CN112062845B - Angptl3结合片段及其用途 - Google Patents

Angptl3结合片段及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，其与血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)结合，并抑制或干扰其至少一种活性。该抗ANGPTL3抗体可用于治疗与ANGPTL3相关的疾病或失调，如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂异常，包括高甘油三酯血症、高胆固醇血症等。此外，该抗ANGPTL3抗体可以给需要预防或治疗疾病或失调的受试者施用，这类疾病或失调包括心血管疾病，如动脉粥样硬化和冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病、肥胖症等。

Description

ANGPTL3结合片段及其用途
技术领域
本发明涉及一种结合血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)的抗体或其抗原结合片段，以及其制备方法和用于制备疾病诊断组合物、药物组合物、治疗疾病的用途。
背景技术
高脂血症是涵盖特征为血液中脂质水平和/或脂蛋白水平升高或与之相关的疾病和障碍的一般术语。高脂血症包括高胆固醇血症、高甘油三酯血症、合并高脂血症和脂蛋白(a)(Lp(a))升高。在许多群体中，特定的高脂血症普遍形式是高胆固醇血症。高胆固醇血症，特别是低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(LDL-C)水平升高，构成形成动脉粥样硬化和冠心病(CHD)的主要风险(Sharrett等人,2001,Circulation 104:1108-1113)。低密度脂蛋白胆固醇经鉴定为胆固醇降低疗法的主要靶标并且被公认为有效的代用治疗终点。血管生成素样蛋白3基因(ANGPTL3)中的功能失活变异与三酸甘油酯、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的血浆水平降低有关。研究发现，ANGPTL3功能突变的杂合参与者其血清甘油三酯，高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平显著降低。小鼠模型中，evinacumab抑制ANGPTL3可显著降低动脉粥样硬化病变面积和坏死含量。人体中，相比于安慰剂。evinacumab显示剂量依赖的甘油三酯和LDL胆固醇降低作用，最大降幅分别为76％和23％。研究表明ANGPTL3基因突变或抑制与人体主要脂质组分减少和动脉粥样硬化性心血管疾病发病率降低相关(Dewey等人，(2017)，The New England Journal of Medicine，1-11)。
发明内容
本发明全文中关于VL结构域、VH结构域、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3的各个实施方式可以各自单独实施，也可以任意组合实施。
在本发明的一个方面中，提供一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下(1)-(2)中VL结构域和VH结构域的任意一种组合：
(1)含有SEQ ID NO:5所示LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:6所示LCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:8所示HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:9所示HCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:10所示HCDR3氨基酸序列的VH结构域；
(2)含有SEQ ID NO:5所示LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:6所示LCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7所示L-CDR3氨基酸序列的VL结构域，以及含有SEQ ID NO:11所示HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:12所示HCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:10所示HCDR3氨基酸序列的VH结构域；
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含如下(1)-(2)中VL结构域和VH结构域的任意一种组合：
(1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的VH结构域；
(2)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的VL结构域，以及SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的VH结构域。
在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dsFv片段。
根据本发明的一方面，本发明的抗体或其抗原结合片段结合血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)，并抑制或干扰其至少一种活性。优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段结合人ANGPTL3。
在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的重链恒定区。
在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链恒定区。
在本发明的一个方面中，本发明涉及一种核酸，其包含编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
在本发明的一个方面中，本发明涉及一种载体，其表达本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个方面中，本发明涉及一种细胞，其表达本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段诊断疾病的方法，包括将本发明的抗体或其抗原结合片段与来自受试者的样品接触，并且确定所述抗体与ANGPTL3的结合情况，由此确定受试者样品的ANGPTL3表达水平，从而诊断受试者中的疾病。优选地，所述疾病选自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于诊断疾病或制备诊断疾病的试剂的用途。优选地，所述疾病选自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段预防、治疗疾病的方法，包括将本发明的抗体或抗原结合片段给予有需要的受试者。优选地，所述疾病选自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于预防、治疗疾病或制备预防、治疗疾病的药物组合物的用途。优选地，所述疾病选自高脂血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
根据本发明的另一方面，还提供一种组合物，其包含本发明所述的特异性结合血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。
在一些实施方式中，所述组合物还可以包含其他治疗剂。在一些实施方式中，其他治疗剂包括免疫治疗剂或激素治疗剂等。所述抗体或其抗原结合片段与其他治疗剂的联合施用能够增强治疗效果。
在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，例如人类。在另一些实施方式中，所述受试者是分离的细胞、组织或器官，例如离体培养的细胞、血液。
在一些实施方式中，所述“增强治疗效果”是指增强其他治疗剂或疗法的治疗效果。本发明提供的所述抗体或其抗原结合片段可以单独施用，也可以与其他治疗剂或疗法联合施用。在一些实施方式中，其他治疗剂或疗法包括化疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂、放射治疗、手术治疗。
本发明提供的抗体或其抗原结合片段具有以下中的一种或多种功效：增强的ANGPTL3蛋白结合能力、增强的ANGPTL3蛋白亲和力、增强的降LDL能力，增强的降non-LDL能力、更长的半衰期、更大的药物动力学曲线下面积。上述表现是本发明所述抗体或抗原结合片段与对照抗体在同等条件下相比较而体现出的增强。在一些实施方式中，所述对照抗体为现有技术中存在的特异性结合ANGPTL3蛋白的抗体，例如可以通过数据库寻找这样的抗体。在一些实施方式中，所述对照抗体为AP-REGN-IgG4抗体。
附图说明
图1示出了BALB/c小鼠四免后抗ANGPTL3的抗体的血清滴度。
图2示出了利用Elisa测定检测抗体与ANGPTL3之间的结合活性。
图3示出了利用Elisa检测人源化抗体与ANGPTL3的结合灵敏度。
图4A示出了CA129人源化抗体酶活检测。
图4B示出了CA136人源化抗体酶活检测。
图4C示出了CA168人源化抗体酶活检测。
图4D示出了CA63人源化抗体酶活检测。
图5示出了Elisa检测候选抗体与ANGPTL3的结合灵敏度。
图6A示出了SRP检测AP-REGN-IgG4亲和力。
图6B示出了SRP检测APM1-CA63.17-IgG4亲和力。
图6C示出了SRP检测APM2-CA129.14-IgG4亲和力。
图6D示出了SRP检测APM2-CA136.18-IgG4亲和力。
图6E示出了SRP检测APM1-CA168.12-IgG4亲和力。
图7示出了ANGPTL3候选抗体体外功能活性检测。
图8A示出了候选抗体对食蟹猴TG水平的影响。
图8B示出了候选抗体对食蟹猴TC水平的影响。
图8C示出了候选抗体对食蟹猴HDL水平的影响。
图8D示出了候选抗体对食蟹猴LDL水平的影响。
图8E示出了候选抗体对食蟹猴non-HDL水平的影响。
图9示出了食蟹猴体内不同单抗平均药时曲线对比图。
图10A示出了129.14在食蟹猴体内的免疫原性检测结果。
图10B示出了REGN在食蟹猴体内的免疫原性检测结果。
图10C示出了136.18在食蟹猴体内的免疫原性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，举出以下实施例是为了向本发明所属技术领域的一般专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.抗ANGPTL3单克隆抗体的产生
1.1免疫
用ANGPTL3(Sinobiological，目录号10770-H08B)或ANGPTL3(Sinobiological，目录号10770-H08H1)与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠。首免使用弗氏完全佐剂，二免至四免使用弗氏不完全佐剂，本次共免疫4只小鼠。把4只小鼠加强免疫3天后处死，取出脾脏用于后续实验。通过Elisa检测的血清滴度参见图1。
1.2噬菌体库的建立
取免疫小鼠的脾脏细胞，提取RNA后获得cDNA，噬菌体库的建立步骤参照CarlosF.Barbas III，Phage display：Alaboratory manual中记载的方法进行，用PCR的方法从cDNA中获得重链和轻链的可变区，再将重链和轻链的可变区通过重叠延伸PCR的方法获得scFv，scFv酶切后与质粒pCOMB3x连接，然后将连接产物电转染至大肠杆菌TG1感受态细胞中，TG1经培养后加入噬菌体侵染，然后回收培养物上清，以编号为APM01的小鼠建立的噬菌体库APM01，库容7.3x 108；以编号为APM02的小鼠建立的噬菌体库APM02，库容8x 108；以编号为APH1M01的小鼠建立的噬菌体库APH1M01，库容5.78x108；以编号为APH1M02小鼠建立的噬菌体库APH1M02库容6.3x 108。
1.3以两种方法进行筛选
平板筛选：ANGPTL3蛋白(义翘神州，10770-H08H1)以1μg/孔包被平板，4℃放置过夜，第二天通过2％BSA封闭平板1h，加入噬菌体库(2x1012)孵育2h，洗涤4-10次后用ElutionBuffer(pH 2.2)洗脱ANGPTL3特异性结合的噬菌体。
磁珠筛选：ANGPTL3蛋白(义翘神州，10770-H08H1)按照常规步骤进行生物素化(投入的ANGPTL3蛋白与生物素摩尔比1:2)，再与Thermo的磁珠(Invitrogen Dynabeads M-280Streptavidin，00355871)结合后与噬菌体库孵育，洗涤4-10次后用Elution Buffer(pH2.2)洗脱ANGPTL3特异性结合的噬菌体。
1.4抗体分子的构建与生产
将克隆APM1-CA63\CA168、APM2-CA129\CA136送Invitrogen生物技术有限公司测序。各克隆氨基酸序列如表1。
表1.具有阻断活性克隆氨基酸序列
Figure BDA0002505895570000041
Figure BDA0002505895570000051
通过常规的分子生物学技术PCR(2*Phanta Max Master Mix厂家：Vazyme货号：P515-AA批号：TE211GB)、信号肽与可变区重叠延伸、同源重组(ClonExpressⅡOne StepCloning Kit厂家：Vazyme货号：C112-01批号：TE211L8)等方法，把编码VH结构域的核苷酸序列片段插入带有编码抗体重链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:13)的核苷酸序列的载体pCDNA3.4(Life Technology)，把编码VL结构域的核苷酸序列片段插入带有编码抗体轻链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:16)的核苷酸序列的载体pCDNA3.4(Life Technology)，转染进入HEK293细胞在37℃\8％CO2\125rpm摇床中培养，瞬时表达6-7天后上清通过ProteinA亲和层析，纯化获得ANGPTL3抗体，并通过UV280结合消光系数确定抗体浓度。
对照抗体选择再生元(Regeneron Pharmaceuticals)公司靶向创新靶点血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)的evinacumab，该抗体在关键性3期临床试验获得积极结果。试验数据表明，与已有降脂疗法相比，evinacumab可使纯合家族性高胆固醇血症(HoFH)患者的LDL胆固醇水平降低49％，且具有良好的耐受性。
对照抗体生产：通过IMGT数据及专利US20170312359确定再生元ANGPTL3抗体Evinacumab的氨基酸序列(VH如SEQ ID NO:14所示、VL如SEQ ID NO:15所示)，全基因合成后插入载体pCDNA3.4通过HEK293细胞表达，生产的抗体命名为AP-REGN-IgG4。
1.5利用Elisa检测抗体与ANGPTL3的结合活性
包被不同浓度(0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.025μg/mL、0.0125μg/mL、0.00625μg/mL、0.003125μg/mL、0μg/mL)的ANGPTL3蛋白(10770-H08B，义翘神州)，100μl/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1μg/mL候选抗体各100μl，37度孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果参见图2。
如图2所示，候选抗体APM2-CA129-IgG4与APM2-CA136-IgG4与ANGPTL3蛋白结合能力优于对照组AP-REGN-IgG4。预示候选抗体APM2-CA129-IgG4、APM2-CA136-IgG4相较对照组AP-REGN-IgG4对ANGPTL3蛋白有更强的靶向性和结合性，能达到更好的药学效果。
实施例2.人源化抗体的获得
2.1抗体人源化
借助Discovery Studio软件对抗体进行三维结构模拟，结合CDR graft对鼠源序列进行人源化改造，通过回复突变分析确定回复突变位点，构建并生产携带不同回复突变位点的人源化突变体，通过亲和力及体外活性检测筛选的候选人源化抗体，各克隆氨基酸序列如表2。
表2.人源化抗体氨基酸序列
Figure BDA0002505895570000061
Figure BDA0002505895570000071
将抗体基因与编码重链恒定区序列SEQ NO:13的基因融合后，通过常规的分子生物学技术进行可变区基因扩增(2*EasyPfu PCR SuperMix厂家：Transgen货号：AS211批号：#L11228)、信号肽与可变区重叠延伸、同源重组(ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit厂家：Vazyme货号：C112-01批号：TE222B8)连接入载体pCDNA3.4(Life Technology)，转染进入HEK293细胞在37℃\8％CO2\125rpm摇床中培养，6-7天后的瞬时表达上清通过ProteinA亲和层析，纯化获得ANGPTL3人源化抗体，并通过UV280结合消光系数确定抗体浓度。
2.2利用Elisa检测人源化抗体与ANGPTL3的结合灵敏度
包被不同浓度(0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.025μg/mL、0.0125μg/mL、0.00625μg/mL、0.003125μg/mL、0μg/mL)的抗原ANGPTL3(10770-H08B，义翘神州)，100uL/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1μg/mL候选抗体各100μL，37℃孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果参见图3和表3。
如表3所示，候选抗体APM2-CA129.14-IgG4与ANGPTL3蛋白结合EC50值为0.016，显著低于对照组AP-REGN-IgG4的EC50值0.162，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组AP-REGN-IgG4。
如表3所示，候选抗体APM2-CA136.18-IgG4与ANGPTL3蛋白结合EC50值为0.040，显著低于对照组AP-REGN-IgG4的EC50值0.162，说明候选抗体的抗原结合能力优于对照组AP-REGN-IgG4。
预示候选抗体APM2-CA129.14-IgG4、APM2-CA136.18-IgG4相较对照组AP-REGN-IgG4对ANGPTL3蛋白有更强的靶向性和结合性，能达到更好的药学效果。
表3.利用Elisa检测人源化抗体与ANGPTL3的结合灵敏度EC50
抗体ID EC50(μg/mL) 抗体ID EC50(μg/mL)
APM1-CA63.1-IgG4 ～0.741 APM1-CA168.1-IgG4 0.017
APM2-CA129.12-IgG4 0.027 APM1-CA168.2-IgG4 0.023
APM2-CA129.14-IgG4 0.016 APM1-CA168.9-IgG4 0.022
APM2-CA129.17-IgG4 0.025 APM1-CA168.11-IgG4 0.017
APM2-CA136.13-IgG4 0.026 APM1-CA168.12-IgG4 0.023
APM2-CA136.18-IgG4 0.040 AP-REGN-IgG4 0.162
2.3基于酶活性方法的抗体体外活性检测
用Na3PO4 Buffer蛋白ANGPTL3稀释至350μg/mL，2倍梯度稀释，每孔5uL加入96孔黑板中。再用Na3PO4 Buffer将抗体稀释至500μg/mL，然后以2倍浓度梯度稀释共8个点，以每孔15uL加入96孔板，与ANGPTL3蛋白混合。
将LPL(R&D，9888-LL)放置在冰上，将R&D原液(LPL 343μg/mL)，用Buffer稀释为3μg/mL，每孔10uL加入96孔板中与ANPTL3及抗体混合，在25度条件下避光静置30min。取DGGR底物(1639μg/mL)加入buffer，配制为浓度25μg/mL，以每孔25uL加入96孔板中，与三种蛋白混合液混合。37度静置孵育40-60min，535nm激发光、612nm发射光，检测荧光值。结果参见图4A-图4D和表4-表5。
如表4、表5所示，候选抗体APM2-CA129.14-IgG4的EC50值为93.69，候选抗体APM2-CA136.18-IgG4的EC50值为104.3，对照组AP-REGN-IgG4的EC50值为95.09，说明候选抗体与对照抗体效果相当。
表4.CA129、CA168人源化抗体酶活检测EC50
抗体ID EC50(μg/mL) 抗体ID EC50(μg/mL)
APM2-CA129.12-IgG4 195.6 APM1-CA168.1-IgG4 66.93
APM2-CA129.14-IgG4 93.69 APM1-CA168.2-IgG4 87.68
APM2-CA129.17-IgG4 96.89 APM1-CA168.9-IgG4 87.83
AP-REGN-IgG4 95.09 APM1-CA168.11-IgG4 100.2
/ / APM1-CA168.12-IgG4 79.21
表5.CA136、CA63人源化抗体酶活检测EC50
抗体ID EC50(μg/mL) 抗体ID EC50(μg/mL)
APM2-CA136.13-IgG4 151.8 APM1-CA63.17-IgG4 73.10
APM2-CA136.18-IgG4 104.3 AP-REGN-IgG4 95.09
实施例3.候选抗体的表征
3.1Elisa检测候选抗体与ANGPTL3蛋白的结合
包被不同浓度(0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.025μg/mL、0.0125μg/mL、0.00625μg/mL、0.003125μg/mL、0μg/mL)的ANGPTL3蛋白(10770-H08B，义翘神州)，100uL/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入1μg/mL候选抗体各100μL，37度孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果参见图5。
如图5所示，候选抗体APM2-CA129.14-IgG4与APM2-CA136.18-IgG4与ANGPTL3蛋白结合能力优于对照组AP-REGN-IgG4。预示候选抗体APM2-CA129.14-IgG4、APM2-CA136.18-IgG4相较对照组AP-REGN-IgG4对ANGPTL3蛋白有更强的靶向性和结合性，能达到更好的药学效果。
3.2BIAcore检测候选抗体与ANGPTL3蛋白的结合
抗体结合动力学使用基于表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SRP)技术的BIAcore8K仪器测量。通过GE anti Human IgG Fc氨基偶联试剂盒(GE，cat#BR-1008-39)，将anti-human IgG抗体氨基偶联到CM5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将ANGPTL3蛋白(义翘神州，10770-H08B)用HBS-EP+1×(GE，BR-1008-26)缓冲液2倍连续稀释，50nM起始，2倍稀释4个浓度梯度，并设置0浓度。抗体：2μg/ml，进样时间70s，流速5μL/min，稳定5s；ANGPTL3蛋白：结合60s，流速30μL/min，解离450s；再生：用3M MgCl2 buffer再生30s，Startup 3次。使用简单一对一Languir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合常数(ka)和解离常数(kd)，平衡解离常数(KD)以比率kd/ka计算。结果参见图6A-6E和表6。
表6.BIAcore检测候选抗体结合动力学
抗体ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
AP-REGN-IgG4 6.09E+05 2.75E-04 4.52E-10
APM1-CA63.17-IgG4 2.28E+06 5.46E-04 2.39E-10
APM2-CA129.14-IgG4 5.73E+05 1.93E-04 3.36E-10
APM2-CA136.18-IgG4 5.83E+05 2.58E-04 4.43E-10
APM1-CA168.12-IgG4 6.55E+05 2.00E-04 3.05E-10
3.3ANGPTL3候选抗体体外功能活性检测
用Na3PO4 Buffer蛋白ANGPTL3稀释至350μg/mL，2倍梯度稀释，每孔5μL加入96孔黑板中。再用Na3PO4 Buffer将抗体稀释至500μg/mL，然后以2倍浓度梯度稀释共8个点，以每孔15μL加入96孔板，与ANGPTL3蛋白混合。
将LPL(R&D，9888-LL)放置在冰上，将LPL原液(R&D 343μg/mL)，用Buffer稀释为3μg/mL，每孔10uL加入96孔板中与ANPTL3及抗体混合，在25℃条件下避光静置30min。取DGGR底物(1639μg/mL)加入buffer，配制为浓度25μg/mL，以每孔25μL加入96孔板中，与三种蛋白混合液混合。37℃静置孵育40-60min,535nm激发光、612nm发射光，检测荧光值。结果见图7。
如图7所示，候选抗体APM2-CA129.14-IgG4与APM2-CA136.18-IgG4在体外功能活性检测中与对照组AP-REGN-IgG4效果相当。
实施例4.候选抗体体内实验
4.1候选抗体对NHP血液脂质浓度的体内效应
选择自发性肥胖食蟹猴，根据甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和非高密度脂蛋白(non-HDL)水平筛选出用于实验的食蟹猴，并对实验动物进行分组，分组后通过适当的座椅训练让实验动物适应实验环境，采用静脉注射的方式按照15mg/kg剂量给药，于给药前，给药后1天、2天、4天、7天、10天、12天、16天和20天采血，采血时，实验猴保定在猴椅后，从头静脉或隐静脉采集适量体积的全血至真空采集管内(促凝血清分离管(BD SST管))。采集后的血液常温放置至少30分钟以便血液凝结，然后在常温下离心，3500转/分钟，离心10分钟，分离的血清用于TG,TC,HDL,LDL,non-HDL的检测。检测结果参见图8A-图8E和表7-表11。
如图8D所示，候选抗体APM2-CA136.18-IgG4在食蟹猴体内使LDL下降的速率与比例均高于对照组AP-REGN-IgG4，说明候选抗体较对照组AP-REGN-IgG4可以有更优秀的降LDL能力。预示候选抗体APM2-CA136.18-IgG4相较对照组AP-REGN-IgG4，能达到更好的药学效果。
如图8E所示，候选抗体APM2-CA136.18-IgG4在食蟹猴体内使non-HDL下降的速率与比例均高于对照组AP-REGN-IgG4，说明候选抗体较对照组AP-REGN-IgG4可以有更优秀的降non-HDL能力。预示候选抗体APM2-CA136.18-IgG4相较对照组AP-REGN-IgG4，能达到更好的药学效果。
表7.候选抗体对食蟹猴TG水平的影响值
Figure BDA0002505895570000101
表8.候选抗体对食蟹猴TC水平的影响数值
Figure BDA0002505895570000102
表9.候选抗体对食蟹猴HDL水平的影响数值
Figure BDA0002505895570000103
表10.候选抗体对食蟹猴LDL水平的影响数值
Figure BDA0002505895570000111
表11.候选抗体对食蟹猴non-HDL水平的影响数值
Figure BDA0002505895570000112
4.2候选抗体在食蟹猴体内的PK活性
食蟹猴静脉注射不同候选抗体后，并于给药前(0h)及给药后1min，30min，3h，6h，1d，2d，4d，7d，10d，14d经静脉取出全血样品，置血样收集管中，冰盒内让其自然凝固，于血样取出后8h内置离心机中，1000～3000g离心10min，分离血清，置样本保存管中，第14天再次静脉注射不同候选抗体，并于给药前(0h)及给药后1min(14d+1m)，30min(14d+30m)，3h(14d+3h)，6h(14d+6h)，1d(15d)，2d(16d)，4d(18d)，7d(21d)，10d(24d)，14d(28d)，21d(35d)，28d(42d)，经静脉取出全血样品，置血样收集管中，冰盒内让其自然凝固，于血样取出后8h内置离心机中，1000～3000g离心10min，分离血清，置样本保存管中，用Elisa的方法检测抗体在食蟹猴体内的代谢情况，结果参见图9和表12。
如图9所示，在食蟹猴体内，候选抗体APM2-CA136.18-IgG4首次注射半衰期2.37天，优于对照组AP-REGN-IgG4的1.09天；候选抗体APM2-CA136.18-IgG4末次注射半衰期7.16天，优于对照组AP-REGN-IgG4的1.11天；候选抗体APM2-CA136.18-IgG4末次注射曲线下面积128.0μg/mL*d，优于对照组AP-REGN-IgG4的65.1μg/mL*d。说明候选抗体较对照组AP-REGN-IgG4有更优秀药代动力学表现。预示候选抗体APM2-CA136.18-IgG4相较对照组AP-REGN-IgG4，能达到更好的药学效果。
表12.食蟹猴静脉给予不同单抗后体内的动力学参数
Figure BDA0002505895570000113
Figure BDA0002505895570000121
4.3候选抗体在食蟹猴体内的免疫原性检测
以CBS包被液(pH9.6碳酸溶液)包被AP-CA129-14、AP-REGN、AP-136-18抗体分别为0.25μg/mL，100ul/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入100X血清，100ul，37度孵育1h；然后加入AP-CA129-14-biotin、AP-REGN-biotin、AP-136-18-biotin分别为0.25μg/mL，37℃孵育1h。洗掉，继而加入链霉素/HRP，37℃孵育1h；显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果参见图10。
如图10所示，候选抗体APM2-CA136.18-IgG4在食蟹猴体内未产生免疫原性，优于对照组AP-REGN-IgG4。说明候选抗体APM2-CA136.18-IgG4较对照组AP-REGN-IgG4可以更少的引起免疫反应，减少对机体的毒性，也有利于保持血药浓度以达到更好的药学效果。
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<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Arg Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Arg Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Val Ala Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Tyr Thr Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Gln Gln Ala Asn Thr Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Ile Trp Ser Asp Gly Ser Lys
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Ala Arg Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 11
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 13
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 14
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Leu Arg Asn Thr Ile Phe Gly Val Val Ile Pro Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
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<213> Homo sapiens
<400> 16
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (11)

1.一种结合血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含VL结构域和VH结构域，其中，所述抗体或其抗原结合片段的VL结构域包含SEQ ID NO:5所示的LCDR1、SEQ ID NO:6所示的LCDR2和SEQ ID NO:7所示的LCDR3，并且所述抗体或其抗原结合片段的VH结构域包含SEQ ID NO:11所示的HCDR1、SEQ ID NO:12所示的HCDR2和SEQ ID NO:10所示的HCDR3。
2.一种结合血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3所示的VL结构域，并且所述抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:4所示的VH结构域。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段结合人ANGPTL3。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dsFv片段。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗和/或预防疾病的药物组合物中的用途，所述疾病选自血脂异常、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述血脂异常为高脂血症。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述高脂血症为高脂蛋白血症、高甘油三酯血症、或高胆固醇血症。
8.一种核酸，其包含编码根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
9.一种载体，其表达根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种细胞，其表达根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
11.一种组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体。
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