ES2699499T3 - Anticuerpos anti-ANGPTL3 y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-ANGPTL3 y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína 3 similar a angiopoyetina humana (hANGPTL3) de la SEQ ID NO:161 y neutraliza, reduce o interfiere en, al menos una actividad de hANGPTL3, en el que el anticuerpo o fragmento: (a) comprende un par de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) de la SEQ ID NO: 66/74; (b) comprende secuencias de región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada, HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y secuencias de CDR de cadena ligera, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, contenidas dentro de un par de secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) y de región variable de cadena ligera (LCVR) ( 10 HCVR/LCVR) de la SEQ ID NO: 66/74, en el que las CDR están determinadas por la definición de Kabat, la definición de Chothia o la definición de AbM; o (c) comprende una combinación de secuencias HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de las SEQ ID NO: 68/70/72/76/78/80.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-ANGPTL3 y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente a la proteína 3 similar a angiopoyetina humana (hANGPTL3), y métodos terapéuticos para usar esos anticuerpos.
Antecedentes
El gen de la proteína 3 similar a angiopoyetina (ANGPTL3) se identificó a partir de la base de datos EST basándose en secuencias señal y hélices anfipáticas, y posteriormente se aisló un ADNc de ANGPTL3 de longitud completa a partir de una biblioteca de ADNc de hígado/bazo fetal humano (Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482). La proteína hANGPTL3 de 460 aminoácidos deducida comparte una identidad de secuencia de aminoácidos del 76 % con ANGPTL3 de ratón y tiene la estructura característica de las angiopoyetinas; es decir, un péptido señal, un dominio helicoidal extendido del que se predijo que formará espiras enrolladas diméricas o triméricas, un péptido enlazador corto y un dominio de homología de fibrinógeno globular (FD) (Conklin et al., 1999, anteriormente citado). ANGPTL3 contiene los 4 restos de cisteína conservados implicados en los puentes disulfuro intramoleculares dentro del FD; sin embargo, ANGPTL3 no contiene ni las dos cisteínas adicionales ni el motivo característico de unión a calcio que se encuentra en los FD de las angiopoyetinas (ANG; es decir, ANG1, ANG2 y ANG4) (Conklin et al., 1999, anteriormente citado), que son factores de crecimiento proteicos que promueven la angiogénesis. Además, a diferencia de las ANG, ANGPTL3 no se une a Tie2; sin embargo, también puede inducir la angiogénesis uniéndose a integrina avp3 mediante su FD C-terminal (Camenisch et al., 2002, J Biol Chem 277: 17281-17290).
Se obtuvieron datos completos in vivo del modelo en ratón KK exogámico, que es moderadamente obeso con niveles anormalmente altos de insulina, glucosa y lípidos en plasma, parecidos a la diabetes mellitus de tipo 2 en seres humanos (Koishi et al., 2002, Nature Genetics 30:151-157). Sin embargo, se descubrió que una sub-estirpe de ratón, la KK/San, exhibía niveles de lípidos en plasma anormalmente bajos (hipolipidemia), que se heredaron como un carácter mendeliano recesivo. Los loci se cartografiaron para el cromosoma 4 y, finalmente, se identificaron como el gen que codifica ANGPTL3, que contenía una inserción de secuencia de nucleótidos de 4 pb en el exón 6 (Koishi et al., 2002, anteriormente citado). Por el contrario, los niveles de lípidos en plasma aumentan después de la transferencia mediada por adenovirus del gen de ANGPTL3, o después de la administración de ANGPTL3 humana recombinante en ratones KK/San. Este efecto no fue mediado por cambios en los genes implicados en la síntesis de colesterol, el aclaramiento de lipoproteínas o la oxidación de NEFA (Koishi et al., 2002, anteriormente citado). Además, el análisis in vitro de la proteína recombinante mostró que ANGPTL3 inhibe directamente la actividad de la lipoproteína lipasa (LPL), lo que indica que es un modulador del metabolismo lipídico que regula los niveles de triglicéridos de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) a través de la inhibición de la actividad de la LPL (Shimizugawa et al., 2002, J Biol Chem 277(37): 33742-33748). Se ha demostrado que el dominio de la espira enrollada N-terminal, especialmente los restos 17-165 de la región N-terminal, y no el FD C-terminal, de ANGPTL3, se requiere para su actividad de aumentar los niveles de triglicéridos en plasma en ratones (Ono et al., 2003, J Biol Chem 278: 41804­ 41809).
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de ANGPTL3 humana se muestran en las SEQ ID NO: 161 y 162, respectivamente. Los anticuerpos contra ANGPTL3 se describen, por ejemplo, los documentos WO2008/073300 y US 7.935.796.
Breve sumario de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se definen en las reivindicaciones que específicamente se unen a y neutralizan, inhiben, bloquean, anulan, reducen o interfieren en, al menos una actividad de ANGTPL3, en particular, a Ng PTL3 humana (SEQ ID NO: 161). La actividad de ANGPTL3 que puede neutralizarse, inhibirse, bloquearse, anularse, reducirse o interferirse, mediante los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, incluye, pero sin limitación, la inhibición de la actividad de la LPL, la inducción de la angiogénesis y similares. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede neutralizar, inhibir, bloquear, anular, reducir o interferir en, una actividad de hANGPTL3 uniéndose a un epítopo de hANGPTL3 que está directamente implicado en la actividad dirigida de hANGPTL3. Un anticuerpo o fragmento del mismo también puede neutralizar, inhibir, bloquear, anular, reducir o interferir en, una actividad de hANGPTL3 uniéndose a un epítopo de hANGPTL3 que no está directamente implicado en la actividad dirigida de hANGPTL3, pero el anticuerpo o fragmento que se une al mismo Inhibe, bloquea, anula, reduce o interfiere estérica o conformacionalmente en, la actividad dirigida de hANGPTL3. Un anticuerpo o fragmento del mismo de la divulgación puede unirse a un epítopo de hANGPTL3 que no está directamente implicado en la actividad dirigida (por ejemplo, inhibir la actividad de la l Pl , inducir la angiogénesis y similares) de hANGPTL3 (es decir, un anticuerpo no bloqueante), pero la unión del anticuerpo o fragmento al mismo da como resultado la mejora del aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación, en comparación con el aclaramiento de hANGPTL3 en ausencia del anticuerpo o fragmento del mismo, inhibiendo, bloqueando, anulando, reduciendo o interfiriendo en, indirectamente de este modo, una actividad de hANGPTL3. El aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación puede mejorarse particularmente al combinar dos o más anticuerpos no bloqueantes diferentes que no compiten entre sí por la unión específica a hANGPTL3.
Los anticuerpos (Ab) pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv) y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol.
164:1925-1933).
En un aspecto, la divulgación comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146 y 180, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, 18, 34, 66, 82, 114 y 180. En la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:66.
En un aspecto, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154 y 188, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. En otro aspecto, el anticuerpo o parte de unión a antígeno de un anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, 26, 42, 74, 90, 122 y 188. En la invención, el anticuerpo o parte de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74.
En aspectos adicionales, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 y 180/188. En un aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de HCVR y LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 y 180/188. En la invención, el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender un par de secuencias de HCVR y LCVR de las SEQ ID NO:66/74.
En un segundo aspecto, la divulgación presenta un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complemetariedad 3 de cadena pesada (HCDR3) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152 y 186, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y una secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera (LCDR3) seleccionada del grupo que consiste en la Se Q ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160 y 194, secuencias sustancialmente similares de las mismas que tienen al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. En un aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 que comprende las SEQ ID NO:8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160 o 186/194. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 que comprende las SEQ ID NO:8/16, 24/32, 40/48, 72/80, 88/96, 120/128 y 186/194. En la invención, el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 que comprende las SEQ ID NO:72/80.
En un aspecto adicional de la divulgación, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada (HCDR1) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148 y 182, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y una secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada (HCDR2) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150 y 184, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y opcionalmente comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera (LCDR1) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156 y 190, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y/o una secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera (LCDR2) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158 y 192, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
Como alternativa, la divulgación presenta un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una combinación HCDR1/HCDR2/HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n O:4/6/8, 20/22/24, 36/38/40, 52/54/56, 68/70/72, 84/86/88, 100/102/104, 116/118/120, 132/134/136, 148/150/152 y 182/184/186; y/o una combinación LCDR1/LCDR2/LCDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:12/14/16, 28/30/32, 44/46/48, 60/62/64, 76/78/80, 92/94/96, 108/110/112, 124/126/128, 140/142/144, 156/158/160 y 190/192/194. En un aspecto, las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera comprenden una combinación de secuencias de CDR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 y 182/184/186/190/192/194. En un aspecto, las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera comprenden una combinación de secuencias de CDR de las SEQ ID NO: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 116/118/120/124/126/128 o 182/184/186/190/192/194. En una realización, las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera comprenden una combinación de secuencias de CDR de las SEQ ID NO:68/70/72/76/78/80.
En un aspecto relacionado, la divulgación comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a hANGPTL3, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende dominios de CDR de cadena pesada y ligera contenidos dentro de pares HCVR/LCVR seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 y 180/188. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácido de HCVR y LCVR son conocidas en la técnica y pueden aplicarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas divulgadas en el presente documento. Las definiciones convencionales que pueden aplicarse para identificar los límites de las CDR incluyen la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un compendio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). También están disponibles bases de datos públicas para identificar las secuencias de CDR dentro de un anticuerpo. En un aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de CDR contenidas dentro de un par de HCVR y LCVR de las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 o 180/188. En una realización de la invención, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de CDR contenidas dentro de un par de HCVR y LCVR de las SEQ ID NO:66/74, en el que las c Dr están determinadas por la definición de Kabat, la definición de Chothia o la definición de AbM.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión específica a hANGPTL3 con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende secuencias de CDR de cadena pesada y ligera contenidas en un par de secuencias HCVR/LCVR de las SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 o 180/188. En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno compite por la unión específica a hANGPTL3 con un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un par de secuencias HCVR/LCVR de las SEQ ID NO:66/74. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno compite por la unión específica a hANGPTL3 con un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una combinación de secuencias de CDR de cadena pesada y ligera seleccionada del grupo que consisten en 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 y 182/184/186/190/192/194. En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo compite por la unión específica a hANGPTL3 con un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una combinación de secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de las SEQ ID NO:68/70/72/76/78/80.
En otro aspecto relacionado, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en hANGPTL3 que es reconocido por un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de un par de secuencias HCVR/LCVR de las SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 o 180/188. En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une al mismo epítopo en hANGPTL3 que el reconocido por el anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un par de secuencias HCVR/LCVR de las SEQ ID NO:66/74. En un aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al mismo epítopo en hANGPTL3 que es reconocido por un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una combinación de secuencias de CDR de cadena pesada y ligera seleccionada del grupo que consisten en 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 y 182/184/186/190/192/194. En un aspecto, dicho epítopo es reconocido por un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una combinación de secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de las SEQ ID NO:68/70/72/76/78/80.
La divulgación presenta un anticuerpo anti-hANGPTL3 asilado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo situado dentro de la región de espira enrollada N-terminal en los restos 17 a 209 de la SEQ ID NO:161 y neutraliza, inhibe, anula, reduce o interfiere en, al menos una actividad de hANGPTL3. La divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo situado dentro de la región de espira enrollada N-terminal de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161) y neutraliza, inhibe, anula, reduce o interfiere en, al menos una actividad de hANGPTL3, anticuerpo o fragmento del mismo que no se une al péptido ANGPTL3 de la SEQ ID NO:170 (corresponde a los restos Glu32 a Leu57 de hANGPTL3 de la SEQ ID NO:161).
Anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 17 a 200, 17 a 100, 17 a 70, 17 a 65, 17 a 60, 17 a 57 o 17 a 50, de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161), opcionalmente con la condición de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se una al péptido ANGPTL3 de la SEQ ID NO:170. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a un epítopo dentro de los restos 40 a 200, 40 a 100, 40 a 70, 50 a 200, 50 a 100, 50 a 70, 58 a 200, 58 a 100, 58 a 70, 58 a 68 o 61 a 66, de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161), opcionalmente con la condición de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se una al péptido ANGPTL3 de la SEQ ID NO:170. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del anticuerpo se une a un epítopo que puede implicar más de uno de los epítopos o restos enumerados dentro de la región de espira enrollada N-terminal de hANGPTL3, opcionalmente con la condición de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se una al péptido ANGPTL3 de la SEQ ID NO:170.
En una realización adicional, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-ANGPTL3 o fragmentos de los mismos de la invención. Los vectores de expresión recombinante que portan los ácidos nucleicos de la invención, y células hospedadoras, por ejemplo, células bacterianas, tales como E. coli o células de mamífero, tales como células CHO, en las que se han introducido dichos vectores, también están abarcados por la invención, así como métodos de producción de los anticuerpos por cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y recuperar los anticuerpos producidos.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145 y 179, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1, 17, 33, 65, 81, 113 o 179. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:65.
En un aspecto de la divulgación, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una LCVR codificada por secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153 y 187, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma. En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:9, 25, 41, 73, 89, 121 o 187. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:73.
En aspectos adicionales de la divulgación, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) codificadas por un par de secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/121, 129/137, 145/153 y 179/187. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR/LCVR codificadas por un par de secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID n O:1/9, 17/25, 33/41, 65/73, 81/89, 113/121 o 179/187. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR/LCVR codificadas por un par de secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID n O:65/73.
En un aspecto, la divulgación presenta un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151 y 185, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159 y 193, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de HCDR3 y LCDR3 codificadas por el par de secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:7/15, 23/31, 39/47, 55/63, 71/79, 87/95, 103/111, 119/127, 135/143, 151/159 y 185/193. En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de HCDR3 y LCDR3 codificadas por el par de secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO:7/15, 23/31, 39/47, 71/79, 87/95, 119/127 o 185/193. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de HCDR3 y LCDR3 codificadas por el par de secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO:71/79.
En un aspecto adicional de la divulgación, el anticuerpo o fragmento del mismo comprenden un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147 y 181, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma; y un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149 y 183, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma; y opcionalmente comprende adicionalmente un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155 y 189, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma; y/o un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157 y 191, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de homología de la misma.
Como alternativa, la divulgación presenta un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una combinación HCDR1/HCDR2/HCDR3 codificada por una combinación de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:3/5/7, 19/21/23, 35/37/39, 51/53/55, 67/69/71, 83/85/87, 99/101/103, 115/117/119, 131/133/135, 147/149/151 y 181/183/185; y/o una combinación LCDR1/LCDR2/LCDR3 codificada por una combinación de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:11/13/15, 27/29/31,43/45/47, 59/61/63, 75/77/79, 91/93/95, 107/109/111, 123/125/127, 139/141/143, 155/157/159 y 189/191/193. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de CDR de cadena pesada y ligera codificadas por una combinación de secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO:67/69/71/75/77/79.
En una realización adicional, la invención presenta un anticuerpo anti-ANGPTL3 humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de secuencias de línea germinal VH, Dh y JH, y una región variable de cadena ligera (LCVR) codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de secuencias de línea germinal VK y JK, en el que la HCVR y la LCVR son codificadas por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de una combinación de genes de línea germinal seleccionados del grupo que consiste en: (i) Vh3-43, Dh3-3, Jh3, Vk1-5 y Jk2; (ii) Vh3-11, Dh1-1, Jh4, Vk1-39 y Jk4; (iii) Vh3-30, Dh1-7, Jh6, Vk1-5 y Jk1; (iv) Vh3-30, Dh1-26, Jh6, Vk1-12 y Jk3; (v) Vh3-30, Dh3-10, Jh6, Vk1-12 y Jk3; y (vi) Vh3-23, Dh3-10, Jh4, Vk1-5 y Jk1.
En una realización adicional, la invención presenta un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a hANGPTL3 con una constante de disociación en equilibrio (KD) de aproximadamente 7 nM o menos, aproximadamente 6 nM o menos, aproximadamente 5 nM o menos, aproximadamente 4 nM o menos, aproximadamente 3 nM o menos, aproximadamente 2 nM o menos, o aproximadamente 1 nM o menos, tal como se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, BIACORE™). En determinadas realizaciones, el anticuerpo de la invención exhibe una KD de 800 pM o menos, aproximadamente 700 pM o menos; aproximadamente 600 pM o menos; aproximadamente 500 pM o menos; aproximadamente 400 pM o menos; aproximadamente 300 pM o menos; aproximadamente 200 pM o menos; aproximadamente 100 pM o menos; o aproximadamente 50 pM o menos.
El anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que se une a la proteína hANGPTL3 de la SEQ ID NO:161, puede no reaccionar de forma cruzada con una proteína relacionada, tal como una proteína 4 similar a angiopoyetina humana (hANGPTL4; SEQ ID NO:164), tal como se determina mediante, por ejemplo, ELISA, ensayo de resonancia de plasmón superficial, o tecnología LUMINEX® XMAP®, como se describe en el presente documento. ANGPTL4 es otra proteína secretada que se sabe que reduce la actividad de la LPL y tiene una región de espira enrollada N-terminal y un dominio similar a fibrinógeno C-terminal (Ge et al., 2004, J Biol Chem 279: 2038-2045; Yau et al., 2009, J Biol Chem 284: 11942-11952). En otros aspectos, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una proteína hANGPTL3 y reacciona de forma cruzada con una proteína hANGPTL4. En determinados aspectos, la afinidad de unión del anticuerpo contra hANGPTL3 o fragmento del mismo a la proteína hANGPTL4 es de aproximadamente el 75 % o menos, o aproximadamente el 50 % o menos, de la afinidad de unión del anticuerpo o fragmento a la proteína hANGPTL3.
En otro aspecto relacionado, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de unión a antígeno del mismo que no reacciona de forma cruzada con ANGPTL3 de ratón (mANGPTL3; SEQ ID NO:163), o ANGPTL3 de rata (rANGPTL3; SEQ ID NO:175), pero reacciona de forma cruzada con ANGPTL3 de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) (MfANGPTL3), por ejemplo, con los 17-170 restos N-terminales de la SEQ ID NO:177 (una secuencia de aminoácidos parcial de MfANGPTL3). La invención proporciona un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento del mismo que reacciona de forma cruzada con MfANGPTL3, mANGPTL3 y rANGTPL3.
La invención abarca anticuerpos anti-hANGPTL3 que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para retirar sitios de glucosilación no deseables puede ser útil, o por ejemplo, retirada de un resto de fucosa para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, la retirada del sitio de N-glucosilación puede reducir las reacciones inmunitarias no deseables contra los anticuerpos terapéuticos, o aumentar las afinidades de los anticuerpos. En aún otras aplicaciones, puede hacerse modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En un aspecto adicional, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo de la invención, que se une específicamente a hANGPTL3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos anti-ANGPTL3 o fragmentos de los mismos, que no compiten de forma cruzada entre sí, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la composición farmacéutica puede contener dos o más anticuerpos no bloqueantes, que no compiten entre sí por la unión específica a hANGPTL3 y son eficaces para aclarar hANGPTL3 de la circulación. Las combinaciones adecuadas de anticuerpos no bloqueantes incluyen, pero sin limitación, una combinación de anticuerpos que comprenden pares de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) de: (i) SEQ ID NO:82/90 y 180/188, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 114/122 y 180/188, respectivamente; (iii) SEQ ID n O:82/90 y 18/26, respectivamente; o (iv) SEQ ID NO:114/122 y 18/26, respectivamente.
En realizaciones relacionadas, la invención presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser uno o más de cualquier agente tal como (1) inhibidores de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa, tales como cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, y similares; (2) inhibidores de la captación de colesterol y/o la reabsorción de ácidos biliares; (3) niacina, que aumenta el catabolismo de lipoproteínas; (4) fibratos o ácidos carboxílicos anfipáticos, que reducen el nivel de lipoproteína de baja densidad (LDL), mejoran los niveles de lipoproteína de alta densidad (HDL) y TG, y reducen el número de ataques cardiacos no mortales; y (5) activadores del factor de transcripción LXR que juega un papel en la eliminación del colesterol tal como 22-hidroxicolesterol, o combinaciones fijas tales como ezetimiba más simvastatina; una estatina con una resina biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam), una combinación fija de niacina más una estatina (por ejemplo, niacina con lovastatina); o con otros agentes reductores de lípidos, tales como los ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, omacor). Además, el segundo agente terapéutico puede ser uno o más inhibidores de ANGPTL3 diferentes, así como inhibidores de otras moléculas, tales como ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 y proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), que están implicados en el metabolismo de lípidos, en particular, la homeostasia del colesterol y/o los triglicéridos. Los inhibidores de estas moléculas incluyen moléculas pequeñas y anticuerpos que se unen específicamente a estas moléculas y bloquean su actividad.
En realizaciones relacionadas, el segundo agente terapéutico puede ser uno o más agentes antineoplásicos, tales como agentes quimioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes apoptóticos, y otros agentes bien conocidos en la técnica para tratar el cáncer u otras enfermedades o trastornos proliferativos, así como otros agentes terapéuticos, tales como analgésicos, agentes antiinflamatorios, incluyendo fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como inhibidores de Cox-2 y similares, para mitigar y/o reducir los síntomas que acompañan al cáncer/tumor subyacente.
En un aspecto adicional, la divulgación presenta métodos para neutralizar, inhibir, bloquear, anular, reducir o interferir en, la actividad de hANGPTL3 usando uno o más anticuerpos anti-hANGPTL3 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la divulgación. En un aspecto, la divulgación proporciona un método terapéutico que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos anti-hANGPTL3 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la divulgación y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales descritos anteriormente. Los anticuerpos anti-ANGPTL3 o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos neutralizantes o anticuerpos no bloqueantes contra ANGPTL3, o combinaciones de los mismos.
En aspectos relacionados, la divulgación proporciona métodos de mejora del aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación de un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto al menos dos anticuerpos antihANGPTL3 o fragmentos de los mismos que no compiten entre sí por la unión a hANGPTL3 y preferentemente no bloquean al menos una actividad de hANGPTL3 (es decir, anticuerpos no bloqueantes). Al menos una actividad de hANGPTL3 referida incluye, pero sin limitación, inhibir la actividad de la LPL, inducir la angiogénesis, y similares. En un aspecto, una combinación de al menos dos anticuerpos anti-hANGPTL3 no bloqueantes o fragmentos de los mismos mejora el aclaramiento de hANGPTL3 de la circulación en al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o aproximadamente un 80 %, con respecto a no administrar los anticuerpos o fragmentos. Los niveles circulantes de hANGPTL3 se pueden medir mediante ensayos in vitro bien conocidos en la técnica y los descritos en el presente documento. En otro aspecto, la combinación de al menos dos anticuerpos anti-hANGPTL3 no bloqueantes comprende pares de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) de: (i) SEQ ID NO:82/90 y 180/188, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 114/122 y 180/188, respectivamente; (iii) SEQ ID NO:82/90 y 18/26, respectivamente; o (iv) SEQ ID NO:114/122 y 18/26, respectivamente.
La enfermedad o trastorno tratable mediante los métodos descritos en el presente documento es cualquier enfermedad o afección que se mejora, se mitiga, se inhibe o se previene, o cuya tasa de aparición se reduce, en comparación con aquella sin tratamiento con anticuerpo anti-hANGPTL3 (por ejemplo, enfermedades o trastornos mediados por ANGPTL3), retirando, inhibiendo, reduciendo o interfiriendo de otro modo en, la actividad de ANGPTL3. Los ejemplos de enfermedades o trastornos tratables con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, aquellos que implican el metabolismo de lípidos, tales como hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y dislipidemia, incluyendo dislipidemia aterogénica, dislipemia diabética, hipertrigliceridemia, hipertrigliceridemia grave con TG > 1000 mg/dl, hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia mixta (obesidad, síndrome metabólico, diabetes, etc.), lipodistrofia, lipoatrofia y similares, causadas por, por ejemplo, disminución de la actividad de LPL y/o deficiencia de l Pl , disminución de la actividad del receptor de LDL (Ld l R) y/o deficiencia del receptor de LDL (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar homocigótica con LDLR'/'), ApoC2 alterada, deficiencia de ApoE, aumento de ApoB, aumento de la producción y/o disminución de la eliminación de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), ciertos tratamientos farmacológicos (por ejemplo, dislipidemia inducida por el tratamiento con glucocorticoides), cualquier predisposición genética, dieta, estilo de vida y similares. Los métodos también pueden prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados o resultantes de hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia y/o dislipidemia, incluyendo, pero sin limitación, enfermedades o trastornos cardiovasculares, tales como aterosclerosis, aneurisma, hipertensión, angina, ictus, enfermedades cerebrovasculares, insuficiencia cardíaca congestiva, arteriopatías coronarias, infarto de miocardio, vasculopatías periféricas y similares; pancreatitis aguda; esteatohepatitis no alcohólica (NASH); trastornos de la glucemia, tales como diabetes; obesidad, y similares.
Otros ejemplos de enfermedades o trastornos tratables mediante los métodos incluyen cáncer/tumor, así como enfermedades o trastornos asociados con angiogénesis no neoplásicos, incluyendo enfermedades o trastornos angiogénicos oculares, tales como degeneración macular relacionada con la edad, oclusión de la vena central retiniana u oclusión de una rama de la vena retiniana, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro y similares, enfermedades o trastornos inflamatorios, tales como artritis, artritis reumatoide (AR), psoriasis y similares.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra un alineamiento de secuencia de los péptidos 1-3 usados en un experimento de unión a anticuerpo anti-hANGPTL3 (ejemplo 5) contra las partes relevantes de la secuencia de hANGPTL3 (es decir, dentro de los restos 30 a 70 de la SEQ ID NO:161 o GenBank #NP_055310). Péptido 1 (control: péptido ANGPTL4; SEQ ID NO: 168); Péptido 2 (péptido ANGPTL3; SEQ ID NO: 169); y Péptido 3 (péptido ANGPTL3; SEQ ID NO: 170).
La figura 2 muestra los resultados de la unión del anticuerpo anti-hANGPTL3 a los péptidos de la espira enrollada N-terminal de hANGPTL3 (Péptidos 2 y 3) o hANGPTL4 (Péptido Control de Isotipo; y ■: anticuerpo H4H1276S.
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención con detalle, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.
Definiciones
La expresión "proteína 3 similar a angiopoyetina humana" o "hANGPTL3", como se usa en el presente documento, se refiere a ANGPTL3 que tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO:162 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:161, o un fragmento biológicamente activo de las mismas.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región constante de cadena pesada (Ch; compuesta por los dominios Ch1, Ch2 y Ch3). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región constante de cadena ligera (Cl). Las regiones HCVR y LCVR se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones marco (FR). Cada HCVR y LCVR se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9: 133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR realmente entran en contacto con el antígeno. Padlan también descubrió muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenían aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).
Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno se pueden identificar basándose en estudios anteriores (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDRH2 a menudo no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de CDR de Chothia, por modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR o uno o más restos de la misma, generalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para la sustitución dentro de CDR y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los mAb humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir mAb en que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón), se han injertado en secuencias FR humanas.
Los anticuerpos anti-hANGPTL3 completamente humanos divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de línea germinal correspondiente. Dichas mutaciones pueden averiguarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en este documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en este documento, en las que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácido conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se mencionan en este documento colectivamente como "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo con las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en este documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más retromutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos, todos los restos marco y/o CDR dentro de los dominios VH y/o VL mutan de vuelta a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal humana de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros aspectos, únicamente determinados restos mutan de vuelta a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más de los restos del marco y/o la CDR se mutan al o los restos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la que se derivó originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en las que ciertos restos individuales son mutado a los restos correspondientes de una secuencia de línea germinal particular mientras que determinados otros restos que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o son mutados al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de línea germinal pueden ensayarse fácilmente para una o más propiedades deseadas, tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión aumentada, propiedades biológicas agonistas o antagonistas (según sea el caso) mejoradas o potenciadas, inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados dentro de la presente descripción.
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-ANGPTL3 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-ANGPTL3 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, 2 o 1, sustituciones de aminoácidos conservativas con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento. En un aspecto, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:487 con 10 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En otros aspectos, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:487 con 8 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En otros aspectos, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:487 con 6 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En otro aspecto, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:487 con 4 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En otro aspecto más, una HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:487 con 2 o 1 sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En un aspecto, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44 con 10 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En otro aspecto, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44 con 8 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En otro aspecto, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44 con 6 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En otro aspecto, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44 con 4 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior. En otro aspecto más, una LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44 con 2 o 1 sustituciones de aminoácidos conservativas en su interior.
Salvo que se indique específicamente de otra manera, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, debe entenderse que abarca moléculas de anticuerpo que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas de anticuerpo completas"), así como fragmentos de unión a antígeno de las mismas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, y similares, como se usan en este documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado genéticamente, que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden derivarse, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica estándar adecuada, tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que impliquen la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y (opcionalmente) constantes de anticuerpos. Dicho ADN es conocido y/o está fácilmente disponible de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, bibliotecas de anticuerpos de presentación en fagos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o utilizando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para organizar uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 limitado. Otras moléculas genomanipuladas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de CDR injertada, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también están abarcados dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno," como se usa en este documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprenderá típicamente al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Los ejemplos, no limitativos, de configuraciones de dominios variables y constantes que se pueden encontrar dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-CH3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ejemplares enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una bisagra completa o parcial o región conectora. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que producen una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Asimismo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Como con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en los que cada dominio variable puede unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ejemplares divulgados en este documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden estar conjugados a un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunodepresor o un radioisótopo.
La expresión "se une específicamente", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede caracterizarse por una constante de disociación en equilibrio (Kd) de aproximadamente 1x10‘6 M o menos (es decir, una Kd más pequeña indica una unión más estrecha). Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial, y similares. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a hANGPTL3 puede, sin embargo, exhibir reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de ANGPTL3 de otras especies, por ejemplo, ANGPTL3 de macaco cangrejero, ANGPTL3 de ratón, ANGPTL3 de rata, y/o hANGPTL4 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:164. Asimismo, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) que se unen a hANGPTL3 y uno o más antígenos adicionales se consideran, no obstante, anticuerpos que "se unen específicamente a" hANGPTL3, como se usa en este documento.
La expresión anticuerpo "de alta afinidad" se refiere a aquellos anticuerpos que tienen una afinidad de unión a hANGPTL3, expresada como Kd, de aproximadamente 2x10-9 M o menos, aproximadamente 1,5x10-9 M o menos, aproximadamente 1x10-9 M o menos, aproximadamente 0,5x10-9 M o menos, aproximadamente 0,25x10-9 M o menos, aproximadamente 1x10-10 M o menos, o aproximadamente 0,5x10-10 M o menos, tal como se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA por afinidad en solución.
El término "Kd", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.
Por la expresión "disociación lenta", "Koff" o "kd" se entiende un anticuerpo que se disocia de hANGPTL3 con una constante de velocidad de 4 x 10-3 s-1 o menos, 3 x 10-3 s-1 o menos, 2 x 10-3 s-1 o menos, 1 x 10-3 s-1 o menos, 1 x 10­ 4 s-1 o menos, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™.
Por la expresión "constante de afinidad intrínseca" o "ka" se entiende un anticuerpo que se asocia con hANGPTL3 a una constante de velocidad de aproximadamente 1 x 103 M-1s-1 o mayor, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que es sustancialmente libre de otros mAb que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une de manera específica a hANGPTL3 es sustancialmente libre de mAb que se unen de manera específica a antígenos que no sean hANGPTL3). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a hANGPTL3 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de ANGPTL3 de otras especies, tales como macaco cangrejero, ratón, rata, y/u otras proteínas relacionadas, tales como ANGPTL4 humana.
Un anticuerpo "neutralizante", "bloqueante" o "anulante", como se usa en el presente documento (o un anticuerpo que "neutraliza", "bloquea" o "anula" la actividad de ANGPTL3), pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión a ANGPTL3 da como resultado la inhibición directa de al menos una actividad biológica de ANGPTL3, tal como se evalúa mediante ensayos in vitro estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, véase los ejemplos más adelante). Los términos, "neutralizar", "inhibir", "bloquear" y "anular", pueden usarse en el presente documento indistintamente. Un anticuerpo "no bloqueante" se refiere a un anticuerpo cuya unión a ANGPTL3 no bloquea directamente una actividad dirigida de ANGPTL3 tal como se evalúa por ensayos in vitro estándar, pero aun así puede ser un anticuerpo "interferente" cuya unión a ANGPTL3 produce inhibición indirecta, reducción, atenuación u otra interferencia de al menos una actividad biológica de ANGPTL3 in vivo, por ejemplo, mejorando el aclaramiento de ANGPTL3 de la circulación. El aclaramiento de ANGPTL3 de la circulación puede mejorarse particularmente mediante una combinación de al menos dos anticuerpos no bloqueantes. La neutralización, inhibición, anulación, reducción, atenuación o interferencia de una actividad biológica de ANGPTL3 puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de actividad biológica de ANGPTL3 por uno o más de varios ensayos in vitro o in vivo estándar conocidos en la técnica (véase también los ejemplos más adelante).
La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real por detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).
El término "epítopo" es una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos por aminoácidos no lineales. En determinadas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son grupos de moléculas químicamente activas en la superficie tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 90 %, y más preferentemente al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, medida por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se analiza a continuación.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco por defecto, comparten al menos un 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de grado de similitud puede ajustarse a la alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol.
24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácido conservativa son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquiera cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas acopla secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) anteriormente citado). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389, 402.
Por la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, la edad y el tamaño del sujeto tratado, la vía de administración y similares y la podrá averiguar un experto en la materia usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos se conocen en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a ANGPTL3.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra ANGPTL3 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo la afinidad, selectividad, epítopo, y similares.
En general, los anticuerpos de la presente invención poseen altas afinidades, poseyendo típicamente una Kd de aproximadamente 10'12 M a aproximadamente 10'9 M, cuando se miden mediante unión a antígeno inmovilizado sobre fase sólida o en fase en solución. Las regiones constantes de ratón son reemplazadas con regiones constantes humanas deseadas, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre, o IgG1 o IgG4 modificadas, para generar los anticuerpos completamente humanos de la invención. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana de los anticuerpos residen en la región variable.
Cartografiado de epítopos y tecnologías relacionadas
Para explorar para anticuerpos que se unen con un epítopo particular, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otros métodos incluyen mutantes de barrido de alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), o análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).
El término "epítopo"se refiere a un lugar sobre un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos típicamente se mantienen al tratarlos con disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante plegamiento terciario típicamente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
El perfilado asistido por modificación (MAP), también conocido como perfilado de anticuerpos basado en la estructura del antígeno (ASAP) es un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo único diferente o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de mAb genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en mAb genéticamente distintos. Cuando se aplica al cribado de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen mAb que tienen las características deseadas. MAP se puede usar para clasificar los mAb anti-ANGPTL3 de la invención en grupos de mAb que se unen a diferentes epítopos.
ANGPTL3 contiene un dominio de espira enrollada amino-terminal y un dominio similar a fibrinógeno (FD) carboxiloterminal y la proteína ANGPTL3 forma un oligómero en ausencia de enlaces disulfuro intermoleculares (Ge et al., 2005, J Lipid Res 46:1484-1490). Se ha notificado de que el dominio de espira enrollada N-terminal es importante en la inhibición de la actividad de la LPL (Ono et al., 2003, J Biol Chem 278: 41804-41809). El anticuerpo anti-hANGPTL3 o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación se une a un epítopo dentro del dominio de espira enrollada N-terminal (restos 17-209) de hANGPTL3 (SEQ ID NO: 161) y neutraliza al menos una actividad de hANGPTL3 (por ejemplo, inhibición de la actividad de la LPL). El anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo dentro del dominio de espira enrollada N-terminal de hANGPTL3 y neutraliza al menos una actividad de hANGPTL3, con la condición de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se una al péptido ANGPTL3 de la SEQ ID NO:170. El anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse específicamente a un epítopo dentro de los restos 17 a 200, 17 a 100, 17 a 70, 17 a 65, 17 a 60, 17 a 57, 17 a 55, 17 a 50, 17 a 45, 17 a 40, o 17 a 35, de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161), opcionalmente con la condición de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se una al péptido ANGPTL3 de la SEQ ID NO:170. El anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse específicamente a un epítopo dentro de los restos 40 a 200, 40 a 100, 40 a 70, 50 a 200, 50 a 100, 50 a 70, 58 a 200, 58 a 100, 58 a 70, 58 a 68, o 61 a 66 (conocido como "motivo de unión a heparina") de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161), opcionalmente con la condición de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se una al péptido ANGPTL3 de la SEQ ID NO:170. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del anticuerpo se une a un epítopo que puede implicar más de uno de los epítopos o restos enumerados dentro de la región de espira enrollada N-terminal de hANGpTL3, opcionalmente con la condición de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se una al péptido ANGPTL3 de la SEQ ID NO:170.
En otros aspectos de la divulgación, el anticuerpo contra hANGPTL3 o fragmento del mismo se une a uno o más fragmentos de hANGPTL3, por ejemplo, un fragmento de al menos 5 restos, al menos 7 restos, al menos 10 restos, al menos 20 restos, al menos 30 restos, al menos 50 restos, al menos 70 restos, al menos 100 restos, al menos 150 restos o al menos 200 restos, de hANGPTL3 (SEQ ID NO:161), opcionalmente con la condición de que el anticuerpo o fragmento del mismo no se una al péptido ANGPTL3 de la s Eq ID NO:170.
La presente divulgación incluye anticuerpos contra hANGPTL3 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento. Asimismo, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-hANGPTL3 que compiten por la unión a hANGPTL3 o un fragmento de hANGPTL3 con cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento.
Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido hANGPTL3 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse a la molécula hANGPTL3. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a hANGPTL3 después de unión por saturación con el anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula hANGPTL3 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-hANGPTL3 de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: en una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula hANGPTL3 en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula hANGPTL3. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula hANGPTL3 en condiciones de saturación seguido por evaluación del anticuerpo de referencia a la molécula ANGPTL3. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula ANGPTL3, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a hANGPTL3. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopos solapantes si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso de factor 1, 5-, 10-, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente un 75 %, 90 % o incluso un 99 % medida en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Entonces puede realizarse experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, r Ia , resonancia del plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica.
Inmunoconjugados
La invención abarca un anticuerpo monoclonal anti-ANGPTL3 humano conjugado con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunodepresor o un radioisótopo. Los agentes de citotoxina incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos de agentes de citotoxina adecuados y agentes quimioterapéuticos para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica, véase por ejemplo, documento WO 05/103081.
Biespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los mAb multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol.
147:60-69. Los mAb anti-hANGPTL3 humanos pueden unirse a o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.
Un formato de anticuerpo biespecífico ejemplar que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en el que el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig se une a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo bi-específico descrito anteriormente.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-hANGPTL3 y fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían respecto a las de los mAb descritos, pero que conservan la capacidad de unión a ANGPTL3 humana. Dichos mAb variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los mAb descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-hANGPTL3 de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-hANGPTL3 o fragmento de anticuerpo de la divulgación. Los ejemplos de dichas secuencias variantes de aminoácido y ADN se analizan anteriormente.
Dos proteínas de unión a antígeno o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su tasa de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcado, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado. En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.
En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con tratamiento continuado sin dicho cambio.
En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que sea correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-hANGPTL3 de la divulgación pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o eliminando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica pueden eliminarse o remplazarse con otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización.
Administración terapéutica y formulaciones
La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-hANGPTL3 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención y también se refiere a métodos terapéuticos que los usan. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares mejoradas. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, lípidos (catiónicos o aniónicos) que contienen vesículas (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de grasa en agua y agua en grasa, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversas masas moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contiene Carbowax. Véase también, Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis puede variar dependiendo de la edad y el tamaño de un sujeto a recibir la administración, la enfermedad diana, la finalidad del tratamiento, las condiciones, la vía de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se usa para tratar diversas afecciones y enfermedades asociadas directa o indirectamente con ANGPTL3, incluyendo hipercolesterolemia, trastornos asociados con LDL y apolipoproteína B, y trastornos del metabolismo de lípidos, y similares, en un paciente adulto, es ventajoso administrar por vía intravenosa o por vía subcutánea el anticuerpo de la presente invención en una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, la frecuencia y la duración del tratamiento, pueden ajustarse. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención puede administrarse como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 800 mg, aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg, o aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg, hasta aproximadamente 100 mg, o hasta aproximadamente 50 mg. En determinadas realizaciones, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en la que las dosis posteriores están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composiciones farmacéuticas de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véanse Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365; Lopez-Berestein, ibíd., págs. 317-327; véase generalmente en el mismo lugar).
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, anteriormente citado; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede ubicarse en proximidad de la diana de la composición, requiriendo por tanto solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138, 1984).
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos para el público. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal, descrita anteriormente, en un medio acuoso estéril o un medio oleoso convencionalmente usado para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleaginoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se llena preferentemente en una ampolla apropiada. Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de administración de pluma ya tiene aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de administración de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración de pluma entonces puede reutilizarse. En un dispositivo de administración de pluma desechable, no hay un cartucho reemplazable. En su lugar, el dispositivo de administración de pluma desechable viene prellenado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.
Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, aunque ciertamente sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), DISETRo N iC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma Bd ™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTlPEN STARLET™ y OpTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, aunque ciertamente sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly).
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los ingredientes activos. Dichas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 800 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, El anticuerpo mencionado anteriormente está contenido en de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, en de aproximadamente 5 a 300 mg, en de aproximadamente 8 a 200 mg, y en de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg para las otras formas de dosificación.
Terapias de combinación
La invención proporciona además anticuerpos contra hANGPTL3 o fragmentos de los mismos de la invención en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales para uso en métodos terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos, como se define en las reivindicaciones, que están asociados directa o indirectamente con hANGPTL3. El agente terapéutico adicional puede ser uno o más de cualquier agente que se combine ventajosamente con uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, incluyendo inhibidores de la HMG-CoA reductasa, tales como cerovastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, y similares; niacina; diversos fibratos, tales como fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, clofibrato, gemfibrozil, y similares; activadores del factor de transcripción LXR, y similares. Además, el anticuerpo hANGPTL3 o fragmento del mismo de la invención puede coadministrarse con otros inhibidores de ANGPTL3 así como con inhibidores de otras moléculas, tales como ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 y proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), que están implicados en el metabolismo de lípidos, en particular, la homeostasia del colesterol y/o los triglicéridos. Los inhibidores de estas moléculas incluyen moléculas pequeñas y anticuerpos que se unen específicamente a estas moléculas y bloquean su actividad (véase, por ejemplo, los anticuerpos anti-PCSK9 divulgados en el documento U.S. 2010/0166768 A1).
Además, el agente terapéutico adicional puede ser uno o más agentes antineoplásicos, tales como agentes quimioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes apoptóticos, y otros agentes bien conocidos en la técnica para tratar el cáncer u otras enfermedades o trastornos proliferativos. Los ejemplos de agentes antineoplásicos incluyen, pero sin limitación, un agente antimitótico, tal como docetaxel, paclitaxel, y similares; un compuesto quimioterapéutico a base de platino, tal como cisplatino, carboplatino, iproplatino, oxaliplatino, y similares; u otro agente citotóxico convencional, tal como 5-fluorouracilo, capecitabina, irinotecán, leucovorina, gemcitabina, y similares, y agentes antiangiogénicos, incluyendo antagonistas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), tales como anticuerpos anti-VEGF, por ejemplo, bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) y un bloqueante basado en receptor de VEGF, por ejemplo, la "trampa de VEGF" descrita en la patente de Estados Unidos n.° 7.070.959, antagonistas del ligando 4 de tipo delta (DII4), tales como anticuerpos anti-DII4 como se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 2008/0181899, y una proteína de fusión que contiene el dominio extracelular de DII4, por ejemplo, DII4-Fc como se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 2008/0107648; inhibidores de tirosina cinasa receptora y/o la angiogénesis, incluyendo sorafenib (NEXAVAR® de Bayer Pharmaceuticals Corp.), sunitinib (SUTENT® de Pfizer), pazopanib (VOTRIENT™ de GlaxoSmithKline), toceranib (PALLADIA™ de Pfizer), vandetanib (ZACTIMA™ de AstraZeneca), cediranib (RECENTIN® de AstraZeneca), regorafenib (BAY 73-4506 de Bayer), axitinib (AG013736 de Pfizer), lestaurtinib (CEP-701 de Cephalon), erlotinib (TARCEVA® de Genentech), gefitinib (IREs Sa ™ de AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK™ de Boehringer Ingelheim), lapatinib (TYKERB® de GlaxoSmithKline), neratinib (HKI-272 de Wyeth/Pfizer), y similares, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Además, otros agentes terapéuticos, tales como analgésicos, agentes antiinflamatorios, incluyendo fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como inhibidores de Cox-2 y similares, también pueden coadministrarse con el anticuerpo contra hANGPTL3 o fragmento del mismo de la invención para mitigar y/o reducir los síntomas que acompañan al cáncer/tumor subyacente.
El anticuerpo contra hANGPTL3 o fragmento del mismo de la invención y el agente o agentes terapéuticos adicionales pueden coadministrarse juntos o por separado. Cuando se usan formulaciones de dosificación separadas, el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención y los agentes adicionales pueden coadministrarse de forma concurrente o por separado en momentos escalonados, es decir, secuencialmente, en órdenes apropiados.
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-ANGPTL3 de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir ANGPTL3 en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un Ab anti-ANGPTL3, o fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión aberrante (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de ANGPTL3. Los ensayos de diagnóstico ejemplares para ANGPTL3 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra obtenida de un paciente, con un Ab anti-ANGPTL3 de la invención, en el que el anticuerpo anti-ANGPTL3 está marcado con una marca detectable o molécula informadora o se usa para capturar y aislar selectivamente la proteína ANGPTL3 de las muestras del paciente. Como alternativa, puede usarse un Ab anti-ANGPTL3 no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. la marca detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, 131I o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano rusticano o luciferasa. Los ensayos que pueden usarse para detectar o medir ANGPTL3 en una muestra incluyen ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), separación de células activadas por fluorescencia (FACS) y similares.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación completa y descripción de la manera en que preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los autores de la invención consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados, pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados Celsius y la presión es en o cerca de atmosférica.
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos humanos contra ANGPTL3 humano
Se inmunizaron ratones VELOCIMMUNE™ con ANGPTL3 humana, y la respuesta inmunitaria del anticuerpo se supervisó mediante inmunoensayo específico de antígeno usando suero obtenido de estos ratones. Se recogieron linfocitos B que expresaban anti-hANGPTL3 de los bazos de ratones inmunizados que mostraron tener títulos elevados de anticuerpos anti-hANGPTL3 y se fusionaron con células de mieloma de ratón para formar hibridomas. Los hibridomas se cribaron y se seleccionaron para identificar líneas celulares que expresaban anticuerpos específicos para hANGPTL3 usando ensayos como se describe a continuación. Los ensayos identificaron varias líneas celulares que produjeron anticuerpos anti-hANGPTL3 quiméricos, por ejemplo, H1M896N.
Los anticuerpos específicos para ANGPTL3 humana también se aislaron directamente de linfocitos B inmunizados con antígenos sin fusión a células de mieloma, tal como se describe en el documento U.S. 2007/0280945 A1. Se clonaron regiones variables de cadena pesada y ligera para generar anticuerpos anti-hANGPTL3 completamente humanos del isotipo IgG4 designados H4H1248P, H4H1250P, H4H1263S, H4H1268S, H4H1276S, H4H1279P, H4H1282P, H4H1292P, H4H1295P y H4H1296P. Se establecieron líneas celulares de CHO que expresaban anticuerpo recombinantes.
Ejemplo 2. Análisis de utilización de genes variables
Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables del anticuerpo se clonaron y secuenciaron. A partir de la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, se identificó el uso genes para cada región variable de cadena pesada (HCVR) y región variable de cadena ligera (LCVR). La tabla 1 muestra el uso de genes para anticuerpos seleccionados de acuerdo con la invención.
Tabla 1
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La tabla 2 muestra las parejas de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-hANGPTL3 seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes. Las denominaciones N, P y S se refieren a anticuerpos que tienen cadenas pesadas y ligeras con secuencias CDR idénticas, pero con variaciones de secuencia en las regiones que están fuera de las secuencias CDR (es decir, las regiones marco). Por tanto, las variantes N, P y S de un anticuerpo particular tienen secuencias CDR idénticas dentro de sus regiones variables de cadena pesada y ligera, pero contienen modificaciones dentro de las regiones marco.
Tabla 2
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Ejemplo 3. Parámetros cinéticos de anticuerpos anti-hANGPTL3 que se unen a ANGPTL3
Todos los experimentos de unión cinéticos se realizaron a 25 °C o 37 °C en un instrumento de interacción molecular BIACORE™ T200 sin marcador (GE Healthcare) usando un chip sensor CM5. En resumen, se generó una superficie de captura de antígenos acoplando coval enteme nte un anticuerpo específico de IgG anti-ratón (anti-mFc; GE Healthcare; n° de catálogo BR-1008-38) o un anticuerpo específico anti-pentahistidina (Qiagen; n° de catálogo 34660) a la superficie de un chip sensor CM5 usando un método de acoplamiento de amina convencional. Usando HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) o PBSP (fosfato de sodio 10 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM, tensioactivo P20 al 0,025 %, pH 7,2 o 5,75) como tampón de migración, se capturaron ANGPTL3 humana y de especies variantes con marcas de oligohistidina sobre la superficie acoplada anti-pentahistidina hasta que se consiguió una respuesta de unión de 4,4-46,5 RU. Las proteínas recombinantes capturadas fueron: ANGPTL3 humana madura de longitud completa (es decir, restos de aminoácidos 17-460 de la SEQ ID NO:161) con una marca de decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, MN; n.° de catálogo 3829-AN], dominio de espira enrollada N-terminal de hANGPTL3 (es decir, restos de aminoácidos 17-170 de la SEQ ID NO:161) que contiene una marca de hexahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-170)-His], dominio de espira enrollada N-terminal de ANGPTL3 de Macaca fascicularis [es decir, restos de aminoácidos 17-170 de la SEQ ID NO:177 (una secuencia parcial de ANGPTL3 de Macaca fascicularis)] que contiene una marca myc-myc-hexahistidina [MfANGPTL3(17-170)-mmH; SEQ ID NO:167], ANGPTL3 madura de longitud completa de Mus musculus (es decir, restos de aminoácidos 17-455 de la SEQ ID NO:163) con una marca de decahistidina C-terminal [mANGPTL3(17-455)-His; R&D Systems, MN; n.° de catálogo 136-AN], dominio de espira enrollada N-terminal de ANGPTL3 de Mus musculus (es decir, restos de aminoácidos 17-240 de la SEQ ID NO:163) que contiene una marca de hexahistidina [mANGPTL3(17-240)-His]; SEQ ID NO:166], y dominio de espira enrollada N-terminal de ANGPTL3 de Rattus norvegicus (es decir, restos de aminoácidos 17-240 de la SEQ ID NO:175) que contiene una marca myc-mychexahistidina [rANGPTL3(17-240)-mmH; SEQ ID NO:176]. Además, el dominio de espira enrollada N-terminal de hANGPTL3 (es decir, restos de aminoácidos 17-169 de la SEQ ID NO:161) que contiene una fusión Fc de ratón C-terminal [hANGPTL3(17-169)-mFc; SEQ ID NO:165] se capturó sobre la superficie acoplada anti-mFc hasta que se consiguió una respuesta de unión de 24,8 ± 1,5 RU. Para medir las velocidades de asociación y disociación para la formación del complejo anticuerpo/antígeno, se inyectaron concentraciones de anticuerpo únicas (tablas 3 y 7) o múltiples (tablas 4-6) a través de la superficie de la proteína capturada a un caudal de 50 pl/minuto durante 3 minutos y la disociación del complejo se supervisó durante 20 minutos. Los datos de unión se procesaron y se ajustaron a un modelo de unión 1:1 con transporte masivo usando Scrubber versión 2.0a (BioLogic Software). Las semividas cinéticas (t1/2) se calcularon a partir de la constante de velocidad de disociación, kd.
La tabla 3 muestra la unión de diversos anticuerpos anti-ANGPTL3 a hANGPTL3 a 25 °C, pH 7,4, en tampón HBS-EP.
Tabla 3
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Tal como se muestra en la Tabla 3, los anticuerpos anti-hANGPLT3 se unen a la proteína de longitud completa con una marca de decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His] con constantes de disociación en equilibrio calculadas (KD = kd/ka) que varían entre 96,8 pM y 5,62 nM y hasta el dominio de espira enrollada N-terminal con una fusión Fc C-terminal [hANGPTL3(17-169)-mFc] con KD que varían entre 8,41 pM y 6,23 nM.
Las tablas 4 y 5 muestras la unión cruzada entre especies de H4H1276S a ANGPTL3 a 25 °C y 37 °C, respectivamente, a pH 7,4, en tampón HBS-EP. La tabla 6 muestra la unión de H4H1276S a ANGPTL3 humana y de macaco, a 25 °C o 37 °C, a pH 5,75 o pH 7,2, en tampón PBSP.
Tabla 4
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Tabla 5
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Tabla 6
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Como se muestra en las tablas 4-6, el anticuerpo H4H1276S mostró unión a ANGPTL3 de macaco, ratón y rata con afinidades de unión y constantes cinéticas similares a las de la unión a ANGPTL3 humana.
La tabla 7 muestra la unión de anticuerpos anti-ANGPTL3 seleccionados a hANGPTL3 y mANGPTL3 a 37 °C, pH 7,4, en tampón HBS-EP. NB: No unido.
Tabla 7
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Tal como se muestra en la Tabla 7, los anticuerpos anti-hANGPLT3 se unen a la proteína de longitud completa con una marca de decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His] a pH 7,4 y 37 °C con constantes de disociación en equilibrio calculadas (Kd = kd/ka) que varían entre 158 pM y 1,02 nM y hasta ANGPTL3 de ratón [mANGPTL3(17-455)-His] con Kd que varían entre 167 pM y 682 pM, excepto para H4H1248P y H4H1263S, que no mostraron unión detectable a mANGPTL3. También se muestran las semividas cinéticas (t1/2).
Ejemplo 4. Estudio de competencia cruzada de Biacore para anticuerpos anti-ANGPTL3
Se realizaron experimentos de competencia cruzada a 25 °C en un Biacore esencialmente como se ha descrito en el ejemplo 3 anterior. En resumen, usando HBS-EP como tampón de migración, hANGPTL3 de longitud completa (es decir, restos de aminoácidos 17-460 de la SEQ ID NO: 161) con una marca de decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, MN; n° de catálogo 3829-AN] se capturó sobre la superficie acoplada con anti-penta-histidina hasta que se consiguió una respuesta de unión de 64 RU. Para determinar si dos anticuerpos podían unirse simultáneamente a la ANGPTL3 capturada, los pares de anticuerpos se inyectaron secuencialmente, cada uno a 167 nM a un caudal de 4 pl/minuto durante 15 minutos, sobre la superficie, y la señal de respuesta de unión máxima (RU) se midió para cada acontecimiento de unión. Los resultados se muestran en la tabla 8 con respuesta de unión para el primer anticuerpo (mAb1), seguida de respuesta de unión del segundo anticuerpo (mAb2) en la superficie de ANGPTL3 precargada con el primer anticuerpo. Los números en negrita indican que los pares de anticuerpos pueden unirse a hANGPTL3 simultáneamente. Los números en cursiva indican que los pares de anticuerpos pueden unirse a hANGPTL3 simultáneamente cuando se añaden secuencialmente en una dirección pero no en la otra. Los corchetes indican autocompetencia.
Tabla 8
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Tal como se muestra en la Tabla 8, los pares de anticuerpos H1M896N/H4H1279P y H1M896N/H4H1292P fueron capaces de unirse simultáneamente a ANGPTL3 inmovilizado, independientemente del orden de adición de los anticuerpos. H4H1250P se unió a ANGPTL3 unido previamente con H4H1279P; sin embargo, cuando se invirtió el orden de adición de anticuerpos, H4H1279P exhibió una señal de unión aproximadamente el 24 % de la respuesta máxima esperada después de que ANGPTL3 se uniera previamente con H4H1250P. De manera similar, H4H1250P se unió a ANGPTL3 unido previamente con H4H1292P; sin embargo, cuando se invirtió el orden de adición de anticuerpos, H4H1292P mostró una señal de unión de aproximadamente el 20 % de la respuesta máxima esperada después de que el ANGPTL3 se uniera previamente con H4H1250P.
Ejemplo 5. Unión del anticuerpo anti-hANGPTL3 a péptidos de espira enrollada N-terminal de ANGPTL3
Para evaluar la unión del anticuerpo anti-ANGPTL3 H4H1276S a péptidos derivados de la región de la espira enrollada N-terminal de ANGPTL3, se realizó un ensayo de unión a biosensor libre de marcador usando el sistema OCTET® RED (FortéBio, Inc.). Para la inmovilización sobre el sensor, los péptidos se marcaron con una marca de biotina N-terminal [separada por un enlazador flexible, aminoácidos "AGSSPGG" (SEQ ID NO: 171), para el Péptido 1 y el Péptido 2; y aminoácidos "GGGGS" (SEQ ID NO: 172) para el péptido 3], o una marca de biotina C-terminal [separada por un enlazador flexible, aminoácidos "GPSSGAp Pp K" (s Eq ID n O: 173), para el Péptido 1 y el Péptido 2; y aminoácidos "GGGGSK" (SEQ ID NO: 174) para el péptido 3]. Las secuencias peptídicas ensayadas fueron: un péptido de control negativo, Péptido 1 marcado con biotina N-terminal (SEQ ID NO: 168; restos Arg34 a Leu66 de ANTGPTL4 humana de la SEQ ID NO: 164); y péptidos derivados de la región de espira enrollada N-terminal de ANGPTL3, es decir, Péptido 2 marcado con biotina N-terminal (SEQ ID NO: 169; restos Arg36 a Leu68 de hANGPTL3 de la SEQ ID NO: 161); Péptido 2 marcado con biotina C-terminal; Péptido 3 marcado con biotina N-terminal (SEQ ID NO: 170; corresponde a los restos Glu32 a Leu57 de hANGPTL3 de la SEQ ID NO: 161); y Péptido 3 marcado con biotina C-terminal. Las secuencias peptídicas también se muestran en la figura 1. Las puntas del biosensor revestidas con estreptavidina se revistieron con los péptidos biotinilados dando como resultado 1,22-2,26 nm de unidades de respuesta de unión dependiendo del péptido. Las puntas del biosensor revestidas con péptido se sumergieron luego en pocillos que contenían 1 pM de anticuerpo anti-ANGPTL3 H4H1276S o un anticuerpo de control negativo con isotipo coincidente, y la unión se supervisó durante 2,5 minutos. La respuesta de unión de H4H1276S y el anticuerpo de control de isotipo a cada uno de los péptidos se resume en la figura 2. Se observó que H4H1276S se une a la secuencia lineal de ANGPTL3 definida por el Péptido 2 pero no a la secuencia superpuesta pero distinta definida por el Péptido 3 (véase también la figura 1). El anticuerpo de control de isotipo también sirvió como control positivo para la carga de Péptido 1 (es decir, péptido hANGPTL4) en el biosensor, dado que este anticuerpo de control de isotipo reconoce específicamente hANGPTL4. Como se muestra en la Figura 2, la unión del anticuerpo de control al Péptido 1 confirmó que el Péptido 1 estaba presente sobre la superficie del sensor y también lo estaban los otros péptidos.
Ejemplo 6. Inhibición de hANGPTL3 por anticuerpos anti-hANGPTL3 en bioensayos de LPL
La lipoproteína lipasa (LPL) desempeña un papel crítico en el metabolismo de lípidos en los seres humanos. La LPL cataliza la hidrólisis de los triglicéridos y libera los ácidos grasos para que sean metabolizados. La ANGPTL3 inhibe la actividad de la LPL causando un aumento del nivel de lípidos (Oike et al., 2005, Trends in Molecular Medicine 11(10):473-479). La región de espira enrollada N-terminal de ANGPTL3 inhibe la LPL cuando se expresa sin la región de fibrinógeno C-terminal y, por lo tanto, parece conferir su función inhibidora. Se desarrolló un bioensayo sin células para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-ANGPTL3 para inhibir la disminución inducida por ANGPTL3 de la actividad de la LPL.
La inhibición de la actividad de hANGPTL3 por los anticuerpos anti-ANGPTL3 se determinó usando el ensayo de lipasa fluorométrico continuo CONFLUOLIP™ (Progen, Alemania) utilizando tres proteínas hANGPTL3: hANGPTL3 madura de longitud completa (es decir, restos de aminoácidos 17-460 de la SEQ ID NO: 161) con una marca de decahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, MN; n.° de catálogo 3829-AN], la región de espira enrollada N-terminal (es decir, los restos de aminoácidos 17-169 de la SEQ ID NO: 161) con una fusión Fc de ratón C-terminal [hANGPTL3(17-169)-mFc; SEQ ID NO: 165], y el dominio de espira enrollada N-terminal de hANGPTL3 (es decir, restos de aminoácidos 17-170 de la SEQ ID NO: 161) que contiene una marca de hexahistidina C-terminal [hANGPTL3(17-170)-His ].
En resumen, se premezclaron LPL bovina (concentración final de 2 nM), ApoCII humana (un cofactor de LPL, concentración final de 0,23 pM) y BSA (concentración final de 2 mg/ml) en PBS. Las proteínas recombinantes hANGPTL3 se añadieron a la mezcla Apo/LPL (concentraciones finales de 80-100 nM). Las mezclas de proteínas Apo/LPL/ANGPTL3 se añadieron a continuación junto con anticuerpos anti-hANGPTL3 diluidos sucesivamente y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, se añadieron 100 pl de sustrato de lipasa reconstituido, 1-trinitrofenil-amino-dodecanoil-2-pirendecanoil-3-0-hexadecil-sn-glicerol (LS-A, Progen) a 25 pl de la mezcla de anticuerpos a una placa de ensayo de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C durante dos horas. La fluorescencia se midió a 342 nm/400 nm (excitación/emisión) usando un lector de microplacas FLEXSTATION® 3 (Molecular Devices, CA). La fluorescencia es directamente proporcional a la actividad de la LPL.
El anticuerpo contra H4H1276S mostró inhibición de la actividad inhibidora de hANGPTL3 contra la LPL. Primero se realizó una respuesta a dosis completa usando la proteína hANGPTL3 en el ensayo de LPL para determinar la CE50 de ANGPTL3 para cada experimento, y luego se realizaron las determinaciones de CI50 para el anticuerpo usando concentraciones constantes de proteína ANGPTL3, tal como se muestra en la Tabla 8. Se determinó que las concentraciones de anticuerpo requeridas para una inhibición máxima del 50 % (CI50) eran 9,6 nM para 80 nM de hANGPTL3(17-460)-His, 2,9 nM para 100 nM de hANGPTL3(17-170)-His y 21 nM para 80 nM de hANGPPTL3(17-169)-mFc, respectivamente. Las concentraciones de anticuerpos variaban entre 0 y 300 nM para ensayar las proteínas ANGPTL3 humanas.
De manera similar, H4H1276S se ensayó en el bioensayo de LPL para su capacidad para inhibir ortólogos de especies cruzadas: la región N-terminal del macaco cangrejero (restos de aminoácidos 17-170 de la SEQ ID NO: 177) expresada con una marca myc-myc-hexahistidina C-terminal [MfANGPTL3(17-170)-mmH; SEQ ID NO:167], los restos de aminoácidos de la región N-terminal del ortólogo de ratón 17-240 de la SEQ ID NO: 163 con una marca de hexa­ histidina C-terminal [mANGPTL3(17-240)-His; SEQ ID NO: 166], y ANGPTL3 madura de longitud completa de Mus musculus (es decir, los restos de aminoácidos 17-455 de la s Eq ID NO: 163) con una marca de decahistidina C-terminal [mANGPTL3(17-455)-His; R&D Systems, MN; n° de catálogo 136-AN]. Se determinó que las CI50 son 10 nM para 500 nM de MfANGPTL3(17-170)-mmH constante, 14 nM para 80 nM de mANGPTL3(17-455)-His constante, y 31 nM para 500 nM constante de mANGPTL3(17-240)-His. Las concentraciones de anticuerpos variaban entre 0 y 600 nM para ensayar las proteínas ANGPTL3 de macaco y ratón. Los resultados se resumen en la tabla 9.
Los anticuerpos contra la región N-terminal de la proteína homóloga ANGPTL4 también demostraron bloquear la función inhibidora de ANGPTL4 sobre LPL (Lee et al., 2009, J. Biol. Chem. 284:13735-13745). Por lo tanto, para evaluar la posible reactividad cruzada con ANGPTL4, también se ensayó el anticuerpo anti-ANGPTL3 inhibidor H4H1276S contra ANGPTL4 humana en el ensayo de lipasa LPL, llevado a cabo como se describió anteriormente para las proteínas ANGPTL3. Una forma recombinante de la región de espira enrollada de la ANGPTL4 humana (restos 26-148 de la SEQ ID NO: 164) con una fusión IgG2a Fc de ratón C-terminal [hANGPTL4(26-148)-mFc, SEQ ID NO: 178] exhibía una CE50 en el ensayo de LPL de 0,2 nM (tabla 9). H4H1276S, ensayado a través de un intervalo de concentración de 0 - 600 nM, no bloqueó esta inhibición (NB: No unido; en la tabla 9).
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Como se ha mostrado anteriormente, H4H1276S inhibió la proteína ANGPTL3 humana (de longitud completa y N-terminal), la proteína ANGPTL3 de macaco (N-terminal) y la actividad de ANGPTL3 (longitud completa y N-terminal) de ratón en grados comparables con un intervalo de CI50 de aproximadamente 3-31 nM.
También se ensayó un subconjunto de anticuerpos para determinar si las combinaciones de dos anticuerpos no bloqueantes contra ANGPTL3 añadidos simultáneamente podrían bloquear la actividad inhibidora de ANGPTL3 de la LPL. Se ensayaron pares de anticuerpos para inhibir los dominios N-terminales de ANGPTL3 humana y de ratón, es decir, hANGPTL3(17-169)-mFc y mANGPTL3(17-240)-His, respectivamente. Para este ensayo, las proteínas ANGPTL3 exhibieron valores de C i50 para bloquear LPL de 47 nM [para hANGPTL3(17-169)-mFc] y 341 nM [para mANGPTL3(17-240)-His]. Los siguientes pares, cuando se añadieron a concentraciones finales para cada anticuerpo de al menos 200 nM, no bloquearon la inhibición de la LPL por hANGPTL3(17-169)-mFc a 80 nM o mANGPTL3(17-240)-His a 500 nM: H1M896N H4H1279P; H4H1250P H4H1279P; H4H1248P H4H1292P; y H4H1263S H4H1292P. En este mismo ensayo, H4H1276S solo bloqueó estas mismas concentraciones constantes de ANGPTL3 humano y de ratón con CI50 de 33 nM y 64 nM, respectivamente.
Ejemplo 7.1. Efecto in vivo del anticuerpo anti-ANGPTL3 sobre los niveles de lípidos en suero
El efecto del anticuerpo anti-hANGPTL3, H4H1726S, sobre los niveles de lípidos en suero se determinó en ratones C57BI/6. A los ratones se les extrajo sangre previamente 7 días antes del experimento y se colocaron en grupos de seis ratones cada uno para cada dosis de anticuerpo ensayada. Los anticuerpos se administraron a niveles de dosis de 5 mg/kg (H4H1726S) y 10 mg/kg [H4H1726S y control de hIgG4(S108P) con isotipo coincidente con especificidad irrelevante] mediante inyección subcutánea el día 0 del estudio. A los ratones se les extrajo sangre después de 4 horas de ayuno los días 1, 4, 7 y 12 después de las inyecciones de anticuerpos y los niveles de lípidos en suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no h Dl , colesterol LDL y colesterol HDL) se determinaron en el suero con un sistema ADVIA® Chemistry System 1800 (Siemens). Se calcularon los promedios para cada uno de los puntos temporales para cada anticuerpo. Los resultados, expresados como (media ± SEM) de la concentración de lípidos en suero, se muestran en las tablas 10-14.
Tabla 10
Figure imgf000025_0001
Tabla 11
Figure imgf000025_0002
Tabla 12
Figure imgf000026_0001
Tabla 13
Figure imgf000026_0002
Tabla 14
Figure imgf000026_0003
Los niveles de H4H1726S circulante (Ab en suero) también se determinaron usando un ensayo ELISA convencional. En resumen, las placas se revistieron con un anticuerpo anti-Fc humano de cabra (Sigma-Aldrich) para capturar el Ab en suero. A continuación se añadió suero a las placas y se detectó el anticuerpo humano capturado por quimioluminiscencia usando un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Sigma-Aldrich). Los resultados, expresados como (media ± SEM) se muestran en la tabla 15. Control: ratones que recibieron un Ab de control de isotipo coincidente.
Tabla 15
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La administración única de H4H1276S a ratones C57BI/6 a 10 mg/kg condujo a una reducción de ~60 % de los triglicéridos circulantes 7 días después de la administración del anticuerpo (en comparación con el control de isotipo). La administración de H4H1276S también condujo a una reducción significativa del colesterol total, el colesterol no HDL y el colesterol HDL y no tuvo ningún efecto sobre el colesterol LDL. También se observó una reducción de los niveles de lípidos, pero menos pronunciada, a 5 mg/kg en comparación con los niveles de dosis de 10 mg/kg; por ejemplo, los triglicéridos séricos se redujeron en un 44 % (en comparación con el control de isotipo) 7 días después de la administración del anticuerpo.
Ejemplo 7.2. Efecto in vivo del anticuerpos anti-ANGPTL3 sobre los niveles de lípidos en suero
La evaluación de los efectos in vivo de los anticuerpos anti-hANGPTL3, H4H1276S y el anticuerpo comparador 4.9.1 sobre los niveles de lípidos en suero se realizó en ratones C57BI/6. El anticuerpo 4.9.1 se preparó basándose en las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID No: 24 (VH) y la SEQ ID No: 32 (VL) como se divulga en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos N° 2008/0177045 y como un isotipo de IgG1 de ratón. A los ratones se les extrajo sangre previamente 7 días antes del experimento y se colocaron en grupos de seis ratones por grupo. Los anticuerpos H4H1276S, 4.9.1, y controles negativos de isotipo coincidente (IgG4 humana y IgG1 de ratón, respectivamente) con especificidad irrelevante se administraron a una dosis de 10 mg/kg mediante inyección subcutánea el día 0 del estudio. A los ratones se les extrajo sangre después de 4 horas de ayuno los días 1, 7, 11 y 20 después de la inyección de anticuerpos y los niveles de lípidos en suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no HDL, colesterol LDL y colesterol HDL) se determinaron en el suero usando un sistema ADVIA® Chemistry System 1800 (Siemens). Se calcularon las concentraciones de lípido promedio para cada uno de los puntos temporales para cada anticuerpo. Los resultados, expresados como (media ± SEM) de la concentración de lípidos en suero, se muestran en las tablas 16-20.
Tabla 16
Figure imgf000027_0002
Tabla 17
Figure imgf000027_0003
Tabla 18
Figure imgf000028_0001
Tabla 19
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Tabla 20
Figure imgf000028_0003
Una dosis única de 10 mg/kg de H4H1276S en ratones C57BI/6 dio como resultado una reducción de los niveles de triglicéridos en plasma en comparación con el control de isotipo los días 1, 7, 11 y 20 después de la inyección de anticuerpo; y este efecto fue más sostenido en comparación con un único tratamiento al mismo nivel de dosis con el comparador 4.9.1 (tabla 16). La administración de H4H1276S también condujo a una reducción del colesterol total (tabla 17) y el colesterol HDL (tabla 20) en ratones C57BI/6.
Ejemplo 8. Efecto in vivo de H4H1276S sobre los niveles de lípidos en suero en ratones ApoE'/_ hiperlipidémicos
El efecto del anticuerpo anti-hANGPTL3, H4H1276S, sobre los niveles de lípidos en suero se determinó en ratones apoE-/\ Estos ratones son hiperlipidémicos y la mayoría de su colesterol circulante se encuentra en forma de VLDL y LDL. A los ratones se les extrajo sangre previamente 7 días antes del experimento y se colocaron en grupos de seis ratones por grupo. Los anticuerpos, H4H1276S y un control (hlgG4) con isotipo coincidente con especificidad irrelevante, se administraron a una dosis de 10 mg/kg mediante inyección subcutánea el día 0 del estudio. A los ratones se les extrajo sangre después de 4 horas de ayuno los días 1, 4, 7 y 11 después de la inyección de anticuerpos; y los niveles de lípidos en suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no HDL, colesterol LDL y colestero1 HDL) se determinaron en el suero usando un sistema ADVIA® Chemistry System 1800 (Siemens). Se calcularon las concentraciones de lípido promedio para cada uno de los puntos temporales para cada grupo tratado con anticuerpo. Los resultados, expresados como (media ± SEM) de la concentración de lípidos en suero, se muestran en las tablas -25.
Tabla 21
Figure imgf000029_0001
Tabla 22
Figure imgf000029_0002
Tabla 23
Figure imgf000029_0003
Tabla 24
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Tabla 25
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La administración única de H4H1276S a ratones apoE^ a 10 mg/kg condujo a una reducción (media) de ~72% de los triglicéridos circulantes (tabla 21) y una reducción (media) de ~46% del colesterol LDL (tabla 24) 7 días después de la administración del anticuerpo (en comparación con el Ab de control de isotipo coincidente, es decir, hIgG4). La administración de H4H1276S también condujo a una reducción del colesterol total (tabla 22) y el colesterol no HDL (tabla 23).
Los niveles de H4H1276S circulante (Ab en suero) también se determinaron usando un ensayo ELISA convencional. En resumen, las placas se revistieron con un anticuerpo anti-Fc humano de cabra (Sigma-Aldrich) para capturar el Ab en suero. A continuación se añadió suero a las placas y se detectaron los anticuerpos capturados por quimioluminiscencia usando un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (Sigma-Aldrich). Los resultados, expresados como (media ± SEM), se muestran en la tabla 26 (control: ratones que recibieron un Ab de control de isotipo coincidente, es decir, hIgG4).
Tabla 26
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Ejemplo 9. Efecto in vivo de H4H1276S sobre los niveles de lípidos circulantes en ratones Ldlr/_ hiperlipidémicos
El efecto del anticuerpo anti-hANGPTL3, H4H1726S, sobre los niveles de lípidos en suero se determinó en ratones Ldlr/-. Estos ratones son hiperlipidémicos con una mayoría de colesterol circulante encontrada en forma de LDL debido a la carencia de LDLR, el principal receptor para la captación de colesterol LDL.
A los ratones se les extrajo sangre previamente 7 días antes del experimento y se colocaron en grupos de seis ratones. Los anticuerpos, H4H1726S y control negativo (hlgG4) de isotipo coincidente, se administraron a una dosis de 10 mg/kg mediante inyección subcutánea el día 0 del estudio. A los ratones se les extrajo sangre después de 4 horas de ayuno los días 1, 4, 7 y 11 después de la inyección de anticuerpos y los niveles de lípidos en suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no HDL, colesterol LDL y colesterol HDL) se determinaron usando un analizador de química clínica ADVIA® Chemistry System 1800 (Siemens). Se calcularon los promedios para cada punto temporal para cada anticuerpo. Los resultados, expresados como (media ± SEM) de la concentración de lípidos en suero (triglicéridos, colesterol total, colesterol no h Dl , colesterol LDL y colesterol HDL), se muestran en las tablas 27-31, respectivamente. (Control = ratones que recibieron un anticuerpo de control de isotipo coincidente).
Tabla 27. Tri licéridos en suero m /dl
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Tabla 28. Colesterol total m /dl
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Tabla 29. Colesterol no HDL m /dl
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Tabla 30. Colesterol LDL m /dl
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína 3 similar a angiopoyetina humana (hANGPTL3) de la SEQ ID NO:161 y neutraliza, reduce o interfiere en, al menos una actividad de hANGPTL3, en el que el anticuerpo o fragmento:
(a) comprende un par de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) de la SEQ ID NO: 66/74;
(b) comprende secuencias de región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada, HCDR1, h Cd R2 y HCDR3, y secuencias de CDR de cadena ligera, lCd R1, LCDR2 y LCDR3, contenidas dentro de un par de secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) y de región variable de cadena ligera (LCVR) ( HCVR/LCVR) de la SEQ ID NO: 66/74, en el que las CDR están determinadas por la definición de Kabat, la definición de Chothia o la definición de AbM; o
(c) comprende una combinación de secuencias HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de las SEQ ID NO: 68/70/72/76/78/80.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:
(a) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno reacciona de forma cruzada con ANGPTL3 de macaco cangrejero; y/o
(b) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno reacciona de forma cruzada con ANGPTL3 de ratón o de rata; y/o
(c) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno reacciona de forma cruzada con cualquiera de ANGPTL3 de macaco cangrejero, ANGPTL3 de ratón y ANGPTL3 de rata.
3. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 o 2, en el que:
(a) el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monocatenario, un Fab o un F(ab')2); y/o
(b) el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo quimérico o completamente humano.
4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es una IgG1 o IgG4.
5. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.
8. Un método de producción de un anticuerpo anti-hANGPTL3 o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7 en condiciones que permiten la producción del anticuerpo o fragmento del mismo, y recuperar el anticuerpo o fragmento del mismo producido de este modo.
9. Una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o uno o más anticuerpos de la reivindicación 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de HMG-CoA reductasa, niacina, un fibrato, 22-hidroxicolesterol, ezetimiba más simvastatina, una estatina con una resina biliar, niacina más una estatina, niacina más un éster etílico de ácidos grasos omega-3, una estatina, un anticuerpo anti-hANGPTL4 y un anticuerpo anti-PCSK9.
11. Un anticuerpo o fragmento del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un anticuerpo de la reivindicación 4, o una composición farmacéutica de la reivindicación 9 o 10, para uso en un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno que se previene, mitiga, mejora o inhibe por la reducción o inhibición de la actividad de ANGPTL3, en el que dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia aterogénica, dislipidemia mixta, una enfermedad o trastorno cardiovascular, pancreatitis aguda, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes y obesidad.
12. El anticuerpo, fragmento o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la hipercolesterolemia es hipercolesterolemia familiar homocigótica con LDLR -/-.
13. El anticuerpo, fragmento o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que el método comprende adicionalmente administrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de HMG-CoA reductasa, niacina, un fibrato, 22-hidroxicolesterol, ezetimiba más simvastatina, una estatina con una resina biliar, niacina más una estatina, niacina más un éster etílico de ácidos grasos omega-3, una estatina, un anticuerpo anti-hANGPTL4 y un anticuerpo anti-PCSK9.
14. El anticuerpo, fragmento o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo y el uno o más agentes terapéuticos adicionales se administran de forma concurrente o secuencial.
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