TWI827980B - 結合人il-33的抗體、其製備方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，能夠以高親和力方式結合人IL-33，阻斷ST2與IL-33的結合，應用於製備治療IL-33高度表現的疾病(例如哮喘、特異反應性/過敏性皮膚炎、慢性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病(COPD)等)的藥物，具有良好的臨床應用前景。

Description

結合人IL-33的抗體、其製備方法和用途
本發明屬於生物技術領域，涉及一種結合人IL-33的抗體、其製備方法和用途。
介白素33 (IL-33)是一個多功能細胞激素，屬於IL-1家族新成員。由IL-33基因編碼，在結構細胞如平滑肌細胞、上皮細胞和內皮細胞中組成性表現，在巨噬細胞和樹突狀細胞中，IL-33可以由發炎因子誘導表現。研究發現，IL-33是一種雙功能蛋白。一方面，IL-33定位於細胞核內，發揮轉錄因子的作用；另一方面，IL-33分泌到細胞外，透過與其受體ST2相互作用發揮細胞激素的作用。作爲細胞激素，IL-33是一種TH-2型的細胞激素，被認爲作爲警報素，透過結合ST2，誘導TH-2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等TH-2型的細胞激素。此外，IL-33還可引起肥大細胞、嗜鹼性顆粒細胞分泌發炎性細胞激素和趨化因子，例如IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα等，導致NK細胞和NKT細胞分泌TH-1型細胞激素，如IFNγ等。
哮喘又名支氣管哮喘。支氣管哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道發炎。哮喘一直被認爲是CD4+Th-2細胞驅動的氣道發炎。然而，抗CD4抗體幾乎完全耗盡CD4+細胞，但並不能完全減少哮喘小鼠肺中IL-4、IL-5或IL-13的產生，這表明這些Th-2細胞激素的其他細胞來源肯定存在。IL-33能從表現ST2的ILC2s中產生IL-5和IL-13，這表明即使在沒有Th-2細胞的情况下，也可以誘導IL-5誘導的嗜酸性顆粒細胞增多和IL-13誘導的黏液產生。此外，IL-33在哮喘患者肺中的表現位準高於健康者，IL-33在重症哮喘患者肺組織中的表現尤爲明顯。IL-33促進重症哮喘患兒哮喘纖維母細胞膠原合成，暗示IL-33在重症哮喘特徵性氣道重塑的發生發展中起一定作用。過敏性氣道發炎可透過抗IL-33抗體治療而減輕。由於IL-33能夠活化表現ST2的Th-2細胞，Th-2細胞和ILC2細胞產生的IL-5和IL-13參與了哮喘的發病過程。這些發現表明IL-33可以協調先天免疫和後天免疫之間的橋樑，從而發展爲嚴重哮喘表型。除哮喘外，IL-33途徑還涉及多種病症治療，如特異反應性/過敏性皮膚炎、關節炎、慢性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、全身性硬化症、肝纖維化、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、多發性硬化症、糖尿病腎臟疾病、發炎性腸道疾病、銀屑病、嗜酸性食道炎、糖尿病性黃斑水腫、年齡相關性黃斑部病變、乾眼病、腫瘤等。本發明提供了以高親和力方式結合IL-33並有效中和IL-33活性的IL-33抑制劑。
爲了解決上述技術問題，本發明的發明人進行了大量試驗，從抗原免疫、融合瘤篩選、抗體表現純化到生物活性鑒定，篩選獲得了特異性結合人IL-33的鼠源抗體，並在此基礎上，進一步建構獲得其嵌合抗體以及人源化抗體。
因此，本發明的目的在於提供一種結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段；提供編碼所述結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的核苷酸分子；提供包含所述核苷酸分子的表現載體；提供所述表現載體的宿主細胞；提供所述結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段製備方法；提供包含所述結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段藥物組成物；提供所述結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段在製備藥物中的應用。
爲了實現上述目的，本發明採用了如下技術方案：
本發明一方面提供一種結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與人IL-33結合的親和力EC 50小於1 nM。
在另一優選例中，所述抗體的輕鏈具有SEQ ID No：22所示的L-CDR2，並且具有以下特徵： (t1) 阻斷IL-33和受體ST2的結合； (t2) 抑制IL-33誘導的HUVEC細胞的IL-6分泌； (t3) 抑制IL-33蛋白誘導人PBMC分泌IFNγ； (t4) 抑制IL-33誘導NK細胞分泌IFNγ；和 (t5) 抑制IL-33誘導KU812細胞分泌IL-5和IL-13。
在另一優選例中，所述抗體對人IL-33的Kd值遠遠小於對小鼠IL-33的Kd值(相差20倍或更多)。
在另一優選例中，所述抗體包括： (a)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1如SEQ ID NO：18所示或SEQ ID NO：18至多2個胺基酸替換突變的突變體；H-CDR2如SEQ ID NO：19所示或SEQ ID NO：19至多4個胺基酸替換突變的突變體；H-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示或SEQ ID NO：20至多7個胺基酸替換突變的突變體，和 (b)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示或SEQ ID NO：21至多2個胺基酸替換突變的突變體，所述L-CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示、所述L-CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：23所示或SEQ ID NO：23至多3個胺基酸替換突變的突變體。
作爲優選的方案，所述結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，包括： (a)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：15、16和17所示，或者分別如SEQ ID NO：18、19和20所示，或者分別如SEQ ID NO：18、24和25所示，和 (b)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：21、22和23所示，或者分別如SEQ ID NO：26、22和27所示，或者分別如SEQ ID NO：26、22和28所示。
在另一優選例中，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，包括： (a1)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：15、16和17所示，和 (b1)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：21、22和23所示；或 (a2)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如18、19和20所示，和 (b2)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：21、22和23所示；或 (a3)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：18、24和25所示，和 (b3)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：26、22和27；或 (a4)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：18、19和20所示，和 (b4)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：26、22和28所示。
在另一優選例中，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段包括： (a2)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如18、19和20所示，和 (b2)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：21、22和23所示；或 (a3)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：18、24和25所示，和 (b3)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：26、22和27。
在另一優選例中，上述任一CDR的胺基酸序列中包含經過添加、缺失、修飾和/或取代1、2、3、4、5、6或7個胺基酸的衍生CDR序列，並且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所構成的衍生抗體能夠保留與IL-33結合的親和力。
本發明“抗體(Ab)”是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。本發明的抗體包括單株抗體、多株抗體、由至少兩種抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)等。
本發明“單株抗體”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單株抗體高特異性地針對單個抗原位址。而且，與常規多株抗體製劑(通常是具有針對不同決定位的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定位。除了它們的特異性外，單株抗體的好處還在於它們是透過融合瘤培養來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
本發明“抗原結合片段”是指能夠與人IL-33特異性結合的抗體的片段。本發明的抗原結合片段的例子包括Fab片段、F(ab’) 2片段、Fv片段等。Fab片段是用木瓜蛋白酶消化抗體產生的片段。F(ab’) 2片段是用胃蛋白酶消化抗體產生的片段。Fv片段是由抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區緊密非共價關聯的二聚物組成。
作爲優選的方案，所述的抗體爲鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
本發明“鼠源抗體”是指來源於大鼠或小鼠的抗體，優選小鼠。本發明的鼠源抗體爲使用人IL-33爲抗原免疫小鼠並進行融合瘤細胞篩選獲得。
本發明“嵌合抗體”是指包含來源於一個物種的重鏈和輕鏈可變區序列以及來源於另一個物種的恆定區序列的抗體，例如具有與人恆定區連接的鼠重鏈和輕鏈可變區的抗體。優選的，本發明的嵌合抗體是由鼠源抗體864F3、874F7、871G1重鏈可變區再與包含突變的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區重組，輕鏈可變區與人的kappa鏈恆定區重組獲得。
本發明“人源化抗體”是指其CDR來源於非人物種(優選小鼠)抗體，抗體分子中殘餘的部分(包括框架區和恆定區)來源於人抗體。此外，框架區殘基可被改變以維持結合親和性。優選的，本發明的人源化抗體由鼠源抗體864F3、874F7、871G1的CDR區和來源自人抗體的非CDR區重組，重鏈可變區再與包含突變的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區重組，輕鏈可變區與人的kappa鏈恆定區重組，並對部分有重要影響的殘基進行突變獲得。
作爲優選的方案，所述的抗原結合片段包括Fab片段、F(ab’) 2片段、Fv片段。
作爲優選的方案，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6所示，或者分別如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示，或者分別如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示，或者分別如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：12所示。
作爲優選的方案，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：32所示，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：29、30、31、33、34或35所示。
作爲優選的方案，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：40所示，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：37、38或39所示。
作爲優選的方案，所述抗體的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區。
作爲優選的方案，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：36所示，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：33、34或35所示。
在另一優選例中，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：32所示，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示；或所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：40所示，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：38所示。在另一優選例中，所述輕鏈可變區的胺基酸序列與如序列表中SEQ ID NO：32、40或36所示的胺基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性。
在另一優選例中，所述重鏈可變區的胺基酸序列與如序列表中SEQ ID NO：29、30、31、33、34、35、37、38或39所示的胺基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性。
作爲優選的方案，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的重鏈恆定區和輕鏈恆定區的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
在另一優選例中，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段與IL-33蛋白的結合表位包含對應於SEQ ID NO：55的選自下組的位址： 第45位離胺酸(K45)、第49位纈胺酸(V49)、第65位天冬胺酸(D65)、第50位亮胺酸(L50)、第60位絲胺酸(S60)、第52位絲胺酸(S52)、第48位離胺酸(K48)、第51位亮胺酸(L51)、第53位酪胺酸(Y53)、第55位麩胺酸(E55)； 更佳地，包含選自下組的位址：第45位離胺酸(K45)、第49位纈胺酸(V49)、第65位天冬胺酸(D65)、第50位亮胺酸(L50)位址。
在另一優選例中，所述位址對應於野生型人IL-33蛋白的胺基酸序列，所述胺基酸序列爲NCBI: NP_254274.1的第112位Ser至270位Thr。
本發明另一方面提供了一種核苷酸分子，所述核苷酸分子編碼上述結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段。
作爲優選的方案，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5所示，或者分別如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示，或者分別如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9所示，或者分別如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11所示。
作爲優選的方案，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：41、42、43、45、46或47所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：44所示。
作爲優選的方案，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：49、50或51所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示。
作爲優選的方案，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：45、46或47所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示。
本發明所述核苷酸分子的製備方法爲本領域常規的製備方法，較佳地包括以下製備方法：透過基因轉殖技術例如PCR方法等，獲得編碼上述單株抗體的核苷酸分子，或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述單株抗體的核苷酸分子。
本領域技術人員知曉，編碼上述結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列的核苷酸序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以透過對編碼該結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段基因的一個或多個鹼基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。
本發明另一方面提供了一種表現載體，所述表現載體含有上述的核苷酸分子。
其中所述表現載體爲本領域常規的表現載體，是指包含適當的調控序列，例如啓動子序列、終止子序列、多腺苷醯化序列、增強子序列、標記基因和/或序列以及其他適當的序列的表現載體。所述表現載體可以是病毒或質體，如適當的噬菌體或者噬菌粒，更多技術細節請參見例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。許多用於核酸操作的已知技術和方案請參見Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等編著。本發明所述表現載體較佳地爲pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR，pcDNA4，pDHFF，pGM-CSF或pCHO 1.0。
本發明另外提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有上述的表現載體。
本發明所述的宿主細胞爲本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述重組表現載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核苷酸可被有效表現即可。其中所述宿主細胞包括原核表現細胞和真核表現細胞，所述宿主細胞較佳地包括：COS、CHO (中國倉鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地爲E.coli TG1、BL21 (DE3)細胞(表現單鏈抗體或Fab抗體)或者CHO-K1細胞(表現全長IgG抗體)。將前述表現載體轉形至宿主細胞中，即可得本發明優選的重組表現轉形株。其中所述轉形方法爲本領域常規轉形方法，較佳地爲化學轉形法，熱休克法或電穿孔法。
本發明另一方面提供了上述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟： a)在表現條件下，培養上述的宿主細胞，從而表現所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段； b)分離並純化a)所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段。
本發明所述的宿主細胞的培養方法、所述抗體的分離和純化方法爲本領域常規方法，具體操作方法請參考對應的細胞培養技術手冊以及抗體分離純化技術手冊。本發明中揭示的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的製備方法包括：在表現條件下，培養上述的宿主細胞，從而表現所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段；分離和純化所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段。利用上述方法，可以將重組蛋白純化爲基本均一的物質，例如在SDS-PAGE電泳上爲單一條帶。
可以利用親和層析的方法對本發明揭示的所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段進行分離純化，根據所利用的親和管柱的特性，可以使用常規的方法例如高鹽緩衝液、改變PH等方法洗提結合在親和管柱上的所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段。本發明的發明人對所得所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段進行了檢測實驗，實驗結果表明該所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段能很好地與抗原結合，具有較高的親和力。
本發明另一方面提供了一種組成物，所述組成物含有上述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載劑。
本發明提供的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，可以和藥學上可以接受的載劑一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明揭示的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的構像完整性，同時還保護蛋白質的多官能基防止其降解(包括但不限於凝聚、脫氨或氧化)。通常情况下，對於液體製劑，通常可以在2℃-8℃條件下保存至少穩定一年，對於凍乾製劑，在30℃至少六個月保持穩定。所述雙特異性抗體製劑可爲製藥領域常用的懸浮液、注射液、凍乾等製劑。
對於本發明揭示的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段注射液或凍乾製劑，藥學上可以接受的載劑較佳地包括但不限於：界面活性劑、溶液穩定劑、等滲調節劑和緩衝液之一或其組合。其中界面活性劑較佳地包括但不限於：非離子型界面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80)；poloxamer (如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；十四烷基、亞油基或十八烷基肌胺酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量應使結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的顆粒化趨勢最小。溶液穩定劑較佳地包括但不限於以下列舉之一或其組合：糖類，例如，還原性糖和非還原性糖；胺基酸類，例如，麩胺酸單鈉或組胺酸；醇類，例如：三元醇、高級糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液穩定劑的加入量應該使最後形成的製劑在本領域的技術人員認爲達到穩定的時間內保持穩定狀態。等滲調節劑較佳地包括但不限於氯化鈉、甘露醇之一或其組合。緩衝液較佳地包括但不限於：Tris、組胺酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液之一或其組合。
本發明另一方面提供了一種抗體藥物偶聯物，所述的抗體藥物偶聯物含有： (a)抗體部分，所述抗體部分包含上述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段；和 (b)與所述抗體部分偶聯的偶聯部分，所述偶聯部分選自下組：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、酵素、或其組合。
本發明另一方面提供了上述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段或藥物組成物、抗體藥物偶聯物在製備治療哮喘、關節炎、特異反應性/過敏性皮膚炎、慢性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、全身性硬化症、肝纖維化、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、多發性硬化症、糖尿病腎臟疾病、發炎性腸道疾病、銀屑病、嗜酸性食道炎、糖尿病性黃斑水腫、年齡相關性黃斑部病變、乾眼病、腫瘤的藥物中的應用。所述關節炎包括類風濕性關節炎、骨關節炎、僵直性脊柱炎、痛風性關節炎、反應性關節炎、感染性關節炎、創傷性關節炎、銀屑病關節炎、腸病性關節炎。
本發明結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段及其組成物在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情况，總給藥量不能超過一定範圍。具體講靜脈注射的劑量是1-1800 mg/天。
本發明另一方面提供了一種治療哮喘、關節炎、特異反應性/過敏性皮膚炎、慢性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、全身性硬化症、肝纖維化、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、多發性硬化症、糖尿病腎臟疾病、發炎性腸道疾病、銀屑病、嗜酸性食道炎、糖尿病性黃斑水腫、年齡相關性黃斑部病變、乾眼病、腫瘤的方法，其特徵在於，給需要的對象施用上述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段或藥物組成物、抗體藥物偶聯物、或其組合。
本發明另一方面提供了一種IL-33蛋白的突變體，對應於野生型人IL-33蛋白的胺基酸序列，所述突變體包含選自下組的一個或多個位址發生突變； (Z1)第45位離胺酸(K45)； (Z2)第49位纈胺酸(V49)； (Z3)第65位天冬胺酸(D65)； (Z4)第50位亮胺酸(L50)； (Z5)第60位絲胺酸(S60)； (Z6)第52位絲胺酸(S52)； (Z7)第48位離胺酸(K48)； (Z8)第51位亮胺酸(L51)； (Z9)第53位酪胺酸(Y53)； (Z10)第55位麩胺酸(E55)。
在另一優選例中，所述野生型人IL-33蛋白的序列如SEQ ID NO：55所示。
在另一優選例中，所述突變體包含選自下組的一個或多個位址發生突變； (Z1)第45位離胺酸(K45)； (Z2)第49位纈胺酸(V49)； (Z3)第65位天冬胺酸(D65)； (Z4)第50位亮胺酸(L50)，和/或 所述突變體包含選自下組的一個或多個位址發生突變； (Z5)第60位絲胺酸(S60)； (Z6)第52位絲胺酸(S52)；和/或 所述突變體包含選自下組的一個或多個位址發生突變； (Z7)第48位離胺酸(K48)； (Z8)第51位亮胺酸(L51)； (Z9)第53位酪胺酸(Y53)； (Z10)第55位麩胺酸(E55)。
在另一優選例中，與野生型IL-33蛋白與結合人IL-33的抗體的親和力相比，所述IL-33蛋白的突變體與結合人IL-33的抗體的親和力下降1倍，較佳地下降5倍，更佳地下降10倍，更佳地下降25倍，最佳地下降50倍。
在另一優選例中，所述突變體還包含選自下組的一個或多個位址發生突變； (Z11)第41位離胺酸(K41)； (Z12)第42位離胺酸(K42)； (Z13)第43位天冬胺酸(D43)； (Z14)第44位麩胺酸(E44)； (Z15)第46位離胺酸(K46)； (Z16)第47位天冬胺酸(D47)； (Z17)第54位酪胺酸(Y54)； (Z18)第56位絲胺酸(S56)； (Z19)第57位麩醯胺酸(Q57)； (Z20)第58位組胺酸(H58)； (Z21)第59位脯胺酸(P59)； (Z22)第61位天門冬醯胺(N61)； (Z23)第62位麩胺酸(E62)； (Z24)第63位絲胺酸(S63)； (Z25)第67位纈胺酸(V67)； (Z26)第68位天冬胺酸(D68)； (Z27)第70位離胺酸(K70)。
在另一優選例中，所述的IL-33蛋白的突變體包含將(Z1)-(Z27)中的一個或多個胺基酸突變爲丙胺酸(A)或甘胺酸(G)。
在另一優選例中，所述IL-33蛋白的突變體中的突變選自下組： K45A、V49A、D65A、L50A、S60A、S52A、K48A、L51A、Y53A、E55A、K41A、K42A、D43A、E44A、K46A、D47A、Y54A、S56A、Q57A、H58A、P59A、N61A、E62A、S63A、V67A、D68A、K70A、或其組合； 優選下組中的一個或多個：K45A、V49A、D65A、L50A、S60A、S52A、K48A、L51A、Y53A、E55A；更優選下組中的一個或多個：K45A、V49A、D65A、L50A、S60A、S52A；最優選下組中的一個或多個：K45A、V49A、D65A、L50A。
在另一優選例中，所述IL-33蛋白的突變體選自下組： 將SEQ ID NO：55所示胺基酸序列經過一個或幾個，優選1-20個、更優選1-15個、更優選1-10個、更優選1-8個、更優選1-3個、最優選1個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具有結合IL-33抗體功能的衍生的多肽。
在另一優選例中，所述IL-33蛋白的突變體的胺基酸序列與SEQ ID NO：55相比具有至少70%，優選至少75%、80%、85%、90%，更優選至少95%、96%、97%、98%、99%以上的序列相同性。
本發明另一方面提供了一種評估抗人IL-33抗體結合表位的方法，包括： (S1)提供一抗人IL-33抗體； (S2)與結合野生型IL-33蛋白的親和力A2相比，檢測所述抗人IL-33抗體與IL-33突變體的親和力A1，其中所述IL-33突變體包括K45A、V49A、L50A、D65A、S60A或S52A的一種或多種位址突變，如果親和力下降比例A1/A2≥2.5倍，較佳地≥10倍；則說明所述抗人IL-33抗體結合野生型IL-33蛋白的線性和/或空間表位包括K45、V49、L50、D65、S60A或S52A位址中的一種或多種；其中，所述抗人IL-33抗體包括： 重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：18、24和25所示，和 輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：26、22和27。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：目前臨床上亟待開發新型、特異、高效的IL-33強表現疾病的治療藥，從而能夠改善患有此類疾病人群的生活品質，爲患者提供更多、更有效的治療方案。本發明的抗體對人IL-33具有良好的親和力，能夠阻斷IL-33和其受體ST2的結合，可用於治療多種病症，具有良好的臨床應用前景。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入地研究，經過大量篩選，獲得了一系列具有優異親和力的抗IL-33人源化抗體。具體地，本發明的人源化抗體能夠阻斷IL-33和其受體ST2的結合，抑制IL-33誘導PBMC、NK細胞分泌IFNγ，並能抑制IL-33誘導嗜鹼性白血病細胞KU812分泌IL-5和IL-13。本發明的人源化抗體在體內具有明顯的中和活性。在小鼠動物實驗中，施用本發明的人源化抗體進行單次治療時即可有效降低小鼠周邊血液中由人IL-33刺激引起的嗜酸性顆粒細胞的增加。本發明的抗體有望用於治療多種IL-33相關的病症。在此基礎上完成了本發明。 術語
本發明中，術語“抗體(Antibody，縮寫Ab)”和“免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，縮寫IgG)”是有相同結構特徵的異四聚糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ (Kappa)或λ (Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈透過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈透過樞紐區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。
本發明中，術語“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可將抗體裂解爲兩個完全相同的Fab段和一個Fc段。Fab段由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。Fc段即可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與效應分子或細胞相互作用的部位。
本發明中，術語“scFv”爲單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)，由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通常透過15～25個胺基酸的連接短鏈胜肽(linker)連接而成。
本發明中，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中於重鏈可變區和輕鏈可變區中稱爲互補決定區(complementarity-determining region，CDR)或高度變異區中的三個片段中。可變區中較守恆的部分稱爲框架區(frame region，FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情况下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。
如本文所用，術語“框架區”(FR)指插入CDR間的胺基酸序列，即指在單一物種中不同的免疫球蛋白間相對守恆的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱爲FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相應地，輕鏈可變結構域可因此稱作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重鏈可變結構域可因此表示爲(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。優選地，本發明的FR是人抗體FR或其衍生物，所述人抗體FR的衍生物與天然存在的人抗體FR基本相同，即序列相同性達到85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
獲知CDR的胺基酸序列，本領域的技術人員可輕易確定框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，術語“人框架區”是與天然存在的人抗體的框架區基本相同的(約85%或更多，具體地90%、95%、97%、99%或100%)框架區。
如本文所用，術語“連接子”是指插入免疫球蛋白結構域中爲輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的可動性以折疊成交換雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個胺基酸殘基。在本發明中，優選的連接子是指連接子Linker1和Linker2，其中Linker1連接單鏈抗體(scFv)的VH和VL，而Linker2用於將scFv與另一抗體的重鏈進行連接。
合適的連接子實例包括單甘胺酸(Gly)、或絲胺酸(Ser)殘基，連接子中胺基酸殘基的標識和序列可隨著連接子中需要實現的次級結構要素的類型而變化。
在本發明中，本發明抗體還包括其守恆性變異體，指與本發明雙特異性抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些守恆性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。 表 A
最初的殘基 代表性的取代 優選的取代
Ala (A) Val； Leu； Ile Val
Arg (R) Lys； Gln； Asn Lys
Asn (N) Gln； His； Lys； Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro； Ala Ala
His (H) Asn； Gln； Lys； Arg Arg
Ile (I) Leu； Val； Met； Ala； Phe Leu
Leu (L) Ile； Val； Met； Ala； Phe Ile
Lys (K) Arg； Gln； Asn Arg
Met (M) Leu； Phe； Ile Leu
Phe (F) Leu； Val； Ile； Ala； Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr； Phe Tyr
Tyr (Y) Trp； Phe； Thr； Ser Phe
Val (V) Ile； Leu； Met； Phe； Ala Leu
本發明中，術語“抗”、“結合”、“特異性結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10 -7M，例如小於大約10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。本發明中，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面電漿體共振術(Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
本發明中，術語“表位”是指與抗體特異性結合的多肽決定位。本發明的表位是抗原中被抗體結合的區域。
本發明還提供了編碼上述抗體或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啓動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉形適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。 藥物組成物和應用
本發明還提供了一種組成物。優選地，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學上可接受的載劑。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約爲5-8，較佳地pH約爲6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射(如腹膜內)、顱內注射、或腔內注射。本發明中，術語“藥物組成物”是指本發明的雙特異性抗體可以和藥學上可以接受的載劑一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明揭示的雙特異性抗體的胺基酸核心序列的構形完整性，同時還保護蛋白質的多官能基防止其降解(包括但不限於凝聚、脫氨或氧化)。本發明的藥物組成物含有安全有效量(如0.001-99wt%，較佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本發明上述的雙特異性抗體(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載劑或賦形劑。這類載劑包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他佐劑的水溶液透過常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-約50毫克/千克體重。此外，本發明的雙特異性抗體還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組成物時，是將安全有效量的雙特異性抗體或其免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情况下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀况等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。 抗體 - 藥物偶聯物 (ADC)
本發明還提供了基於本發明抗體的抗體偶聯藥物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗體偶聯藥物包括所述抗體、以及效應分子，所述抗體與所述效應分子偶聯，並優選爲化學偶聯。其中，所述效應分子優選爲具有治療活性的藥物。此外，所述效應分子可以是毒蛋白、化療藥物、小分子藥物或放射性核種中的一種或多種。
本發明抗體與所述效應分子之間可以是透過偶聯劑進行偶聯。所述偶聯劑的例子可以是非選擇性偶聯劑、利用羧基的偶聯劑、肽鏈、利用二硫鍵的偶聯劑中的任意一種或幾種。所述非選擇性偶聯劑是指使效應分子和抗體形成共價鍵連接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶聯劑可以是順烏頭酸酐類偶聯劑(如順烏頭酸酐)、醯基腙類偶聯劑(偶聯位址爲醯基腙)中的任意一種或幾種。
抗體上某些殘基(如Cys或Lys等)用於與多種功能基團相連，其中包括成像試劑(例如發色基團和螢光基團)，診斷試劑(例如MRI對比劑和放射性同位素)，穩定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑。抗體可以被偶聯到功能劑以形成抗體-功能劑的偶聯物。功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩定劑)被偶聯(共價連接)至抗體上。功能劑可以直接地、或者是透過連接子間接地連接於抗體。
抗體可以偶聯藥物從而形成抗體藥物偶聯物(ADCs)。典型地，ADC包含位於藥物和抗體之間的連接子。連接子可以是可降解的或者是不可降解的連接子。可降解的連接子典型地在細胞內環境下容易降解，例如在目標位址處連接子發生降解，從而使藥物從抗體上釋放出來。合適的可降解的連接子包括，例如酶降解的連接子，其中包括可以被細胞內蛋白酶(例如溶酶體蛋白酶或者胞內體蛋白酶)降解的含有肽基的連接子，或者糖連接子例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的連接子。肽基連接子可以包括，例如二胜肽，例如纈胺酸-瓜胺酸，苯丙胺酸-離胺酸或者纈胺酸-丙胺酸。其它合適的可降解的連接子包括，例如，pH敏感連接子(例如pH小於5.5時水解的連接子，例如腙連接子)和在還原條件下會降解的連接子(例如二硫鍵連接子)。不可降解的連接子典型地在抗體被蛋白酶水解的條件下釋放藥物。
連接到抗體之前，連接子具有能夠和某些胺基酸殘基反應的活性反應基團，連接透過活性反應基團實現。巰基特異性的活性反應基團是優選的，並包括：例如馬來醯亞胺類化合物，鹵代醯胺(例如碘、溴或氯代的)；鹵代酯(例如碘、溴或氯代的)；鹵代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基鹵代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基碸，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六環，而對離子是醋酸根、氯離子或者硝酸根；和聚亞甲基二甲基硫醚硫代磺酸鹽。連接子可以包括，例如，透過硫代丁二醯亞胺連接到抗體上的馬來醯亞胺。
藥物可以是任何細胞毒性，抑制細胞生長或者免疫抑制的藥物。在實施方式中，連接子連接抗體和藥物，而藥物具有可以和連接子成鍵的功能性基團。例如，藥物可以具有可以和連接子成鍵的胺基，羧基，巰基，羥基，或者酮基。在藥物直接連接到連接子的情况下，藥物在連接到抗體之前，具有反應的活性基團。
有用的藥物類別包括，例如，抗微管蛋白藥物、DNA小溝結合試劑、DNA複製抑制劑、烷化試劑、抗生素、葉酸拮抗物、抗代謝藥物、化療增敏劑、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼等。在本發明中，藥物-連接子可以用於在一個簡單步驟中形成ADC。在其它實施方式中，雙功能連接子化合物可以用於在兩步或多步方法中形成ADC。例如，半胱胺酸殘基在第一步驟中與連接子的反應活性部分反應，並且在隨後的步驟中，連接子上的功能性基團與藥物反應，從而形成ADC。
通常，選擇連接子上功能性基團，以利於特異性地與藥物部分上的合適的反應活性基團進行反應。作爲非限制性的例子，基於疊氮化合物的部分可以用於特異性地與藥物部分上的反應性炔基基團反應。藥物透過疊氮和炔基之間的1,3-偶極環加成，從而共價結合於連接子。其它的有用的功能性基團包括，例如酮類和醛類(適合與醯肼類和烷氧基胺反應)，膦(適合與疊氮反應)；異氰酸酯和異硫氰酸酯(適合與胺類和醇類反應)；和活化的酯類，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(適合與胺類和醇類反應)。這些和其它的連接策略，例如在《生物偶聯技術》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本領域技術人員所熟知的。本領域技術人員能夠理解，對於藥物部分和連接子的選擇性反應，當選擇了一個互補對的反應活性功能基團時，該互補對的每一個成員既可以用於連接子，也可以用於藥物。
本發明還提供了製備ADC的方法，可進一步地包括：將抗體與藥物-連接子化合物，在足以形成抗體偶聯物(ADC)的條件下進行結合。
在某些實施方式中，本發明方法包括：在足以形成抗體-連接子偶聯物的條件下，將抗體與雙功能連接子化合物進行結合。在這些實施方式中，本發明方法還進一步地包括：在足以將藥物部分透過連接子共價連接到抗體的條件下，將抗體連接子偶聯物與藥物部分進行結合。
在一些實施方式中，抗體藥物偶聯物ADC如下分子式所示： 其中： Ab是抗體， LU是連接子； D是藥物； 而且下標p是選自1到8的值。
以下實施例是對本發明進行進一步的說明，不應理解爲是對本發明的限制。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於建構載體和質體的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質體的方法或將質體引入宿主細胞的方法。這樣的方法對本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch,E.F. and Maniais,T. (1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
以下實施例中使用的實驗材料和來源以及實驗試劑的配製方法具體說明如下。 實驗材料及試劑：
Balb/c小鼠：購自上海靈暢生物科技有限公司。
PBMC：購自澳賽爾斯生物技術上海有限公司，貨號PB004-C。
人IL-33-his：將IL-33序列的Ser112-Thr270 (NCBI登錄號爲NP_254274.1)選殖至E.coli表現載體進行表現，並在IL-33的C-末端添加6×His標籤以便於透過Ni +親和層析管柱進行純化，其胺基酸序列如SEQ ID NO：53所示。
食蟹猴IL-33-his：購自義翹神州，貨號90912-CNAE。
IL-33-his-biotin蛋白：購自Thermo Fisher，貨號20217，按照EZ-Link NHS-Biotin Reagent試劑說明書對IL-33-his蛋白進行biotin化。
Rat-Anti-human IL-6：購自BD Pharmingen，貨號554543。
biotin Rat Anti Human IL-6：購自BD Pharmingen，貨號554546。
Mouse-Anti-human IFNγ：購自BD Biosciences，貨號551221。
biotin mouse-anti-human IFNγ：購自BD Biosciences，貨號554550。
羊抗小鼠IgG二抗：購自Millipore，貨號AP181P。
HRP-anti human IgG Fc二抗：購自Sigma，貨號A0170。
HRP標記的streptavidin二抗：購自BD Biosciences，貨號554066。
IL-6套組：Invitrogen，貨號88-7066-77。
IL-8套組：Invitrogen，貨號BMS204-3TEN
IL-12：購自Sino Biological，貨號CT011-H08H。
ST2-Fc蛋白：將人的ST2序列(NCBI登錄號爲NP_003847.2)與人IgG1的Fc區序列進行融合選殖至真核表現載體PTT5中，透過轉染HEK-293F細胞進行融合表現，隨後收集表現上清液透過ProteinA親和層析管柱進行純化。ST2-Fc胺基酸序列如SEQ ID NO：54所示。
TMB：購自BD公司，貨號555214。
1%的Glutmine (麩醯胺酸)、1% Sodium pyruvate(丙酮酸鈉)、1%MEM-NEAA (最小基本培養基-非必需胺基酸溶液)、1% Penicillin-streptomycin (青黴素-鏈黴素)、β-巰基乙醇、20% FBS (胎牛血清)：均購自Gibco公司。
SA蛋白：Streptavidin，購自Sigma，貨號85878-1MG。
SFM培養基：購自life technologies公司，貨號12045-076。
RPMI1640完全培養基：購自Gibco。 實驗儀器：
電融合儀：購自BTX公司。
酵素標示讀取儀：購自Molecular Devices，型號SpectraMax 190。
本發明的抗體序列如下表所示：
SEQ ID NO. 名稱 序列
2 864F3-ch1 VH QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRLPPGKGLEWLGVIRAGGSSDYNSALMSRLNIRKDNSKSQVFLEMNSLQTADTAMYYCARDHYFSNSYGGSPYWGQGTLVTVSA
4 864F3-ch2,871G1-ch VH QVHLKESGPGLVAPSQSLSITCNVSGFSLSKYGVHWIRQTPGRGLDWLGVLRAGGTISYNSALMSRLSISEDISKSQVFLKMNDLQTDDSAIYFCARDHYYYSSFGGFASWGQGTLVTVSA
6 864F3-ch1,864F3-ch2 VL DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIATWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTEFSFKISSLQAEDFVIYYCQQLYNTPYTFGGGTKLEIK
8 874F7-ch VH QVQLKESGPGLVAPSHSLSITCNVSGFSLSKYGVHWIRQIPGRGLDWLGVLRAGGSTGYNSALMSRLSISKDSSKSQVFLKMNDLRTDDTAVYFCVRDHYYYSSYGGFVYWGQGTLVTVSA
10 874F7-ch VL DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGAWLAWYRQQPGKSPQLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTEFSFKINNLQAEDFVSYYCQQLDSSPYTFGGGTRLEM
12 871G1-ch VL DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGAWLAWYRQQPGKSPQLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKINNLQAEDFVIYYCQQLNSTPYTFGGGTRLEM
13 重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
14 輕鏈恆定區 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
15 864F3 HCDR1 NYGVH
16 864F3 HCDR2 VIRAGGSSDYNSALMS
17 864F3 HCDR3 DHYFSNSYGGSPY
18 864F3, 874F7,871G1 HCDR1 KYGVH
19 864F3,871G1 HCDR2 VLRAGGTISYNSALMS
20 864F3,871G1 HCDR3 DHYYYSSFGGFAS
21 864F3 LCDR1 LASQTIATWLA
22 864F3, 874F7,871G1 LCDR2 AATRLAD
23 864F3 LCDR3 QQLYNTPYT
24 874F7 HCDR2 VLRAGGSTGYNSALMS
25 874F7 HCDR3 DHYYYSSYGGFVY
26 874F7,871G1 LCDR1 LASQTIGAWLA
27 874F7 LCDR3 QQLDSSPYT
28 871G1 LCDR3 QQLNSTPYT
29 864F3-HuG VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQPPGKGLEWIGVIRAGGSSDYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHYFSNSYGGSPYWGQGTLVTVSS
30 864F3-Hu1 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRLPPGKGLEWIGVIRAGGSSDYNSALMSRVTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDHYFSNSYGGSPYWGQGTLVTVSS
31 864F3-Hu2 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWVRLPPGKGLEWLGVIRAGGSSDYNSALMSRLTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDHYFSNSYGGSPYWG
32 864F3-HuG,864F3-Hu1,864F3-Hu2,864F3-Hu3,864F3-Hu4,864F3-Hu5 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIATWLAWYQQKPGKSPKLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYNTPYTFGQGTKVEIK
33 864F3-Hu3,871G1-HuG VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSKYGVHWIRQPPGKGLEWIGVLRAGGTISYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHYYYSSFGGFASWGQGTLVTVSS
34 864F3-Hu4,871G1-Hu1 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSKYGVHWIRQPPGKGLEWIGVLRAGGTISYNSALMSRVTISEDISKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDHYYYSSFGGFASWGQGTLVTVSS
35 864F3-Hu5,871G1-Hu2 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSKYGVHWIRQPPGKGLEWLGVLRAGGTISYNSALMSRLTISEDISKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDHYYYSSFGGFASWGQGTLVTVSS
36 871G1-HuG,871G1-Hu1,871G1-Hu2 VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGAWLAWYQQKPGKSPKLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSTPYTFGQGTKVEIK
37 874F7-HuG VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSKYGVHWIRQPPGKGLEWIGVLRAGGSTGYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHYYYSSYGGFVYWGQGTLVTVSS
38 874F7-Hu1 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSKYGVHWIRQPPGKGLEWIGVLRAGGSTGYNSALMSRVTISKDTSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDHYYYSSYGGFVYWGQGTLVTVSS
39 874F7-Hu2 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSKYGVHWIRQPPGKGLEWLGVLRAGGSTGYNSALMSRLTISKDSSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRDHYYYSSYGGFVYWGQGTLVTVSS
40 874F7-HuG，874F7-Hu1，874F7-Hu2 VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGAWLAWYQQKPGKSPKLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLDSSPYTFGQGTKVEIK
實施例 1 抗原免疫動物以及融合瘤的製備和篩選步驟1：抗原免疫小鼠
用原核重組表現的人IL-33-his蛋白常規腹腔免疫Balb/c小鼠。第一天，可溶性人IL-33-his蛋白與弗氏完全佐劑乳化或水溶性佐劑(quick antibody)充分混勻後，對Balb/c小鼠進行腹腔注射(人IL-33-his 50 μg/鼠)，第十四天，可溶性人IL-33-his蛋白與弗氏不完全佐劑乳化或水溶性佐劑(quick antibody)充分混勻後，對Balb/c小鼠進行腹腔加強免疫(人IL-33-his 50 μg/鼠)，在第三十六天，用可溶性人IL-33-his蛋白同上次一樣加強免疫動物(人IL-33-his 50 μg/小鼠)，三周以後腹腔內注射人IL-33-his激發，3~4天後，取小鼠脾臟進行融合實驗。 步驟2：融合瘤的製備和篩選
在小鼠末次衝擊免疫後3~4天，使用常規的融合瘤技術方案，將小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0透過電融合儀進行電融合。融合後的細胞在完全培養基中懸浮均勻，完全培養基即將RPMI1640和DMEM F12培養基1：1混勻後加入1%的Glutmine (麩醯胺酸)，1% Sodium pyruvate (丙酮酸鈉)，1% MEM-NEAA (最小基本培養基-非必需胺基酸溶液)，1% Penicillin-streptomycin(青黴素-鏈黴素)，50 μM的β-巰基乙醇及20% FBS (胎牛血清)組成的培養基；按10 5個細胞/100 μl/孔，分入共36塊96孔培養盤中培養過夜，次日，每孔加入100 μl孔含有2×HAT的完全培養基，使96孔盤內培養液爲200 μl/孔(含1×HAT)。在7~12天後，收取上清液，透過間接酵素連結免疫吸附測定法(ELISA)篩選人IL-33-his結合活性陽性的融合瘤孔。
其中，間接酵素連結免疫吸附測定法篩選人IL-33-his結合活性陽性的融合瘤孔的方法如下：將重組人IL-33-his蛋白以塗佈液(50 mM的碳酸鹽塗佈緩衝液，pH 9.6)稀釋至1 μg/ml，100 μl/孔加入ELISA培養盤，4℃塗佈過夜。PBST洗滌培養盤3次，加入200 μl/孔封阻液(2% BSA-PBS)，37℃放置1h後PBST洗滌培養盤1次待用。將收取的融合瘤上清液依次加入封阻後的ELISA培養盤，100 μl/孔，37℃放置1h。PBST洗滌培養盤3次，加入HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗，37℃放置30 min；PBST洗滌培養盤5次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5℃)避光放置5 min；每孔加入50 μl 2M H 2SO 4終止液終止受質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，分析待測抗體與標靶抗原人IL-33-his結合能力。
在含血清完全培養基中擴增篩選獲得的10株融合瘤細胞株，離心換液至無血清培養液SFM培養基，使細胞密度爲1~2×10 7/ml，在5% CO 2，37℃條件下培養2周，離心獲取培養上清液，透過Protein G親和層析進行純化，獲得10株鼠源抗人IL-33單株抗體。分別命名爲874F7、871G1、864F3、887B9、858D5、868H10、604A8、604A12、646F8、651H2。 實施例 2 ELISA 法測定鼠源抗體對人 IL-33 的結合活性
間接酵素連結免疫吸附測定法測定鼠源抗體對人IL-33的結合能力。具體方法如下：預先塗佈生物素-親和素(SA)以塗佈液(50 mM的碳酸鹽塗佈緩衝液，pH 9.6)稀釋至2 μg/ml塗佈培養盤4℃，過夜；再用5%的脫脂奶粉封阻，37℃，2小時。儲存於-80℃待用。將生物素化的重組人IL-33-his蛋白以塗佈液(50 mM的碳酸鹽塗佈緩衝液，pH 9.6)稀釋至0.5 μg/ml，100 μl/孔加入預塗佈的SA的培養盤中，37℃，0.5小時。PBST洗滌培養盤3次，將以1% BSA梯度稀釋的待測抗體依次加入封阻後的ELISA培養盤，100 μl/孔，37℃放置1h。PBST洗滌培養盤3次，加入HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗，37℃放置30 min；PBST洗滌培養盤3次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5℃)避光放置5 min；每孔加入50 μl 2M H 2SO 4終止液終止受質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，分析待測抗體與標靶抗原人IL-33-his的結合能力。
結果如圖1A、1B，所示抗體都有很好的結合活性。874F7、871G1、864F3、887B9、858D5、868H10抗體EC 50分別爲0.11 nM、0.14 nM、0.27 nM、0.07 nM、0.18 nM、0.36 nM。604A8、604A12、646F8、651H2抗體EC 50分別爲0.11 nM、0.16 nM、0.10 nM、0.13 nM。 實施例 3 鼠源抗體阻斷 ST2 結合 IL-33 的活性測定
ST2是目前被發現的IL-33唯一的受體，IL-33作爲細胞激素，依賴ST2訊息途徑發揮其生理功能，抗體的阻斷活性可以反應其中和活性。具體方法如下：以2 μg/ml ST2 PBS溶液塗佈培養盤，4℃過夜；PBST洗滌3次，再用5%的脫脂奶粉封阻，37℃，2小時；PBST洗滌3次待用；1% BSA稀釋的20 ng/ml IL-33-his-biotin抗原與用1% BSA梯度稀釋待測抗體1:1等體積混合，37℃培育小時；將此混合液加入到預先塗佈的ST2培養盤中，37℃培育1小時；PBST洗滌3次；按1:8000加入HRP標記的streptavidin二抗，37℃培育0.5小時；PBST洗滌培養盤3次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5℃)避光放置5 min；每孔加入50 μl 2M H 2SO 4終止液終止受質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值。
結果見圖2A、2B，圖2A所示的抗體874F7、871G1、864F3、887B9、858D5、868H10都有很好的阻斷活性，IC 50分別爲0.90 nM、0.74 nM、0.23 nM、0.25 nM、0.16 nM、0.27 nM。圖2B所示抗體604A8、604A12、646F8、651H2沒有或有很弱的阻斷活性。 實施例 4 鼠源抗體對 IL-33 誘導 HUVEC 細胞 IL-6 表現的抑制作用
採用HUVEC細胞測定抗IL-33抗體的生物學活性。具體方法如下：在T75培養瓶中培養HUVEC細胞，把HUVEC細胞傳至第五代細胞，將T75培養瓶中的HUVEC細胞用1×PBS清洗，再用1 ml胰蛋白酶消化10 min，待細胞脫落，用10 ml培養基終止消化，計數，平盤培養，100 μl/孔，6000個/孔。剩餘於T75培養瓶中繼續培養凍存。IL-33-his以培養基稀釋至20 ng/ml，待測抗體從40 μg/ml，4倍稀釋8個梯度，空白做4個孔，稀釋後抗原和抗體取各取50 μl加入細胞盤中，混勻。即IL-33-his的終濃度爲5 ng/ml。混合後37℃培育12h~18h。取上清液測定IL-6的濃度。測定方法詳見IL-6套組說明書。按照以下公式計算IL-6抑制率並透過GraphPad Prism 6軟體進行擬合分析：
抑制率=(ODAgIL-33-OD給藥)/(ODAgIL-33-OD空白)×100%。
結果如圖3A、3B、3C，874F7、871G1、864F3、887B9、858D5、868H10、604A8、604A12、651H2抑制活性的IC 50分別爲0.65 nM、1.66 nM、1.52 nM、4.53 nM、12.25 nM、9.35 nM、0.08 nM、0.13 nM、0.04 nM。另外，抗體604A8、604A12、651H2的最大抑制率較差。 實施例 5 鼠源抗體對 IL-33 誘導 HUVEC 細胞 IL-8 表現的抑制作用
採用HUVEC細胞測定抗IL-33抗體的生物學活性。具體方法如下：在T75培養瓶中培養HUVEC細胞，把HUVEC細胞傳至第五代細胞，將T75培養瓶中的HUVEC細胞用1×PBS清洗，再用1ml胰蛋白酶消化10 min，待細胞脫落，用10 ml培養基終止消化，計數，平盤培養，100 μl/孔，6000個/孔。剩餘於T75培養瓶中繼續培養凍存。IL-33-his以培養基稀釋至20 ng/ml，待測抗體從40 μg/ml，4倍稀釋8個梯度，空白做4個孔，稀釋後抗原和抗體取各取50 μl加入細胞盤中，混勻。即IL-33-his的終濃度爲5 ng/ml。混合後37℃培育12h~18h。取上清液測定IL-8的濃度。測定方法詳見IL-8套組說明書。按照以下公式計算IL-8抑制率並透過GraphPad Prism 6軟體進行擬合分析：
抑制率=(ODAgIL-33-OD給藥)/(ODAgIL-33-OD空白)×100%。
結果見圖4，抗體858D5、868H10活性很弱，抗體874F7、871G1、864F3、887B9的IC 50分別爲0.35 nM、0.16 nM、1.46 nM、8.90 nM。 實施例 6 鼠源抗體與食蟹猴 IL-33 抗原的交叉活性測定
間接酵素連結免疫吸附測定法測定鼠源抗體對食蟹猴IL-33的結合能力。具體方法方法如下：預先塗佈生物素-鏈親合素(SA)以塗佈液(50 mM的碳酸鹽塗佈緩衝液，pH 9.6)稀釋至2 μg/ml塗佈培養盤4℃，過夜；再用5%的脫脂奶粉封阻，37℃，2小時。儲存於-80℃待用。將生物素化的重組食蟹猴IL-33-his蛋白以塗佈液(50 mM的碳酸鹽塗佈緩衝液，pH 9.6)稀釋至1 μg/ml，100 μl/孔加入預塗佈的SA的培養盤中，37℃，0.5小時。PBST洗滌培養盤3次，將以1% BSA梯度稀釋的待測抗體依次加入封阻後的ELISA培養盤，100 μl/孔，37℃放置1h。PBST洗滌培養盤3次，加入HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗，37℃放置30 min；PBST洗滌培養盤3次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μl的TMB，室溫(20±5℃)避光放置5 min；每孔加入50 μl 2M H 2SO 4終止液終止受質反應，酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，分析待測抗體與標靶抗原食蟹猴IL-33-his的結合能力。
結果見圖5，所示抗體都能很好的結合食蟹猴IL-33蛋白。抗體874F7、871G1、864F3、887B9、858D5、868H10、604A8、604A12、646F8、651H2的EC 50分別爲0.03 nM、0.04 nM、0.06 nM、0.05 nM、0.02 nM、0.05 nM、0.06 nM、0.06 nM、0.03 nM、0.06 nM。 實施例 7 鼠源抗體體內中和活性評價
動物靜脈給抗原IL-33會引起體內發炎反應改變，脾臟細胞增殖進而引起脾臟重量增加，此方法可以用來評價抗體藥物在體內中和IL-33的活性。具體方法如下：雌性BALB/C小鼠，體重18-20g，隨機分成6組，每組10隻動物。第一組，正常對照組；第二組，IL-33-his抗原攻擊組，分組後第二天開始每天腹腔注射0.4 μg/隻IL-33抗原，連續給6天；第三組，864F3治療組，分組當天，腹腔注射864F3抗體，5 mg/kg，分組後第二天開始每天腹腔注射0.4 μg/隻IL-33抗原，連續給6天；第四組，871G1治療組，分組當天，腹腔注射871G1抗體，5 mg/kg，分組後第二天開始每天腹腔注射0.4 μg/隻IL-33-his抗原，連續給6天；第五組，874F7治療組，分組當天，腹腔注射874F7抗體，5 mg/kg，分組後第二天開始每天腹腔注射0.4 μg/隻IL-33抗原，連續給6天。分組後第7天，動物秤重，安樂死動物取脾臟秤重。
實驗結果見圖6，PBS對照組脾臟重量平均值爲86.9±9.4 mg，而給抗原Ag-IL-33組增重明顯爲195.7±26.9 mg。864F3、871G1、874F7抗體給藥組脾臟重量平均值分別爲106.3±24.5 mg、77.7±17.5 mg、89.9±14.7 mg，都具有明顯的中和活性。 實施例 8 嵌合抗體的製備
本實施例透過分子生物學的相關方法獲取融合瘤864F3、874F7和871G1的重鏈可變區和輕鏈可變區，並進一步建構嵌合抗體。
透過Trizol萃取864F3、874F7和871G1三個融合瘤細胞的RNA並進行mRNA反轉錄獲取cDNA，隨後以cDNA爲模板，分別用鼠源抗體的重鏈和輕鏈簡併引子(《Antibody Engineering》Volume 1，Edited by Roland Kontermann and Stefan Dübel，組合引子的序列來自第323頁)進行PCR，對所獲得的PCR產物進行定序並透過kabat資料庫分析，確定所獲得的序列爲鼠源抗體的可變區序列。
相關序列資訊如下：
864F3具有兩個重鏈可變區基因序列，全長均爲363 bp，各自編碼121個胺基酸殘基，核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示，胺基酸序列分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示；864F3輕鏈可變區基因序列全長321 bp，編碼107個胺基酸殘基，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
874F7重鏈可變區基因序列全長爲363 bp，編碼121個胺基酸殘基，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示；874F7輕鏈可變區基因序列全長318 bp，編碼106個胺基酸殘基，核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
871G1重鏈可變區基因序列全長爲363 bp，編碼121個胺基酸殘基，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示；871G1輕鏈可變區基因序列全長318 bp，編碼106個胺基酸殘基，核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
三種優選的鼠源抗IL-33抗體的3個H-CDR和3個L-CDR的同源性較高，尤其是均具有相同的L-CDR2 (SEQ ID No：22)。
對所得的各融合瘤重鏈可變區序列與人的IgG4恆定區(包含S228P突變)(胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示)拼接，輕鏈可變區序列與人的kappa鏈恆定區(胺基酸序列如SEQ ID NO：14所示)拼接，分別建構各嵌合抗體的重鏈和輕鏈至pcDNA3.4表現載體，轉染HEK-293F細胞，透過Protein A純化獲得各嵌合抗體，透過SDS-PAGE電泳及SEC-HPLC確定所表現各抗體分子量在150 kD左右，抗體純度＞95%，定量，分裝，凍存於-80℃備用。 實施例 9 ELISA 法測定各嵌合抗體對人 IL-33 的結合活性
將SA蛋白稀釋至2 μg/mL，塗佈ELISA培養盤，100 μL/孔，4℃塗佈過夜，PBST (PBS含0.05% Tween20)洗滌3次，用PBS配製2% BSA，200 μL/孔，於室溫封阻2h，PBST洗滌2次後，用PBST配製的1% BSA將IL-33-his-biotin蛋白稀釋至1 μg/mL，按照100 μL/孔加至ELISA培養盤中，室溫培育1h，用PBST配製的1% BSA按3倍梯度分別稀釋各單株抗體，最高濃度爲10 μg/mL，稀釋12個梯度，加入ELISA孔，100 μL/孔，室溫培育1h，每個樣品平行做2個重複孔，PBST洗滌3次，用PBST配製的1% BSA按照適當比例稀釋HRP-anti human IgG Fc二抗，加入ELISA孔，100 μL/孔，室溫培育1h，PBST洗滌3次後添加TMB顯色液，100 μL/孔，顯色至預期顔色，用2 M H 2SO 4終止顯色反應，70 μL/孔，使各反應液震盪均勻並於酵素標示讀取儀測定OD450 nm，分析數據，計算EC 50。
實驗結果如圖7所示，嵌合抗體864F3-ch2、864F3-ch1、871G1-ch、874F7-ch的EC 50分別爲0.173 nM、0.127 nM、0.178 nM、0144 nM，表明各嵌合抗體對IL-33均具有良好的親和力。 實施例 10 嵌合抗體阻斷 ST2 結合 IL-33 的活性測定
用ELISA塗佈液將ST2-Fc蛋白稀釋至1 μg/mL，塗佈ELISA培養盤，100 μL/孔，置於濕盒中，4℃，塗佈16 h，PBST洗滌ELISA培養盤3次，然後用PBS配製的2% BSA，200 μL/孔，於室溫封阻2h，PBST洗滌1次，拍乾，除去多餘的封阻液，用1% BSA PBST按3倍梯度分別稀釋各單株抗體，最高濃度爲40 μg/mL，稀釋11個梯度，將稀釋好的抗體與10 ng/ml IL-33-his-biotin蛋白1:1混合，混合均勻後加入ELISA孔，100 μL/孔，室溫培育1h，每個濃度平行做2個重複孔(抗體最高濃度終濃度爲20 μg/mL，IL-33-his-biotin終濃度爲5 ng/mL)，洗除未結合的或非特異性結合的一抗，按照抗體說明書要求，用抗體稀釋液HRP標記的streptavidin二抗稀釋至合適濃度，加入ELISA培養盤，100 μL/孔，室溫培育1h，用PBST洗滌5次，並將ELISA培養盤於吸水紙上拍乾，除去多餘的液體，加入TMB顯色液，100 μL/孔，顯色至合適深淺，加入2 M H 2SO 4，70 μL/孔，以終止顯色，並於多功能酵素標示讀取儀中在450 nm波長處測定其吸光度，分析數據。
實驗結果如圖8所示，嵌合抗體874F7-ch、871G1-ch、864F3-ch1、864F3-ch2的IC 50分別爲0.634 nM、0.853 nM、45.245 nM、0.580 nM，表明各嵌合抗體爲IL-33阻斷型抗體，均能有效阻斷IL-33與其受體ST2的結合，並且874F7-ch、871G1-ch和864F3-ch2較優。 實施例 11 人源化抗體的製備
對各候選鼠源抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列進行分析，依據Kabat規則確定鼠源抗體的3個抗原互補決定區(CDR)和4個框架區(FR)。其中，864F3重鏈互補決定區的胺基酸序列爲 HCDR1：NYGVH (SEQ ID NO：15)、 HCDR2：VIRAGGSSDYNSALMS (SEQ ID NO：16)、 HCDR3：DHYFSNSYGGSPY (SEQ ID NO：17)或 HCDR1：KYGVH (SEQ ID NO：18)、 HCDR2：VLRAGGTISYNSALMS (SEQ ID NO：19)、 HCDR3：DHYYYSSFGGFAS (SEQ ID NO：20)，
輕鏈互補決定區的胺基酸序列爲 LCDR1：LASQTIATWLA (SEQ ID NO：21)、 LCDR2：AATRLAD (SEQ ID NO：22)和 LCDR3：QQLYNTPYT (SEQ ID NO：23)。
874F7重鏈互補決定區的胺基酸序列爲 HCDR1：KYGVH (SEQ ID NO：18)、 HCDR2：VLRAGGSTGYNSALMS (SEQ ID NO：24)、 HCDR3：DHYYYSSYGGFVY (SEQ ID NO：25)，
輕鏈互補決定區的胺基酸序列爲 LCDR1：LASQTIGAWLA (SEQ ID NO：26)、 LCDR2：AATRLAD (SEQ ID NO：22)和 LCDR3：QQLDSSPYT (SEQ ID NO：27)。
871G1重鏈互補決定區的胺基酸序列爲 HCDR1：KYGVH (SEQ ID NO：18)、 HCDR2：VLRAGGTISYNSALMS (SEQ ID NO：19)、 HCDR3：DHYYYSSFGGFAS (SEQ ID NO：20)，
輕鏈互補決定區的胺基酸序列爲 LCDR1：LASQTIGAWLA (SEQ ID NO：26)、 LCDR2：AATRLAD (SEQ ID NO：22)和 LCDR3：QQLNSTPYT (SEQ ID NO：28)。
鼠源抗體的CDR序列如下表1a所示：
  序列 SEQ ID NO.
HCDR1   NYGVH 15
KYGVH 18
HCDR2     VIRAGGSSDYNSALMS 16
VLRAGGTISYNSALMS 19
VLRAGGSTGYNSALMS 24
HCDR3     DHYFSNSYGGSPY 17
DHYYYSSFGGFAS 20
DHYYYSSYGGFVY 25
LCDR1   LASQTIATWLA 21
LASQTIGAWLA 26
LCDR2 AATRLAD 22
LCDR3     QQLYNTPYT 23
QQLDSSPYT 27
QQLNSTPYT 28
在Germline資料庫中選取與上述各鼠源抗體非FR區匹配最好的人源化模板。然後將鼠源抗體的CDR區移植到所選擇的人源化模板上，替換人源模板的CDR區，重鏈可變區再與人IgG4恆定區(包含S228P突變)重組，輕鏈可變區與人的kappa鏈恆定區重組，同時以該抗體的三維結構爲基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對各抗體的VL和VH的構形有重要影響的殘基進行回復突變，最終獲得多個人源化抗體，各人源化抗體和嵌合抗體對應的重鏈、輕鏈可變區及序列如表1b所示。分別建構各人源化抗體的重鏈和輕鏈至pcDNA3.4表現載體，轉染HEK-293F細胞，透過ProteinA純化獲得各人源化抗體，並透過SDS-PAGE電泳及SEC-HPLC確定各抗體分子量大小正確及純度＞95%。
表1b：各人源化抗體可變區序列表
Antibody 胺基酸序列 核苷酸序列
864F3-ch1 VH SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：1
VL SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：5
864F3-ch2 VH SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：3
VL SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：5
874F7-ch VH SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：7
VL SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：9
871G1-ch VH SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：3
VL SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：11
864F3-HuG VH SEQ ID NO：29 SEQ ID NO：41
VL SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：44
864F3-Hu1 VH SEQ ID NO：30 SEQ ID NO：42
VL SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：44
864F3-Hu2 VH SEQ ID NO：31 SEQ ID NO：43
VL SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：44
864F3-Hu3 VH SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：45
VL SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：44
864F3-Hu4 VH SEQ ID NO：34 SEQ ID NO：46
VL SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：44
864F3-Hu5 VH SEQ ID NO：35 SEQ ID NO：47
VL SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：44
874F7-HuG VH SEQ ID NO：37 SEQ ID NO：49
VL SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：52
874F7-Hu1 VH SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：50
VL SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：52
874F7-Hu2 VH SEQ ID NO：39 SEQ ID NO：51
VL SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：52
871G1-HuG VH SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：45
VL SEQ ID NO：36 SEQ ID NO：48
871G1-Hu1 VH SEQ ID NO：34 SEQ ID NO：46
VL SEQ ID NO：36 SEQ ID NO：48
871G1-Hu2 VH SEQ ID NO：35 SEQ ID NO：47
VL SEQ ID NO：36 SEQ ID NO：48
實施例 12 ELISA 法測定各人源化抗體對人 IL-33 的結合活性
透過ELISA法測定上述各人源化抗體對人IL-33的結合親和力，相關實驗方法參照實施例9。
實驗結果如圖9A~9D所示，嵌合抗體864F3-ch2和人源化抗體864F3-HuG、864F3-Hu1、864F3-Hu2的EC 50分別爲0.169 nM、0.760 nM、0.249 nM、0.181 nM，與嵌合抗體864F3-ch2相比，人源化抗體864F3-HuG、864F3-Hu1、864F3-Hu2對人IL-33的親和力損失較多，嵌合抗體864F3-ch2和864F3-Hu3、864F3-Hu4、864F3-Hu5的EC 50分別爲0.124 nM、0.138 nM、0.135 nM、0.146 nM，與嵌合抗體864F3-ch2相比，864F3-Hu3、864F3-Hu4和864F3-Hu5對人IL-33的親和力幾乎不變。
嵌合抗體874F7-ch和人源化抗體874F7-Hμg、874F7-Hu1、874F7-Hu2的EC 50分別爲0.177 nM、0.170 nM、0.129 nM、0.136 nM。與嵌合抗體874F7-ch相比，人源化抗體874F7-Hu1和874F7-Hu2對人IL-33的親和力未發生損失。
嵌合抗體871G1-ch和人源化抗體871G1-HuG、871G1-Hu1、871G1-Hu2的EC 50分別爲與0.255 nM、0.187 nM、0.191 nM、0.176 nM。與嵌合抗體871G1-ch相比，人源化抗體871G1-Hu1、871G1-Hu2和871G1-HuG對人IL-33的親和力均未發生損失。 實施例 13 人源化抗體阻斷 ST2 結合 IL-33 的活性測定
透過ELISA法測定上述各人源化抗體對IL-33和其受體ST2結合的阻斷作用，相關實驗方法參照實施例10。
實驗結果如圖10所示，人源化抗體864F3-Hu4、864F3-Hu5、871G1-Hu1、871G1-Hu2、874F7-Hu1、874F7-Hu2對IL-33與ST2蛋白結合阻斷作用的IC 50值分別爲0.512 nM、0.473 nM、0.404 nM、0.361 nM、0.451 nM、0.350 nM。表明各人源化抗體均保留了對IL-33與ST2結合的阻斷作用。 實施例 14 人源化單株抗體對 IL-33 的結合動力學測定
利用共價偶聯有Protein A/G的晶片(購自GE Healthcare，貨號BR-1005-30)捕獲各待測抗體，相關運行參數如下：抗體濃度爲2 μg/mL，接觸時間75 s，流速10 μL/min，再生接觸時間爲30 s。利用HBS-EP pH7.4緩衝液(購自GE Healthcare，貨號BR-1006-69)稀釋IL-33-his抗原，最高濃度爲50 nM，按照2倍稀釋至0.39 nM，設置重複孔及0濃度點，採用6 M鹽酸胍溶液作爲再生緩衝液，在Biacore 8K上按照如下參數進樣，結合時間180 s，解離時間900 s，流速30 μL/min，再生接觸時間爲30 s。運行完成後，利用Biacore 8K Evaluation Software按照“1：1 binding kinetics model”對數據進行分析，得出各抗體對IL-33的結合動力學參數。
結果如表2，各人源化抗體對IL-33結合常數(ka)、解離常數( kd)以及平衡解離常數(KD)均處於同一位準。 表2：各人源化抗體對IL-33的結合動力學參數
樣品 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
864F3-Hu4 3.23E+05 4.47E-04 1.38E-09
864F3-Hu5 3.23E+05 4.39E-04 1.36E-09
874F7-Hu1 2.02E+05 5.70E-04 2.82E-09
874F7-Hu2 1.94E+05 5.76E-04 2.97E-09
871G1-Hu1 2.95E+05 5.04E-04 1.71E-09
871G1-Hu2 3.00E+05 5.27E-04 1.76E-09
實施例 15 人源化抗體對 IL-33 誘導 HUVEC 細胞 IL-6 表現的抑制作用
本實施例透過測定各人源化抗體對IL-33-his蛋白誘導HUVEC細胞表現IL-6的抑制效果以評價各人源化抗體的活性。具體實驗步驟如下：將T75培養瓶中的HUVEC細胞消化計數後平盤培養於完全培養基中，100 μL/孔，6000細胞/孔，於37℃培養箱培養，2 h後，待細胞貼壁後開始給藥；用完全培養基稀釋待測抗體，最高濃度爲200 nM，5倍稀釋9個梯度，設置陽性空白對照及陰性空白對照；稀釋後抗體與20 ng/mL IL-33-his按1:1體積混合(抗體加入細胞後最高濃度終濃度爲50 nM，IL-33-his終濃度爲5 ng/mL)。室溫培育30 min；取100 μL抗體/ IL-33-his混合液加入細胞液中輕輕混勻，37℃ CO 2培養箱作用20 h後離心收集上清液保存於-80℃，以進行IL-6測定。
用ELISA塗佈液稀釋Rat-Anti-human IL-6蛋白至2.5 μg/mL，塗佈ELISA培養盤，100 μL/孔，置於濕盒中，4℃，塗佈16 h；用PBST洗滌ELISA培養盤三次，去除未結合蛋白，並將ELISA培養盤於吸水紙上拍乾，除去多餘的液體，然後用PBS配製的2% BSA，200 μL/孔，於室溫封阻1-2 h；用PBS配製的1% BSA按照3倍梯度稀釋IL-6標準品，最高濃度爲30 ng/mL。混合均勻後加入ELISA孔，100 μL/孔，加入100 μL/孔上述細胞上清液到ELISA孔中，室溫培育1 h，標準曲線每個樣品平行做2個重複孔；洗除未結合的或非特異性結合的一抗，用抗體稀釋液將biotin Rat Anti Human IL-6按照1：1000稀釋，混合均勻後加入ELISA孔，100 μL/孔，室溫培育1h；洗除未結合的或非特異性結合的抗體，將HRP標記的streptavidin二抗稀釋至合適濃度，加入ELISA培養盤，100 μL/孔，室溫培育1h；用PBST洗滌五次，並將ELISA培養盤於吸水紙上拍乾，除去多餘的液體，加入TMB顯色液，顯色至合適深淺，加入2 M H 2SO 4，50 μL/孔，以終止顯色，並於多功能酵素標示讀取儀中在450 nm波長處測定其吸光度，分析數據。
實驗結果如圖11所示，人源化抗體864F3-Hu4、864F3-Hu5、871G1-Hu1、871G1-Hu2、874F7-Hu1、874F7-Hu2對IL-33誘導HUVEC細胞的IL-6表現抑制作用IC 50值分別爲0.073 nM、0.147 nM、0.210 nM、0.175 nM、0.051 nM、0.050 nM。表明各人源化抗體均能有效的抑制IL-33-his蛋白誘導HUVEC細胞的IL-6分泌，尤以874F7-Hu1和874F7-Hu2效果相對較優。 實施例 16 人源化抗體對 IL-33 誘導 PBMC 分泌 IFNγ 的抑制作用
本實施例透過測定各人源化抗體對IL-33-his蛋白誘導PBMC分泌IFNγ的抑制作用以評價各人源化抗體的活性。具體實驗步驟如下：將新鮮PBMC離心計數，PBS洗滌一次，用RPMI1640完全培養基稀釋至4×10 6細胞/Ml；向96孔U型細胞培養盤中加入PBMC細胞，每孔50 μL(2×10 5細胞/孔)，置於37℃培養箱恢復；用RPMI1640完全培養基稀釋抗體，最高濃度爲200 nM(終濃度爲50 nM)，按照3倍梯度稀釋，稀釋後每孔加入等體積40 ng/mL IL-33-his (終濃度爲10 ng/mL)，37℃培育30 min；向上述PBMC細胞培養盤中加入50μL 40 ng/mL完全培養基稀釋的IL-12，隨後後加入100 μL抗體與IL-33-his混合液，混勻後，置於37℃細胞培養箱中培養24 h；將細胞培養盤置於500 g離心5 min，各孔吸取180 μL上清液，供檢測。
用ELISA塗佈液將Mouse-Anti-human IFNγ抗體(購自BD Biosciences，貨號551221)稀釋至1 μg/mL，塗佈ELISA培養盤，100 μL/孔，置於濕盒中，4℃，塗佈16 h；用PBST洗滌ELISA培養盤三次，並將ELISA培養盤於吸水紙上拍乾，除去多餘的液體，然後用PBS配製的2% BSA，200 μL/孔，於室溫封阻1-2 h；用PBST洗滌一次，去除多餘的封阻液，並將ELISA培養盤拍乾，除去多餘的液體；稀釋IFNγ標準品，最高濃度爲250 ng/mL，1/2稀釋12個梯度，加入ELISA孔，100 μL/孔，每個樣品平行做2個重複孔；向ELISA培養盤中加入100 μL上述待測細胞上清液，室溫培育1 h；用PBST洗去三次，加入用1% BSA PBST 1:1000稀釋的biotin mouse-anti-human IFNγ (購自BD，貨號554550)，100 μL/孔，室溫培育1h；洗除未結合的或非特異性結合的抗體，按照抗體說明書要求，用1% BSA PBST將HRP標記的Streptavidin (購自BD，貨號554066)稀釋至合適濃度，加入ELISA培養盤，100 μL/孔，室溫培育1h；用PBST洗滌五次，並將ELISA培養盤於吸水紙上拍乾，除去多餘的液體，加入TMB顯色液，100 μL/孔，顯色至合適深淺，加入2 M H 2SO 4，50 μL/孔，以終止顯色，並於多功能酵素標示讀取儀中在450 nm波長處測定其吸光度，分析數據。
實驗結果如圖12所示，人源化抗體864F3-Hu4、864F3-Hu5、871G1-Hu1、871G1-Hu2、874F7-Hu1、874F7-Hu2對IL-33誘導PBMC分泌IFNγ的抑制作用IC 50值分別爲1.224 nM、0.839 nM、1.395 nM、1.061 nM、0.850 nM、1.736 nM。表明各人源化抗體均能有效的抑制IL-33-his蛋白誘導人PBMC分泌IFNγ，其中874F7-Hu2的活性相對較差。 實施例 17 人源化抗體對 IL-33 誘導 NK 細胞分泌 IFNγ 的抑制作用
將新鮮PBMC離心計數後按照Nk Cell Isolation Kit human (購自 Miltenyi，貨號130-092-657)說明書分離出NK細胞。用PBS洗滌NK細胞兩次後計數，並用1640+10% FBS+1% Glutamax培養基稀釋至0.8×10 6細胞/ mL，並按照每孔50 μL細胞懸浮液舖制96孔細胞培養盤。用1640+10% FBS+1% Glutamax培養基稀釋各抗體，最終最高作用濃度爲100 nM，1/4梯度稀釋。稀釋後每孔加入終濃度爲10 ng/mL的IL-33-his於37℃細胞培養箱培育30 min。隨後向上含有NK細胞的96孔細胞培養盤中加入完全培養基稀釋的終濃度爲2 ng/mL的IL-12，最後加入上述100 μL抗體與IL-33的混合液，於37℃細胞培養箱培育24h後，收集細胞培養上清液測定IFNγ的分泌位準。
IFNγ的檢測方法參照實施例16。實驗結果如圖13所示，人源化抗體864F3-Hu4、864F3-Hu5、871G1-Hu1、871G1-Hu2、874F7-Hu1、874F7-Hu2對IL-33誘導NK細胞分泌IFNγ有抑制作用，IC 50值分別爲0.904 nM、1.021 nM、0.851nM、0.900 nM、0.742 nM、1.559 nM。 實施例 18 人源化抗體對 IL-33 誘導 KU812 細胞分泌 IL-5 和 IL-13 的抑制作用
收集處於對數生長期的嗜鹼性白血病細胞KU812，離心，計數，用含20% FBS的IMDM培養基(完全培養基，購自Gibco，貨號11965-092)重新懸浮，按照20000個細胞每孔，舖制96孔細胞培養盤。用完全培養基配製各待測抗體，按照3倍梯度稀釋作爲給藥組，各組均連續稀釋9梯度，抗體最高工作濃度爲200 μg/mL，同時以完全培養基配製IL-33-his，工作濃度爲700 ng/ml，按照1：1混勻後，加入上述96孔細胞培養盤，每孔終體積爲200 μL，設置未給藥組作爲陰性對照，設置只添加IL-33爲單藥對照組，每個濃度平行做2個重複孔，於37℃細胞培養箱繼續培養48h，收集上清液進行IL-5和IL-13分泌量的測定。
用ELISA塗佈液將anti-human IL-5 (購自BD，貨號554488)及anti-human IL-13 (購自BD，貨號554570)抗體分別稀釋至5 μg/ml，塗佈ELISA培養盤，100 μL/孔，置於濕盒中，4℃，塗佈16 h。用PBST洗滌ELISA培養盤三次，去除未結合抗原，並將ELISA培養盤於吸水紙上拍乾，除去多餘的液體，然後用PBS配製的2% BSA，200 μL/孔，於室溫封阻1h。用PBST洗滌一次，洗除多餘的封阻液，並將ELISA培養盤拍乾，除去多餘的液體，用PBST配製的1% BSA按3倍梯度分別稀釋hu-IL-5標準品，最高濃度爲50 ng/mL，稀釋12個梯度，加入ELISA孔，100 μL/孔，室溫培育1h，每個樣品平行做2個重複孔。加入100 μL/孔收集的細胞上清液。用PBST配製的1% BSA按3倍梯度分別稀釋hu-IL-13標準品，最高濃度爲10 ng/mL，稀釋12個梯度，加入ELISA孔，100 μL/孔，室溫培育2 h，每個樣品平行做2個重複孔。加入50 μL/孔收集的細胞上清液。洗除未結合的或非特異性結合的一抗，按照抗體說明書要求，用抗體稀釋液將Biotin-anti-human-IL-5 (購自BD，貨號 554491)及Biotin-anti-human-IL-13 (購自BD，貨號555054)二抗稀釋至稀釋至合適濃度，加入ELISA培養盤，100 μL/孔，室溫培育2h。用PBST洗滌三次，並將ELISA培養盤於吸水紙上拍乾，除去多餘的液體，用抗體稀釋液將HRP標記的Streptavidin (購自BD，貨號554066)稀釋至合適濃度，加入ELISA培養盤，100 μL/孔，室溫培育0.5 h。用PBST洗滌三次，並將ELISA培養盤於吸水紙上拍乾，除去多餘的液體，加入TMB顯色液，100 μL/孔，顯色至合適深淺，加入2 M H 2SO 4，50 μL/孔，以終止顯色，並於多功能酵素標示讀取儀中在450 nm波長處測定其吸光度，分析數據。
實驗結果如圖14所示，人源化抗體864F3-Hu4和874F7-Hu1可有效抑制IL-33誘導KU812細胞分泌IL-5，其IC 50分別爲27.605 nM和7.828 nM。
如圖15所示，人源化抗體864F3-Hu4和874F7-Hu1亦可有效抑制IL-33誘導KU812細胞分泌IL-13，其IC 50分別爲14.745 nM和5.219 nM。 實施例 19 人源化抗體對不同種屬 IL-33 蛋白的交叉反應性
實驗方法參照實施例14，其中抗原分別用食蟹猴IL-33蛋白(購自Sino biological，貨號90912-CNAE)和小鼠IL-33蛋白(購自R&D，3626-ML-010/CF)，同時設置人IL-33蛋白作爲對照。實驗結果如表3所示，864F3-Hu4和874F7-Hu1均與食蟹猴IL-33蛋白有交叉反應，並且與各抗體和人的IL-33蛋白結合特徵相一致。此外，864F3-Hu4和874F7-Hu1與小鼠IL-33蛋白也有一定的交叉反應，但其親和力要明顯低於各抗體與人IL-33蛋白的結合。 表3：人源化抗體對食蟹猴和小鼠IL-33蛋白的交叉反應性
樣品 人 IL-33 食蟹猴 IL-33 小鼠 IL-33
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
864F3-Hu4 2.70E+05 1.49E-04 5.52E-10 3.85E+05 2.45E-04 6.37E-10 1.08E+05 2.05E-02 1.90E-07
874F7-Hu1 1.80E+05 2.04E-04 1.13E-09 2.73E+05 3.49E-04 1.27E-09 6.40E+04 2.12E-03 3.32E-08
實施例 20 人源化抗體的體內中和活性評估
具體實驗步驟參照實施例7，每個實驗組10隻BALB/C小鼠。
如圖16所示，結果表明，與對照組(脾臟重量80.55 mg)相比IL-33抗原組脾臟明顯增重，爲176.49 mg。864F3-Hu4、864F3-Hu5、871G1-Hu1、871G1-Hu2、874F7-Hu1和874F7-Hu2抗體給藥組的脾臟重量平均值分別爲78.39 mg、86.6 mg、92.82 mg、98.87 mg、75.63 mg和77.49 mg，可見各人源化抗體在體內均具有明顯的中和活性。 實施例 21 人源化抗體的體內藥效活性測定
實驗方法參照實施例7，實驗結果如圖17所示，腹腔注射人IL-33後，可明顯刺激小鼠脾臟腫大(IL-33組)，脾臟重量約爲194.6 mg，對照組(未給與人IL-33刺激)爲76.1 mg，而當分別給予5 mg/kg的864F3-Hu4和874F7-Hu1進行單次治療時可有效抑制小鼠脾臟腫大，脾臟重量分別爲65.4 mg和55.9 mg。
上述實驗結束時，對各組小鼠進行安樂死，並分別進行周邊血液中的嗜酸性顆粒細胞和IL-5位準檢測。
將上述小鼠全血取出一部分置於普通EP管中，4℃放置5 h以上使其完全凝血。凝血後將EP管置於4℃預冷的離心機中以8000 rpm離心6 min。離心後取出血清，置於新的離心管中，再次在4℃預冷的離心機中以8000 rpm離心6 min。離心後取出上清液，分裝，置於-80℃中保存。按照BD CBA Mouse Enhanced Sensivity Master Buffer Kit (購自BD biosciences，貨號562246)的說明書要求對標準品和待測血清樣品進行稀釋。隨後按照Mouse IL-5 Enhanced Sensitivity Flex Set (購自BD biosciences，貨號562234)說明書要求對各樣品進行處理，設置好檢測參數在流式細胞儀(BD FACSCelesta)對各樣品進行檢測，透過GraphPad Prism對上述採集到的數據進行分析，根據標準曲線計算出各實驗組血清樣品中IL-5的含量。
實驗結果如圖18所示，與對照組相比(未給與人IL-33刺激)，腹腔注射人IL-33後，可明顯刺激小鼠周邊血液中IL-5的分泌(IL-33組)，約78.6倍，而當分別給予5 mg/kg的864F3-Hu4和874F7-Hu1進行單次治療時可有效抑制小鼠周邊血液IL-5分泌，分別爲對照組的1.7倍和0.9倍。
將上述小鼠全血取出一部分置於EDTA抗凝管中，上下顛倒均勻，置於4℃備用。取10 mL圓底離心管，向其中每管加入2 μL mouse Fc blocker (購自BD biosciences，貨號553142)。每個樣品取50 μL血樣於10 mL離心管中，輕輕吸沖使血樣與blocker混合均勻。置於冰上培育15 min。向每個離心管中加入2 μL混合好的三種抗體：0.5 μL CD45.2 Monoclonal Antibody (104), PerCP-Cyanine5.5 (購自eBioscience TM，貨號45-0454-82)、0.5μL CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PE (購自eBioscience TM，貨號12-1702-82)、1 μL Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (RB6-8C5), APC-eFluor 780 (購自eBioscience TM，貨號47-5931-82)；冰上避光培育1 h。向離心管中加入500 mL 1x Lysing buffer (購自BD Biosciences，貨號555899)，混勻，室溫裂解紅血球5 min。將離心管進行350 g離心5 min。棄掉上清液，向管中加入3 mL預冷的PBS洗滌細胞，置於350 g離心5 min。棄掉上清液，向管中加入500 μL預冷、過濾處理的PBS，輕輕彈起沉降的細胞。將細胞懸浮液用細胞篩網過濾至流式管中，透過流式細胞儀對各樣品中嗜酸性顆粒細胞占白血球的比例進行分析。
實驗結果如圖19所示，與對照組相比(未給與人IL-33刺激)，腹腔注射人IL-33後，可明顯刺激小鼠周邊血液中嗜酸性顆粒細胞的增加(IL-33組)，約10.5倍，而當分別給予5 mg/kg的864F3-Hu4和874F7-Hu1進行單次治療時可有效降低小鼠周邊血液中由人IL-33刺激引起的嗜酸性顆粒細胞的增加，分別爲對照組的1.6倍和1.58倍。 實施例 22 人源化抗體對 IL-33 的結合表位測定
根據IL-33成熟蛋白的胺基酸序列：
MSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET (SEQ ID NO：55)(胺基酸序列來源於NCBI：NP_254274.1的第112位Ser至270位Thr)，合成如下16條多肽以進行人源化抗體對IL-33的結合表位特徵，各多肽胺基酸序列如表4所示，其N-端均進行了biotin化標記。 表4：多肽胺基酸序列
多肽名稱 多肽序列 SEQ ID NO.
Pep1 Bio- VQKYTRALHDSSITGISPIT 56
Pep2 Bio- SSITGISPITEYLASLSTYN 57
Pep3 Bio- EYLASLSTYNDQSITFALED 58
Pep4 Bio- DQSITFALEDESYEIYVEDL 59
Pep5 Bio- ESYEIYVEDLKKDEKKDKVL 60
Pep6 Bio- KKDEKKDKVLLSYYESQHPS 61
Pep7 Bio- LSYYESQHPSNESGDGVDGK 62
Pep8 Bio- NESGDGVDGKMLMVTLSPTK 63
Pep9 Bio- MLMVTLSPTK DFWLHANNKE 64
Pep10 Bio- DFWLHANNKE HSVELHKCEK 65
Pep11 Bio- HSVELHKCEK PLPDQAFFVL 66
Pep12 Bio- PLPDQAFFVL HNMHSNCVSF 67
Pep13 Bio- HNMHSNCVSF ECKTDPGVFI 68
Pep14 Bio- ECKTDPGVFI GVKDNHLALI 69
Pep15 Bio- GVKDNHLALI KVDSSENLCT 70
Pep16 Bio- KVDSSENLCT ENILFKLSET 71
爲了測定抗體對各多肽片段的結合活性，預先以塗佈液(50 mM的碳酸鹽塗佈緩衝液，pH 9.6)稀釋生物素-鏈親合素(SA)至2 μg/mL，100 μL/孔，塗佈ELISA培養盤，4℃，過夜；PBST洗滌3次，再用PBS配製的2%的BSA，於室溫封阻2 h，200 μL/孔。PBST洗滌1次，分別加入終濃度爲10 μg/mL的864F3和874F7，100 μL/孔，室溫培育1 h。PBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗，室溫培育30 min；PBST洗滌培養盤3次後，在吸水紙上儘量拍乾殘留液滴，每孔加入100 μL的TMB顯色液，顯色至合適深淺；每孔加入50 μL 2 M H 2SO 4終止液終止受質反應，於酵素標示讀取儀450 nm處讀取OD值，分析待測抗體與各多肽片段的結合能力。實驗結果如表5所示，可見874F7能顯著的與Pep6結合而不與其他多肽片段結合。 表5：多肽胺基酸序列
多肽片段 / 樣品 864F3 874F7
Pep1 0.059 0.048 0.074 0.061
Pep2 0.054 0.050 0.056 0.050
Pep3 0.048 0.047 0.053 0.048
Pep4 0.047 0.047 0.050 0.048
Pep5 0.046 0.047 0.050 0.049
Pep6 0.051 0.053 1.042 1.027
Pep7 0.047 0.047 0.055 0.051
Pep8 0.047 0.047 0.053 0.047
Pep9 0.061 0.060 0.065 0.061
Pep10 0.050 0.051 0.053 0.052
Pep11 0.049 0.048 0.056 0.053
Pep12 0.050 0.051 0.056 0.053
Pep13 0.048 0.049 0.054 0.053
Pep14 0.048 0.048 0.059 0.053
Pep15 0.047 0.049 0.055 0.052
Pep16 0.050 0.057 0.049 0.049
基於上述實驗結果，以及874F7-Hu1與鼠IL-33蛋白的結合Kd值爲3.32×10 -8，根據上述IL-33成熟蛋白的胺基酸序列選取：
“KKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGK”區域(SEQ ID NO：55的41位-70位)透過PCR (聚合酶鏈式反應)進行丙胺酸掃描式定點突變，隨後進行原核表現，並純化，分別獲得如下胺基酸位址突變的IL-33突變體蛋白： K41A、K42A、D43A、E44A、K45A、K46A、D47A 、K48A、V49A、L50A、L51A、S52A、Y53A、Y54A、E55A、S56A 、Q57A、H58A、P59A、S60A、N61A、E62A、S63A、D65A、V67A、D68A、K70A。
隨後參照實施例9的實驗方法，分別測定上述各突變體蛋白對874F7-Hu1的親和力，同時設置未進行任何突變的IL-33蛋白(WT-1、WT-2、WT-3、WT-4)作爲對照。
代表性實驗結果分別如圖20-圖23及表6所示，可見與WT相比，K45、V49、L50、D65突變後，874F7-Hu1與IL-33的親和力顯著減弱，下降25倍以上；S60、S52突變後，874F7-Hu1與IL-33的親和力明顯減弱，下降10-25倍；K48、L51、Y53、E55突變後，874F7-Hu1與IL-33的親和力有一定減弱，下降2.5-10倍。這也說明影響874F7-Hu1與IL-33結合的關鍵位址主要爲K45、V49、D65、L50，其次爲S60、S52，再者爲K48、L51、Y53、E55。
上述各位址在IL-33結晶3D結構圖(來源於PDB: 2KLL)中的位置如圖24所示，這也進一步說明874F7-Hu1與IL-33的結合表位爲包括上述關鍵胺基酸位址在內的線性和空間表位。 表6：874F7-Hu1與IL-33各突變體蛋白結合親和力
樣品名稱 EC 50(nM) SD Top value 親和力下降比例
WT-1 0.23 0.03 1.21 1.0
E44A 0.13 0.01 1.24 0.6
K45A \ \ 0.67 ＞25
K46A 0.23 0.05 1.27 1.0
Q57A 0.12 0.01 1.45 0.5
H58A 0.43 0.23 1.21 1.9
P59A 0.12 0.00 1.35 0.5
S60A 5.31 0.62 1.02 23.2
WT-2 0.13 0.00 1.81 1.0
K48A 0.49 0.29 1.28 3.7
V49A \ \ 0.34 ＞25
L51A 0.91 0.52 1.35 6.8
S52A 1.96 1.31 1.24 14.6
Y53A 0.44 0.13 1.57 3.3
E55A 0.33 0.00 1.54 2.5
WT-3 0.18 0.08 1.87 1.0
N61A 0.15 0.08 1.98 0.8
E62A 0.15 0.06 1.99 0.8
S63A 0.16 0.04 1.71 0.9
D65A 35.30 0.09 1.32 191.8
V67A 0.11 0.03 2.14 0.6
D68A 0.22 0.09 1.67 1.2
K70A 0.11 0.04 1.57 0.6
WT-4 0.12 0.03 2.52 1.0
L50A 3.34 2.14 1.20 28.5
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作爲參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作爲參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1A~B：鼠源抗體對人IL-33結合活性。 圖2A~B：鼠源抗體阻斷ST2結合IL-33的活性。 圖3A~C：鼠源抗體對IL-33誘導HUVEC細胞IL-6表現的抑制作用。 圖4：鼠源抗體對IL-33誘導HUVEC細胞IL-8表現的抑制作用。 圖5：鼠源抗體與食蟹猴IL-33抗原的交叉活性。 圖6：脾臟秤重實驗評價鼠源抗體體內中和活性。 圖7：嵌合抗體對人IL-33的結合活性。 圖8：嵌合抗體阻斷ST2結合IL-33的活性。 圖9A~D：各人源化抗體對人IL-33的結合活性。 圖10：人源化抗體阻斷ST2結合IL-33的活性。 圖11：人源化抗體對IL-33誘導HUVEC細胞IL-6表現的抑制作用。 圖12：人源化抗體對IL-33誘導PBMC分泌IFNγ的抑制作用。 圖13：人源化抗體對IL-33誘導NK細胞分泌IFNγ的抑制作用。 圖14：人源化抗體864F3-Hu4和874F7-Hu1可有效抑制IL-33誘導KU812細胞分泌IL-5。 圖15：人源化抗體864F3-Hu4和874F7-Hu1可有效抑制IL-33誘導KU812細胞分泌IL-13。 圖16：脾臟秤重實驗評價人源化抗體體內藥效活性。 圖17：脾臟秤重實驗評價人源化抗體864F3-Hu4和874F7-Hu1的體內藥效活性。 圖18：人源化抗體864F3-Hu4和874F7-Hu1可有效抑制小鼠周邊血液IL-5分泌。 圖19：人源化抗體864F3-Hu4和874F7-Hu1可有效降低小鼠周邊血液中由人IL-33刺激引起的嗜酸性顆粒細胞的增加。 圖20：IL-33突變體蛋白(E44A、K45A、K46A、Q57A、H58A、P59A、S60A)對874F7-Hu1的親和力。 圖21：IL-33突變體蛋白(K48A、V49A、L51A、S52A、Y53A、E55A)對874F7-Hu1的親和力。 圖22：IL-33突變體蛋白(N61A、E62A、S63A、D65A、V67A、D68A、K70A)對874F7-Hu1的親和力。 圖23：IL-33突變體蛋白(L50A)對874F7-Hu1的親和力。 圖24：影響874F7-Hu1結合的關鍵胺基酸位址在IL-33結晶3D結構圖中位置。

Claims (23)

  1. 一種結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，其中該抗體或其抗原結合片段與人IL-33結合的親和力EC50小於1nM；所述抗體具有以下特徵：(t1)阻斷IL-33和受體ST2的結合；(t2)抑制IL-33誘導的HUVEC細胞的IL-6分泌；(t3)抑制IL-33蛋白誘導人PBMC分泌IFNγ；(t4)抑制IL-33誘導NK細胞分泌IFNγ；和(t5)抑制IL-33誘導KU812細胞分泌IL-5和IL13；所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，包括：(a3)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：18、24和25所示，和(b3)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：26、22和27；或(a2)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如18、19和20所示，和(b2)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：21、22和23所示；或 (a4)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：18、19和20所示，和(b4)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：26、22和28所示。
  2. 如請求項1所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，包括：(a3)重鏈互補決定區H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：18、24和25所示，和(b3)輕鏈互補決定區L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：26、22和27。
  3. 如請求項1所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：8，和輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
  4. 如請求項1或2所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的抗體為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
  5. 如請求項1或2所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的抗原結合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段。
  6. 如請求項1所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，和輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，或者重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，和輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
  7. 如請求項1所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：32所示，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：33、34或35所示。
  8. 如請求項1所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：40所示，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：37、38或39所示。
  9. 如請求項1所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO： 36所示，重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：33、34或35所示。
  10. 如請求項1或2所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區。
  11. 如請求項10所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的重鏈恆定區和輕鏈恆定區的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
  12. 如請求項10所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段與IL-33蛋白的結合表位包含對應於SEQ ID NO：55的選自下組的位址：第45位離胺酸(K45)、第49位纈胺酸(V49)、第65位天冬胺酸(D65)、第50位亮胺酸(L50)、第60位絲胺酸(S60)、第52位絲胺酸(S52)、第48位離胺酸(K48)、第51位亮胺酸(L51)、第53位酪胺酸(Y53)、第55位麩胺酸(E55)。
  13. 一種核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼如請求項1-12中任一項所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段。
  14. 如請求項13所述的核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示，或者 分別如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9所示，或者分別如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11所示。
  15. 如請求項13所述的核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：45、46或47所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：44所示。
  16. 如請求項13所述的核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：49、50或51所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示。
  17. 如請求項13所述的核苷酸分子，其特徵在於，所述核苷酸分子編碼重鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：45、46或47所示，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示。
  18. 一種表現載體，其特徵在於，所述表現載體含有如請求項13-17中任一項所述的核苷酸分子。
  19. 一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞含有如請求項18所述的表現載體。
  20. 一種製備如請求項1-12中任一項所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟：a)在表現條件下，培養如請求項19所述的宿主細胞，從而表現所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段； b)分離並純化a)所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段。
  21. 一種組成物，其特徵在於，所述組成物含有如請求項1-12中任一項所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載劑。
  22. 一種抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述的抗體藥物偶聯物含有：(a)抗體部分，所述抗體部分包含如請求項1-12中任一項所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段；和(b)與所述抗體部分偶聯的偶聯部分，所述偶聯部分選自下組：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、酵素、或其組合。
  23. 一種如請求項1-12中任一項所述的結合人IL-33的抗體或其抗原結合片段或如請求項21所述的組成物、如請求項22所述的抗體藥物偶聯物在製備治療哮喘、關節炎、特異反應性/過敏性皮膚炎、慢性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、全身性硬化症、肝纖維化、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克隆氏症、多發性硬化症、糖尿病腎臟疾病、發炎性腸道疾病、銀屑病、嗜酸性食道炎、糖尿病性黃斑水腫、年齡相關性黃斑部病變、乾眼病的藥物中的應用。
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