TR201816591T4 - Anti-angptl3 antikorları ve bunların kullanımları. - Google Patents

Abstract

Buluş insan antikorları ve insan antikorlarının spesifik olarak insan anjiyopoietin benzeri protein 3'ü (hANGPTL3) bağlayan antijen bağlama fragmanları ve bu antikorların terapötik kullanım yöntemleri ile ilgilidir.

Description

TARFNAME ANTI-ANGPTL3 ANTIKORLARI VE BUNLARIN KULLANIMLARI BULUSUN ALANI Mevcut bulus insan antikorlari ve insan antikorlarinin spesifik olarak insan anjiyopoietin benzeri protein 3'ü (hANGPTLS) baglayan antijen baglama fragmanlari ve bu antikorlarin terap'otik kullanim yöntemleri ile ilgilidir. ARKA PLAN Anjiyopoietin benzeri protein 3 (ANGPTL3) geni sinyal sekanslarina ve amfipatik sarmallara dayanarak EST veri tabanindan tanimlanmistir ve bir tam uzunluklu ANGPTL3 cDNA sonrasinda bir insan fetal karaciger / dalak CDNA kütüphanesinden asitli hANGPTL3 proteini fare ANGPTL3'ü ile % 76 amino asit sekansi özdesligi paylasmaktadir ve anjiyopoietinin, baska bir deyisle bir sinyal peptidi, dimerik veya trimerik sarili sarmallar olusturdugu tahmin edilen bir uzatilmis sarmal alan ve bir lobular fibrinojen homoloji alani (FD) karakteristik yapisina sahiptir (Conklin et al., 1999, yukarida geçen). ANGPTL3 FD içindeki molekül içi disülfit baglarina dahil olan 4 korunmus sistein kalintisi içermektedir; ancak ANGPTL3 ne iki ilave sisteini ne de anjiyogenezi destekleyen protein büyüme faktörleri olan anjiyopoietinlerin (ANGs; baska bir deyisle, ANG1, ANG2 ve ANG4) (Conklin ve arkadaslari, 1999, yukarida geçen) FDrlerinde bulunan karakteristik kalsiyum baglama motifini içermektedir Ek olarak ANG'Ierin aksine ANGPTL3 Tie21ye baglanmamaktadir; ancak ayrica kendi C- terminali araciligiyla integrine oivßs baglanarak anjiyogenezi indükleyebilmektedir Kapsamli in vivo veriler insanlardaki tip 2 diabetes mellitus benzeri anormal derecede yüksek seviyelerde plazma insülin, glikoz ve Iipitleri olan orta derecede obez olan farkli soydan üremis KK fare modelinden elde edilmistir (Koishi et al., 2002, Nature Genetics :151-157). Ancak farenin alt türü KK/ Sanrin bir mendelyan alici olarak kalit alan anormal derecede düsük plazma Iipit seviyeleri sergiledigi bulunmustur. Lokuslar kromozom 4 ile eslestirilmistir ve sonuç olarak ekson &da bir 4-bp nükleotit sekansi eki içeren ANGPTLß'ü kodlayan gen olarak tanimlanmistir. Bunun aksine plazma Iipit seviyeleri ANGPTL3 geninin adenovirüs aracili transferinden sonra veya KK / San farelerde rekombinant insan ANGPTL3*ünün uygulanmasindan sonra artmaktadir. Bu etkiye kolesterol sentezine, lipoprotein kleransina ve NEFA oksidasyonuna dahil olan genlerdeki degisimler aracilik etmemistir (Koishi et al., 2002, yukarida geçen). Ayrica rekombinant proteinin in vitro analizi ANGPTL3'ün dogrudan Iipaz (LPL) aktivitesini inhibe ettigini göstermis olup, bu da bunun LPL aktivitesinin inhibisyonu araciligiyla çok düsük yogunluklu lipoprotein (VLDL) trigliserit seviyelerini regüle eden bir lipit metabolizmasi oldugunu belirtmektedir (Shimizugawa et al., 2002, J Biol Chem sarmal alani, özellikle N-terminal bölgesi kalintilar 17-165 farelerde plazma trigliserit seviyelerini arttirmaya iliskin aktivitesi için gereklidir (Ono et al., 2003, J Biol Chem Insan ANGPTLßtün amino asit ve nükleotit sekanslari sirasiyla SEK ID NO: 161 ve 7,935,796 sayili patent belgelerinde açiklanmaktadir. BULUSUN KISA 'OZETI Bir birinci yönde bulus ANGTPLS'L'in özellikle insan ANGTPL37ün en az bir aktivitesini spesifik olarak baglayan ve nötralize eden, inhibe eden, bloke eden, kaldiran, azaltan veya bununla etkilesen tam olarak insan monoklonal antikorlar (mAbs) ve bunlarin antijen baglama fragmanlarini saglamaktadir (SEK ID NO: 161). Bulusun antikorlari veya bunlarin fragmanlari tarafindan nötralize edilebilen, inhibe edilebilen, kaldirilabilen, azaltilabilen veya bununla etkilesime girebilen ANGPTL3 aktivitesi LPL aktivitesinin kisitlamasini, inhibisyonunu, anjiyogenezin indüksiyonunu ve benzerini ancak sadece örnek yoluyla içermektedir. Bir antikor veya bunun fragmani hANGPTLß'ün hedeflenmis aktivitesine dogrudan dahil olan bir hANGPTL3 aktivitesine baglanarak hANGPTL3'ün bir aktivitesini nötralize edebilmekte, inhibe edebilmekte, bloke edebilmekte, ortadan kaldirabilmekte, azaltabilmekte veya bununla etkilesebilmektedir. Bir antikor veya bunun fragmani ayrica hANGPTL3fün hedeflenen aktivitesine dogrudan dahil olmayan bir hANGPTLS epitopuna baglanarak hANGPTLS'ün bir aktivitesini nötralize edebilmekte, inhibe edebilmekte, bloke edebilmekte, ortadan kaldirabilmekte, azaltabilmekte veya bununla etkilesebilmektedir ancak buraya baglanan antikor veya fragman hANGPTLSiün hedeflenen aktivitesini sterikal olarak veya konformer olarak inhibe etmekte, bloke etmekte, ortadan kaldirmakta, azaltmakta veya bununla etkilesmektedir. Patent hakki bildiriminin bir antikoru veya bunun fragmani dogrudan hANGPTL3*'ün (baska bir deyisle, bir bloke etmeyen antikor) hedeflenen aktivitesine dahil olmayan (örn, anjiyogenez dahil olmak üzere LPL aktivitesi) dahil olmayan bir hANGPTL3 epitopuna baglanabilmektedir ancak buraya baglanan antikor veya bunun fragmani antikorun veya bunun fragmaninin yoklugunda hANGPTLSf'ün kleransiyla karsilastirildigi zaman hANGPTLsrün sirkülasyondan kleransina iliskin gelisme ile sonuçlanmaktadir, böylelikle hANGPTL37'un bir aktivitesini dolayli olarak inhibe etmekte, bloke etmekte, ortadan kaldirmakta, azaltmakta veya bununla etkilesmektedir. hANGPTL3'ün sirkülasyondan kleransi özellikle hANGPTLSSe spesifik baglanmak için bir digeriyle rekabet etmeyen iki veya daha fazla bloke etmeyen antikorun kombine edilmesi vasitasiyla gelistirilebilmektedir. Antikorlar (Abs) tam uzunluklu (örnegin, bir IgG1 veya IgG4 antikor) olabilmektedir veya sadece bir antijen baglama kismi (örnegin bir Fab, F(ab')2 veya scFv fragmani) içerebilmektedir ve islevselligi etkilemek örn, kalinti efektör fonksiyonlari ortadan 1933) Bir yönde patent hakki bildirimi bir antikor veya bir antikorun antijen baglama özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansindan olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi (HCVR) içermektedir. Baska bir yönde antikor veya seçilen bir amino asit sekansina sahip olan bir HCVR içermektedir. Bulusta antikor veya bunun bir antijen baglama fragmani SEK lD NO: &nin bir amino asit sekansina sahip olan bir HCVR içerebilmektedir. Bir yönde patent hakki bildirimi bir antikor veya bir antikorun antijen baglama 188iden olusan gruptan veya bunun en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az hafif zincir degisken bölgesi (LCVR) içermektedir. Baska bir yönde antikor veya bunun bir amino asit sekansina sahip olan bir LCVR içermektedir. Bulusta antikor veya bunun bir antijen baglama fragmani SEK lD NO: 74'nin bir amino asit sekansina sahip olan bir LCVR içerebilmektedir. gruptan seçilen bir HCVR ve LCVR sekans çifti (HCVR / LCVR) içermektedir. Bir yönde bir HCVR ve LCVR sekans çifti içermektedir. Bulusta antikor veya bunun bir antijen baglama fragmani SEK ID NO: 66 / 74'den olusan gruptan seçilen bir HCVR ve LCVR sekans çifti içermektedir. Bir ikinci yönde patent hakki bildirimi bir antikor veya bir antikorun antijen baglama 186'dan olusan gruptan seçilen veya en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az amino asit sekansini belirleyen bir agir zincirtamamlayiciligi ve SEK ID NO: 6, 32, 48, az % 95, en az % 98 veya en az % 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansindan seçilen bir hafif zincir CDR3 (LCDR3) amino asit sekansini belirleyen bir agir zincir tamamlayiciligi içermektedir. Bir yönde antikor veya bunun çifti içermektedir. Bir yönde antikor veya bunun fragmani SEK lD NO: No:8 / 16, 24/ asit sekansi çifti içermektedir. Bulusta antikor veya bunun bir antijen baglama fragmani SEK lD NO: 72 I 80'den olusan gruptan seçilen bir HCDR3 / LCDR3 sekans çifti içermektedir. Patent hakki bildiriminin baska bir yönünde antikor veya bunun fragmani ayica SEK ID bunun en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az % 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansindan olusan gruptan seçilen bir agir zincir CDR1 en az % 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansindan seçilen bir agir zincir CDR2 (HCDR2) amino asit sekansi içermektedir ve opsiyonel gruptan veya bunun en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az % 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansini seçilen bir hafif zincir CDR1 en az °/o 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansindan seçilen bir hafif zincir CDR2 (LCDR2) amino asit sekansi içermektedir. Alternatif olarak patent hakki bildirimi bir antikor veya bir antikorun antijen baglama kombinasyonunu içermektedir. Bir yönde agir ve hafif zincir CDR amino asit sekanslari gruptan seçilen bir CDR kombinasyonu içermektedir. Bir yönde agir ve hafif zincir CDR kombinasyonunu içermektedir. Bir uygulamada agir ve hafif zincir CDR amino asit kombinasyonudur. Iliskili bir yönde patent hakki bildirimi spesifik olarak hANGPTL3 baglayan bir antikor veya bir antikorun antijen baglama alanini içermekte olup, burada antikor veya bunun içinde bulunan agir ve hafif zincir CDR alanlari içermektedir. HCVR ve LCVR amino asit sekanslari içindeki CDR'Ieri tanimlamak için yöntemler ve teknikler teknikte bilinmektedir ve burada açiklanan belirtilmis HCVR ve / veya LCVR amino asit sekanslari içindeki CDR'leri tanimlamak için uygulanabilmektedir. CDR'lerin sinirlarini tanimlamak için uygulanabilen geleneksel tanimlar Kabat tanimini, Chothia tanimini ve AbM tanimini içermektedir. Genel olarak Kabat tanimi sekans degisebilirligine dayanmaktadir, Chothia tanimi yapisal döngü alanlarinin konumlarina dayanmaktadir ve AbM tanimi Kabat ve Chothia yaklasimlarinin arasinda bir uzlasmadir. Bkz, örn, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National lnstitutes of Health, sekanslarini tanimlamak için ayrica kamusal veri tabanlari mevcuttur. Bir yönde antikor veya 180 / 188'in bir HCVR ve LCVR sekans çifti içermektedir içinde bulunan CDR sekanslarini içermektedir. Bulusun bir uygulamasinda antikor veya bunun fragmani SEK lD NO: 66 I 74iün bir HCVR ve LCVR çifti içinde bulunan CDR sekanslarini içermekte olup, burada CDR'Ier Kabat tanimi, Chothia tanimi veya AbM tanimi vasitasiyla belirlenmektedir. LCVR sekans çiftine dahil olan agir ve hafif zincir CDR sekanslarini içeren bir antikor veya antijen baglama fragmani ile hANGPTLßte spesifik baglanma için rekabet eden bir antikor veya antijen baglama fragmani saglamaktadir. Bir yönde antikor veya antijen baglama fragmani SEK ID NO: 66 / 74'ün bir HCVR/ LCVR sekans çiftini içeren bir antikor veya bunun fragmani ile hANGPTL3ie spesifik baglanma için rekabet etmektedir. Baska bir yönde antikor veya antijen baglama fragmani 4 / 6 l 8 / 12 / 14 / hafif zincir CDR sekansini içeren bir antikor veya bunun bir fragmani ile hANGPTLBie spesifik baglanma Için rekabet etmektedir. Bir yönde antikor veya antijen baglama içeren bir antikor veya bunun fragmani ile hANGPTL3'e spesifik baglanma için rekabet etmektedir. LCVR sekans çiftine dahil olan agir ve hafif zincir CDR sekanslarini içeren bir antikor veya antijen baglama fragmani vasitasiyla ayirt edilen ayni hANGPTL3 epitopunu baglayan bir antikor veya antijen baglama fragmani saglamaktadir. Bir yönde antikor veya antijen baglama fragmani SEK lD NO: 66 /74t'L`in bir HCVR / LCVR sekans çiftini içeren antikor veya fragmani tarafindan ayirt edilen hANGPTL3 üzerindeki ayni epitopu baglamaktadir. Baska bir yönde antikor veya antijen baglama fragmani 4/ 6 / agir ve hafif zincir CDR sekansi kombinasyonu içeren bir antikor veya bunun bir fragmani tarafindan ayirt edilen hANGPTL3 'uzerindeki ayni epitopu baglamaktadir. Bir CDR sekans kombinasyonunu içeren bir antikor tarafindan ayirt edilmektedir. Patent hakki bildirimi SEK ID NO: 161'in kalintilarindaki 17 ila 209 N-terminali sarilmis sarmal içine yerlestirilen bir epitopu baglayan ve hANGPTL3"un en az bir aktivitesini nötralize eden, inhibe eden, ortadan kaldiran, azaltan veya bununla etkilesen bir izole edilmis anti-hANGPTL3 antikorunu veya bunun antijen baglama fragmanini saglamaktadir. Patent hakki bildirimi hANGPTL3 (SEO NO:161) N-terminal sarilmis sarmali içine yerlestirilen bir epitopa spesifik olarak baglanan ve hANGPTL3"un en az bir aktivitesini nötralize eden, inhibe eden, ortadan kaldiran, azaltan veya bununla etkilesen bir izole edilmis antikor veya bunun antijen baglama kismini saglamakta olup, antikor veya bunun fragmani SEK lD NO: 170'in ANGPTL3 peptitine (SEK ID NO: baglanmamaktadir. Patent hakki bildiriminin antikorlari veya bunlarin fragmanlari opsiyonel olarak antikorun veya bunun fragmaninin SEK ID NO: 170'in ANGPTL3 peptitine baglanmamasi kosuluyla spesifik olarak hANGPTL3"ün (SEK lD NO: 161) baglanmaktadir. Baska bir yönde antikorlar veya bunlarin fragmanlar opsiyonel olarak antikorun veya bunun fragmaninin SEK lD NO: 170iin ANGPTL3 peptitine baglanmamasi kosuluyla spesifik olarak hANGPTL37ün (SEK ID NO: 161) kalintilarina fragmani opsiyonel olarak antikorun veya bunun fragmaninin SEK ID NO: 170'in ANGPTL3 peptitini baglamamasi kosuluyla N-terminal sarilmis sarmal bölgesi içindeki sayili epitoplarin veya kalintilarini birinden daha fazlasini içerebilen bir epitopu baglamaktadir. Baska bir uygulamada bulus bulusun anti-ANGPTL3 antikorlarini veya bunlarin fragmanlarini kodlayan nükleik asit molekülleri saglamaktadir. Bulusun nükleik asitlerini tasiyan rekombinant ekspresyon vektörleri ve bu vektörlerin dahil edilmis oldugu konak hücreler örn, E. coli gibi bakteri hücreleri veya CHO hücreleri gibi memeli hücreleri ayni zamanda antikorlarin üretimine izin veren kosullar altinda konak hücrelerin kültürlenmesi ve üretilen antikorlarin geri kazanilmasi vasitasiyla antikorlari üremeye iliskin yöntemler de ayrica bulus tarafindan kapsanmaktadir. Bir yönde patent hakki bildirimi bir antikor veya bunun fragmanini içermekte olup, SEK en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az % 99 homolojisine sahip olan büyük ölçüde özdes bir sekansindan seçilen bir nükleik asit sekansi tarafindan kodlanan bir HCVR içermektedir. Baska bir yönde antikor veya bunun fragmani SEK lD NO: 1, 17, içermektedir. Bir uygulamada antikor veya bunun fragmani SEK ID NO: 65'in bir nükleik asit sekansi tarafindan kodlanan bir HCVR içermektedir. Bir yönde patent hakki bildirimi bir antikor veya bunun fragmanini içermekte olup, SEK en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az % 99 homolojisine sahip olan büyük ölçüde özdes bir sekansindan seçilen bir nükleik asit sekansi tarafindan kodlanan bir LCVR içermektedir. Baska bir yönde antikor veya bunun fragmani SEK ID NO: 9, 25, içermektedir. Bir uygulamada antikor veya bunun fragmani SEK ID NO: 73'ün bir nükleik asit sekansi tarafindan kodlanan bir LCVR içermektedir. Patent hakki bildirimlerinin baska yönlerinde antikor veya bunun fragmani SEK ID NO: 153 ve 179 / 187*den olusan gruptan seçilen bir nükleik asit sekansi çifti tarafindan kodlanan bir HCVR ve LCVR sekans çifti (HCVR / LCVR) içermektedir. Patent hakki bildiriminin baska bir yönde antikor veya bunun fragmani SEK ID NO: 1 /9, 17 / 25, 33 kodlanan bir HCVR / LCVR içermektedir. Bir uygulamada antikor veya bunun fragmani SEK ID NO: 65/ 73'ün bir nükleik asit sekansi tarafindan kodlanan bir HCVR / LCVR içermektedir. Bir yönde patent hakki bildirimi bir antikor veya bir antikorun antijen baglama 185tten olusan gruptan seçilen veya en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az amino asit sekansini belirleyen bir agir zincir tamamlayiciligi ve SEK lD NO: 6, 32, 48, 95, en az % 98 veya en az % 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansindan seçilen 3 (LCDR3) amino asit sekansini belirleyen bir agir zincir tamamlayiciligi içermektedir. Patent hakki bildiriminin bir yönünde antikor veya bunun tarafindan kodlanan bir HCDR3 ve LCDR3 sekans çiftini içermektedir. Patent hakki bildiriminin baska bir yönde antikor veya bunun fragmani SEK lD NO: 7 / 15, 23/31, kodlanan bir HCDR3 ve LCDR3 içermektedir. Bir uygulamada antikor veya bunun fragmani SEK ID NO: 71 / 79'un nükleik asit sekansi çifti tarafindan kodlanan bir HCDR3 ve LCDR3 içermektedir. Patent hakki bildiriminin baska bir yönünde antikor veya bunun fragmani ayrica SEK bunun en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az % 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansindan olusan gruptan seçilen bir nükleotit sekansi sekansindan seçilen bir HCDR2 amino asit sekansi içermektedir ve opsiyonel olarak gruptan veya bunun en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az % 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansini seçilen bir LCDR1 amino olusan gruptan veya bunun en az % 90, en az % 95, en az % 98 veya en az % 99 sekans özdesligine sahip olan büyük ölçüde benzer bir sekansindan seçilen bir LCDR2 amino asit sekansi içermektedir. Alternatif olarak patent hakki bildirimi bir antikor veya bir antikorun antijen baglama kombinasyonunu içermektedir. Bir uygulamada antikor veya bunun fragmani SEK ID ve hafif zincir CDR sekanslari içermektedir. Baska bir uygulamada bulus bir insan anti-ANGPTL3 antikoru veya bunun bir antijen baglama fragmanini saglamakta olup, VH, DH ve JH gem hattindan t'uretilen nükleotit sekansi segmentleri tarafindan kodlanan bir agir zincir degisken bölgesi (HVCR) ve VK ve JK germ hatti sekanslarindan türetilen nükleotit sekans segmentleri tarafindan kodlanan bir hafif zincir degisken bölgesi (LCVR) içermektedii', burada HCVR ve LCVR seçilen bir germ hatti gen kombinasyonundan türetilen nükleotit sekans segmentleri tarafindan kodlanmaktadir. Baska bir uygulamada bulus y'uzey plazmon rezonans dizisi (örnegin BIACORETM) vasitasiyla ölçüldügü üzere yaklasik 7 nM veya daha az, yaklasik 6 nM veya daha az, yaklasik 5 nM veya daha az, yaklasik 4 nM veya daha az, yaklasik 3 nM veya daha az, yaklasik 2 nM veya daha az veya yaklasik 1 nM veya daha az bir denge çözüs'üm sabiti olan hANGPTL3'e spesifik olarak baglanan bir antikor veya antijen baglama fragmani saglamaktadir. Belirli uygulanmalarda bulusun antikoru yaklasik 800 pM veya daha az, yaklasik 700 pM veya daha az, yaklasik 600 pM veya daha az, yaklasik 500 pM veya daha az, yaklasik 400 pM veya daha az, yaklasik 300 pM veya daha az yaklasik 200 pM veya daha az yaklasik 100 pM veya daha az veya yaklasik 50 pM veya daha az bir KD sergilemektedir. Mevcut bulusun SEK ID NO: 161*in hANGPT3 proteinini baglayan Anti-hANGPTLS antikoru veya bunun antijen baglama fragmani örnegin ELIZA, yüzey plazmon rezonans dizisi analizi veya LUMINEX® XMAP® Teknolojisi vasitasiyla belirlendigi üzere burada açiklandigi sekilde bir insan anjiyopoietin benzeri protein 4 gibi bir iliskili protein ile çapraz etkilesmemektedir. ANGPTL4 LPL aktivitesini düsürdügü bilinen ve bir N-terminal sarilmis sarmal bölgesine ve bir C-terminali fibrinojen benzeri alana bir hANGPTL3 proteini baglayan ve bir hANGPTL4 proteini ile çapraz etkilesime giren bir anti-hANGPTL3 antikoru veya antijen baglama fragmani saglamaktadir. Belirli yönlerde hANGPTL3 antikorunun veya bunun fragmaninin hANGPTL4 proteinine baglanma afinitesi antikor veya fragmanin hANGPTL3 proteinine baglanma afinitesinden yaklasik % 75 veya daha az veya yaklasik % 50 veya daha azdir. Baska bir iliskili yönde patent hakki bildirimi fare ANGPTL3 (mANGPTL3; SEK ID NO: ile çapraz reaksiyona girmeyen fakat sinomolgus maymun (Macaca fascicularis) ANGPTL3 (MfANGPTL3) örnegin SEK lD NO: 177'nin N-terminal 17-170 kalintilari (mANGPTLS'ün bir kismi amino asit sekansi) ile çapraz reaksiyona girmeyen bir anti-hANGPTL3 antikoru veya bunun antijen baglama fragmanini saglamaktadir. Bulus MfANGPTL3, mANGPTL3 ve rANGTPL3 ile çapraz reaksiyona girmeyen bir anti-hANGPTL3 antikoru veya bunun fragmanini saglamaktadir. Bulus modifiye edilmis bir paterne sahip olan anti-hANGPTL3 antikorlarini kapsamaktadir. Bazi uygulamalarda istenmeyen glikosilasyon alanlarini uzaklastirmak için modifikasyon veya örn, antikora bagli hücresel sitotoksisite (ADCC) fonksiyonunu arttirmak için bir fukoz kisminin uzaklastirilmasi faydali olabilmektedir (bkz Shield et al. (. Diger uygulamalarda N-glikosilasyon alaninin uzaklasmasi terapötik antikorlara karsi istenmeyen immün reaksiyonlari azaltabilmekte veya antikorlarin afinitelerini arttirabilmektedir. Yine diger uygulamalarda glikosilasyonun modifikasyonu kompleman baglamli sitotoksisiteyi (CDC) modifiye etmek için yapilabilmektedir. Baska bir yönde bulus bulusun spesifik olarak hANGPTL3'ünü baglayan bir rekombinant insan antikorunu veya fragmanini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi içeren bir farmasötik bilesim saglamaktadir. Bir yönde patent hakki bildirimi bir farmasötik bilesim saglamakta olup, baska biri ile çapraz rekabet etmeyen bir veya daha fazla anti-ANGPTL3 antikorlari veya fragmanlari ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi içermektedir. Bir yönde farmasötik bilesim hANGPTLS'e spesifik baglanma için bir digeriyle rekabet etmeyen ve hANGPTL3*ü sirkülasyondan temizlemekte etkili olan iki veya daha fazla bloke etmeyen antikorlar içerebilmektedir. Bloke etmeyen antikorlarin uygun kombinasyonlari (i) sirasiyla SEK ID NO: 82/90 ve sirasiyla SEK lD HCVR ve LCVR sekans çiftini (HCVR / LCVR) iceren antikorlarin bir kombinasyonunu içermektedir ancak bunlarla sinirli degildir. Iliskili uygulamalarda bulus bulusun bir antikorunun veya antijen baglama fragmaninin ve bir ikinci terapötik ajanin bir kombinasyonu olan bir bilesim saglamaktadir. Ikinci terapötik ajan (1) 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzim A (HMG-CoA) reduktaz inhibitörleri Örnegin servastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin ve benzeri; (2) kolesterol alim ve / veya safra asidi yeniden abzorpsiyonunun inhibitörlerini; (3) Iipoprotein katabolizmasini arttiran niasin; (4) düsük yogunluklu Iipoprotein (LDL) seviyesini azaltan, yüksek yogunluklu Iipoprotein (HDL) ve TG seviyelerini arttiran ve ölümcül olmayan kalp krizlerinin sayisini azaltan fibratlar veya amfipatik karboksilik asitler ve (5) 22-hidr0ksikolesterol gibi kolesterol eliminasyonunda bir rol oylayan LXR transkripsiyon faktörünün aktivatörlerini veya ezetimib arti simvastatin; bir safra reçine ile bir statin (örn, kolestiramin, kolestipol, kolesevelam) gibi sabit kombinasyonlari, niasin arti bir statinin bir sabit kombinasyonunu (örn, niasin ile Iovastatin) veya 0mega-3-yag asidi etil esterleri gibi diger Iipit düsüren ajanlar (örnegin amakor) gibi herhangi bir ajanin birini veya daha fazlasi olabilmektedir. Bundan baska ikinci terapötik ajan lipit metabolizmasina, özellikle kolesterol ve / veya trigliserit homeostaza dahil olan ANGPTL3iün bir veya daha baska inhibitörleri ayni zamanda ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTLG ve proprotein konvertaz subtilisin / keksin tipi 9 (PCSK9) gibi diger moleküllerin inhibitörleri olabilmektedir. Bu moleküllerin inhibitörleri küçük molekülleri ve bu moleküllere spesifik olarak baglanan ve bunlarin aktivitesini bloke eden antikorlari içermektedir. Iliskili yapilanmalarda ikinci terapötik ajan kemoterapötik ajanlar, anti-anjiyojenik ajanlar, büyüme inhibitörü ajanlari, sitotoksik ajanlar, apoptik ajanlar gibi bir veya daha fazla anti-kanser ajanlari ve kanser veya diger proliferatif hastaliklari veya rahatsizliklari tedavi etmek için teknikte iyi bilinen diger ajanlar ayni zamanda altta yatan kansere / tümöre eslik eden semptomlari hafifletmek ve /veya azaltmak için Cox- 2 inhibitörleri ve benzerleri gibi steroidal olmayan anti-inflamatuar ilaçlar (NSAlDS) analjezikler, anti-inflamatuar ajanlar gibi diger terapötik ajanlar olabilmektedir. Baska bir yönde patent hakki bildirimi açiklamanin bir veya daha fazla anti-hANGPTL3 antikorunu veya bunun antijen baglama fragmanlarini kullanarak hANGPTL3 aktivitesini nötrlestirmek, inhibe etmek, bloke etmek, ortadan kaldirmak, azaltmak veya bununla etkilesmek için yöntemler saglamaktadir. Bir yönde patent hakki bildirimi bir terapötik yöntem saglamakta olup, ihtiyaci olan bir denege patent hakki bildiriminin bir veya daha fazla anti-hANGPTL3 antikorunu veya bunun antijen baglama fragmanlarini ve opsiyonel olarak yukarida açiklanan bir veya daha fazla ilave terapötik ajani içeren bir farmasötik bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarini uygulamayi içermektedir. Anti-ANGPTL3 antikorlari veya bunlarin fragmanlari ANGPTL3*e karsi nötralize edici antikorlar veya bloke etmeyen antikorlar veya bunlarin kombinasyonlari olabilmektedir. Iliskili yönlerde patent hakki bildirimi ihtiyaci olan bir denegin sirkülasyonundan hANGPTLS'ün kleransini gelistirmeye iliskin yöntemler saglamakta olup, denege hANGPTL3'e baglanmak için baska biriyle rekabet etmeyen ve tercih edilen sekliyle hANGPTLS'ün en az birini bloke etmeyen (baska bir deyisle, bloke etmeyen antikorlar) en az iki anti-hANGPTL3 antikorunun veya bunlarin fragmanlarinin uygulanmasini içermektedir. Anilan hANGPTL3'ün en az bir aktivitesi LPL aktivitesini inhibe etmeyi, anjiyogenezi indüklemeyi ve benzerini kisitlama olmaksizin içermektedir. Bir yönde en az iki bloke etmeyen anti-hANGPTL3 antikoru veya bunlarin fragmanlari antikorlarin veya fragmanlarin uygulanmamasina göre hANGPTL3°ün sirkülasyondan kleransini en az yaklasik % 60, en az yaklasik % 70 veya en az yaklasik % 80 arttirmaktadir. hANGPTLßr'ün devridaim olan seviyeleri teknikte iyi bilinen in vitro analizler ve burada açiklananlar vasitasiyla ölçülebilmektedir. Baska bir önde en az iki bloke etmeyen anti- sekans çiftini (HCVR / LCVR) içeren antikorlarin bir kombinasyonunu içermektedir ancak bunlarla sinirli degildir. Burada açiklanan yöntemler vasitasiyla tedavi edilebilen hastalik veya rahatsizlik ANGPTLS aktivitesini uzaklastirarak, inhibe ederek, azaltarak veya aksi halde bunlarla etkileserek anti-hANGPTLS antikor tedavisi ile (örn, ANGPTLS aracili hastaliklar veya rahatsizliklar) karsilastirildigi zaman gelisen, hafifleyen, inhibe edilen veya engellenen herhangi bir hastalik veya kosul veya bunun azaltilan ortaya çikma oranidir. Burada açiklanan yöntemler vasitasiyla tedavi edilebilen hastaliklara veya rahatsizliklara iliskin örnekler hiperlipidemi, hiperlipoproteinemi ve dislipidemi gibi aterojenik dislipidemi, diyabetik dislipidemi, TG 1000m mg / dL sahibi yaygin hipertrigliseridemi dahil olmak üzere hipertrigliseridemi, hiperkolesterolemi, silomikronemi, karisik dislipidemi (obezite, metabolik sendrom, diyabet, vs.), Iipodistropi, lipoatropi ve benzeri dahil olmak üzere azalan LPL aktivitesini ve / veya LPL eksikliginin, azalan LDL reseptör (LDLR) aktivitesinin ve / veya LDL reseptör eksikliginin (örn, LDLR- / - ile homozigot ailesel hiperkolesterolemi), degismis ApoCZ, ApoE eksikliginin, artan ApoB'nin, çok düsük yogunluklu Iipoproteinin (VLDL) azalan eliminasyonunun, belirli ilaç tedavilerinin (örn, glukokortikoid tedavisi ind'ukl'u dislipidemi), herhangi bir genetik egilim, diyet, yasam tarzi ve benzerinin neden oldugu Iipit metabolizmasini içerenleri içermektedir ancak bunlarla sinirli degildir. Yöntemler ayrica hiperlipidemi, hiperlipoproteinemi ve / veya dislipidemiden kaynaklanan veya bunlarla iliskili hastaliklari veya rahatsizliklari engelleyebilmek veya tedavi edebilmekte olup, aterosikleroz, anevrizma, hipertansiyon, anjin, felç, serebrovasküler hastaliklar, kongestif kalp rahatsizligi, koroner arter hastaliklari, miyokard enfarktüs, periferik vasküler hastaliklari ve benzerleri gibi kardiyovasküler hastaliklari; akut pankreatiti; alkol olmayan seteohepatiti (NASH); diyabet gibi kan sekeri hastaliklarini; obezite ve benzerini içermektedir ancak bunlarla sinirli degildir. Yöntemler tarafindan tedavi edilemeyen hastaliklara veya rahatsizliklara iliskin örnekler kanser / tümör ayni zamanda neo-plastik anjiyogenez ile iliskili hastaliklari veya rahatsizliklari içermekte olup, oküler anjiyojenik hastaliklari veya rahatsizliklar örnegin Yasa Bagimli Maküler Dejenerasyonu, merkezi retinal damar tikanmasini veya yan retinal damar tikanmasini, diyabetik retinopatiyi, prematüre retinopatisini ve benzerlerini, inflamatuar hastaliklari veya rahatsizliklari örnegin artrit, römatoid artrit (RA), psöriasis ve benzerlerini içermektedir ancak bunlarla sinirli degildir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, hANGPTL3 sekansinin (baska bir deyisle, SEK lD NO: 161*in kalintilari 30 ila 70 içinde veya GenBank #NP_055310) ilgili kisimlarina karsi bir anti-hANGPTL3 antikorunda kullanilan Peptitlerin 1-3 bir sekans hizalamasini göstermektedir. Peptit 1 (kontrol: ANGPTL4 peptit; SEK lD NO: 168); Peptit 2 (ANGPTL3 peptit; SEK ID NO: Sekil 2, hANGPTLsiün N-terminali sarilmis sarmal peptitlerine baglanan anti- hANGPTL3 antikorunun (Peptitler 2 ve 3) veya hANGPTL4 (Peptit .5: Izotip Kontrolü; ve I: H4H12768 antikorunun sonuçlarini göstermektedir AYRINTILI AÇIKLAMA Mevcut bulus detayli sekilde açiklanmadan önce bulusun belirli yöntemleriyle kisitli olmadigi ve bu yöntemler ve kosullar olarak açiklanan deneysel kosullar degisiklik gösterebilmektedir. Ayrica mevcut bulusun kapsami sadece ekli istemler tarafindan kisitlanacagindan dolayi burada kullanilan terminolojinin sadece belirli uygulamalarini açiklama amacini tasidigi ve kisitlayici olmayi amaçlamadigi anlasilmalidir. Aksi belirtilmedigi müddetçe burada kullanilan bütün teknik ve bilimsel terimler hak talebinde bulunulan konunun ait oldugu alanda siradan uzmanlikta kisi tarafindan genel olarak anlasilanla ayni anlama sahiptir. Her ne kadar burada açiklananlara benzer veya esdeger herhangi bir yöntem ve malzeme mevcut bulusun uygulamasinda veya test edilmesinde kullanilabilmektedir, tercih edilen yöntemler ve malzemeler simdi açiklanmaktadir Tanimlar Burada kullanildigi 'üzere "insan anjiyopoietin benzeri protein 3" veya "hANGPTLS" terimi SEK ID NO: 1627de gösterilen nükleik asit sekansina ve SEK lD NO: 161'in amino asit sekansina veya bunlarin biyolojik olarak aktif bir fragmanina sahip olan ANGPTL3*e isaret etmektedir. Burada kullanildigi üzere "antikor" teriminin dört polipeptit zincirinden, disülfit baglari vasitasiyla birbirine baglanan iki agir (H) zincirden ve iki hafif (L) zincirden olusan immunoglobulin moleküllerine isaret etmesi amaçlanmaktadir. Her bir agir zincir bir agir zincir degisken bölgesinden (HCVR) ve bir agir zincir sabit alanindan (CH; CH1, CH2 ve CH3 alanlarindan olusmaktadir) olusmaktadir. Her bir hafif zincir bir agir zincir degisken bölgesinden (LCVR) ve bir hafif zincir sabit bölgesinden (CL) olusur. HCVR ve LCVR ayrica hiper degiskenlik bölgelerine bölünebilmekte olup, tamamlayici belirleme bölgeleri (CDR) olarak adlandirilir, çerçeve bölgeleri (FR) olarak adlandirilan daha korunmus olan bölgelerin arasina yerlestirilir. Her bir HCVR ve LCVR üç CDR'den ve dört FR'den olusmakta olup, bunlar amino terminalinden karboksi terminaline dogru asagidaki sirada düzenlenir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, Bir veya daha fazla CDR kalintisinin ornatimi veya bir veya daha fazla CDRtnin çikarilmasi ayrica mümkündür. Antikorlar bir veya iki CDR*nin baglanma Için dagitilabildigi bilimsel literatürde açiklanmistir. Padlan ve arkadaslari (1995 FASEB J. 9:133-139) yayinlanan kristal yapilara dayanarak antikorlar ve bunlarin antijenleri arasindaki sabit bölgeleri analiz etmistir ve CDR kalintilarinin sadece yaklasik üçte birinin ila beste birinin gerçekten antijenle temas ettigi sonucuna varmistir. Padlan ayrica bir veya iki CDR'nin bir antijen ile temas halinde hiç bir amino aside sahip olmadigi birçok antikor bulmustur. Antijen ile temas etmeyen CDR kalintilari önceki çalismalara dayanarak (örnegin, CDRH2'de kalintilar H60-H65 siklikla gerekmemektedir) moleküler modelleme vasitasiyla ve / veya ampirik olarak Chothia CDR'lerin disinda kalan Kabat CDR bölgelerinden tanimlanabilmektedir. Eger bir CDR veya bunun kalintisi (kalintilari) çikartilirsa genellikle baska bir insan antikor sekansinda veya bu sekanslarin bir konsensusundaki karsilik gelen pozisyonu isgal eden bir amino asit ile ornatilmaktadir. Ornatmak için CDR*ler ve amino asitler içindeki ornatim pozisyonlari ayrica ampirik olarak seçilebilmektedir. Ampirik ornatimlar geleneksel veya geleneksel olmayan ornatimlar olabilmektedir. Burada kullanilan sekliyle "insan antikoru" teriminin, insan germ hatti sekanslarindan türetilen degisken ve sabit bölgelere sahip olan antikorlari içermesi amaçlanmaktadir. Bulusun insan mAb,Ieri insan germ hatti immünoglobulin sekanslari tarafindan kodlanmayan amino asit kalintilarini da kapsayabilir (örnegin rastgele ya da alana özgü mutagenez yoluyla in vitro olarak ya da somatik mutasyon yoluyla in vivo olarak dahil edilen mutasyonlar). Ancak "Insan antikor" terimi, içerisinde baska bir memeli türünün germ hattindan türetilen CDR sekanslarinin insan FR sekanslarina grafte edilmis oldugu mAb'leri içermesi amaçlanmaktadir. Burada açiklanan tam olarak insan anti-hANGPTL3 antikorlari çerçevede bir veya daha fazla amino asit ornatimi, eklemesi ve / veya çikarmasi ve / veya karsilik gelen germ hatti sekanslariyla karsilastirildigi zaman agir ve hafif zincir degisken alanlarinin CDR bölgelerini içerebilmektedir. Bu mutasyonlar burada açiklanan amino asit sekanslarinin örnegin kamusal antikor sekansi veri tabanlarindan bulunabilen germ hatti sekanslariyla karsilastirilarak kolaylikla belirlenebilmektedir. Mevcut patent hakki bildirimi burada açiklanan amino asit sekanslarinin herhangi birinden türetilen antikorlari ve antijen baglama fragmanlarini içermekte olup, burada bir veya daha fazla çerçeve ve / veya DR bölgesi içindeki bir veya daha fazla amino asit türetildigi antikordan germ hatti sekansinin karsilik gelen kalintisina (kalintilarina) veya baska bir insan germ hatti sekansinin karsilik gelen kalintisina (kalintilarina) veya karsilik gelen germ hatti kalintisinin (kalintilarinin bir konzervatif amino asit ornatimina mutasyona ugramaktadir (bu sekans degisimleri burada toplu olarak "germ hatti mutasyonlari" olarak anilmaktadir). Teknikte siradan uzmanlikta bir kisi burada açiklanan agir ve hafif zincir degisken bölge sekanslari ile baslayarak bir veya daha fazla münferit germ hatti geri mutasyonu veya bunlarin kombinasyonunu içeren çesitli antikorlar ve antijen baglama fragmanlarini kolayca üretebilmektedir. Belirli yönlerde VH ve / veya VL alanlari içindeki çerçevenin ve / veya CDR kalintilarinin hepsi antikorun türetilmis oldugu orijinal germ hatti sekansinda bulunan kalintilari olusturacak sekilde mutasyona ugramaktadir. Diger yönlerde sadece belirli kalintilar orijinal germ hatti sekansina 'orn, sadece FR1rin ilk 8 amino asidi içinde veya F4rün son 8 amino asidi içinde bulunan mutasyona ugramis kalintilara veya sadece CDR1, CD2 veya CDR3 içinde bulunan mutasyona ugramis kalintilara geri mutasyona ugramaktadir. Diger yönlerde çerçevenin ve / veya CDR kalintisinin (kalintilarinin) biri veya daha fazlasi farkli bir germ hatti sekansinin karsilik gelen kalintisini (kalintilarini) olusturacak sekilde mutasyona ugramaktadir (baska bir deyisle, antikorun orijinal olarak türetildigi germ hatti sekansindan farkli olan bir germ hatti sekansi). Bundan baska antikorlar çerçeve ve / veya CDR bölgesi içindeki iki veya daha fazla germ hatti mutasyonunun herhangi bir kombinasyonunu içerebilmekte olup, örnegin burada belirli münferit kalintilar belirli bir germ hatti sekansinin karsilik gelen kalintilarini olusturacak sekilde mutasyona ugrarken orijinal germ hatti sekansindan farklilik gösteren baska belirli kalintilar farkli bir germ hatti sekansinin karsilik gelen kalintilarini olusturacak sekilde mutasyona ugramaktadir. Elde edildikten sonra bir veya daha fazla germ hatti mutasyonu içeren antikorlar ve antijen baglama fragmanlari gelismis baglama spesifitesi, artan baglanma afinitesi, gelismis veya artmis antagonistik veya agonistik biyolojik özellikler (durumun oldugu gibi), indirgenmis immünojenisite, vb. gibi bir veya daha fazla istenen özellige yönelik kolay bir sekilde test edilebilmektedir. Bu genel sekilde elde edilen antikorlar ve antijen baglama fragmanlari mevcut patent hakki bildirimi içinde kapsanmaktadir. Mevcut patent hakki bildirimi ayrica anti-ANGPTL3 antikorlarini içermekte olup, bir veya daha fazla konzervatif ornatima sahip olan, burada açiklanan HCVR, LCVR ve / veya CDR amino asit sekanslarinin herhangi birinin varyantlarini içermektedir. 'Ornegin mevcut patent hakki bildirimi anti-ANGPTL3 antikorlarini içermekte olup, burada açiklanan HCVR, LCVR ve / veya CDR amino asit sekanslarinin her birine göre örnegin 10 veya daha az, 8 veya daha az, 6 veya daha az, 4 veya daha az, 2 veya 1 konzervatif amino asidi olan HCVR; LCVR ve / veya CDR amino asit sekanslarina sahiptir. Bir yönde bir HCVR SEK ID NO: 487'nin amino asit sekansini içermekte olup, burada 10 veya daha az konzervatif amino asit ornatimi vardir. Baska bir yönde bir HCVR SEK ID NO: 4877nin amino asit sekansini içermekte olup, burada 8 veya daha az konzervatif amino asit ornatimi vardir. Baska bir yönde bir HCVR SEK lD NO: 487=nin amino asit sekansini içermekte olup, burada 6 veya daha az konzervatif amino asit ornatimi vardir. Baska bir yönde bir HCVR SEK ID NO: 487'nin amino asit sekansini içermekte olup, burada 4 veya daha az konzervatif amino asit ornatimi vardir. Baska bir yönde bir HCVR SEK lD NO: 487'nin amino asit sekansini içermekte olup, burada 2 veya 1 konzervatif amino asit ornatimi vardir. Bir yönde bir LHCVR SEK amino asit ornatimi vardir. Baska bir yönde bir LCVR SEK lD NO: 44"un amino asit sekansini içermekte olup, burada 8 veya daha az konzervatif amino asit ornatimi vardir. Baska bir yönde bir LCVR SEK ID NO: 44"un amino asit sekansini içermekte olup, burada 6 veya daha az konzervatif amino asit ornatimi vardir. Baska bir yönde bir LCVR SEK ID NO: 44"ün amino asit sekansini içermekte olup, burada 4 veya daha az konzervatif amino asit ornatimi vardir. Baska bir yönde bir LCVR SEK lD NO: 44"uin amino asit sekansini içermekte olup, burada 2 veya 1 konzervatif amino asit ornatimi Aksi spesifik olarak belirtilmedigi müddetçe burada kullanildigi üzere "antikor" teriminin iki immünoglobulin agir zincirini ve iki imm'unoglobulin hafif zincirini (baska bir deyisle, antijen baglama fragmanlarini kapsadigi anlasilmalidir. Bir antikorun "antijen baglama kismi", bir antikorun "antijen baglama fragmani" ve benzerleri bir kompleks olusturmak için bir antijeni spesifik olarak baglayan herhangi bir dogal olarak meydana gelen, enzimatik olarak elde edilebilen, sentetik veya genetik olarak üretilmis polipeptiti veya glikoproteini içermektedir. Bir antikorun antijen baglama fragmanlari proteolitik parçalama veya antikor degisken ve (opsiyonel olarak) sabit alanlarini kodlayan DNAinin manipülasyonunu ve ekspresyonunu içeren rekombinant genetik üretim teknikleri gibi herhangi bir uygun standart teknik kullanilacak örn, eksiksiz antikor moleküllerinden türetilebilmektedir. Bu DNA örn, ticari kaynaklardan, DNA kütüphanelerinden (bm, faj-gorüntüleme antikor kütüphaneleri dahil olmak üzere) kolay bir sekilde bulunabilmekte ve / veya bilinmektedir veya sentezlenebilmektedir. DNA örnegin bir veya daha fazla degisken ve / veya sabit alanlari uygun bir konfigürasyonda düzenlemek veya kodonlar dahil etmek, sistein kalintilari meydana getirmek, amino asitleri modifiye etmek, eklemek veya silmek, vb. için kimyasal olarak veya moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak sekanslanabilir ve maniple edilebilmektedir. Antijen baglama fragmanlarinin kisitlayici olmayan örnekleri (i) Fab fragmanlarini; (ii) F(ab')2 fragmanlar; (iii) Fd fragmanlar; (iv) Fv fragmanlar; (v) tek zincirli Fv (soFv) moleküllerini; (vi) dAb fragmanlarini ve (vii) bir antikorun hiper degisken bölgesini taklit eden amino asit kalintilarindan (tüm, bir CDR3 peptit gibi bir izole edilmis tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR)) veya bir kisitli FR3-CDR3-FR4 peptitinden olusan minimum ayirt etme birimlerini içermektedir. Alana özgü antikorlar, tek alan antikorlari, alanda silinmis antikorlar, kimerik antikorlar, CDR-grafte edilmis antikorlar, diabodiler, triabodiler, tetrabodiler, minibodiler, nanobadiler (örn, monovalent nanobodiler, bivalent nanobodiler, vb.), küçük modüler immünofarmas'otikler (SMlPiler) ve keskin degisken lgNAR alanlar gibi diger üretilmis moleküller de ayrica burada kullanildigi üzere "antijen baglama fragmani" ifadesi içinde kapsanmaktadir. Bir antikorun bir antijen baglama fragmani tipik olarak en az bir degisken alan içerecektir. Degisken alan herhangi bir büyüklükte amino asit bilesimi olabilmektedir ve genel olarak bir veya daha fazla çerçeve sekansi ile bitisik veya çerçeve içinde en az bir CDR içerecektir. Bir VL alani ile iliskili bir VH alanina sahip olan antijen baglama fragmanlarinda VH ve VL alanlari uygun herhangi bir düzenlemede baska birine göre yerlestirilebilmektedir. Ornegin degisken alan dimerik olabilmektedir VH-VH, VH-VL ya da VL-VL ve dimerlerini içerebilmektedir. Alternatif olarak bir antikorun antijen baglama fragmani bir monomerik VH veya VL alani içerebilmektedir. Belirli uygulamalarda bir antikorun bir antijen baglama fragmani en az bir sabit alana kovalent olarak baglanan en az bir degisken alan içerebilmektedir. Mevcut bulusun bir antikorunun bir antijen baglama fragmani içinde bulunabilen degisken ve sabit alanlarin kisitlayici olmayan, 'Örnek konfigürasyonlari (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH- (IX) VL-CH2; (X) VL-CHS; (Xi) VL-CH'l-CHZ; (XII) VL-CH1-CH2-CH3; (XIII) VL-CH2-CH3 ve (xiv) VL-CL içermektedir. Yukarida listelenen örnek niteligindeki konfigürasyonlarin herhangi biri dahil olmak üzere sabit ve degisken alanlarin herhangi bir konfigürasyonunda degisken ve sabit alanlar birbirine ya dogrudan baglanmaktadir ya da bir tam veya kismi mentese veya baglayici bölge vasitasiyla baglanabilmektedir. Bir mentese bölgesi tek bir polipeptit moleküldeki bitisik degisken ve / veya sabit alan 60 veya daha fazla) amino asitten olusabilmektedir. Bunun 'ötesinde mevcut bulusun bir antikorunun bir antijen baglama fragmani bir digeriyle ve / veya bir veya daha fazla monomerik VH veya VL alani (örn, disülfit bagi (baglari) vasitasiyla) ile kovalent olmayan iliski içinde yukarida listelenen degisken ve sabit alan konfigürasyonlarinin herhangi birinin Eksiksiz antikor molekülleri ile oldugu gibi antijen baglama fragmanlari monospesifik veya multispesifik (bm, bispesifik) olabilmektedir. Bir antikorun bir multispesifik antijen baglama fragmani tipik olarak en az iki farkli degisken alan içerecek olup, burada her bir degisken alan spesifik olarak ayri bir antijene veya ayni antijen üzerinde farkli bir epitopa baglanabilmektedir. Burada açiklanan 'örnek niteligindeki bispesifik antikor formatlari dahil olmak 'üzere herhangi bir multispesifik antikor formati teknikte bulunabilen rutin teknikleri kullanarak mevcut bulusun bir antikorunun bir antijen baglama fragmaninin kapsaminda kullanim için uyarlanabilmektedir. Belirli uygulamalarda bulusun antikoru veya antikor fragmani bir sitotoksin, bir kemoterapötik ilaç, bir immüno baskilayici veya bir radyo izotop gibi bir terapötik kisma ("immünokonjugat") konjuge olabilmektedir. baglama fragmanlarinin fizyolojik kosullar altinda nispeten stabil olan bir antijen ile bir kompleks olusturdugu anlamina gelmektedir. Spesifik baglanma yaklasik M veya daha az (baska bir deyisle, daha küçük bir KD daha siki bir baglanmayi belirtmektedir) bir denge çözüs'üm sabiti (KD) ile karakterize edilmektedir. Iki molekül'Un spesifik olarak baglanip baglanmadigini belirlemeye yönelik yöntemler teknikte iyi bilinmektedir ve örnegin denge diyalizi, yüzey plazmon rezonansi ve benzerini içermektedir. Spesifik olarak hANGPTL3 baglayan bir izole edilmis antikor ayrica diger türlerden ANGPTL3 molekülleri örnegin sinomolgus maymunu ANGPTLS, fare ANGPTL3, siçan ANGPTL3 gibi diger antijenlerle ve / veya SEK ID NO: 164'ün amino asit sekansina sahip olan hANGPTL4 ile çapraz reaktivitesini çapraz iliskilendirebilmektedir. Bunun ötesinde hANGPTLS'e ve bir veya daha fazla ilave antijene multi-spesifik antikorlar (örn, bispesifikler) bununla beraber burada kullanildigi üzere hANGPTL3,ü "spesifik olarak baglayan" antikorlar olarak degerlendirilmektedir. Yüzey plazmon rezonans örn, BIACORETM veya solüsyon afinitesi ELIZA vasitasiyla ölçüldügü üzere yaklasik 2x10'9 M veya daha az, yaklasik 1.5x10*9 M veya daha az, daha 2 KD olarak ifade edilen, hANGPTL3'e bir baglanma afinitesine sahip olan Burada kullanildigi üzere "KD" teriminin belirli bir antikor-antijen etkilesiminin denge çözüsüm sabitini isaret etmesi amaçlanmaktadir. ile hANGPTL3'ten ayrilan bir antikor anlamina gelmektedir. vasitasiyla belirlendigi üzere yaklasik 1 x 103 M'is-1 veya daha yüksek bir hiz sabitinde hANGPTL3 ile iliskili olan bir antikor anlamina gelmektedir. Burada kullanilan sekliyle "izole edilmis bir antikorun", farkli antijenik spesifitelere sahip olan baska antikorlardan büyük ölçüde bagimsiz olan bir antikoru göstermesi amaçlanmaktadir (örnegin hANGPTLS'e spesifik olarak baglanan izole edilmis bir antikor, hANGPTL3 disinda antijenlere spesifik olarak baglanan antikorlardan büyük ölçüde bagimsizdir). Spesifik olarak hANGPTL3 baglayan bir izole edilmis antikor ayrica sinomolgus maymunu, fare, siçan ve / veya ANGPLT4 gibi baska iliskili proteinler gibi diger antijenler ile çapraz reaktivitesini çapraz iliskilendirebilmektedir. Burada kullanildigi sekilde bir "nötrlestirici", "bloke edici" veya "ortadan kaldirici" antikorun (veya ANGPTL3 aktivitesini "nötrlestiren", "bloke eden" veya "ortadan kaldiran") ANGPTL3'e baglanmasi teknikte bilinen in vitro analizler vasitasiyla degerlendirildigi `üzere (örnegin, bkz, asagidaki örnekler) ANGPTLS'Ün en az bir biyolojik aktivitesinin dogrudan inhibisyonu ile sonuçlanan bir antikora isaret etmesi amaçlanmaktadir. "Nötrlestirmek, "inhibe etmek", "bloke etmek" ve "ortadan kaldirmak" terimleri burada degistirilebilir sekilde kullanilabilmektedir. Bir "bloke etmeyen" antikor ANGPTLB'e baglanmasi standart in vitro analizler vasitasiyla degerlendirildigi 'üzere ANGPTLS'ün bir hedeflenen aktivitesini dogrudan bloke etmeyen ancak sirkülasyondan ANGPLTS'ün kleransini arttirarak in vivo ANGPTLS'e baglanmasi ANGPTL3'un en az bir biyolojik aktivitesinin dolayli inhibisyonu, azalmasi, hafiflemesi veya diger etkilesimleri ile sonuçlanan bir "müdahaleci" antikor olabilen bir antikora isaret etmektedir. ANGPTLB'Un sirkülasyondan kleransi özellikle en az iki bloke etmeyen antikorun bir kombinasyonu vasitasiyla özellikle arttirilabilmektedir. ANGPTL3*i'.in nötralizasyonu, inhibisyonu, ortadan kaldirilmasi, azalmasi, hafiflemesi veya etkilesimi teknikte bilinen çesitli standart in vitro veya in vivo analiz vasitasiyla ANGPTL3 biyolojik aktivitesinin bir veya daha fazla göstergesinin ölçülmesi vasitasiyla degerlendirilebilmektedir. Burada kullanildigi üzere "yüzey plazmon rezonans" terimi örnegin BIACORETM sistem (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.) kullanarak bir biyosensör matris içindeki protein konsantrasyonlarindaki degisimlerin tespiti vasitasiyla gerçek zamanli biyospesifik etkilesimlerin analizine olanak saglayan bir optik fenomene isaret etmektedir. yapisal veya fonksiyonel olarak tanimlanabilmektedir. Fonksiyonel epitoplar genel olarak yapisal epitoplarin bir alt dizisidir ve etkilesimin afinitesine dogrudan katkida bulunan bu kalintilara sahiptir. Epitoplar uyusumlu olabilmektedir, lineer olmayan amino asitlerden olusmaktadir. Belirli uygulamalarda epitoplar amino asitler, seker tarafi zincirleri, fosforil gruplari veya sülfonil gruplari gibi moleküllerin kimyasal olarak aktif y'uzey gruplandirmalari olan belirleyiciler içerebilmektedir veya belirli uygulamalarda üç boyutlu spesifik yapisal karakteristiklere ve / veya spesifik y'uk karakteristiklerine sahip olabilmektedir. Bir nükleik asite veya bunun fragmanina atifta bulunuldugu zaman "büyük ölçüde özdeslik" veya "büyük ölçüde özdes" terimi uygun nükleotit eklemeleri veya silinmeleri ile baska bir nükleik asidi (veya bunun komplementer sarmalini) optimal olarak hizaladigi zaman asagida tartisildigi üzere FASTA, BLAST veya GAO gibi sekans özdesligine iliskin iyi bilinen herhangi bir algoritma tarafindan ölçüldügü üzere en az yaklasik % 90 ve daha da tercih edilen sekliyle en az yaklasik % 95, % 96, % 97, % 98 veya % 99 nükleotit sekans özdesligi oldugunu belirtmektedir. Polipeptitlere uygulandigi sekilde "büyük ölçüde benzer" veya "büyük ölçüde benzerlik" terimi varsayilan aralik agirliklarini kullanarak GAP veya BESTFIT programlari vasitasiyla optimal olarak hizalandigi zaman iki peptit sekansinin en az % 90 sekans özdesligi, daha da tercih edilen sekliyle en az % 95, % 98 veya % 99 sekans özdesligi paylastigi anlamina gelmektedir. Tercih edilen sekliyle özdes olmayan kalinti pozisyonlar konzervatif amino asit sekanslari ile farklilik göstermektedir. Bir (örn, yük veya hidrofobisite) olan bir yan zincire (R grubu) sahip olan baska bir amino asit kalintisi ile ornatilabildigi biridir. Genel olarak bir konzervatif amino asit ornatimi bir proteinin fonksiyonel özelliklerini büyük ölçüde degistirmeyecektir. Iki veya daha fazla amino asit sekansinin bir digerinden konzervatif ornatimlar vasitasiyla farklilik gösterdigi durumlarda benzerlik yüzdesi veya derecesi ornatimin konzervatif dogasini düzeltmek için yukari dogru ayarlanabilmektedir. Bu ayarlamayi yapmak için araçlar teknikte uzman kisilerce iyi bilinmektedir. Bkz, örn, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Benzer kimyasal özellikleri olan yari zincirlere sahip olan amino asit gruplarinin örnekleri 1) alifatik yan zincirler: glisin, alanin, valin, lösin ve izolösin; 2) alifatik-hidroksil yan zincirleri; serin ve treonin; 3) amid içeren yan zincirler: asparjin ve glutamin; 4) aromatik yan zincirler: fenilalanin, tirozin ve triptofan; 5) bazik yan zincirler: lizin, arjinin ve histidin; 6) asidik yan zincirler: aspartat ve glutamat ve 7) sülfür içeren yan zincirler: sistein ve metiyonin içermektedir. Tercih edilen konzervatif amino asit ornatim gruplari valin-lösin-izolösin, fenilalanin-tirozin, lizin-arjinin, alanin-valin, glutamat-aspartat ve asparjin-glutamattir. Alternatif olarak bir konzervatif yer log-benzeri matriste bir pozitif degere sahip olan herhangi bir degisimdir. "Orta derecede konzervatif" bir yer degistirme PAM250 log benzeri matriste bir negatif olmayan degere sahip olan herhangi bir degisimdir. Polipeptitler için sekans özdesligi tipik olarak sekans analiz yazilimi kullanarak ölçülmektedir. Protein analizi yazilimi konzervatif amino asit ornatimi dahil olmak üzere çesitli ornatimlara, silinmelere ve diger modifikasyonlara atanan benzerlik ölçümleri kullanilarak benzer sekanslarla eslesmektedir. Ornegin GCG yazilimi sekans homolojisini veya yakindan iliskili polipeptitler, örnegin organizmalarin farkli türlerinden homolog polipeptitler arasinda veya bir sokak tipi protein ve bunun bir muteini arasindaki sekans homolojisini veya sekansini belirlemek için varsayilan parametreler ile kullanilabilen GAP ve BESTFIT gibi programlari içermektedir. Bkz, örn., GCG Versiyon 6.1. Polipeptit sekanslari ayrica FASTA kullanilarak varsayilan veya önerilen parametrelerle karsilastirilabilmektedir; GCG Versiyon 6.1*de bir program. FASTA (örn, FASTA2 ve FASTA3) sira ve arastirma sekanslari arasindaki en iyi üst üste binme alanlarinin hizalamalarini ve yüzde sekans özdesligini saglamaktadir (Pearson (2000) yukarida geçen). Bulusun bir sekansi farkli organizmalardan çok sayida sekans içeren bir veri tabani ile karsilastirildigi zaman tercih edilen baska bir algoritma varsayilan parametreleri kullanan bilgisayar programi BLAST, özellikle BLASTP ve anlamina gelmektedir. Kesin miktar tedavi amaci, uygulama yolu, tedavi edilen bir denegin yasi ve kilosu ve benzerine dayanacaktir ve bilinen teknikler kullanilarak teknikte uzman bir kisi tarafindan degerlendirilebilecektir (bkz, örnegin Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding). Insan Antikorlarinin Hazirlanmasi Transjenik farelerde insan antikorlari olusturmak için yöntemler teknikte bilinmektedir. Bu tür bilinen herhangi bir yöntem ANGPTLßte spesifik olarak baglanan insan antikorlari yapmak için mevcut bulusun kapsaminda kullanilabilmektedir. Monoklonal antikorlar üretmeye yönelik VELOCIMMUNETN' teknolojisini veya bilinen baska bir yöntemi kullanarak ANGPTL3,e yüksek afiniteli kimerik antikorlar ilk olarak bir insan degisken alanina ve bir fare sabit alanina sahip olacak sekilde izole edilmektedir. Asagidaki deney bölümündeki gibi antikorlar afinite, seçicilik, epitop ve benzeri dahil olmak üzere istenen karakteristiklere yönelik karakterize edilmekte ve seçilmektedir. Genel olarak mevcut bulusun antikorlari y'uksek afiniteler saglamakta olup, gerek kati faz gerekse solüsyon fazinda immobilize edilen antijene baglanma vasitasiyla ölçülen 1042 M ila yaklasik 10'9 M'Iik KD sahiptir. Fare sabit bölgeleri bulusun tam olarak insan antikorlarini olusturmak için istenen insan sabit bölgeleri, örnegin sokak tipi IgG1 veya spesifik kullanima göre degisiklik gösterebilirken antikorlarin y'uksek afiniteli antijen baglama ve hedef spesifitesi özellikleri degisken bölgelerde bulunmaktadir. Epitop Esleme ve Iliskili Teknolojiler Belirli bir epitopa baglanan antikorlari taramak için Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY) yayininda açiklananlar gibi bir rutin çapraz bloke edici analiz gerçeklestirilebilmektedir. Diger yöntemler alanin tarama klevaj analizlerini içermektedir. Ek olarak antijenlerin epitop eksizyonu, epitop ekstraksiyonu ve kimyasal modifikasyonu kullanilabilmektedir (Tomer (2000) Protein gelmektedir. B-hücre epitoplari bir proteinin tersiyer katlanmasi vasitasiyla yan yana koyulan hem kesintisiz amino asitlerden hem de kesintili amino asitlerden olusturulabilmektedir. Kesintisiz amino asitlerden olusturulan epitoplar tipik olarak denat'ure edici solventlere maruz kalma üzerine tutulurken tersiyer katlama vasitasiyla olusturulan epitoplar tipik olarak denat'ure edici solventler ile islem üzerine kaybolmaktadir. Bir epitop tipik olarak kendine özgü bir uzamsal konformasyonda en az 3 ve daha genel olarak en az 5 veya 8-10 amino asit içermektedir. Modifikasyona Yardimci Profilleme (MAP), ayrica Antijen Yapisina dayali Antikor Profilleme (ASAP) olarak bilinmektedir, her bir antikorun kimyasal olarak veya enzimatik olarak modifiye edilmis antijen yüzeylerine baglanma profiline iliskin benzerliklerine göre ayni antijene karsi yönlendirilen çok sayida monoklonal antikor bir kategori ile gösterilen epitoptan çok farklidir ya da kismen bununla üst 'üste binmektedir. Bu teknoloji genetik olarak özdes mAb'Ierin karakterizasyonun genetik olarak ayri mAbtIere odaklanabilecegi sekilde hizli filtrelenmesine olanak saglamaktadir. Hibridoma taramaya uygulandigi zaman MAP istenen karakteristiklere sahip olan mAb'ler üreten nadir hibridoma klonlarinin tanimlamasini kolaylastirabilmektedir. MAP bulusun anti-ANGPTL3 mAb'lerini farkli epitoplari baglayan mAb gruplarina ayirmak için kullanilabilmektedir. ANGPTL3 bir amino-terminali sarilmis sarmal alani ve bir karboksil-terminali fibrinojen benzeri alan (FD) içermektedir ve ANGPTL3 proteini molekül için difülsit baglarinin N-terminali sarilmis sarmal alaninin LPL aktivitesinin inhibisyonunda önemli oldugu anti-hANGPTL3 antikoru veya bunun antijen baglama fragmani hANGPTL3tün (SEK baglamaktadir ve hANGPTL3'ün en az bir aktivitesini nötr hale getirmektedir. Anti- hANGPLT3 antikoru veya bunun antijen baglama fragmani, antikor veya bunun fragmaninin SEK ID NO: 170'in ANGPTL3 peptitini baglamamasi kosuluyla hANGPTLS'ün N-terminali sarilmis sarmal alani içindeki bir epitopu baglamakta ve hANGPTLßrün en az bir aktivitesini nötr hale getirmektedir. Antikor veya bunun fragmani opsiyonel olarak SEK lD NO: 170'in ANGPTL3 peptitine baglanmamasi veya 17 ila 35 içindeki bir epitopu baglayabilmektedir. Antikor veya bunun fragmani opsiyonel olarak SEK ID NO: 170'in ANGPTL3 peptitine baglanmamasi kosuluyla, ila 66 (bir "heparin baglama motifi" olarak bilinmektedir) içindeki bir epitopu baglayabilmektedir. Bazi yönlerde antikor veya antikor fragmani opsiyonel olarak antikorun veya bunun fragmaninin SEK lD NO: 170!in ANGPTL3 peptitini baglamamasi kosuluyla N-terminal sarilmis sarmal bölgesi içindeki sayili epitoplarin veya kalintilarini birinden daha fazlasini içerebilen bir epitopu baglamaktadir. Patent hakki bildiriminin diger yönlerinde hANGPTLS antikoru veya bunun fragmani, opsiyonel olarak antikorun veya bunun fragmaninin SEK ID NO: 170'in ANGPTL3 peptitine baglanmamasi kosuluyla hANGPTL3*ün bir veya daha fazla fragmanini, örnegin hANGPTLßrün (SEK ID NO: 161) en az 5 kalintilik, en az 7 kalintilik, en az 10 en az 150 kalintilik veya en az 200 kalintilik bir fragmanini baglamaktadir. Mevcut patent hakki bildirimi burada açiklanan spesifik örnek niteligindeki antikorlarin herhangi biri ile ayni epitopa baglanan hANGPTL3 antikorlarini içermektedir. Benzer sekilde mevcut patent hakki bildirimi burada açiklanan spesifik örnek niteligindeki antikorlarin herhangi biri ile hANGPTL3 veya bir hANGPTL3 fragmanina baglanma için rekabet eden anti-hANGPTL3 antikorlari içermektedir. Bir kisi bir antikorun bir referans anti-hANGPTL3 antikoru ile ayni epitopa baglanip baglanmadigini veya bununla baglanmak için rekabet edip etmedigini teknikte bilinen rutin yöntemler vasitasiyla kolay bir sekilde belirleyebilmektedir. Örnegin bir test antikorunun bir referans anti-hANGPTL3 antikoru olarak ayni epitopa baglanip baglanmadigini belirlemek için referans antikorun doygunlastirici kosullar altinda bir hANGPTL3 proteinine veya peptitine baglanmasina olanak saglamaktadir. Daha sonra bir test antikorunun hANGPTL3 molek'uli'ine baglanma kabiliyeti degerlendirilmektedir. Eger test antikoru referans anti-hANGPTL3 antikoru ile doygunluk baglanmasini takiben hANGPTLB'e baglanabiliyorsa test antikorunun referans anti-hANGPTL3 antikorundan farkli bir epitopa baglandigi sonucuna varilabilmektedir. Diger taraftan eger test antikoru referans anti-hANGPTL3 antikoru ile doygunluk baglanmasini takiben hANGPTL3'e baglanamiyorsa o zaman test antikorunun referans anti- hANGPTL3 antikoruyla ayni epitopa baglanabildigi sonucuna varilabilmektedir. Bir antikorun bir referans hANGPTL3 antikoru ile baglanmak için rekabet edip etmedigini belirlemek için yukarida açiklanan baglama metodolojisi iki oryantasyonda gerçeklestirilmektedir: Bir birinci oryantasyonda referans antikor test antikorunun hANGPTL3 molekülune baglanmasina iliskin degerlendirmeyi takiben doygunlastirici kosullar altinda bir hANGPTL3 molekülüne baglanmasina olanak saglanmaktadir. Bir ikinci oryantasyonda test antikoru referans antikorunun hANGPTL3 molekül'une baglanmasina iliskin degerlendirmeyi takiben doygunlastirici kosullar altinda bir hANGPTL3 molekül'une baglanmasina olanak saglanmaktadir. Eger her iki oryantasyonda da sadece birinci (doygunlastirici) antikor ANGPTLS molekülüne baglanabiliyorsa o zaman test antikorunun ve referans antikorunun hANGPTL31e baglanmak için rekabet ettigi sonucuna varilabilmektedir. Teknikte siradan uzmanlikta bir kisi tarafindan takdir edilecegi 'üzere bir referans antikor ile baglanmak için rekabet eden bir antikorun referans antikor gibi özdes epitopa baglanmasina gerek olmayabilmektedir ancak üst üste binen veya bitisik bir epitopun baglanmasi vasitasiyla referans antikorun baglanmasini sterikal olarak bloke edebilmektedir. Iki antikor eger her biri digerini antijene baglanmasini rekabetçi bir sekilde inhibe ediyorsa (bloke ediyorsa) ayni veya üst üste binen epitopa baglanabilmektedir. Yani bir karsilastirmali baglanma analizinde ölçüldügü üzere bir antikorun bir 1-, 5-, 10-, 20- veya 100-kat fazlasi digerinin baglanmasini en az % 50 ancak tercih edilen sekliyle % 75, % 90 veya hatta % 99 inhibe etmektedir (bkz, örn, Junghans et al., Cancer Res, baglanmasini azaltan veya ortadan kaldiran esasen bütün amino asit mutasyonlari digerine baglanmayi azaltiyorsa veya ortadan kaldiriyorsa ayni epitopa sahiptir. Iki antikor eger bir antikorun baglanmasini azaltan veya ortadan kaldiran bazi amino asit mutasyonlari digerinin baglanmasini azaltiyorsa veya ortadan kaldiriyorsa üst üste binen epitopa sahiptir. Ilave rutin deneyler (örn, peptit mutasyonu ve baglanma analizleri) daha sonra test antikorunun gözlemlenen baglanma eksikliginin aslinda referans antikorla ayni epitopa baglanmadan dolayi olup olmadigini veya eger sterik blokajin (baska bir fenomen) gözlemlenen baglanma eksikliginden sorumlu olup olmadigini onaylamak için gerçeklestirilebilmektedir. Bu türde deneyler teknikte bulunabilen ELIZA, RIA, yüzey plazmon rezonansi, akis sitometrisi veya herhangi baska bir niteliksel veya niceliksel antikor baglama analizi kullanilarak gerçeklestirilebilmektedir. Imünokonjugatlar Bulus bir sitotoksin, bir kemoterapötik ilaç, bir immüno baskilayici veya bir radyo izotop gibi bir terapötik kisma ("immünokonjugat") konjuge edilen bir insan anti-ANGPTL3 monoklonal antikorunu kapsamaktadir. Sitotoksin ajanlar hücreler için öldürücü olan herhangi bir ajan içermektedir. Uygun sitotoksin ajanlari ve immünokonjugatlari olusturmaya yönelik kemoterapötik ilaçlara iliskin örnekler teknikte bilinmektedir, bkz, örnegin WC 05/ 103081. Bispesifikler Mevcut bulusun antikorlari monospesifik, bispesifik veya multispesifik olabilmektedir. Multispesifik mAb'Ier bir hedef polipeptitin farkli epitoplarina özgü olabilmektedir veya birden fazla hedef polipeptite özgü antijen baglama alanlari içerebilmektedir. Bkz, örn, fonksiyonel moleküle, örn, baska bir peptite veya proteine baglanabilmekte veya bununla birlikte eksprese edilebilmektedir. Örnegin bir antikor veya bunun fragmani bir ikinci baglama spesifitesi olan bir bispesifik veya bir multispesifik antikor üretmek için baska bir antikor gibi bir veya daha fazla baska moleküler entiteye fonksiyonel olarak baglanabilmektedir (örn, kimyasal kenetleme, genetik füzyon, kovalent olmayan birlesme veya baskasi). Mevcut bulusun kapsaminda kullanilabilen 'örnek niteligindeki bir bi-spesifik antikor formati bir birinci immünoglobulin (lg) CH3 analinin ve bir ikinci lg CH3 alaninin kullanimini içermekte olup, burada birinci ve ikinci CHS alani bir digerinden en az bir amino asit ile farklilasmaktadir ve burada en az bir amino asit farki amino asit farkindan muaf bir bi-spesifik antikorla karsilastirildigi zaman bispesifik antikorun Protein A'ya baglanmasini azaltmaktadir. Bir uygulamada birinci lg CH3 alani Protein Atyi baglamaktadir ve ikinci CH3 alani bir H95R (IMGT ekson numaralandirilmasina bre: EU numaralandirmasina göre H435R) modifikasyonu gibi Protein A baglamasini azaltan veya oradan kaldiran bir mutasyon içermektedir. Ikinci CHB ayrica bir Y96F modifikasyonu (IMGT göre; Y436F EUtya göre) içerebilmektedir. Ikinci CH3 içinde bulunabilen diger modifikasyonlar sunlari içermektedir: D16E, L18M, N44S, K52N, ve V422I; EU'ya göre) lgG4 antikorlari durumunda. Yukarida açiklanan bi-spesifik antikor formatindaki varyasyonlar tasarlanmaktadir. Biyo esdegerler Mevcut patent hakki bildiriminin anti-hANGPTLS antikorlari ve bunlarin antikor fragmanlari açiklanan mAb*Ierinkinden farklilik gösteren ancak insan ANGPTLS'e baglanma kabiliyetini koruyan amino asit sekanslarina sahip olan proteinleri kapsamaktadir. Bu varyant mAb ve antikor fragmanlari ana sekansla karsilastirildigi zaman bir veya daha fazla amino asit eklemesi, çikarmasi veya ornatimi içeren ancak açiklanan mAb'lerinkine esasen esdeger olan biyolojik aktivite sergilemektedir. Benzer sekilde mevcut patent hakki bildiriminin anti-hANGPTL3 antikor kodlayan DNA sekanslari açiklanan sekansla karsilastirildiginda nükleotitlerin bir veya daha fazla eklemesini, çikarmasini veya ornatimini içeren ancak bir anti-hANGPTL3 antikoruna veya patent hakki bildiriminin antikor fragmanina esasen biyo esdeger olan bir anti- hANGPTL3 antikoru veya antikor fragmanini kodlayan sekanslari içermektedir. Bu varyant amino asit ve DNA sekanslarina iliskin örnekler yukarida açiklanmaktadir. Iki antijen baglama proteini veya antikoru eger örnegin bunlar emilim hizi veya kapsami benzer deneysel kosullar altinda ayni molar dozda, gerek tek doz gerekse çoklu dozda uygulandigi zaman önemli bir fark göstermeyen farmasötik esdegerler veya farmasötik alternatifler oldugu zaman biyo esdeger olarak degerlendirilmektedir. Bazi antikorlar eger bunlar kendi emilimleri kapsaminda esdegerken kendi emilim hizlari kapsaminda degil ise ve yine de emilim hizindaki bu farklar kasitli oldugundan ve etiketlemede yansitilabildiginden dolayi biyo esdeger olarak degerlendirilebilirse esdeger veya farmasötik alternatifler olarak degerlendirilecektir çünkü emilim hizindaki bu farklar kastidir ve etiketlemeye yansimaktadir, örn, kronik kullanimda etkili vücut ilaç konsantrasyonlarinin edinilmesi için hayati degildir ve çalisilan özel ilaç ürünü için medikal olarak önemsiz olarak degerlendirilmektedir. Bir yönde iki antijen baglama proteinleri eger güvenleri, safligi ve potensinde kliniksel olarak anlamli farklar yok ise biyo esdegerdir. Bir yönde iki antijen baglama proteini eger bir hasta referans 'ürün ve biyolojik ürün arasinda bu geçis devam eden terapi ile karsilastirildigi zaman immünojenesitede klinik olarak önemli bir degisim veya azalan etkinlik dahil olmak 'üzere yan etki riskinde beklenen bir artis olmadan bir veya daha fazla kez geçis yapabiliyorsa esdegerdir. Bir yönde iki antijen baglama proteini bu tür mekanizmalar bilindigi müddetçe eger bunlar hem ortak bir mekanizma hem de kullanima yönelik kosul veya kosullar için etki mekanizmalari tarafindan etkileniyorsa biyo esdegerdir. Biyo esdegerlik in vivo veya in vitro yöntemler vasitasiyla gösterilebilmektedir. Biyo esdegerlik örn, (a) insanlarda veya diger memelilerde antikorun veya bunun metabolitlerinin konsantrasyonunun kanda, plazmada, serumda veya baska bir miyolojik akiskanda zamanin bir fonksiyonu olarak ölçüldügü bir in vivo test; (b) insan in vivo biyo uyumluluk verisinin mantikli sekilde tahmin edilir oldugu ve bununla iliskili olan bir in vitro test; (0) insanlarda veya diger hayvanlarda antikorun (veya hedefinin) uygun akut farmakolojik etkisinin zamanin bir fonksiyonu olarak ölçüld'ug'u bir in vivo test ve (d) bir antikorun güvenligini, etkinligini veya biyo uyumlulugunu veya biyo esdegerliligini olusturan iyi kontrollü bir klinik deneme içermektedir. Patent hakki bildiriminin anti-hANGPTL3 antikorlarinin biyo esdeger varyantlari örnegin kalintilarin veya sekanslarin çesitli ornatimlarinin yapilmasi veya terminalin veya dahili kalintilarin silinmesi veya biyolojik aktivite için gerekli olmayan sekanslar vasitasiyla olusturulabilmektedir. Ornegin biyolojik aktivite için önemli olmayan sistein kalintilari yeniden natürasyon üzerine gereksiz veya yanlis molekül için disülfit köprülerinin olusumunu engellemek için silinebilmekte veya diger amino asitlerle degistirilebilmektedir. Terapötik Uygulama ve Formülasyonlar Bulus terapötik bilesimler saglamakta olup, mevcut bulusun anti-hANGPTL3 antikorlarini veya bunlarin antijen baglama fragmanlarini içermektedir ve ayrica aynisini kullanan terapötik yöntemler ile ilgilidir. Bulusa göre terapötikler bilesimlerin uygulamasi uygun tasiyicilar, eksipiyanlar ve gelismis transfer, iletim, tolerans ve benzerini saglamak için formülasyonlara dahil edilen diger ajanlar ile uygulanacaktir. Birden çok uygun formülasyon bütün farmasötik kimyagerler tarafindan bilinen formüllerde bulunabilmektedir: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Bu formülasyonlar örnegin tozlari, macunlari, jelleri, mumlari, yaglari, Iipitleri, ipit (katyonik veya anyonik) içeren araçlari (LlPOFECTlNTM gibi), DNA konjugatlarini, susuz abzorpsiyon macunlarini, su içinde yag ve yag içinde su emülsiyonlarini, emülsiyonlar carbowax (çesitli moleküler agirliklarda polietilen glikollar), carbowax içeren yari kati jeller ve yari kati karisimlari içermektedir. Bkz ayrica Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA Doz uygulanacak bir denegin yasina ve büyüklügüne, hedef hastaliga, tedavinin amacina, kosullara, uygulama rutinine ve benzerine bagli olarak degisiklik gösterebilmektedir. Mevcut bulusun antikoru dogrudan veya dolayli olarak ANGPTL3 ile iliskili çesitli kosullari ve hastaliklari bir yetiskin hastada tedavi etmek için kullanilmakta olup, hiperkolesterolemiyi, LDL ve apolipoprotein B ile iliskili rahatsizliklari ve Iipit metabolizmasi rahatsizliklarini ve benzerlerini içermektedir, mevcut bulusun antikorunu yaklasik 0,01 ila yaklasik 20 mg / kg vücut agirligi, daha da tercih edilen sekliyle yaklasik 0,02 ila yaklasik 7, yaklasik 0,03 ila yaklasik 5 veya yaklasik 0,05 ila yaklasik 3 mg / kg vücut agirliginda tek bir dozda intravenöz olarak veya subkütanöz olarak uygulamak avantajlidir. Kosulun yayginligina göre tedavinin frekansi ve süresi ayarlanabilmektedir. Belirli uygulamalarda bulusun antikoru veya antijen baglama fragmani en az yaklasik 0.1 mg ila yaklasik 800 mg, yaklasik 1 ila ila yaklasik 100 mg veya yaklasik 50 mg'lik bir baslangiç dozu olarak uygulanabilmektedir. Belirli uygulamalarda baslangiç dozu baslangiç dozuyla yaklasik olarak ayni veya bundan farkli olabilen bir miktarda antikorun veya antijen baglama fragmaninin bir ikinci veya birden çok sonraki dozunun uygulanmasi vasitasiyla devam ettirilebilmekte olup, burada sonraki dozlar en az 1 gün ila 3 gün; en az bir hafta, en az 8 hafta; en az 9 hafta; en az 10 hafta; en az 12 hafta veya en az 14 hafta ayrilmaktadir. Çesitli iletim sistemleri bilinmektedir ve bulusun farmasötik bilesimini uygulamak için örn, lipozomlar, mikro parçaciklar, mikrokapsüller, mutant virüsleri eksprese edebilen rekombinant hücreler, reseptör aracili endositoz seklinde kapsül haline getirme (bkz, intradermal, intramüsküler, intraperitoneal, intravenöz, subkütanöz, intranazal, epidural ve oral yollari içermektedir ancak bunlarla sinirli degildir. Bilesim herhangi bir geleneksel yol vasitasiyla örnegin infüzyon veya bolus enjeksiyonu vasitasiyla, epitelyal veya mukokütanöz zar araciligiyla emilim vasitasiyla (örn, oral mukoza, rektal ve intestinal mukoza, vb.) uygulanabilmektedir ve diger biyolojik olarak aktif ajanlar ile birlikte uygulanabilmektedir. Uygulama sistemik veya lokal olabilmektedir. Farmasötik bilesim ayrica bir vezikül örnegin bir Iipozom (bkz. Langer (1990) Science and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez- Berestein, ibid., pp. 317-327; bkz, genel olarak ibid.) seklinde iletilebilmektedir. Belirli durumlarda farmasötik bilesim bir kontrollü salim sisteminde iletilebilmektedir. Bir uygulamada bir pompa kullanilabilmektedir (bkz, Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 142201). Baska bir uygulamada polimerik malzemeler kullanilabilmektedir, bkz Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). Yine baska bir uygulamada bir kontrollü salim sistemi bilesimin hedefinin yakinina yerlestirilebilmektedir, dolayisiyla sadece sistemik dozda bir fraksiyona gerek duymaktadir (bkz, örn, Goodson, in Medical Enjekte edilebilir preparasyonlar intravenöz, subkütanöz, intrakutanöz ve intramüsk'uler enjeksiyonlar, damla inf'üzyonlar, vb. için dozaj formlarini içerebilmektedir. Bu enjekte edilebilir preparasyonlar yaygin olarak bilinen yöntemler vasitasiyla hazirlanabilmektedir. Ornegin enjekte edilebilir preparasyonlar örn, steril bir sulu ortamda veya enjeksiyonlar için geleneksel olarak kullanilan yagli bir ortamda yukarida açiklanan antikorun veya bunun tuzunun çözünd'urülmesi, süspansiyon veya emülsiyon haline getirilmesi vasitasiyla hazirlanabilmektedir. Enjeksiyonlara yönelik 5qu ortam olarak Örnegin fizyolojik salin, glikoz içeren bir izotonik solüsyon ve bir alkol (örn, etanol), bir polialkol (örn, propilen glikol, polietilen glikol), bir iyonik olmayan yüzey aktif madde [örn, polisorbat 80, HCG-50 (hidrojenli hint yaginin polioksietilen (50 mol) yardimcisi)], vb. gibi uygun bir çözündür'uç'u ajan ile kombinasyon halinde kullanilabilen diger yardimci ajanlar vardir. Yagli ortam olarak örn, benzil benzoat, benzil alkol, vb. gibi bir çözündür'uc'u ajan ile kombinasyon halinde kullanilabilen susam yagi, soya fasulyesi yagi vb. kullanilabilmektedir. Bu sekilde hazirlanan enjeksiyon tercih edilen sekliyle uygun bir ampul seklinde doldurulmaktadir. Mevcut bulusun bir farmasötik bilesimi standart bir igne ve siringa ile subkütanöz olarak veya intravenöz olarak iletilebilmektedir. Ek olarak subkütanöz iletime göre bir kalem anahtar cihazi mevcut bulusun farmasötik bir bilesimini iletmekte uygulamalara sahiptir. Bu tür bir kalem iletim cihazi yeniden kullanilabilmekte veya tek kullanimlik olabilmektedir. Yeniden kullanilabilen bir kalem iletim cihazi genel olarak bir farmasötik bilesimi içeren bir degistirilebilir kartus kullanmaktadir. Kartus içindeki farmasötik bilesimin hepsi uygulandiktan sonra ve kartus bos oldugunda bos kartus kolay bir sekilde çikartilabilmekte ve farmasötik bilesimi içeren yeni bir kartus ile degistirilebilmektedir. Kalem iletim cihazi daha sonra yeniden kullanilmaktadir. Tek kullanimlik bir kalem iletim cihazinda degistirilebilir kartus yoktur. Bunun yerine tek kullanimlik kalem iletim cihazi cihazin içindeki bir rezervuarda tutulan farmasötik bilesim ile önceden doldurulmus gelmektedir. Rezervuarda farmasötik bilesim kalmadigi zaman t'um cihaz atilmaktadir.. Mevcut bulusun bir farmasötik bilesiminin subkütanöz iletiminde çesitli yeniden kullanilabilen kalem ve oto enjektör iletim cihazlari uygulamalara sahiptir. Ornekler birkaçini belirtmek gerekirse AUTOPENTM (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DlSETRONlCTM kalem (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Isviçre), HUMALOG MlX 75 / 25TM kalem, HUMALOGTM kalem, HUMALIN 70 / 30TM kalem (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPENTM I, ll ve Ill (Novo Nordisk, Copenhagen, Danimarka), NOVOPEN JUNIORTM (Novo Nordisk, Copenhagen, Danimarka), BDTM kalem (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPENTM, OPTIPEN PROT'V', OPTIPEN STARLETTM ve OPTICLlKTM (sanofi-aventis, Frankfurt, Almanya) içermektedir. Mevcut bulusun farmasötik bilesiminin subkütanöz iletiminde uygulamalara sahip olan tek kullanimlik kalem iletim cihazlarina iliskin örnekler SOLOSTARTM kalem (sanofi-aventis), FLEXPENTM (Novo Nordisk) ve KWIKPENTM kalem (Eli Lilly) içermektedir ancak kesinlikle bunlarla sinirli degildir. Avantajli olarak yukarida açiklanan oral veya parental kullanima yönelik farmasötik bilesimler aktif bilesenlerin bir dozunu yerlestirmek için uygun bir birim doz seklinde dozaj formlarinda hazirlanmaktadir. Bir birim doz seklindeki bu dozaj formlari örnegin tabletleri, haplari, kapsülleri, enjeksiyonlari (ampülleri), fitilleri, vb. içermektedir. Içerilen yukarida bahsedilen antikor miktari genel olarak bir birim dozda dozaj basina yaklasik 0,1 ila yaklasik 800 mg içerilmektedir; özellikle enjeksiyon formunda yukarida bahsedilen antikor yaklasik 1 ila yaklasik 500 mg, yaklasik 5 ila 300 mg ve diger dozaj formlari için yaklasik 10 ila yaklasik 100 mg içerilmektedir. Kombinasyonlar Terapileri Bulus ayrica istemlerde açiklandigi üzere hANGPTL3 ile dogrudan veya dolayli olarak iliskili olan hastaliklari veya rahatsizliklari tedavi etmek için terapötik yöntemlerde kullanim için bir veya daha fazla ilave terapötik ajan ile kombinasyon halinde bulusun hANGPTL3 antikorlarini veya bunlarin fragmanlarini saglamaktadir. Ilave terapötik ajan bulusun bir veya daha fazla antikoru veya bunlarin fragmanlari ile avantajli olarak kombine edilen herhangi bir ajanin biri veya daha fazlasi olabilmekte olup, kerovastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastin, ros uvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin ve benzeri; niasin; çesitli fibratlar Örnegin fenofibrat, bezafibrat, siprofibrat, klofibrat, gemfibrozil ve benzerleri gibi HMG-CoA redüktaz inhibitörlerini; LXR transkript faktör aktivatörlerini ve benzerlerini içermektedir. Bundan baska lipit metabolizmasina, özellikle kolesterol ve / veya trigliserit homeostaza dahil olan ANGPTL4, ANGPTLS, ANGPTLB ve proprotein konvertaz subtilisin / keksin tipi 9 (PCSK9) gibi diger moleküllerin inhibitörlerinin yani sira diger ANGPTL3 inhibitörleri ile birlikte uygulanabilmektedir. Bu moleküllerin inhibitörleri küçük molekülleri ve bu moleküllere spesifik olarak baglanan ve bunlarin aktivitesini bloke eden antikorlari PCSK9 antikorlari). Bundan baska ilave terapötik ajan bir veya daha fazla kemoterapötik ajanlar gibi anti- kanser ajan, anti-anjiyojenik ajan, büyüme inhibitörü ajani, sitotoksik ajan, apoptik ajan ve teknikte iyi bilinen kanseri veya baska proliferatif hastaliklari veya rahatsizliklari tedavi etmek için diger ajanlari içerebilmektedir. Anti-kanser ajanlarina iliskin örnekler bir anti-mitotik ajan örnegin dosetaksel, paklitaksel ve benzeri; bir platinyum bazli kematerapötik bilesik örnegin sisplastin, karboplatin, iproplatin, oksaliplatin ve benzeri veya diger geleneksel sitotoksik ajanlari örnegin 5-florourasil, kapesitabin, irinotekan, lökovorin, gemsitabin ve benzerini ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) antagonisleri örnegin anti-VEGF antikorlari, örn, bevasizumab (AVASTlN®, Genentech) ve US No. 7,070,959 sayili patent belgesinde açiklanan bir reseptör bazli yayininda açiklanan deta benzeri ligand 4 (DII4) antagonistleri örnegin anti-DII4 DIl4-Fc gibi hücre disi DII4 alani içeren bir füzyon proteinini; sorafenib (NEXAVAR® Bayer Pharmaceuticals Corp.), sunitinib (SUTENT® Pfizer), pazopanib (VOTRIENTTM GIaxoSmithKline), toceranib (PALLADlATM Pfizer), vandetanib (ZACTlMATM AstraZeneca), sediranib (RECENTIN® AstraZeneca), regorafenib (BAY 73-4506 Bayer), aksitinib (AG, erlotinib (TARCEVA® Genentech), gefitinib (IRESSATM AstraZeneca), BlBW 2992 (TOVOKTM Boehringer Ingelheim), lapatinib (TYKERB® GIaxoSmithKline), neratinib (HKI-272 Wyeth / Pfizer) ve benzerleri dahil olmak üzere reseptör tirozin kinaz ve I veya anjiyogenez inhibitörlerini ve yukaridakilerin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarini, asitlerini veya türevlerini içermektedir ancak bunlara sinirli degildir. Ek olarak analjezikler, Cox-2 inhibitörleri steroidal olmayan anti-inflamatuar ilaçlar (NSAlDS) dahil olmak üzere anti-inflamatuar ajanlari ve benzerleri gibi diger terapötik ajanlar ayrica altta yatan kansere / tümöre eslik eden semptomlari hafifletmek ve / veya azaltmak için bulusun hANGPTL3 antikoru veya bunun fragmani ile birlikte uygulanabilmektedir. Bulusun hANGPTL3 antikoru veya bunun fragmani ve ilave terapötik ajan (ajanlar) birlikte veya ayri ayri uygulanabilmektedir. Ayri dozaj formülasyonlari kullanildiginda bulusun antikoru veya bunun fragmani ve ilave ajanlar es zamanli olarak veya asamali, baska bir deyisle uygun siralarda zamanlarda ayri ayri uygulanabilmektedir. Antikorlarin Tanisal Kullanimlari Mevcut bulusun anti-ANGPTL3 antikorlari ayrica bir örnekte, örn, tanisal amaçlar dogrultusunda bir örnekte ANGPTLßiü tespit etmek ve / veya ölçmek için kullanilabilmektedir. Örnegin bir anti-ANGPTL3 veya bunun fragmani ANGPTLS'ün tipik olmayan ekspresyonu (örn, fazla ekspresyon, az ekspresyon, ekspresyon eksikligi, vs.) ile karakterize edilen bir kosulu veya hastaligi teshis etmek için kullanilabilmektedir. ANGPTLS'e yönelik örnek niteligindeki tanisal analizler örn, bir hastadan elde edilen bir Örnegin bulusun bir anti-ANGPTL3 Ab'si ile temas ettirilmesini içerebilmekte olup, burada anti-ANGPTL3 antikoru tespit edilebilir bir etiket veya raporcu molekül ile etiketlenmekte veya seçime bagli olarak hasta örneklerinden ANGPTL3 proteinini yakalamak ve bunu izole etmek için kullanilabilmektedir. Alternatif olarak etiketlenmemis bir anti-ANGPTL3 Ab kendisi tespit edilebilir sekilde etiketlenen bir ikincil antikor ile kombinasyon halinde kullanilabilmektedir. Tespit edilebilir etiket izotiyonat veya rodamin gibi bir floresan veya kemiluminesan kisim veya alkalin fosfataz, ß-galaktosidaz, at kili peroksidaz veya Iusiferaz gibi bir enzim olabilmektedir. Bir örnekte ANGPTLSÜ tespit etmek veya ölçmek için analizler enzime bagli bagisiklik analizi (ELIZA), radyoimmüno analiz (RIA), floresan aktive edilmis hücre ölçümü (FACS) ve benzerini içermektedir. ORNEKLER Asagidaki örnekler teknikte uzman kisilere bulusun yöntemlerini ve bilesimlerinin nasil yapilacagina ve kullanilacagina dair tam bir açiklama ve tarif saglamak için sunulmaktadir ve bulus sahiplerinin kendi buluslari olarak degerlendirdigi seyin kapsamini kisitlamayi amaçlamamaktadir. Kullanilan sayilar ile iliskili kesinligi saglamak için çaba harcanmistir ancak bazi deneysel hatalar ve sapmalar dikkate alinmalidir. Aksi belirtilmedigi müddetçe moleküler agirlik ortalama moleküler agirliktir, sicaklik santigrat derecedir ve basinç atmosferik veya buna yakindir. Örnek 1: Insan ANGPTL3 için Insan Antikorlarinin Uretimi VELOClMMUNETM fareler insan ANGPTL3 ile immünize edilmistir ve antikor immün tepkisi bu farelerden elde edilen serum kullanilarak antijene özgü immünoanaliz ile gözlemlenmistir. B hücreleri eksprese eden anti-hANGPTL3 yüksek anti-hANGPTLS antikor titrelerine sahip oldugunu gösteren immünize fare dalaklarindan toplanmistir ve hibridomalar olusturmak için fare miyelom hücreleri ile kaynastirilmistir. Hibridomalar asagida açiklanan analizleri kullanarak hANGPTLSie özgü antikorlari eksprese eden hücre hatlarini tanimlamak için taranmis ve seçilmistir. Analizler üretilen kimerik anti-hANGPTL3 antikorlarini, örn, H1M896N üreten çesitli hücre hatlarini tanimlamistir. belgesinde açiklanan miyelom hücrelere füzyon olmadan antijen-immünize edilmis B hücrelerinden dogrudan izole edilmistir. Agir ve hafif zincir degisken bölgeleri anti-hANGPTL3 antikorlarini olusturmak için klonlanmistir. Stabil rekombinant antikor eksprese eden CHO hücre hatlari olusturulmustur. Ornek 2. Degisken Gen Kullanim Analizi Üretilen antikorlarin yapisini analiz etmek için antikor degisken alanlarini kodlayan nükleik asitler klonlanmis ve sekanslanmistir. Antikorlarin nükleik asit sekansindan ve tahmin edilen amino asit sekanslarindan gen kullanimi her bir agir zincir degisken bölgesi (HCVR) ve hafif zincir degisken bölgesi (LCVR) için tanimlanmistir. Tablo 1, bulusa göre seçilen antikorlara yönelik gen kullanimini göstermektedir. Antikor HCVR LCVR Antikor HCVR LCVR Tablo 2, seçilen anti-hANGPTL3 antikorunun agir ve hafif zincir degisken bölgesini ve bunlar karsilik gelen antikor tanimlayicilarini göstermektedir. N, P ve S gösterimi özdes CDR sekanslari olan ancak CDR sekanslarinin disina çikan bölgelerde (baska bir deyisle, çerçeve bölgelerinde) sekans varyasyonlari olan agir ve hafif zincirlere sahip olan antikorlara isaret etmektedir. Dolayisiyla belirli bir antikorun N, P ve S varyantlari kendi agir ve hafif zincir degisken bölgeleri içinde özdes CDR sekanslarina sahiptir ancak çerçeve bölgeleri içinde modifikasyonlar içermektedir. Ad HCVRI LCVR SEK ID NO Ad HCVRI LCVR SEK ID NO Ad HCVRI LCVR SEK ID NO Ad HCVRI LCVR SEK ID NO Ornek 3. ANGPTL3,e Anti-hANGPTL3 Antikor Baglanmasinin Kinetik Parametreleri Bütün kinetik deneyler bir CMS sensör çipi kullanan bir BIACORETM T2OO etiketsiz moleküler etkilesim aygitinda (GE Healthcare) 25 cC veya 37 °C*de ge rçeklestirilmistir. Kisaca bir antijen yakalama yüzeyi ya bir anti-fare IgG"ye Özgü antikorun (anti-mFc; GE Healthcare; katalog #BR-1008-38) ya da bir anti-pentahistidine özgü antikorun (Qiagen; katalog #34660) bir CMS sensör çipinin yüzeyine standart bir amin kenetleme yöntemi vasitasiyla kovalent olarak kenetlenmesi vasitasiyla olusturulmustur. Çalisan tampon olarak HBS-EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, % 0,05 Yüzey etiketleri olan ANGPTLSiün insan ve tür varyantlari 4,4-46,5 RU*Iuk bir baglanma tepkisine kadar anti-penta-histidin kenetlenmis yüzey üzerinde yakalanmistir. Yakalanan rekombinant proteinler: bir C-terminali dekahistidin etiketi [hANGPTL3(17- 460)-His; R&D Systems, MN; catalog #3829-AN] olan tam uzunluklu olgun insan ANGPTL3*ü (baska bir deyisle, SEK ID NO: 161 'in amino asit kalintilari 17-460), bir C- terminali hekzahistidin etiketi [hANGPTL3(17-170)-His] içeren hANGPLTS'ün N- terminal sarilmis sarmal alani (baska bir deyisle, bir myo-myc-hekzahistidin etiketi kalintilari 17-170), Macaca fascicularis°ten ANGPTL3'ün N terminali sarilmis sarmal alani [baska bir deyisle, SEK ID NO: 177'ün amino asit kalintilari (Macaca fascicularis ANGPTL3'ün bir kismi sekansi)], bir C-terminal dekahistidin etiketi [mANGPTL3(17- 455)-His; R&D Systems, MN; katalog #136-AN] olan Mus musculusitan tam uzunluklu olgun ANGPTLS, bir hekzahistidin etiketi [mANGPTL3(17-240)-His; SEK ID NO: 166] içeren Mus musculus'un ANGPTL3iünün N-terminali sarilmis sarmal alani (baska bir deyisle, SEK ID NO: 163'ün amino asit kalintilari 17-240) ve bir myc-myc-hekzahistidin etiketi [rANGPTL3(17-240)-mmH; SEK ID NO: 176] içeren Rattus norvegicusidan ANGPTLS'ün N-terminali sarilmis sarmal alani (baska bir deyisle, SEK ID NO: 1757in amino asit kalintilari 17-240) olmustur. Ek olarak bir C-terminali fare Fc füzyonu ± 1,5 RUrluk bir baglanma tepkisine erisilene kadar anti-mFc kenetli yüzey 'üzerinde yakalanmistir. Antikor / antijen kompleksinin olusumuna yönelik birlesme ve ayrisma hizlarini ölçmek için tek (Tablolar 3 ve 7) veya çoklu (Tablolar 4-6) konsantrasyonlarda antikor 3 dakika boyunca 50 pl / dakika bir akis hizinda yakalanan protein yüzeyi boyunca enjekte edilmistir ve kompleksin ayrismasi 20 dakika boyunca gözlemlenmistir. Baglanma verisi islenmis ve Scrubber versiyon 2.0a (BioLogic Software) kullanilarak yigin asima ile 1:1 baglanma modeline oturtulmustur. Kinetik yari ömürler ((t1/2) ayrisim orani sabitinden, kd hesaplanmistir. Tablo 3, HBS-EP tamponunda 25 °C'de, pH 7.4'te hANG PTL3'e çesitli anti-ANGPTL3 antikorlarinin baglanmasini göstermektedir. Ab Klonlari Protein ka (M'15'1) kd (5'1) KD (nM) t1/,(dak) H4H1248P H4H1250P H4H12638 Ab Klonlari Protein ka (M"s'1) kd (s'1) Kn(nM) t%(dak) H4H12768 H4H1279P H4H1282P H4H1292P H4H1295P H4H1296P Tablo Site gösterildigi gibi anti-hANGPLT3 antikorlari 96,8 pM ila 5,62 nM arasinda degisen hesaplanmis denge ayrisim sabitleri (KD = kd / ka) olan bir C-terminal dekahistidin etiketi [hANGPTL3(17-460)-His] olan tam uzunluklu proteine ve 8,41 pM ila 6,23 nM arasinda degisen Kosileri olan bir C-terminal FC füzyonu [hANGPTL3(17- 169)-mFc] olan N-terminal sarilmis sarmal alanina baglanmistir. cC'de ANGPTL3'e baglanan çapraz türleri göstermektedir. Tablo 6, H4H12768'nin PBSP tamponunda pH 7.2'de 25 °C veya 37 °C'de insan ve sinomolgus ANGPTL3'üne baglanmasini göstermektedir. Ab Klonu H4H12768 Ab Klonu H4H12768 Protein hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)-mmH mANGPTL3(17-240)-His mANGPTL3(17-455)-His rANGPTL3(17-240)-mmH Protein hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)-mmH mANGPTL3(17-240)-His mANGPTL3(17-455)-His 9,73E+05 ,88E+05 1,35E+06 6,70E+05 1,29E+06 1,35E+06 1,59E+06 6,32E+05 1,87E+06 8,19E+05 1,94E+06 9,12E-04 2,89E-04 .35E-04 3,07E-O4 3,46E-O4 7,18E-04 2,41E-03 8,12E-04 1,17E-03 9,64E-04 7,91E-04 0,938 0,491 0,396 0,458 0,268 0,530 0,625 0,408 tv2 (dak) 0,670 0,370 Ab Klonu Protein 37 cÇ Ab Klonu Protein ka (M'1S'1) kd (3'1) 1,26E- 4,02E- MfANGPTL3(17-170)- 5,38E- 1,45E+06 6,72E- MfANGPTL3(17-170)- 4,32 E- 2,06E+05 2,73E- 1,18E- Ko (nM) tv, (dak) Ab Klonu Protein MfANGPTL3(17-170)- hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)- 1,36E- 2,78E+05 18,8 Tablolar 4-6'da gösterildigi gibi antikor H4H12768, fare, maymun ve siçanlardan ANGPTL3'e insan ANGPTLßiüne baglanmaya yonelik olanlara benzer baglanma afiniteleri ve kinetik sabitleri olan baglanma sergilemistir. Tablo 7, HBS-EP tamponunda 37 cOde, pH 7.4'te hANG PTL3 ve mANGPTL3*e seçilen anti-ANGPTL3 antikorlarinin baglanmasini göstermektedir. NB: Baglanmamis. Ab Klonlari H1M896N H4H1248P H4H1250P Protein hANGPTL3(17-460)-His mANGPTL3(17-455)-His hANGPTL3(17-460)-HIS mANGPTL3(17-455)-His hANGPTL3(17-460)-His 3,36E+06 3,62E+06 1,96E+06 3,50E+06 ,3OE-O4 2.47E-03 1,93E-03 1,13E-03 1,58E-1O 6,82E-1O 9,86E-1O 3,24E-10 Ab Klonlari Protein ka (M'1s'1) kd (s'1) Ko (nM) tyz (dak) H4H1279P H4H1292P Sekil 7'de gösterildigi üzere anti-hANGPLT3 antikorlari, mANGPTLS'e tespit edilebilir degisen hesaplanmis denge ayrisim sabitleri (KD = kd / ka) ile pH 7.4'te ve 37 °C'de bir C-terminal dekahistidin etiketi [hANGPTL3(17-460)-His] olan tam uzunluklu proteine ve 167 pM ila 682 pM arasinda degisen "si olan fare ANGPTL3rüne gösterilmektedir. Ornek 4. Anti-ANGPTL3 Antikorlarina yönelik Biacore Çapraz-Rekabet çalismasi Çapraz rekabet deneyleri, esasen yukarida Ornek 3'te açiklanan bir Biacore üzerinde °de gerçekle stirilmistir. Kisaca çalisma tamponu olarak HBS-EP kullanilarak bir C- terminali dekahistidin etiketi [hANGPTL3(17-460)-His; R&D Systems, MN; katalog amino asit kalintilari 17-460) 64 RUilik bir baglanma tepkisine erisilene kadar anti- penta-histidin kenetli yüzey üzerinde yakalandi. Iki antikorun es zamanli olarak yakalanan ANGPTLS'e baglanip baglanamadigini belirlemek için yüzey üzerinde her biri 15 dakika boyunca 4 pl / dakika bir akis hizinda 167 nMide antikor çiftleri es zamanli olarak enjekte edilmistir ve maksimum baglanma tepkisi sinyali (RU) her bir baglanma olayi için ölçülmüst'ur. Sonuçlar Tablo 8'de gösterilmekte olup, burada birinci antikor (mAb1) için baglanma tepkisi, ardindan birinci antikorla önceden yüklenen ANGPTL3 y'uzeyi `üzerinde ikinci antikorun (mAb2) baglanma tepkisi vardir. Koyu yazilmis sayilar antikor çiftlerinin hANGPTLßte es zamanli olarak baglanabildigini belirtmektedir. Italik sayilar antikor çiftlerinin tek bir dogrultuda sirali olarak eklendigi zaman es zamanli olarak hANGPTLS'e baglanabildigini belirtmektedir. Parantezler kendi kendine rekabeti belirtmektedir. ug / ml 25 ug / ml mAb2 baglama tepkisi (RU) Ab hANGPTL3(17- mAb1 460)-His baglama Klonlari Negatif Kontrol H4H1292P antikorlarin eklenme sirasina bakilmaksizin immobilize ANGPTL3*e es ANGPTL3*e baglanmistir; ancak antikor eklemesinin sirasi tersine çevrildigi zaman maksimum tepkinin yaklasik olarak % 241] bir baglanma sinyali sergilemistir. Benzer ancak antikor eklemesinin sirasi tersine çevrildigi zaman H4H1292P, ANGPTL3 H4H1250P ile önceden baglandiktan sonra beklenen maksimum tepkinin yaklasik olarak % 20'si bir baglanma sinyali sergilemistir. Ornek 5. ANGPTL3 N-terminali Sarilmis Sarmal Peptitlerine Anti-hANGPTL3 Antikor Baglanmasi Anti-ANGPtL3 antikoru H4H127687nin ANGPTLS'Un N-terminali sarilmis sarmal bölgesinden türetilen peptitlere baglanmasini analiz etmek için OCTET® RED sistemi (Fort'eBio, lnc.) kullanarak bir etiketsiz biyosensör baglanma analizi gerçeklestirilmistir. Sensör üzerinde immobilizasyon için peptitler bir N-terminali biyotin etiketi [bir esnek baglayici vasitasiyla ayrilmaktadir, Peptitler 1 ve 2 için amino asitler "AGSSPGG" (SEK ID NO: ] veya bir C-terminali biyotin etiketi bir esnek baglayici vasitasiyla ayrilmaktadir, Peptit 1 ve 2 için "GPSSGAPPPK" (SEK ID NO: ] ile etiketlenmistir. Test edilen peptit sekanslari su sekildedir: Bir negatif kontrol peptidi. N-terminal biyotin etiketli Peptit 1 (SEK ID NO: 168, SEK ID NO: 164"un insan ANTGPTL4Jün`un kalintilari ArgS4 ila Leu66) ve ANGPTL3"un N-terminali sarilmis sarmal bölgesinden, baska bir deyisle N-terminali biyotin etiketli Peptit 2*den (SEK lD NO: ; C-terminali biyotin etiketli Peptit 2; N-terminali biyotin etiketli Peptit 3 (SEK ID NO: 170; SEK lD terminali biyotin etiketli Peptit 3 olmustur. Peptit sekanslari Sekil 1'de ayrica gösterilmektedir. Streptavidin kapli biyosensör uçlari peptite bagli olarak 1,22 - 2,26 nm ile sonuçlanacak sekilde biyotinillenmis peptitler ile kaplanmistir. Peptit kapli biyosensör uçlari daha sonra gerek anti-ANGPTL3 antikorundan H4H12768 gerekse bir izotip eslenmis negatif kontrol antikorundan 1 uM içeren kuyucuklara daldirilmistir ve baglanma 2,5 dakika boyunca gözlemlenmistir. H4H12768'nin ve izotip kontrol antikorunun peptitlerin her birine baglanma tepkisi Sekil 2'de özetlenmistir. H4H12768'nin Peptit 2 ancak Peptit 3 tarafindan tanimlanan üstüste binen degil ayri sekans tarafindan tanimlanan ANGPTL3 lineer sekansina baglanmaktadir (bkz, ayrica Sekil 1). Izotip kontrol antikoru ayrica Peptit1'in (baska bir deyisle, hANGPTL4 peptidi) biyosensör 'üzerine yüklenmesi için bir pozitif kontrol olarak islev görmektedir çünkü bu izotip kontrol antikoru hANGPTL4'ü spesifik olarak ayirt etmektedir. Sekil 2'de gösterildigi 'L'izere kontrol antikorunun Peptit 1'e baglanmasi Peptit 1'in ve diger peptitlerin sensör yüzeyinde bulundugunu onaylamistir. hANGPTL3'1'm Inhibisyonu Lipoprotein Lipaz (LPL) insanlarda lipit metabolizmasinda kritik bir rol oynamaktadir. LPL trigliseritlerin hidrolizini katalize etmektedir ve metabolize olacak yag asitlerini salmaktadir. ANGPTLS, artan lipit seviyelerine neden olan LPL aktivitesini inhibe ANGPTL3*`ün N-terminali sarilmis sarmal bölgesi C-terminal fibrinojen bölgesi olmadan eksprese edildigi zaman LPLSyi inhibe etmektedir ve dolayisiyla kendi inhibitör fonksiyonunu sundugu görülmektedir. Anti-ANGPTLS'ün LPL aktivitesinde ANGPTL3 ind'ukl'u azalmayi inhibe etme kabiliyetini belirlemek için bir hücresiz biyoanaliz gelistirilmistir. Anti-ANGPTL3 antikorlari vasitasiyla hANGPTL3 aktivitesinin inhibisyonu CONFLUOLIPTM Kesintisiz Florometrik Lipaz Testi (Progen, Almanya) kullanarak belirlenmis olup, test `üç hANGPTL3 proteini kullanmaktadir: bir C-terminali olan tam uzunluklu olgun hANGPTL3 (baska bir deyisle, SEK ID NO: 161*in amino asit kalintilari), bir C-terminali fare Fc füzyon [hANGPTL3(17-169)-mFc; SEK ID NO: 165] olan N-terminali sarilmis sarmal bölgesi (baska bir deyisle, SEK ID NO: 161'in kalintilari -His] içeren hANGPTLsr'un N-terminali sarilmis sarmal alani (baska bir deyisle, SEK ID NO: 161'in amino asit kalintilari 17-170). Kisaca sigir LPL'si (nihai konsantrasyon 2 nM), insan ApoCII (bir IPL kofaktör'u, nihai konsantrasyon PBS içinde önceden karistirilmistir. hANGPTL3 rekombinant proteinler Apo / LPL karisimina eklenmistir (80 - . Apo / LPL/ANGPTL3 protein karisimlari seri olarak seyreltilmis anti-hANGPTL3 antikorlari ile birlikte eklenmistir ve 30 dakika boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Inkübasyonu takiben 100 pl yeniden olusturulmus lipaz substrati, 1-trinitrofenil-amino-dodekanoiI-2-pirendekanoiI-B-O-hekzadesil-sn-gliserol (LS-A, Progen), bir 96 kuyucuklu analiz plakasina eklenmek üzere 25 pl antikor karisimina eklenmistir ve iki saat boyunca 37 °C*de ink'ube edilmistir. Floresan daha sonra bir FLEXSTATION® 3 Mikroplaka Okuyucu (Molecular Devices, CA) kullanilarak 342 nm / 400 nmtde ölçülmüst'ur. Floresan LPL aktivitesi ile dogrudan orantilidir. Antikor H4H12768, hANGPTLSiün LPL'ye karsi inhibitör aktivitesine iliskin inhibisyon sergilemistir. LPL analizinde her bir deney için ANGPTL3 E050 ve belirlemek için hANGPTL3 proteini kullanarak bir tam doz-tepkisi ilk önce gerçeklestirilmistir ve antikora yönelik lC50 belirlemeleri Tablo 8'de gösterildigi gibi sabit konsantrasyonda ANGPTL3 proteini kullanilarak gerçeklestirilmistir. % 50 maksimum inhibisyon (IC50 ) için gerekli antikor konsantrasyonlari sirasiyla 80 nM hANGPTL3(17-460)-His için -mFc için 21 nM olarak belirlenmistir. ANGPTL3 proteinlerini test etmek için antikor konsantrasyonlari insan 0 ila 300 nm arasinda degismistir. Benzer sekilde H4H12768 çapraz tür ortologlarini inhibe etme kabiliyeti için LPL biyoanalizinde test edilmistir: bir C-terminali myo-myc-hekza-histidin etiketi maymun N-terminal bölgesi (SEK ID NO: 177'nin amino asit kalintilari 17-170), bir C- terminal hekza-histidin etiketi [mANGPTL3(17-240)-His; SEK ID NO: 166] olan SEK lD NO: 1637'un fare ortolog N-terminal bölgesi amino asit kalintilari ve bir C-terminali dekahistidin etiketi [mANGPTL3(17-455)-His; R&D Systems, MN; catalog #136-AN] olan Mus musculusidan tam uzunluklu olgun ANGPTL3 (baska bir deyisle, SEK lD NO: mANGPTL3(17-240)-His için 31 nM olarak belirlenmistir. Maymun ve fare ANGPTL3 proteinlerini test etmek için antikor konsantrasyonlari insan 0 ila 600 nm arasinda degismistir. Sonuçlar Tablo 9'da özetlenmektedir. Homolog protein ANGPTL4'ün N-terminal bölgesine karsi antikorlarin ayrica LPL üzerinde ANGPTL4r'un inhibitör fonksiyonunu bloke ettigi gösterilmistir (Lee et al., reakstiviteyi degerlendirmek için inhibitör anti-ANGPTL3 antikor H4H12768 ayrica ANGPTL3 proteinlerine yönelik yukarida açiklandigi üzere LPL lipaz analizinde insan H4H12768'ine karsi test edilmistir. Bir insan C-terminali fare lgG2a FC füzyonu bölgesinin bir rekombinant formu (SEK lD NO: 164'ün kalintilari 26-148) LPL analizinde . 0 - 600 nM'Iik bir konsantrasyon araliginda test edilen H4H12768 bu inhibisyonu bloke etmemistir (NB: Baglanmamis; Tablo 9'da). ANGPT ANGPTL4( L3 (17- 26-148)- 170)- mFc ANGPTL3 |C50 S maymun ANGPTL3 (N-terminali) proteini ve fare ANGPTL3 (tam uzunluk ve N- terminali) aktivitesini 3-31 nM'Iik bir IC50 araligi ile karsilastirmali derecelerde inhibe etmistir. Eger es zamanli olarak eklenen iki ANGPTL3 bloke etmeyen antikor kombinasyonu ANGPTLß'ün LPL inhibitör aktivitesini bloke edip edemedigini belirlemek için antikorlarin bir alt kümesi ayrica test edilmistir. Antikor çiftleri hem insan hem de fare ANGPTL3'ün'un N-terminal alanlarini, baska bir deyisle, sirasiyla hANGPTL3(17-169)- mFc and mANGPTL3(17-240)-His inhibe etmek için test edilmistir. Bu analiz için ANGPTL3 proteinleri LPLiyi bloke etmek için 47 nM'lik hANGPTL3(17-169)-mFc için] ve -His için] ICSO degeri sergilemistir. Asagidaki çiftler her bir antikor için en az 200nM9Iik nihai konsantrasyonlarda eklendigi zaman ne 80 thde hANGPTL-His araciligiyla ANGPTLB'nin ayni sabit konsantrasyonlarini bloke etmistir. Ornek 7.1. Anti-ANGPTL3 Antikorunun Serum Lipit Seviyeleri 'üzerindeki In Vivo anti-hANGPTL3 antikoru H4H17268'nin serum lipit seviyeleri 'üzerindeki etkisi C57BI / 6 farelerde belirlenmistir. Daha sonra farelerin kani deneyden 7 gün önce alinmistir ve test edilen her bir doz için alti farelik gruplara ayrilmistir. Antikorlar, 5mg / kg (hlgG4) kontrol] çalismanin 0. gününde subkütanbz enjeksiyon vasitasiyla 10 mg / kg dozda uygulanmistir. Farelerin antikor enjeksiyonundan 1, 4, 7 ve 12 günde 4 saatlik açliktan sonra kani alinmistir ve serum lipit seviyeleri (trigliseritler, toplam kolesterol, HDL olmayan kolesterol, LDL kolesterol ve HDL kolesterol) bir ADVlA® 1800 Kimya Sistemi (Siemens) klinik kimya test edici kullanilarak belirlenmistir. Ortalamalar her bir antikor için zaman noktalarinin her birine yönelik hesaplanmistir. Serum lipit konsantrasyonunun (ortalama ± SEM) olarak belirtilen sonuçlar Tablo 10-14'te gösterilmektedir. Serum trigliserit (mg I dL) günler kg) kg) kg) Enjeksiyondan sonraki günler Enjeksiyondan sonraki günler Serum trigliserit (mg I dL) Ortalama 99,66 99,83 82,00 ,15 Ortalama 62,16 55,83 76,83 Toplam kolesterol (mg I dL) Kontrol Ab (10 mg! H4H12768 (5 mg I Ortalama 82,50 87,83 75,00 83,50 87,83 Ortalama 80,33 71,50 59,50 67,00 83,00 ,56 Ortalama SEM 50,67 3,51 39,67 2,55 53,00 6,51 H4H1276$ (10 mg / Ortalama SEM 81,33 2,14 63,67 3,38 51,00 2,98 61,33 2,33 69,33 3,22 HDL olmayan kolesterol (mg I dL) g'i'inler kg) kg) kg) LDL kolesterol (mg I dL) g'ünler kg) kg) kg) HDL kolesterol (mg I dL) günler kg) kg) kg) H sirkülasyon seviyeleri ayrica standart bir ELIZA analizi kullanilarak belirlenmistir. Kisaca plakalar Serum Ab'yi yakalamak için bir keçi anti- insan Fc antikoru ile kaplanmistir. Daha sonra serum plakalara eklenmistir ve yakalanan insan antikorlar bir at kili peroksidaz (HRP) konjuge edilmis keçi anti-insan (ortalama ± SEM) olarak belirtilen sonuçlar Tablo 15rte gösterilmektedir. Kontrol (Kontrol = bir izotip eslesmis kontrol antikoru alan fareler). Serum Ab (ug I mL) g'i'inler kg) kg) kg) gün sonraki sirk'ule olan trigiseritlerde (izotip kontrolüyle karsilastirildigi zaman) ~% 60 azalmaya neden olmustur. H4H12768'nin uygulanmasi ayrica toplam kolesterolde, HDL olmayan kolesterolde ve HDL kolesterolde önemli bir azalmaya neden olmustur ve LDL kolesterol üzerinde etkiye sahip degildir. Lipit seviyelerindeki bir azalma ayrica mg / kg doz seviyeleriyle karsilastirildiginda 5 mg / kg*da gözlemlenmistir; örn, serum trigliseritler antikor uygulamasindan 7 gün sonra % 44 azaltilmistir (izotip kontrolü ile karsilastirildiginda). Ornek 7.2. Anti-ANGPTL3 Antikorlarinin Serum Lipit Seviyeleri 'üzerindeki In Vivo seviyeleri 'üzerindeki in vivo etkilerinin degerlendirmesi C57BI / 6 farelerde açiklanan SEK lD NO: 24 ve SEK lD NO: 32'nin (VL) amino asit sekanslarina bagli olarak ve birfare lgG1 izotipi olarak hazirlanmistir. Daha sonra farelerin kani deneyden 7 gün 'önce alinmistir ve grup basina alti farelik gruplara ayrilmistir. Antikorlar, H4H17268 ve alakasiz spesifitesi olan bir izotip eslesmis negatif kontroller (sirasiyla, insan hIgG4 ve fare lgG1) çalismanin 0. gününde subk'utanöz enjeksiyon vasitasiyla mg / kg dozda uygulanmistir. Farelerin antikor enjeksiyonundan 1, 7, 11 ve 20 günde 4 saatlik açliktan sonra kani alinmistir ve serum lipit seviyeleri (trigliseritler, toplam kolesterol, HDL olmayan kolesterol, LDL kolesterol ve HDL kolesterol) bir ADVIA® 1800 Kimya Sistemi (Siemens) klinik kimya test edici kullanilarak belirlenmistir. Ortalama lipit konsantrasyonlari her bir antikor için zaman noktalarinin her biri için hesaplanmistir. Serum lipit konsantrasyonunun (ortalama ± SEM) olarak belirtilen sonuçlar Tablo 16-20'de gösterilmektedir. Serum trigliserit (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki gunler Tablo17 Toplam kolesterol (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki gunler Enjeksiyondan sonraki günler Enjeksiyondan sonraki günler Toplam kolesterol (mg I dL) Kontrol (lgG4) H4H127GS HDL olmayan kolesterol (mg I dL) Kontrol (lgG1) 4.9.1 Ortalama SEM 71,35 1,82 82,07 4,36 84,58 1,08 88,40 2,84 4.9.1 Ortalama SEM 41,73 1,40 36,97 1,49 40,47 2,35 41,38 1,05 44,40 1,57 Enjeksiyondan sonraki günler Enjeksiyondan sonraki günler LDL kolesterol (mg I dL) Kontrol (lgG4) Ortalama SEM 3,93 0,07 3,95 0,28 3,75 0,14 ,05 0,26 ,72 0,34 H4H127GS Ortalama SEM 4,20 0,26 4,25 0,37 ,25 1,08 ,47 0,23 4,95 0,32 HDL kolesterol (mg I dL) Kontrol (lgG4) Ortalama SEM 38,37 0,95 41,97 1,32 40,17 0,93 45,28 1,80 45,03 0,75 H4H12768 Ortalama SEM 38,00 2,27 32,00 1,89 29,87 1,23 33,83 1,15 38,07 1,79 Kontrol (lgG1) Ortalama SEM 4,38 0,26 3,92 0,17 ,76 1,61 4,88 0,27 4,97 0,28 Kontrol (lgG1) Ortalama SEM 37,12 1,88 42,30 2,09 41,72 2,97 43,64 1,70 42,75 1,69 4.9.1 Ortalama SEM 4,20 0,18 4,62 0,37 4,57 0,73 4,78 0,23 ,65 0,46 4.9.1 Ortalama SEM 37,63 1,52 34,38 0,85 41,60 2,47 43,20 1,57 44,00 1,83 ve HDL kolesterolde (Tablo 20) de bir azalmaya yol açmistir. üzerindeki In Vivo Etkisi anti-hANGPTL3 antikoru H4H1726S'nin serum Iipit seviyeleri 'üzerindeki etkisi apoE'/ - farelerde belirlenmistir. Bu fareler VLDL ve LDL formunda bulunan kendi sirk'L'iIe olan kolesterolün'un çoguyla hiperlipidemiktir. Daha sonra farelerin kani deneyden 7 gün alakasiz spesifitesi olan bir izotip eslesmis (hlgG4) çalismanin 0. gününde subkütanöz enjeksiyon vasitasiyla 10 mg / kg dozda uygulanmistir. Farelerin antikor enjeksiyonundan 1, 4, 7 ve 11 günde 4 saatlik açliktan sonra kani alinmistir ve serum ve HDL kolesterol) bir ADVIA® 1800 Kimya Sistemi (Siemens) klinik kimya test edici kullanilarak belirlenmistir. Ortalama Iipit konsantrasyonlari her bir antikor islenmis grup için zaman noktalarinin her biri için hesaplanmistir. Serum Iipit konsantrasyonunun (ortalama ± SEM) olarak belirtilen sonuçlar Tablo 21-25*te gösterilmektedir. Serum trigliserit (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki günler Kontrol (hlgG4) H4H1276$ Ortalama SEM Ortalama SEM Enjeksiyondan sonraki günler Enjeksiyondan sonraki günler Toplam kolesterol (mg I dL) Kontrol (hlgG4) Ortalama 450,67 497,50 395,00 447,33 463,80 ,68 37,77 14,37 22,18 36,01 H4H1276$ Ortalama 479,33 386,33 281,20 295,50 398,03 HDL olmayan kolesterol (mg I dL) Kontrol (hlgG4) Ortalama 435,87 476,30 375,61 427,66 442,27 ,59 37,29 14,51 21,45 34,19 H4H12768 Ortalama 464,53 371,25 266 ,26 280,75 379,55 13,76 28,59 ,83 12,86 23,13 13,97 28,65 21,19 12,55 22,31 LDL kolesterol (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki günler Kontrol (hlgG4) H4H12768 Ortalama SEM Ortalama SEM HDL kolesterol (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki günler Kontrol (hlgG4) H4H1276$ Ortalama SEM Ortalama SEM Antikor uygulamasindan 7 gün sonra (izotip eslesmis kontrol Ab, baska bir deyisle hIgG4 ile karsilastirildigi zaman) H4H12768'nin apoE'/' farelere 10 mg / kg'de münferit uygulanmasi sirküle olan trigliseritlerde ~% 72 (ortalama) azalmaya (Tablo 21) ve LDL ayrica toplam kolesterolde (Tablo 22) ve HDL olmayan kolesterolde (Tablo 23) bir azalmaya neden olmaktadir. H sirkülasyon seviyeleri ayrica standart bir ELIZA analizi kullanilarak belirlenmistir. Kisaca plakalar Serum Ab'yi yakalamak için bir keçi anti- insan FC antikoru ile kaplanmistir. Daha sonra serum plakalara eklenmistir ve yakalanan antikorlar bir at kili peroksidaz (HRP) konjuge edilmis keçi anti-insan lgg antikoru (Sigma-Aldrich) kullanilarak kemilüminesans vasitasiyla tespit edilmistir. (ortalama ± SEM) olarak belirtilen sonuçlar Tablo 26ida gösterilmektedir (Kontrol: bir izotip eslesmis kontrolü Ab, baska bir deyisle hlgG4 alan fareler). Serum Ab (pg l mL) Ortalama SEM Ortalama SEM Ornek 9. H4H12768,nin Hiperlipidemik Ldlr'/' Farelerde Sirküle Olan Lipit Seviyeleri üzerindeki In Vivo Etkisi anti-hANGPTL3 antikoru H4H172685nin serum lipit seviyeleri 'üzerindeki etkisi Ldlr- / - farelerde belirlenmistir. Bu fareler hiperlipidemik olup, sirk'L'ile olan kolesterolün çogu LDLR, LDL kolesterol alimi için ana reseptör eksikliginden dolayi LDL formunda bulunmaktadir. Daha sonra farelerin kani deneyden 7 gün önce alinmistir ve alti farelik gruplara ayrilmistir. Antikorlar, H4H17268 ve izotip eslesmis (hIgG4) negatif kontrol çalismanin 0. gününde subkütanoz enjeksiyon vasitasiyla 10 mg / kg dozda uygulanmistir. Farelerin antikor enjeksiyonundan 1, 4, 7 ve 11 günde 4 saatlik açliktan sonra kani alinmistir ve serum Iipit seviyeleri (trigliseritler, toplam kolesterol, HDL olmayan kolesterol, LDL kolesterol ve HDL kolesterol) bir ADVlA® 1800 Kimya Sistemi (Siemens) klinik kimya test edici kullanilarak belirlenmistir. Ortalamalar her bir antikor için her bir zaman noktasina yönelik hesaplanmistir. Serum Iipit konsantrasyonunun (trigliseritler, toplam kolesterol, HDL olmayan kolesterol, LDL kolesterol ve HDL kolesterol) (ortalama ± SEM) olarak ifade edilen sonuçlar sirasiyla Tablolar 27-31'de gösterilmektedir. (Kontrol = bir izotip eslesmis kontrol antikoru alan fareler). Tablo 27. Serum trigliserit (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki günler Antikor Ortalama SEM Ortalama SEM Tablo 28. Toplam kolesterol (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki günler Antikor Kontrol (10mg I kg) Ortalama SEM 237,95 7,33 241,97 10,58 229,88 7,61 234,74 10,49 251,87 18,82 Tablo 29. HDL olmayan kolesterol (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki günler Antikor Kontrol (1 Omg I kg) Ortalama SEM 180,81 7,47 184,35 10,22 175,13 7,26 174,84 9,26 190,00 17,07 H4H1726$ (10mg 1 kg) Ortalama SEM 236,99 5,68 206,98 9,68 172,96 4,49 176,28 7,47 201,73 10,12 H4H17268 (10mg i kg) Ortalama 182,79 155,93 130,79 126,56 145,43 Tablo 30. LDL kolesterol (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki günler Antikor Kontrol (1 Omg / kg) Ortalama 62,75 63,25 60,97 59,52 63,23 Tablo 31. HDL kolesterol (mg I dL) Enjeksiyondan sonraki günler Antikor Kontrol (10mg / kg) Ortalama 57,13 57,62 54,75 59,90 61,87 H4H1726$ (10mg I kg) Ortalama SEM 62,75 1,81 53,82 4,09 49,65 2,72 46,05 2,13 54,28 1,67 H4H1726$ (10mg / kg) Ortalama SEM 54,20 1,89 51,05 0,98 42,17 1,89 49,72 2,35 56,30 3,43 trigliseritlerinde maksimum gözlemlenen azalma % 44 olmak üzere (ortalama degerlere dayanmaktadir) 'önemli bir azalmaya neden olmustur. LDL kolesterolde (% 23'e kadar) ayni zamanda toplam kolesterolde, HDL olmayan kolesterolde ve HDL kolesteroldeki `önemli düsüsler ayrica H4H17268 verilmis deneklerde gözlemlenmistir. LDL kolesterol alimi (LDLR) için ana reseptörden muaf farelerde LDL kolesterolün düsmesi ANGPTL3 inhibisyonu vasitasiyla LDL kolesterol azalmasina yönelik bir LDRL"den bagimsiz mekanizma önermektedir. H sirkülasyon seviyeleri ayrica standart bir ELIZA analizi kullanilarak belirlenmistir. Kisaca plakalar Serum Ab*yi yakalamak için bir keçi anti- insan Fc antikoru ile kaplanmistir. Daha sonra serum plakalara eklenmistir ve yakalanan antikorlar bir at kili peroksidaz (HRP) konjuge edilmis keçi anti-insan lgg antikoru (Sigma-Aldrich) kullanilarak kemilüminesans vasitasiyla tespit edilmistir. (ortalama ± SEM) olarak belirtilen sonuçlar Tablo 32'de gösterilmektedir. (Kontrol = bir izotip eslesmis kontrol antikoru alan fareler). Tablo 32. Serum Ab (pg / mL) Antikor Enjeksiyondan sonraki günler Kontrol (1 Omg 1 kg) H4H17268 (1 Omg I kg) Ortalama SEM Ortalama SEM SEKANS LISTESI <110› Regeneron Pharmaceuticals, lnc. <120 Anti-ANGPTL3 Antikorlari ve Bunlarin Kullanimlari <130 6500A-WO <140› atanacak <141› ile <160› 194 <170› FastSEQ Windows Version 4.0 için <210 1 <211 369 <212 DNA <213› Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <4001 **tags t;]t]çgç*î :nqvv'<'~› ":qu- i ] -i-l TIIIIQIST? " "'g'iîg'g' J* 1521-25; ' _l -2 iriuii i <210 2 <211 123 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik - g atggaaçiaa LaiaiicigL ;EU i_' ;tüî-iüîxf. `il `l <210 3 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 3 <210 4 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 4 <210 5 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 5 <210 6 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 6 <210 7 <211 48 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 7 <210 8 <211 16 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 8 <210 9 <211 321 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 9 iîj'.'i1[i'i.i-i'!›-A t'1;'1i".`i-2-VJ'I' ' 1**'.'*.`v ..'i'u'î *IÜGGP 'î .-"-'-îl'1H*-l-'- 5-15" IIÜQJÄ.' "" .-1 2' i iyi! '. :t "-*' FF.' "z- r.' .at " %1' 'T.'{-.'JT*.=.«.'1 'WT-.'bî'f.' «iv n; i:: ti ti --L i::;i11.i-..%ii"»' .'î " :marina-3," îrîgiî-îrîliîiîfirg ami-t i.';1':'-. _"i .5 ç. .1 _-.:.,;t' .-.'_ &pan; tLLizv'sçsi:: .SLIL <210 10 <211 107 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 10 7 'Dr' 7. ', !i'ii' ': . . IN.! r'r-i ::°~f "-Hr I::. I'»-: .v`v.i1 FED* ','«: ':11' <210 11 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 11 <210 12 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 12 <210 13 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 13 <210 14 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 14 <210 15 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 15 <210 16 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 16 Gln Lys Ala Asn Ser ?he Pro Pite Thr <210 17 <211 369 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <210 18 <211 123 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 18 .1.1 ' ~_ I' J <210 19 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 19 <210 20 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 20 <210 21 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 21 <210 22 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 22 <210 23 <211 48 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 23 <210 24 <211 16 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 24 <210 25 <211 321 <212 DNA <213› Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 25 <210 26 <211 107 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 26 <210 27 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 27 11.4 - -.|i - <210 28 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 28 <210 29 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 29 <210 30 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 30 <210 31 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 31 <210 32 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 32 Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Ser Trp Thr <210 33 <211 372 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 33 i' .'.i.';›IJ" "di-51'.: ii:';-.`.`Ii.'li'g:.';'.î'__' 'Iklim'ggrâlîziîî «îîlüîîütîîq -ütjçüggtâü G - *Wafrüîf ru,:ü45;w1 .tna ij; _ni '1_çgi njgud.u'w' <210 34 <211 124 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik 4;qü'üs_;s ;5;;ggi4_j :13 Lqaug.1; ib <210 35 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 35 <210 36 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 36 <210 37 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 37 <210 38 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 38 ile Ser Phe Asp Arg Gly Asn Lys <210 39 <211 51 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 39 <210 40 <211 17 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 40 <210 41 <211 324 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 41 <210 42 <211 108 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 42 <210 43 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 43 <210 44 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 44 <210 45 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 45 <210 46 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 46 <210 47 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 47 <210 48 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 48 Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe Thr <210 49 <211 375 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 49 <210 50 <211 125 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik 2 1 I E: 1 N 1 'r :i: I 1 <210 51 <211 30 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 51 <210 52 <211 10 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 52 3.7 A5: ja: Ün; :v: Ei: A5: Bu: 3; <210 53 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik ;'LI <400 53 <210 54 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 54 Thr Ty: Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn <210 55 <211 45 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 55 <210 56 <211 15 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 56 <210 57 <211 326 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 57 çm:g;:::t'_i ..'..iÇzLiJLLsi ›.'t.'_;f_'-_'_i-_'.=_'~..:; L4'...a-.it..i-;'.'_ _itÇ-."_i_*.'-:_ii_' ;tiissccgi ::içti <210 58 <211 108 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 58 . 21: `~'v~` Ti:: II::: 74': .::ii 1,., `ni Ir-'J ?ali Fu.' 'i'il I : fi `ii Ti ..... 1 ?vr [i i 1~i ' i :r 1 I FI 1 J , T" T <210 59 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 59 <210 60 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 60 <210 61 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 61 <210 62 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 62 <210 63 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 63 <210 64 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 64 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro Thr <210 65 <211 378 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 65 <210 66 <211 126 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 66 1 i'i'i; 'i i - i <210 67 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 67 <210 68 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 68 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala <210 69 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 69 <210 70 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 70 <210 71 <211 57 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 71 <210 72 <211 19 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 72 <210 73 <211 324 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 73 .zii'iüî ' i.›-. 13. îf;m"".-.'iî" T'izîif '.'-.: '7.';`:.'Y.'i'.=i' :'ît':'.`-.fsiii1:›;._- _4_:.:.i_t;-ç ~_._: armaoî*nîî JSJC*EÜ*F3 :aç*er*e:a anrrqqîfsu :17:2"3fne rwagi ;wa <210 74 <211 108 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 74 -*- 1 ›: -~1 Ii En- l »- .'.'ii ;.va i'fiL' 1;& 27°- -HI ~ <210 75 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 75 <210 76 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 76 <210 77 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 77 <210 78 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 78 <210 79 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 79 <210 80 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 80 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Tyr Thr <210 81 <211 354 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 81 <210 82 <211 118 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 82 . 4 L Sin. Ji . 1 T 4 '3 k; k <210 83 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 83 <210 84 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 84 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ty: Tyr <210 85 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 85 <210 86 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 86 <210 87 <211 33 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 87 <210 88 <211 11 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 88 3 . . . . <210 89 <211 324 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 89 <210 90 <211 108 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 90 Rap 1.& ulu Er& ?tr 5;: &%5 irc ::r -'" <210 91 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 91 <210 92 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 92 <210 93 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 93 <210 94 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 94 <210 95 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 95 <210 96 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 96 Gln Gln Thr Tyr Ser Äsn Pro Leu Thr <210 97 <211 360 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 97 <210 98 <211 120 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <210 99 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 99 <210 100 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 100 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly <210 101 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 101 <210 102 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 102 Val Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Lys <210 103 <211 39 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 103 <210 104 <211 13 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 104 <210 105 <211 324 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 105 vücutu;g:f t:u;.qudî, '.;u13.'|; q.%'iî Q'gijîr'r ir`rii:`,W'ýT riljiij: :IL-11 r <210 106 <211 108 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 106 4-. 'I- <210 107 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 107 <210108 <2116 (4 7-- , -L 4 13.,, <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 108 <210 109 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 109 <210 110 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 110 <210 111 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 111 <210 112 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 112 Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr <210 113 <211 354 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 113 üaçgtjçagj _ _1. _ rsgijjJqJj jsAi .r 1 0 ('i' 'Hu n"JqYHG*a qfjüf1}iîû v&ia';-'4 r;_JçIvyçç :f1n'v*îî1 'a'WT'^'W «7-9 <210 114 <211 118 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 114 i."i '-iîl 'i ,'.igsi i "'14 î'îwi Hiç' "1 '-'.'_ j_»,. .::n "1 '4 -"'t› <210 115 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 1 15 <210 116 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 116 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr <210 117 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 117 <210 118 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 1 18 <210 119 <211 33 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 1 19 <210 120 <211 11 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 120 <210 121 <211 324 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 121 <210 122 <211 108 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 122 J [49› i A 1 i i ::r i 1 1 <210 123 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 123 <210 124 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 124 <210 125 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 125 <210 126 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 126 <210 127 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 127 <210 128 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 128 <210 129 <211 342 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 129 <210 130 <211 114 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 130 <210 131 <211 21 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 131 <210 132 <211 7 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 132 <210 133 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 133 <210 134 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 134 <210 135 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 135 <210 136 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 136 Ala Arg Gly Arg Leu Phe Asp Tyr <210 137 <211 339 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 137 ..agiiJJSAL-;J .ii'._*'._î-f.:_;._.:_ig_i.: L;'_^_-_:_tji_:'.'. I..:.L.i.^'.-_:'_'«tz '_gi_'-..i.1sg?.-.I-_^ -.i.'±.".ig;_'-_'._: 5.".4 <210 138 <211 113 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 138 <210 139 <211 33 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 139 <210 140 <211 11 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 140 <210 141 <21 1 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 141 <210 142 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 142 <210 143 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 143 <210 144 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 144 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Ty:: Thr <210 145 <211 354 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 145 <210 146 <211 118 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 146 i- 9.". I "'r'r <210 147 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 147 <210 148 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 148 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr <210 149 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 149 <210 150 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 150 <210 151 <211 33 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 151 <210 152 <211 11 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 152 <210 153 <211 324 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 153 ›.i.`..-'.S]I-. Yi'éii"_.›.:.fg"'. TW'ZTU'FZI .'.`"':'i'*'-';"' 11* 521.2" 4' .'u QÜUÜuüütVJ II' 52:17:' : . 1 ;igçiiiîiitgî › :i , ' iy I `_ i Lu Jr::: t::î:: :âr'ii'vîî .I' IL' UJÜÜ*›T1"E IüJûîîu.îi UKGCUJGÇuS JÇLLMÇJCLH uütjgtîîâî ttîCIG`î'î 1'i <210 154 <211 108 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 154 <210 155 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 155 <210 156 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 156 <210 157 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 157 <210 158 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 158 <210 159 <211 27 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 159 <210 160 <211 9 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 160 Gln Gln Thr Tyr Thr Asn Pro Leu Th: <210 161 <211 460 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 161 2-`, '1. ...EN <210 162 <211 1383 <212 DNA <213 Homo sapiens 1." ,_ 4.251 <400 162 <210 163 <211 455 <212 PRT <213 Mus musculus <400 163 : 'v - ' .I . _` ' .791. ..".1 .Fa-v:: 54-; <210 164 <211 406 <212 PRT <213 Homo sapiens <400 164 9 -M. - li Cli . i , üln __T rJ L.] _ 4 ris H-- L-: w_ .1. `i4 "I 51 _ _ Y _ 4 '1 . ' I] r i Mr 1 Lt vr &Lu _ _ uly ›- 14 1% 1: rll -y ~z' |›i . L 1› i_ n 3. 4 ` ` F u i ›n 1 1'. I . 71_ i' LiL F_ 'ag L. _:4 ~_4 h i 1~p 1- i. `-i h,› lu Tr I 4 I_ î u __r __ hi: "s" s.\ -_J __3 As; .h- -15 E ni Le; I J 3.', _li i.. 1...›-4 ..1 r'-- ..'_2 "'-1 F2-: i- <210 165 <211 386 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 165 . - 1:. 5 . '" <210166 <211 235 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik ..5`i ;L <400 166 <210 167 <211 182 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 167 r , 4.14 tr., IU 1 I Iii II 'i l <210 168 <211 33 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 168 -i l ' r I'e' ;vr i' _ i <210 169 <211 33 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 169 11'e. ALF. tut-r. ..ez ::aL-'p 4;_ '.*`._'; L::: I_i_- Lu.: I'_ <210 170 <211 26 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 170 <210 171 <211 7 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 171 <210 172 <211 5 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 172 <210 173 <211 10 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 173 <210174 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 174 <210 175 <211 455 <212 PRT <213 Rattus norvegicus <400 175 <210 176 <211 252 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 176 <210 177 <211 210 <212 PRT J 5 ..... ` --H 4..._ -..- <213 Macaca fascicularis <400 177 <210 178 <211 356 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 178 2."1'I 11`: ~`^ F. ;9. .7; ir: 3.;:Ti <210 179 <211 363 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400179 1 .: u'i ", J* -ijîßfji' <210 180 <211 121 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 180 <210 181 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 181 <210 182 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 182 Gly Phe Thr ?he Ser Thr Tyr Ala <210 183 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 183 <210 184 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 184 <210 185 <211 42 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 185 <210 186 <211 14 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 186 <210 187 <211 318 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 187 irzigziw::'i-'»' "'Y'itztf'î '<*' "çarz 3' aq .i <210 188 <211 106 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 188 <210 189 <211 18 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 189 <210 190 <211 6 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 190 <210 191 <211 9 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 191 <210 192 <211 3 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 192 <210 193 <211 24 <212 DNA <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 193 <210 194 <211 8 <212 PRT <213 Yapay Sekans <220 <223 Sentetik <400 194 Gln Gln Ty: Asn Asp Tyr Trp Thr TR