TW201313738A - 人類類血管生成素蛋白３之人類抗體 - Google Patents

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Abstract

提供一種專一性結合及抑制或干擾至少一種人類類血管生成素蛋白3(hANGPTL3)活性之全人類抗體或人類抗體之抗原結合片段。人類抗-hANGPTL3抗體可用於治療於有關的疾病或病症，例如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂異常，包括高三酸甘油酯、高膽固醇血症、乳糜微粒血症等等。再者，抗-hANGPTL3抗體可投予有此需要之對象用以預防或治療脂質代謝異常為一風險因子之疾病或病症。此疾病或病症包括心血管疾病，例如動脈硬化和冠狀動脈疾病；急性胰臟癌；非酒精性脂性肝炎(NASH)；糖尿病；及肥胖症；及類似病症。

Description

人類類血管生成素蛋白3之人類抗體
本發明係關於專一性結合人類類血管生成素蛋白3(hANGPTL3)之人類抗體和人類抗體之抗原結合片段，以及使用該等抗體之方法。
類血管生成素蛋白3(ANGPTL3)基因係由以訊號序列和雙性螺旋為基礎之EST資料庫中辨識出，及隨後從人類胎兒的肝/脾cDNA庫中分離出全長的ANGPTL3 cDNA(Conklin等人，1999,Genomics 62：477-482)。此推斷的460-胺基酸hANGPTL3蛋白與小鼠ANGPTL3享有76%胺基酸序列一致性且具有血管生成素之特徵結構；亦即一種訊號胜肽，預計形成二聚體或三聚體捲曲螺旋(coiled-coil)之延伸的螺旋區，一短的連接子胜肽和球狀纖維蛋白原同源區(FD)(Conklin等人，1999,supra)。ANGPTL3含有4個牽涉FD內之分子內雙硫鍵的保留性半胱胺酸殘基；然而，ANGPTL3並不含有於血管生成素FD中所發現的二個額外的半胱胺酸及特徵鈣結合域(motif)(ANGs；亦即ANG1、ANG2和ANG4)(Conklin等人，1999,supra)，其為促進血管新生之蛋白生長因子。此外，不像ANG，ANGPTL3不與Tie2結合；然而其亦可能經由其C-端FD與整合素αvβ3結合而引發血管新生(Camenisch等人，2002,J Biol Chem 277：17281-17290)。
由遠系繁殖的KK小鼠模型得到充分的活體內數據，該小鼠為中度肥胖，具異常高量的血漿胰島素、血糖和血脂，類似人類第2型糖尿病(Koishi等人，2002,Nature Genetics 30：151-157)。然而發現一KK/San亞品系小鼠具有異常低血脂量(低脂血症)，其為孟德爾隱性遺傳。基因座係位於4號染色體及最後鑑定為編碼ANGPTL3之基因，其在外顯子6含有一插入的4-bp核苷酸序列(Koishi等人，2002,supra)。相反地，於KK/San小鼠中，在腺病毒媒介的ANGPTL3基因轉移或投予重組的人類ANGPTL3後，血脂量增加。此效應並非由涉及膽固醇合成、脂蛋白清除或NEFA氧化之基因改變所媒介(Koishi等人，2002,supra)。另外，重組蛋白的活體外分析顯示，ANGPTL3直接抑制脂蛋白脂解酶(LPL)活性，此顯示ANGPTL3為一經由抑制LPL活性，調節極低密度脂蛋白(VLDL)三酸甘油酯量之脂質代謝調節劑(Shimizugawa等人，2002,J Biol Chem 277(37)：33742-33748)。已證實N-端捲曲螺旋區，特別是ANGPTL3之N-端區17-165殘基而非C-端FD為增加小鼠血漿三酸甘油酯量之活性上所必須(Ono等人，2003,J Biol Chem 278：41804-41809)。
人類ANGPTL3之胺基酸和核苷酸序列分別係如SEQ ID NOS：161和162所示。ANGPTL3之抗體係揭示於，例如WO2008/073300和US 7,935,796中。
在第一方面，本發明係提供專一性結合及中和、抑制、阻斷、消除、降低、干擾至少一種ANGTPL3，特別是人類ANGTPL3(SEQ ID NO：161)活性之全人類單株抗體(mAb)及其抗原結合片段。可藉由本發明抗體或其片段中和、抑制、阻斷、消除、降低或干擾之ANGTPL3活性，包括(但非限制)抑制LPL活性，降低血管新生諸如此類。在一實施例中，本發明之抗體或其片段可藉由與直接涉及hANGPTL3目標活性之hANGPTL3表位結合，來中和、抑制、阻斷、消除、降低或干擾hANGPTL3活性。在另外的實施例中，本發明之抗體或其片段可藉由與非直接涉及hANGPTL3目標活性之hANGPTL3表位結合，來中和、抑制、阻斷、消除、降低或干擾hANGPTL3活性，但與其相結合之抗體或片段係立體上或構形上抑制、阻斷、消除、降低或干擾hANGPTL3之目標活性。又在另外的實施例中，本發明之抗體或其片段係與非直接涉及hANGPTL3目標活性(例如抑制LPL活性，引發血管新生諸如此類)之hANGPTL3表位結合(亦即非阻斷性抗體)，但相較於缺乏抗體或其片段之hANGPTL3廓清率，與其結合之抗體或片段造成循環中hANGPTL3廓清率增加，藉此間接抑制、阻斷、消除、降低或干擾hANGPTL3活性。循環中hANGPTL3之廓清率特別可藉由組合二或多種不會彼此競爭與hANGPTL3專一性結合之不同的非阻斷抗體來增進。
抗體(Ab)可為全長的(例如，IgG1或IgG4抗體)或可僅包括抗原結合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，且可經修飾影響功能性，例如消除殘餘的效應子功能(Reddy等人，2000,J.Immunol.164：1925-1933)。
在一實施例中，本發明係包含含有由SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146和180組成之群中選出的重鏈可變區(HCVR)，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列之抗體或抗體的抗原結合片段。在另外的實施例中，抗體或其抗原結合片段係包含具有由SEQ ID NO：2、18、34、66、82、114和180組成之群中選出的胺基酸序列之HCVR。又在另外的實施例中，抗體或其抗原結合片段係包括具有SEQ ID NO：66胺基酸序列之HCVR。
在一實施例中，抗體或抗體之抗原結合片段係包含由SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154和188組成之群中選出的輕鏈可變區(LCVR)，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。在另外的實施例中，抗體或抗體之抗原結合部分係包含具有由SEQ ID NO：10、26、42、74、90、122和188組成之群中選出的胺基酸序列之LCVR。又在另外的實施例中，抗體或抗體之抗原結合片段係包括具有SEQ ID NO：74胺基酸序列之LCVR。
在另外的實施例中，抗體或其片段係包括由下列組成之群中選出的HCVR和LCVR序列對(HCVR/LCVR)：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154及180/188。在一實施例中，抗體或其片段係包含由下列組成之群中選出的HCVR和LCVR序列對：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、66/74、82/90、114/122及180/188。在另外的實施例中，抗體或其片段係包含SEQ ID NO：66/74之HCVR和LCVR序列對。
在第二方面，本發明特徵為包含由SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152及186組成之群中選出的重鏈互補決定區3(HCDR3)胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；及由SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160和194組成之群中選出的輕鏈CDR3(LCDR3)胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列之抗體或抗體的抗原結合片段。在一實施例中，抗體或其片段係包括包含SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160或186/194之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。在另外的實施例中，抗體或其片段係包括包含SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、72/80、88/96、120/128或186/194之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。 又在另外的實施例中，抗體或其片段係包括包含SEQ ID NO：72/80之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。
在一另外的實施例中，抗體或其片段進一步包含由SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148和182組成之群中選出的重鏈CDR1(HCDR1)胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似的序列；及包含由SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150和184組成之群中選出的重鏈CDR2(HCDR2)胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似的序列；及視需要進一步包含由SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156和190組成之群中選出的輕鏈CDR1(LCDR1)胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似的序列；及/或由SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158和192組成之群中選出的輕鏈CDR2(LCDR1)胺基酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似的序列。
另外，本發明特徵為包含由SEQ ID NO：4/6/8、20/22/24、36/38/40、52/54/56、68/70/72、84/86/88、100/102/104、116/118/120、132/134/136、148/150/152和182/184/186組成之群中選出的HCDR1/HCDR2/HCDR3組合；及/或由SEQ ID NO： 12/14/16、28/30/32、44/46/48、60/62/64、76/78/80、92/94/96、108/110/112、124/126/128、140/142/144、156/158/160和190/192/194組成之群中選出的LCDR1/LCDR2/LCDR3組合之抗體或抗體的抗原結合片段。在一實施例中，重鏈和輕鏈CDR胺基酸序列係包含由SEQ ID NO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160和182/184/186/190/192/194組成之群中選出的CDR序列組合。在一實施例中，重鏈和輕鏈CDR胺基酸序列係包含SEQ ID NO：4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、116/118/120/124/126/128或182/184/186/190/192/194之CDR序列組合。在另外的實施例中，重鏈和輕鏈CDR胺基酸序列係包含SEQ ID NO：68/70/72/76/78/80之CDR序列組合。
在一相關的實施例中，本發明係包含專一性結合hANGPTL3之抗體或抗體的抗原結合片段，其中該抗體或其片段係包括包含在由SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154和180/188組成之群中選出的HCVR/LCVR對內之重鏈和輕鏈CDR區。鑑定HCVR和LCVR胺基酸 序列內的CDR之方法和技術已為本項技術所知，並可應用於鑑定文中所揭示的特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可用於鑑定CDR界限之習用定義包括Kabat定義、Chothia定義及AbM定義。大體上，Kabat定義係以序列可變性為基礎，Chothia定義係以結構環區之位置為基礎，而AbM定義為Kabat和Chothia法之折衷。參見例如Kabat之“Sequences of Proteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。亦可取得用於鑑別抗體內CDR序列之公用數據庫。在一實施例中，抗體或其片段係包括包含在SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、66/74、82/90、114/122或180/188之HCVR和LCVR對內的CDR序列。在另外的實施例中，抗體或其片段係包括包含在SEQ ID NO：66/74之HCVR和LCVR對內的CDR序列。
在另外相關的實施例中，本發明係提供一抗體或其抗原結合片段，其係與包括包含在SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154或180/188之HCVR/LCVR序列對內的重鏈和輕鏈CDR序列之抗體或抗原結合片段競爭和hANGPTL3專一性結合。在一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段係與包括SEQ ID NO：66/74之 HCVR/LCVR序列對的抗體或其片段競爭與hANGPTL3專一性結合。在另外的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段係與包含由4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160和182/184/186/190/192/194組成之群中選出的重鏈和輕鏈CDR序列組合之抗體或其片段競爭與hANGPTL3專一性結合。在一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段係與包含SEQ ID NOS：68/70/72/76/78/80的重鏈和輕鏈CDR序列組合之抗體或其片段競爭與hANGPTL3專一性結合。
在另外相關的實施例中，本發明係提供與hANGPTL3上的相同表位結合之抗體或其抗原結合片段，其中該表位係經包括來自SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154或180/188之HCVR/LCVR序列對的重鏈和輕鏈CDR之抗體或其片段所辨識。在一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段係與包含SEQ ID NO：66/74之HCVR/LCVR序列對的抗體或其片段所辨識之相同的hANGPTL3表位結合。在一實施例中，本發明之抗體或其片段係與包含由4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、 52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160和182/184/186/190/192/194組成之群中選出的重鏈和輕鏈CDR序列組合之抗體或其片段所辨識之相同的hANGPTL3表位結合。在一實施例中，此表位係經包含SEQ ID NO：68/70/72/76/78/80之重鏈和輕鏈CDR序列組合的抗體或其片段所辨識。
在第三方面，本發明特徵為一分離的抗-hANGPTL3抗體或其抗原結合片段，其係與位在SEQ ID NO：161之17至209殘基的N-端捲曲螺旋內之表位結合，並中和、抑制、消除、降低或干擾至少一種hANGPTL3活性。在另外的實施例中，本發明係提供一分離的抗體或抗體之抗原結合片段，其係專一性與位於hANGPTL3(SEQ ID NO：161)之N-端捲區螺旋區內的表位結合，並中和、抑制、消除、降低或干擾至少一種hANGPTL3活性，其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽(相當於SEQ ID NO：161之hANGPTL3的Glu32至Leu57殘基)結合。在一實施例中，本發明之抗體或其片段係專一性與hANGPTL3(SEQ ID NO：161)之17至200、17至100、17至70、17至65、17至60、17至57或17至50殘基內的表位結合，視需要其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。在另外的實施例 中，抗體或其片段係專一性與hANGPTL3(SEQ ID NO：161)之40至200、40至100、40至70、50至200、50至100、50至70、58至200、58至100、58至70、58至68或61至66殘基內的表位結合，視需要其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。在某些實施例中，抗體或抗體片段係與可能涉及一種以上hANGPTL3之N-端捲區螺旋區內列舉的表位或殘基之表位結合，視需要其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。
在第四方面，本發明係提供編碼抗-ANGPTL3抗體或其片段，特別是任一上述抗體或其片段之核酸分子。攜帶本發明核酸之重組表現載體和其中已導入此等載體之宿主細胞，例如細菌細胞例如大腸桿菌(E.coli)，或哺乳動物細胞例如CHO細胞，以及藉由於製造抗體允許的條件下培養宿主細胞來製造抗體和回收所製造的抗體之方法，亦涵蓋在本發明中。
在一實施例中，本發明係提供包括由SEQ ID NO：1、17、33、49、65、81、97、113、129、145和179組成之群中選出的核酸序列所編碼的HCVR，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列的抗體或其片段。在另外的實施例中，抗體或其片段係包括由SEQ ID NO：1、17、33、65、81、113或179之核酸序列所編碼的HCVR。又在另外的實施例中抗體或其片段係包括由SEQ ID NO：65之核酸 序列所編碼的HCVR。
在一實施例中，抗體或其抗原結合片段係包括由SEQ ID NO：9、25、41、57、73、89、105、121、137、153和187組成之群中選出的核酸序列所編碼的LCVR，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列。在另外的實施例中，抗體或其片段係包括由SEQ ID NO：9、25、41、73、89、121或187之核酸序列所編碼的LCVR。又在另外的實施例中，抗體或其片段係包括由SEQ ID NO：73之核酸序列所編碼的LCVR。
在另外的實施例中，抗體或其片段係包含由SEQ ID NO：1/9、17/25、33/41、49/57、65/73、81/89、97/105、113/121、129/137、145/153和179/187組成之群中選出的核酸序列對所編碼的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列對。在一實施例中，抗體或其片段係包含由SEQ ID NO：1/9、17/25、33/41、65/73、81/89、113/121或179/187之核酸序列對所編碼的HCVR/LCVR序列對。在另外的實施例中，抗體或其片段係包含由SEQ ID NO：65/73之核酸序列對所編碼的HCVR/LCVR序列對。
在一實施例中，本發明特徵為包含由SEQ ID NO：7、23、39、55、71、87、103、119、135、151和185組成之群中選出的核酸序列所編碼的HCDR3區，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列；及由SEQ ID NO：15、31、47、 63、79、95、111、127、143、159和193組成之群中選出的核酸序列所編碼的LCDR3區，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列的抗體或抗體的抗原結合片段。在一實施例中，抗體或其片段係包含由SEQ ID NO：7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159和185/193組成之群中選出的核酸序列對所編碼的HCDR3和LCDR3序列對。在另外的實施例中，抗體或其片段係包含由SEQ ID NO：7/15、23/31、39/47、71/79、87/95、119/127或185/193之核酸序列對所編碼的HCDR3和LCDR3序列對。又在另外的實施例中，抗體或其片段係包含由SEQ ID NO：71/79之核酸序列對所編碼的HCDR3和LCDR3序列對。
在一另外的實施例中，抗體或其片段進一步係包含由SEQ ID NO：3、19、35、51、67、83、99、115、131、147和181組成之群中選出的核苷酸序列所編碼的HCDR1區，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列；及由SEQ ID NO：5、21、37、53、69、85、101、117、133、149和183組成之群中選出的核苷酸序列所編碼的HCDR2區，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列；及視需要進一步包含由SEQ ID NO：11、27、43、59、75、91、107、123、139、155和189組成之群中選出的核苷酸序列所編碼的 LCDR1區，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列；及/或由SEQ ID NO：13、29、45、61、77、93、109、125、141、157和191組成之群中選出的核苷酸序列所編碼的LCDR2區，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性之實質上相同序列。
另外，本發明特徵為包含由SEQ ID NO：3/5/7、19/21/23、35/37/39、51/53/55、67/69/71、83/85/87、99/101/103、115/117/119、131/133/135、147/149/151和181/183/185組成之群中選出的核苷酸序列組合所編碼的HCDR1/HCDR2/HCDR3組合；及/或由SEQ ID NO：11/13/15、27/29/31、43/45/47、59/61/63、75/77/79、91/93/95、107/109/111、123/125/127、139/141/143、155/157/159和189/191/193組成之群中選出的核苷酸序列組合所編碼的LCDR1/LCDR2/LCDR3組合之抗體或抗體的抗原結合片段。在一實施例中，抗體或其片段係包括由SEQ ID NO：67/69/71/75/77/79之核苷酸序列組合所編碼的重鏈和輕鏈CDR序列。
在第五方面，本發明特徵為包括由衍生自VH、DH和JH胚原序列的核苷酸序列片段所編碼的重鏈可變區(HCVR)，及由衍生自VK和JK胚原序列的核苷酸序列片段所編碼的輕鏈可變區(LCVR)之抗-ANGPTL3抗體或其抗原結合片段，其中該HCVR和LCVR係由衍生自下列組成之群中選出的生殖細胞基因組之核苷酸序列片段所 編碼：(i)VH3-43、DH3-3、JH3、VK1-5和JK2；(ii)VH3-11、DH1-1、JH4、VK1-39和JK4；(iii)VH3-30、DH1-7、JH6、VK1-5和JK1；(iv)VH3-30、DH1-26、JH6、VK1-12和JK3；(v)VH3-30、DH3-10、JH6、VK1-12和JK3；以及(vi)VH3-23、DH3-10、JH4、VK1-5和JK1。
在第六方面，本發明特徵為專一性與hANGPTL3結合之抗體或其抗原結合片段，當以表面電漿子共振分析(例如，BIACORETM)測量，其係具有約7 nM或更低，約6 nM或更低，約5 nM或更低，約4 nM或更低，約3 nM或更低，約2 nM或更低或約1 nM或更低之平衡解離常數(KD)。在特定的實施例中，本發明之抗體具有約800 pM或更低、約700 pM或更低；約600 pM或更低；約500 pM或更低；約400 pM或更低；約300 pM或更低；約200 pM或更低；約100 pM或更低；或約50 pM或更低之KD。
在第七方面，本發明係提供與SEQ ID NO：161之hANGPTL3蛋白結合，但不會與相關蛋白，例如人類類血管生成素蛋白4(hANGPTL4；SEQ ID NO：164)交叉反應之抗-hANGPTL3抗體或其抗原結合片段，如以例如，上述的ELISA、表面電漿子共振分析或LUMINEX® XMAP®技術測量時。ANGPTL4為另外的分泌蛋白，其已知係降低LPL活性並具有N-端捲區螺旋區和C-端類纖維蛋白原區(Ge等人，2004,J Biol Chem 279：2038-2045；Yau等人，2009、J Biol Chem 284：11942-11952)。在相關的實施例中，本發明係提供與hANGPTL3蛋白結合及與hANGPTL4蛋白交叉反應之抗-hANGPTL3抗體或其抗原結合片段。在特定的實施例中，hANGPTL3抗體或其片段與hANGPTL4蛋白之結合親和力為hANGPTL3蛋白之結合親和力的約75%或更低，或約50%或更低。
在另外相關的實施例中，本發明係提供不與小鼠ANGPTL3(mANGPTL3；SEQ ID NO：163)，或大鼠ANGPTL3(rANGPTL3；SEQ ID NO：175)交叉反應，但與獼猴(Macaca fascicularis)ANGPTL3(MfANGPTL3)，例如與SEQ ID NO：177之N-端17-170殘基(MfANGPTL3之部分胺基酸序列)交叉反應之抗-hANGPTL3抗體或抗原結合片段。又在另外的實施例中，本發明係提供與MfANGPTL3、mANGPTL3和rANGTPL3交叉反應之抗-hANGPTL3抗體或其片段。
本發明涵蓋具有修飾的糖基化模式之抗-hANGPTL3抗體。在某些應用上，移除不欲的糖基化位點之修飾作用可能為有用的，或例如移除岩藻糖基團以增加抗體依賴的細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield等人，(2002)JBC 277：26733)。在其他的應用中，移除N-糖基化位點可降低對抗治療基因之不欲的免疫反應，或增加抗體親和力。又在另外的應用中，可製造糖基化之修飾作用以修飾補體依賴的細胞毒性(CDC)。
在第八方面，本發明之特徵為包括專一性與 hANGPTL3結合之重組的人類抗體或其片段和醫藥上可接受載劑之醫藥組成物。在一實施例中，本發明係提供包括一或多種不會彼此交叉競爭之抗-ANGPTL3抗體或其片段和醫藥上可接受載劑之醫藥組成物。在一實施例中，本發明之醫藥組成物可含有二或多種非阻斷抗體，其不會彼此競爭與hANGPTL3之專一性結合且可有效用從循環中清除hANGPTL3。適合的非阻斷抗體之組合包括(但不限於)包含：(i)分別為SEQ ID NO：82/90和180/188；(ii)分別為SEQ ID NO：114/122和180/188、；(iii)分別為SEQ ID NO：82/90和18/26；或(iv)分別為SEQ ID NO：114/122和18/26之HCVR和LCVR序列對(HCVR/LCVR)的抗體組合。
在相關的實施例中，本發明特徵為一組成物，其為本發明抗體或其抗原結合片段與第二治療劑之組合。第二治療劑可為一或多種任何藥劑，例如(1)3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，例如西立伐他汀(cerivastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、羅伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)諸如此類；(2)膽固醇吸收及/或膽酸再吸收抑制劑；(3)增加脂蛋白異化作用之菸鹼酸；(4)減少低密度脂蛋白(LDL)量，增進高密度脂蛋白(HDL)和TG量，以及降低非致命性心臟病發作之纖維酸或兩性羧酸；及(5)在膽固醇消除作用中扮演一 角色之LXR轉錄因子之活化劑，例如22-羥基膽固醇或固定組合例如依折麥布(ezetimibe)與辛伐他汀；他汀與膽酸樹脂(例如考來烯胺(cholestyramine)、考來替泊(colestipol)、考來維侖(colesevelam))、菸鹼酸與他汀之固定組合(例如菸鹼酸與洛伐他汀)；或與其他降脂劑例如ω-3-脂肪酸乙酯(例如歐馬可(omacor))之組合。再者，第二治療劑可為一或多種其他的ANGPTL3抑制劑和涉及脂質代謝，特別是膽固醇及/或三酸甘油酯體內平衡之其他分子，例如ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6和第9型前蛋白轉化酶枯草溶菌素(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)(PCSK9)之抑制劑。這些分子之抑制劑包括小分子及專一性與這些分子結合和阻斷其活性之抗體。
在相關的實施例中，第二治療劑可為一或多種抗癌劑，例如化療劑、抗血管新生劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡劑和其他本項技術中用於治療癌症或其他增生性疾病或病症之熟知的藥劑，以及其他治療劑例如鎮痛劑、抗發炎劑，包括非類固醇抗發炎藥(NSAIDS)，例如Cox-2抑制劑諸如此類，用以改善及/或降低潛藏癌症/腫瘤下伴隨的癥狀。
在第九方面，本發明特徵為使用一或多種本發明之抗-hANGPTL3抗體或其抗原結合片段中和、抑制、阻斷、消除、降低或干擾hANGPTL3活性之方法。在一實施例中，本發明係提供包括於有此需要之對象中投予 一治療上有效量的醫藥組成物之治療方法，其中該醫藥組成物係包括一或多種本發明之抗-hANGPTL3抗體或其抗原結合片段，及視需要一或多種上述之另外的治療劑。本發明之抗-ANGPTL3抗體或其片段可中和抗ANGPTL3之抗體或非阻斷性抗體或其組合。
在相關的實施例中，本發明係於有此需要之對象中提供增進循環中hANGPTL3廓清率之方法，其包括投予該對象至少二種不會彼此競爭與hANGPTL3結合且較佳地不會阻斷至少一種hANGPTL3活性之本發明抗-hANGPTL3抗體或其片段(亦即非阻斷抗體)。至少一種hANGPTL3活性係指，包括(但不限於)抑制LPL活性，包括血管新生作用諸如此類。在一實施例中，相對於未投予抗體或片段，至少二種非阻斷性抗-hANGPTL3抗體或其片段之組合增進了循環中hANGPTL3廓清率至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%或約80%。hANGPTL3之循環量可藉由本項技術熟知的活體外分析和該等文中所述分析來測量。在另外的實施例中，至少二種非組斷性抗-hANGPTL3抗體包括：(i)分別為SEQ ID NO：82/90和180/188；(ii)分別為SEQ ID NO：114/122和180/188；(iii)分別為SEQ ID NO：82/90和18/26；或(iv)分別為SEQ ID NO：114/122和18/26之HCVR和LCVR序列對(HCVR/LCVR)。
可藉由本發明方法治療的疾病或病症為相較於無抗-hANGPTL3抗體治療(例如hANGPTL3-媒介的疾病 或病症)，其可藉由移除、抑制、降低或其他干擾ANGPTL3活性來改進、改善、抑制或防止或降低其發生率之任何疾病或症狀。可藉由本發明方法治療的疾病或病症之實例包括(但不限於)該等涉及脂質代謝，例如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂異常，包括致動脈粥樣化血脂異常、糖尿病血脂異常，高三酸甘油酯血症，包括TG>1000 mg/dL之嚴重高三酸甘油酯血症、高膽固醇血症、乳糜微粒血症、混合性血脂異常(肥胖症、代謝症候群、糖尿病等)、脂肪失養症、脂肪萎縮諸如此類，其係由例如LPL活性減低及/或LPL缺乏、LDL受體(LDLR)活性減低及/或LDL受體缺乏(例如，LDLR-/-之同合子家族性高膽固醇血症)、ApoC2改變、ApoE缺乏、ApoB增高、極低密度脂蛋白(VLDL)的製造增加及/或消除減少、特定藥物治療(例如，糖皮質素治療引發的血脂異常)、任何遺傳傾向、飲食、生活型態等等。本發明之方法亦可預防或治療與高脂血症、高脂蛋白血症及/或脂質異常有關或由其所導致之疾病或病症，包括(但不限於)心血管疾病或病症，例如動脈硬化、動脈瘤、高血壓、心絞痛、中風、腦血管疾病、鬱血性心衰竭、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、週邊血管疾病等等；急性胰臟炎；非酒精性脂性肝炎(NASH)；血糖病症，例如糖尿病；肥胖症等等。
其他可藉由本發明方法治療的疾病或病症之實例包括癌症/腫瘤以及非腫瘤血管新生有關的疾病或病 症，包括眼睛血管新生疾病或病症，例如老化有關的黃斑部退化、視網膜中央靜脈阻塞或視網膜分枝靜脈阻塞、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變諸如此類，發炎疾病或病症，例如關節炎、類風濕性關節炎(RA)、乾癬諸如此類。
從檢閱確切的詳細說明，其他的實施例將變得更顯見。
詳細說明
在詳細描述本發明之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法及實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解的相同意義。雖然類似或相當該等文中所述的任何方法和物質可用於施行或試驗本發明，但較佳的方法和物質為目前所描述。
定義
術語「人類類血管生成素蛋白3」或「hANGPTL3」，如文中所用，係指具有如SEQ ID NO：162中所示的核酸序列和SEQ ID NO：161之胺基酸序列或其生物活性片段之ANGPTL3。
術語「抗體」，如文中所用，希望係指包括由雙硫 鍵相互連接的四條多肽鏈，二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈之免疫球蛋白分子。各重鏈係包括一重鏈可變區(HCVR)及一重鏈恆定區(CH；包括CH1、CH2和CH3區)。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(LCVR)及一輕鏈恆定區(CL)。HCVR和LCVR可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為架構區(FR)。各HCVR和LCVR係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。
一或多個CDR殘基之取代，或一或多個CDR之刪除亦為可能。抗體已描述於科學文獻中，其中一或二個CDR可免於結合。Padlan等人(1995 FASEB J.9：133-139)基於公開的晶體結構，分析抗體和抗原間的接觸區，並結論出僅約五分之一至三分之一的CDR殘基真正接觸抗原。Padlan亦發現許多抗體其中一或多二個CDR並無胺基酸與抗原接觸(亦參見Vajdos等人2002 J Mol Biol 320：415-428)。
未與抗原接觸之CDR殘基可以之前的研究為基礎(例如，CDRH2之H60-H65殘基通常不需要)，從位於Chothia CDR外部的Kabat CDR區，藉由分子模建及/或憑經驗，來加以鑑定。若CDR或其殘基被刪除，其通常係以佔據另外人類抗體序列或相同的此等序列之對應位置的胺基酸取代。CDR內供取代的位置和取代的胺基酸亦可憑經驗來選擇。依經驗之取代可為保守性或非保守性取代。
術語「人類抗體」，如文中所用，希望係包括具有衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列之可變和恆定區的抗體。本發明之人類mAB可包括非由人類生殖細胞免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由隨機或活體外位置專一性誘變所導入之突變或活體內體細胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術語「人類抗體」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖細胞的CDR序列已稼接在人類FR序列上之mAB。
相較於對應的生殖細胞序列，在重鏈和輕鏈可變區之架構及/或CDR區中，文中所揭示的全人類抗-hANGPTL3抗體可包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示的胺基酸序列與得自例如公開的抗體序列資料庫之生殖細胞序列相比較，加以容易地確定。本發明包括由任何文中所揭示的胺基酸序列所衍生之抗體及其抗原結合片段，其中在一或多個架構及/或CDR區中的一或多個胺基酸係突變成衍生抗體之生殖細胞序列的對應殘基，或另一種人類生殖細胞序列之對應殘基(此序列改變在文中共同稱為生殖細胞突變)。由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區序列開始，本項技術之一般技術者可容易地製造許多包括一或多個個別的生殖回復細胞突變或其組合之抗體和抗原結合片段。在特定的實施例中，VH及/或VL區內的所有架構及/或CDR殘基係突變回到衍生此抗體之原始生 殖細胞序列的殘基。在其他實施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖細胞序列，例如僅在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中所發現的突變殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內所發現的突變殘基。在其他的實施例中，一或多個架構及/或CDR殘基係突變成不同生殖細胞序列之對應殘基(亦即與最初衍生抗體之生殖細胞序列不同的生殖細胞序列)。再者，本發明之抗體在架構及/或CDR區內可含有任何二或多個生殖細胞突變之組合，例如，其中特定的個別殘基係突變成特定生殖細胞序列之對應殘基，而與原始生殖細胞序列不同的其他殘基係維持原樣或突變成不同生殖細胞序列之對應殘基。一旦得到後，含有一或多個生殖細胞突變之抗體和抗原結合片段可容易地試驗其一或多種所欲的性質，例如改善結合專一性、增加結合親和力、改善或增進拮抗或促效性生物性質(視情況而定)、降低致免疫力等。以此通用方法所得到的抗體和抗原結合片段係涵蓋在本發明中。
本發明亦包括抗-ANGPTL3抗體，其係包括具有一或多個保守取代之任何文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列之變體。例如，本發明包括抗-ANGPTL3抗體，相對於任何文中所揭示之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，其係具有含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少、2個或1個保守性胺基酸取代之HCVR、LCVR及/或CDR胺基 酸序列。在一實施例中，HCVR係包括其中帶有10個或更少保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：487的胺基酸序列。在另外的實施例中，HCVR係包括其中帶有8個或更少保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：487的胺基酸序列。在另外的實施例中，HCVR係包括其中帶有6個或更少保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：487的胺基酸序列。在另外的實施例中，HCVR係包括其中帶有4個或更少保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：487的胺基酸序列。又在另外的實施例中，HCVR係包括其中帶有2或1個保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：487的胺基酸序列。在一實施例中，HCVR係包括其中帶有10個或更少保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：44的胺基酸序列。在另外的實施例中，HCVR係包括其中帶有8個或更少保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：44的胺基酸序列。在另外的實施例中，HCVR係包括其中帶有6個或更少保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：44的胺基酸序列。在另外的實施例中，HCVR係包括其中帶有4個或更少保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：44的胺基酸序列。又在另外的實施例中，HCVR係包括其中帶有2或1個保守性胺基酸取代之SEQ ID NO：44的胺基酸序列。
除非另有指出，否則術語「抗體」，如文中所用，應了解係涵蓋包括二條免疫球蛋白重鏈和二條免疫球蛋白輕鏈之抗體(亦即「全抗體分子」)以及其抗原結合片段。術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結 合片段」諸如此類，如文中所用，包括任何專一性與抗原結合形成複合物之天然生成、酵素性製得、合成或基因工程的多肽或糖蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何標準的技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及操控和表現編碼抗體可變區和(視需要)恆定區DNA之重組基因工程技術，衍生自，例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可得自，例如市面來源、DNA庫(包括，例如噬菌體-抗體庫)或可經合成的。此DNA可經定序和以化學或藉由使用分子生物技術操控，例如將一或多個可變及/或恆定區排列成適合的構形，或導入密碼子，產生半胱胺酸殘基，修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限定實例實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，如CDR3胜肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子，例如區域專一性抗體、單區抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-嫁接抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫醫藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區，亦涵蓋在文中所用的「抗原結合片段」之詞語內。
抗體之抗原結合片段典型地係包括至少一可變區。可變區可為任何大小或胺基酸組成之區域且一般應 包括至少一個與一或多個架構序列相鄰或在其框架內之CDR。在具有VL區與VH區結合之抗原結合片段中，VH和VL區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。另外，抗體之抗原結合片段可含有單體VH或VL區。
在特定的實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個與至少一恆定區共價連接的可變區。在本發明之抗體的抗原結合片段內可發現的可變區和恆定區之示例性組態的非限定實例包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。在任何可變區和恆定區之組態中，包括任何上列的示例性組態，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈區或連接子區相連。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)在單一多肽分子中相鄰的可變及/或恆定區間產生柔性和半柔性連結之胺基酸所組成。再者，在本發明之抗體的抗原結合片段可包括以非共價彼此相互連結及/或與一或多個單體VH或VL區(例如以雙硫鍵)相連結之任何上列的可變和恆定區組態之同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。
因帶有全抗體分子，抗原結合片段可為單專一性或 多專一性(例如雙專一性)。抗體之多專一性抗原結合片段典型地將包括至少二個不同的可變區，其中一個可變區能專一地與個別的抗原結合或與相同抗原上不同的表位結合。任何多專一性抗體模式，包括文中所揭示之示例的雙專一性抗體模式，可使用本項技術中可取得的習用技術來改造，使其適用於本發明抗體之抗原結合片段狀況。
在特定的實施例中，本發明之抗體或抗體片段可與治療基團，例如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素接合(「免疫接合物」)。
術語「專一性結合」或其類似詞，係指抗體或其抗原結合片段與抗原形成一複合物，其在生理狀況下為相當穩定的。專一性結合其特徵可為約1x10-6 M或更低之平衡解離常數(KD)(亦即，KD越小代表結合越緊密)。測定二分子是否專一性結合之方法已為本項技術所熟知並包括，例如平衡透析、表面電漿共振諸如此類。然而，專一性結合hANGPTL3之分離的抗體，對其他抗原，例如來自其他物種之ANGPTL3分子，例如獼猴ANGPTL3、小鼠ANGPTL3、大鼠ANGPTL3及/或具有SEQ ID NO：164胺基酸序列之hANGPTL4，可具有交叉反應性。再者，與hANGPTL3和一或多種另外的抗原結合之多專一性抗體(例如雙專一性)仍視為，如文中所用，「專一性結合」hANGPTL3之抗體。
術語「高親和力」抗體係指該等，當以表面電漿子 共振分析，例如BIACORETM或溶液親和力ELISA測量時，以KD表示，具有約2x10-9 M或更低、約1.5x10-9 M或更低、約1x10-9 M或更低、約0.5x10-9 M或更低、約0.25x10-9 M或更低、約1x10-10 M或更低或約0.5x10-10 M或更低之hANGPTL3親和力。
術語「KD」，如文中所用，希望係指特定抗體-抗原交互作用之平衡解離常數。
術語「低解離率」、「Koff」或「kd」係指，當以表面電漿共振分析，例如BIACORETM測定時，以4x10-3 s-1或更低、3x10-3 s-1或更低、2x10-3 s-1或更低、1x10-3 s-1或更低、1x10-4 s-1或更低之速率常數從hANGPTL3解離之抗體。
術語「內在親和常數」或「ka」係指，當以表面電漿共振分析，例如BIACORETM測定時，以約1x103 M-1s-1或更高的速率常數與hANGPTL3結合之抗體。
「分離的抗體」，如文中所用，希望係指實質上無其他具有不同抗原專一性之mAB的抗體(例如專一性結合hANGPTL3之分離抗體為實質上無專一性結合hANGPTL3以外的抗原之mAB)。然而專一性結合hANGPTL3之分離抗體對其他抗原例如來自其他物種，例如獼猴、小鼠、大鼠之ANGPTL3，及/或其他相關蛋白，例如人類hANGPTL4可具有交叉反應性。
「中和」、「阻斷」或「消除」抗體，如文中所用(或「中和」、「阻斷」或「消除」ANGPTL3活性之抗 體)，希望係指抗體與ANGPTL3之結合，當以本項技術中已知的標準活體外分析評估時，導致直接抑制至少一種ANGPTL3生物活性(例如，參見下列實例)。術語「中和」、「抑制」、「阻斷」和「消除」在文中可交換使用。「非阻斷抗體」係指抗體與ANGPTL3之結合，當以標準活體外分析評估時，不會直接阻斷ANGPTL3之目標活性，但仍可為干擾抗體其與ANGPTL3之結合，於活體中導致間接抑制、降低、衰減或其他干擾至少一種ANGPTL3生物活性，例如藉由增進循環中ANGPTL3之廓清率。循環中ANGPTL3之廓清率可特別藉由至少二種非阻斷抗體之組合來增進。中和、抑制、消除、降低、衰減或干擾ANGPTL3之生物活性可以一或多種本項技術中已知的數種標準活體外或活體內分析，藉由測量一或多種ANGPTL3生物活性之指示劑來評估(亦參見下列實例)。
術語「表面電漿共振」，如文中所用，係指一種能藉由偵測生物感測器基質內蛋白濃度之改變進行即時相互作用分析之光學現象，例如使用BIACORETM系統(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
術語「表位」為一被抗體結合之抗原區域。表位可以結構或功能來定義。功能性表位一般為結構表位之亞群並具有該等直接造成相互作用之親和力的殘基。表位亦可為構形，亦即由非線性胺基酸所組成。在特定的實 施例中，表位可包括決定物，其為分子，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基基團或磺醯基基團之化學活性表面組合，且在特定的實施例中，可具有特定的三維結構特性，及/或特定的電荷特性。
術語「實質上一致」或「實質上相同」當係指核酸或其片段時，係表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最適化對齊時，以任何熟知的序列一致性演算法，例如下文所論述的FASTA、BLAST或GAP來測量，有至少約90%，及更佳地至少約95%、96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基具核苷酸序列一致性。
如用於多肽，術語「實質上類似」係指二胜肽序列，當以GAP或BESTFIT程式使用缺位重量最適化對齊時，享有至少90%序列一致性，甚佳地至少95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不同的殘基位置係相差在保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基團)之胺基酸殘基所取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白質的功能特性。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中，可調高序列一致性之百分比或類似程度以修正此保守性取代作用之性質。調整之方法已為熟習本項技術者所熟知。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團 實例包括(1)脂系側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂系-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；(4)芳香側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸胺酸。另外，保守性置換為任何在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之變換。「中度保守性」置換為任何在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之變化。
多肽之序列類似性典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度測量值配出類似的序列。例如，GCG軟體含有例如Gap和Bestfit程式，其可用於內定參數，測定密切相關的多肽間(例如來自不同生物物種之同源多肽，或野生型和其突變蛋白間)之序列同源性或序列一致性。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，以內定或建議參數作比較；GCG Version 6.1 FASTA(例如FASTA2和FASTA3)內的程式係提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列一致性百分比(Pearson(2000) supra)。當本發明序列與含有較大量來自不同物種的序列資料庫作比較時，另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。
「治療上有效量」一詞係指對其所投予者產生所欲效用之量。確切的量將依照治療目的、治療對象的年齡和體型、給藥路徑諸如此類而定，並將由熟習本項技術者使用已知技術來確認(參見，例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。
製備人類抗體
於基因轉殖小鼠中產生人類抗體之方法已為本項技術所知。任何此等已知的方法皆可用於本發明之內文中，用以製造與ANGPTL3專一性結合之人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術或任何其他已知的產生單株抗體之方法，起初先分離對ANGPTL3具高親和力之具有人類可變區和小鼠恆定區的嵌合抗體。如下列實驗部分所示，抗體係經定性並以所欲的性質來選擇，包括親和力、選擇性、表位諸如此類。
一般而言，本發明抗體具有高親和力，當以固定在固相或溶液相之抗原結合測量時，典型地具有從約10-12 M至約10-9 M之KD。以所欲的人類恆定區，例如野生型或修飾型IgG1或IgG4置換小鼠恆定區，產生本發明 全人類抗體。根據特定的用途所選的恆定區可不同，而抗體之高親和力抗原結合及目標專一性特性則係存在於可變區內。
表位定位及相關技術
篩選與特定表位結合之抗體，可進行一例行的交叉阻斷分析，例如Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所描述。其他的方法包括丙胺酸掃描突變分析、胜肽墨點分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248：443-463)或胜肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化學修飾等方法(Tomer,2000,Protein Science 9：487-496)。
術語「表位」係指回應B及/或T細胞之抗原上的位置。B-細胞表位可由連續胺基酸或與三級折疊蛋白並列的非連續胺基酸所形成。由連續胺基酸所形成之表位經暴露於變性溶劑典型地仍保留，而由三級折疊所行成的表位經變性溶劑處理則喪失。在獨特的空間構形中，一表位典型地係包括至少3個，更通常至少5個或8-10個胺基酸。
修飾輔助分析(MAP)，亦稱為抗原結構為基礎之抗體分析(ASAP)為根據各抗體與或化學性或酵素性修飾抗原表面之結合特性的類似性，分類大量針對抗相同抗原之單株抗體(mAb)的方法(US 2004/0101920)。各種類可反應一獨特表位與另外種類所代表的表位顯著不同 或部分重疊。此技術可快速地過濾基因上相同的mAb，使特性描述可集中在基因不同的mAb。當應用於雜交瘤篩選時，MAP可過濾產生具有所欲特性之mAb的罕見雜交瘤選殖株身分。MAP可用於將本發明之抗-ANGPTL3 mAb分類成mAb結合不同的表位。
ANGPTL3含有一胺基端捲區螺旋區和一羧基端類纖維蛋白原區(FD)，且ANGPTL3蛋白在缺乏分子內雙硫鍵下，形成一寡聚物(Ge等人，2005、J Lipid Res 46：1484-1490)。已有報告指出，N-端捲曲螺旋區對抑制LPL活性很重要(Ono等人，2003、J Biol Chem 278：41804-41809)。因此，在特定的實施例中，抗-hANGPTL3抗體或抗體之抗原結合片段與hANGPTL3(SEQ ID NO：161)之N-端捲曲螺旋區(殘基17-209)內的表位結合並中和至少一種hANGPTL3活性(例如抑制LPL活性)。在另外的實施例中，抗-hANGPTL3抗體或其抗原結合片段係與hANGPTL3之N-端捲曲螺旋區內的表位結合並中和至少一種hANGPTL3活性，其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。在一實施例中，抗體或其片段係專一性與hANGPTL3(SEQ ID NO：161)之17至200、17至100、17至70、17至65、17至60、17至57、17至55、17至50、17至45、17至40或17至35殘基內的表位結合，視需要其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。在另外的實施例中， 抗體或其片段係專一性與hANGPTL3(SEQ ID NO：161)之40至200、40至100、40至70、50至200、50至100、50至70、58至200、58至100、58至70、58至68或61至66殘基(稱為「肝素結合模體」)內的表位結合，視需要其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。在某些實施例中，抗體或抗體片段係與可能涉及一種以上枚舉表位或ANGPTL3之N-端捲曲螺旋區內殘基之表位結合，視需要其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。
在另外的實施例中，hANGPTL3抗體或其片段係與一或多個hANGPTL3之片段，例如hANGPTL3(SEQ ID NO：161)之至少5個殘基、至少7個殘基、至少10個殘基、至少20個殘基、至少30個殘基、至少50個殘基、至少70個殘基、至少100個殘基、至少150個殘基、至少200個殘基之片段結合，視需要其限制條件為該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。
本發明包括與任何文中所述之專一性例示抗體相同之表位相結合的抗-hANGPTL3抗體。同樣地，本發明亦包括和任何文中所述之專一性示例抗體競爭與hANGPTL3或hANGPTL3片段相結合之抗-hANGPTL3抗體。
藉由使用本項技術中已知的習用方法可容易地測 定抗體是否與相同的表位結合，或與參照的抗-hANGPTL3抗體競爭結合。例如，測定受試的抗體是否與本發明參照抗-hANGPTL3抗體相同之表位結合，係讓此參照抗體與hANGPTL3蛋白或胜肽於飽和的條件下結合。接著，評估受試抗體與hANGPTL3分子結合之能力。若在與參照的抗-hANGPTL3抗體飽和結合後，受試抗體能與hANGPTL3結合，則可結論出受試抗體係與不同於參照抗-hANGPTL3抗體之表位結合。另一方面，若在與參照抗-hANGPTL3抗體飽和結合後，受試抗體不能與hANGPTL3結合，則受試抗體可能係與本發明之參照抗-hANGPTL3抗體結合表位相同之表位相結合。
就測定一抗體是否係與參照的抗-hANGPTL3抗體競爭結合，係以二個方面來進行上述結合方法：第一方面，讓參照抗體於飽和的條件下與hANGPTL3分子結合，接著評估受試抗體與hANGPTL3分子之結合。第二方面，讓受試抗體於飽和的條件下與hANGPTL3分子結合，接著評估參照抗體與hANGPTL3分子之結合。若在此二方面中，僅第一(飽和)抗體能與hANGPTL3分子結合，則可結論出受試抗體係與參照抗體競爭與hANGPTL3結合。本項技術之一般技術者應了解，與參照抗體競爭結合之抗體可能不需與參照抗體相同的表位結合，但可能藉由與重疊或相鄰的表位結合而於空間上阻斷參照抗體之結合。
若各自競爭性抑制(阻斷)另一抗體與抗原之結合，則二種抗體係與相同或重疊的表位結合。亦即，如競爭性結合分析中所測，1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗體抑制另一種抗體之結合至少50%，但較佳的75%、90%或甚至99%，(參見，例如Junghans等人，Cancer Res.1990：50：1495-1502)。另外，若基本上在降低或消除一抗體結合之抗原中，所有的胺基酸突變係消除或降低另一種抗體之結合，則此二種抗體具有相同的表位。若降低或消除一抗體結合之某些胺基酸突變，降低或減少另一種抗體結合，則二種抗體係具有重疊表位。
然後可進行另外的習用試驗(例如胜肽突變和結合分析)用以確定觀察到沒有結合的受試抗體事實上是否係因為與參照抗體相同的表位結合或是空間阻斷(或另外的現象)造成沒有觀察到結合。此類型之實驗可使用ELISA、RIA、表面電漿共振、流式細胞儀或任何其他本項技術可取得的定量或定性之抗體結合分析來進行。
免疫接合物
本發明係涵蓋與治療基團，例如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素接合之人類抗-ANGPTL3單株抗體(免疫接合物)。細胞毒性劑包括任何對細胞有害之試劑。用於形成免疫接合物之適合的細胞毒性劑及化療劑實例已為本項技術所知，參見，例如WO 05/103081。
雙專一性
本發明之抗體可為單專一性、雙專一性或多專一性。多專一性mAb可對一目標多肽之不同的表位具專一性或可含有對一個以上的目標多肽具專一性之抗原結合區。參見，例如Tutt等人，(1991)J.Immunol.147：60-69。人類抗-hANGPTL3 mAb可與另外的功能分子，例如另外的胜肽或蛋白相連結或共表現。例如，抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體，例如另外的抗體或其片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他)，產生帶有第二結合專一性之雙專一性或多專一性抗體。
可用於本發明內文中之示例的雙專一性抗體模式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3區及第二Ig CH3區，其中第一和第二Ig CH3區至少有一胺基酸互不相同，且相較於無此胺基差異之雙專一性抗體，其中該至少一胺基酸差異降低了雙專一性抗體與蛋白A之結合。在一實施例中，第一Ig CH3區與蛋白A結合而第二Ig CH3區含有降低或消除蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(IMGT外顯子編號；EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包括Y96F修飾(IMGT；EU為Y436F)。在第二CH3中可發現的另外修飾作用，就IgG1抗體而言係包括：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；就IgG2抗體而言係包括N44S、K52N和V82I(IMGT；EU為N384S、K392N和V422I)；及就IgG4 抗體而言係包括Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述之雙專一性抗體模式之變體係涵蓋在本發明之範圍內。
生物等效性
本發明之抗-hANGPTL3抗體及抗體片段涵蓋具有與所述的mAb不同但保留與人類ANGPTL3結合能力之胺基酸序列的蛋白。此等變體抗體和抗體片段，當與親代序列相比較時，係包括一或多個胺基酸之添加、刪除或取代，但具有與所述的抗體基本上相當之生物活性。同樣的，本發明之抗-hANGPTL3抗體編碼DNA序列，當與所揭示的序列相比較時，係包括一或多個核苷酸之添加、刪除或取代，但其所編碼的抗-hANGPTL3抗體或抗體片段與本發明之抗-hANGPTL3抗體或抗體片段基本上為生物等效的。此等變異的胺基酸和DNA序列之實例係如上所論述。
二種抗原結合蛋白或抗體，若例如其為醫藥同等物或醫藥替代物，當於類似的實驗條件下以相同的莫耳劑量或單一劑量或多劑量投予時，其吸收速率和程度並無顯示出顯著的差異，則係視為生物等效性。某些抗體若其吸收程度相當但是吸收速率不同應可視為等效物或醫藥替代品，且仍可視為生物等效，因為此等吸收速率上的差異為故意的並反映在標示上，對於達到(例如)長期使用之有效體藥濃度並非必要的，且就特定藥物產品 的研究上被認為是無醫療價值的。在一實施例中，二種抗原結合蛋白若其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異，則為生物等效的。
在一實施例中，若相較於無此變更之持續治療，病患在預期無增加有害效應之風險下(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低)可在參照產品和生物產品間作一或多次變更，則二種抗原結合蛋白為生物等效的。
在一實施例中，若二種抗原結合蛋白係藉由共同的機制或作用機制作用於症狀或所用症狀，而達到此等機制已知的程度，則其二者係為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內和活體外方法來驗證。生物等效性測量包括，例如(a)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量血液、血漿、血清或其他生物流體中隨時間變化之抗體濃度或其代謝物；(b)與人類活體內生物可利用性數據相關及可合理預測此數據之活體外試驗；(c)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量隨時間變化之抗體(或其目標)的適當急性藥理效用；及(d)已建立抗體之安全性、效力或生物可利用性和生物等效性之良好對照的臨床試驗。
本發明之抗-hANGPTL3抗體的生物等效變體可藉由，例如製造各種殘基或序列之取代，或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來建構。例如，生物活性不需要的酪胺酸殘基可刪除或以其他的胺基酸置換，以防止因恢復活性而形成不必要或不正確的分子內 雙硫橋。
治療給藥和調配物
本發明係提供包括本發明之抗-hANGPTL3抗體或其抗原結合片段的治療組成物，及使用彼等之治療方法。本發明治療組成物之給藥係與併入調配物中提供改善轉移、遞送、耐受性及類似性質之適合的載劑、賦形劑和其他藥劑來投予。許多適合的調配物可參見所有醫藥化學家已知的處方集：賓州伊斯頓馬克出版公司之Remington's Pharmaceutical Sciences。這些調配物包括，例如散劑、糊膏、軟膏、軟凍、蠟、油、脂質、含囊泡之脂質(陽離子或陰離子)(例如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊膏、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含碳蠟(carbowax)之半固體混合物。亦參見Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
劑量可依照所投予病患的年齡和體型大小、目標疾病、治療目的、症狀、給藥路徑諸如此類而不同。當本發明抗體係用於成年人中治療直接或間接與hANGPTL3有關的各種症狀和疾病，包括高脂血症、與LDL和脂前蛋白B有關的病症以及脂質代謝病症諸如此類時，其有利的係以靜脈內或皮下給予約0.01至約20 mg/kg體重，更佳地約0.02至約7，約0.03至約5，或約0.05至約3 mg/kg體重之單一劑量的本發明抗體。 依照症狀之嚴重度，治療之頻率和作用期可調整。在特定的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段可以至少約0.1 mg至約800 mg、約1至約500 mg、約5至約300 mg，或約10至約200 mg、至約100 mg或至約50 mg之最初劑量來給藥。在特定的實施例中，最初劑量後可接著以大約與最初劑量相同或更低之量給予第二或多數個抗體或其抗原結合片段之後續劑量，其中後續劑量可隔開至少1至3天；至少一週、至少2週；至少3週；至少4週；至少5週；至少6週；至少7週；至少8週；至少9週；至少10週；至少12週；或至少14週。
已知有各種遞送系統並可用於投予本發明之醫藥組成物，例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現突變病毒之重組細胞、受體媒介的內吞作用(參見，例如Wu等人，1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)。導入之方法包括(但不限於)皮膚內、肌肉內、腹胺內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外或口服路徑。組成物可以任何方便的路徑給藥，例如輸注或團注、經由表皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收，並可與其他的生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部性。
醫藥組成物亦可以囊體遞送，特別是微脂體(參見Langer(1990)Science 249：1527-1533；Treat等人(1989)之Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365；Lopez-Berestein，同上，pp. 317-327；參見，一般而言同上)。
在特定的情況下，醫藥組成物可以控制釋放系統來遞送。在一實施例中，可使用幫浦(參見Langer,supra；Sefton,(1987),CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另外的實施例中，可使用聚合物質；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)。又在另外的實施例中，控制釋放系統可放置在靠近組成物的目標處，因此僅需要全身劑量之一部分(參見，例如Goodson之Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138,1984)。
可注射製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。這些可注射製備物可以公開已知的方法來製備。例如，可注射製備物可，例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於注射上習用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來製備。注射用之水性媒劑有，例如生理食鹽水、含葡萄糖之等張溶液和其他佐劑等，其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。油性媒劑，可使用例如芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。因此所製備的注射液較佳地係填充於適當的安瓶中。本發明之醫藥組成物可以標準的針和注射器 由皮下或靜脈內遞送。此外，就皮下遞送而言，筆型遞送裝置可容易地用於遞送本發明之醫藥組成物。此筆型遞送裝置可為再用型或拋棄型。再用型筆型遞送裝置一般係利用含有醫藥組成物之可更換內匣。一旦匣內的所有醫藥組成物投予後而內匣變空，空匣可容易丟棄並更換新的含醫藥組成物之內匣。然後此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的內匣。取而代之的，拋棄型筆型遞送裝置係預先填充醫藥組成物收藏在裝置內的儲槽中。一但醫藥組成物的儲槽變空，整個裝置便可丟棄。
許多再用型筆型和自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括(但不限於)AUTOPENTM(英國伍德斯托克Owen Mumford公司)、DISETRONICTM筆(瑞士伯格多夫Disetronic Medical Systems公司)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(印第安那州印第安那波里Eli Lilly公司)、NOVOPENTM I,II及III(丹麥哥本哈根Novo Nordisk公司)、NOVOPEN JUNIORTM(丹麥哥本哈根Novo Nordisk公司)、BDTM筆(紐澤西州福蘭克林湖Becton Dickinson公司)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM及OPTICLIKTM(德國法蘭克福sanofi-aventis公司)，僅提出一些。用於皮下遞送本發明醫藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置包括(但不限於)SOLOSTARTM筆 (sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)。
有利地，上述之口服或非經腸用途的醫藥組成物係製備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的前述抗體之量一般為每單位劑型約0.1至約800 mg；特別是注射形式，較佳的前述抗體係含有約1至約500 mg，約5至約300 mg，約8至約200 mg，而其他劑型為約10至約100毫克。
組合治療
本發明進一步係藉由投予本發明之hANGPTL3抗體或其片段與一或多種另外的治療之組合，提供治療直接或間接與hANGPTL3有關的疾病或病症之方法。另外的治療劑可為一或多種有利地與本發明一或多種抗體或其片段組合之任何藥劑，包括HMG-CoA還原酶抑制劑，例如西立伐他汀(cerivastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、羅伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)及其類似物；菸鹼酸；各種纖維酸，例如非諾貝特(fenofibrate)、苯扎貝特(bezafibrate)、環丙貝特(ciprofibrate)、氯貝特(clofibrate)、吉非貝齊(gemfibrozil)及其類似物；LXR轉錄因子之活化劑及其類似物。再者，本發明之hANGPTL3抗體或其片段 可與其他的hANGPTL3抑制劑以及涉及脂質代謝(特別是膽固醇及/或三酸甘油酯異化作用)之其他分子，例如ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6和第9型前蛋白轉化酶枯草溶菌素(PCSK9)之抑制劑共投予。這些分子之抑制劑包括小分子及專一性與這些分子結合和阻斷其活性之抗體(參見，例如揭示於U.S.2010/0166768 A1中之抗-PCSK9抗體)。
再者，另外的治療劑可為一或多種抗癌劑，例如化療劑、抗血管新生劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡劑和其他本技術中用於治療癌症或其他增生性疾病或病症之熟知的藥劑。抗癌劑之實例包括(但不限於)抗-有絲分裂劑，如多西紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及其類似物；鉑為主的化療劑，例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、異丙鉑(iproplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及其類似物；或其他習用的細胞毒性劑，例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、依立替康(irinotecan)、亞葉酸(leucovorin)、吉西他濱(gemcitabine)及其類似物，和抗血管新生劑，包括血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑，例如抗-VEGF抗體，例如貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN®,Genentech)和VEGF之受體阻斷劑，例如美國專利第7,070,959號中所述之「VEGF trap」，類δ配體4(Dll4)拮抗劑，例如美國專利申請公開案第2008/0181899號中所述之抗-Dll4抗體，及含有 Dll4胞外區之融合蛋白，例如美國專利申請公開案第2008/0107648號中所述之Dll4-Fc；受體酪胺酸激酶及/或血管新生之抑制劑，包括索拉菲尼(sorafenib)(拜耳醫藥公司之Nexavar®)、舒尼替尼(sunitinib)(輝瑞公司之Sutent®)、帕唑帕尼(pazopanib)(葛蘭素史克公司之VotrientTM)、托西尼布(toceranib)(輝瑞公司之PalladiaTM)、凡德他尼(vandetanib)(阿斯特捷利康公司之ZactimaTM)、西地尼布(cediranib)(阿斯特捷利康公司之Recentin®)、瑞格尼布(regorafenib)(拜耳公司之BAY 73-4506)、阿西替尼(axitinib)(輝瑞公司之AG013736)、來他替尼(lestaurtinib)(Cephalon公司之CEP-701)、厄洛替尼(erlotinib)(Genentech公司之Tarceva®)、吉非替尼(gefitinib)(阿斯特捷利康公司之IressaTM)、BIBW 2992(百靈佳殷格翰公司之TovokTM)、拉帕替尼(lapatinib)(葛蘭素史克公司之Tykerb®)、來那替尼(neratinib)(惠氏/輝瑞公司之HKI-272)及其類似物和任何上述之醫藥上可接受鹽類、酸或衍生物。此外，其他的治療劑，例如鎮痛劑、抗發炎劑，包括非類固醇抗發炎藥(NSAIDS)，例如Cox-2抑制劑及其類似藥劑，亦可與本發明之hANGPTL3抗體或其片段共投予，用以改善及/或降低潛藏癌症/腫瘤下伴隨的癥狀。
本發明之hANGPTL3抗體或其片段和另外的治療劑可一起共投予或分開共投予。當使用分開的劑量調配物時，本發明之抗體或其片段和另外的治療劑可同時、 或於交錯時間分開給藥，亦即以適當的順序連續給藥。
抗體之診斷用途
本發明之抗-hANGPTL3抗體亦可用於偵測及/或測量樣本中之hANGPTL3，例如供作診斷目的。例如抗-hANGPTL3 Ab或其片段可用於診斷特徵為hANGPTL3異常表現(例如過度表現，表現不足，無表現等)之症狀或疾病。用於hANGPTL3之示例診斷分析可包括，例如將得自病患的樣本與本發明之抗-hANGPTL3 Ab接觸，其中該抗-hANGPTL3抗體係以可偵測的標記或受體分子標定或用於從病患樣本中選擇性捕捉和分離hANGPTL3蛋白。另外，未標定的抗-hANGPTL3 Ab可與本身經可偵測標記標定之第二抗體組合用於診斷用途。可偵測標記或受體分子可為放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學螢光基團，例如螢光素異硫氰酸酯或羅丹明(rhodamine)；或酵素例如鹼性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或螢光素酶(luciferase)。可用於偵測或測量樣本之hANGPTL3的分析包括酵素連結免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)及螢光活化細胞分類(FACS)諸如此類。
實例
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造及使用本發明組合物之方法的完整揭示和說明，但 不希望限制發明者所認為之發明範圍。雖已盡力確保所用的相關數字之正確性，但仍有某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度數表示，而壓力係為或接近大氣壓。
實例1：產生抗人類ANGPTL3之人類抗體
將VELOCIMMUNETM小鼠以人類ANGPTL3使其免疫，並使用得自這些小鼠的血清，以抗原專一性免疫分析監測抗體的免疫反應。從顯示升高抗-hANGPTL3抗體效價之免疫小鼠的脾臟收取表現B細胞之抗-hANGPTL3，並與小鼠骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤。使用下述分析篩選及選擇雜交瘤以辨識出表現hANGPTL3-專一性抗體之細胞株。此等分析係辨識數種產生嵌合抗-hANGPTL3抗體之細胞株，例如H1M896N。
如U.S.2007/0280945 A1所述，在未與骨髓瘤細胞融合下，直接從抗原致免疫B細胞分離人類ANGPTL3-專一性抗體。選殖重鏈和氫鏈可變區以產生IgG4同型之全人類抗-hANGPTL3抗體，係稱為H4H1248P、H4H1250P、H4H1263S、H4H1268S、H4H1276S、H4H1279P、H4H1282P、H4H1292P、H4H1295P和H4H1296P。建立穩定表現重組抗體之CHO細胞。
實例2.可變基因利用分析
選殖編碼抗體可變區之核酸並定序，用以分析所產生的抗體結構。從核酸序列和預測的抗體之胺基酸序列辨識各重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)之基因 使用。表1係顯示本發明所選的抗體之基因使用
表2係顯示所選的抗-hANGPTL3抗體之重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列對及其對應的抗體識別碼。N、P和S命名係指具有含相同CDR序列，但區中序列變異係落在CDR序列外(亦即在架構區中)之重鏈和輕鏈的抗體。因此，特定抗體之N、P和S之變體在其重鏈和輕鏈可變區內具有相同CDR序列，但在架構區內含有修飾。
實例3.與hANGPTL3結合之抗-hANGPTL3抗體的動力學參數
所有的動力學結合實驗係於25℃或37℃在BIACORETM T200免標定生物分子交互作用儀器(GE Healthcare)上使用CM5感應晶片來進行。簡言之，抗原捕捉表面係藉由抗-小鼠IgG-專一性抗體(抗-mFc；GE Healthcare；型號#BR-1008-38)或抗-五組胺酸-專一性抗體(Qiagen；型號#34660)與CM5感應晶片之表面使用標準的胺偶合法，共價偶合所產生。使用HBS-EP(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20,pH 7.4)或PBSP(10 mM磷酸鈉、2.7 mM KCl、137 mM NaCl、0.025%界面活性劑P20,pH 7.2或5.75)作為操作緩衝液，將帶有寡組胺酸標籤之人類和物種ANGPTL3變體捕捉到抗-五聚組胺酸偶合表面，直到達到4.4-46.5 RU之結合反應。捕捉的重組蛋白為：帶有 C-端十聚組胺酸標籤[hANGPTL3(17-460)-His；R&D Systems,MN；型號#3829-AN]之全長的成熟人類ANGPTL3(亦即SEQ ID NO：161之17-460胺基酸殘基)、含有C-端六聚組胺酸標籤[hANGPTL3(17-170)-His]之hANGPTL3的N-端捲曲螺旋區(亦即SEQ ID NO：161之17-170胺基酸殘基)、含有myc-myc-六聚組胺酸標籤[MfANGPTL3(17-170)-mmH；SEQ ID NO：167]之來自獼猴(Macaca fascicularis)hANGPTL3的N-端捲曲螺旋區[亦即SEQ ID NO：177之17-170胺基酸殘基(獼猴ANGPTL3之部分序列)]、帶有C-端十聚組胺酸標籤[mANGPTL3(17-455)-His；R&D Systems、MN；型號#136-AN]之來自小鼠(Mus musculus)全長成熟ANGPTL3(亦即SEQ ID NO：163之17-455胺基酸殘基)、含有六聚組胺酸標籤[mANGPTL3(17-240)-His；SEQ ID NO：166]之來自小鼠hANGPTL3的N-端捲曲螺旋區(亦即SEQ ID NO：163之17-240胺基酸殘基)，及含有myc-myc-六聚組胺酸標籤[rANGPTL3(17-240)-mmH；SEQ ID NO：176]之來自大鼠(Rattus norvegicus)ANGPTL3的N-端捲曲螺旋區(亦即SEQ ID NO：175之17-240胺基酸殘基)。此外，含有C-端小鼠Fc融合[hANGPTL3(17-169)-mFc；SEQ ID NO：165]之hANGPTL3的N-端捲曲螺旋區(亦即SEQ ID NO：163之17-169胺基酸殘基)係捕捉到抗-mFc偶合表面，直到達到24.8±1.5 RU之結合反應。測量抗體/抗 原複合物形成之結合和解離速率，係將單一(表3和7)或多種(表4-6)濃度之抗體以50 μl/分鐘之流速注射穿過捕捉的蛋白表面歷時3分鐘，並監測複合物之解離歷時20分鐘。處理結合數據並以大量傳輸使用Scrubber version 2.0a(BioLogic Software)與1：1結合模型擬合。從解離速率常數kd計算動力半衰期(t1/2)。
表3係顯示在25℃、pH 7.4下於HBS-EP緩衝液中各種hANGPTL3之抗-ANGPTL3抗體的結合。
如表3所示，與帶有C-端十聚組胺酸標籤[hANGPTL3(17-460)-His]，帶有範圍從96.8 pM至5.62 nM之計算平衡解離常數(KD=kd/ka)的全長蛋白相結合，及與含有C-端小鼠Fc融合[hANGPTL3(17-169)-mFc]之N-端捲曲螺旋區，帶有範圍從8.41 pM至6.23 nM之KD結合的抗-hANGPLT3抗體。
如表4-6中所示，抗體H4H1276S展現以類似於人類ANGPTL3結合之結合親和力和動力學常數，與來自猴子、小鼠和大鼠之ANGPTL3結合。
表7係顯示在25℃、pH 7.4下於HBS-EP緩衝液中所選的hANGPTL3和mANGPTL3之抗-ANGPTL3抗體的結合。NB：未結合。
如表7所示，在pH 7.4和37℃與帶有C-端十聚組胺酸標籤[hANGPTL3(17-460)-His]和帶有範圍從158 pM至1.02 nM之計算平衡解離常數(KD=kd/ka)的全長蛋白相結合，及與帶有範圍從167 pM至682 pM之KD的小鼠ANGPLT3[mANGPTL3(17-455)-His]結合之抗-hANGPLT3抗體，但H4H1248P和H4H1263S除外，其未顯示出可偵測的mANGPTL3結合。亦顯示動力學半衰期(t1/2)。
實例4.抗-ANGPTL3抗體之Biacore交叉競爭研究
交叉競爭實驗係基本上如上文實例3中所述，於25℃，Biacore上來進行。簡言之，使用HBS-EP做為操作緩衝液，將帶有C-端十聚組胺酸標籤[hANGPTL3(17-460)-His；R&D Systems,MN；型號#3829-AN]之全長hANGPTL3(亦即SEQ ID NO：161之17-460胺基酸殘基)捕捉到抗-五聚組胺酸偶合表面，直到達到64 RU之結合反應。為了測定二種抗體是否能同時與捕捉的ANGPTL3結合，係將抗體對連續各以167 nM用4 μl/分鐘之流速注射15分鐘於表面，並測量各結合事件之最大結合反應訊號(RU)。結果係如表8所示，第一抗體(mAb1)之結合反應，接著於預載入第一抗體之ANGPTL3表面上的第二抗體(mAb2)。粗黑體之數字係表示抗體對能同時與hANGPTL3結合。斜體之數字係表示當以一方向連續添加時，抗體對能與hANGPTL3結合，而從另一方向則否。括弧係表示自我-自我競爭。
如表8所示，H1M896N/H4H1279P和H1M896N/H4H1292P抗體對能同時與固定的ANGPTL3結合，與添加抗體之順序無關。H4H1250P與預結合H4H1279P之ANGPTL3相結合；然而，當添加抗體的順序相反時，在ANGPTL3與H4H1250P預結合後，H4H1279P顯示大約24%之預期最大反應的結合訊號。同樣地，H4H1250P與預結合H4H1292P之ANGPTL3相結合；然而，當添加抗體的順序相反時，在ANGPTL3與H4H1250P預結合後，H4H1292P顯示大約20%之預期最大反應的結合訊號。
實例5.抗-hANGPTL3抗體與ANGPTL3 N-端捲曲螺旋胜肽
為了評估抗-ANGPTL3抗體H4H1276S與衍生自ANGPTL3的N-端捲曲螺旋區之胜肽的結合，係使用OCTET® RED系統(FortéBio、Inc.)進行一免標定生物感應器結合分析。將胜肽以N-端生物素標籤[對胜肽1 和胜肽2，以柔性連接子，胺基酸“AGSSPGG”(SEQ ID NO：171)分開；及對胜肽3，係以胺基酸“GGGGS”(SEQ ID NO：172)]，或C-端生物素標籤[對胜肽1和胜肽2，以柔性連接子，胺基酸“GPSSGAPPPK”(SEQ ID NO：173)分開；及對胜肽3係以“GGGGSK”(SEQ ID NO：174)]標定，固定在感應器上。受試的胜肽序列為：負性對照胜肽，N-端生物素標定的胜肽1(SEQ ID NO：168；SEQ ID NO：164之人類ANTGPTL4的Arg34至Leu66殘基)；和衍生自ANGPTL3的N-端捲曲螺旋區之胜肽，亦即N-端生物素標定的胜肽2(SEQ ID NO：169；SEQ ID NO：161之hANTGPTL3的Arg36至Leu68殘基)；C-端生物素標定的胜肽2；N-端生物素標定的胜肽3(SEQ ID NO：170；相當SEQ ID NO：161之hANTGPTL3的Glu32至Leu57殘基)；和C-端生物素標定的胜肽3。胜肽序列亦顯示於圖1中。於塗覆鏈黴親和素的生物感應器尖端塗上生物素化胜肽，產生1.22-2.26 nm之結合反應單位，依胜肽而定。然後將塗覆胜肽的感應器尖端浸入含1 μM的抗-ANGPTL3抗體H4H1276S，或同型匹配的負性對照抗體之孔槽中，並監測結合2.5分鐘。H4H1276S和同型對照抗體對各胜肽之結合反應係概述於圖2中。觀察到，H4H1276與胜肽2所定義的ANGPTL3線性序列結合，而非重疊但胜肽3所定義的不同序列(亦參見圖1)。同型對照抗體亦作為胜肽1(亦即hANGPTL4胜肽)載入生物感應器的正性對照，因為 此同型對照抗體專一性辨識hANGPTL4。如圖2所示，對照抗體與胜肽1之結合確認了胜肽1出現在感應器表面及其他胜肽亦同。
實例6.於LPL生物分析中以抗-hANGPTL3抗體抑制hANGPTL3
脂蛋白脂解酶(LPL)在人類脂質代謝中扮演重要的角色。LPL催化三酸甘油酯之水解並釋放脂肪酸進行代謝。ANGPTL3抑制LPL活性，使得脂質之量增加(Oike等人，2005,Trends in Molecular Medicine 11(10)：473-479)。當在無C-端纖維蛋白原區下表現時，ANGPTL35之N-端捲曲螺旋區抑制LPL，並因此似乎給予其抑制功能。已開發出無細胞生物分析用以測定抗-ANGPTL3抗體抑制ANGPTL3-引發的LPL活性減低之能力。
抗-ANGPTL3抗體抑制hANGPTL3活性係使用CONFLUOLIPTM連續螢光儀脂解酶試驗(Progen，德國)，使用三種hANGPTL3蛋白來測定：帶有C-端十聚組胺酸標籤[hANGPTL3(17-460)-His；R&D Systems,MN；型號#3829-AN]之全長成熟的hANGPTL3(亦即SEQ ID NO：161之17-460胺基酸殘基)、帶有C-端小鼠Fc融合[hANGPTL3(17-169)-mFc；SEQ ID NO：165]之N-端捲曲螺旋區(亦即SEQ ID NO：161之17-169胺基酸殘基)，和含有C-端六聚組胺酸標籤[hANGPTL3(17-170)-His]之hANGPTL3的N-端捲曲螺 旋區(亦即SEQ ID NO：161之17-170胺基酸殘基)。
簡言之，將牛LPL(最終濃度2 nM)、人類ApoCII(LPL之共因子，最終濃度0.23 μM)和BSA(最終濃度2 mg/mL)於PBS中預混合。將hANGPTL3重組蛋白加到Apo/LPL混合物中(最終濃度80-100 nM)。然後將Apo/LPL/ANGPTL3蛋白混合物經連續稀釋一起加到抗-hANGPTL3抗體中並於室溫培養30分鐘。培養後，將100 μl重建的脂解酶受質1-三硝基苯基-胺基-十二醯基-2-芘癸醯-3-0-十六烷基-sn-甘油(LS-A,Progen)加到96-孔分析盤之25 μl的抗體混合物中並於37℃培養二小時。然後於342 nm/400 nm(激發/放射)使用FLEXSTATION® 3微量盤判讀儀(Molecular Devices,CA)測量螢光。螢光與LPL活性成正比。
H4H1276S抗體展現抑制hANGPTL3之抗LPL的抑制活性。於LPL分析中使用hANGPTL3蛋白先進行全劑量反應，用以測定各實驗之ANGPTL3 EC50，及然後使用固定濃度的ANGPTL3蛋白測定各抗體IC50，如表8中所示。50%最大抑制(IC50)所需之抗體濃度經測定分別是，80 nM hANGPTL3(17-460)-His為9.6 nM，100 nM hANGPTL3(17-170)-His為2.9 nM，而80 nM hANGPTL3(17-169)-mFc為21 nM。用於試驗人類ANGPTL3蛋白之抗體濃度範圍係從0至300 nM。
同樣地，以LPL生物分析試驗H4H1276S其抑制跨物種直系同源體之能力：以C-端myc-myc-六聚組胺酸 標籤[MfANGPTL3(17-170)-mmH；SEQ ID NO：167]表現之獼猴N-端區(SEQ ID NO：177之17-170胺基酸殘基)、帶有C-端六聚組胺酸標籤[mANGPTL3(17-240)-His；SEQ ID NO：166]之小鼠直系同源體N-端區SEQ ID NO：163之17-240胺基酸殘基，及帶有C-端十聚組胺酸標籤[mANGPTL3(17-455)-His；R&D Systems,MN；型號#136-AN]之全長成熟的小鼠ANGPTL3(亦即SEQ ID NO：163之17-455胺基酸殘基)。測定IC50，500 nM固定的MfANGPTL3(17-170)-mmH為10 nM，80 nM固定的mANGPTL3(17-455)-His為14 nM，而500 nM固定的mANGPTL3(17-240)-His為31 nM。以範圍從0至600 nM之抗體濃度試驗猴子和小鼠ANGPTL3蛋白。結果係概述於表9中。
抗同源蛋白ANGPTL4之N-端區的抗體亦顯示阻斷ANGPTL4對LPL的抑制功能(Lee等人，2009、J.Biol.Chem.284：13735-13745)。因此，抑制的抗-ANGPTL3抗體H4H1276S亦可以LPL脂解酶分析試驗抗人類ANGPTL4，如上ANGPTL3蛋白中所述來進行，用以評估對ANGPTL4之可能的交叉反應性。帶有C-端小鼠IgG2a Fc融合[hANGPTL4(26-148)-mFc、SEQ ID NO：178]之人類ANGPTL4捲曲螺旋區的重組形式(SEQ ID NO：164之26-148殘基)於LPL分析中顯現0.2 nM之EC50(表9)。以0-600 nM濃度範圍試驗的H4H1276S無法阻斷此抑制作用(NB：未結合；表9中)。
如上所示，H4H1276S以相當約3-31 nM之IC50範圍抑制人類ANGPTL3(全長和N-端)、猴子ANGPTL3(N-端)蛋白及小鼠ANGPTL3(全長和N-端)活性。
亦試驗一抗體亞群，來測定同時加入二種ANGPTL3非阻斷性抗體組合是否可阻斷ANGPTL3之LPL抑制活性。將成對抗體進行抑制人類和小鼠ANGPTL3之N-端區，亦即分別為hANGPTL3(17-169)-mFc和mANGPTL3(17-240)-His之試驗。就此分析而言，ANGPTL3蛋白對於阻斷LPL顯 現47 nM[對hANGPTL3(17-169)-mFc]，及341 nM[對mANGPTL3(17-240)-His]之IC50值。下列抗體對，當各抗體以至少200 nM之最終濃度加入時，無法阻斷80 nM之hANGPTL3(17-169)-mFc或500 nM之mANGPTL3(17-240)-His的LPL抑制作用：H1M896N+H4H1279P；H4H1250P+H4H1279P；H4H1248P+H4H1292P；和H4H1263S+H4H1292P。在此相同的分析中，H4H1276S單獨以分別33 nM和64 nM之IC50阻斷此等相同固定濃度的人類和小鼠ANGPTL3。
實例7.1.活體內抗-ANGPTL3抗體對血清脂質之量的效應
於C57Bl/6小鼠中測定抗-hANGPTL3抗體H4H1726S對血清脂質之量的效應。在實驗前7天將小鼠預先放血並分成各組六隻小鼠進行各抗體劑量試驗。於研究的第0天以皮下注射投予5mg/kg(H4H1726S)和10 mg/kg[H4H1726S和同型匹配的hIgG4(S108P)對照組，無關專一性]劑量。注射抗體後在第1、4、7和12天禁食4小時後將小鼠放血，並用ADVIA® 1800 Chemistry System(Siemens)以血清測量血清脂質之量(三酸甘油酯、總膽固醇、非-HDL膽固醇、LDL膽固醇和HDL膽固醇)。計算各抗體之各時間點的平均。結果，以血清脂質濃度(平均值±SEM)表示，係如表10-14所示。
使用標準的ELISA分析亦測定循環中H4H1726S(血清Ab)之量。簡言之，將測定盤塗覆山羊抗-人類Fc抗體(Sigma-Aldrich)用以捕捉血清Ab。然後將血清加到測定盤中並以化學螢光使用辣根過氧化酶(HRP)接合山羊抗-人類IgG抗體(Sigma-Aldrich)偵測所捕捉的人類抗體。結果，以(平均±SEM)表示，係如表15所示。對照組：接受同型-匹配的對照組Ab之小鼠。
於C57Bl/6小鼠中單一投予10 mg/kg之H4H1276S在投予抗體7天後使循環的三酸甘油酯產生~60%降低(相較於同型對照組)。投予H4H1276S對總膽固醇、非-HDL膽固醇和HDL膽固醇產生顯著的下降，但對LDL膽固醇無效應。亦觀察到脂質下降，但相較於10 mg/kg劑量，5 mg/kg不太明顯；例如投予抗體7天後，血清三酸甘油酯降低44%(相較於同型對照組)。
實例7.2.活體內抗-ANGPTL3抗體對血清脂質之量的效應
於C57Bl/6小鼠中進行抗-hANGPTL3抗體H4H1276S和比較抗體4.9.1於活體中對血清脂質之量的效應。抗體4.9.1係以美國專利申請公開案第號中所揭示的SEQ ID No：24(VH)和SEQID No：32(VL)胺基酸序列為基礎所製備並作為小鼠IgG1同型。在實驗前7天將小鼠預先放血並分成每組六隻小鼠。於研究的第0天以皮下注射投予10 mg/kg劑量之抗體H4H1276S、4.9.1和同型相匹配的負性對照組(分別為人類IgG4和小鼠IgG1)，與專一性無關。注射抗體後，在第1、7、11和20天禁食4小時後將小鼠放血，並使用ADVIA® 1800 Chemistry System(Siemens)以血清測量血清脂質之量(三酸甘油酯、總膽固醇、非-HDL膽固醇、LDL膽 固醇和HDL膽固醇)。計算各抗體之各時間點的平均脂質濃度。結果，以血清脂質濃度之(平均±SEM)表示，係如表16-20所示。
表20
在抗體注射後第1、7、11和20天，相較於同型對照組，於C57Bl/6小鼠中單一10 mg/kg劑量之H4H1276S造成血漿三酸甘油酯降低；且相較於相同劑量的比較抗體4.9.1之單一治療，此效應更持久(表16)。投予H4H1276S亦導致C57Bl/6小鼠中總膽固醇(表17)和HDL膽固醇(表20)下降。
實例8.於高脂血症ApoE -/- 小鼠中H4H1276S於活體中對血清脂質之量的效應
於apoE-/-小鼠中測定抗-hANGPTL3抗體H4H1276S對血清脂質之量的效應。這些小鼠為高脂血症，其循環中主要的膽固醇為VLDL和LDL形式。在實驗前7天將小鼠預先放血並分成每組六隻小鼠。於研究的第0天以皮下注射投予10 mg/kg劑量之H4H1276S抗體和同型相匹配的(hIgG4)對照組，與專一性無關。注射抗體後在第1、4、7和11天禁食4小時後將小鼠放血，並使用ADVIA® 1800 Chemistry System(Siemens) 以血清測量血清脂質之量(三酸甘油酯、總膽固醇、非-HDL膽固醇、LDL膽固醇和HDL膽固醇)。計算各抗體之各時間點的平均脂質濃度。結果，以血清脂質濃度之(平均±SEM)表示，係如表21-25所示。
單一投予10 mg/kg之H4H1276S於apoE-/-小鼠，於抗體投予7天後(相較於同型相匹配的對照Ab，亦即hIgG4)，造成循環中三酸甘油酯下降~72%(平均)(表21)和LDL膽固醇下降~46%(平均)(表24)。投予H4H1276S亦造成總膽固醇(表22)和非-HDL膽固醇下降(表23)。
亦使用標準的ELISA分析測定循環中H4H1726S(血清Ab)之量。簡言之，將測定盤塗覆山羊抗-人類Fc抗體(Sigma-Aldrich)用以捕捉血清Ab。然後將血清加到測定盤中並以化學螢光使用辣根過氧化酶(HRP)接合山羊抗-人類IgG抗體(Sigma-Aldrich)偵測所捕捉的人類抗體。結果，以(平均±SEM)表示，係如表26所示(對照組：接受同型-匹配的對照組Ab，亦即hIgG4之小鼠)。
實例9.於高脂血症Ldlr -/- 小鼠中H4H1276S於活體中對循環中脂質之量的效應
於Ldlr -/-小鼠中測定抗-hANGPTL3抗體H4H1276S對血清脂質之量的效應。這些小鼠為高脂血症，由於缺乏LDLR(LDL膽固醇吸收之主要受體)，其循環中主要的膽固醇為LDL形式。
在實驗前7天將小鼠預先放血並分成每組六隻小鼠。於研究的第0天以皮下注射投予10 mg/kg劑量的H4H1276S抗體和同型相匹配的(hIgG4)負性對照組。抗體注射後在第1、4、7和11天禁食4小時後將小鼠放血，並使用ADVIA® 1800 Chemistry System(Siemens)臨床化學分析儀測定血清脂質之量(三酸甘油酯、總膽固醇、非-HDL膽固醇、LDL膽固醇和HDL膽固醇)。計算各抗體之各時間點的平均。結果，以血清脂質濃度(三酸甘油酯、總膽固醇、非-HDL膽固醇、LDL膽固醇 和HDL膽固醇)之(平均±SEM)表示，分別係如表27-31所示。
如表27-31所示，投予Ldlr-/-小鼠H4H1726S造成血漿三酸甘油酯顯著下降，其中所觀察最大的下降量為44%(以平均值為基準)。於經H4H1726S-治療的對象中亦觀察到LDL膽固醇(至高23%)以及總膽固醇、非-HDL膽固醇和HDL膽固醇顯著下降。在缺乏LDL膽固醇吸收主要受體(LDLR)之小鼠中LDL膽固醇的下降顯示由ANGPTL3抑制之LDL膽固醇下降的LDLR-依賴機制。
亦使用標準的ELISA分析測定循環中H4H1726S(血清Ab)之量。簡言之，將測定盤塗覆山羊抗-人類Fc抗體(Sigma-Aldrich)用以捕捉血清Ab。然後將血清加到測定盤中並以化學螢光使用辣根過氧化酶(HRP)接合山羊抗-人類IgG抗體(Sigma-Aldrich)偵測所捕捉的抗體。結果，以(平均±SEM)表示，係如表32所 示。(對照組=接受同型-匹配的對照組抗體之小鼠)。
如表32所示，在注射小鼠10 mg/kg的抗體後，於第11天之前，血清中H4H1726S之量降至約21 μg/mL。
本發明並不希望被限制於文中所述的實施例之範圍中。實際上，除了該等文中所述之外，由前述說明及伴隨的圖示，本發明之各種修改對熟習本項技術者將變得顯而易見。此等修改係希望落在所附的申請專利範圍內。
圖1係顯示用於抗hANGPTL3序列相關部分的抗-hANGPTL3結合實驗(實例5)之胜肽1-3序列比對(亦即，SEQ ID NO：161之30至70殘基內，或基因庫編號#NP_055310)。胜肽1(對照組：ANGPTL4胜肽；SEQ ID NO：168)；胜肽2(ANGPTL3胜肽：SEQ ID NO：169)；及胜肽3(ANGPTL3胜肽；SEQ ID NO：170)。
圖2係顯示與hANGPTL3(胜肽2和3)或hANGPTL4(胜肽1)之N-端捲曲螺旋胜肽結合的抗-hANGPTL3結果。：同型對照組；及■：H4H1276S表。
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
<210> 168
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 168
<210> 169
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 169
<210> 170
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 170
<210> 171
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 171
<210> 172
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 172
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 173
<210> 174
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 174
<210> 175
<211> 455
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 175
<210> 176
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 176
<210> 177
<211> 210
<212> PRT
<213> 獼猴
<400> 177
<210> 178
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 178
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<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 179
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 180
<210> 181
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 181
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 182
<210> 183
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 183
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 185
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 187
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 189
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 191
<210> 192
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 192
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 193
<210> 194
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 194

Claims (35)

  1. 一種分離的人類抗體或其抗原結合片段，其係專一性與SEQ ID NO：161之人類類血管生成素蛋白3(hANGPTL3)結合並中合、降低或干擾至少一種hANGPTL3活性。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或片段，其中該抗體或其片段係與位於SEQ ID NO：161之17至209殘基的N-端捲曲螺旋區內的表位結合。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體或片段，其中該抗體或其片段不與SEQ ID NO：170之ANGPTL3胜肽結合。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體或片段，其中該表位係位於SEQ ID NO：161之17至200、17至100、17至70、17至65、17至60、17至57、17至50、40至200、40至100、40至70、50至200、50至100、50至70、58至200、58至100、58至70、58至68、或61至66殘基內。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗體或片段，其中該抗體或片段為嵌合的或全人類抗體或抗體片段。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或片段，其係包含由SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146和180組成之群中選出的重鏈可變區(HCVR)；及/或由SEQ ID NO：10、26、42、58、 74、90、106、122、138、154和188組成之群中選出的輕鏈可變區(LCVR)。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗體或片段，其中該抗體或其片段係包含由SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154和180/188組成之群中選出的HCVR和LCVR序列對(HCVR/LCVR)。
  8. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或片段，其中該抗體或片段係包含於由SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154和180/188組成之群中選出的重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)序列對(HCVR/LCVR)內所含之重鏈互補決定區(CDR)序列HCDR1、HCDR2和HCDR3，及輕鏈CDR序列LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  9. 如申請專利範圍第8項之抗體或片段，其中該HCDR1/HCDR2/HCDR3序列組合係由SEQ ID NO：4/6/8、20/22/24、36/38/40、52/54/56、68/70/72、84/86/88、100/102/104、116/118/120、132/134/136、148/150/152和182/184/186組成之群中選出；及/或該LCDR1/LCDR2/LCDR3序列組合係由SEQ ID NO：12/14/16、28/30/32、44/46/48、60/62/64、76/78/80、92/94/96、108/110/112、124/126/128、140/142/144、156/158/160和190/192/194組成之群中選出。
  10. 如申請專利範圍第8或9項之抗體或片段，其中該抗體或片段係包含由4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/4852/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/8084/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160和182/184/186/190/192/194組成之群中選出的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列組合。
  11. 一種抗體或其抗原結合片段，其係與包含由4/6/8/12/14/16、20/22/24/28/30/32、36/38/40/44/46/48、52/54/56/60/62/64、68/70/72/76/78/80、84/86/88/92/94/96、100/102/104/108/110/112、116/118/120/124/126/128、132/134/136/140/142/144、148/150/152/156/158/160和182/184/186/190/192/194組成之群中選出的重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)序列組合之抗體或其原結合片段，競爭與hANGPTL3相結合，或是和與其相同的hANGPTL3上之表位相結合。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係與獼猴ANGPTL3交叉反應。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係與小鼠或大鼠ANGPTL3交叉反應。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段係與獼猴ANGPTL3、小鼠ANGPTL3和大鼠ANGPTL3中任一者交叉反應。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之抗體或片段，其中該抗體片段為單鏈的抗體、Fab或F(ab’)2。
  16. 一種分離的核酸分子，其係編碼如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體或其片段。
  17. 一種表現載體，其係包含如申請專利範圍第16項之核酸分子。
  18. 一種分離的宿主細胞，其係包含如申請專利範圍第17項之表現載體。
  19. 一種製造抗-hANGPTL3抗體或其抗原結合片段之方法，其係包括將如申請專利範圍第18項之宿主細胞於得以產生抗體或其片段之條件下培養，並回收由此產生的抗體或其片段。
  20. 一種醫藥組成物，其係包含一或多種如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體或其片段與醫藥上可接受載劑。
  21. 如申請專利範圍第20項之醫藥組成物，其中該抗體或其片段係包含SEQ ID NO：68/70/72/76/78/80之重 鏈和輕鏈互補決定區(CDR)序列組合，或包含SEQ ID NO：66/74之重鏈可變區和輕鏈可變區HCVR/LCVR對。
  22. 如申請專利範圍第20項之醫藥組成物，其係包含由下列組成之群中選出的重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)序列對(HCVR/LCVR)之抗體或其片段組合：(i)SEQ ID NO：82/90和180/188；(ii)SEQ ID NO：114/122和180/188；(iii)SEQ ID NO：82/90和18/26；以及(iv)SEQ ID NO：114/122和18/26。
  23. 如申請專利範圍第20至22項中任一項之醫藥組成物，進一步係包含一或多種由下列組成之群中選出的另外治療劑：HMG-CoA還原酶抑制劑；膽固醇吸收或膽酸再吸收抑制劑、或二者；增加脂蛋白異化作用之藥劑；降低非致命性心臟病發作次數之藥劑；及LXR轉錄因子之活化劑。
  24. 如申請專利範圍第20至22項中任一項之醫藥組成物，進一步係包含一或多種由下列組成之群中選出的另外治療劑：他汀、菸鹼酸、纖維酸、抗-hANGPTL4抗體和抗-PCSK9抗體。
  25. 一種預防或治療疾病或病症之方法，其中該疾病或病症係藉由降低或抑制ANGPTL3活性來預防、改善、改進或抑制，該方法包括於有此需要之對象中 投予一治療上有效量之如申請專利範圍第20至24項中任一項之醫藥組成物。
  26. 一種預防或治療疾病或病症之方法，其中該疾病或病症係藉由降低或抑制ANGPTL3活性來預防、改善、改進或抑制，該方法包括於有此需要之對象中投予一治療上有效量之一或多種如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體或其片段。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，進一步包括於該對象中投予一或多種由下列組成之群中選出的另外治療劑：HMG-CoA還原酶抑制劑；膽固醇吸收或膽酸再吸收抑制劑、或二者；增加脂蛋白異化作用之藥劑；降低非致命性心臟病發作次數之藥劑；及LXR轉錄因子之活化劑。
  28. 如申請專利範圍第26項之方法，進一步包括於該對象中投予一或多種由下列組成之群中選出的另外治療劑：他汀、菸鹼酸、纖維酸、抗-hANGPTL4抗體和抗-PCSK9抗體。
  29. 如申請專利範圍第27或28項之方法，其中該一或多種抗體或其片段以及一或多種另外的治療劑係同時或連續給藥。
  30. 如申請專利範圍第25至29項中任一項之方法，其中該疾病或病症係由下列組成之群中選出：高三酸甘油酯血症、高膽固醇血症、乳糜微粒血症、致動脈粥樣化血脂異常、心血管疾病或病症、急性胰臟 炎、非酒精性脂性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
  31. 一種於有此需要對象之循環中增加hANGPTL3廓清率之方法，其包括投予該對象至少二種不會彼此競爭與hANGPTL3結合及不會阻斷至少一種hANGPTL3活性之抗體或其抗原結合片段。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該一種hANGPTL3活性為抑制脂蛋白脂解酶(LPL)活性。
  33. 如申請專利範圍第31或32項之方法，其中該二種抗體係由下列組成之群中選出的重鏈可變區(HCVR)和輕鏈可變區(LCVR)序列對(HCVR/LCVR)：(i)SEQ ID NO：82/90和180/188；(ii)SEQ ID NO：82/90和18/26；(lii)SEQ ID NO：114/122和180/188；以及(iv)SEQ ID NO：114/122和18/26。
  34. 如申請專利範圍第20至24項中任一項之醫藥組成物，其係用於治療疾病或病症，其中該疾病或病症係藉由降低或抑制ANGPTL3活性來預防、改善、改進或抑制。
  35. 如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其中該疾病或病症係由下列組成之群中選出：高三酸甘油酯血症、高膽固醇血症、乳糜微粒血症、致動脈粥樣化血脂異常、心血管疾病或病症、急性胰臟炎、非酒精性脂性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
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