JP6400471B2

JP6400471B2 - 抗ａｎｇｐｔｌ３抗体及びその使用

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Publication number: JP6400471B2
Application number: JP2014515976A
Authority: JP
Inventors: マーク・ダブル・スリーマン; ヴィクトリア・グサロヴァ; アンドリュー・ジェイ・マーフィ
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2018-10-03
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: SI2721065T1; NZ619092A; RS58310B1; NL301122I1; NO2021037I1; ES2699499T3; LT2721065T; UA114891C2; IL229612B; EP3418301A1; DOP2013000299A; NI201300136A; US9951127B2; JO3412B1; US20220153825A1; JP2014523739A; EP2721065A1; TW201815822A; PL2721065T3; HUS2100034I1

Description

本発明は、ヒトアンギオポエチン様タンパク質３（ｈＡＮＧＰＴＬ３）を特異的に結合するヒト抗体及びヒト抗体の抗原結合フラグメント、及びそれらの抗体を用いる治療方法に関する。

アンギオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子は、シグナル配列及び両親媒性へリックスに基づくＥＳＴデータベースから同定され、そして完全長ＡＮＧＰＴＬ３ｃＤＮＡが、その結果ヒト胎児の肝臓／脾臓ｃＤＮＡライブラリーから分離された（非特許文献１）。推定４６０アミノ酸のｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、７６％のアミノ酸配列同一性をマウスＡＮＧＰＴＬ３と共有し、そしてアンギオポエチンの特性構造；即ち、シグナルペプチド、二量体又は三量体コイルドコイルを形成すると予測される伸長ヘリックスドメイン、ショートリンカーペプチド、及び球状フィブリノーゲン相同性ドメイン（ＦＤ）を有する (非特許文献１)。ＡＮＧＰＴＬ３は、ＦＤ内の分子内ジスルフィド結合に関与する４つの保存システイン残基を含有する；しかしながら、ＡＮＧＰＴＬ３は、血管新生を促進するタンパク質成長因子である、アンギオポエチンのＦＤ（ＡＮＧ；即ち、ＡＮＧ１、ＡＮＧ２及びＡＮＧ４）中に見出される、２つの更なるシステインも特徴的なカルシウム結合モチーフも含有しない(非特許文献１)。加えて、ＡＮＧと異なり、ＡＮＧＰＴＬ３はＴｉｅ２に結合しない；しかしながら、それはまたそのＣ末端ＦＤを介してインテグリンαｖβ３に結合することにより血管新生を誘導し得る(非特許文献２)。

総合的インビボデータは、異常に高いレベルの血漿インスリン、グルコース、及び脂質を伴う中等度の肥満であって、ヒトの２型糖尿病に似た、非近交系ＫＫマウスモデルから得られた（非特許文献３）。しかしながら、亜株マウスの１つ、ＫＫ／Ｓａｎは、メンデルの劣性として遺伝された異常に低い血漿脂質レベルを示すことが見出された（低脂肪血症）。遺伝子座は染色体４にマップされ、そして最終的にエキソン６中に４ｂｐヌクレオチド配列挿入を含有する、ＡＮＧＰＴＬ３をコード化する遺伝子であることが同定された（非特許文献３）。逆に、血漿脂質レベルは、アデノウイルス媒介ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子導入後に、又はＫＫ／Ｓａｎマウス中の組換ヒトＡＮＧＰＴＬ３の投与後に増加する。この効果は、コレステロール合成、リポタンパク質クリアランス又はＮＥＦＡ酸化に関与する遺伝子の変化によって媒介されなかった（非特許文献３）。更に、組換タンパク質のインビトロ解析は、ＡＮＧＰＴＬ３がリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性を直接阻害することを示したことから、ＬＰＬ活性の阻害を通して超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）トリグリセリドレベルを調節する、脂質代謝モジュレータであることを示唆する（非特許文献４）。ＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン、特にＮ末端領域残基１７−１６５は（ＣＤ末端ＦＤではなく）、マウスの血漿トリグリセリドレベルを増加させるその活性に必要なことを示している（非特許文献５）。

ヒトＡＮＧＰＴＬ３のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１６１及び１６２に示される。ＡＮＧＰＴＬ３に対する抗体は、例えば特許文献１及び２に開示される。

ＷＯ２００８／０７３３００ＵＳ７，９３５，７９６

Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482 Camenisch et al., 2002, J Biol Chem 277:17281-17290 Koishi et al., 2002, Nature Genetics 30:151-157 Shimizugawa et al., 2002, J Biol Chem 277(37):33742-33748 Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:41804-41809

第１の態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３、特にヒトＡＮＧＰＴＬ３（配列番号１６１）の少なくとも１つの活性を、特異的に結合及び中和し、阻害し、ブロックし、抑止し、減少させ又は干渉する、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体又はそのフラグメントにより、中和され、阻害され、ブロックされ、抑止され、減少され又は干渉され得るＡＮＧＰＴＬ３の活性は、限定されるものではないが、ＬＰＬ活性の阻害、血管新生の誘導などを含む。１つの実施態様では、本発明の抗体又はそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３の標的活性に直接関与するｈＡＮＧＰＴＬ３のエピトープに結合することによって、ｈＡＮＧＰＴＬ３の活性を中和し、阻害し、ブロックし、停止し、減少させ又は干渉することができる。別の実施態様では、本発明の抗体又はそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３の標的活性に直接関与しないｈＡＮＧＰＴＬ３のエピトープに結合することによって、ｈＡＮＧＰＴＬ３の活性を中和し、阻害し、ブロックし、停止し、減少させ又は干渉することができるが、しかしそこへ結合する抗体又はフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３の標的活性を立体的又は配座的に阻害し、ブロックし、停止し、減少させ又は干渉する。尚別の実施態様では、本発明の抗体又はそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３(即ち、非ブロッキング抗体)の標的活性（例えば、ＬＰＬ活性を阻害し、血管新生を誘導することなど）に直接関与しないｈＡＮＧＰＴＬ３のエピトープに結合するが、しかしそこへ結合する抗体又はフラグメントは、抗体又はそのフラグメントの不存在下でのｈＡＮＧＰＴＬ３のクリアランスと比べて、循環からのｈＡＮＧＰＴＬ３のクリアランスの強化をもたらし、それによりｈＡＮＧＰＴＬ３の活性を間接的に阻害し、ブロックし、停止し、減少させ又は干渉する。循環からのｈＡＮＧＰＴＬ３のクリアランスは、特にｈＡＮＧＰＴＬ３への特異的結合のために互いに競合しない２つ又はそれ以上の異なる非ブロッキング抗体を組み合わせることによって強化されることができる。

抗体（Ａｂ）は完全長（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であり得て、又は抗原結合部分のみ（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂又はｓｃＦｖフラグメント）であってよく、そして機能性に影響を与えるように、例えば残存エフェクタ機能を除去するように修飾され得る(Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933)。

１つの実施態様では、本発明は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６及び１８０、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含んでなる抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。別の実施態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、６６、８２、１１４、及び１８０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。尚別の実施態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６６のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。

１つの実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４及び１８８、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。別の実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号１０、２６、４２、７４、９０、１２２及び１８８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。尚別の実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号７４のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。

更なる実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４及び１８０／１８８から成る群から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、６６／７４、８２／９０、１１４／１２２及び１８０／１８８から成る群から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列ペアを含む。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号６６／７４のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列ペアを含む。

第２の態様では、本発明は、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２及び１８６、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列; 及び配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０及び１９４、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、を含んでなる抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／１１２、１２０／１２８、１３６／１４４、１５２／１６０又は１８６／１９４を含んでなるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、７２／８０、８８／９６、１２０／１２８又は１８６／１９４を含んでなるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む。尚別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号７２／８０を含んでなるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む。

更なる実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８及び１８２、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列；及び配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０及び１８４、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を更に含む；そして選択的に、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６及び１９０、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列；及び／又は配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８及び１９２、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％配列同一性を有する実質的にその類似配列から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列を更に含む。

あるいは、本発明は、配列番号４／６／８、２０／２２／２４、３６／３８／４０、５２／５４／５６、６８／７０／７２、８４／８６／８８、１００／１０２／１０４、１１６／１１８／１２０、１３２／１３４／１３６、１４８／１５０／１５２及び１８２／１８４／１８６から成る群から選択されるＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３組み合わせ;及び／又は配列番号１２／１４／１６、２８／３０／３２、４４／４６／４８、６０／６２／６４、７６／７８／８０、９２／９４／９６、１０８／１１０／１１２、１２４／１２６／１２８、１４０／１４２／１４４、１５６／１５８／１６０及び１９０／１９２／１９４から成る群から選択されるＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３組み合わせを含んでなる、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。１つの実施態様では、重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号４／６／８／１２／１４／１６、２０／２２／２４／２８／３０／３２、３６／３８／４０／４４／４６／４８、５２／５４／５６／６０／６２／６４、６８／７０／７２／７６／７８／８０、８４／８６／８８／９２／９４／９６、１００／１０２／１０４／１０８／１１０／１１２、１１６／１１８／１２０／１２４／１２６／１２８、１３２／１３４／１３６／１４０／１４２／１４４、１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０及び１８２／１８４／１８６／１９０／１９２／１９４から成る群から選択されるＣＤＲ組み合わせを含む。１つの実施態様では、重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号４／６／８／１２／１４／１６、２０／２２／２４／２８／３０／３２、３６／３８／４０／４４／４６／４８、６８／７０／７２／７６／７８／８０、８４／８６／８８／９２／９４／９６、１１６／１１８／１２０／１２４／１２６／１２８又は１８２／１８４／１８６／１９０／１９２／１９４のＣＤＲ組み合わせを含む。別の実施態様では、重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号６８／７０／７２／７６／７８／８０のＣＤＲ配列組み合わせを含む。

関連実施態様では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ３を特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで抗体又はそのフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４及び１８０／１８８から成る群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲペア内に含有される重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内でＣＤＲを同定する方法及び技術は当技術分野で公知であり、そして本明細書に開示される特定ＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内でＣＤＲを同定するのに適用されることができる。ＣＤＲの境界を同定するのに適用されることができる従来の定義は、Kabat定義、Chothia定義、及びAbM定義を含む。大まかに言えば、Kabat定義は配列可変性に基づいており、Chothia定義は構造ループ領域の位置に基づいており、そしてAbM定義はKabatとChothiaアプローチ間の折衷案である。例えば、Kabat、「免疫学的に重要なタンパク質の配列」、National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997);及びMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)を参照されたい。公開データベースはまた抗体内のＣＤＲ配列を同定するのに入手可能である。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、６６／７４、８２／９０、１１４／１２２又は１８０／１８８のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲペア内に含有されるＣＤＲ配列を含む。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号６６／７４のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲペア内に含有されるＣＤＲ配列を含む。

別の関連実施態様では、本発明は、配列番号２／１０、／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４又は１８０／１８８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペア中に含有される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含んでなる、抗体又は抗原結合フラグメントとｈＡＮＧＰＴＬ３への特異的結合を競合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施態様では、本発明の抗体又は抗原フラグメントは、配列番号６６／７４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペアを含んでなる抗体又はそのフラグメントとｈＡＮＧＰＴＬ３への特異的結合を競合する。別の実施態様では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、４／６／８／１２／１４／１６、２０／２２／２４／２８／３０／３２、３６／３８／４０／４４／４６／４８、５２／５４／５６／６０／６２／６４、６８／７０／７２／７６／７８／８０、８４／８６／８８／９２／９４／９６、１００／１０２／１０４／１０８／１１０／１１２、１１６／１１８／１２０／１２４／１２６／１２８、１３２／１３４／１３６／１４０／１４２／１４４、１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０及び１８２／１８４／１８６／１９０／１９２／１９４から成る群から選択される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列組み合わせを含んでなる、抗体又はそのフラグメントとｈＡＮＧＰＴＬ３への特異的結合を競合する。１つの実施態様では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６８／７０／７２／７６／７８／８０の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列組み合わせを含んでなる、抗体又はそのフラグメントとｈＡＮＧＰＴＬ３への特異的結合を競合する。

別の関連実施態様では、本発明は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４又は１８０／１８８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペアからの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含んでなる、抗体又はそのフラグメントによって認識されるｈＡＮＧＰＴＬ３上に同じエピトープを結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施態様では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号６６／７４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペアを含んでなる、抗体又はそのフラグメントによって認識されるようなｈＡＮＧＰＴＬ３上に同じエピトープを結合する。１つの実施態様では、本発明の抗体又はそのフラグメントは、４／６／８／１２／１４／１６、２０／２２／２４／２８／３０／３２、３６／３８／４０／４４／４６／４８、５２／５４／５６／６０／６２／６４、６８／７０／７２／７６／７８／８０、８４／８６／８８／９２／９４／９６、１００／１０２／１０４／１０８／１１０／１１２、１１６／１１８／１２０／１２４／１２６／１２８、１３２／１３４／１３６／１４０／１４２／１４４、１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０及び１８２／１８４／１８６／１９０／１９２／１９４から成る群から選択される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列組み合わせを含んでなる、抗体又はそのフラグメントによって認識されるｈＡＮＧＰＴＬ３上に同じエピトープを結合する。１つの実施態様では、そのようなエピトープは、配列番号６８／７０／７２／７６／７８／８０の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列組み合わせを含んでなる、抗体又はそのフラグメントによって認識される。

第３の態様では、本発明は、配列番号１６１の残基１７〜２０９におけるＮ末端コイルドコイル領域内に位置するエピトープに結合する、単離された抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントを特徴とし、そして少なくとも１つのｈＡＮＧＰＴＬ３の活性を中和し、阻害し、停止し、減少させ又は干渉する。別の実施態様では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号１６１）のＮ末端コイルドコイル領域内に位置するエピトープに特異的に結合する、単離された抗体又は抗体の抗原結合フラグメントをもたらし、そして少なくとも１つのｈＡＮＧＰＴＬ３の活性を中和し、阻害し、停止し、減少させ又は干渉し、但し抗体又はそのフラグメントは、配列番号１７０（配列番号１６１のｈＡＮＧＰＴＬ３の残基Ｇｌｕ３２〜Ｌｅｕ５７に対応する）のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。１つの実施態様では、本発明の抗体又はそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号１６１）の残基１７〜２００、１７〜１００、１７〜７０、１７〜６５、１７〜６０、１７〜５７、又は１７〜５０内のエピトープに特異的に結合し、但し選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号１７０のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号１６１）の残基４０〜２００、４０〜１００、４０〜７０、５０〜２００、５０〜１００、５０〜７０、５８〜２００、５８〜１００、５８〜７０、５８〜６８、又は６１〜６６内のエピトープに特異的に結合し、但し選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号１７０のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。幾つかの実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイル領域内の列挙エピトープ又は残基の１つより多くにかかわり得るエピトープを結合し、但し選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号１７０のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。

第４の態様では、本発明は、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメント、特に上記のいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を運ぶ組換体発現ベクター、及びそのようなベクターが導入されている宿主細胞、例えば、大腸菌のような細菌細胞、又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞もまた、抗体の生産を可能にする条件下で宿主細胞を培養することにより抗体を生産し、そして産生抗体の回収する方法のように、本発明によって包含される。

１つの実施態様では、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５及び１７９、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％その相同性を有する実質的に同一の配列から成る群から選択される核酸配列によってコード化されるＨＣＶＲを含んでなる、抗体又はそのフラグメントを提供する。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１、１７、３３、６５、８１、１１３又は１７９の核酸配列によってコード化されるＨＣＶＲを含む。尚別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号６５の核酸配列によってコード化されるＨＣＶＲを含む。

１つの実施態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３及び１８７、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％その相同性を有する実質的に同一の配列から成る群から選択される核酸配列によってコード化されるＬＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号９、２５、４１、７３、８９、１２１又は１８７の核酸配列によってコード化されるＬＣＶＲを含む。尚別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号７３の核酸配列によってコード化されるＬＣＶＲを含む。

更なる実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１／９、１７／２５、３３／４１、４９／５７、６５／７３、８１／８９、９７／１０５、１１３／１２１、１２９／１３７、１４５／１５３及び１７９／１８７から成る群から選択される核酸配列ペアによってコード化されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列ペアを含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１／９、１７／２５、３３／４１、６５／７３、８１／８９、１１３／１２１又は１７９／１８７の核酸配列ペアによってコード化されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペアを含む。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号６５／７３の核酸配列ペアによってコード化されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペアを含む。

１つの実施態様では、本発明は、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１及び１８５、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％その相同性を有する実質的に同一の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコード化されるＨＣＤＲ３ドメイン；及び配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９及び１９３、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％その相同性を有する実質的に同一の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコード化されるＬＣＤＲ３ドメインを含んでなる、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号７／１５、２３／３１、３９／４７、５５／６３、７１／７９、８７／９５、１０３／１１１、１１９／１２７、１３５／１４３、１５１／１５９及び１８５／１９３から成る群から選択される核酸配列ペアによってコード化されるＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列ペアを含む。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号７／１５、２３／３１、３９／４７、７１／７９、８７／９５、１１９／１２７又は１８５／１９３の核酸配列ペアによってコード化されるＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列ペアを含む。尚別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号７１／７９核酸配列ペアによってコード化されるＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列ペアを含む。

更なる実施態様では、抗体又はそのフラグメントは更に、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７及び１８１、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％その相同性を有する実質的に同一の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコード化されるＨＣＤＲ１ドメイン；及び配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９及び１８３、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％その相同性を有する実質的に同一の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコード化されるＨＣＤＲ２ドメインを含む；そして配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５及び１８９、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％その相同性を有する実質的に同一の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコード化されるＬＣＤＲ１ドメイン；及び／又は配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７及び１９１、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％その相同性を有する実質的に同一の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列によってコード化されるＬＣＤＲ２ドメインを選択的に更に含む。

あるいは、本発明は、配列番号３／５／７、１９／２１／２３、３５／３７／３９、５１／５３／５５、６７／６９／７１、８３／８５／８７、９９／１０１／１０３、１１５／１１７／１１９、１３１／１３３／１３５、１４７／１４９／１５１及び１８１／１８３／１８５から成る群から選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコード化される、ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３組み合わせ;及び／又は配列番号１１／１３／１５、２７／２９／３１、４３／４５／４７、５９／６１／６３、７５／７７／７９、９１／９３／９５、１０７／１０９／１１１、１２３／１２５／１２７、１３９／１４１／１４３、１５５／１５７／１５９及び１８９／１９１／１９３から成る群から選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコード化される、ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３組み合わせを含んでなる、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号６７／６９／７１／７５／７７／７９ヌクレオチド配列組み合わせによってコード化される重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。

第５の態様では、本発明は、Ｖ_H、Ｄ_H及びＪ_H生殖細胞系配列から由来するヌクレオチド配列セグメントによってコード化される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及びＶ_K及びＪ_K生殖細胞系配列から由来するヌクレオチド配列セグメントによってコード化される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなる、ヒト抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントを特徴とし、ここでＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは：（ｉ）Ｖ_H３−４３、Ｄ_H３−３、Ｊ_H３、Ｖ_K１−５及びＪ_K２；（ｉｉ）Ｖ_H３−１１、Ｄ_H１−１、Ｊ_H４、Ｖ_K１−３９及びＪ_K４；（ｉｉｉ）Ｖ_H３−３０、Ｄ_H１−７、Ｊ_H６、Ｖ_K１−５及びＪ_K１；（ｉｖ）Ｖ_H３−３０、Ｄ_H１−２６、Ｊ_H６、Ｖ_K１−１２及びＪ_K３；（ｖ）Ｖ_H３−３０、Ｄ_H３−１０、Ｊ_H６、Ｖ_K１−１２及びＪ_K３；及び（ｖｉ）Ｖ_H３−２３、Ｄ_H３−１０、Ｊ_H４、Ｖ_K１−５及びＪ_K１から成る群から選択される生殖細胞系遺伝子組み合わせから由来するヌクレオチド配列セグメントによってコード化される。

第６の態様では、本発明は、表面プラズモン共鳴アッセイ(例えば、BIACORE（商標）)
で測定された通り、約７ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は約１ｎＭ以下の平行解離定数（Ｋ_D）でｈＡＮＧＰＴＬ３に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを特徴とする。ある実施態様では、本発明の抗体は、約８００ｐＭ以下、約７００ｐＭ以下；約６００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下；約４００ｐＭ以下；約３００ｐＭ以下；約２００ｐＭ以下；約１００ｐＭ以下；又は約５０ｐＭ以下のＫ_Dを示す。

第７の態様では、本発明は、配列番号１６１のｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を結合する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントを提供するが、しかし、本明細書に記載のように、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴アッセイ、又はLUMINEX（登録商標）XMAP（登録商標）技術によって決定されるように、ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４；配列番号１６４）のような、関連タンパク質と交差反応しない。ＡＮＧＰＴＬ４は、ＬＰＬ活性を低下させることが知られている別の分泌タンパク質であり、そしてＮ末端コイルドコイル領域及びＣ末端フィブリノーゲン様ドメインを有する (Ge et al., 2004, J Biol Chem 279:2038-2045; Yau et al., 2009, J Biol Chem 284:11942-11952)。関連実施態様では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を結合し、そしてｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質と交差反応する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。ある実施態様では、ｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に対するｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメントの結合親和性は、ｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に対する抗体又はフラグメントの結合親和性の、約７５％以下、又は約５０％以下である。

別の関連実施態様では、本発明は、マウスＡＮＧＰＴＬ３（ｍＡＮＧＰＴＬ３；配列番号１６３）、又はラットＡＮＧＰＴＬ３（ｒＡＮＧＰＴＬ３；配列番号１７５）と交差反応しないで、カニクイザル(Macaca fascicularis) ＡＮＧＰＴＬ３（ＭｆＡＮＧＰＴＬ３）と、例えば配列番号１７７（ＭｆＡＮＧＰＴＬ３の部分アミノ酸配列）のＮ末端１７−１７０残基と交差反応する、抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。尚別の関連実施態様では、本発明は、ＭｆＡＮＧＰＴＬ３、ｍＡＮＧＰＴＬ３及びｒＡＮＧＴＰＬ３と交差反応する、抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明は、修飾グリコシル化タンパク質を有する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体を包含する。使用目的によっては、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、又は例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるためのフコース部分の除去(Shield et
al. (2002) JBC 277:26733参照)は有用であり得る。他の応用では、Ｎグリコシル化部位の除去は、治療抗体に対する望ましくない免疫反応を減少させ得るか、又は抗体の親和性を増加させ得る。尚他の応用では、ガラクトシル化修飾が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために行われることができる。

第８の態様では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ３及び薬学的に許容される担体を特異的に結合する、組換ヒト抗体又はそのフラグメントを含んでなる医薬組成物を特徴とする。１つの実施態様では、本発明は、互いと交差競合しない本発明の１つ又はそれ以上の抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメントを含んでなる医薬組成物、及び薬学的に許容される担体を提供する。１つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、ｈＡＮＧＰＴＬ３への特異的結合に対して互いと競合しない２つ又はそれ以上の非ブロッキング抗体を含有することができ、そして循環からｈＡＮＧＰＴＬ３をクリアするのに有効である。非ブロッキング抗体の好適な組み合わせは、限定されるものではないが：（ｉ）それぞれ、配列番号８２／９０及び１８０／１８８；（ｉｉ）それぞれ、配列番号１１４／１２２及び１８０／１８８；（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号８２／９０及び１８／２６；又は（ｉｖ）それぞれ、配列番号１１４／１２２及び１８／２６の、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含んでなる抗体の組み合わせを含む。

関連実施態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び第２の治療剤の組み合わせである組成物を特徴とする。第２の治療剤は、（１）セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチンなどのような、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤；（２）コレステロール取込及び／又は胆汁酸再吸収の阻害剤；（３）リポタンパク質異化を増強するナイアシン；（４）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを減少させ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及びＴＧレベルを改善し、そして非致死的心臓発作の数を減少させる、フィブラート系薬剤又は両親媒性カルボン酸；そして（５）２２−ヒドロキシコレステロールのようなコレステロール除去の役割を果たすＬＸＲ転写因子のアクチベータ、又はエゼチミベ＋シンバスタチンのような固定組み合わせ；胆汁樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）とスタチン、ナイアシン＋スタチンの固定組み合わせ（例えば、ロバスタチンとナイアシン）；又はオメガ−３−脂肪酸エチルエステル（例えば、オマコール（omacor）と）のような他の脂質低下薬との固定組み合わせなど、１つ又はそれ以上のいずれの薬剤であってよい。更に、第２の治療剤は、１つ又はそれ以上のＡＮＧＰＴＬ３の阻害剤、並びに脂質代謝、特にコレステロール及び／又はトリグリセリドホメオスタシスに関与する、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６及びプロタンパク質コンベルターゼスブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）などの他の分子の阻害剤であり得る。これらの分子の阻害剤は、これらの分子に特異的に結合しそしてそれらの活性をブロックする小分子及び抗体を含む。

関連実施態様では、第２の治療剤は、化学療法薬、抗血管新生薬、増殖阻害剤、細胞毒性薬、アポトーシス薬などの１つ又はそれ以上の抗癌剤、及び癌又は他の増殖性疾患又は障害を処置するのに当技術分野で周知の他の薬剤、並びに基礎となる癌／腫瘍に伴う症状を回復及び／又は軽減させるのに、鎮痛薬、Ｃｏｘ−２阻害剤のような非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）を含む抗炎症薬などであってよい。

第９の態様では、本発明の１つ又はそれ以上の抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントを用いて、ｈＡＮＧＰＴＬ３活性を中和し、阻害し、ブロックし、抑止し、減少させ又は干渉する方法を特徴とする。１つの実施態様では、本発明は、治療方法であって、それを必要とする対象（subject）に本発明の１つ又はそれ以上の抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメント、及び選択的に上記の１つ又はそれ以上の更なる治療剤を含んでなる、医薬組成物の医療的有効量を投与することを含んでなる、上記方法を提供する。本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメントは、ＡＮＧＰＴＬ３に対する中和抗体若しくは非ブロッキング抗体、又はその組み合わせであってよい。

関連実施態様では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ３に結合するのに互いと競合せず、そして好ましくはｈＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つの活性をブロックしない（即ち、非ブロッキング抗体）、本発明の少なくとも２つの抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメントを対象に投与することを含んでなる、それを必要とする対象の循環からｈＡＮＧＰＴＬ３のクリアランスを強化する方法を提供する。調べられたｈＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つの活性は、限定されるものではないが、ＬＰＬ活性を阻害すること、血管新生を誘導することなどを含む。１つの実施態様では、少なくとも２つの非ブロッキング抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメントの組み合わせは、抗体又はフラグメントを投与しないのに対して、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、又は約８０％だけ循環からのクリアランスを強化する。ｈＡＮＧＰＴＬ３の循環レベルは、当技術分野で周知のインビトロアッセイ及び明細書記載の方法で測定されることができる。別の実施態様では、少なくとも２つの非ブロッキング抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体の組み合わせは：（ｉ）それぞれ、配列番号８２／９０及び１８０／１８８；（ｉｉ）それぞれ、配列番号１１４／１２２及び１８０／１８８；（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号８２／９０及び１８／２６；又は（ｉｖ）それぞれ、配列番号１１４／１２２及び１８／２６の、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む。

本発明の方法により処置可能な疾患又は障害は、改善され、軽減され、阻害され又は予防されるいずれもの疾患又は病態であり、又はその発生率は、抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体処置のない場合（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３媒介疾患又は障害）と比べて、ＡＮＧＰＴＬ３活性を除去し、阻害し、低減し、又はさもなければ干渉することによって減少する。本発明の方法により処置可能な疾患又は障害の例は、限定されるものではないが、例えば、ＬＰＬ活性低下及び／又はＬＰＬ欠乏、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）活性低下及び／又はＬＤＬ受容体欠乏（例えば、ＬＤＬＲ^-/-を伴うホモ接合性家族性高コレステロール血症）、ＡｐｏＣ２変質、ＡｐｏＥ欠乏、ＡｐｏＢ増加、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生増加及び／又は除去減少、ある薬物処置（例えば、グルココルチコイド処置誘発脂質異常症、いずれかの遺伝性素因、食事、ライフスタイルなどに起因する、アテローム性脂質異常症、糖尿病性アテローム性脂質異常症、ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬの重度高トリグリセリド血症を含む高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合脂質異常症(肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病など)、リポジストロフィー、脂肪萎縮症を含む、高脂血症、高リポ蛋白質血症及び脂質異常症などの脂質代謝にかかわる疾患を含む。本発明の方法はまた、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、高血圧症、狭心症、卒中、脳血管疾患、欝血性心不全、冠状動脈疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患などの心血管疾患及び障害；急性膵炎；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；糖尿病のような血糖障害；肥満などを含み、高脂血症、高リポ蛋白質血症、及び／又は脂質異常症を伴う又はそれから生じる疾患又は障害を阻止又は処置することができる。

本発明の方法によって処置可能な疾患又は障害の他の例は、癌／腫瘍、並びに加齢黄斑変性症、網膜中心静脈閉塞症又は網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症などの眼血管由来疾患又は障害を含む、非腫瘍性血管新生関連疾患又は障害、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬などの炎症性疾患又は障害を含む。

他の実施態様は、下記の詳細説明の精査によって明らかになるものである。

ｈＡＮＧＰＴＬ３配列（即ち、配列番号１６１の残基３０〜７０又はＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＰ＿０５５３１０内）の関連部分に対する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体結合実験(実施例５)で使用されたペプチド１−３の配列アラインメントを示す。ペプチド１（対照：ＡＮＧＰＴＬ４ペプチド；配列番号１６８）；ペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ３ペプチド；配列番号：１６９）；及びペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３ペプチド；配列番号：１７０）。ｈＡＮＧＰＴＬ３（ペプチド２及び３）又はｈＡＮＧＰＴＬ４（ペプチド

イソタイプ対照；及び■：Ｈ４Ｈ１２７６Ｓ抗体）のＮ末端コイルドコイルペプチドに結合する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体の結果を示す。

本発明が詳細に記載される前に、当然のことながら、方法及び条件は変動し得ることから、本発明は記載される特定の方法、及び実験条件に限定されるものではない。また当然のことながら、本明細書に使用される用語は特定の実施態様を記載する目的のためだけであり、そして本発明の範囲は添付請求の範囲だけによって限定され得ることから、限定することを目的とするものではない。

他に規定されない限り、本明細書に使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が所属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等のいずれの方法及び材料は本発明の実施又は試験において使用されることができるが、好ましい方法と材料はこれから記載される。

定義
本明細書に使用される用語「ヒトアンギオポエチン様蛋白質３」又は「ｈＡＮＧＰＴＬ３」は、配列番号１６２に示される核酸配列及び配列番号１６１のアミノ酸配列、又は生物学的に活性なそのフラグメントを有するＡＮＧＰＴＬ３をいう。

本明細書に使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）から成る免疫グロブリン分子をいう。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び重鎖定常領域（Ｃ_H；ドメインＣ_H１、Ｃ_H２及びＣ_H３から成る）から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び軽鎖定常領域（Ｃ_L）から成る。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が組み入れられている、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分されることができる。各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、下記の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから成る。

１つ又はそれ以上のＣＤＲ残基の置換又は１つ又はそれ以上のＣＤＲの欠落も可能である。１つ又は２つのＣＤＲは結合のためになしで済ますことができる抗体が科学文献に記載されている。Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139)は、公開結晶構造に基づいて抗体とそれらの抗原間の接触領域を解析し、そしてＣＤＲ残基の約１／５〜１／３だけが実際に抗原と接触すると結論した。Padlanはまた、１つ又は２つのＣＤＲが抗原と接触したアミノ酸を有さない多くの抗体を見出した (Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428をも参照されたい)。

抗原と接触しないＣＤＲ残基は、分子モデルによって及び／又は経験的に、ChothiaＣＤＲの外側にあるKabatＣＤＲの領域から、既研究（例えば、ＣＤＲＨ２中のＨ６０−Ｈ６５はしばしば必要とされない）に基づいて同定されることができる。ＣＤＲ又はその１つ又は複数の残基が欠落している場合、それは通常別のヒト抗体配列又はそのような配列のコンセンサス中に対応する位置を占めるアミノ酸と置換される。置換しようとするＣＤＲ及びアミノ酸内に置換する位置はまた、経験的に選択されることができる。経験的置換は保存的又は非保存的置換であり得る。

本明細書に使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを目的としている。本発明のヒトｍＡｂは、例えばＣＤＲ及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（例えば、インビトロランダム又は部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボ体細胞突然変異によって導入される突然変異）によってコード化されないアミノ酸残基を含んでよい。しかしながら、本明細書に使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列から由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へグラフトされている、ｍＡｂを含むことを目的としていない。

本明細書に開示の完全ヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体は、対応する生殖細胞系配列と比べて、重鎖及び軽鎖の可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域に１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含んでよい。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから得られる生殖細胞系配列と比較することによって容易に確認されることができる。本発明は、本明細書に開示のいずれかのアミノ酸配列から由来する抗体、及びその抗原結合フラグメントを含み、ここで１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖細胞系配列の対応する１つ又は複数の残基に、又は別のヒト生殖細胞系配列の対応する１つ又は複数の残基に、又は対応する１つ又は複数の生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換に突然変異される（そのような配列変化は本明細書において総称して「生殖細胞系突然変異」といわれる）。本明細書に開示の配列重鎖及び軽鎖可変領域配列を始めとして、当業者は、１つ又はそれ以上の個々の生殖細胞系復帰突然変異又はその組み合わせを含む、多数の抗体及びその抗原結合フラグメントを容易に産生することができる。ある実施態様では、Ｖ_H及び／又はＶ_Lドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のすべては、抗体が由来する元の生殖細胞系配列に見出される残基に復帰突然変異される。他の実施態様では、ある残基だけ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内又はＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される変異残基だけ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３内に見出される変異残基だけが元の生殖細胞系配列に復帰突然変異される。他の実施態様では、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又は１つ又は複数のＣＤＲ残基は、異なる生殖細胞系配列(即ち、抗体が元々由来する生殖細胞系配列と異なる生殖細胞系配列)の対応する１つ又は複数の残基に突然変異される。更に、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の２つ又はそれ以上の生殖細胞系突然変異のいずれの組み合わせを含んでもよく、例えば、ここである個々の残基は、特定の生殖細胞系配列の対応する残基に突然変異され、一方で元の生殖細胞系配列と異なるある他の残基は維持され、又は異なる生殖細胞系配列の対応する残基に突然変異される。一度得られると、１つ又はそれ以上の生殖細胞系突然変異を含有する抗体及びその抗原結合フラグメントは、結合特異性改善、結合親和性増加、アンタゴニスト又はアゴニスト生物学的特性の改善又は強化(場合うによっては)、免疫原性低減などのような１つ又はそれ以上の望ましい性質を容易に検査されることができる。一般的このようにして得られる抗体及びその抗原結合フラグメント本発明の範囲に包含される。

本発明はまた、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示のいずれかのＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のバリアントを含んでなる抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示のいずれかのＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列に対して、例えば、１０以下、８以下、６以下、４以下、２又は１の１つ又は複数のアミノ酸置換のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体を含む。１つの実施態様では、ＨＣＶＲは、それに１０以下の保存的アミノ酸置換の配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ＨＣＶＲは、それに８以下の保存的アミノ酸置換の配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ＨＣＶＲは、それに６以下の保存的アミノ酸置換の配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ＨＣＶＲは、それに４以下の保存的アミノ酸置換の配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。尚別の実施態様では、ＨＣＶＲは、それに２又は１の１つ又は複数の保存的アミノ酸置換の配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。１つの実施態様では、ＬＣＶＲは、それに１０以下の保存的アミノ酸置換の配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ＬＣＶＲは、それに８以下の保存的アミノ酸置換の配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ＬＣＶＲは、それに６以下の保存的アミノ酸置換の配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ＬＣＶＲは、それに４以下の保存的アミノ酸置換の配列番号４４のアミノ酸配列を含む。尚別の実施態様では、ＨＣＶＲは、それに２又は１の１つ又は複数の保存的アミノ酸置換の配列番号４４のアミノ酸配列を含む。

他に具体的に示されない限り、本明細書に使用される用語「抗体」は、当然のことながら、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖（即ち、「完全抗体分子」）、並びにその抗原結合フラグメントを含んでなる抗体分子を包含する。本明細書に使用される用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、複合体を形成するために抗原を特異的に結合する、いずれの自然発生、酵素的に得られる、合成、又は遺伝子工学によるポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質分解のようないずれの好適な標準的技術、又は抗体の可変及び(選択的に)定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現にかかわる組換遺伝子工学技術を用いて、例えば、完全抗体分子から導かれ得る。そのようなＤＮＡは公知であり、及び／又は例えば、商業ソース、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを含む）から容易に得られ、又は合成されることができる。ＤＮＡは、例えば、１つ又はそれ以上の可変及び／又は定常ドメインを好適な立体配置に配列するために、又はコドンを導入し、システイン残基を創出し、アミノ酸を修飾し、付加し又は欠失させるなどのために、化学的に及び分子生物学的技術を用いることによって配列決定されそして操作され得る。

抗原結合フラグメントの非限定的例は：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、又は束縛ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを倣するアミノ酸残基から成る最小認識単位を含む。ドメイン特異抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、二量体、三量体、四量体、ミニ体、ナノ体（例えば一価ナノ体、二価ナノ体など）、小分子免疫医薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の改変分子もまた、本明細書に使用される表現「抗原結合フラグメント」内に包含される。

抗体の抗原結合フラグメントは、通常少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。可変ドメインはいずれものサイズ又はアミノ酸組成から成り得て、そして一般的に１つ又はそれ以上のフレームワークに隣接し又はそれで構成される少なくとも１つのＣＤＲを含み得る。Ｖ_LドメインとかかわるＶ_Hドメインを有する抗原結合フラグメントでは、Ｖ_H及びＶ_Lドメインはいずれの好適な配列においても互いに対して位置されてよい。例えば、可変領域は二量体であり得て、そしてＶ_H−Ｖ_H、Ｖ_H−Ｖ_L又はＶ_L−Ｖ_L二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは単量体のＶ_H又はＶ_Lドメインを含有してよい。

ある実施態様では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含有してよい。限定されない、本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出され得る可変及び定常ドメインの例示的立体配置は：（ｉ）Ｖ_H−Ｃ_H１；（ｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_H２；（ｉｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_H３；（ｉｖ）Ｖ_H−Ｃ_H１−Ｃ_H２；（ｖ）Ｖ_H−Ｃ_H１−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｖｉ）Ｖ_H−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｖｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_L；（ｖｉｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１；（ｉｘ）Ｖ_L−Ｃ_H２；（ｘ）Ｖ_L−Ｃ_H３；（ｘｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１−Ｃ_H２；（ｘｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H２−Ｃ_H３；及び（ｘｉｖ）Ｖ_L−Ｃ_Lを含む。上記に掲載されたいずれもの例示的立体配置を含む、可変及び定常ドメインのいずれもの立体配置では、可変及び定常ドメインは、互いに直接結合され得るか又は完全若しくは部分ヒンジ又はリンカー領域によって結合され得る。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中で隣接した可変及び／又は定常ドメイン間のフレキシブル又はセミフレキシブル結合をもたらす、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）のアミノ酸から成り得る。その上、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いと及び／又は１つ又はそれ以上の単量体Ｖ_H又はＶ_Lドメインとの非共有結合（例えば、１つ又は複数のジスルフィド結合による）において、上記に掲載されたいずれもの可変及び定常ドメイン立体配置のホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含んでよい。

完全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であってよい。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、通常少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み得て、ここで各可変ドメインは別の抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示の例示的二重特異性抗体フォーマットを含み、いずれの多重特異性抗体フォーマットも、当技術分野で得られるルーチン技術を用いて本発明の抗体の抗原結合フラグメントとの関連で使用するのに適合され得る。

ある実施態様では、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制薬又は放射性同位体などの治療剤部分（「免疫複合体」）に結合され得る。

用語「特異的に結合する」などは、抗体又はその抗原結合フラグメントが生理的条件下に比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、約１ｘ１０^-6Ｍ未満（即ち、より小さいＫ_Dはより堅固な結合を示す）の平衡解離定数（Ｋ_D）によって特徴付けられることができる。２つの分子が特異的に結合するかを決定する方法は当技術分野で周知であり、そして例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。しかしながら、ｈＡＮＧＰＴＬ３を特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのＡＮＧＰＴＬ３分子、例えば、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３、マウスＡＮＧＰＴＬ３、ラットＡＮＧＰＴＬ３、及び／又は配列番号１６４のアミノ酸配列を有するｈＡＮＧＰＴＬ３などの他の抗原に対して交差反応を示す。その上、ｈＡＮＧＰＴＬ３及び１つ又はそれ以上の更なる抗原に結合する多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)は、それでも尚本明細書に使用されるｈＡＮＧＰＴＬ３を「特異的に結合する」抗体と考えられる。

用語「高親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE(商標)又は溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定された、約２ｘ１０^-9Ｍ以下、約１．５ｘ１０^-9Ｍ以下、約１ｘ１０^-9Ｍ以下、約０．５ｘ１０^-9Ｍ以下、約０．２５ｘ１０^-9Ｍ以下、約１ｘ１０^-10Ｍ以下、又は約０．５ｘ１０^-10Ｍ以下のＫ_Dで表されるｈＡＮＧＰＴＬ３への結合親和性を有するそれらの抗体をいう。

本明細書に使用される用語「Ｋ_D」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数をいうことが目的とされる。

用語「低速オフレート」では、「Ｋｏｆｆ」又は「ｋ_d」は、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE(商標)によって測定された、４ｘ１０^-3ｓ^-1以下、３ｘ１０^-3ｓ^-1以下、２ｘ１０^-3ｓ^-1以下、１ｘ１０^-3ｓ^-1以下、１ｘ１０^-4ｓ^-1以下の速度定数でｈＡＮＧＰＴＬ３から解離する抗体を意味する。

用語「固有親和定数」又は「ｋ_a」では、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE(商標)によって測定された、約１ｘ１０^-3Ｍ^-1ｓ^-1以上の速度定数でｈＡＮＧＰＴＬ３と結合する抗体を意味する。

本明細書に使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性（例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ３を特異的に結合する単離された抗体はｈＡＮＧＰＴＬ３以外の抗原を特異的に結合するｍＡｂが実質的に無い）を有する他のｍＡｂが実質的に無い抗体をいうことが目的とされる。しかしながら、ｈＡＮＧＰＴＬ３を特異的に結合する単離された抗体は、カニクイザル、マウス、ラットなどの他の種からのＡＮＧＰＴＬ３分子のような他の抗原、及び／又はヒトＡＮＧＰＴＬ４のような他の関連タンパク質に対して交差反応性を有し得る。

本明細書に使用される用語「中和」、「ブロッキング」又は「停止」抗体（又はＡＮＧＰＴＬ３活性を「中和し」、「ブロックし」又は「停止する」抗体）は、ＡＮＧＰＴＬ３へのその結合が当技術分野で公知の標準インビトロアッセイによって評価されるように、ＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つの生物活性の直接阻害をもたらす、抗体をいうことが目的とされる（例えば、下記の実施例を参照されたい）。用語「中和する」、「阻害する」、「ブロックする」及び「停止する」は本明細書において同義的に使用され得る。「非ブロッキング」抗体は、ＡＮＧＰＴＬ３へのその結合が標準インビトロアッセイによって評価されるように、ＡＮＧＰＴＬ３の標的活性を直接ブロックしない抗体をいうが、しかし尚、ＡＮＧＰＴＬ３へのその結合が、例えば、循環からのＡＮＧＰＴＬ３のクリアランスを強化することにより、インビボでＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つの生物活性の間接阻害、減少、減弱、又は他の干渉をもたらす「干渉」抗体であってよい。循環からのＡＮＧＰＴＬ３のクリアランスは、少なくとも２つの非ブロッキング抗体の組み合わせによって特に増強されることができる。ＡＮＧＰＴＬ３の生物活性の、中和、阻害、停止、減少、減弱又は干渉は、当技術分野で公知の１つ又はそれ以上の幾つかの標準インビトロ又はインビボアッセイにより、ＡＮＧＰＴＬ３の生物活性の１つ又はそれ以上のインジケータを測定することによって評価されることができる（例えば、下記の実施例を参照されたい）。

本明細書に使用される用語「表面プラズモン共鳴」は、例えばBIACORE(商標)システム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)を用いて、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度変化の検出により、リアルタイム生物特異的相互作用の解析を可能にする光学的現象をいう。

用語「エピトープ」は、抗体によって結合される抗原の領域である。エピトープは構造的又は機能的で定義され得る。機能的エピトープは一般的に構造的エピトープのサブセットであり、そして相互作用の親和性に直接寄与するそれらの残基を有する。エピトープは立体配座的であり、即ち非線状アミノ酸から構成される。ある実施態様では、エピトープは、アミノ酸，糖側鎖、リン酸基、又はスルホニル基などの分子の化学的活性表面グルーピングである決定基を含み得て、そしてある実施態様では、特異的三次元構造特性、及び／又は特異的電荷特性を有してよい。

核酸又はそのフラグメントをいうとき、用語「実質的同一性」又は「実質的に同一の」は、別の核酸（又はその相補鎖）により適切なヌクレオチド挿入又は欠失と最適に配列されるとき、下記に検討されるようにＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧＡＰなど、配列同一性のいずれの周知のアルゴリズムによって測定され、核酸塩基の少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。

ポリペプチドに適用されるように、用語「実質的類似性」又は「実質的に類似の」は、デフォルトギャップウェイトを用いてプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによるように最適に配列されるとき、2つのペプチド配列が少なくとも９０％配列同一性、尚更に好ましくは少なくとも９５％、９８％又は９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化し得ない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なるという場合には、類似性の百分率又は程度は置換の保存的性質を是正するように上方に調整され得る。この調整をする手段は当業者に周知されている。例えば、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照されたい。類似の化学的性質の側鎖を有するアミノ酸グループの例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；及び７）含硫側鎖：システイン及びメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイソン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びグルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45に開示のＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正値を有するいずれもの変化である。「中程度に保存的」置換はＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて非負値を有するいずれもの変化である。

ポリペプチドの配列類似性は通常配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の修飾に帰属される類似性の尺度を用いて類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、種々の生物種からの相同ポリペプチドのような密接に関連したポリペプチド間、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質間の配列相同性又は配列同一性を決定するのに、デフォルトパラメータによって使用されることができるＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、デフォルト又は推奨パラメータによってＦＡＳＴＡ；ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムを使用して比較されることができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、質問及び検索配列間の最高重複の領域のアラインメント及び百分率配列同一性を提供する (Pearson (2000) supra)。本発明の配列を異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースと比較するとき、別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用した計算機プログラムのＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 and (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402を参照されたい。

語句「治療的有効量」では、それが投与されて望ましい効果をもたらす量を意味する。その正確な量は、処置の目的、処置される対象の年齢及びサイズ、投与経路などによって決まり得て、そして公知の技術を用いて当業者によって確かめられ得るものである（例えば、Lloyd (1999) 医薬品配合の技法、科学及び技術を参照されたい）。

ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成する方法は当技術分野で公知である。いずれのそのような公知方法は、ＡＮＧＰＴＬ３に特異的に結合するヒト抗体を作るために本発明の関連で使用されることができる。

モノクローナル抗体を生成するVELOCIMMUNE(商標)技術又はその他の公知の方法を用いて、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するＡＮＧＰＴＬ３に対する高親和性キメラ抗体が最初に分離される。下記の実験の項におけるように、抗体は特徴付けられ、そして親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特性で選択される。

一般に、本発明の抗体は、固相に固定化されるか又は液相で抗原に結合することにより測定されるとき、通常約１０^-12Ｍ〜約１０^-9ＭのＫ_Dを持つ高親和性を有する。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体を生成するために、望ましいヒト定常領域、例えば、野生型ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４、又は修飾ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４と置換される。選択された定常領域が特殊用途に従って変わり得る一方で、抗体の高親和性抗原結合及び標的特異性特性は可変領域に存在する。

エピトープマッピング及び関連技術
特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)に記載のように、ルーチン交差ブロッキングアッセイは行われることができる。他の方法は、アラニン走査突然変異体、ペプチドブロット（Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63）、又はペプチド切断解析を含む。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出及び化学修飾などの方法が用いられ得る(Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496)。

用語「エピトープ」はＢ及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位をいう。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並べられる隣接アミノ酸又は非隣接アミノ酸の両方から形成されることができる。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは通常変性溶媒に露出時に保持され、一方で三次折り畳みによって形成されるエピトープは通常変性溶媒による処理時に失われる。エピトープは通常、特有の空間立体配座において少なくとも３、及びより通常は、少なくとも５又は８−１０アミノ酸を含む。

抗原構造ベース抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）とも知られている、修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）は、各抗体の化学的又は酵素的修飾抗原表面との結合プロファイルの類似性に従った、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープと明瞭に区別されるか又は部分的に重複する特有のエピトープを反映し得る。この技術は、特徴付けが遺伝的に異なるｍＡｂに集中されることができるように、遺伝的に同一のｍＡｂの迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用されるとき、ＭＡＰは望ましい特性を有するｍＡｂを産生する希少ハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰは、本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体ｍＡｂを、異なるエピトープを結合するｍＡｂの群に選別するのに使用し得る。

ＡＮＧＰＴＬ３はアミノ末端コイルドコイルドメイン及びカルボキシル末端フィブリノーゲン様ドメイン（ＦＤ）を含有し、そしてＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は分子間ジスルフィド結合の不存在下にオリゴマーを形成する(Ge et al., 2005, J Lipid Res 46:1484-1490)。Ｎ末端コイルドコイルドメインはＬＰＬ活性の阻害に重要なことが報告されている(Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:41804-41809)。このように、ある実施態様では、抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又は抗体の抗原結合フラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３(配列番号１６１)のＮ末端コイルドコイルドメイン(残基１７〜２０９)内でエピトープを結合し、そしてｈＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つの活性を中和する（例えば、ＬＰＬ活性の阻害）。別の実施態様では、抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン内でエピトープを結合し、そしてｈＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つの活性を中和し、但し、抗体又はそのフラグメントは配列番号１７０のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３(配列番号１６１)の残基１７〜２００、１７〜１００、１７〜７０、１７〜６５、１７〜６０、１７〜５７、１７〜５５、１７〜５０、１７〜４５、１７〜４０、又は１７〜３５内でエピトープに結合し、但し、選択的にその抗体又はそのフラグメントは配列番号１７０のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。別の実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３(配列番号１６１)の残基４０〜２００、４０〜１００、４０〜７０、５０〜２００、５０〜１００、５０〜７０、５８〜２００、５８〜１００、５８〜７０、５８〜６８、又は６１〜６６（「ヘパリン結合モチーフ」として公知）内でエピトープを特異的に結合し、但し、選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号１７０のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。幾つかの実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン内で列挙エピトープ又は残基の１つより多くを含み得るエピトープを結合し、但し、選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号１７０のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。

他の実施態様では、ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体及びそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ３の１つ又はそれ以上のフラグメント、例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ３(配列番号１６１)の少なくとも５残基、少なくとも７残基、少なくとも１０残基、少なくとも２０残基、少なくとも３０残基、少なくとも５０残基、少なくとも７０残基、少なくとも１００残基、少なくとも１５０残基、又は少なくとも２００残基のフラグメントを結合し、但し、選択的に抗体又はそのフラグメントは配列番号１７０のＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合しない。

本発明は、本明細書に記載のいずれかの特異的例示的抗体と同じエピトープに結合するｈＡＮＧＰＴＬ３抗体を含む、同様に、本発明はまた、本明細書に記載のいずれかの特異的例示的抗体とｈＡＮＧＰＴＬ３又はｈＡＮＧＰＴＬ３フラグメントへの結合を競合する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体を含む。

抗体が当技術分野において公知のルーチン方法を用いることによって参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれとの結合を競合するかは、容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体と同じエピトープに結合に結合するかを決定するために、参照抗体は、飽和条件下にｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質又はペプチドに結合することが可能にされる。次に、ｈＡＮＧＰＴＬ３分子への試験抗体の結合能力が評価される。試験抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体との飽和結合後にｈＡＮＧＰＴＬ３に結合することができる場合、試験抗体は参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体と異なるエピトープに結合すると結論されることができる。他方で、試験抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体との飽和結合後にｈＡＮＧＰＴＬ３分子に結合することができない場合、そのとき試験抗体は、本発明の参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合し得る。

抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体との結合を競合するかを決定するために、上記結合方法は２つの配向で行われる：第１の配向では、参照抗体は飽和条件下にｈＡＮＧＰＴＬ３分子に結合することが可能にされ、続いてｈＡＮＧＰＴＬ３分子への試験抗体の結合の評価がなされる。第２の配向では、試験抗体は飽和条件下にｈＡＮＧＰＴＬ３分子に結合することが可能にされ、続いてＡＮＧＰＴＬ３分子への参照抗体の結合の評価がなされる。両方の配向において、第１の(飽和)抗体だけがＡＮＧＰＴＬ３分子へ結合することができる場合、そのとき試験抗体及び参照抗体はｈＡＮＧＰＴＬ３への結合を競合すると結論される。当業者には当然のことながら、参照抗体との結合を競合する抗体は、参照抗体と同一のエピトープに必ずしも結合し得るとは限らず、重複又は隣接エピトープを結合することにより参照抗体の結合を立体的にブロックし得る。

２つの抗体は、各々が抗原への他の結合を競合的に阻害（ブロック）する場合、同じ又は重複するエピトープに結合する。即ち、１、５、１０、２０、又は１００倍過剰の１つの抗体は、競合結合アッセイで測定して少なくとも５０％しかし好ましくは７５％、９０％又は更に尚９９％だけ他の結合を阻害する(例えば、Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502を参照されたい)。

次いで、更なるルーチン実験（例えば、ペプチドの突然変異及び結合解析）は、試験抗体の結合の実測欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に因るのか、又は立体ブロッキング（又は他の現象）が実測結合の欠如に関与するかを確認するために行われることができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用可能な他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて行われることができる。

免疫複合体
本発明は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制薬又は放射性同位体など、治療部分（「免疫複合体」）に結合されるヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ３モノクローナル抗体を包含する。細胞毒剤は細胞に有害ないずれの薬剤をも含む。免疫複合体を形成するための好適な細胞毒剤及び化学療法薬の例は当技術分野で公知であり、例えばＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。

二重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であってよい。多重特異性ｍＡｂは１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得て、又は１つの標的ポリペプチドより多くに対して特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Tutt
et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69を参照されたい。ヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ３ｍＡｂは別の機能性分子、例えは、別のペプチド又はタンパク質に結合され又はそれと共発現されることができる。例えば、抗体又はそのフラグメントは、第２の結合特異性をもつ二重特異性又は多重特異性抗体を生産するために、別の抗体又は抗体フラグメントのような１つ又はそれ以上の他の分子実体に、機能的に結合されることができる（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合などにより）。

本発明の関連で使用されることができる例示的二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｃ_H３ドメイン及び第２のＩｇＣ_H３ドメインの使用を含み、ここで第１及び第２のＩｇＣ_H３ドメインは少なくとも１つのアミノ酸だけ互いに異なり、そして少なくとも１つのアミノ酸差は、アミノ酸差を欠いている二重特異性抗体と比べてプロテインＡへの二重特異性抗体の結合を減少させる。１つの実施態様では、第１のＩｇＣ_H３ドメインはプロテインＡを結合し、そして第２のＩｇＣ_H３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソン付番による；ＥＵ付番によるＨ４３５Ｒ）のようなプロテインＡ結合を減少させ又は停止する突然変異を含有する。第２のＣ_H３は更に、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を含んでよい。第２のＣ_H３内に見出され得る更なる修飾は：ＩｇＧ１抗体の場合にＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合にＮ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；及びＩｇＧ４抗体の場合にＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）を含む。上記の二重特異性抗体フォーマットでの変動は本発明の範囲内とみなされる。

生物学的同等物
本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体及び抗体フラグメントは、記載のｍＡｂのものと異なり、しかしヒトＡＮＧＰＴＬ３を結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異ｍＡｂ及び抗体フラグメントは、元の配列と比べるとき、１つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含み、しかし本質的に記載ｍＡｂと同等の生物活性を示す。同様に、本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体コード化ＤＮＡ配列は、開示配列と比べるとき１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を含み、しかし本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又は抗体フラグメントに本質的に生物学的に同等である抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又は抗体フラグメントをコードする、配列を包含する。そのような変異アミノ酸及びＤＮＡ配列が上記で検討される。

２つの抗原結合タンパク質、又は抗体は、例えば、類似の実験条件下に同じモル用量で、単回用量か又は複数回用量投与されるとき、それらは、吸収速度及び程度が顕著な差を示さない薬学的同等物又は薬学的代替物である。幾つかの抗体は、それらが、それらの吸収程度は同等であるが、それらの吸収速度はそうではない場合、同等物又は薬学的代替物であると考えられ得て、そして尚吸収速度のそのような差は意図的でそしてラベリングに反映され、例えば、長期使用時に有効な体内薬物濃度の達成に必須ではなく、そして特定の試験医薬品にとって医学的に重要ではないことから、生物学的同等性であると考えられ得る。１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び有効性において臨床的に有意味な差がない場合、生物学的同等性である。

１つの実施態様では、患者がそのような入れ替えのない継続治療と比べて、免疫原性の臨床的に有意な変化、又は有効性低下を含む副作用のリスクの期待された増加なしに、参照製品と生物学的製剤間で１回又はそれ以上の回数入れ替えられることができる場合、２つの抗原結合タンパク質は生物学的に同等性である。

１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、それらがいずれも、そのような機構が公知の程度に、病態に対して共通機構若しくは作用機構又は使用条件によって作用する場合、生物学的に同等性である。

生物学的同等性はインビトロ及びインビボの方法で実証され得る。生物学的同等性手段は、例えば、(ａ) 抗体又はその代謝物の濃度が血液、血漿、血清、又は他の体液中で時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物でのインビボテスト; (ｂ)ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関されそして合理的に予測されるインビトロテスト；（ｃ）抗体の適切な急性薬理効果(又はその標的)が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物でのインビボテスト; 及び(ｄ)抗体の安全性、有効性、又はバイオアベイラビリティ若しくは生物学的同等性を確立する十分管理された臨床試験を含む。

本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体の生物学的同等性バリアントは、例えば、生物活性に不要な、残基又は配列又は欠失末端若しくは内部残基又は配列の種々の置換を行うことにより、構成され得る。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基は、再生時に不要な又は誤った分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、他のアミノ酸を欠失し置換されることができる。

治療的投与及び製剤
本発明は、本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はその抗原結合フラグメントを含んでなる治療的組成物、及びそれを用いる治療的方法を提供する。本発明に基づく治療的組成物の投与は、移動、送達、耐容性の改善などをもたらすために、製剤へ組み込まれる好適な担体、賦形剤、及び他の薬剤と併せて投与され得る。多数の適切な製剤は、すべての薬学化学者に公知の処方集に見出されることができる：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA。これらの製剤は、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ジェリー剤、ワックス、オイル、脂質類、ベシクル(LIPOFECTIN(商標)など)を含有する脂質（陽イオン性又は陰イオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト剤、水中油及び油中水乳剤、乳剤カルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、及びカルボワックスを含有する半固形混合物を含む。また Powell et al. 「非経口製剤用の賦形剤の概論」 PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311を参照されたい。

用量は、投与される予定の対象の年齢及びサイズ、標的疾患、処置の目的、病態、投与経路などによって変動し得る。本発明の抗体が、成人患者において、高コレステロール血症を含むＢＡＮＧＰＴＬ３に直接又は間接に関連する種々の病態及び疾患、ＬＤＬ及びアポタンパク質Ｂに関連する障害、及び脂質代謝障害などを処置するのに使用されるとき、本発明の抗体を約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で静脈内又は皮下投与することは有利である。病態の重度に依存して、処置の頻度及び期間は調整されることができる。ある実施態様では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１〜約５００ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、又は約１０〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、又は５０ｍｇまでの初回用量として投与されることができる。ある実施態様では、初回用量は、初回用量とほぼ同じか又はそれより少なくてよい量で、抗体又はその抗原結合フラグメントの第２の又は複数の以後の用量投与が続けられ得て、ここでその後の用量は、少なくとも１日〜３日；少なくとも１週、少なくとも２週；少なくとも３週；少なくとも４週；少なくとも５週；少なくとも６週；少なくとも７週；少なくとも８週；少なくとも９週；少なくとも１０週；少なくとも１２週；又は少なくとも１４週で分けられる。

種々の送達システムは公知であり、そして本発明の医薬品組成物、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルス、受容体介在エンドサイトーシスを発現することができる組換細胞でのカプセル化を投与するのに使用されることができる(例えば、Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照)。導入方法は、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含む。組成物はいずれかの従来の経路により、例えば、点滴及びボーラス注射により、上皮又は粘膜皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収により投与され得て、そして他の生理活性物質と併せて投与され得る。投与は全身的又は局所的であり得る。

医薬組成物はまた、ベシクル、特にリポソームで送達されることができる (Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989)感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327参照; generally ibid.参照)。

ある状況では、医薬組成物は制御放出システムで送達されることができる。１つの実施態様では、ポンプが使用され得る（Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201参照）。別の実施態様では、高分子材料が使用されることができる；制御放出の医学応用, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)参照。尚別の実施態様では、制御放出システムは組成物の標的の近傍に入れられることができ、その結果全身用量のわずかだけを必要とする(例えば、Goodson, 制御放出の医学用途, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照されたい) 。

注射製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴などのための剤形を含んでよい。これらの注射剤は公に知られた方法によって調製され得る。例えば、注射剤は、例えば、上記の抗体又はその塩を通常注射剤に使用される水性媒体又は油性媒体に溶解、懸濁又は乳化することによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースを含有する等張液、及びアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る他の補助剤などがある。油性媒体としては、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような可溶化剤と組み合わせて使用され得るゴマ油、ダイズ油などが用いられる。このように調製された注射剤は好ましくは適切なアンプルに充填される。本発明の医薬組成物は、標準針及びシリンジで皮下又は静脈内に送達されることができる。加えて、皮下送達に関しては、ペン送達デバイスは本発明の医薬組成物を送達するのに容易に用途を有する。そのようなペン送達デバイスは再使用可能又は使い捨てであり得る。再使用可能ペン送達デバイスは一般に、医薬組成物を含有する交換可能カートリッジを利用する。一度カートリッジ内のすべての医薬組成物が投与されそしてカートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄されることができて、そして医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換される。ペン送達デバイスはこのように再使用されることができる。使い捨てペン送達デバイスでは、交換可能カートリッジはない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスはデバイス内のリザーバ中に保存された医薬組成物をプレフィルドされるようになる。一度リザーバで医薬組成物が空の状態になると、デバイス全体は廃棄される。

多数の再使用可能及び自己注射器送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用を有する。例として、勿論限定されるものではないが、AUTOPEN（商標）(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC(商標)ペン(Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25(商標)ペン、HUMALOG(商標)ペン、HUMALIN 70/30(商標)ペン(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN)、NOVOPEN(商標)I, II及びIII (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、NOVOPEN JUNIOR(商標)(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD(商標)ペン(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、OPTIPEN(商標)、OPTIPEN PRO(商標)、OPTIPEN STARLET(商標)、及びOPTICLIK（商標）(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)を含む。本発明の医薬組成物の皮下送達に適用を有する使い捨てペン送達デバイス例は、勿論限定されるものではないが、SOLOSTAR(商標)ペン (sanofi-aventis)、FLEXPEN(商標) (Novo Nordisk)、及び KWIKPEN(商標) (Eli Lilly)を含む。

有利なこととして、上記に記載の経口又は非経口使用のための医薬組成物は、有効成分の用量を適合させるのに適している単位用量での剤形に調製される。単位用量でのそのような剤形は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などを含む。前記の含有抗体の量は一般に、単位用量での剤形当り約０．１〜約８００ｍｇ；特に注射剤の形態では、前記の抗体は、他の剤形に対して約１〜約５００ｍｇで、約５〜３００ｍｇで、約８〜２００ｍｇ、そして１０〜約１００ｍｇで含有される。

併用療法
本発明は更に、本発明のｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメントを１つ又はそれ以上の更なる治療剤と組み合わせて投与することにより、ｈＡＮＧＰＴＬ３と直接又は間接に関連する疾患又は障害を処置する治療方法を提供する。更なる治療剤は、セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤; ナイアシン;フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジルなどの種々のフィブラート系薬; ＬＸＲ転写因子アクチベータなどを含み、１つ又はそれ以上の本発明の抗体又はそのフラグメントと有利に組み合わせられる１つ又はそれ以上のいずれの活性物質であってよい。更に、本発明のｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメントは、他のｈＡＮＧＰＴＬ３阻害剤と、並びに脂質代謝、特にコレステロール及び／又はトリグリセリドホメオスタシスに関与する、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６及びプロタンパク質コンベルターゼスブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）などの、他の分子の阻害剤と同時投与されることができる。これらの分子の阻害剤は、これらの分子に特異的に結合しそしてそれらの活性をブロックする小分子及び抗体を含む（例えば、Ｕ．Ｓ．２０１０／０１６６７６８Ａ１に開示の抗ＰＣＳＫ９抗体を参照されたい）。

更に、更なる治療剤は、化学療法薬、抗血管新生薬、増殖阻害剤、細胞毒性薬、アポトーシス薬などの１つ又はそれ以上の抗癌剤、及び癌又は他の増殖性疾患又は障害を処置するのに当技術分野で周知の他の薬剤であってよい。抗癌剤の例は、限定されるものではないが、ドセタキセル、パクリタキセルなどのような抗有糸分裂剤；シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、オキサリプラチンなどのような白金系化学療法化合物；又は５−フルオロウラシル、カペシタビン、イリノテカン、ロイコボリン、ゲムシタビンなどの他の従来の細胞毒性剤、及び抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ベバシズマブ(AVASTIN（登録商標）, Genentech)のような血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト及びＶＥＧＦの受容体ベースブロッカー、例えば、ＵＳ特許７，０７０，９５９に記載の「ＶＥＧＦトラップ」、Ｕ．Ｓ．特許出願公開２００８／０１８１８９９に記載の抗Ｄｌｌ４抗体のようなデルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）アンタゴニスト、及びＤｌｌ４の細胞外ドメイン、例えば、Ｕ．Ｓ．特許出願公開２００８／０１０７６４８に記載のＤｌｌ４−Ｆｃを含有する融合タンパク質を含む抗血管新生剤；ソラフェニブ(NEXAVAR(登録商標)by Bayer Pharmaceuticals Corp.)、スニチニブ(SUTENT(登録商標) by Pfizer)、パゾパニブ(VOTRIENT(商標) by GlaxoSmithKline)、トセラニブ(PALLADIA(商標) by Pfizer)、バンデタニブ(ZACTIMA(商標)by AstraZeneca)、セジラニブ(RECENTIN(登録商標)by AstraZeneca)、レゴラフェニブ(BAY 73-4506 by Bayer)、アキシチニブ(AG013736 by Pfizer) 、レスタウルチニブ(CEP-701 by Cephalon)、エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)by Genentech)、ゲフィチニブ(IRESSA(商標) by AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK(商標) by Boehringer Ingelheim)、ラパチニブ(TYKERB(登録商標)by GlaxoSmithKline)、ネラチニブ (HKI-272 by Wyeth/Pfizerなどを含む受容体チロシンキナーゼ及び／又は血管新生阻害剤、及び薬学的に許容される塩、酸又は上記のいずれかの誘導体を含む。加えて、鎮痛薬、Ｃｏｘ−２阻害剤のような非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）を含む抗炎症薬などの他の治療剤は、基礎となる癌／腫瘍に伴う症状を軽減し及び／又は減少させるために、本発明のｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメントを同時投与され得る。

本発明のｈＡＮＧＰＴＬ３抗体又はそのフラグメント及び更なる１つ又は複数の治療剤は、併せて又は別々に同時投与されることができる。別々の投与製剤が使用される場合、本発明の抗体又はそのフラグメント及び更なる薬剤は、同時に、又はずらした時間に別々に、即ち、逐次的に適切な順序で投与されることができる。

抗体の診断的使用
本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体はまた、サンプル中のＡＮＧＰＴＬ３を、例えば、診断目的のために検出及び／又は測定するのに使用されることができる。例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ３Ａｂ又はそのフラグメントは、異常発現（例えば、過剰発現、発現不足、発現欠如など）によって特徴付けられる病態及び疾患を診断するのに使用されることができる。ＡＮＧＰＴＬ３の例示的診断的アッセイは、例えば、本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ３Ａｂと患者から得られるサンプルを接触させることを含んでよく、ここで抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体は、検出可能な標識又はレポーター分子で標識され、又は患者サンプル由来のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を選択的に捕捉しそして分離するのに使用される。あるいは、非標識抗ＡＮＧＰＴＬ３Ａｂは、それ自体検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて診断用途に使用されることができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹³¹Ｉ又は¹²⁵Ｉなどの放射性同位体；フルオレセインイソチオシアナート、又はローダミンなどの蛍光又は化学発光部分；又はアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、又はルシフェラーゼなどの酵素であってよい。サンプル中のＡＮＧＰＴＬ３を検出又は測定するのに使用されることができるアッセイは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）などを含む。

下記の実施例は、本発明の方法及び組成物の作り方及び使用の仕方の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提案され、そして発明者らがそれらの発明と見なすものの範囲を限定することを目的とするものではない。使用された数値について正確さを確保するための努力はなされているが、幾つかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。他に明示されない限り、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏度であり、そして圧力は大気圧又はその付近である。

〔実施例１〕ヒトＡＮＧＰＴＬ３に対するヒト抗体の生成
VELOCIMMUNE(商標)マウスをヒトＡＮＧＰＴＬ３で免疫感作し、そして抗体免疫反応をこれらのマウスから得られた血清を用いて抗原特異的イムノアッセイによってモニターした。Ｂ細胞を発現する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３は、抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体タイターを上昇させたことが示される免疫されたマウスの脾臓から回収し、そしてハイブリドーマを形成するためにマウスミエローマ細胞と融合した。ハイブリドーマをスクリーニングし、そして下記のアッセイを用いてｈＡＮＧＰＴＬ３特異的抗体を発現する細胞株を同定するために選択した。アッセイは、キメラ抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体、例えば、Ｈ１Ｍ８９６Ｎを産生する幾つかの細胞株を同定した。

ヒトＡＮＧＰＴＬ３特異的抗体はまた、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１に記載の、ミエローマ細胞へ融合のない抗原免疫感作Ｂ細胞から直接分離した。重鎖及び軽鎖可変領域をクローン化し、Ｈ４Ｈ１２４８Ｐ、Ｈ４Ｈ１２５０Ｐ、Ｈ４Ｈ１２６３Ｓ、Ｈ４Ｈ１２６８Ｓ、Ｈ４Ｈ１２７６Ｓ、Ｈ４Ｈ１２７９Ｐ、Ｈ４Ｈ１２８２Ｐ、Ｈ４Ｈ１２９２Ｐ、Ｈ４Ｈ１２９５Ｐ及びＨ４Ｈ１２９６Ｐで表されたＩｇＧ４イソタイプの完全ヒト抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体を生成させた。安定な組換抗体発現性ＣＨＯ細胞株を樹立した。

〔実施例２〕可変遺伝子利用解析
産性抗体の構造を解析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローン化しそして配列決定した。抗体の核酸配列及び予測アミノ酸配列から、遺伝子利用法を、各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）で同定した。表１は、本発明に基づいた選択抗体での利用法を示す。

表２は、選択抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体及び対応する抗体識別子の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列ペアを示す。Ｎ、Ｐ及びＳの記号表示は同一のＣＤＲ配列の、しかしＣＤＲ配列から外れる領域において（即ち、フレームワーク領域において）配列変異の重鎖及び軽鎖を有する抗体をいう。それ故、特定の抗体のＮ、Ｐ及びＳバリアントは、それらの重鎖及び軽鎖可変領域内に同一のＣＤＲ配列を有し、しかしフレームワーク領域内に修飾を含有する。

〔実施例３〕ＡＮＧＰＴＬ３への抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体結合の速度論的パラメータ
すべての速度論的結合実験は、BIACORE(商標)T200ラベルフリー分子相互作用機器(GE Healthcare) にＣＭ５センサチップを用いて２５℃又は３７℃で行った。簡単に言うと、抗原捕獲表面は、抗マウスＩｇＧ特異抗体（抗ｍＦｃ; GE Healthcare;カタログ＃ＢＲ−１００８−３８）か又は抗ペンタヒスチジン特異抗体 (Qiagen; カタログ＃３４６６０)を、標準アミンカップリング法を用いてＣＭ５センサチップの表面に共有結合することによって生成した。実施緩衝液として、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）、又はＰＢＳＰ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２．７ｍＭＫＣｌ、１３７ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．２又は５．７５）を用いて、４．４−４６．５ＲＵの結合反応を実現するまで、オリゴヒスチジンタグのＡＮＧＰＴＬ３のヒト及び種バリアントを抗ペンタヒスチジン結合表面で捕獲した。捕獲組換タンパク質は：Ｃ末端デカヒスチジンタグ［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−４６０）−Ｈｉｓ；R&D Systems,MN；カタログ＃３８２９−ＡＮ］の完全長成熟ヒトＡＮＧＰＴＬ３（即ち、配列番号１６１のアミノ酸残基１７−４６０）、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１７０）−Ｈｉｓ］を含有する、ｈＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン（即ち、配列番号１６１のアミノ酸残基１７−１７０）、ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ［ＭｆＡＮＧＰＴＬ３（１７−１７０）−ｍｍＨ；配列番号１６７］を含有する、カニクイザル由来のＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン［即ち、配列番号１７７のアミノ酸残基１７−１７０（カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３の部分配列）］、Ｃ末端デカヒスチジンタグ［ｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−４５５）−Ｈｉｓ；R&D Systems, MN;カタログ＃１３６−ＡＮ］の、ハツカネズミ由来完全長成熟ＡＮＧＰＴＬ３（即ち、配列番号１６３のアミノ酸残基１７−４５５）、ヘキサヒスチジンタグ［ｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−２４０）−Ｈｉｓ；配列番号１６６］を含有する、ハツカネズミ由来のＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン（即ち、配列番号１６３のアミノ酸残基１７−２４０）、及びｍｙｃ−ｍｙｃ−ヒスチジンタグ［ｒＡＮＧＰＴＬ３（１７−２４０）−ｍｍＨ；配列番号１７６］を含有する、ドブネズミ由来のＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン（即ち、配列番号１７５のアミノ酸残基１７−２４０）である。加えて、２４．８±１．５ＲＵの結合反応を実現するまで、Ｃ末端Ｆｃ融合［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１６９）−ｍＦｃ；配列番号１６５］を含有する、ｈＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン（即ち、配列番号１６１のアミノ酸残基１７−１６９）を抗ｍＦｃ結合表面に捕獲した。抗体／抗原複合体の形成の連結及び解離速度を測定するために、単一（表３及び７）及び複数（表４〜６）濃度の抗体を、５０μｌ／分の流速で３分間捕獲タンパク質表面をわたって注入し、そして複合体の解離を２０分間モニターした。結合データを処理し、そして Scrubberバージョン２．０ａ(BioLogic Software)で物質移動により１：１結合モデルに合わせた。動的半減期（ｔ_1/2）を解離速度定数、ｋｄから計算した。

表３は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中ｐＨ７．４、２５℃で、種々抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体のｈＡＮＧＰＴＬ３への結合を示す。

表３に示されるように、抗ｈＡＮＧＰＬＴ３抗体は、９６．８ｐＭから５．６２ｎＭまで変動する計算平衡解離定数（Ｋ_D＝ｋｄ／ｋａ）のＣ末端デカヒスチジンタグ［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−４６０）−Ｈｉｓ］と完全長タンパク質に、そして８．４１ｐＭから６．２３ｎＭまで変動するＫ_DｓのＣ末端Ｆｃ融合［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１６９）−ｍＦｃ］とＮ末端コイルドコイルドメインに結合した。

表４及び５は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中ｐＨ７．４で、それぞれ２５℃及び３７℃におけるＨ４Ｈ１２７６ＳのＡＮＧＰＴＬ３への異種結合を示す。表６は、ＰＢＳＰ緩衝液中ｐＨ５．７５又はｐＨ７．２で、２５℃又は３７℃におけるＨ４Ｈ１２７６Ｓのヒト又はカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３への結合を示す。

表４〜６に示されるように、抗体Ｈ４Ｈ１２７６Ｓは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３への結合のものと類似した結合親和性及び速度定数のサル、マウス、及びラット由来のＡＮＧＰＴＬ３への結合を示した。

表７は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中ｐＨ７．４、３７℃で、選択抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体のｈＡＮＧＰＴＬ３及びｍＡＮＧＰＴＬ３への結合を示す。ＮＢ：結合せず。

表７に示されるように、抗ｈＡＮＧＰＬＴ３抗体は、１５８ｐＭから１．０２ｎＭまで変動する計算平衡解離定数（Ｋ_D＝ｋｄ／ｋａ）のｐＨ７．４及び３７℃でＣ末端デカヒスチジンタグ［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−４６０）−Ｈｉｓ］と完全長タンパク質に、そしてｍＡＮＧＰＴＬ３に対して検出可能結合を示さなかったＨ４Ｈ１２４８Ｐ及びＨ４Ｈ１２６３Ｓを除いて、１６７ｐＭから６８２ｐＭまで変動するＫ_DｓのマウスＡＮＧＰＴＬ３［ｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−４５５）−Ｈｉｓ］に結合した。また動的半減期（ｔ_1/2）を示す。

〔実施例４〕抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体のBiacore交差競合研究
本質的に上記実施例３に記載のBiacoreで２５℃において交差競合研究を実施した。簡単に言えば、実施緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰを用いて、Ｃ末端デカヒスチジンタグ［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−４６０）−Ｈｉｓ；R&D Systems,MN；カタログ＃３８２９−ＡＮ］の完全長ｈＡＮＧＰＴＬ３（即ち、配列番号１６１のアミノ酸残基１７−４６０）を、６４ＲＵの結合反応を実現するまで、抗ペンタヒスチジン結合表面に捕獲した。２つの抗体が捕獲ＡＮＧＰＴＬ３に同時に結合し得るかを決定するために、抗体ペアは各々１６７ｎＭで４μｌ／分の流速において１５分間逐次的に表面にわたって注入し、そして最大結合反応シグナル（ＲＵ）を各結合イベントに対して測定した。結果は表８に、第１の抗体（ｍＡｂ１）の結合反応、続いて第１の抗体をプレロードしたＡＮＧＰＴＬ３表面への第２の抗体（ｍＡｂ２）の結合反応で示す。太字の数は、抗体ペアがｈＡＮＧＰＴＬ３に同時に結合が可能であることを示す。イタリックの数は、他ではなく１つの方向に逐次的に加えられるとき、抗体ペアがｈＡＮＧＰＴＬ３に同時に結合が可能であることを示す。

表８に示されるように、抗体ペアＨ１Ｍ８９６Ｎ／Ｈ４Ｈ１２７９Ｐ及びＨ１Ｍ８９６Ｎ／Ｈ４Ｈ１２９２Ｐは、抗体の添加順序に関係なく、固定化ＡＮＧＰＴＬ３に同時に結合することができた。Ｈ４Ｈ１２５０Ｐは、Ｈ４Ｈ１２７９Ｐとプレ結合したＡＮＧＰＴＬ３に結合した；しかしながら、抗体の添加順序が逆になったとき、Ｈ４Ｈ１２７９Ｐは、ＡＮＧＰＴＬ３がＨ４Ｈ１２５０Ｐとプレ結合した後に、予想最大反応のほぼ２４％の結合シグナルを示した。同様に、Ｈ４Ｈ１２５０ＰはＨ４Ｈ１２９２Ｐとプレ結合したＡＮＧＰＴＬ３に結合した；しかしながら、抗体の添加順序が逆になったとき、Ｈ４Ｈ１２９２Ｐは、ＡＮＧＰＴＬ３がＨ４Ｈ１２５０Ｐとプレ結合した後に、予想最大反応のほぼ２０％の結合シグナルを示した。

〔実施例５〕ＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルペプチドへの抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体結合
ＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイル領域由来ペプチドへの抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体Ｈ４Ｈ１２７６Ｓの結合を評価するために、標識なしバイオセンサ結合アッセイをOCTET（登録商標）RED システム(ForteBio, Inc.)を用いて行った。センサペプチドへの固定のために、ペプチドは、Ｎ末端ビオチンタグ［ペプチド１及びペプチド２ではフレキシブルリンカー、アミノ酸「ＡＧＳＳＰＧＧ」（配列番号１７１）；及びペプチド３ではアミノ酸「ＧＧＧＧＳ」（配列番号１７２）によって分離された］か，又はＣ末端ビオチンタグ［ペプチド１及びペプチド２ではフレキシブルリンカー、アミノ酸「ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ」（配列番号１７３）；及びペプチド３ではアミノ酸「ＧＧＧＧＳＫ」（配列番号１７４）によって分離された］で標識した。試験したペプチド配列は：陰性対照ペプチド、Ｎ末端ビオチンタグ化ペプチド１（配列番号１６８；配列番号１６４のヒトＡＮＴＧＰＴＬ４の残基Ａｒｇ３４〜Ｌｅｕ６６）；及びＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイル領域由来ペプチド、即ち、Ｎ末端ビオチンタグ化ペプチド２（配列番号１６９；配列番号１６１のｈＡＮＧＰＴＬ３の残基Ａｒｇ３６〜Ｌｅｕ６８）；Ｃ末端ビオチンタグ化ペプチド２；Ｎ末端ビオチンタグ化ペプチド３（配列番号１７０；配列番号１６１のｈＡＮＧＰＴＬ３の残基Ｇｌｕ３２〜Ｌｅｕ５７に対応）；及びＣ末端ビオチンタグ化ペプチド３であった。ペプチド配列はまた図１に示される。ストレプトアビジンコーティングバイオセンサチップはビオチニル化ペプチドでコーティングし、ペプチドに応じて１．２２−２．２６ｎｍの結合反応単位をもたらした。ペプチドコーティングバイオセンサチップは、次いで１μＭの抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体のＨ４Ｈ１２７６Ｓか又はイソタイプ適合陰性対照抗体を含有するウェルに浸漬し、そして結合を２．５分間モニターした。各ペプチドへのＨ４Ｈ１２７６Ｓ及びイソタイプ対照抗体の結合反応は、図２にまとめられる。Ｈ４Ｈ１２７６Ｓはペプチド２によって規定されるＡＮＧＰＴＬ３線状配列に結合し、しかしペプチド３によって規定される重複しかし異なる配列はそうでないことを認めた（図１も参照されたい）。このイソタイプ対照抗体は特異的にｈＡＮＧＰＴＬ４を認識することから、イソタイプ対照抗体はまた、バイオセンサへのペプチド１（即ち、ｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチド）の負荷に対する陽性対照としての機能を果たした。図２に示されるように、ペプチド１への対照抗体の結合は、ペプチド１がセンサ表面に存在し、そしてそれで他のペプチドであることを確認した。

〔実施例６〕ＬＰＬバイオアッセイにおける抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体によるｈＡＮＧＰＴＬ３の阻害
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）はヒトの脂質代謝において重要な役割を果たしている。ＬＰＬはトリグリセリドの加水分解を触媒し、そして代謝されるように脂肪酸を放出する。ＡＮＧＰＴＬ３はＬＰＬ活性を阻害し脂質のレベル増加をもたらす(Oike et al., 2005, Trends in Molecular Medicine 11(10):473-479)。ＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイル領域は、Ｃ末端フィブリノーゲン領域なしに発現されるときＬＰＬを阻害し、そしてその結果その阻害機能を与えるように見える。ＬＰＬ活性のＡＮＧＰＴＬ３誘導減少を阻害する抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体の能力を測定する無細胞バイオアッセイを開発した。

抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体によるｈＡＮＧＰＴＬ３活性の阻害を、CONFLUOLIP（商標）連続蛍光リパーゼ試験 (Progen, Germany)を使用して、３つのｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質：Ｃ末端デカヒスチジンタグ［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−４６０）−Ｈｉｓ；R&D Systems,MN；カタログ＃３８２９−ＡＮ］の完全長成熟ｈＡＮＧＰＴＬ３（即ち、配列番号１６１のアミノ酸残基１７−４６０）、Ｃ末端マウスＦｃ融合［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１６９）−ｍＦｃ；配列番号１６５］のＮ末端コイルドコイルド領域（即ち、配列番号１６１のアミノ酸残基１７−１６９）、及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグ［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１７０）−Ｈｉｓ］を含有する、ｈＡＮＧＰＴＬ３のＮ末端コイルドコイルドメイン（即ち、配列番号１６１のアミノ酸残基１７−１７０）、を用いて測定した。

簡単に言えば、ＰＢＳ中でウシＬＰＬ（２ｎＭの最終濃度）、ヒトＡｐｏＣＩＩ（ＬＰＬのコファクタ、０．２３μＭの最終濃度）、及びＢＳＡ（２ｍｇ／ｍＬの最終濃度）をプレミックスした。ｈＡＮＧＰＴＬ３組換タンパク質をＡｐｏ／ＬＰＬ混合液（８０−１００ｎＭの最終濃度）に加えた。次いでＡｐｏ／ＬＰＬ／ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質混合液を連続的に希釈した抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体と併せて加え、そして室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、再構成リパーゼ基質として、１００μｌの１−トリニトロフェニル−アミノ−ドデカノイル−２−ピレンデカノイル−３−０−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロール(LS-A, Progen)を、９６ウェルアッセイプレートで２５μｌの抗体混合液に加え、そして３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いでFLEXSTATION（登録商標）3マイクロプレートリーダー(Molecular Devices, CA)を用いて、３４２ｎｍ／４００ｎｍ（励起／放出）で蛍光を測定した。蛍光はＬＰＬ活性に正比例する。

抗体Ｈ４Ｈ１２７６ＳはＬＰＬに対するｈＡＮＧＰＴＬ３の阻害活性の阻害を示した。ＬＰＬアッセイでｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を用いた完全用量反応を、各実験でＡＮＧＰＴＬ３のＥＣ₅₀を測定するために先ず実施し、そして表８に示すように次いで抗体のＩＣ₅₀測定をＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の一定濃度を用いて実施した。５０％最大阻害（ＩＣ₅₀）に必要な抗体の濃度は、それぞれ、８０ｎＭのｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−４６０）−Ｈｉｓでは９．６ｎＭ、１００ｎＭのｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１７０）−Ｈｉｓでは２．９ｎＭ及び８０ｎＭのｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１６９）−ｍＦｃでは２１ｎＭであると決定した。抗体濃度は検査ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質で０から３００ｎＭまで変動した。

同様に、Ｈ４Ｈ１２７６Ｓについて、異種間オーソログのその阻害能力をＬＰＬバイオアッセイにおいて以下で試験した：Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ［ＭｆＡＮＧＰＴＬ３（１７−１７０）−ｍｍＨ；配列番号：１６７］で発現したカニクイザルのＮ末端領域（配列番号１７７のアミノ酸残基１７−１７０）、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ［ｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−２４０）−Ｈｉｓ；配列番号１６６］のマウスオーソログＮ末端領域配列番号１６３のアミノ酸残基１７−２４０、及びＣ末端デカヒスチジンタグ [ｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−４５５）−Ｈｉｓ; R&D Systems, MN; catalog #136-AN]のハツカネズミ由来の完全長成熟ＡＮＧＰＴＬ３（即ち、配列番号１６３のアミノ酸残基１７−４５５）。ＩＣ₅₀は、５００ｎＭ定常ＭｆＡＮＧＰＴＬ３（１７−１７０）−ｍｍＨでは１０ｎＭ、８０ｎＭ定常ｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−４５５）−Ｈｉｓでは１４ｎＭ、そして５００ｎＭ定常ｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−２４０）−Ｈｉｓでは３１ｎＭと決定した。抗体濃度は試験サル及びマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質で０から６００ｎＭまで変動した。結果は表９にまとめられる。

相同タンパク質ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端領域に対する抗体はまた、ＬＰＬへのＡＮＧＰＴＬ４の阻害機能をブロックすることを示している(Lee et al., 2009, J. Biol. Chem. 284:13735-13745)。従って、ＡＮＧＰＴＬ４に対する交差反応性の可能性を評価するために、阻害性抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体Ｈ４Ｈ１２７６Ｓをまた、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に対して上記で実施された、ＬＰＬアッセイでヒトＡＮＧＰＴＬ４に対して試験した。Ｃ末端マウスＩｇＧ２ａのＦｃ融合［ｈＡＮＧＰＴＬ４（２６−１４８）−ｍＦｃ、配列番号１７８］したヒトＡＮＧＰＴＬ４（配列番号１６４の残基２６−１４８）のコイルドコイル領域の組換型は、ＬＰＬアッセイで０．２ｎＭのＥＣ₅₀を示した（表９）。０−６００ｎＭの濃度範囲を通して試験したＨ４Ｈ１２７６Ｓはこの阻害をブロックしなかった（ＮＢ：結合せず；表９）。

上記のように、Ｈ４Ｈ１２７６Ｓは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３（完全長及びＮ末端）、サルＡＮＧＰＴＬ３（Ｎ末端）タンパク質及びマウスＡＮＧＰＴＬ３（完全長及びＮ末端）活性を、約３−３１ｎＭのＩＣ₅₀範囲で同程度に阻害した。

同時に加えられた２つのＡＮＧＰＴＬ３非ブロッキング抗体の組み合わせが、ＡＮＧＰＴＬ３のＬＰＬ阻害活性をブロックし得るかを決定するために、抗体のサブセットをまた試験した。抗体のペアについて、ヒト及びマウスの両方のＡＮＧＰＴＬ３、即ち、それぞれｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１６９）−ｍＦｃ及びｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−２４０）−ＨｉｓのＮ末端ドメインの阻害を試験した。このアッセイで、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、４７ｎＭ［ｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１６９）−ｍＦｃに対して］及び３４１ｎＭ［ｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−２４０）−Ｈｉｓに対して］のＬＰＬブロッキングのＩＣ₅₀値を示した。下記のペアは、少なくとも２００ｎＭの各抗体の最終濃度で加えたとき、８０ｎＭでｈＡＮＧＰＴＬ３（１７−１６９）−ｍＦｃか又は５００ｎＭでｍＡＮＧＰＴＬ３（１７−２４０）−ＨｉｓによるＬＰＬの阻害をブロックしなかった：Ｈ１Ｍ８９６Ｎ＋Ｈ４Ｈ１２７９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２５０Ｐ＋Ｈ４Ｈ１２７９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２４８Ｐ＋Ｈ４Ｈ１２９２Ｐ；及びＨ４Ｈ１２６３Ｓ＋Ｈ４Ｈ１２９２Ｐ。この同じアッセイで、Ｈ４Ｈ１２７６Ｓだけが、それぞれ３３ｎＭ及び６４ｎＭのＩＣ₅₀でこれらの同じ一定濃度のヒト及びマウスのＡＮＧＰＴＬ３をブロックした。

〔実施例７.１.〕血清脂質レベルに対する抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体のインビボ効果
血清脂質レベルに対する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体のＨ４Ｈ１２７６Ｓの効果を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで測定した。マウスを実験の７日前にプレ放血し、そして各試験抗体用量に対して各々６マウス群を割り当てた。抗体を、５ｍｇ／ｋｇ（Ｈ４Ｈ１７２６Ｓ）及び１０ｍｇ／ｋｇ［Ｈ４Ｈ１７２６Ｓ及び無関係な特異性のイソタイプ適合ｈＩｇＧ４（Ｓ１０８Ｐ）対照］用量レベルで、試験の０日目に皮下注射によって投与した。マウスを抗体注射の１、４、７及び１２日後に４時間の絶食後に放血し、そして血清脂質レベル（トリグリセリド、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロール）を、ADVIA^(R) 1800 Chemistry System (Siemens)によって血清で測定した。各抗体に対してそれぞれの時点での平均値を算出した。（平均±ＳＥＭ）の血清脂質濃度で表した結果を表１０〜１４に示した。

循環Ｈ４Ｈ１２７６Ｓ（血清Ａｂ）のレベルも、標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に言えば、プレートは、血清Ａｂを捕獲するためにヤギ抗ヒトＦｃ抗体(Sigma-Aldrich) でコーティングした。次に血清をプレートに加えて、そして捕獲ヒト抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Sigma-Aldrich)を用いて化学ルミネセンスによって検出した。（平均±ＳＥＭ）で表した結果を表１５に示した。対照：イソタイプ適合対照Ａｂを受けたマウス。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへの１０ｍｇ／ｋｇでのＨ４Ｈ１２７６Ｓの単回投与は、抗体投与の７日後に循環トリグリセリドの減少をもたらした（イソタイプ対照と比べて）。Ｈ４Ｈ１２７６Ｓの投与はまた、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロールの顕著な減少をもたらし、そしてＬＤＬコレステロールへの作用はなかった。脂質レベルの減少も認められたが、しかし１０ｍｇ／ｋｇレベルと比べて５ｍｇ／ｋｇではそれほど顕著ではなかった；例えば、血清トリグリセリドは抗体投与の７日後に４４％減少した（イソタイプ対照と比べて）。

〔実施例７.２.〕血清脂質レベルに対する抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体のインビボ効果
血清脂質レベルに対する抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体のＨ４Ｈ１２７６Ｓ及びコンパレータ４.９.１のインビボ効果の評価は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで実施した。抗体４.９.１は、ＵＳ特許出願公開２００８／０１７７０４５に開示のそしてマウスイソタイプＩｇＧ１として配列番号２４（ＶＨ）及び配列番号３２（ＶＬ）のアミノ酸配列に基づいて調製した。マウスを実験の７日前にプレ放血し、そして群当り６マウスの群に割り当てた。抗体Ｈ４Ｈ１７２６Ｓ、４.９.１、及び無関係な特異性のイソタイプ適合陰性対照（それぞれヒトＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ１）を、１０ｍｇ／ｋｇ用量で、試験の０日目に皮下注射によって投与した。マウスを抗体投与の１、７、１１及び２０日後に４時間の絶食後に放血し、そして血清脂質レベル（トリグリセリド、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロール）を、ADVIA（登録商標）1800 Chemistry System (Siemens)を用いて血清で測定した。各抗体に対してそれぞれの時点での平均脂質濃度を算出した。（平均±ＳＥＭ）の血清脂質濃度で表した結果を表１６〜２０に示した。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでのＨ４Ｈ１２７６Ｓの単回１０ｍｇ／ｋｇ用量は、抗体注射後１、７、１１及び２０日でイソタイプ対照と比べて血漿トリグリセリドレベルの減少をもたらした；そしてその効果はコンパレータ４.９.１と同じ用量レベルでの単回処置に比べてより持続性であった（表１６）。Ｈ４Ｈ１２７６Ｓの投与はまた、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて総コレステロール（表１７）及びＨＤＬコレステロール（表２０）の減少をもたらした。

〔実施例８〕高脂血症ＡｐｏＥ^-/-マウス中の血清脂質レベルに対するＨ４Ｈ１２７６Ｓのインビボ効果
血清脂質レベルに対する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体Ｈ４Ｈ１２７６Ｓの効果を、ＡｐｏＥ^-/-マウスで測定した。これらのマウスは、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの形態で見出される大部分のそれらの循環コレステロールにより高脂血症性である。マウスを実験の７日前にプレ放血し、そして群当り６マウスの群に割り当てた。抗体、Ｈ４Ｈ１２７６Ｓ及び無関係な特異性のイソタイプ適合（ｈＩｇＧ４）対照を、１０ｍｇ／ｋｇ用量で試験の０日目に皮下注射によって投与した。マウスを抗体の注射の１、４、７及び１１日後に４時間の絶食後に放血し；そして血清脂質レベル（トリグリセリド、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロール）を、ADVIA（登録商標）1800 Chemistry System (Siemens)を用いて血清中で測定した。各抗体処置群に対してそれぞれの時点で平均脂質濃度を算出した。（平均±ＳＥＭ）の血清脂質濃度で表した結果を表２１〜２５に示した。

ＡｐｏＥ^-/-マウスへ１０ｍｇ／ｋｇでのＨ４Ｈ１２７６Ｓの単回投与は、抗体投与後７日に循環トリグリセリドの〜７２％（平均）減少（表２１）及びＬＤＬコレステロールの〜４６％（平均）減少（表２４）をもたらした（イソタイプ適合対照Ａｂ、即ち、ｈＩｇＧ４と比べて）。Ｈ４Ｈ１２７６Ｓの投与はまた、総コレステロール（表２２）及び非ＨＤＬコレステロール（表２３）の減少をもたらした。

循環Ｈ４Ｈ１２７６Ｓ（血清Ａｂ）のレベルも、標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に言えば、プレートは、血清Ａｂを捕獲するためにヤギ抗ヒトＦｃ抗体(Sigma-Aldrich) でコーティングした。次いで血清をプレートに加えて、そして捕獲ヒト抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Sigma-Aldrich)を用いて化学ルミネセンスによって検出した。（平均±ＳＥＭ）で表した結果を表２６に示した（対照：イソタイプ適合対照Ａｂ、即ち、ｈＩｇＧ４を受けたマウス）。

〔実施例９〕高脂血症Ｌｄｌｒ^-/-マウスでの循環脂質レベルに対するＨ４Ｈ１２７６Ｓのインビボ効果
血清脂質レベルに対する抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体Ｈ４Ｈ１２７６Ｓの効果をＬｄｌｒ^-/-マウスで測定した。これらのマウスは、ＬＤＬコレステロール取込の主要受容体、ＬＤＬＲの欠乏に因りＬＤＬの形態で見出される大部分の循環コレステロールにより高脂血症性である。

マウスを実験の７日前にプレ放血し、そして６マウスの群に割り当てた。抗体、Ｈ４Ｈ１２７６Ｓ及びイソタイプ適合（ｈＩｇＧ４）陰性対照を、１０ｍｇ／ｋｇ用量で試験の０日目に皮下注射によって投与した。抗体の注射の１、４、７及び１１日後に４時間の絶食後に放血し；そして血清脂質レベル（トリグリセリド、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロール）を、ADVIA（登録商標）1800 Chemistry System (Siemens)臨床化学分析計を用いて測定した。各抗体に対しそれぞれの時点で平均値を算出した。（平均±ＳＥＭ）の血清脂質濃度（トリグリセリド、総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロール）で表した結果を、それぞれ表２７〜３１に示した。（対照＝イソタイプ適合対照抗体を受けたマウス）。

表２７〜３１に示されるように、Ｌｄｌｒ^-/-マウスに対するＨ４Ｈ１２７６Ｓの投与は、４４％の最大実測減少で血漿トリグリセリドの顕著な減少をもたらした（平均値ベース）。ＬＤＬコレステロール（２３％まで）、並びに総コレステロール、非ＨＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロールの顕著な減少もＨ４Ｈ１２７６Ｓ処置被検体で認められた。ＬＤＬコレステロール取込の主要受容体（ＬＤＬＲ）欠乏マウスにおけるＬＤＬコレステロールの減少は、ＡＮＧＰＴＬ３阻害によるＬＤＬコレステロール減少に対するＬＤＬＲ非依存性機構を示唆する。

循環Ｈ４Ｈ１２７６Ｓ（血清Ａｂ）のレベルもまた、標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に言えば、プレートは、血清Ａｂを捕獲するためにヤギ抗ヒトＦｃ抗体(Sigma-Aldrich) でコーティングした。次いで血清をプレートに加えて、そして捕獲抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Sigma-Aldrich)を用いて化学ルミネセンスによって検出した。（平均±ＳＥＭ）で表した結果を表３２に示した。（対照＝イソタイプ適合対照抗体を受けたマウス）。

表３２に示されるように、Ｈ４Ｈ１２７６Ｓの血清レベルは１０ｍｇ／ｋｇの抗体をマウスに注射後１１日までに約２１μｇ／ｍＬに減少した。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様によってその範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の種々の変更は、前述の明細書及び添付図面から当業者に明らかになるものである。そのような変更は添付の請求の範囲内に含まれる予定のものである。

Claims

配列番号１６１のアミノ酸配列を有するヒトアンギオポエチン様タンパク質３（ｈＡＮＧＰＴＬ３）と特異的に結合し、そしてｈＡＮＧＰＴＬ３のＬＰＬ阻害活性を中和し、減少させ、又は干渉する、配列番号６６／７４の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列ペアを含む、単離されたヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
配列番号１６１のアミノ酸配列を有するヒトアンギオポエチン様タンパク質３（ｈＡＮＧＰＴＬ３）と特異的に結合し、そしてｈＡＮＧＰＴＬ３のＬＰＬ阻害活性を中和し、減少させ、又は干渉する、配列番号６８／７０／７２の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３配列の組み合わせ及び配列番号７６／７８／８０の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列の組み合わせを含む、単離されたヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３と交差反応する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
マウス又はラットのＡＮＧＰＴＬ３と交差反応する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３、マウスＡＮＧＰＴＬ３、及びラットＡＮＧＰＴＬ３のいずれかと交差反応する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
単鎖抗体、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ’）₂である、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
抗体又は抗原結合フラグメントは、キメラ又は完全ヒト抗体又は抗体フラグメントである、請求項１に記載の抗体又はフラグメント。
ＡＮＧＰＴＬ３活性の減少又は阻害によって予防され、軽減され、改善され又は阻害される疾患又は障害を処置又は予防するための医薬の製造における、請求項１〜６及び８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントの使用。
疾患又は障害は、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、混合脂質異常症、心血管疾患及び障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病及び肥満から成る群から選択される、請求項９に記載の使用。
高コレステロール血症が、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）である、請求項１０に記載の使用。