低的血清LDL-C量至少25天。在特定的情況下，係提供抗-PCSK9抗體，其當以約10mg/kg之劑量投予一對象時，與基線相 比降低血清LDL-C量至少25%並維持此降低的血清LDL-C量達例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多天。如文中所用，術語「基線」當其係關於LDL-C(或其他相關參數)時，係指在將抗-PCSK9抗體(或其他比較的治療性介入)投予一對象之前，該對象之血清中LDL-C的量。
本發明人等已發現，至少在特定的治療情況下，對於與PCSK9結合，具有太高程度的pH敏感性對抗體可能為有害的。亦即，在特定的情況下，相較於中性pH在酸性pH時以較低的親和力與抗體結合可能是所欲的，但仍保留在酸性pH時特定程度對PCSK9之結合親和力。因此，根據本發明特定的實施例，係提供具有中間pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體。
如文中所用，「中間pH-依賴性結合特性」一詞係指抗體或其抗原結合片段具有大於3.0但低於8.0之酸性/中性KD 比率。在特定的示例性實施例中，帶有「中間pH-依賴性結合特性」之抗體的酸性/中性KD 比率係介於3.5至8.0；介於4.0至8.0；介於4.5至8.0；介於5.0至8.0；介於5.5至8.0；介於6.0至8.0；介於6.5至8.0；介於3.0至7.5；介於3.0至7.0；介於3.0至6.5；介於3.0至8.0；介於3.5至7.5；介於4.0至7.0；介於4.5至7.0；介於5.0至7.0；or介於4.5至6.5。在特定示例性實施例中，帶有「中間pH-依賴性結合特性」之抗體的酸性/中性KD 比率為約3.0，約3.5，約4.0，約4.5，約5.0，約5.5，約6.0，約6.5，約7.0，約7.5或約8.0。帶有「中間pH-依賴性結合特性」之抗-PCSK9抗體亦可具有低於約1.0但大於約0.15之酸性/中性t½比率。就測定一抗體是否具有如文中所定義的「中間pH-依賴性結合特性」，可於25℃藉由表面電漿子共振測定酸性/中性KD 比率及/或酸性/中性t½比率。
如文中所用，帶有「中間pH-依賴性結合特性」之抗-PCSK9抗體亦包括，如表面電漿子共振所測，在酸性pH(例如pH 6.0)及25℃以低於約35分鐘但大於10.5分鐘之t½與PCSK9結合之抗體及抗原結合片段。例如，本發明係包括帶有「中間pH-依賴性結合特性」之抗-PCSK9抗體，其在酸性pH(例如pH 6.0)及25℃係以低於約20分鐘但大於10分鐘；低於約20分鐘但大於約11分鐘；低於約20分鐘但大於約12分鐘；低於約20分鐘但大於約13分鐘；低於約20分鐘但大於約14分鐘；低於約20分鐘但大於約15分鐘；低於約30分鐘但大於約11分鐘；低於約25分鐘但大於約12分鐘；低於約18分鐘但大於約14分鐘；低於約16分鐘但大於約13分鐘；或低於約16分鐘但大於約14分鐘之t½與PCSK9結合。
帶有「中間pH-依賴性結合特性」之抗體亦包括在酸性pH(例如pH 6.0)及25℃係以約10.5分鐘，約11.0分鐘，約11.5分鐘，約12.0分鐘，約12.5分鐘，約13.0分鐘，約13.5分鐘，約14.0分鐘，約14.5分鐘，約15.0分鐘，約15.5分鐘，約16.0分鐘，約16.5分鐘，約17.0分鐘，約17.5分鐘，約18.0分鐘，約18.5分鐘，約19.0分鐘，約19.5分鐘，約20.0分鐘，約20.5分鐘，約21.0分鐘，約22.0分鐘，約23.0分鐘，約24.0分鐘，約25.0分鐘，約26.0分鐘，約27.0分鐘，約28.0分鐘，約29.0分鐘，約30.0分鐘，約31.0分鐘，約32.0分鐘，約33.0分鐘，約34.0分鐘或35.0分鐘之t½與PCSK9結合的抗體。
帶有組胺酸取代之pH-依賴的抗-PCSK9抗體
本發明係提供帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體，其中此等抗體，相較於母源抗-PCSK9抗體，係具有一或多個胺基酸差異。如文中所用，「母源」抗-PCSK9抗體為一不顯示pH-依賴性結合特性或僅顯示中間pH-依賴性結合特性之抗 -PCSK9抗體(例如，其中在中性pH時母源抗體對PCSK9之結合親和力不大於酸性pH時抗體與PCSK9結合親和力的3倍；或其中在中性pH時母源抗體與PCSK9結合之t½不短於酸性pH時抗體與PCSK9結合之t½的3倍)。在某些案例中，「母源」抗-PCSK9抗體可為相較於中性pH，在酸性pH時對PCSK9具有結合增加之抗-PCSK9抗體。在某些實施例中，「母源」抗-PCSK9抗體為一藉由標準抗體製造/分離方法(例如小鼠致免疫、噬菌體表現等)，而並無在互補決定區(CDR)中以人工導入任何胺基酸修飾所得來之抗體。
根據本發明此方面，相對於母源抗-PCSK9抗體，帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體可具有一或多個胺基酸變異。例如，帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體可含有一或多個組胺酸取代或插入，例如在一或多個母源抗-PCSK9抗體的CDR中。因此，根據本發明特定的實施例，係提供抗-PCSK9抗體，其包括與母源抗-PCSK9抗體的CDR胺基酸序列相同之CDR胺基酸序列(例如重鏈和輕鏈CDR)，但母源抗體的一或多個CDR之一或多個胺基酸係經組胺酸殘基取代。帶有pH-依賴性結合之抗-PCSK9抗體，在母源抗體之單一CDR中或母源抗-PCSK9抗體之分布整個多數(例如2、3、4、5或6個)CDR中，可具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個組胺酸取代。例如，本發明包括帶有pH-依賴性結合之抗-PCSK9抗體，其係包括母源抗-PCSK9抗體的HCDR1中之一或多個組胺酸取代，HCDR2中之一或多個組胺酸取代，或HCDR3中之一或多個組胺酸取代，LCDR1中之一或多個組胺酸取代，LCDR2中之一或多個組胺酸取代，LCDR3中之一或多個組胺酸取代。
可經修飾、突變或另外工程化以具有pH-依賴性結合特性(或增進的pH-依賴性結合特性)之「母源」抗-PCSK9抗體包 括：包含任何美國專利第8,062,640號中所揭示之互補決定區(CDR)或重鏈和經鏈可變區(HCVR/LCVR)的抗-PCSK9抗體(亦總述於文中之實例1表1中)。一僅具有中間pH-依賴性結合特性之母源抗-PCSK9抗體的特定實例為文中(及在美國專利第8,062,640號中)稱為「300N」之抗體。300N包含具有SEQ ID NO：218/226之HCVR/LCVR胺基酸序列，及分別具有SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232之重鏈和輕鏈CDR序列(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)。因此，任何包含SEQ ID NO：218/226之HCVR/LCVR胺基酸序列對，或SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列的抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，為可在胺基酸序列層級作修飾(例如，在一或多個CDR中帶有一或多個組胺酸取代及/或插入)以產生帶有pH-依賴性結合特性的抗-PCSK9抗體之適合的母源抗體。
另一種選擇，任何抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR/LCVR胺基酸序列對，或美國專利第8,062,640號中所述(以總述於文中實例1表1中)之任何示例性抗-PCSK9抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3胺基酸序列，亦為可在胺基酸序列層級作修飾(例如，在一或多個CDR中帶有一或多個組胺酸取代及/或插入)以產生帶有pH-依賴性結合特性的抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段之適合的母源抗體。
在特定的實施例中，本發明係提供顯示pH-依賴性結合特性及包含一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中該HCVR係包含任一SEQ ID NO：2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、 310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、738和742之胺基酸序列，或其中在一或多個重鏈CDR內的一或多個胺基酸係經組胺酸殘基取代之任何前述胺基酸序列的變體；及其中該LCVR係包含任一SEQ ID NO：10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、730、740及744之胺基酸序列，或其中在一或多個輕鏈CDR內的一或多個胺基酸係經組胺酸殘基取代之任何前述胺基酸序列的變體。
例如，本發明係提供稱為「300N」之示例性母源抗-PCSK9抗體之變體(亦即包含SEQ ID NO：218/226之HCVR/LCVR胺基酸序列對的抗體之變體)。特言之，本發明係提供顯示pH-依賴性結合特性及包含一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中HCVR係包含SEQ ID NO：218或包含一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸取代之SEQ ID NO：218的變體：N52H、Q53H、I100H、V101H、V104H、D106H、M107H、D108H和Y112H；及其中LCVR係包含SEQ ID NO：226或包含一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸取代之SEQ ID NO：226的變體：L29H、L30H、N33H、G34H、Y37H、 L97H、T99H和P100H。
根據一示例性實施例，本發明係提供顯示pH-依賴性結合特性及包含一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中HCVR係包括包含一D106H胺基酸取代之SEQ ID NO：218的變體，及其中LCVR係包含SEQ ID NO：226。D106H胺基酸取代係位於重鏈CDR3(HCDR3)內。包括D106H胺基酸取代之變體HCDR3係以文中表3所示的SEQ ID NO：788胺基酸序列來表示。
根據另外的示例性實施例，本發明係提供具有pH-依賴性結合特性及包括一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中該HCVR係包括SEQ ID NO：218，及其中該LCVR係包括包含一L30H胺基酸取代之SEQ ID NO：226的變體。該L30H胺基酸取代係位於輕鏈CDR1(LCDR1)內。包括L30H胺基酸取代之變體LCDR1係以文中表3所示的SEQ ID NO：802胺基酸序列來表示。
根據另外的示例性實施例，本發明係提供顯示pH-依賴性結合特性及包含一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中該HCVR係包括包含一D106H胺基酸取代之SEQ ID NO：218的變體，及其中該LCVR係包括包含一L30H胺基酸取代之SEQ ID NO：226的變體。
在特定的實施例中，本發明係提供顯示pH-依賴性結合特性及包含3個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中該HCDR1係包含SEQ ID NO：220(母源)；其中HCDR2係包含由SEQ ID NO：222(母源)、772(N52H)和773(Q53H)組成之群中選出之胺基酸序列；其中HCDR3係包含 由SEQ ID NO：224(母源)、782(I100H)、783(V101H)、786(V104H)、788(D106H)、789(M107H)、790(D108H)和794(Y112H)組成之群中選出之胺基酸序列；其中LCDR1係包含由SEQ ID NO：228(母源)、801(L29H)、802(L30H)、804(N33H)、805(G34H)和808(Y37H)組成之群中選出之胺基酸序列；其中LCDR2係包含SEQ ID NO：230(母源)；及其中LCDR3係包含由SEQ ID NO：232(母源)、815(L97H)、817(T99H)和818(P100H)組成之群中選出之胺基酸序列。
根據特定的實施例，本發明係提供顯示pH-依賴性結合特性及包含3個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中HCDR1係包含SEQ ID NO：220(母源)；其中HCDR2係包括SEQ ID NO：222(母源)；其中HCDR3係包含SEQ ID NO：224(母源)或788(D106H)；其中LCDR1係包含SEQ ID NO：228(母源)或802(L30H)；其中LCDR2係包含SEQ ID NO：230(母源)；及其中LCDR3係包含SEQ ID NO：232(母源)。
根據特定的實施例，本發明係提供具有pH-依賴性結合特性及包含3個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中HCDR1係包含SEQ ID NO：220(母源)；其中HCDR2係包含SEQ ID NO：222(母源)；其中HCDR3係包括SEQ ID NO：788(D106H)；其中LCDR1係包含SEQ ID NO：228(母源)；其中LCDR2係包含SEQ ID NO：230(母源)；及其中LCDR3係包含SEQ ID NO：232(母源)。
根據特定的實施例，本發明係提供具有pH-依賴性結合特性及包含3個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9 抗體或其抗原結合片段，其中HCDR1係包含SEQ ID NO：220(母源)；其中HCDR2係包含SEQ ID NO：222(母源)；其中HCDR3係包含SEQ ID NO：224(母源)；其中LCDR1係包含SEQ ID NO：802(L30H)；其中LCDR2係包含SEQ ID NO：230(母源)；及其中LCDR3係包含SEQ ID NO：232(母源)。
根據特定的實施例，本發明係提供具有pH-依賴性結合特性及包含3個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)和3個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段，其中HCDR1係包含SEQ ID NO：220(母源)；其中HCDR2係包含SEQ ID NO：222(母源)；其中HCDR3係包含SEQ ID NO：788(D106H)；其中LCDR1係包含SEQ ID NO：802(L30H)；其中LCDR2係包含SEQ ID NO：230(母源)；及其中LCDR3係包含SEQ ID NO：232(母源)。
包括Fc變體之抗-PCSK9抗體
根據本發明特定的實施例，係提供包括Fc區之抗-PCSK9抗體，其中Fc區係包含，例如相較於中性pH，在酸性pH時增進或減少抗體與FcRn受體結合之一或多個突變。例如，本發明包括在Fc區的CH 2或CH 3區中包含一突變之抗-PCSK9抗體，其中此突變係增加酸性環境中Fc區與FcRn之親和力(例如，在其中pH範圍從約5.5至約6.0的核內體中)。此等Fc修飾之非限定實例包括，例如位置250(例如，E或Q)；250和428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)及256(例如，S/R/Q/E/D或T)之修飾；或位置428及/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如，H/F或Y)之修飾；或位置250及/或428之修飾；或位置307或308(例如，308F、V308F)及434之修飾。在一實施例中，此修飾包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修飾；428L、259I(例如，V259I)及308F(例如，V308F)修飾；433K (例如，H433K)及434(例如，434Y)修飾252、254及256(例如，252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾(例如，T250Q和M428L)；及307及/或308修飾(例如，308F或308P)。
本發明係包括包含下列二者之抗-PCSK9抗體：(1)包含一或多個組胺酸取代之變體CDR序列，其相較於中性pH，在酸性pH時降低抗體與PCSK9之結合親和力；及(2)包含一或多個突變之變體Fc區序列，其相較於中性pH，在酸性pH時增加Fc區對FcRn之親和力。根據本發明此方面，可建構包含如文中所述之任何組胺酸取代的重鏈或輕鏈可變區(HCVR/LCVR)或CDR(參見例如，表3)，及包含任何上述突變之Fc區之抗-PCSK9抗體，其中該等突變係使得Fc區在酸性pH時以較大親和力與FcRn相結合。例如，本發明係包括包含CDR胺基酸序列之抗-PCSK9抗體，例如，文中稱為「VH-D106H」之組胺酸變體抗-PCSK9抗體或文中稱為「VK-L30H」之組胺酸變體抗-PCSK9抗體，及包括一或多個由下列組成之群中選出之突變的Fc區：T250Q/M248L；M252Y/S254T/T256E；M428L/N434S；及H433K/N434F。文中所述之所有可能的CDR組胺酸取代突變和Fc區突變係涵蓋在本發明範圍內。
抗體的生物特性
除了具有pH-依賴性結合特性外，本發明之抗-PCSK9抗體亦可具有一或多種另外的有利生物性質。例如，本發明係包括有效阻斷PCSK9和低密度脂前蛋白受體(LDLR)間的相互作用之抗-PCSK9抗體。在特定的實施例中，本發明之抗體在中性pH時係以低於約1nM，例如，低於約900pM，低於約800pM，低於約700pM，低於約600pM，低於約500pM，低於約400pM，低於約300pM，低於約200pM，或低於約100pM之IC50 阻斷PCSK9和LDLR間的相互作用，例如，使用文中實例4中所述之 阻斷ELISA或實質上類似的分析模式所測定。
在特定的實施例中，本發明之抗體在中性pH時比在酸性pH時能更有效地阻斷PCSK9/LDLR相互作用(例如，在酸性pH時反映抗體與PCSK9結合降低)。抗-PCSK9抗體阻斷PCSK9/LDLR相互作用之能力可藉由IC50 值來量化表示，例如，在中性和酸性pH時。(參見，例如，文中實例4)。相較於酸性pH，在中性pH時抗體阻斷PCSK9/LDLR相互作用之程度可藉由在酸性pH時所測量的抗體IC50 值與在中性pH時所測量的抗體IC50 值之比率來表示。在此類分析模式中較高的酸性/中性IC50 比率係反映相較於中性pH，在酸性pH時阻斷PCSK9/LDLR相互作用之能力下降。因此，本發明係包括抗-PCSK9抗體，其中如使用實例4的分析模式或實質上類似的分析所測，抗體係以大於約1，大於約5，大於約10，大於約20，大於約30，大於約32，大於約34，大於約36，大於約38，大於約40，大於約50，大於約60，大於約70，大於約80，大於約90，大於約100，大於約110，大於約120，大於約130，大於約140，大於約150，大於約160，大於約170，大於約180，大於約190，大於約200，大於約210，大於約220，大於約230或更大之酸性/中性IC50比阻斷PCSK9/LDLR相互作用。
本發明亦包括帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體，其中抗體係阻斷PCSK9-媒介的LDL吸收之抑制作用。以細胞為基礎的LDL吸收分析例如文中實例5中所示，可用於測定抗-PCSK9抗體是否能阻斷PCSK9-媒介的LDL吸收之抑制作用及/或其程度。根據特定的實施例，係提供具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體，其中該抗體，例如，如使用文中實例5中所述之活體外LDL吸收分析或實質上類似的分析所測，能以低於約40nM，低於約35nM，低於約30nM，低於約25nM，低於約20nM，低 於約15nM或低於約10nM之IC50 阻斷PCSK9-媒介的LDL吸收之抑制作用。
本發明之抗體可具有一或多種前述的生物特性，或任何其組合。前面所列的本發明抗體之生物特性並非詳盡的。熟習本項技術之一般技術者從檢閱本揭示文(包括文中操作實例)，將更明白本發明抗體之其他生物特性。
產生帶有pH-依賴性結合特性之抗體的方法
本發明亦提供產生帶有pH-依賴性結合特性之抗體的方法。根據本發明此方面之方法，係包括篩選具有至少中間pH-依賴性結合特性之抗體及然後將此抗體進行進一步的致突變作用以增進此抗體對其抗原之pH-依賴。篩選步驟可包括任何方法或過程，藉此在對特定抗原具專一性之抗體族群中辨識出具有中間pH-依賴性結合特性之抗體。在特定的實施例中，最初的抗體族群係藉由使動物免疫或藉由對專一與特定相關抗原結合之抗體篩選噬菌體表現資料庫所獲得。此等抗體，在特定的實施例中，可為全人類抗體。在特定的實施例中，篩選步驟係包括於酸性pH和中性pH測量最初的抗體組群中個別抗體之一或多個結合參數(例如，KD 或t½)。抗體之結合參數可使用，例如表面電漿子共振或任何其他能定量上和定性上評估抗體對特定抗原之結合特性的分析方法來測量。根據本發明此方面之特定的實施例，此篩選步驟包括辨識以大於約3.0但低於約8.0之酸性/中性KD 比率與抗原結合之抗體。另一種選擇，此篩選步驟可包括辨識以低於約1.0但大於約0.15之酸性/中性t½比率與抗原結合之抗體。又在其他的實施例中，此篩選步驟可包括辨識在酸性pH(例如pH 6.0)時具有低於40分鐘但大於20分鐘(例如於25℃)之t½的抗體。
一但辨識出帶有中間pH-依賴性結合特性之抗體，則將所辨識出的抗體進行致突變作用以增進抗體對抗原之pH-依賴 性結合。「增進的pH-依賴性結合」係指此突變版本的抗體比致突變前原始的母源(亦即中間pH-依賴)版本抗體具有較大的酸性/中性KD 比率，或較小的酸性/中性t½比率。在特定的實施例中，「增進的pH-依賴性結合」係指在酸性pH(例如pH 6.0)時抗體與其抗原結合之t½小於致突變前抗體之t½。在特定的實施例中，「增進的pH-依賴性結合」係指在酸性pH(例如pH 6.0)時抗體與其抗原結合之t½係低於約16分鐘，低於約10分鐘，低於約5分鐘，低於約2分鐘或低於約1.5分鐘(例如在25℃時)。
根據本發明此方面，致突變的步驟可包括在抗體的重鏈及/或輕鏈內刪除、取代或添加一胺基酸。根據特定的實施例，此致突變係在抗體的一或多個可變區內，例如在一或多個CDR內進行。例如，致突變可包括將抗體之一或多個CDR內的胺基酸以另外的胺基酸取代。在特定的實施例中，致突變係包括將抗體之至少一個CDR內的一或多個胺基酸以組胺酸取代。
在文中所述的操作實例中，帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體(例如，全人類抗-PCSK9抗體)係使用如上所述之篩選/致突變方法所產生；然而，根據本發明此方面之方法可用於產生帶有pH-依賴性結合特性之抗體，其與任何抗原結合就pH-依賴特性而言應為有用或所欲的。根據本發明此方面之方法可用於產生當投於一對象或病患時具有延長的血清半衰期之抗體。
「雙組胺酸」(His-His)致突變製造pH-依賴性的抗體
基於文中所述的特定實驗，意外地發現，在CDR中位於與天然生成的組胺酸殘基相鄰(例如，緊接上方或下方)之殘基，將組胺酸取代導入抗體的CDR中，藉此產生一His-His胺基酸序列，可將帶有中間pH-依賴性結合特性之抗體轉變成具有更明顯pH-依賴性結合特性之抗體。如文中所用，「更明顯pH-依賴性結合特性」係指該抗體，在導入組胺酸取代後，比導入組胺酸取代之 前顯示下列一或多項：(a)更大的酸性/中性KD 比率；(b)更大的酸性/中性kd 比率；及/或(c)更小酸性/中性t½比率。例如，文中稱為300N之抗體具有中間pH-依賴性結合特性且在LCDR1(參見SEQ ID NO：228)之第五個胺基酸位置含有單一天然生成的組胺酸。藉由在LCDR1之第五個胺基酸位置導入組胺酸(產生包含帶有SEQ ID NO：802之LCDR1的「VK-L30H」抗體)，發現所生成的抗體具有比300N更加明顯的pH-依賴性結合特性，如文中實例3A和3B所示。此「雙-His」突變策略為一般用於產生帶有明顯pH-依賴性結合特性之抗體的可應用方法。因此，本發明係包括用於增進抗體之pH-依賴性質之方法，其包括選擇一帶有中間pH-依賴性結合特性之抗體，並在與現有的組胺酸殘基相鄰的胺基酸位置，將一組胺酸取代導入抗體之一或多個CDR中，藉此製造帶有更明顯pH-依賴性結合特性之抗體(例如，比導入組胺酸取代前之母源抗體具有較大的酸性/中性KD 比率)。此方法亦可應於正常在CDR中缺乏任何組胺殘基之抗體，例如，在一或多個CDR內相鄰的胺基酸位置，導入二或多個組胺酸取代。
表位定位(epitope mapping)及相關技術
本發明包括與在PCSK9之原結構域內發現的一或多個胺基酸(SEQ ID NO：755之1至152胺基酸)相互作用之抗-PCSK9抗體。本發明亦包括與在PCSK9之催化區內發現的一或多個胺基酸(SEQ ID NO：755之153至425胺基酸)相互作用之抗-PCSK9抗體。本發明亦包括與在PCSK9之C-端區內發現的一或多個胺基酸(SEQ ID NO：755之426至692胺基酸)相互作用之抗-PCSK9抗體。在特定的情況下，本發明之抗-PCSK9抗體係與位於PCSK9之二個相鄰區域內的胺基酸相互作用。與抗體結合之表位可由位於一或多個PCSK9區域內之3或多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多)胺基酸 的單一連續序列所組成。另外，表位可由位於一或多個PCSK9區域內之多數個非連續胺基酸(或胺基酸序列)所組成。
各種本項技術之一般技術者已知的技術皆可用於測定抗體之抗原結合區是否與多肽或蛋白內的「一或多個胺基酸交互作用」。示例的技術包括，例如習用的交叉阻斷分析，例如描述於Antibodies ,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中，丙胺酸掃描突變分析、胜肽墨點分析(Reineke(2004),Methods Mol Biol 248：443-463)及胜肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化學修飾等方法(Tomer 2000,Protein Science 9：487-496)。可用於辨識多肽內與抗體之抗原結合區相互作用之胺基酸的另外方法係以質譜偵測氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法係包括以氘標定有關的蛋白，接著讓抗體與氘標定的蛋白結合。接著，將蛋白/抗體複合物轉置於水中，讓除了受抗體保護的殘基(其仍為氘標定)以外的所有殘基發生氫-氘交換。解離抗體後，將目標蛋白以蛋白酶裂解並以質譜分析，藉此找出氘標定殘基，其係相當於與抗體交互作用之專一性胺基酸。參見，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73 ：256A-265A。
本發明進一步係包括與任何文中所述之特定示例性抗體相同之表位結合的抗-PCSK9抗體。例如，本發明包括與任何文中表3所列的組胺酸取代變體抗體的相同表位結合之抗-PCSK9抗體(例如，VH-G26H、VH-F27H、VH-T28H、VH-F29H、VH-S30H、VH-S31H、VH-W33H、VH-I51H、VH-N52H、VH-Q53H、VH-D54H、VH-G55H、VH-S56H、VH-E57H、VH-K58H、VH-A97、VH-R98H、VH-D99H、VH-I100H、VH-V101H、VH-L102H、VH-M103H、VH-V104H、VH-Y105H、VH-D106H、VH-M107H、VH-D108H、 VH-Y109H、VH-Y110H、VH-Y111H、VH-Y112H、VH-G113H、VH-M114H、VH-D115H、VH-V116H、VK-Q27H、VK-S28H、VK-L29H、VK-L30H、VK-S32H、VK-N33H、VK-G34H、VK-N35H、VK-N36H、VK-Y37H、VK-L55H、VK-G56H、VK-S57H、VK-M94H、VK-Q95H、VK-T96H、VK-L97H、VK-Q98H、VK-T99H、VK-P100H、VK-L101H、VK-T102H)。同樣的，本發明亦包括與任何文中表3所列的組胺酸取代變體抗體競爭與PCSK9結合之抗-PCSK9抗體(例如，VH-G26H、VH-F27H、VH-T28H、VH-F29H、VH-S30H、VH-S31H、VH-W33H、VH-I51H、VH-N52H、VH-Q53H、VH-D54H、VH-G55H、VH-S56H、VH-E57H、VH-K58H、VH-A97、VH-R98H、VH-D99H、VH-I100H、VH-V101H、VH-L102H、VH-M103H、VH-V104H、VH-Y105H、VH-D106H、VH-M107H、VH-D108H、VH-Y109H、VH-Y110H、VH-Y111H、VH-Y112H、VH-G113H、VH-M114H、VH-D115H、VH-V116H、VK-Q27H、VK-S28H、VK-L29H、VK-L30H、VK-S32H、VK-N33H、VK-G34H、VK-N35H、VK-N36H、VK-Y37H、VK-L55H、VK-G56H、VK-S57H、VK-M94H、VK-Q95H、VK-T96H、VK-L97H、VK-Q98H、VK-T99H、VK-P100H、VK-L101H、VK-T102H)。
藉由使用本項技術中已知的習用方法，可容易地測定一抗體是否與參照抗-PCSK9抗體相同的表位結合或是與其競爭結合。例如，測定試驗抗體是否如同本發明之參照抗-PCSK9抗體與相同的表位結合，係讓參照抗體與PCSK9蛋白結合。接著，評估試驗抗體與PCSK9分子結合之能力。若試驗抗體在參照抗-PCSK9抗體飽和結合後，能與PCSK9結合，則其可結論出，該試驗抗體係與參照抗-PCSK9抗體不同的表位結合。另一方面，若試驗抗體在參照抗-PCSK9抗體飽和結合後，不能與PCSK9分子結合，則試驗抗體可能與和本發明之參照抗-PCSK9抗體結合的表 位相同之表位結合。然後可進行另外例行的實驗(例如胜肽突變和結合分析)，以確定所觀察到無試驗抗體結合事實上是否係由於與和參照抗-PCSK9抗體相同的表位結合所致，或是否是立體阻斷(或另外的現象)造成無觀察到結合。此類實驗可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或本項技術中可取得的另外其他量性或質性抗體-結合分析來進行。依照本發明特定的實施例，如於競爭性結合分析中所測，若例如1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗體抑制另一抗體之結合至少50%，但較佳地75%、90%或甚至99%，則二種抗體係與相同(或重疊)的表位結合(參見，例如Junghans等人，Cancer Res.199050：1495-1502)。另外，若基本上降低或消除一抗體之結合的抗原中所有的胺基酸突變，係降低或消除另一種抗體之結合，則二種抗體被認為係與相同的表位結合。若僅一亞群的胺基酸突變降低或消除一抗體之結合或消除另一種抗體之結合，則二種抗體被認為具有「重疊的表位」。
為了測定一抗體是否與參照抗-PCSK9抗體競爭結合，係以二個定向進行上述結合方法：第一定向：讓參照抗體在飽和的條件下與PCSK9結合，接著評估試驗抗體與PCSK9分子之結合。第二定向：讓試驗抗體在飽和的條件下與PCSK9分子結合，接著評估參照抗體與PCSK9分子之結合。若在二個定向中，僅有第一(飽和)抗體能與PCSK9分子結合，則結論出試驗抗體和參照抗體係競爭與PCSK9結合。本項技術之一般技術者應了解，與參照抗體競爭結合之抗體可能不一定係與參照抗體相同之表位結合，但可能藉由與重疊或相鄰的表位結合，在立體上阻斷參照抗體之結合。
製備人類抗體
產生單株抗體(包括全長的人類單株抗體)之方法已為本項技術所知。任何此等已知的方法皆可用於本發明之內文中， 用以製造專一與人類PCSK9結合之人類抗體。然後此等抗體可用作母源抗體，從其可衍生組胺酸取代的變體抗體(例如，具有pH-依賴性結合性質之組胺酸取代的變體抗體)。
使用VELOCIMMUNETM 技術或任何其他已知的產生單株抗體之方法，起初先分離對PCSK9具高親和力之具有人類可變區和小鼠恆定區的嵌合抗體。將抗體定性並就所欲的性質來選擇，包括親和力、選擇性、表位等。以所欲的人類恆定區置換小鼠恆定區，例如野生型或修飾型IgG1或IgG4，產生本發明全人類抗體。當根據特定用途所選的恆定區可不同之時，高親和力抗原結合及目標專一性特性則留存在可變區內。
生物等效性
除了文中特定作為示例之組胺酸取代外，本發明亦涵蓋具有與該等文中所述的抗體不同但保留與帶有pH-依賴性結合性質之人類PCSK9結合能力之胺基酸序列的抗體。此等變體抗體及抗體片段，當與親代序列相比較時，係包括一或多個胺基酸之添加、刪除或取代，但具有與所述的抗體實質上相當之生物活性。同樣的，本發明之抗-PCSK9抗體編碼DNA序列，當與所揭示的序列相比較時，係包括一或多個核苷酸之添加、刪除或取代，但其所編碼的抗-PCSK9抗體或抗體片段與本發明之抗-PCSK9抗體或抗體片段實質上為生物等效的。
二種抗原結合蛋白或抗體，若例如其為醫藥同等物或醫藥替代品，當於類似的實驗條件下以單一劑量或多劑量之相同的莫耳劑量投予時，其吸收速率和程度並無顯示顯著的差異，則係視為生物等效的。某些抗體若其吸收程度相當但是吸收速率不同應可視為等效物或醫藥替代品，且仍可視為生物等效，因為此等吸收速率上的差異為故意的並反映在標示上，對於達到例如長期使用之有效體藥濃度並非必要的，且就特定藥物產品的研究 上被視為無醫療上的顯著性。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白若在其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異，則為生物等效的。
在一實施例中，若相較於無此變更之持續治療，病患可在參照產品和生物產品間作一或多次變更而無預期的有害效應之風險增加(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低)，則二種抗原結合蛋白為生物等效的。
在一實施例中，若二種抗原結合蛋白係藉由共同的機制或作用機制作用於症狀或所用症狀，而達到此等機制已知的程度，則二者係為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內和活體外方法來驗證。生物等效性測量包括，例如(a)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量血液、血漿、血清或其他生物體液中隨時間變化之抗體或其代謝物濃度；(b)與人類活體內生物可利用性數據有相互關係及可合理預測此數據之活體外試驗；(c)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量隨時間變化之抗體(或其目標)的適當急性藥理效用；及(d)已建立抗體之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性之良好對照的臨床試驗。
本發明之抗-PCSK9抗體的生物等效變體可藉由，例如製造各種殘基或序列之取代，或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來建構。例如，生物活性不需要的半胱胺酸殘基可刪除或以其他的胺基酸置換，以防止因變性而形成不必要或不正確的分子內雙硫橋。在其他內容中，生物等效抗體可包括抗-PCSK9抗體變體，其係包含修飾抗體之糖基化特性的胺基酸改變，例如消除或移除糖基化之突變。
物種選擇性和物種交叉反應
根據本發明特定的實施例，抗-PCSK9抗體係與人類 PCSK9結合但不與其他物種的PCSK9結合。本發明亦包括與人類PCSK9及來自一或多種非人類物種之PCSK9結合的抗-PCSK9抗體。例如本發明之抗-PCSK9抗體可與人類PCSK9結合，以及可與或不與(視情況而定)一或多種小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、獼猴、絨猴、恆河猴或黑猩猩PCSK9結合。
多專一性抗體
本發明之抗體可為單專一性、雙專一性或多專一性。多專一性抗體可對一目標多肽之不同的表位具專一性或可含有對一個以上的目標多肽具專一性之抗原結合區。參見，例如Tutt等人，1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer等人，2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發明之抗-PCSK9抗體可與另外的功能分子，例如另一胜肽或蛋白相連結或共表現。例如，抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體，例如另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他)，產生帶有第二結合專一性之雙專一性或多專一性抗體。例如，本發明包括雙專一性抗體，其中免疫球蛋白之一臂係對人類PCSK9或其片段具專一性，而免疫球蛋白之另一臂係對第二治療目標具專一性，或與具療效成份接合。
可用於本發明內文中之示例性雙專一性抗體模式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH 3區及第二Ig CH 3區，其中第一和第二Ig CH 3區至少有一胺基酸互不相同，且相較於無此胺基差異之雙專一性抗體，其中至少一胺基酸差異降低了雙專一性抗體與蛋白A之結合。在一實施例中，第一Ig CH 3區結合蛋白A而第二Ig CH 3區含有降低或消除蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(IMGT外顯子編號；EU編號為H435R)。第二CH 3可進一步包括Y96F修飾(IMGT；EU為Y436F)。在第二CH 3中可發現的另外修飾作用， 就IgG1抗體而言係包括：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、and V82I(IMGT；EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I)；就IgG2抗體而言係包括：N44S、K52N和V82I(IMGT；EU為N384S、K392N和V422I)；及就IgG4抗體而言係包括：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述之雙專一性抗體模式之變異係涵蓋在本發明之範圍內。
治療調配物及給藥
本發明係提供包括本發明抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物係與適合的載劑、賦形劑和其他提供改善轉移、運送、耐受性及類似性質之藥劑所調配。許多適合的調配物可參見所有醫藥化學家已知的處方集：賓州伊斯頓馬克出版公司之Remington's Pharmaceutical Sciences。這些調配物包括，例如散劑、糊膏、軟膏、軟凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(例如LIPOFECTINTM ,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA接合物、無水吸收糊膏、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含碳蠟(carbowax)之半固體混合物。亦參見Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311
投予病患之抗體劑量可依照病患的年齡和體型大小、標的疾病、症狀、給藥路徑及其類似因素而不同。較佳的劑量典型地係根據體重或體表面積來計算。給予抗-PCSK9抗體之有效劑量和時程可依經驗來決定；例如可以定期評估來監看病患進步，並據此調整劑量。再者，物種間劑量之衡量可使用本項技術熟知的方法來進行(例如Mordenti等人，1991,Pharmaceut.Res.8 ：1351)。
各種的遞送系統已為所知並可用於投予本發明之醫藥組成物，例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現突變病毒之重組細胞、受體媒介的內吞作用(參見，例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。導入方法包括(但不限於)皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服路徑。組成物可以任何方便的路徑，例如以輸注或團注、以經由上皮或黏膜層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收來給藥，並可與其他生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部的。
本發明之醫藥組成物可以標準針或注射器由皮下或靜脈內來遞送。此外，就皮下遞送而言，筆型遞送裝置可容易地用於遞送本發明之醫藥組成物。此筆型遞送裝置可為重複使用型或拋棄型。可重複使用的筆型遞送裝置一般係利用含有醫藥組成物之可更換補充匣。一旦匣內的所有醫藥組成物投予後而補充匣變空，此空匣可容易丟棄並更換新的含醫藥組成物之補充匣。然後此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的補充匣。取而代之的，拋棄型筆型遞送裝置係預先填充醫藥組成物收藏在裝置內的儲槽中。一但醫藥組成物的儲槽變空，整個裝置便可丟棄。
許多可重複使用的筆型和自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括(但不限於)AUTOPENTM (Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM 筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM 筆、HUMALOGTM 筆、HUMALIN 70/30TM 筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I,II及III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM (Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM 筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM 、 OPTIPEN PROTM 、OPTIPEN STARLETTM 及OPTICLIKTM (sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅提出一些。用於皮下遞送本發明醫藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置包括(但不限於)SOLOSTARTM 筆(sanofi-aventis)、FLEXPENTM (Novo Nordisk)及KWIKPENTM (Eli Lilly)、SURECLICKTM 自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM (Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRATM 筆(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅提出一些。
在特定的情況下，醫藥組成物可以控制釋放系統來遞送。在一實施例中，可使用幫浦(參見Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一實施例中，可使用聚合物質；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。又在另外的實施例中，控制釋放系統可放置在靠近組成物的目標處，因此僅需要全身劑量之一部分(參見，例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。其他的控制釋放系統係論述於Langer,1990,Science 249：1527-1533之評論中。
可注射的製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。這些可注射製備物可以公開已知的方法來製備。The例如，可注射製備物可，例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於注射上習用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來製備。注射用之水性媒劑有，例如生理食鹽水、含葡萄糖之等張溶液和其他佐劑等，其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。油性媒劑，可使用芝麻油、大豆油等，其可與增溶 劑例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。因此所製備的注射液較佳地係填充於適當的安瓶中。
有利地，上述之口服或非經腸用途之醫藥組成物係製備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑量之劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的前述抗體之量一般每單位劑量之劑型為約5至約500毫克；特別是注射形式，較佳的此前述抗體係含有約5至約100毫而其他劑型為約10至約250毫克。
抗體之治療用途
本發明包括於有此需要之對象投予一包括抗-PCSK9抗體(例如，具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體)之治療組成物的方法。此治療組成物可包括任何如文中所述的抗-PCSK9抗體或其片段。如文中所用，「有此需要之對象」一詞係指具有一或多項高膽固醇血症之癥候或適應症之人類或非人類，或經診斷出患有高膽固醇血症者，或其他受利於總血清膽固醇、LDL、三酸甘油酯或VLDL降低者，或受利於HDL增加者。本發明亦包括藉由投予本發明抗-PCSK9抗體(例如，具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體)降低脂蛋白(a)[Lp(a)]量之方法。
在某些情況下，以本發明治療調配物治療之病患為健康的，但具有升高量脂膽固醇、脂質、三酸甘油酯或脂蛋白。例如，此病患在治療時期可能不具有任何其他心血管、血栓或其他疾病或病症之風險因子。然而，在其他的情況下，此病患係以診斷或發生因升高的血清膽固醇、脂質、三酸甘油酯或脂蛋白所造成或與其相關或隨附的疾病或病症之風險為基礎來選擇。例如，在投予本發明醫藥組成物之時或之前，此病患可能經診斷或鑑定為處於發生心血管疾病或病症，例如冠狀動脈疾病、急性心肌梗塞、無症狀的頸動脈粥狀硬化、中風、週邊動脈阻塞疾病等之風 險。此心血管疾病或病症，在某些情況下，為高膽固醇血症。例如，若一病患經診斷或鑑定係處於發生高膽固醇血症症狀，例如異型接合子家族性高膽固醇血症(heFH)、同型接合子家族性高膽固醇血症(hoFH)以及發生不同於家族性高膽固醇血症之高膽固醇血症(nonFH)的風險，則此病患可選擇以本發明醫藥組成物來治療。
在其他的情況下，在投予本發明醫藥組成物之時或之前，此病患可能經診斷或鑑定為處於發生血栓栓塞疾病或病症，例如肺栓塞、視網膜中央靜脈栓塞等之風險中。在特定的實施例中，此病患係以診斷或處於發生二或多種上述疾病或病症之組合的風險為基準來選擇。例如，在投予本發明醫藥組成物之時或之前，此病患可能經診斷或鑑定為處於發生冠狀動脈疾病和肺栓塞之風險。其他的診斷組合(例如，動脈粥狀硬化及視網膜中央靜脈栓塞、heFH和中風等)亦包括在可用本發明醫藥組成物治療之病患族群的定義中。
本發明之醫藥組成物亦可用於治療由下列組成之群中選出的潛藏疾病或病症所造成或與其相關之高膽固醇血症或血脂異常：代謝症候群、糖尿病、甲狀腺機能低下、腎病症候群、腎衰竭、庫欣氏症候群、膽道肝硬化、肝醣儲積病、肝瘤、膽汁鬱積、生長激素缺乏。本發明之醫藥組成物亦可用於治療由之前的治療療法，例如雌激素治療、黃體素治療、β阻斷劑或利尿劑所造成或與其相關之高膽固醇血症或血脂異常。
又在其他的情況下，以本發明醫藥組成物治療之病患係以一或多個由下列組成之群中選出的因素為基準來選擇：年齡(例如，大於40、45、50、55、60、65、70、75或80歲)、種族、性別(男性或女性)、運動習慣(例如，規律運動者、非運動者)、其他已存在的醫學症狀(例如，第II型糖尿病、高血壓等)及目前的用藥狀況(例如，目前服用他汀類(statins)[例如，西立伐他汀 (cerivastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等]、β阻斷劑、菸鹼酸等)。潛在的病患可在以本發明方法治療前，以一或多個此等因素為基準來選擇/篩選(例如，藉由問卷、診斷評估等)。
本發明亦包括藉由將PCSK9抑制劑投予一對象，於此對象中增加經腸道的膽固醇分泌(TICE)之方法。例如，本發明係提供藉由將帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體投予一對象，於此對象中增加TICE之方法。根據特定的實施例，本發明係包括鑑定其增進TICE應為有利的之對象，或鑑定具有TICE障礙之對象，並將PCSK9抑制劑投予該對象之方法。
他汀類已知係上調病患中PCSK9量(參見，例如Dubuc等人，Aug.2004,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24 ：1454-1459)。接受習用的抗-PCSK9治療劑之他汀類-治療的病患比非他汀治療的病患具有較快的抗-PCSK9清除率。不受限於理論，提出在服用他汀類之病患中升高的PCSK9量可能經由目標-媒介的清除，導致更快消除抗-PCSK9抗體。因此，服用他汀類之病患可能需要較大劑量及/或較頻繁給予習用的抗-PCSK9治療劑(例如，抗-PCSK9抗體)，以達到最佳的降膽固醇。如文中所用，術語「習用的抗-PCSK9治療劑」係指任何不具有pH-依賴性結合特性之PCSK9-結合分子，亦即相較於中性pH，在酸性pH時不具有與PCSK9結合下降之分子。本發明人等已設想可藉由使用能在他汀治療的病患體內有效再循環之抗-PCSK9抗體，來避免或規避此他汀-引起的目標-媒介清除。因此，本發明係包括藉由在進行他汀治療療法之對象中投予一治療上有效量之具有pH-依賴性結合特性的抗-PCSK9抗體，來克服/避免抗-PCSK9結合劑之他汀-引起的目 標-媒介清除的方法。本發明亦包括降低必須投予他汀-服用病患以達到適當地降膽固效用之抗-PCSK9劑用量的方法，及/或降低抗-PCSK9劑投予他汀-服用病患之頻率的方法，其中此等方法係包括以具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體取代最初投予病患之習用的抗-PCSK9劑，來修改病患的治療給劑療法。任何文中所述的pH-依賴的抗-PCSK9抗體皆可用於前述的方法內容中。
組合治療
本發明亦提供包括將包含文中所述之任何示例性抗-PCSK9抗體之醫藥組成物與一或多種另外的治療劑組合給藥之治療方法。可與本發明之抗-PCSK9抗體組合給藥之示例性另外的治療劑包括，例如他汀類(阿伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀等)、菸鹼酸、纖維酸、膽酸螯合劑(例如，考來烯胺(cholestyramine))、考來維侖(colesevelam)、考來替泊(colestipol)、依折麥布(ezetimibe)、抗-高血壓劑、抗-糖尿病劑、類血管生成素蛋白3(ANGPTL3)或類血管生成素蛋白-4(ANGPTL4)之拮抗劑(例如，抗-ANGPTL3抗體[例如，如WO2008/073300或US 7,935,796中所述之抗-ANGPTL3抗體]或抗-ANGPTL4抗體[例如，如WO2006/0074228或WO2007/109307或WO 2011/0792575中所述之抗-ANGPTL4抗體])以及任何前述另外治療劑之組合。
另外的治療活性劑可在投予本發明抗-PCSK9抗體之前、同時或之後不久給藥(就本揭示文之目的，此等給藥療法係被視為是本發明之抗-PCSK9抗體與另外的治療活性劑「組合」給藥)。本發明係包括其中本發明之抗-PCSK9抗體係與一或多種如文中他處所述之另外的治療活性組份共調配之醫藥組成物。
本發明亦提供包括將包含文中所述之任何示例性抗-PCSK9抗體之醫藥組成物，投予一在給予本發明醫藥組成物之時 或之前正在進行高膽固醇血症或相關症狀治療之治療療法的病患。例如，之前已診斷患有高膽固醇血症之病患，在投予包括本發明抗-PCSK9抗體之醫藥組成物之前及/或同時，可能已給予處方並正接受另外藥劑之穩定的治療療法。之前或同時的治療療法可包括，例如(1)藉由抑制3-羥基-3-甲基-戊二醯基(HMG)-輔酶A(CoA)還原酶引發細胞消除膽固醇合成之藥劑，例如他汀類(例如，西立伐他汀、阿伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀及普伐他汀等)；(2)抑制膽固醇吸收及/或膽酸再吸收之藥劑；(3)增加脂蛋白分解代謝之藥劑(例如菸鹼酸)；及/或(4)參與膽固醇消除之LXR轉錄作用的活化劑，例如22-羥基膽固醇。在特定的實施例中，此病患，在投予抗-PCSK9抗體之前及/或同時，正服用治療劑之固定組合物例如依折麥布+辛伐他汀；他汀與膽酸樹脂(例如考來烯胺、考來替泊、考來維侖)；菸鹼酸+他汀(例如菸鹼酸與洛伐他汀)；或其他降血脂藥物例如ω-3-脂肪酸乙酯(例如omacor)。
劑量
根據本發明之方法和給藥療法，投予一對象之抗-PCSK9抗體的量一般為一治療上有效量。如文中所用，「治療上有效量」一詞係指產生可察覺的降低血清LDL-C之抗-PCSK9抗體劑量，或抑制、預防、減輕或延遲高膽固醇血症及/或相關症狀之抗-PCSK9抗體劑量。就帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體的情況而言，治療上有效量可從約0.05mg至約600mg，例如約0.05mg，約0.1mg，約1.0mg，約1.5mg，約2.0mg，約10mg，約20mg，約30mg，約40mg，約50mg，約60mg，約70mg，約75mg，約80mg，約90mg，約100mg，約110mg，約120mg，約130mg，約140mg，約150mg，約160mg，約170mg，約180mg，約190mg，約200mg，約210mg，約220mg，約230mg， 約240mg，約250mg，約260mg，約270mg，約280mg，約290mg，約300mg，約310mg，約320mg，約330mg，約340mg，約350mg，約360mg，約370mg，約380mg，約390mg，約400mg，約410mg，約420mg，約430mg，約440mg，約450mg，約460mg，約470mg，約480mg，約490mg，約500mg，約510mg，約520mg，約530mg，約540mg，約550mg，約560mg，約570mg，約580mg，約590mg或約600mg的抗-PCSK9抗體。
包含在個別劑量中之抗-PCSK9抗體的量可以每公斤病患體重之抗體毫克數來表示(亦即mg/kg)。例如，抗-PCSK9可以約0.0001至約10mg/病患體重kg之劑量投予病患。
給藥療法
根據本發明特定的實施例，可於一定義的時程將多劑量的抗-PCSK9抗體(例如包括帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體的醫藥組成物)投予一對象。根據本發明此方面之方法係包括先後將多劑量之本發明抗-PCSK9抗體投予一對象。如文中所用，「先後給藥」係指各劑量之抗-PCSK9抗體係於不同的時間點投予該對象，例如以預計的間隔隔開之不同日(例如小時、日、週或月)。本發明係包括，包含將一單一起始劑量之抗-PCSK9抗體先後投予病患，接著一或多個第二劑量之抗-PCSK9抗體及視需要接著一或多個第三劑量之抗-PCSK9抗體之方法。
術語「起始劑量」、「第二劑量」和「第三劑量」係指投予抗-PCSK9抗體之暫時順序。因此，「起始劑量」為治療療法開始時所投予之劑量(亦稱為「基線」劑量)；「第二劑量」為在起始劑量之後所投予之劑量；而「第三劑量」為在第二劑量之後所投予之劑量。起始、第二和第三劑量皆可含有相同量之抗-PCSK9抗體，但就給藥的頻率而言，一般可彼此不同。在特定的實施例中，然而，包含在起始、第二及/或第三劑量中之抗-PCSK9抗體的 量，在治療期間可互不相同(例如，若適當經上調或下調)。在特定的實施例中，係在治療療法開始時投予二或多個(例如2、3、4或5個)劑量為「承載劑量」，接著以較低頻率為基礎，投予後續劑量(例如「維持劑量」)。承載劑量可以例如，一週一次，每2週一次、每3週一次、一個月一次、每2個月一次、每3個月一次等之頻率給藥。
在本發明一示例性的實施例中，各第二及/或第三劑量係緊接前面劑量之後的1至60週(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60或或更久)給藥。「緊接前面劑量」一詞，如文中所用，係指在一多重給藥之順序中，抗-PCSK9抗體之劑量，在每個相鄰接的劑量給藥之前係以無插入劑量之順序給藥。
根據本發明此方面之方法可包括將任何數目之第二及/或第三劑量之抗-PCSK9抗體投予一病患。例如，在特定的實施例中，僅將一單一第二劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二劑量投予該病患。同樣的，在特定的實施例中，僅將一單一第三劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三劑量投予該病患。在某些案例中，第二及/或第三劑量可以特定的頻率給藥多年或一對象的終生。
在涉及多重第二劑量之實施例中，各第二劑量可與其他第二劑量相同的頻率來給藥。例如，各第二劑量可在緊接前面劑量後1至60週，投予該病患。同樣的，在涉及多重第三劑量之實施例中，各第三劑量可與其他第三劑量相同的頻率來給藥。例如，各第三劑量可在緊接前面劑量後1至60週，投予該病患。另外，投予病患之第二及/或第三劑量的頻率，在治療療法期間可 不同。在治療期間，給藥頻率亦可依照個別病患之需求在臨床檢查後由醫師做調整。
圖1 係顯示於僅表現小鼠PCSK9(亦即不表現人類PCSK9)之小鼠中，在皮下投予1mg/kg劑量的抗-PCSK9抗體後，於不同的時間點所測量的抗-PCSK9抗體濃度。
圖2A、2B和2C 係顯示於僅表現人類PCSK9(取代小鼠PCSK9)之小鼠中，在皮下投予1mg/kg劑量的抗-PCSK9抗體後，於不同的時間點所測量的抗-PCSK9抗體濃度。用於圖2A、2B和2C所描繪之實驗的抗體說明係如文中表5所示。
圖3A-3G 係顯示來自表面電漿子共振結合實驗之感應圖，其中係讓抗-PCSK9抗體與人類PCSK9抗原在中性pH(pH 7.4)結合，接著換成各種pH(7.4、7.2、6.0和5.75)的緩衝液進行解離期。於這些實驗中所試驗的抗體為：316P(v1)和300N(v2)(圖3A )；VH-D106H和VK-L30H(圖3B )；VH-D106H/VK-L30H和比較子1(圖3C )；比較子2和比較子3(圖3D )；比較子4和比較子5(圖3E )；比較子6和比較子7(圖3F )；及比較子8和比較子9(圖3G )。各圖形中個別的線代表於不同濃度之個別抗體的結合反應。用於這些實驗中的抗體之說明係如文中表5所示。所有的實驗皆在37℃進行。解離半衰期值(t½)係標示在各別的感應圖上方。
 實例
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造及使用本發明方法和組合物之完整揭示和說明，但不希望限制發明人所認為之發明範圍。雖已盡力確保所用的相關數字(例如量、溫度等)之正確性，但仍應考量某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則份數係為重量之份數，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度數表示，而壓力係為或接近大氣壓。
實例1.產生抗人類PCSK9之人類抗體
人類抗-PCSK9抗體係如美國專利第8,062,640號中所述而產生。表1係列出所選的本發明抗-PCSK9抗體之重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列對和CDR的胺基酸序列的識別符及其對應的抗體名稱。
任何表1中所列的抗-PCSK9抗體，係有關個別的重鏈和經鏈可變區及/或CDR之胺基酸序列，可用作母源抗體，如下列非限定操作實例所示，可從其衍生pH-依賴的組胺酸取代變體抗 體。
實例2. 建構組胺酸取代突變的人類抗-PCSK9抗體
命名為300N之抗-PCSK9抗體為已知具有在酸性pH時對PCSK9結合親和力下降之中間pH-依賴性結合性質，及增進的藥物動力學(參見美國專利第8,062,640號)。欲產生帶有更大pH-依賴性結合性質(亦即相較於中性pH，在低pH時結合下降)及活體內改善的效力(例如，較長的抗體血清半衰期、腸其地降膽固醇活性等)之300N變體，係建構一系列變異抗體。特言之，建構突變版本之300N，其中300N之互補決定區(CDR)內的各胺基酸係個別地突變成組胺酸。如表1所示，母源300N抗體之重鏈可變區(HCVR)包括SEQ ID NO：218胺基酸序列，而母源300N抗體之輕鏈可變區(LCVR)係包括SEQ ID NO：226胺基酸序列。母源300N抗體之CDR序列係如表2所示。His-取代的突變，以及衍生自300N之組胺酸取代的變體抗體的對應抗體名稱(例如，VH-G26H、VH-F27H等)，係如表3所示。
就表3中所列的各變體抗體，除了表中所指出的突變CDR序列外，所有的CDR序列係與母源300N抗體相同(包括SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232之CDR序列)。例如， 稱為「VH-D106H」之組胺酸取代的變體抗體係包括具有SEQ ID NO：220、222、788 、228、230、232胺基酸序列之重鏈和輕鏈CDR序列(其中SEQ ID NO：224之HCDR3序列係被SEQ ID NO：788之變體HCDR3序列所置換)。同樣的，稱為「VK-L30H」之組胺酸取代的變體抗體係包括具有SEQ ID NO：220、222、224、802 、230、232胺基酸序列之重鏈和輕鏈CDR序列(其中SEQ ID NO：228之LCDR1序列係被SEQ ID NO：802之變體LCDR1序列所置換)。
實例3A.變體抗-PCSK9抗體在中性和酸性pH時的結合性質
將實例2之組胺酸取代的變體抗體使用於25℃進行的即時電漿子共振生物感測器(Biacore T200)分析，在pH 5.75和pH 7.2就與人類PCSK9的pH-依賴性結合進行試驗。此實驗的目的係辨識出相對於中性pH，在酸性pH時具有與人類PCSK9結合降低之組胺酸取代的變體抗體。
Biacore CM4感測器晶片係由單株小鼠抗-人類Fc抗體衍生，用以捕捉人類抗體。在暫時表現於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞後，從培養基將組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體捕捉至抗-人類Fc感測器表面。將範圍介於3.125nM至500nM之不同濃度、帶有C-端myc-myc-六組胺酸標籤(hPCSK9-mmH)的人類PCSK9(SEQ ID NO：755)以50μl/min之流速注射在捕捉於表面的抗-PCSK9單株抗體上。監測抗體-抗原結合歷時4或5分鐘及然後監測抗原從捕捉的單株抗體解離歷時5或8分鐘。藉由使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體處理數據並與1：1結合模型擬合，測定動力結合(k a )和解離(k d )速率常數。結合解離平衡常數(K D )及解離半 衰期(t1/2 )係由動力速率常數所計算：K D (M)=k d /k a ；及t1/2 (min)=(ln2/(60*k d )。
在pH 7.2(中性)和pH 5.75(酸性)時各組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體與人類PCSK9結合之KD 值和t1/2 值，以及這些個別值之pH 5.75/pH 7.2比率，係如表4所示。母源300N抗體之值係顯示於此表的最下行。KD 值係以體積莫耳濃度(M)表示而t½值係以分鐘(min)表示
如表4所示(所有測量係於25℃)，母源(300N)抗體在pH 7.2和pH 5.75時顯示中度的結合親和力(KD ~0.9-1.0nM)，而相較於pH 7.2，在pH 5.75時t1/2 係降3-倍以上(亦即在pH 5.75時較快解離；pH 5.75/pH7.2比率=0.26)。
數種單一組胺酸取代在pH 7.2和pH 5.75時造成實質上結合下降，而相較於原來的序列，其他的取代對pH依賴性結合影響極小。然而，重要地，相對於母源抗體，數種單一組胺酸取代，相較於pH 7.2，在pH 5.75時造成抗體具有實質上較快的解離速率(在pH 5.75之t1/2 比pH 7.2時之t1/2 低至少5-倍)。此等帶有pH-依賴性結合特性之抗體包括帶有重鏈CDR取代之抗體： VH-W33H、VH-Q53H、VH-I100H、VH-V104H、VH-D106H、VH-M107H和VH-Y112H；及帶有輕鏈CDR取代之抗體：VK-L29H、VK-L30H、VK-N33H、VK-L97H、VK-T99H和VK-P100H。組胺酸取代的變體抗體VH-D106H和VK-L30H具有特別明顯的pH-依賴性結合並選擇供進一步研究用。
為了進一步研究組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體VH-D106H和VK-L30H以及雙組胺酸取代的變體(VH-D106H/VK-L30H)之pH-依賴性結合特性，係將抗體純化並於中性pH(pH 7.4)(表6)及酸性pH(pH 6.0)(表7)使用類似上述條件進行與人類PCSK9結合之試驗。酸性pH對中性pH之結合性質的比率係如表8所示。數種對照/比較抗體亦包括在這些實驗中。此分析中所試驗的抗體之彙總係如表5所示。所有的測量係在25℃進行。
高數值(例如，大於約12)之kd 和KD 的酸性/中性比率，及低數值(例如，低於約0.20)之t½的酸性/中性比率係表示pH-依賴性結合。以這些標準，組胺酸取代的變體抗體VK-L30H和雙突變VH-D106H/VK-L30H，在所有試驗抗體中具有最大幅的pH-依賴性結合特性。特言之，這些抗體各具有大於約28之kd 酸性/中性比率，大於約14之KD 酸性/中性比率，及小於約0.05之t½酸性/中性比率。
實例3B.組胺酸變體抗-PCSK9抗體對人類PCSK9之結合特性： 在中性pH結合及在中性和酸性pH範圍解離
為了進一步評估本發明抗-PCSK9抗體之pH-依賴性 結合特性，係進行結合實驗，其中係於37℃中性pH觀察抗體/抗原結合相及於中性或酸性pH範圍觀察抗體/抗原解離相。
Biacore CM4感測器晶片係以Fab'2多株抗-人類Fc抗體衍生，用以捕捉人類抗體。將選擇的純化組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體(VH-D106H、VK-L30H和VH-D016H/VK-L30H)以及母源抗體(316P和300N)和比較抗體(比較子1-7，參見表5)捕捉至抗-人類Fc感測器表面。將帶有C-端myc-myc-六組胺酸標籤(hPCSK9-mmH)、範圍從3.125nM至50nM之不同濃度的人類PCSK9，以30μl/min之流速注射於抗-PCSK9單株抗體捕捉表面。於pH 7.4觀察抗體-抗原結合歷時6分鐘及然後於pH 7.4、7.2、6.0或5.75觀察抗原從捕捉的單株抗體解離歷時5分鐘。藉由使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體處理及擬合數據，測定解離(k d )速率常數。解離半衰期(t1/2 )係由解離速率常數所計算：t1/2 (min)=(ln2/k d )/60。描繪各種pH條件下抗體之結合/解離特性的感應圖係如圖3A至3G中之圖形所示。
這些實驗結果確認了，相較於母源抗體，組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體VH-D106H、VK-L30H和VH-D016H/VK-L30H在低pH時展現更加快速從抗原解離(如圖3A-3G所示，在pH 6.0和5.75實驗中於360秒點的回應等級上快速下降)。
實例4.變體抗-PCSK9抗體之受體阻斷活性
首先使用ELISA-為基礎的免疫分析，試驗選擇的組胺酸取代變體抗-PCSK9抗體在中性pH時阻斷重組的人類PCSK9與人類LDLR(hLDLR)結合之能力。
簡言之，將以C-端人類Fc標籤("hLDLR EGFA-hFc")表現的人類LDLR之類表皮生長因子A區(SEQ ID NO：758之313-355胺基酸)之2μg/ml的PBS溶液塗覆在69-孔微量滴定盤上，於4℃至隔夜，接著以0.5%(重量/體積)BSA之PBS溶液阻斷。將此盤用於測量在中性pH(pH7.2)時以不同濃度的抗-hPCSK9抗體預平衡過的hPCSK9-mmH溶液中之游離的PCSK9(母源或組胺酸取代的變體)，如表9A所示。
作為測量中性pH(pH 7.2)時抗體之阻斷性質的最初實驗，係將固定最終濃度500pM之hPCSK9-mmH(參見實例3)以範圍從0至約100nM的抗體連續稀釋液預混合，接著於室溫培養1小時讓結合達到平衡。然後將平衡的樣本溶液轉置於如上文描述所製備之塗覆LDLR EGFA-hFc的盤中。1小時培養後清洗塗覆受體的微量滴定盤並使用HRP-接合抗-myc二級抗體(Novus,# NB600-341)偵測與盤-結合的hPCSK9-mmH，及使用TMB HRP基質(BD Biosciences,# 555214)展開比色訊號。記錄450nm之吸收度，以反映於預平衡的PCSK9-抗體溶液中能與盤-塗覆的LDLR受體結合之游離的hPCSK9-mmh濃度。IC50 值，定義為與無抗體相比產生50%樣本之PCSK9-mmH結合訊號降低的抗體濃度，係使用Prism軟體(GraphPad)由數據所測，並顯示於表9A中。(進行二個個別的實驗；在各實驗中並非每一種抗體皆有試驗，如表9A中虛線[--]所示)。
母源抗體300N顯示約0.20nM之IC50 值。相較於300N，組胺酸取代的變體抗體一般具有輕微效力上降低，但皆保持IC50 值<1.0nM。VK-L30H變體保持接近母源抗體之阻斷效力(在二次個別測量中IC50 值為0.17和0.20nM)。
然後將本發明組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體之亞群和比較抗體就中性和低pH條件下阻斷重組的人類PCSK9與人類LDLR(hLDLR)結合之能力，使用類似的ELISA-為基礎的免疫分析進行試驗。
簡言之，將hLDLR EGFA-hFc以2μg/mL之PBS溶液塗覆在96-孔微量滴定盤上，於4℃至隔夜，接著以0.5%(重量/體積)BSA之PBS溶液阻斷。將此盤用於測量在中性pH(pH7.2)或低(pH 5.75)pH時以不同濃度的抗-hPCSK9抗體預平衡過的hPCSK9-mmH溶液中之游離的hPCSK9-mmH。
就阻斷試驗，係將固定最終濃度500pM之hPCSK9-mmH(參見實例3)以範圍從0至約200nM的抗體連續稀釋液預混合，接著於室溫培養1小時讓結合達到平衡。取一組此混合物於pH 7.2之緩衝液中預結合並取第二組於pH 5.75之緩衝液中預結合。然後將平衡的樣本溶液轉置於塗覆LDLR EGFA-hFc 的盤中。1小時培養後清洗塗覆受體的微量滴定盤，並使用HRP-接合抗-myc二級抗體(Novus,# NB600-341)偵測與盤-結合的hPCSK9-mmH，並使用TMB HRP基質(BD Biosciences,# 555214)展開比色訊號。記錄450nm之吸收度以反映游離的hPCSK9-mmh濃度並對抗體濃度作圖。IC50 值，定義為產生無抗體存在下50%游離PCSK9-mmH訊號降低的抗體濃度，係使用Prism軟體(GraphPad)由數據所測。二個分析的IC50 值以及反映結合能力之pH依賴性所計算的比率係顯示於表9B中。
記錄為<1.25E-10之IC50 數據具有低於假設一抗體可與二個配體結合位置結合之分析理論底線的計算值。使用括號中實際得到的值產生比率。不能判斷=因於不規則的鐘型抗體劑量反應曲線，而無可計算之IC50 。
如表9B所示，大部分的比較抗體，相較於中性pH在酸性pH時不具有或具有極小降低阻斷活性(參見，例如比較子2、5、6、7、8及9相較於中性pH在酸性pH時於阻斷活性上皆少於3-倍的降低)。比較子3和4在阻斷能力上展現中度的降低，其中酸性/中性IC50 比率分別為35.9和19.2。相反的，二種本發明之示例性組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H，在酸性pH時對PCSK9/LDLR阻斷活性具有戲劇性降低，其中酸性/中性IC50 比率大於約200。
此實驗之結果確認了本發明之組胺酸變體抗-PCSK9抗體的pH-依賴性結合特性反映了這些抗體在中性和酸性pH時能阻斷PCSK9和LDLR間的相互作用之程度。
實例5.活體外變體抗-PCSK9抗體阻斷PCSK9-媒介的LDL吸收之抑制作用之能力
選擇的組胺酸取代變體抗-PCSK9抗體於活體外增加LDL吸收之能力係使用人類肝細胞癌細胞株(HepG2,ATCC # HB-8065)所測定。將HepG2細胞以2 x 104個細胞/孔，植入96-孔盤中5%脂蛋白缺乏的血清(LPDS,Millipore,# LP4)之DMEM，並於37℃、5% CO2培養至隔夜形成HepG2單層。將2nM的重組人類PCSK9(SEQ ID NO：755，以C-端myc-myc六組胺酸標籤及D374Y突變表現；"hPCSK9-D374Y-mmH")或50nM的重組獼猴PCSK9(以C-端myc-myc六組胺酸標籤表現；MfPCSK9-mmH；SEQ ID NO：761)加入各種抗體濃度(從50nM至0.098nM連續稀釋液)之LPDS培養基中。培養至隔夜後，將BODIPY-LPL(Invitrogen,L3483)之LPDS培養基加到細胞中至0.01mg/mL的最終濃度。BODIPY-LPL的吸收係於37℃培養6小時後，藉由螢光盤判讀儀(Molecular Devices Flexstation III)使用激發/發射濾光器設定在390nm/520nm所偵測。各試驗的抗-PCSK9抗體之IC50值係如表10所示(IC50=LDL吸收增加50%之抗體濃度)。
如表10所示，此分析中所有試驗的組胺酸取代變體抗-PCSK9抗體皆以低於5nM之IC50 值阻斷hPCSK9-D374Y-mmH-媒介的LDL吸收抑制作用(亦即提升LDL吸收)，及以低於22nM之IC50 值阻斷MfPCSK9-mmH-媒介的LDL吸收抑制作用(亦即提升LDL吸收)。
本發明之抗-PCSK9抗體亞群和比較抗體(參見表5)在活體外增加LDL吸收之能力亦使用上述相同的人類肝細胞癌細胞株分析法，但係以重組的野生型人類PCSK9(SEQ ID NO：755，以C-端myc-myc六組胺酸標籤表現；"hPCSK9-mmh")。加入100nM恆定的hPCSK9-mmH與不同濃度的抗體(從2000nM至0.034nM之連續稀釋液)之LPDS培養基。各試驗的抗-PCSK9抗體之IC50 值係如表11A所示(IC50 =LDL吸收增加50%時之抗體濃度)。
如表11A所示，10種試驗的抗-PCSK9抗體以介於26nM至37nM之IC50 值抑制hPCSK9-mmh，比較子1僅以18nM 之IC50 值部分抑制hPCSK9-mmh。
本發明之抗-PCSK9抗體和比較抗體亞群(參見表5)在活體外增加LDL吸收之能力亦使用上述相同的人類肝細胞癌細胞株分析法，使用重組的野生型人類PCSK9(SEQ ID NO：755，以C-端myc-myc六組胺酸標籤表現；"hPCSK9-mmh")、人類PCSK9(以C-端myc-myc六組胺酸標籤及D374Y突變表現；"hPCSK9-D374Y-mmH")或重組的獼猴PCSK9(以C-端myc-myc六組胺酸標籤表現；MfPCSK9-mmH；SEQ ID NO：761)所測定。加入50nM恆定的hPCSK9-mmH、2nM恆定的hPCSK9-D374Y-mmH或50nM恆定的MfPCSK9-mmH與不同濃度的抗體(對於hPCSK9-mmH或MfPCSK9-mmH阻斷，抗體濃度從500nM開始以1：2連續稀釋；對於hPCSK9-D374Y-mmH阻斷，抗體濃度從50nM開始以1：2連續稀釋)之LPDS培養基。各試驗的抗-PCSK9抗體之IC50 值係如表11B所示(IC50 =LDL吸收增加50%時之抗體濃度)。
如表11B所示，VK-L30H係以9nM之IC50 值阻斷hPCSK9-mmH，而316(v1)和300N(v2)分別係以7.8nM和10.3nM之IC50 值阻斷hPCSK9-mmH。此分析中所試驗的比較抗體係以範圍從8.9nM至39.3nMnM之IC50 值阻斷hPCSK9-mmH。VK-L30H係以3.3nM之IC50 值阻斷hPCSK9-D374Y-mmH，而316(v1)和300N(v2)二者係以2nM之IC50 值阻斷hPCSK9-mmH。比較子7係以0.97nM之IC50 值阻斷hPCSK9-D374Y-mmH，而比較子9係以10.6nM之IC50 值部分阻斷hPCSK9-D374Y-mmH及比較子8並未展現任何可測量的hPCSK9-D374Y-mmH阻斷性。VK-L30H係以26.4nM之IC50 值阻斷MfPCSK9-mmH，而316(v1)和300N(v2)分別係以10.3nM和15.7nM之IC50 值阻斷MfPCSK9-mmH。比較子7和9分別係以10.4nM和33.9nM之IC50 值阻斷MfPCSK9-mmH，而比較子8係以77.2nM之IC50 值阻斷MfPCSK9-mmH。
實例6.在野生型和PCSK9人源化小鼠中變體抗-PCSK9抗體之藥物動力學分析
於野生型(WT)小鼠和以同型接合子表現人類PCSK9取代小鼠PCSK9之小鼠(人源化PCSK9小鼠)中，其中所有的小鼠係具有相同的品系背景(75% C57BL6及25% 129Sv)，進行三種組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體(VH-D106H、VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H)與其母源抗體分子之藥物動力學清除率比較。各抗體係於5隻WT和5隻人源化PCSK9小鼠中試驗。所有的抗體係以1mg/kg之劑量經皮下給藥。除了於抗體注射的前一天收集 血液(前取血)外，於注射後6h、1、2、3、4、7、10、14、21、30、39、50、60和74天收集血液。將血液中的血清部分分離並使用ELISA免疫分析進行總血清抗體分析。簡言之，將1μg/mL的山羊抗-人類IgG多株抗體(Jackson ImmunoResearch,# 109-005-098)藉由於4℃培養至隔夜塗覆在96-孔盤上。隔天將測定盤以BSA阻斷及然後清洗。然後將六-劑量的連續稀釋液之血清樣本及12-劑量連續稀釋液之個別抗體的參照標準加到測定盤中，並於室溫培養1小時。以清洗移除未結合的抗體後，將盤-捕捉的人類抗體使用山羊抗-人類IgG多株抗體(Jackson ImmunoResearch,# 109-005-098)偵測。清洗測定盤及然後以比色的四甲基聯苯胺(TMB)基質根據製造商(BD Pharmingen)的建議展色。於450nm測量吸收度並使用樣本盤中所產生的參照標準曲線計算血清樣本中人類IgG之濃度。結果係如圖1和2A所示，其係分別顯示WT和人源化小鼠中試驗的四種抗-PCSK9抗體之濃度變化的時程。各組於實驗期間之平均血清抗體濃度(μg/ml±SEM)係如表12(第14、21和30天)、表13(第39、50和60天)和表14(第74天)所示。
如圖1所示，四種試驗的抗體在約第1-2天達到類似的Cmax ，並在WT小鼠中顯示類似的清除率，具重疊的藥物動力學樣態。在人源化PCSK9小鼠中(圖2A)，母源抗體300N，相較於所試驗的組胺酸取代變體抗-PCSK9抗體，顯現較快的清除率。於第14天時，人源化PCSK9小鼠中300N之抗體濃度在偵測極限以下(<0.02μg/ml)，相對的，在WT小鼠中約8μg/ml，其顯示母源抗體之快速人類PCSK9-媒介的清除率。在人源化PCSK9小鼠中組胺酸取代的變體抗體VH-D106H比母源抗體顯現較慢的清除 率，其中在人源化PCSK9小鼠中第14天的平均抗體濃度約0.7μg/ml。於人源化PCSK9小鼠中，VH-D106H之抗體濃度在約第50天降至偵測極限以下。在人源化PCSK9小鼠中，相較於VH-D106H或母源抗體，組胺酸取代的變體抗體VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H展現較慢的清除率，其中在第14天的平均抗體濃度分別為大約10μg/ml和5μg/ml。VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H之血清的抗體量，直到至少第74天仍在可偵測的範圍內(>0.02μg/ml)。特言之，在人源化PCSK9小鼠中VK-L30H之血清濃度直到第74天仍在0.25μg/ml以上。
接著，將VH-D106H和VK-L30H之藥物動力學清除率與其母源抗體(300N)以及六種比較子抗-PCSK9抗體做比較(如表5所定義比較子1、2、3、4、5和6)。此組實驗係於帶有75% C57BL6和25% 129Sv品系背景之人源化PCSK9小鼠中進行。各抗體係以一組5隻小鼠進行試驗，且所有的抗體係以1mg/kg之劑量經皮下給藥。除了於抗體注射的前收集血液(前取血)外，於注射後6h、1、2、3、4、7、10、14、21、30、45和74天收集血液。個別樣本中總人類抗體之分析係使用ELISA進行，偵測人類IgG Fc。結果為圖2B中以總人類抗體量之時間過程作圖。各組隨時間之平均血清抗體濃度係如表15(第14、21和30天)及表16A(第45和74天)所示。
如圖2B所示，所有試驗的抗體在約第1-2天達到最大血清濃度(Cmax )，其中六種抗體(300N、VH-D106H、VK-L30H、比較子1、比較子3和比較子4)具有類似的Cmax ；其他的三種抗體(比較子2、比較子5和比較子6)具有大約2-3倍較低的Cmax 。相較於其他試驗抗體，抗體300N、比較子2、比較子5和比較子6 具有較快清除率。如表15所示，四種抗體的抗體濃度在第14天係在偵測極限以下(<0.02ug/ml)。相反的，VH-D106H抗體、比較子1和比較子4在第14天具有範圍從0.5μg/mL至2μg/mL之血清濃度；而VK-L30H抗體和比較子3在第14天具有大約7μg/mL之血清濃度。在第30天，VH-D106H抗體、比較子1抗體、VK-L30H和比較子3仍為可偵測的，各組的平均藥物血清濃度分別為0.07、0.07、1.04和1.85μg/mL。VK-L30H和比較子3抗體之血清量直到至少第74天(表16A)仍為可偵測的範圍(>0.02μg/mL)。
然後進行一另外的研究，比較抗-PCSK9抗體，包括316P(v1)、316P(v2)、300N(v1)、300N(v2)、VK-L30H和三種比較子抗-PCSK9抗體(比較子7、8和9，如表5所定義)之藥物動力學清除率。此組實驗係於帶有75% C57BL6和25% 129Sv品系背景之人源化PCSK9小鼠中進行。各抗體係以一組5隻小鼠進行試驗，且所有的抗體係以1mg/kg之劑量經皮下給藥。除了於抗體注射的前收集血液(前取血)外，於注射後6h、1、2、3、4、8、10、14、21和30天收集血液。個別樣本中總人類抗體之分析係使用ELISA進行，偵測人類IgG Fc。將結果以隨時間過程之總人類抗體量作圖於圖2C中。各組隨時間之平均血清抗體濃度係如表16B所示(第14、21和30天)。
如圖2C所示，所有的試驗抗體在約第1天達到最大血清濃度(Cmax )，其中七種抗體[316P(v1)、316(v2)、300N(v1)、300N(v2)、比較子7、比較子8和比較子9]具有類似的Cmax ；而相較於其他試驗抗體，VK-L30H具有大約1.5至2倍較高的Cmax 。316P(v1)抗體、316P(v2)、300N(v2)和比較子7具有較快清除率。如表16B所示，四種抗體的抗體濃度在第14天係在偵測極限以下(<0.02ug/ml)。相反的，300N(v1)抗體、比較子8和比較子9在第14天具有範圍從0.4μg/mL至0.7μg/mL之血清濃度；而VK-L30H抗體在第14天具有大約7μg/mL之血清濃度。在第30天，VK-L30H抗體和比較子8仍為可偵測的，此二組的平均藥物血清濃度分別為0.09和3.34μg/mL。
此實例顯示，相較於不具有pH-依賴性結合特性或僅具有中間pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體(例如，300N和比較子2、5和6)，帶有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體(例如，VH-106H、VK-L30H和VH-D106H/VK-L30H)具有增進的藥物動力學性質(例如，長期較高的血清抗體量)。
實例7.活體外變體抗-PCSK9抗體之降膽固醇活性
活體外抗-人類PCSK9抗體對血清LDL-C量之效用係於以同型接合子表現人類PCSK9取代小鼠PCSK9以及異型接合子表現小鼠(Pcsk9 hum/hum Ldlr +/- )之小鼠中測定。將小鼠於實驗前5 天預取血並以其LDL-C量為基準分入治療組，使得各組之平均LDL-C量為相等的。然後在研究的第0天將小鼠以皮下注射10mg/kg劑量的抗-PCSK9抗體或無關特異性之同型對照抗體。就此研究而言，係使用二種非修飾的母源抗-PCSK9抗體(316P和300N)和二種組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體(VK-L30H和VH-D106H)。此實驗係使用二種316P版本，316P(v1)和316P(v2)。316P(v1)具有人類IgG1 Fc，而316P(v2)具有人類IgG4 Fc。所有其他的試驗抗體具有人類IgG4 Fc。(用於此實例之"300N"抗體係與用於文中實例3之"300N(v2)"抗體相同)。各治療組係使用五隻小鼠。
將小鼠於注射後第4、7、14、20、26、33、42、46和52天取血。血清中LDL-C量係使用ADVIA® 1800 Chemistry System(Siemens)所測定。然後就各治療組就各時間點計算血清中平均LDL-C，及結果，以(平均±SEM)表示，係如表17所示。數值係以平均LDL-C量(mg/dL)(±SEM)表示。表18係顯示與基線相比LDL-C量之下降百分比。
如表17和18中所示，將單一10mg/kg劑量的組胺酸取代的變體抗體(VK-L30H和VH-D106H)投予Pcsk9 hum/hum Ldlr +/- 小鼠，與基線相比在第7天各造成大於約45%，在第14天與基線相比造成大於約44%之LDL-C降低。再者，經單一劑量之VK-L30H治療的小鼠與基線相比具有至少33%持續的LDL-C降低直到第33天。在單一10mg/kg劑量後，經VK-L30H治療的小鼠LDL-C量在第46天仍低於基線幾乎20%。給予VH-D106H之小鼠如同VK-L30H具有類似的最初下降量，但在第33天與基線相比LDL-C量僅下降約13%。單一劑量的316P(v1)，與基線相比亦大約造成與VK-L30H相同之最初的LDL-C下降百分比(在抗體給藥 後第7天，與基線相比大約下降49%)，但降LDL-C效應不像組胺酸取代的突變體延長。316P(v2)和300N顯示最佳的短期降LDL-C效應(各抗體在第7天與基線相比大約下降58%)，但相較於組胺酸取代的突變體具有較短的持續性效應。
各治療組小鼠中循環的人類抗體量亦使用標準的ELISA分析來測定。於4℃將測定盤以1μg/ml之PBS溶液塗覆山羊抗-人類Fc抗體(Jackson ImmunoResearch,#109-005-098)歷時18小時。然後將測定盤於室溫(RT)阻斷3小時。產生標準曲線，將各抗體以2-倍稀釋加入盤中。從抗體注射後的第4、7、14、20、26、33、42和46天之小鼠血清以1：100，1：200，1：500，1：2000，1：4000和1：8000稀釋加入盤中及然後於RT培養2小時。使用山羊抗-人類IgG HRP接合抗體(Jackson ImmunoResearch,#109-035-098)偵測捕捉的抗體並使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)(MP Biomedicals,#152346)基質展開比色訊號。以2.0M H2 SO4 停止反應及然後記錄450nm之吸收度，用以測量小鼠血清中人類抗體的總量。計算試驗的治療組中各時間點的平均抗體量及結果係如表19所示。數值係以平均總血清抗體量(μg/mL)(±SEM)來表示。
母源抗體316P(v1)、316P(v2)和300N分別在第14、20和26天從循環中清除，其在所指的時間點，從經這些抗體治療之小鼠的血清樣本中並未偵測到人類抗體。相反的，在經組胺酸取代的突變體抗體VK-L30H和VH-D106H治療之小鼠的血清樣本中偵測到人類抗體直到至少第55天。人類抗體之量與各時間點所觀察到的降膽固醇程度大致相關。因此，本發明之組胺酸取代的變體抗體以比母源抗體更長的時間留在經治療動物的循環中，並比母源抗體更長時間降低血清LDL-C。
最後，於各時間點測量各治療組之小鼠血清中的人類PCSK9總量。結果，以人類PCSK9之ng/mL表示，係如表20所示。
抗體投予後至少42天，經組胺酸取代的變體體體VK-L30H和VH-D106H治療之小鼠中的總PCSK9仍維持在1500ng/mL以上。相反的，在所有其他的治療組中，在第20天或更早，總PCSK9量降至1000ng/mL以下。
接著，使用Pcsk9 hum/hum Ldlr +/- 小鼠評估組胺酸取代的變體抗-PCSK9抗體VK-L30H相對於各種比較子抗-PCSK9抗體(如表5中所定義之比較子1、2、3和4)在血清LDL-C方面之效應。將小鼠於實驗前8天預取血，並以其LDL-C量為基準分入治療組，使得各組之平均LDL-C量為相等的。然後在研究的第0天將小鼠(n=5/每治療組)以皮下注射10mg/kg劑量的抗-PCSK9抗體或無關特異性之同型(hIgG4)對照抗體。將小鼠於注射後第4、7、14、21、28、42、49、63和77天取血並以ADVIA® 1800 Chemistry System(Siemens)測定血清中LDL-C量。然後就各治療組就各時間點計算 血清中平均LDL-C，及結果，以平均LDL-C量(mg/dL)(±SEM)表示，係如表21所示。表22係顯示與基線(亦即第8天)相比之LDL-C量的下降百分比。
表22：與基線相比[第8天]LDL-C量之百分比變化
如表21和22所示，將單一10mg/kg劑量的組胺酸取代的變體抗體VK-L30H投予Pcsk9 hum/hum Ldlr +/- 小鼠，造成在所有77天的測量中與基線相比大於30%的LDL-C下降，其中在第14天與基線相比約52%之最大的LDL-C下降。相比之下，以比較子2給劑的小鼠在抗體給藥後第7天具有約40%之最大的LDL-C下降，但在抗體給藥後第14天或之後的任何時間點，此降低程度並不明顯。單一劑量的比較子1顯示延長的LDL-C下降(其中在第14天與激險相比約37%之最大的LDL-C下降)，但從第42天至實驗結束的第77天，此LDL-C下降之程度與基線相比僅約9%至24%。雖然以ELISA確認循環中有抗體存在，但比較子3和4在降低LDL-C上並未顯現可測量的效用。
各治療組之小鼠中循環的人類抗體量係使用ELISA 法偵測總人類IgG Fc所測定。計算試驗的治療組中在第4、7、14、21、28、42、49、63和77天之小鼠血清的平均抗體量，及結果，以平均總血清抗體量(μg/mL)(±SEM)表示，係如表23所示。
比較子2和比較子4分別在第28和77天從循環中清除，在所指的時間點之後，經這些抗體治療的小鼠從血清樣本 中並未偵測到人類抗體。相反的，在經組胺酸取代的變體抗體VK-L30H以及比較子1和3治療的小鼠之血清樣本中偵測到人類抗體在第77天仍偵測到人類抗體。在第77天，相較於所有其他治療組，VK-L30H治療組具有最高的人類抗體可測量。
最後，於各時間點測量各治療組小鼠之血清中的人類PCSK9總量。結果，以平均人類PCSK9量(ng/mL)(±SEM)表示，係如表24所示。
在此實驗中，於抗體投予後，經組胺酸取代的變體抗體VK-L30H和比較子3治療的小鼠中之總人類PCSK9量維持在2500ng/mL以上達至少77天。相反的，比較子2和比較子4治療組之總PCSK9量焚別在第21和42天掉到1000ng/mL以下。比較子1治療組之總PCSK9量從未高於1000ng/mL。
本發明並不限制於文中所述的特定實施例之範圍中。實際上，除了該等文中所述之外，由前述說明及伴隨的圖示，各種本發明之修改對熟習本項技術者為顯而易見。此等修改係希望落在所附的申請專利範圍內。
<110> George D.Yancopoulos Nicholas J.Papapopoulos Andrew J.Murphy Neil Stahl
<120> 具有pH-依賴性結合特性之抗-PCSK9抗體
<130> 8450A
<140> 分派至
<141> 隨附提交
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<221> 變體
<222> (1)...(20)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<220>
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<221> 變體
<222> (1)...(3)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<221> 變體
<222> (1)...(9)
<223> Xaa=任何胺基酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 753
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<211> 2076
<212> DNA
<213> 智人
<400> 754
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 755
<210> 756
<211> 692
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<213> 獼猴
<400> 756
<210> 757
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<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 758
<210> 759
<211> 753
<212> PRT
<213> 智人
<400> 759
<210> 760
<211> 785
<212> PRT
<213> 智人
<400> 760
<210> 761
<211> 692
<212> PRT
<213> 長尾獼猴
<400> 761
<210> 762
<211> 698
<212> PRT
<213> 黃金倉鼠
<400> 762
<210> 763
<211> 691
<212> PRT
<213> 褐大鼠
<400> 763
<210> 764
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 807
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 809
<210> 810
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<210> 811
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<210> 813
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<210> 820
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 820

Claims (51)

  1. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其如表面電漿子共振所測，係以在中性pH時比酸性pH時高至少13倍的親和力與人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)結合。
  2. 如申請專利範圍第1項之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係以在中性pH時比酸性pH時高至少14倍的親和力與PCSK9結合。
  3. 如申請專利範圍第2項之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係以在中性pH時比酸性pH時高至少15倍的親和力與PCSK9結合。
  4. 一種與人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)結合之分離的或其抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，在25℃時該抗體或其抗原結合片段與PCSK9結合之酸性/中性KD 比率係大於約12.5。
  5. 一種與人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)結合之分離的或其抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，在25℃時該抗體或其抗原結合片段與PCSK9結合之酸性/中性Kd 比率係大於約7.5。
  6. 一種與人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)結合之分離的或其抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，在25℃時該抗體或其抗原結合片段與PCSK9結合之酸性/中性t½比率係小於約0.14。
  7. 一種分離的或其抗原結合片段，其在25℃及酸性pH係以低於約4.5分鐘之解離半衰期(t½)與人類前蛋白轉化酶枯 草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)結合，其中該抗體或其抗原結合片段在25℃及中性pH係以大於約35分鐘之t½與PCSK9結合。
  8. 如申請專利範圍第7項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在25℃及酸性pH係以低於約2分鐘之解離半衰期(t½)與PCSK9結合，其中該抗體或其抗原結合片段在25℃及中性pH係以大於約35分鐘之t½與PCSK9結合。
  9. 如申請專利範圍第8項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在25℃及酸性pH係以低於約1.5分鐘之解離半衰期(t½)與PCSK9結合，其中該抗體或其抗原結合片段在25℃及中性pH係以大於約35分鐘之t½與PCSK9結合。
  10. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其如表面電漿子共振所測，在酸性pH時與PCSK9結合之t½比中性pH時抗體與PCSK9結合之t½短至少10倍。
  11. 如申請專利範圍第10項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在酸性pH時與PCSK9結合之t½比中性pH時該抗體與PCSK9結合之t½短至少15倍。
  12. 如申請專利範圍第11項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在酸性pH時與PCSK9結合之t½比中性pH時該抗體與PCSK9結合之t½短至少20倍。
  13. 一種抗體或其抗原結合片段其係以在中性pH時比酸性pH時高至少12倍的親和力與PCSK9結合，其中該抗體 或其抗原結合片段在酸性pH時與PCSK9結合之t½比中性pH時該抗體與PCSK9結合之t½短至少10倍。
  14. 一種抗體或其抗原結合片段，其在中性pH時阻斷人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)和低密度脂前蛋白受體(LDLR)間的相互作用，其IC50 值比在酸性pH時該抗體或其抗原結合片段之PCSK9/LDLR阻斷IC50 值低至少36倍。
  15. 如申請專利範圍第1項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段當以約10mg/kg之單一劑量投予一對象時，與基線相比降低血清LDL-C至少33%，且其中該血清LDL-C之降低係在投藥後持續至少26天。
  16. 如申請專利範圍第15項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段當以約10mg/kg之單一劑量投予一對象時，與基線相比降低血清LDL-C至少33%，且其中該血清LDL-C之降低係在投藥後持續至少33天。
  17. 如申請專利範圍第1項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段當以約10mg/kg之單一劑量投予一對象時，與基線相比降低血清LDL-C至少15%，且其中該血清LDL-C之降低係在投藥後持續至少42天。
  18. 如申請專利範圍第17項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段當以約10mg/kg之單一劑量投予一對象時，與基線相比降低血清LDL-C至少15%，且其中該血清LDL-C之降低係在投藥後持續至少55天。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包含一重鏈可變區(HCVR)和一輕鏈可變區(LCVR)， 其中HCVR係包含SEQ ID NO：218或包含一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸取代之SEQ ID NO：218的變體：N52H、Q53H、I100H、V101H、V104H、D106H、M107H、D108H和Y112H；且其中LCVR係包含SEQ ID NO：226或包含一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸取代之SEQ ID NO：226的變體：L29H、L30H、N33H、G34H、Y37H、L97H、T99H和P100H。
  20. 如申請專利範圍第19項之分離的抗體或抗原結合片段，其中HCVR係包括包含D106H胺基酸取代之SEQ ID NO：218變體；及其中LCVR係包括SEQ ID NO：226。
  21. 如申請專利範圍第19項之分離的抗體或抗原結合片段，其中HCVR係包括SEQ ID NO：218；及其中LCVR係包括包含L30H胺基酸取代之SEQ ID NO：226變體。
  22. 如申請專利範圍第19項之分離的抗體或其抗原結合片段，其中HCVR係包括包含D106H胺基酸取代之SEQ ID NO：218變體；及其中LCVR係包括包含L30H胺基酸取代之SEQ ID NO：226變體。
  23. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之分離的抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包含3個重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2和HCDR3)及3個輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1係包含SEQ ID NO：220(母源)；其中HCDR2係包含由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：222(母源)、772(N52H)和773(Q53H)；其中HCDR3係包含由下列組成之群中選出的胺基酸序列： SEQ ID NO：224(母源)、782(I100H)、783(V101H)、786(V104H)、788(D106H)、789(M107H)、790(D108H)和794(Y112H)；其中LCDR1係包含由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：228(母源)、801(L29H)、802(L30H)、804(N33H)、805(G34H)和808(Y37H)；其中LCDR2係包含SEQ ID NO：230(母源)；及其中LCDR3係包含由下列組成之群中選出的胺基酸序列：SEQ ID NO：232(母源)、815(L97H)、817(T99H)和818(P100H)。
  24. 如申請專利範圍第23項之分離的抗體或抗原結合片段，其中HCDR2係包含SEQ ID NO：222(母源)；HCDR3係包含SEQ ID NO：224(母源)或788(D106H)；LCDR1係包含SEQ ID NO：228(母源)或802(L30H)；及LCDR3係包含SEQ ID NO：232(母源)。
  25. 如申請專利範圍第24項之分離的抗體或抗原結合片段，其中HCDR3係包含SEQ ID NO：788(D106H)，及LCDR1係包含SEQ ID NO：228(母源)。
  26. 如申請專利範圍第24項之分離的抗體或抗原結合片段，其中HCDR3係包含SEQ ID NO：224(母源)，及LCDR1係包含SEQ ID NO：802(L30H)。
  27. 如申請專利範圍第24項之分離的抗體或抗原結合片段，其中HCDR3係包含SEQ ID NO：788(D106H)，及LCDR1係包含SEQ ID NO：802(L30H)。
  28. 一種於一對象中降低血清LDL-C之方法，該方法係包括將一包含治療上有效量之如申請專利範圍第1至27項中 任一項之分離的抗體或抗原結合片段的醫藥組成物投予該對象。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中在投予醫藥組成物後該對象之血清LDL-C量與基線相比降低至少33%，且該血清LDL-C之降低係持續至投藥後至少26天。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中在投予醫藥組成物後該對象之血清LDL-C量與基線相比降低至少33%，且該血清LDL-C之降低係在投藥後持續至少33天。
  31. 如申請專利範圍第28項之方法，其中在投予醫藥組成物後該對象之血清LDL-C量與基線相比降低至少15%，且該血清LDL-C之降低係持續至投藥後至少42天。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中在投予醫藥組成物後該對象之血清LDL-C量與基線相比降低至少15%，且該血清LDL-C之降低係在投藥後持續至少55天。
  33. 一種治療高膽固醇血症之方法，係包括將一包含治療上有效量之如申請專利範圍第1至27項中任一項之分離的抗體或抗原結合片段的醫藥組成物投予有此需要之病患。
  34. 一種與人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)結合之分離的或其抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，在25℃時該抗體或其抗原結合片段與PCSK9結合之酸性/中性KD 比率係介約3.0至8.0之間。
  35. 如申請專利範圍第34項之分離的抗體或抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，在25℃時該抗體或抗原結合片段與PCSK9結合之酸性/中性KD 比率係介約4.0至7.0之間。
  36. 如申請專利範圍第35項之分離的抗體或抗原結合片段， 其中如表面電漿子共振所測，在25℃時該抗體或抗原結合片段與PCSK9結合之酸性/中性KD 比率係介約5.0至7.0之間。
  37. 如申請專利範圍第34至36項中任一項之分離的抗體或抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，在25℃時該抗體或抗原結合片段與PCSK9結合之酸性/中性t½比率係低於約0.14。
  38. 如申請專利範圍第37項之分離的抗體或抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，在25℃時該抗體或抗原結合片段與PCSK9結合之酸性/中性t½比率係低於約0.13。
  39. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，該抗體或其抗原結合片段在pH6.0及25℃時係以低於約35分鐘及大於約10.5分鐘之t½與人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)結合。
  40. 如申請專利範圍第39項之分離的抗體或抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，該抗體或其抗原結合片段在pH 6.0及25℃時係以低於約20分鐘及大於約12分鐘之t½與人類PCSK9結合。
  41. 如申請專利範圍第40項之分離的抗體或抗原結合片段，其中如表面電漿子共振所測，該抗體或其抗原結合片段在pH 6.0及25℃時係以低於約16分鐘及大於約14分鐘之t½與人類PCSK9結合。
  42. 一種產生帶有pH-依賴性結合特性之抗體的方法，該方法包括：(a)篩選一群抗體以辨識具有至少中間pH-依賴性結合抗原之一或多種抗體：及(b)將(a)中所辨識出的抗體進行致突變作用以增進此抗體對此抗原之pH-依賴性結 合。
  43. 如申請專利範圍第42項之方法，其中篩選步驟(a)係包括辨識以大於約3.0但低於約8.0之酸性/中性KD 比率與抗原結合之抗體。
  44. 如申請專利範圍第42項之方法，其中篩選步驟(a)係包括辨識以低於約1.0但大於約0.15之酸性/中性t½比率與抗原結合之抗體。
  45. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該酸性/中性KD 比率係於酸性pH及於中性pH使用表面電漿子共振分析所測。
  46. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該酸性/中性t½比率係於酸性pH及於中性pH使用表面電漿子共振分析所測。
  47. 如申請專利範圍第42項之方法，其中致突變步驟(b)係包括將抗體的至少一個互補決定區(CDR)中的一或多個胺基酸以組胺酸取代。
  48. 如申請專利範圍第42至47項中任一項之方法，其中由步驟(a)和(b)所產生的抗體係具有等於或大於約4.0之酸性/中性KD 比率，及/或等於或小於約0.14之酸性/中性t½比率。
  49. 一種產生帶有pH-依賴性結合特性之抗體的方法，該方法包括：(a)篩選一群抗體以辨識出一或多種在pH 6.0時對抗原具有大於約20分鐘但小於約40分鐘之t½的pH-依賴性結合之抗體；及(b)將(a)中所辨識的抗體進行致突變作用以產生保留pH-依賴性結合特性、但具有在pH 6.0時t½低於約20分鐘之抗體。
  50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中致突變步驟(b)係產生具有在pH 6.0時t½低於約5分鐘之抗體。
  51. 如申請專利範圍第42至50項中任一項之方法，其中該抗原為PCSK9。
TW102128784A 2012-08-13 2013-08-12 具有ｐＨ－依賴性結合特性之抗－ＰＣＳＫ９抗體 TWI596115B (zh)

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US (1) US9540449B2 (zh)
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UY (1) UY34975A (zh)
WO (1) WO2014028354A1 (zh)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2592271T3 (es) 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
EP4218801A3 (en) 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
EP4342995A3 (en) 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
WO2009041643A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cdrのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
AR068563A1 (es) 2007-09-26 2009-11-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo mutante
JP4954326B2 (ja) 2008-04-11 2012-06-13 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP3674317A1 (en) 2009-03-19 2020-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2011037158A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
PT2644698T (pt) 2010-11-17 2018-01-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula multiespecífica de ligação ao antigénio com uma função alternativa à função do fator viii de coagulação do sangue
EP4231014A3 (en) 2010-11-30 2024-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
KR20200133826A (ko) 2011-01-28 2020-11-30 사노피 바이오테크놀로지, 소시에떼 빠르 악씨옹 셍쁠리피에 특정 대상자 그룹의 치료 방법에 이용하기 위한 ｐｃｓｋ9에 대한 인간 항체
US20140093496A1 (en) 2011-02-25 2014-04-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
EA028278B1 (ru) 2011-09-16 2017-10-31 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ УРОВНЕЙ ЛИПОПРОТЕИНА(а) ПОСРЕДСТВОМ ВВЕДЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОПРОТЕИНКОНВЕРТАЗЫ СУБТИЛИЗИН/КЕКСИН-9 (PCSK9)
TW201326209A (zh) 2011-09-30 2013-07-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP2762493B1 (en) 2011-09-30 2021-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
KR20210074395A (ko) 2011-11-30 2021-06-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역 복합체를 형성하는 세포내로의 운반체（캐리어）를 포함하는 의약
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
CA2881679C (en) 2012-08-13 2021-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics
NZ705370A (en) 2012-08-24 2018-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
US11236168B2 (en) 2012-08-24 2022-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody
US10766960B2 (en) 2012-12-27 2020-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
PL2970497T3 (pl) * 2013-03-15 2018-05-30 Bayer Healthcare Llc Warianty przeciwciał anty-TFPI z różnicowym wiązaniem w zakresie pH dla poprawy farmakokinetyki
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
KR102318483B1 (ko) 2013-04-02 2021-10-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Ｆｃ영역 개변체
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
EA201592267A1 (ru) 2013-06-07 2016-04-29 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способы ингибирования атеросклероза посредством введения ингибитора pcsk9
AU2014325063B2 (en) 2013-09-27 2019-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
CN118105481A (zh) 2013-11-12 2024-05-31 赛诺菲生物技术公司 用于与pcsk9抑制剂一起使用的给药方案
CN107206068A (zh) 2014-07-16 2017-09-26 赛诺菲生物技术公司 用于治疗杂合型家族性高胆固醇血症(heFH)患者的方法
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EA201791366A1 (ru) 2014-12-19 2018-02-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к c5 и способы их применения
MY181199A (en) 2014-12-19 2020-12-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
CN107108729A (zh) 2015-02-05 2017-08-29 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il‑8‑结合抗体，及其应用
BR112017014067B1 (pt) 2015-02-27 2021-01-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6
IL254577B2 (en) 2015-03-31 2023-11-01 Vhsquared Ltd polypeptides
SG11201706882VA (en) * 2015-03-31 2017-09-28 Vhsquared Ltd Polypeptides
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
EP3302553A4 (en) * 2015-05-28 2019-03-06 Bio-rad Laboratories, Inc. AFFINITY LIGANDS AND ASSOCIATED METHODS
CN106084058B (zh) * 2015-07-15 2019-08-27 北京天广实生物技术股份有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
WO2017031151A1 (en) 2015-08-18 2017-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 inhibitory antibodies for treating patients with hyperlipidemia undergoing lipoprotein apheresis
CN106589127A (zh) * 2015-10-16 2017-04-26 钜川生物医药 一种pcsk9抗体及其制备方法和应用
SG10201709415WA (en) * 2015-12-18 2017-12-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
JP6142069B1 (ja) * 2015-12-18 2017-06-07 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および使用方法
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
EP3398965A4 (en) 2015-12-28 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION
CN107531795B (zh) * 2016-01-05 2021-01-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
SG11201807936VA (en) 2016-03-14 2018-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
CN105801701B (zh) * 2016-03-31 2019-03-29 河北仁博科技有限公司 一种pcsk9抗体的重链和轻链可变区及其应用
AU2017285763B2 (en) * 2016-06-17 2024-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-C5 antibodies and methods of use
KR20230079499A (ko) 2016-08-05 2023-06-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
WO2018039499A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
JP7191833B2 (ja) 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
CR20190417A (es) 2017-03-16 2019-12-06 Medimmune Ltd Anticuerpos anti-par2 y usos de los mismos referencia cruzada a solicitudes relacionadas
WO2018203545A1 (ja) 2017-05-02 2018-11-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
GB201707484D0 (en) * 2017-05-10 2017-06-21 Argenx Bvba Method of preparing ph-dependent antibodies
KR20210084695A (ko) 2017-07-06 2021-07-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 당단백질을 만들기 위한 세포 배양 과정
CN111479618B (zh) 2017-12-22 2022-08-02 瑞泽恩制药公司 用于表征药物产品杂质的系统和方法
AU2019215363A1 (en) 2018-01-31 2020-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System and method for characterizing size and charge variant drug product impurities
TW202311746A (zh) 2018-02-02 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
MX2020008988A (es) 2018-02-28 2020-09-28 Regeneron Pharma Sistemas y metodos para la identificacion de contaminantes virales.
JP7315565B2 (ja) 2018-03-19 2023-07-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド マイクロチップキャピラリー電気泳動アッセイおよび試薬
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
CA3100035A1 (en) 2018-08-27 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of raman spectroscopy in downstream purification
CN112601963B (zh) 2018-08-30 2024-05-24 瑞泽恩制药公司 用于表征蛋白质复合物的方法
SG11202104373YA (en) * 2018-10-31 2021-05-28 Bioatla Inc Anti-ctla4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
EP3857237B1 (en) 2019-01-16 2023-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing disulfide bonds
CA3125765A1 (en) 2019-01-18 2020-07-23 Astrazeneca Ab Pcsk9 inhibitors and methods of use thereof
KR20220007586A (ko) 2019-05-13 2022-01-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 개선된 경쟁적 리간드 결합 검정
WO2020236670A1 (en) 2019-05-17 2020-11-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genome-based methods for reducing cardiovascular risk
JP2022538083A (ja) 2019-06-21 2022-08-31 ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク． ポリペプチド
JP2022537780A (ja) 2019-06-21 2022-08-29 ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク． ポリペプチド
CN114269778A (zh) * 2019-08-19 2022-04-01 洛克菲勒大学 具改良药物动力学的经酸碱度依赖性抗原结合活性工程化的抗人类免疫缺乏病毒抗体
CN110669778A (zh) * 2019-09-19 2020-01-10 上海药明生物技术有限公司 一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法
CA3216345A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for chromatography use and regeneration
EP4023672A1 (en) * 2019-09-30 2022-07-06 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd Anti-pd-l1 antigen binding protein, and application thereof
EP4065086A1 (en) 2019-11-25 2022-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous emulsions
CA3165060C (en) 2020-01-21 2023-06-20 Yiming Zhao Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
EP4168029A1 (en) * 2020-06-19 2023-04-26 Board of Regents, The University of Texas System Anti-bst2 antibodies targeting bst2 long isoform
JP2023542820A (ja) 2020-08-31 2023-10-12 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 細胞培養成績を改善し、アスパラギン配列バリアントを軽減するためのアスパラギン供給戦略
KR20230113280A (ko) 2020-11-25 2023-07-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 비수성 멤브레인 유화법을 사용한 지속 방출 제형
MX2023007225A (es) 2020-12-17 2023-06-27 Regeneron Pharma Fabricacion de microgeles encapsuladores de proteina.
JP2024503408A (ja) 2021-01-20 2024-01-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 細胞培養におけるタンパク質力価の改善方法
WO2022177870A1 (en) * 2021-02-17 2022-08-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Multimeric sars-cov-2 binding molecules and uses thereof
JP2024512299A (ja) 2021-03-03 2024-03-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タンパク質の粘度を定量及び変更するためのシステム及び方法
BR112023018665A2 (pt) 2021-03-26 2023-10-03 Regeneron Pharma Métodos e sistemas para desenvolvimento de protocolos de mistura
BR112023024984A2 (pt) 2021-06-01 2024-02-20 Regeneron Pharma Tampão de amostra de eletroforese aquosa, método para identificar contaminantes ou impurezas em uma amostra de droga proteica, e, kit
WO2023039457A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A high-throughput and mass-spectrometry-based method for quantitating antibodies and other fc-containing proteins
AU2022348521A1 (en) 2021-09-20 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of controlling antibody heterogeneity
TW202323817A (zh) 2021-10-07 2023-06-16 美商再生元醫藥公司 Ｐｈ建模及控制之系統及方法
WO2023059803A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ph meter calibration and correction
CN118176167A (zh) 2021-10-26 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于产生实验室用水和分配处于不同温度的实验室用水的系统和方法
TW202346856A (zh) 2022-03-18 2023-12-01 美商里珍納龍藥品有限公司 分析多肽變體的方法及系統

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070224663A1 (en) 1997-03-07 2007-09-27 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
EP1067182A3 (en) 1999-07-08 2001-11-21 Helix Research Institute Secretory protein or membrane protein
US7129338B1 (en) 1999-07-08 2006-10-31 Research Association For Biotechnology Secretory protein or membrane protein
US7029895B2 (en) 1999-09-27 2006-04-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 27411, a novel human PGP synthase
WO2001057081A2 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
JP2004524005A (ja) 2000-09-08 2004-08-12 マサチューセッツ　インスティテュート　オブ　テクノロジー Ｇ−ｃｓｆアナログ組成物および方法
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
WO2006007422A2 (en) 2004-06-16 2006-01-19 The Trustees Fo Columbia University In The City Of New York CaMKII/CALCIUM CHANNEL PHOSPHORYLATION-RELATED COMPOSITIONS AND METHODS
US20060147945A1 (en) 2005-01-06 2006-07-06 Edmonds Brian T Novel secreted proteins and their uses
WO2007109307A2 (en) 2006-03-20 2007-09-27 Curagen Corporation Antibodies directed to angiopoietin-like protein 4 and uses thereof
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
CN101636179B (zh) 2006-11-07 2012-10-10 默沙东公司 Pcsk9拮抗剂
WO2008057457A2 (en) 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
US20100040610A1 (en) 2006-11-07 2010-02-18 Ayesha Sitlani Antagonists of pcsk9
EP2083860A4 (en) 2006-11-07 2010-05-26 Merck Sharp & Dohme PCSK9 ANTAGONISTS
MX2009006082A (es) 2006-12-08 2009-08-18 Lexicon Pharmaceuticals Inc Anticuerpos monoclonales contra la proteina 3 similar a angiopoyetina (angptl3).
US20100233177A1 (en) 2007-04-13 2010-09-16 David Langdon Yowe Molecules and methods for modulating proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (pcsk9)
JOP20080381B1 (ar) * 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
CA2703712A1 (en) 2007-10-26 2009-04-30 Joseph A. Hedrick Anti-pcsk9 and methods for treating lipid and cholesterol disorders
AR070316A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9)
AR070315A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
JP4954326B2 (ja) 2008-04-11 2012-06-13 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US8357371B2 (en) * 2008-12-15 2013-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to PCSK9
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
JO3672B1 (ar) * 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
WO2011037791A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Antagonists of pcsk9
EP2483682A1 (en) 2009-10-02 2012-08-08 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Combination of spla2 activity and lp(a) cardiovascular risk factors for the diagnosis/prognosis of a cardiovascular disease/event
CN102639150A (zh) 2009-10-30 2012-08-15 默沙东公司 Ax213和ax132 pcsk9拮抗剂和变体
AU2010313381A1 (en) 2009-10-30 2012-04-12 Merck Sharp & Dohme Corp. AX1 and AX189 PCSK9 antagonists and variants
AR079336A1 (es) 2009-12-11 2012-01-18 Irm Llc Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)
JO3274B1 (ar) 2009-12-24 2018-09-16 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية للبروتين 4 المشابه لأجيوبيوتين البشري
SA111320266B1 (ar) * 2010-03-11 2015-06-21 رينات نيوروساينس كوربوريشن أجسام مضادة مع ارتباط مولد مضاد يعتمد على الأس الهيدروجيني
TW201206466A (en) * 2010-03-11 2012-02-16 Rinat Neuroscience Corp Antibodies with pH dependent antigen binding
WO2012054438A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Schering Corporation Anti-pcsk9
US20120195910A1 (en) 2010-12-22 2012-08-02 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies and methods of use
KR20200133826A (ko) 2011-01-28 2020-11-30 사노피 바이오테크놀로지, 소시에떼 빠르 악씨옹 셍쁠리피에 특정 대상자 그룹의 치료 방법에 이용하기 위한 ｐｃｓｋ9에 대한 인간 항체
EP2673302A1 (en) 2011-02-11 2013-12-18 Irm Llc Pcsk9 antagonists
AR088782A1 (es) 2011-04-29 2014-07-10 Sanofi Sa Sistemas de ensayo y metodos para identificar y caracterizar farmacos hipolipemiantes
JOP20200043A1 (ar) 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
MY173376A (en) * 2012-03-16 2020-01-21 Regeneron Pharma Mice that produce antigen?binding proteins with ph?dependent binding characteristics
MX355944B (es) 2012-03-16 2018-05-07 Regeneron Pharma Animales no humanos que expresan secuencias de inmunoglobulina sensibles al ph.
CA2881679C (en) 2012-08-13 2021-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics

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