TW202413415A

TW202413415A - 抗腎上腺髓質素非中和抗體、其製備方法及用途

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Publication number: TW202413415A
Application number: TW112127223A
Authority: TW
Inventors: 鄭云程; 俗俊鄧; 楊欣秀; 王宗達; 顧春銀
Original assignee: 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司
Priority date: 2022-07-20
Filing date: 2023-07-20
Publication date: 2024-04-01

Abstract

本發明屬於生物工程和生物治療領域，公開了一種抗ADM單克隆抗體或其片段，以及包含所述單克隆抗體或其片段的藥物組合物、檢測試劑或套裝藥盒，本發明還公開了所述單克隆抗體或其片段在製備藥物中的用途

Description

抗腎上腺髓質素非中和抗體、其製備方法及用途

本發明涉及一種抗腎上腺髓質素非中和抗體、其製備方法及用途，屬於生物工程和生物治療領域。

腎上腺髓質素(Adrenomedullin，ADM)是一段由52個胺基酸組成的6 kDa的多肽，1993年最早在嗜鉻細胞瘤中發現，後發現在血管表皮細胞及血管平滑肌細胞均廣泛分泌表達。腎上腺髓質素的基因位於11號染色體上，轉譯後由前激素原逐步酶切，形成作為降鈣素基因相關肽(CLR)。CLR與RAMP2或RAMP3組成的異源二聚體是腎上腺髓質素的受體，基於其受體調控的內吞作用以及蛋白酶的作用，其半衰期僅為22 min。

腎上腺髓質素具有維持內皮細胞完整性，增強屏障的作用。這是藉由以下兩方面實現的：(1)加強GTPase Rac1的活性，提高皮層肌動蛋白和應力纖維的生成；(2)藉由抑制RhoA/ROCK途徑，減少肌球蛋白輕鏈激酶誘導的肌動球蛋白收縮。腎上腺髓質素還具有血管舒張，降低血壓的作用。這是藉由以下兩方面實現的：(1)藉由PI3K/Akt途徑，釋放NO，活化環磷酸鳥苷(cGMP)/啟動蛋白激酶K(PKG)；(2)藉由與血管平滑肌的結合，導致環磷酸腺苷(cAMP)/啟動蛋白激酶A(PKA)濃度提高，藉由磷酸化作用，引起平滑肌細胞的鬆弛。

在健康人群中，腎上腺髓質素濃度極低，在10 pg/mL左右，可以靈活穿梭於血管內外，靈活調節血管舒張和維持內皮細胞屏障功能。在膿毒症休克患者中，腎上腺髓質素濃度是正常情況下的5-6倍，和病情嚴重程度和預後直接相關。在膿毒症休克患者中，基於炎症的作用減弱了血管的屏障作用，血管舒張導致血壓進一步降低。

腎上腺髓質素非中和抗體將腎上腺髓質素限制於血管內，糾正了血管內屏障功能，減弱了胞外的血管舒張作用，提高了腎上腺髓質素在血漿內的半衰期，以達到治療及減弱膿毒症的休克症狀。因此，目前亟需研製能與腎上腺髓質素具有較高親和力的非中和抗體。

針對上述技術問題，本發明一方面提供了一種抗腎上腺髓質素(抗ADM)單克隆抗體或其片段，其中所述單克隆抗體或片段特異性結合人腎上腺髓質素(ADM)的N端第1-21個胺基酸序列，所述人ADM的N端第1-21位胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，並且所述單克隆抗體或片段展現出對ADM的KD值小於10 ^-10M的親和力。

在本發明的整篇說明書中，本發明的「抗體」或「抗體片段」能夠結合ADM，因此針對ADM，並因此可被稱為「抗ADM抗體」或「抗ADM抗體片段」。

本發明所述「抗體」或「抗體片段」是抗腎上腺髓質素的非中和抗體或其片段。

在這種背景下，出於簡化的目的，統稱為「非中和」抗ADM抗體或抗體片段(其例如封閉80％以下的ADM生物活性)的具有「非中和抗ADM活性」的抗體或抗體片段被定義為：結合ADM的一種或多種分子，在添加至真核細胞系培養物之後，藉由平行添加的合成的人ADM肽的作用降低所述細胞系所產生的cAMP的量，所述細胞系表達由CRLR(降鈣素受體樣受體)和RAMP3(受體活性修飾蛋白3)組成的功能性人重組ADM受體，其中所述添加的合成的人ADM以這樣的量添加：在不存在待分析的非中和抗體的情況下，導致cAMP合成的半最大刺激，其中所述分子結合ADM導致cAMP降低的程度不超過80％，甚至當待分析的能與ADM結合的所述非中和分子以所述量(用待分析的非中和抗體能得到的獲得cAMP的最大降低所需的)10倍以上的量添加時也如此。

相同的定義適用於其他範圍：95％、90％、50％等。

生物活性被定義為這樣的作用：一種物質在其相互作用後在體內或體外(例如，在測定中)呈現為活的生物體或組織或器官或功能單元。就ADM生物活性而言，這可以是ADM在人重組腎上腺髓質素受體cAMP功能測定中的作用。因此，根據本發明，生物活性藉由腎上腺髓質素受體cAMP功能測定來定義。

為了在這樣的測定中測定ADM生物活性，可以進行以下步驟：在所述人重組腎上腺髓質素受體cAMP功能測定中用ADM進行劑量反應曲線。可以計算半最大cAMP刺激的ADM濃度。

在恆定的半最大cAMP刺激時，分別藉由ADM穩定抗體或腎上腺髓質素穩定抗體片段進行ADM濃度劑量反應曲線(高達100μg/ml的終濃度)。

所述ADM生物測定中50％的最大抑制表示，所述抗ADM抗體或所述抗腎上腺髓質素抗體片段分別封閉基線值50％的生物活性。所述ADM生物測定中80％的最大抑制表示，所述抗ADM抗體或所述抗腎上腺髓質素抗體片段分別封閉80％的ADM生物活性。其含義是封閉不超過80％的ADM生物活性。這意味著仍存在約20％的殘餘ADM生物活性。

然而，藉由本說明書以及在上述背景下，結合本文公開的抗ADM抗體和抗ADM抗體片段而言，表述「封閉ADM的生物活性」應當被理解為僅降低ADM的生物活性，較佳最大時將ADM生物活性從100％降低至20％的剩餘ADM生物活性，較佳將ADM生物活性從100％降低至50％的剩餘ADM生物活性，但是在任何情況下，仍有可以如上所述測定的ADM生物活性。

本文中，抗腎上腺髓質素(ADM)抗體是能特異性結合ADM的抗體，抗腎上腺髓質素抗體片段是ADM抗體的片段，其中所述片段能特異性結合ADM。特異性結合ADM也允許結合其他抗原。這意味著，該特異性不排除該抗體可以與活化該抗體的多肽之外的多肽交叉反應。這也適合本發明的抗ADM抗體或其片段的特異性。

本發明的非中和抗ADM抗體或非中和抗ADM抗體片段提供顯著超越中和抗ADM抗體或中和抗ADM抗體片段的治療優勢。

本發明的抗體是蛋白，包括實質上由免疫球蛋白基因編碼的能特異性結合抗原的一種或多種多肽。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恆定區基因以及無數的免疫球蛋白可變區基因。全長免疫球蛋白輕鏈長度通常為約25KDa或214個胺基酸。全長免疫球蛋白重鏈的長度通常為約50KDa或446個胺基酸。輕鏈由位於NH ₂-端的可變區基因(長度約110個胺基酸)和位於COOH-端的κ或λ恆定區基因編碼。重鏈同樣由可變區基因(長度約116個胺基酸)和其他恆定區基因之一編碼。

抗體的基本結構單元通常是由兩對相同的免疫球蛋白鏈組成的四聚體，每一對都具有一條輕鏈和一條重鏈。在每對中，輕鏈和重鏈可變區結合抗原，而恆定區調控效應或功能。免疫球蛋白還以多種其他形式存在，包括例如，Fv、Fab和F(ab') ₂以及雙功能雜合抗體和單鏈抗體。免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區包括由三個高變區中斷的框架區，所述高變區也稱為互補決定區(CDR's)。如上文所指出的，CDR主要負責結合抗原的表位。免疫複合物是抗體如單克隆抗體、嵌合抗體人源化抗體或人抗體或功能性抗體片段特異性結合抗原。

在本領域中，可以藉由多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則、基於結構環區域位置的Chothia定義規則和基於IMGT本體論(IMGT-ONTOLOGY)的概念。本發明中，所述抗ADM抗體的VL和VH的胺基酸序列按Chothia編碼規則進行編碼，所述抗ADM抗體的輕鏈CDR1-3(LCDR 1-3)和重鏈CDR1-3(HCDR 1-3)按Chothia定義。

嵌合抗體是這樣的抗體：藉由基因工程附屬於不同物種的免疫球蛋白可變區和恆定區基因構建其輕鏈和重鏈基因。例如，可以將來自小鼠單克隆抗體基因的可變節段連接至人恆定節段如κ和γ1或γ3。在一個實例中，治療性嵌合抗體因而是由來自小鼠抗體的可變結構域或抗原結合結構域和來自人抗體的恆定或效應結構域組成的雜合蛋白，儘管可以使用其他哺乳動物物種或藉由分子技術產生可變區。

「人源化」免疫球蛋白是包括人框架區和非人(諸如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一個或多個CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白稱為「供體」，提供框架的人免疫球蛋白稱為「受體」。

在一個實施方案中，人源化免疫球蛋白中的所有CDR都來自供體免疫球蛋白。不需要存在恆定區，但是如果存在，它們必須與人免疫球蛋白恆定區基本一致，即至少約85-90％，諸如約95％一致或更加一致。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR，都與天然人免疫球蛋白序列的對應部分基本一致。「人源化抗體」是包含人源化輕鏈和人源化重鏈免疫球蛋白的抗體。人源化抗體能與提供CDR的供體抗體結合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗體的受體框架可以具有有限數量的來自供體框架的胺基酸的取代。人源化或其他單克隆抗體可以具有其他保守的胺基酸取代，其對抗原結合或其他免疫球蛋白功能基本上沒有影響。人源化免疫球蛋白可以藉由基因工程的手段來構建。

人抗體是這樣的抗體：其中輕鏈和重鏈基因來自人。人抗體可以藉由使分泌目的抗體的人B細胞永生化來產生。永生化可以例如藉由EBV感染或藉由將人B細胞與骨髓瘤或雜交瘤細胞融合以產生三源雜交瘤細胞來實現。人抗體還可以藉由噬菌體展示方法產生，或從人組合單克隆抗體資料庫選擇。人抗體還可以利用攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因動物來製備。

因此，抗ADM抗體可以具有本領域內已知的形式。實例為人抗體、單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體。

在較佳的實施方案中，本發明的抗體是重組產生的抗體例如IgG，或至少含有重鏈和/或輕鏈的F-可變結構域的抗體片段例如化學偶聯的抗體(片段抗原結合)。

因此，在本發明較佳的實施方案中，本發明所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體片段包括Fab，Fab'，F(ab) ₂、Fv片段、F(ab') ₂、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。

在本發明一個較佳的實施方案中，本發明的抗體可以如下產生：分別將合成的人ADM的N端16個胺基酸多肽、人ADM的N端21個胺基酸多肽或鼠ADM的N端19個胺基酸多肽(簡稱YY-19，SEQ ID NO: 3)與偶聯物作為免疫原免疫小鼠。最後一次免疫一周後取血，ELISA測定血清抗YY-21的滴度。血清效價高的鼠經免疫原衝擊免疫後，取脾臟細胞進行融合。經脾細胞融合和雜交瘤克隆篩選後，得到雜交瘤克隆。經親和力測定，雜交瘤克隆展現出對ADM的KD值小於10 ^-10M的親和力。

本發明中，用語「K _D」、「 K _D 」或「KD」可互換使用，通常是指抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。本發明中使用的「KD」是解離速率常數(kdis，也稱為「解離率(off-rate)(koff)」或「kd」)與結合速率常數(kon，也稱為「結合率(kon)」或「ka」)的比值。

經定序，所述雜交瘤克隆的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYAFTTF (如SEQ ID NO:11所示)， (ii) NTYSRV(如SEQ ID NO:12所示)， (iii) GYGGEGGLGF(如SEQ ID NO:13所示)，以及所述雜交瘤克隆的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RSSQSIIDSDGNTYLE(如SEQ ID NO:14所示)， (ii) KVSNRFS(如SEQ ID NO:15所示)， (iii) FQGSHFPYT(如SEQ ID NO:16所示)。

在本發明的某些實施方案中，所述雜交瘤克隆包含SEQ ID NO: 9所示的重鏈可變區序列，所述雜交瘤克隆包含SEQ ID NO: 10所示的輕鏈可變區序列。

可以按照以下方案進行抗ADM抗體的人源化：

藉由序列比對，挑選同源性最高的人抗體胚系基因作為人源化設計框架。將雜交瘤克隆的重鏈可變區進行CDR移植和回復突變獲得人源化重鏈可變區序列。將雜交瘤克隆的輕鏈可變區進行CDR移植和回復突變獲得人源化輕鏈可變區序列。

由此，在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYAFTTF(如SEQ ID NO:11所示)， (ii) NTYSRV(如SEQ ID NO:12所示)， (iii) GYGGEGGLGF(如SEQ ID NO:13所示)，以及所述人源化抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RSSQSIIDSDGNTYLE(如SEQ ID NO:14所示)， (ii) KVSNRFS(如SEQ ID NO:15所示)， (iii) FQGSHFPYT(如SEQ ID NO:16所示)。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:18和19任一所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:18所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:19所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述單克隆抗體還包含抗體輕鏈恆定區，所述輕鏈恆定區為人Kappa鏈恆定區。在本發明中，所述人Kappa鏈恆定區包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。

在本發明的某些實施方案中，所述單克隆抗體還包含抗體重鏈恆定區，所述重鏈恆定區為人IgG1恆定區。在本發明中，所述人IgG1恆定區包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。

將本發明所述單克隆抗體的輕鏈可變區序列與人Kappa鏈恆定區組合成抗體輕鏈，將本發明所述單克隆抗體的重鏈可變區序列與人IgG1恆定區組合成抗體重鏈。

由此，在本發明的某些實施方案中，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:23、25、27任一所示的重鏈序列，所述單克隆抗體抗體包含SEQ ID NO:22、24、26任一所示的輕鏈序列。

在本發明的某些實施方案中，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:23所示的重鏈序列，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:22所示的輕鏈序列。

在本發明的某些實施方案中，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:25所示的重鏈序列，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:24所示的輕鏈序列。

在本發明的某些實施方案中，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:27所示的重鏈序列，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:26所示的輕鏈序列。

密碼子優化後進行基因合成，克隆合成後基因片段到表達載體中。表達質粒擴增和質粒抽提後雙質粒共轉Expi293F或CHO-K1細胞中，進行抗體瞬轉表達，表達後藉由Protein A親和層析柱純化。經親和力測定，人源化抗ADM抗體展現出對ADM的KD值小於10 ^-10M的親和力。

本發明還可以藉由對全人源單鏈噬菌體抗體庫進行陶選，來進行抗ADM單克隆抗體的篩選。

由此，在本發明較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY(如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SAYNGN(如SEQ ID NO:44所示)， (iii) EGRSGGSFDI(如SEQ ID NO:45所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。

在本申請中，「單克隆抗體」通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變和/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)外。例如，在本發明的某些實施方案中，所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體含有NG的轉譯後修飾(PTM)位點。

在本發明的某些實施方案中，將所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體含有的NG的轉譯後修飾(PTM)位元點，定點突變成QG去除脫醯胺異構作用。

由此，在本發明的某些實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY (如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRSGGSFDI (如SEQ ID NO:45所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET (如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明的某些實施方案中，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:28和29任一所示的重鏈可變區序列，所述單克隆抗體包含SEQ ID NO:35所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:28所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:35所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:29所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:35所示的輕鏈可變區序列。

為了提高全人源抗體與人ADM的親和力，本發明還設計和構建了全人源抗體的親和力成熟資料庫。藉由對全人源抗體親和力成熟資料庫的篩選和單克隆的鑒定，本發明獲得了不同的全人源抗ADM抗體，它們均展現出對ADM的KD值小於10 ^-10M的親和力。

因此，在本發明較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中： (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTX1Y，其中X1選自S、Q或H， (ii) SX2YX3GX4，其中X2選自A或P，X3選自N、Q、S或T，X4選擇N或K， (iii) EGRX5GGSFX6I，其中X5選自S或W，X6選自D或N，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RAX7X8GIX9X10YLA，其中X7選自S或A，X8選自Q或E，X9選自S或G，X10選自S或E， (ii) DX11SX12X13X14X15，其中X11選擇A、V或T，X12選自N、I或D，X13選自L或V，X14選自E或D，X15選自T或A， (iii) QQYDX16LX17LX18，其中X16選自N或D，X17選自P或D，X18選自T或S。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY (如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET (如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY (如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASEGISEYLA (如SEQ ID NO:52所示)， (ii) DASNLET (如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY (如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RAAEGIGSYLA (如SEQ ID NO:53所示)， (ii) DASNLET (如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY (如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SPYSGN (如SEQ ID NO:54所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASEGISEYLA (如SEQ ID NO:52所示)， (ii) DASNLET (如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTHY(如SEQ ID NO:55所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DVSILDA (如SEQ ID NO:56所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY (如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DVSILDA (如SEQ ID NO:56所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY (如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNVDT (如SEQ ID NO:57所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY (如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SPYTGK (如SEQ ID NO:58所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DVSILDA (如SEQ ID NO:56所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY (如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SPYTGK (如SEQ ID NO:58所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DTSDLDT (如SEQ ID NO:59所示)， (iii) QQYDNLPLT (如SEQ ID NO:48所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTHY(如SEQ ID NO:55所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET (如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDDLDLT (如SEQ ID NO:60所示)。

在本發明進一步較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中， (a) 所述單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY (如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN (如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI (如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA (如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET (如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDDLPLS (如SEQ ID NO:61所示)。

此外，本發明還獲得了親和力提高後的抗體的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列。

由此，在本發明較佳的實施方案中，在所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段中，所述的單克隆抗體包含SEQ ID NO: 30至34任一所示的重鏈可變區序列，所述的單克隆抗體包含SEQ ID NO: 35至42任一所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:30所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:35所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:36所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:37所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:32所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:36所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:33所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:38所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:38所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:39所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:34所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:38所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:34所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:40所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:33所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:41所示的輕鏈可變區序列。

在本發明的某些實施方案中，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列，所述人源化抗體包含SEQ ID NO:42所示的輕鏈可變區序列。

將所述的單克隆抗體的輕鏈可變區序列與人Kappa鏈恆定區組合成抗體輕鏈，將所述的單克隆抗體的重鏈可變區序列與人IgG1恆定區組合成抗體重鏈。

密碼子優化後進行基因合成，克隆合成後基因片段到表達載體pcDNA3.4中，在CHO細胞表達、純化，可以得到親和力成熟的單克隆抗體。經親和力測定，所述抗ADM抗體展現出對ADM的KD值小於10 ^-10M的親和力。

本發明再一方面提供了編碼本發明所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段的核苷酸序列。

本發明再一方面提供了包含本發明所述的核苷酸序列的表達載體，其中較佳為載體pcDNA3.4。

本發明再一方面提供了包含本發明所述的核苷酸序列或表達載體的宿主細胞，其中較佳為CHO細胞。

本發明再一方面提供了一種包含本發明所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段的藥物組合物、檢測試劑或套裝藥盒。

本發明再一方面提供了本發明所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於維持內皮細胞完整性、增強屏障作用的藥物中的用途。

本發明再一方面提供了本發明所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於控制血管舒張、降低血壓的藥物中的用途。

本發明再一方面提供了本發明所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於治療或預防膿毒性休克或創傷性損傷，尤其是膿毒症晚期的藥物中的用途。

本發明再一方面提供了本發明所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於降低患者的慢性或者急性病或急性病症的死亡風險的藥物中的用途，所述慢性或者急性病或急性病症選自重度感染，如腦膜炎、全身炎症反應綜合症(SIRS)、敗血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、動脈粥樣硬化，水腫；休克如敗血性休克和器官功能障礙如腎功能障礙、肝功能障礙、燒傷、手術、外傷、中毒。

本發明再一方面提供了本發明所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於穩定患者迴圈尤其是全身迴圈的藥物中的用途，所述患者患有慢性或者急性病或急性病症，所述慢性或者急性病或急性病症選自重度感染，如腦膜炎、全身炎症反應綜合症(SIRS)、敗血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、動脈粥樣硬化，水腫；休克如敗血性休克和器官功能障礙如腎功能障礙、肝功能障礙、燒傷、手術、外傷、中毒。

在本發明較佳的實施方案中，所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段與另一種藥劑聯合使用。

在本發明進一步較佳的實施方案中，所述的藥劑選自血管加壓藥，靜脈注射液，TNF-α-抗體和抗生素。

有益效果

本發明藉由雜交瘤技術篩選出抗ADM單克隆抗體，並藉由抗體的人源化表達、全人源單鏈噬菌體抗體庫淘選，獲得了全人源抗ADM單克隆抗體。在此基礎上，本發明藉由篩選親和力成熟資料庫，最終獲得了具有較高的與人ADM的N端相結合的活性。與現有技術中存在的抗ADM非中和抗體相比，本發明的抗ADM非中和抗體展現出對ADM的KD值小於10 ^-10M的親和力。

動物試驗表明，使用本發明的抗ADM非中和性抗體進行治療，可以顯著改善膿毒症症狀，提高動物的存活率。

為了更好的說明本方法的目的和優點，結合圖式及具體實施例對本發明具體實施內容做進一步詳細說明。

實施例 1 ：雜交瘤技術篩選抗 ADM 單克隆

1.1 小鼠免疫

分別將合成的人ADM的N端16個胺基酸多肽(簡稱YY-16，SEQ ID NO: 1)、人ADM的N端21個胺基酸多肽(簡稱YY-21，SEQ ID NO: 2)或鼠ADM的N端19個胺基酸多肽(簡稱YY-19，SEQ ID NO: 3)與KLH(Sigma，H8283)的偶聯物作為免疫原免疫小鼠。初次免疫時，將免疫原與弗氏完全佐劑以1:1的比例進行乳化，腹腔注射至6~8周齡雌性Balb/c小鼠、SJL小鼠或SD大鼠，100 μg/只；之後每間隔2~3周進行加強免疫，每只動物50 μg免疫原加弗氏不完全佐劑，免疫3~4次後採血測效價。最後一次免疫一周後取血，ELISA測定血清抗YY-21的滴度。血清效價高的鼠經腹腔注射50 μg免疫原衝擊免疫後，第三天取動物的脾臟細胞進行融合。

1.2 脾細胞融合

鼠安樂死後，解剖、取脾、研磨並收集細胞，用5 mL紅細胞裂解液懸浮細胞，4℃放置5 min，用DMEM+10%FBS終止反應。離心後用40 mL DMEM重懸脾細胞，靜置2~3min後轉移上清到另外一個50 mL離心管中。按SP2/0:脾細胞=1:2的比例混合，離心，充分吸取上清後，混合細胞沉澱，用DMEM洗滌混合細胞兩次，用電穿孔緩衝液重懸細胞，加入電穿孔槽中。待電穿孔程式結束後，將融合後的細胞先靜置5 min，再加入到DMEM+10%FBS+1×HAT篩選培養基中。將上述細胞懸液加入96孔細胞培養板內，置37℃、濕度75%、5%CO ₂培養箱內培養7～9天。

1.3 雜交瘤 克隆的篩選

用PBS分別稀釋YY-21或YY-19至1.0 μg/mL，加至96孔板(Corning，9018)內，100 μL/孔，置4℃包被過夜。第二天將ELISA板在自動洗板機上用洗滌緩衝液(PBS+0.05%吐溫20)洗滌3次。每孔加入300 μL封閉緩衝液(PBS+0.05%吐溫20+1%BSA)，置室溫封閉1 h。然後在自動洗板機上用洗滌緩衝液洗滌3次，加雜交瘤上清至ELISA板各孔內，置室溫孵育1 h，然後依照上述方法洗板3次。用封閉緩衝液中1:5000稀釋Goat Anti-mouse IgG Fc-HRP (Sigma，A0168)或Goat Anti-rat-IgG-HRP (Sigma，A5795)，每孔加入100 μL，置室溫孵育1 h。然後依照上述方法洗板3次。加入100 μL/孔TMB底物液室溫孵育10 min，然後每孔加入50 μL 1.0 M 鹽酸終止反應，藉由酶標儀在OD ₄₅₀nm讀板。挑取陽性細胞進行亞克隆及亞克隆篩選，直至得到穩定的可分泌結合YY-21和YY-19的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。藉由結合實驗，篩選到雜交瘤克隆40E12，凍存細胞株，並採用無血清培養基進行50 mL小規模生產，protein A柱純化後做後續鑒定。

1.4 雜交瘤 克隆 40E12 的親和力測定

採用Octet RED96e(Fortebio)測定候選抗體與生物素標記的人ADM(簡稱人ADM-C-biotin，人ADM序列如SEQ ID NO: 4所示)和鼠ADM(簡稱鼠ADM-C-biotin，鼠ADM序列如SEQ ID NO: 5所示)的親和力。抗原及抗體均用1×PBST稀釋，抗原使用濃度為2 μg/ml，抗體使用工作濃度為100 nM。

首先，將樣品加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，體系為200 µL/well。然後設置軟體參數，板溫設定為30℃，收集標準動力學訊號的頻率為5.0 HZ。接著，用1×PBST預濕鏈黴親和素感測器(Fortébio，貨號：18-5020)10 min，然後上機檢測。每個迴圈包含以下步驟：1)浸入緩衝液 180 s，使基線平穩；2)抗原固化10 s，使抗原結合到感測器上，抗原結合量控制在0.5-1.0 nm之間；3)感測器浸入緩衝液180 s；4)抗原與抗體結合，結合時間180 s；5)抗原抗體的解離，時間10 min。

採用Fortebio的Data Analysis 12.0軟體，對抗原-抗體以1:1的結合方式，測定結合速率(Kon)和解離速率(Koff)，以此計算抗體的平衡解離常數(KD)結果如表1所示。

表1 候選抗體40E12的平衡解離常數(KD)

抗原	KD (M)	Kon (1/Ms)	Koff (1/s)
人ADM-C-biotin	3.14E-10	3.47E+05	1.09E-04
鼠ADM-C-biotin	2.36E-10	3.77E+05	8.90E-05

1.5 雜交瘤 克隆 40E12 的測序

培養雜交瘤單克隆細胞株，離心收集5×10 ⁶個雜交瘤細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉錄反應後得到的cDNA，藉由末端轉移酶進行加G反應，後用VH引子(序列如SEQ ID NO: 6所示)、VK引子(序列如SEQ ID NO: 7所示)和polyC引子(序列如SEQ ID NO: 8所示)擴增含可變區序列的DNA，做TA克隆，測序後得鼠源雜交瘤克隆40E12重鏈可變區(40E12VH)和40E12輕鏈可變區(40E12VK)序列分別如SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10所示。對輕重鏈可變區進行Chothia編號，採用Chothia定義的克隆40E12的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13，LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16。

實施例 2 ：抗 ADM 抗體的人源化和表達

2.1 抗 ADM 抗體的人源化

藉由序列比對，挑選同源性最高的人抗體胚系基因作為人源化設計框架。

重鏈可變區以人抗體胚系基因序列IGHV7-4-1*02和IGHJ6*01為框架，將40E12VH(又簡稱為2004hzVH0)進行CDR移植和回復突變獲得人源化重鏈可變區序列2004hzVH9(胺基酸序列如SEQ ID NO: 17)。輕鏈可變區以人抗體胚系基因序列IGKV2-30*02和IGKJ2*01為框架，將40E12VK(又簡稱為2004hzVK0)進行CDR移植和回復突變的人源化輕鏈可變區序列2004hzVK7(胺基酸序列如SEQ ID NO: 18)和2004hzVK9(胺基酸序列如SEQ ID NO: 19)。

2.2 抗 ADM 抗體的表達

將2004hzVK7、2004hzVK9序列與人Kappa鏈恆定區(CL，胺基酸序列SEQ ID NO: 20)組合成抗體輕鏈，將2004hzVH9序列與人IgG1恆定區(CH，胺基酸序列SEQ ID NO: 21)組合成抗體重鏈。2004hzVH0和2004hzVK0分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成嵌合抗體2004hz00(序列如SEQ ID NO: 22和23所示)；2004hzVH9和2004hzVK7分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體2004hz97(序列如SEQ ID NO: 24和25所示)；2004hzVH9和2004hzVK9分別與人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區組合後配對組成人源化抗體2004hz99(序列如SEQ ID NO: 26和27所示)。

密碼子優化後進行基因合成，克隆合成後基因片段到表達載體pcDNA3.4(Life Technologies)。表達質粒擴增和質粒抽提(Qiagen, EndoFree ^®Plasmid Maxi Kit, Cat. No. 12362)後雙質粒共轉Expi293F(ThermoFisher Scientific，A14527)或CHO-K1細胞(ECACC catalogue no. 85051005)，根據供應商Expi293F或CHO-K1表達系統方法進行抗體瞬轉表達，表達後藉由Protein A親和層析柱純化，檸檬酸緩衝液(PH3.4)洗脫，使用NanoDrop儀器讀取280 nm吸光度值；透析收集抗體備用。

抗體表達結果如表2所示，表明利用上述方法能表達出抗ADM抗體。

表2 候選抗體的表達量

抗體名稱	表達量(mg/L)
2004hz00	71.7
2004hz97	260.0
2004hz99	215.0

實施例 3 ：抗 ADM 抗體的親和力測定

採用Octet RED96e(Fortebio)測定抗體2004hz00、2004hz97、2004hz99與生物素標記的人、小鼠ADM(人ADM貨號：894757，小鼠ADM貨號：894758，GLBiochem合成)的親和力，抗原及抗體均用1×PBST(1×PBS：生工，B548117-0500；0.02%吐溫20：sigma，P1379)稀釋，抗體使用濃度為100 nM，抗原使用濃度為2 μg/mL。將候選抗體樣品按200 µL/孔加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，設置軟體參數，溫度30 ℃、收集標準動力學訊號的頻率為5.0 Hz；用1×PBST預濕SA感測器(Fortebio，貨號：18-5020)10 min，然後上機檢測。

每個迴圈包含以下步驟：1)浸入緩衝液60 s；2)檢測抗原是否與感測器有非特異性結合；3)10 mM pH1.7的甘胺酸溶液再生；4)浸入緩衝液60 s；5)抗原固化在感測器上，時間為10 s；6)感測器浸入緩衝液180 s；7)抗原與抗體結合，時間180 s；8)抗原抗體的解離，時間600 s；9)感測器再生。

採用Fortebio的Data Analysis 12.0軟體，對抗原-抗體以1:1的結合方式，測定結合速率(Kon)和解離速率(Koff)，以此計算抗體的平衡解離常數(KD)，結果分別如表3和表4所示。由表3和表4可知，人源化抗體2004hz97、2004hz99與人、小鼠ADM的親和力與嵌合抗體2004hz00親和力相當。

表3 候選抗體與人ADM的親和力

抗體名稱	回應值	KD (M)	kon(1/Ms)	Koff (1/s)
2004hz00	2.69	4.57E-10	4.41E+05	2.01E-04
2004hz97	2.39	5.46E-10	4.61E+05	2.52E-04
2004hz99	2.58	4.29E-10	4.68E+05	2.01E-04

表4 候選抗體與小鼠ADM的親和力

抗體名稱	回應值	KD (M)	kon(1/Ms)	Koff (1/s)
2004hz00	3.19	4.54E-10	4.32E+05	1.96E-04
2004hz97	3.00	4.89E-10	4.72E+05	2.31E-04
2004hz99	3.06	4.18E-10	4.65E+05	1.94E-04

實施例 4 ：人源化抗體理化性質評估

抗體2004hz97和2004hz99的表達量及親和力較為理想，作為候選分子繼續進行理化成藥性評估，具體如下。

4.1 SEC-HPLC 純度分析

將樣品濃度調整至1 mg/mL，離心取上清轉至樣品瓶，放入HPLC樣品盤。設置管柱層析條件如下：管柱層析管柱，TSK G3000SWxl；檢測波長，280 nm；柱溫，25 ℃；樣品室溫度，5 ℃；流速，0.5 mL/min。管柱層析管柱採用流動相(200 mM磷酸鹽緩衝液，pH6.8)平衡後，進樣分析，用管柱層析軟體進行資料分析，峰面積歸一化法計算各個峰的峰面積百分比，百分比越高說明抗體純度越高。

4.2 HIC-HPLC 分析

將樣品濃度調整至1 mg/mL，離心取上清待測。設置管柱層析條件如下：管柱層析管柱，MAbPac ^TMHIC-10；檢測波長，214 nm；柱溫，30 ℃；樣品室溫度，5 ℃；流速，0.8 mL/min。用流動相A(50 mM 磷酸鹽緩衝液/1 M硫酸銨，pH 7.0)和流動相B(50 mM 磷酸鹽緩衝液，pH 7.0)進行梯度洗脫，記錄主峰保留時間，出峰時間短則抗體親水性強。

4.3 熔解溫度 (Tm) 值分析

按照Protein Thermal Shift™ Starter Kit說明書，取供試品溶液13 µL加入至PCR管內，加入5 µL Protein Thermal shift TM Buffer，加入2 µL10×染色液，使反應體積為20 µL，混勻後，12000 rpm離心5 min以去除氣泡。將檢測樣品置於PCR儀內，進行樣品分析，記錄樣品的Tm值，Tm值越高表示抗體的熱穩定性越好。

4.4 等電聚焦 (iCIEF) 分析

取樣品溶液加入到已經充分混勻的以下體系中：1%的甲基纖維素(MC)70 µL，尿素5 M 80 µL，兩性電解質Pharmalyte pH 3-10 8 µL，pI marker 5.5和9.5各2 µL。補加適當體積超純水至200 µL，混勻。離心取上清進樣分析。分析結束後，將結果檔導入ChromPerfect軟體進行圖譜積分處理並計算各峰的等電點以及各峰百分比，分析候選抗體的電荷異構體分佈情況。

4.5 nrCE-SDS

用超純水將樣品稀釋到4 mg/mL，取25 µL，加入SDS樣品緩衝液75 µL，0.25 mol. L-1碘乙醯胺(IAM)5 µL，混勻後，70℃加熱10 min，取90 µL上清放入樣品瓶中上機分析。採用Beckman PA800 Plus 毛細管電泳系統，無塗層毛細管(總長度31cm，有效長度21cm)檢測；檢測條件：分離電壓為15KV，毛細管溫度25℃，樣品室溫度15℃，檢測波長220 nm。計算主峰校正峰面積百分比。

由表5可知，人源化抗體2004hz97、2004hz99經過一步protein A純化，已具有良好的理化特性。

表5 候選抗體理化性質分析結果

樣品名稱	SEC-HPLC	cIEFIEF	nrCE-SDS	Tm(℃)	HIC-HPLC(min)
HMWS%	Main Peak%	LMWS%	pI	酸性峰%	主峰%	鹼性峰%	主峰%
2004hz99	0.6	99.4	0	9	11.4	41.1	47.5	96.2	69.44	16.44
2004hz97	0.5	99.5	0	9	12.7	42.2	45.1	95.2	70.21	16.44

實施例 5: 全人源單鏈噬菌體抗體庫淘選

取150 µL Streptavidin Magnetic Beads(Thermo fisher，貨號：88817)與2 mL全人源單鏈噬菌體抗體庫預結合，室溫孵育90 min，去除非特異性結合。將去除背景後的資料庫噬菌體加入 10 µg人ADM (貨號NT-H-2，金斯瑞合成)，150 µL Streptavidin Magnetic Beads，室溫孵育15 min，PBST(PBS中含有0.05% Tween-20)洗14遍，洗去不結合的噬菌體。用450 µL 100 mM鹽酸洗脫抗原特異性結合的噬菌體，加入50 µL pH11的1M Tris-HCl中和並感染處於對數生長期的大腸桿菌SS320，產生並純化噬菌體用於下一輪的篩選。篩選方法與第一輪相同，僅將抗原用量減為4 µg。取兩輪篩選後富集的噬菌體用酶聯免疫(ELISA)鑒定富集情況，結果表明，經過兩輪淘選後噬菌體富集明顯。

取10 µL兩輪淘選後洗脫的噬菌體梯度稀釋10000倍，加入90 µL對數生長期的大腸桿菌SS320，靜置侵染30 min 後塗布抗性平板，37℃過夜培養。次日從抗性平板上挑取單克隆菌斑放入已加入胺苄青黴素/IPTG/2YT的96深孔板中，37℃過夜培養。次日4000 g離心10 min取上清，藉由酶聯免疫(ELISA)鑒定單克隆結合能力篩選出單克隆1F12(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 28和35所示)。

實施例 6 ：抗 ADM 抗體對 ADM 生物活性的影響

在人重組腎上腺髓質素受體cAMP功能測定(腎上腺髓質素生物測定)中檢測所選的抗ADM抗體對ADM生物活性的影響。

用Stimulation Buffer 1(Cisbio，64SB1FDD)將抗ADM抗體稀釋到1600 μg/mL，工作濃度為400 μg/mL，隨後用Stimulation Buffer 1進行3倍梯度稀釋(8 μL+16 μL Stimulation Buffer 1)，其中拮抗劑人ADM(22-52) (Alfa Aesar，貨號：159899-65-7)稀釋到12000 μg/mL，工作濃度為3000 μg/mL，隨後實驗板中相應孔加入2.5 μL 抗ADM抗體。將人ADM JMB2004 YY-52蛋白(吉爾生化，貨號：196191)用Stimulation Buffer 1稀釋到0.6 μg/mL，相應孔加入2.5 μL，即人ADM JMB2004 YY-52蛋白工作濃度為0.15 μg/mL，隨後實驗板於室溫孵育60 min。用TrypLE Express(gibco，貨號：12604-021)消化分離表達人重組腎上腺髓質素受體的CHO-K1細胞(以下簡稱CHO-K1/CRLR/RAMP3，其中CRLR的基因登錄號為U17473, RAMP3的基因登錄號為AJ001016)，藉由離心收集並重懸於Stimulation Buffer 1中，調整細胞密度至4×10 ⁶/mL，每孔加入5 μL CHO-K1/CRLR/RAMP3細胞(2×10 ⁴細胞/孔)。隨後實驗板於37℃細胞培養箱孵育90 min後，用HTRF試劑盒(Cisbio，62AM4PEB)檢測cAMP的含量，即實驗孔加入 5 μL cAMP-d2 reagent工作液，然後加入5 μL cAMP Eu-Cryptate antibody working solution，室溫孵育1 h後，酶標儀檢測HTRF值。

實驗結果如圖1所示，從圖1可以看出，抗體1F12無阻斷活性。

實施例 7 ：全人源抗體 1F12 的親和力成熟資料庫設計與構建

對篩選獲得的全人源抗體1F12進行親和力成熟，提高其與人ADM的親和力。同時，由於1F12的重鏈抗原結合決定簇2(CDR_H2)含有NG的轉譯後修飾(PTM)位元點，定點突變成QG去除脫醯胺異構作用，突變的抗體命名為1F12 PTMΔ(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 29和35所示)。以突變體1F12 PTMΔ為親本，按Chothia規則進行編碼，按Chothia定義CDR區，對其HCDR-3、LCDR-3位點的胺基酸進行隨機突變，構建突變資料庫。設計NNK突變引子進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增HCDR-3、LCDR-3突變資料庫基因片段，擴增的VH、VL基因片段回收後與酵母展示質粒共同電轉入釀酒酵母菌株EBY100(購自ATCC)，藉由釀酒酵母的同源重組使VH、VL基因插入至酵母展示質粒中，進而實現在酵母細胞壁表面展示抗體的Fab突變資料庫，資料庫命名為JYYDL196-197。電轉後資料庫JYYDL196-197在250 mL的SD-Trp-Leu液體培養基(Clontech，貨號：630316)，30℃培養過夜；各取1.0×10 ⁹菌量，重懸於200 mL YPGP誘導培養基(2%半乳糖，2%蛋白腖，1%酵母提取物，0.54% Na ₂HPO ₄，0.86% NaH ₂PO ₄·H ₂O)，20℃培養24 h，置於4℃待用。同時將親本1F12 PTMΔ的序列展示於酵母表面，作為親本對照使用。

實施例 8 ：全人源抗體 1F12 親和力成熟資料庫篩選與單克隆鑒定

JYYDL196-197資料庫誘導後菌液，測定菌液的OD ₆₀₀，按1OD為1.0×10 ⁷細胞數計算，取1.0×10 ⁹細胞，用磁珠分選系統進行第一輪富集：用50 mL 1×PBSA(1×PBS+1%BSA)洗滌一次，離心棄上清；與5 mL含100 nM 生物素標記的人ADM(簡稱hADM-Biotin，貨號NT-H-2, 金斯瑞合成)的1×PBSA，室溫孵育30 min；洗滌後加入抗生物素的磁珠(miltenyi，貨號：130-090-485)混勻孵育10 min，過磁力柱(Quadro MACS Starting Kit)收集陽性細胞。陽性細胞經過再次培養、誘導後，取3.0×10 ⁷細胞進行第二輪流式分選：用1 mL 1×PBSA，離心棄上清；與1 mL含10 nM hADM-Biotin及鼠抗 V5抗體(Invitrogen，貨號2156578，1:1000稀釋)的1×PBSA冰上孵育30 min；離心棄上清，加入1 mL 1×PBSA洗滌一次；加入500 μL含螢光抗體的1×PBSA(SA-PE 廠家eBioscience，貨號：12-4317-8，按1:200稀釋；羊抗鼠-647廠家Invitrogen，貨號：A21235，按1:400稀釋)，避光冰上孵育20 min；洗滌後加入2 mL 1×PBSA重懸細胞，藉由流式分選儀器收集647螢光訊號與PE螢光訊號均強的細胞群。第二輪流式分選後細胞經過再次培養、誘導後，同第二輪方法，取3.0×10 ⁷細胞在3 nM hADM-Biotin孵育後進行第三輪流式分選，分選後取部分細胞塗布於SD-Trp-Leu固體培養基(Clontech，貨號：630317)平板，30℃靜置培養3天。

JYYDL196-197第三輪篩選產物，各挑取92個單克隆進行測序分析，最終獲得獨一序列的酵母單克隆菌落進行流式染色分析，各取1×10 ⁶個細胞進行染色評估，根據各克隆的染色結果，綜合各克隆序列的相似性，最終挑取全人源抗體Ab2004.Am01(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 30和35所示)進行表達。

實施例 9 ： Ab2004.Am01 親和力成熟資料庫設計與構建

對Ab2004.Am01繼續進行親和力成熟，提高其與人、小鼠ADM的親和力。參考實施例7，選擇Ab2004.Am01的HCDR-1、HCDR-2、LCDRL-1、LCDR-2、LCDR-3的胺基酸進行突變資料庫構建，資料庫編號JYYDL208-212。資料庫JYYDL208-212培養、誘導後待用。同時將Ab2004.Am01的Fab序列展示於酵母表面，作為本輪親和成熟的親本對照使用。

實施例 10 ： Ab2004.Am01 親和力成熟資料庫篩選

JYYDL208-212資料庫誘導後菌液，取1.0×10 ⁹細胞用磁珠分選系統進行第一輪富集，磁珠篩選後陽性細胞經過再次培養、誘導，取3.0×10 ⁷細胞進行第二輪流式分選，藉由流式分選儀器收集647螢光訊號與PE螢光訊號均強的細胞群，細胞群培養、誘導後進行第三輪流式篩選。JYYDL208-209的第二輪篩選產物，取3.0×10 ⁷細胞在10 nM mADM-Biotin條件下進行第三輪流式分選；JYYDL210-212取3.0×10 ⁷細胞在100 nM mADM-Biotin條件下進行第三輪流式分選。第二輪、第三輪分選後細胞塗布於SD-Trp-Leu固體培養基平板，30℃靜置培養3天。

實施例 11 ：輕、重鏈突變組合資料庫構建與篩選

JYYDL208-209，JYYDL211第二輪、第三輪篩選產物，各挑取若干單克隆構建輕、重鏈突變組合資料庫JYYDL227。

JYYDL227取2.0×10 ⁷細胞，分別用3 nM hADM-Biotin和1.2 nM mADM-Biotin進行流式第一輪分選；分選後取細胞塗布於SD-Trp-Leu固體培養基，30℃靜置培養3天。

JYYDL227第一輪篩選產物，各挑取46個單克隆進行測序，最終獲得獨一序列的酵母單克隆菌落進行流式染色EC ₅₀鑒定。各取1×10 ⁵個細胞進行染色評估：1、評估各克隆在不同抗原濃度下與人ADM的結合水準，計算出各克隆與人ADM的EC ₅₀值，值越小說明親和力越強；2、評估各克隆在不同抗原濃度下與小鼠ADM的結合水準，同理可得到各克隆與小鼠ADM的親和力強弱。

根據各克隆的染色結果(如表6所示)，綜合各克隆序列的相似性，最終挑取了表達抗體Ab2004.Am31(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 31和36所示)、Ab2004.Am32(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 31和37所示)、Ab2004.Am33(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 32和36所示)、Ab2004.Am34(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 33和38所示)、Ab2004.Am35(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 31和38所示)、Ab2004.Am36(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 31和39所示)、Ab2004.Am37(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 34和38所示)、Ab2004.Am38(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 34和40所示)、Ab2004.Am39(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 33和41所示)和Ab2004.Am40(可變區胺基酸序列如SEQ ID NO: 31和42所示)的單克隆。候選抗體的Chothia編號的CDR區胺基酸序列見表7，候選抗體的輕重鏈可變區胺基酸序列見表8。

表6 酵母單克隆菌落流式染色結果

抗體名稱	人ADM EC ₅₀(nM)	小鼠ADM EC ₅₀(nM)
Ab2004.Am01	4.00	88.22
Ab2004.Am31	0.45	1.66
Ab2004.Am32	0.41	2.20
Ab2004.Am33	0.79	15.04
Ab2004.Am34	1.06	4.43
Ab2004.Am35	1.47	2.26
Ab2004.Am36	1.73	2.67
Ab2004.Am37	0.88	6.74
Ab2004.Am38	0.74	14.3
Ab2004.Am39	0.86	4.23
Ab2004.Am40	0.50	2.50

表7 候選抗體的Chothia編號的CDR序列

	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCDR1	LCDR2	LCDR3
1F12	GYTFTSY (SEQ ID NO: 43)	SAYNGN (SEQ ID NO: 44)	EGRSGGSFDI (SEQ ID NO: 45)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DASNLET (SEQ ID NO:47)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
1F12-PTMΔ	GYTFTSY (SEQ ID NO: 43)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRSGGSFDI (SEQ ID NO: 45)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DASNLET (SEQ ID NO:47)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am01	GYTFTSY (SEQ ID NO: 43)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DASNLET (SEQ ID NO:47)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am31	GYTFTQY (SEQ ID NO: 51)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASEGISEYLA (SEQ ID NO:52)	DASNLET (SEQ ID NO:47)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am32	GYTFTQY (SEQ ID NO: 51)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RAAEGIGSYLA (SEQ ID NO:53)	DASNLET (SEQ ID NO:47)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am33	GYTFTSY (SEQ ID NO: 43)	SPYSGN (SEQ ID NO: 54)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASEGISEYLA (SEQ ID NO:52)	DASNLET (SEQ ID NO:47)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am34	GYTFTHY (SEQ ID NO: 55)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DVSILDA (SEQ ID NO:56)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am35	GYTFTQY (SEQ ID NO: 51)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DVSILDA (SEQ ID NO:56)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am36	GYTFTQY (SEQ ID NO: 51)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DASNVDT (SEQ ID NO:57)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am37	GYTFTSY (SEQ ID NO: 43)	SPYTGK (SEQ ID NO: 58)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DVSILDA (SEQ ID NO:56)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am38	GYTFTSY (SEQ ID NO: 43)	SPYTGK (SEQ ID NO: 58)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DTSDLDT (SEQ ID NO:59)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:48)
Ab2004.Am39	GYTFTHY (SEQ ID NO: 55)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DASNLET (SEQ ID NO:47)	QQYDDLDLT (SEQ ID NO:60)
Ab2004.Am40	GYTFTQY (SEQ ID NO: 51)	SAYQGN (SEQ ID NO: 49)	EGRWGGSFNI (SEQ ID NO:50)	RASQGISSYLA (SEQ ID NO:46)	DASNLET (SEQ ID NO:47)	QQYDDLPLS (SEQ ID NO:61)

表8 候選抗體的可變區序列

抗體名稱	VH	VL
1F12	SEQ ID NO: 28	SEQ ID NO: 35
1F12-PTMΔ	SEQ ID NO:29	SEQ ID NO: 35
Ab2004.Am01	SEQ ID NO: 30	SEQ ID NO: 35
Ab2004.Am31	SEQ ID NO:31	SEQ ID NO: 36
Ab2004.Am32	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 37
Ab2004.Am33	SEQ ID NO: 32	SEQ ID NO: 36
Ab2004.Am34	SEQ ID NO: 33	SEQ ID NO: 38
Ab2004.Am35	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 38
Ab2004.Am36	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 39
Ab2004.Am37	SEQ ID NO: 34	SEQ ID NO: 38
Ab2004.Am38	SEQ ID NO:34	SEQ ID NO:40
Ab2004.Am39	SEQ ID NO: 33	SEQ ID NO: 41
Ab2004.Am40	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 42

實施例 12 ：候選抗體的表達

同實施例2.2，將各克隆的VH與VK序列分別與人Kappa鏈恆定區(CL，胺基酸序列SEQ ID NO: 20)和人IgG1恆定區(CH，胺基酸序列SEQ ID NO: 21)組合成抗體輕鏈和重鏈，裝入表達載體pcDNA3.4(Life Technologies)，委託南京金斯瑞生物科技有限公司進行瞬轉CHO細胞表達、純化，最終得到親和力成熟候選抗體見表9。

表9 親和力成熟候選抗體表達、純化資料

抗體名稱	理論等電點	消光係數	表達量 (mg/L)
Ab2004.Am31	8.0	1.46	307
Ab2004.Am32	8.1	1.46	227
Ab2004.Am33	8.0	1.46	235
Ab2004.Am34	8.2	1.46	298
Ab2004.Am35	8.2	1.46	318
Ab2004.Am36	8.2	1.46	221
Ab2004.Am37	8.3	1.46	305
Ab2004.Am38	8.2	1.46	343
Ab2004.Am39	8	1.46	275
Ab2004.Am40	8.1	1.46	226

實施例 13 ：候選抗體親和力測定

同實施例3，繼續測定親和力成熟抗體Ab2004.Am31-Ab2004.Am40及親本抗體Ab2004.Am01分別與人、小鼠ADM的親和力，結果如表10。由表10可知，Ab2004.Am31、Ab2004.Am34、Ab2004.Am39與人ADM的親和力相對於親本抗體Ab2004.Am01提高最大，且與小鼠ADM的親和力與陽性對照抗體Enibarcimab相當。

表10 候選抗體與人、小鼠ADM的親和力測定

抗原	抗體編號	回應值	K _D (M)	kon(1/Ms)	koff(1/s)
人ADM	Enibarcimab	2.07	5.67E-10	6.73E+05	3.82E-04
Ab2004.Am01	2.34	7.66E-10	3.05E+05	2.33E-04
Ab2004.Am31	2.64	2.88E-10	4.91E+05	1.41E-04
Ab2004.Am32	2.53	3.40E-10	4.30E+05	1.46E-04
Ab2004.Am33	2.63	3.16E-10	6.76E+05	2.14E-04
Ab2004.Am34	2.61	1.54E-10	4.44E+05	6.81E-05
Ab2004.Am35	1.96	2.81E-10	4.23E+05	1.19E-04
Ab2004.Am36	2.70	2.91E-10	3.72E+05	1.08E-04
Ab2004.Am37	2.88	2.56E-10	5.87E+05	1.50E-04
Ab2004.Am38	2.83	2.55E-10	6.26E+05	1.60E-04
Ab2004.Am39	2.57	1.78E-10	4.68E+05	8.33E-05
Ab2004.Am40	2.66	3.52E-10	4.49E+05	1.58E-04
小鼠ADM	Enibarcimab	2.75	4.97E-10	5.97E+05	2.97E-04
Ab2004.Am01	2.35	2.21E-09	4.34E+05	9.56E-04
Ab2004.Am31	2.81	4.12E-10	5.37E+05	2.21E-04
Ab2004.Am32	2.76	4.74E-10	4.61E+05	2.19E-04
Ab2004.Am33	2.80	4.74E-10	7.69E+05	3.65E-04
Ab2004.Am34	2.78	4.51E-10	4.92E+05	2.22E-04
Ab2004.Am35	2.74	4.52E-10	4.56E+05	2.06E-04
Ab2004.Am36	2.75	5.18E-10	4.27E+05	2.21E-04
Ab2004.Am37	2.85	4.69E-10	7.03E+05	3.30E-04
Ab2004.Am38	2.88	4.67E-10	7.33E+05	3.42E-04
Ab2004.Am39	2.70	4.89E-10	5.43E+05	2.66E-04
Ab2004.Am40	2.65	4.92E-10	5.13E+05	2.53E-04

實施例 14 ：候選抗體理化性質評估

候選抗體Ab2004.Am31、Ab2004.Am34、Ab2004.Am39的表達量及親和力較為理想，繼續進行理化成藥性評估，結果匯總如表11。由表11可知，Ab2004.Am31、Ab2004.Am34、Ab2004.Am39在純度、熱穩定性、親水性、電荷異構體等方面均符合成藥性標準，方法參考實施例4。

表11 親和力成熟抗體理化性質分析結果

抗體名稱	SEC-HPLC(%)	Tm (℃)	出峰時間 (min)	iCIEF	NR-CE-SDS (%)
等電點 (pI)	酸峰 (%)	主峰 (%)	堿峰 (%)	碎片	主峰
Ab2004.Am31	99.6	86.9	13.3	8.4	18.1	71.2	10.7	7.5	92.5
Ab2004.Am34	99.6	84.9	14.5	8.8	20.2	69.2	10.6	5.7	94.3
Ab2004.Am39	99.2	84.0	13.3	8.4	16.3	72.3	11.5	6.5	93.5

實施例 15 ： ADM 抗體在 LPS 誘導的 C57BL/6J 小鼠膿毒症模型中的藥效學研究

C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，10-11周齡，雄性，共50只。按照體重將動物隨機分成以下五組(n=10)：G1組為模型組給予同型對照RSV-IgG1(2 mg/kg，IV，Single)，G2組為陽性對照組給予Enibarcimab(2 mg/kg，IV，Single)，G3、G4、G5組則分別給予本發明抗體2004hz97(2 mg/kg，IV，Single)、2004hz99(2 mg/kg，IV，Single)和Ab2004.Am34(2 mg/kg，IV，Single)。LPS誘導膿毒症前5 min 單次IV給予相應抗體治療，5 min後單次IP給予20 mg/kg的LPS(E.coli 055:B5；Sigma)誘導小鼠膿毒症，造模後每天2次、連續7天觀察動物死亡情況。資料採用GraphPad Prism 8軟體作圖，並用Log-rank (Mantel-Cox) test方法對資料進行統計學分析。

LPS處理7天后各組動物存活率分別為：RSV-IgG1(40%)、Enibarcimab(50%，P=0.6713 vs RSV-IgG1)、2004hz97(90%，P＜0.05 vs RSV-IgG1)、2004hz99(80%，P=0.1001 vs RSV-IgG1)、Am34(80%，P＜0.05 vs RSV-IgG1)結果顯示使用本發明抗體治療後可顯著提高動物存活率，改善膿毒症症狀(參見表12，圖2)。

表12 候選抗體對LPS誘導的小鼠膿毒症存活率

藥物	動物數	藥物劑量(mg/kg)	7天後存活率(%)
RSV-IgG1	10	2	40
Enibarcimab	10	2	50
2004hz97	10	2	90
2004hz99	10	2	80
Ab2004.Am34	10	2	80

以上所述為本發明的較佳實施例而已，本發明不應該局限於該實施例和圖式所公開的內容。凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的範圍。

序列表

SEQ ID NO:	序列描述	序列
1	hADM 1-16AA	YRQSMNNFQGLRSFGC
2	hADM 1-21AA	YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
3	mADM 1-19AA	YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
4	人ADM	YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY
5	鼠ADM	YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMAPRNKISPQGY
6	VH引子	GGACAGGGMTCCAKAGTTCC
7	VK引子	GCACACGACTGAGGCACCTCCAGATGTT
8	polyC引子	AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCATCCCCCCCCCCCCCCCC
9	40E12 VH	QIQLVQSGPELRKPGETVKISCKASGYAFTTFGMSWIKQAPGQGLKWMGWINTYSRVPKYTDDFKGRFAFSLEISATTAYLLINNLKNGDTATYFCARGYGGEGGLGFSGQGTTLTVSS
10	40E12VK	DVLMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSIIDSDGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPYTFAGGTKLELK
11	40E12 HCDR1	GYAFTTF
12	40E12 HCDR2	NTYSRV
13	40E12 HCDR3	GYGGEGGLGF
14	40E12 LCDR1	RSSQSIIDSDGNTYLE
15	40E12 LCDR2	KVSNRFS
16	40E12 LCDR3	FQGSHFPYT
17	2004hzVH9	QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTTFGMSWIRQAPGQGLEWMGWINTYSRVPKYTQGFTGRFVFSLDISVTTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGYGGEGGLGFSGQGTLVTVSS
18	2004hzVK7	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIDSDGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDFGVYYCFQGSHFPYTFGQGTKLEIK
19	2004hzVK9	DVLMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIDSDGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDFGVYYCFQGSHFPYTFAQGTKLEIK
20	人輕鏈恆定區CL	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
21	人重鏈恆定區CH	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
22	2004hz00 LC	DVLMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSIIDSDGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPYTFAGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
23	2004hz00 HC	QIQLVQSGPELRKPGETVKISCKASGYAFTTFGMSWIKQAPGQGLKWMGWINTYSRVPKYTDDFKGRFAFSLEISATTAYLLINNLKNGDTATYFCARGYGGEGGLGFSGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
24	2004hz97 LC	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIDSDGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDFGVYYCFQGSHFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
25	2004hz97 HC	QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTTFGMSWIRQAPGQGLEWMGWINTYSRVPKYTQGFTGRFVFSLDISVTTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGYGGEGGLGFSGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
26	2004hz99 LC	DVLMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIIDSDGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDFGVYYCFQGSHFPYTFAQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
27	2004hz99 HC	QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTTFGMSWIRQAPGQGLEWMGWINTYSRVPKYTQGFTGRFVFSLDISVTTAYLQISSLKAEDTAVYFCARGYGGEGGLGFSGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
28	1F12 VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGRSGGSFDIWGQGTMVTVSS
29	1F12-PTMΔ VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYQGNTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGRSGGSFDIWGQGTMVTVSS
30	Ab2004.Am01 VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYQGNTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGRWGGSFNIWGQGTMVTVSS
31	Ab2004.Am31 VH Ab2004.Am32 VH Ab2004.Am35 VH Ab2004.Am36 VH Ab2004.Am40 VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTQYGIAWVRQAPGQGLEWMGWISAYQGNTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGRWGGSFNIWGQGTMVTVSS
32	Ab2004.Am33 VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGNTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGRWGGSFNIWGQGTMVTVSS
33	Ab2004.Am34 VH Ab2004.Am39 VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYGIAWVRQAPGQGLEWMGWISAYQGNTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGRWGGSFNIWGQGTMVTVSS
34	Ab2004.Am37 VH Ab2004.Am38 VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISPYTGKTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGRWGGSFNIWGQGTMVTVSS
35	1F12 VL 1F12-PTMΔ VL Ab2004.Am01 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
36	Ab2004.Am31 VL Ab2004.Am33 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEGISEYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
37	Ab2004.Am32 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAAEGIGSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
38	Ab2004.Am34 VL Ab2004.Am35 VL Ab2004.Am37 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDVSILDAGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
39	Ab2004.Am36 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNVDTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
40	Ab2004.Am38 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDTSDLDTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
41	Ab2004.Am39 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDDLDLTFGGGTKVEIK
42	Ab2004.Am40 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDDLPLSFGGGTKVEIK
43	1F12 HCDR1	GYTFTSY
44	1F12 HCDR2	SAYNGN
45	1F12 HCDR3	EGRSGGSFDI
46	1F12 LCDR1	RASQGISSYLA
47	1F12 LCDR2	DASNLET
48	1F12 LCDR3	QQYDNLPLT
49	1F12-PTMΔ HCDR2	SAYQGN
50	Ab2004.Am01 HCDR3	EGRWGGSFNI
51	Ab2004.Am31 HCDR1	GYTFTQY
52	Ab2004.Am31 LCDR1	RASEGISEYLA
53	Ab2004.Am32 LCDR1	RAAEGIGSYLA
54	Ab2004.Am33 HCDR2	SPYSGN
55	Ab2004.Am34 HCDR1	GYTFTHY
56	Ab2004.Am34 LCDR2	DVSILDA
57	Ab2004.Am36 LCDR2	DASNVDT
58	Ab2004.Am37 HCDR2	SPYTGK
59	Ab2004.Am38 LCDR2	DTSDLDT
60	Ab2004.Am39 LCDR3	QQYDDLDLT
61	Ab2004.Am40 LCDR3	QQYDDLPLS

無

圖1是抗ADM抗體阻斷hADM誘導CHOK1/CRLR/RAMP3細胞產生cAMP示意圖。圖2是抗ADM抗體對LPS誘導的小鼠膿毒症存活率結果圖。

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Claims

一種抗腎上腺髓質素(抗ADM)單克隆抗體或其片段，其中該單克隆抗體或片段特異性結合人腎上腺髓質素(ADM)的N端第1-21個胺基酸序列，該人ADM的N端第1-21位胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，並且該單克隆抗體或片段展現出對ADM的KD值小於10 ^-10M的親和力。
如請求項1所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中該片段包括Fab，Fab'，F(ab)2、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
如請求項1或2所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYAFTTF(如SEQ ID NO:11所示)， (ii) NTYSRV(如SEQ ID NO:12所示)， (iii) GYGGEGGLGF(如SEQ ID NO:13所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RSSQSIIDSDGNTYLE(如SEQ ID NO:14所示)， (ii) KVSNRFS(如SEQ ID NO:15所示)， (iii) FQGSHFPYT(如SEQ ID NO:16所示)。
如請求項3所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中該單克隆抗體包含SEQ ID NO:9和17任一所示的重鏈可變區序列，該單克隆抗體包含SEQ ID NO:10、18和19任一所示的輕鏈可變區序列，其中該單克隆抗體較佳包含SEQ ID NO:9所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:10所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:18所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:17所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:19所示的輕鏈可變區序列。
如請求項4所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中該單克隆抗體包含SEQ ID NO:23所示的重鏈序列和SEQ ID NO:22所示的輕鏈序列。
如請求項4所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中該單克隆抗體包含SEQ ID NO:25所示的重鏈序列和SEQ ID NO:24所示的輕鏈序列。
如請求項4所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中該單克隆抗體包含SEQ ID NO:27所示的重鏈序列和SEQ ID NO:26所示的輕鏈序列。
如請求項1或2所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTX ₁Y，其中X ₁選自S、Q或H， (ii) SX ₂YX ₃GX ₄，其中X ₂選自A或P，X ₃選自N、Q、S或T，X ₄選擇N或K， (iii) EGRX ₅GGSFX ₆I，其中X ₅選自S或W，X ₆選自D或N，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RAX ₇X ₈GIX ₉X ₁₀YLA，其中X ₇選自S或A，X ₈選自Q或E，X ₉選自S或G，X ₁₀選自S或E， (ii) DX ₁₁SX ₁₂X ₁₃X ₁₄X ₁₅，其中X ₁₁選擇A、V或T，X ₁₂選自N、I或D，X ₁₃選自L或V，X ₁₄選自E或D，X ₁₅選自T或A， (iii) QQYDX ₁₆LX ₁₇LX ₁₈，其中X ₁₆選自N或D，X ₁₇選自P或D，X ₁₈選自T或S。
如請求項8所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中該HCDR1包含SEQ ID NO:43、51和55任一所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:44、49、54和58任一所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:45和50任一所示的胺基酸序列，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中該LCDR1包含SEQ ID NO:46、52和53任一所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:47、56、57和59任一所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO:48、60和61任一所示的胺基酸序列。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY(如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SAYNGN(如SEQ ID NO:44所示)， (iii) EGRSGGSFDI(如SEQ ID NO:45所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY(如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRSGGSFDI(如SEQ ID NO:45所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項8至11中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中該單克隆抗體包含SEQ ID NO:28或29所示的重鏈可變區序列，該單克隆抗體包含SEQ ID NO: 35所示的輕鏈可變區序列，其中該單克隆抗體較佳包含SEQ ID NO:28所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:35所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:29所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:35所示的輕鏈可變區序列。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY(如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY(如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASEGISEYLA(如SEQ ID NO:52所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY(如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RAAEGIGSYLA(如SEQ ID NO:53所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY(如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SPYSGN(如SEQ ID NO:54所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASEGISEYLA(如SEQ ID NO:52所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTHY(如SEQ ID NO:55所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DVSILDA(如SEQ ID NO:56所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY(如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DVSILDA(如SEQ ID NO:56所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY(如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNVDT(如SEQ ID NO:57所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY(如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SPYTGK(如SEQ ID NO:58所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DVSILDA(如SEQ ID NO:56所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTSY(如SEQ ID NO:43所示)， (ii) SPYTGK(如SEQ ID NO:58所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DTSDLDT(如SEQ ID NO:59所示)， (iii) QQYDNLPLT(如SEQ ID NO:48所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTHY(如SEQ ID NO:55所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDDLDLT(如SEQ ID NO:60所示)。
如請求項9所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中： (a) 該單克隆抗體的重鏈可變區包含以下CDR序列： (i) GYTFTQY(如SEQ ID NO:51所示)， (ii) SAYQGN(如SEQ ID NO:49所示)， (iii) EGRWGGSFNI(如SEQ ID NO:50所示)，以及 (b) 該單克隆抗體的輕鏈可變區包含以下CDR序列： (i) RASQGISSYLA(如SEQ ID NO:46所示)， (ii) DASNLET(如SEQ ID NO:47所示)， (iii) QQYDDLPLS(如SEQ ID NO:61所示)。
如請求項8至9、13至23中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段，其中該單克隆抗體包含SEQ ID NO:30至34任一所示的重鏈可變區序列，該單克隆抗體包含SEQ ID NO: 35至42任一所示的輕鏈可變區序列，其中該單克隆抗體較佳包含SEQ ID NO:30所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:35所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:36所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:37所示的輕鏈可變區序列，該單克隆抗體較佳包含SEQ ID NO:32所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:36所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:33所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:38所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:38所示的輕鏈可變區序列，該單克隆抗體較佳包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:39所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:34所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:38所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:34所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:40所示的輕鏈可變區序列，該單克隆抗體較佳包含SEQ ID NO:33所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:41所示的輕鏈可變區序列，該單克隆單體較佳包含SEQ ID NO:31所示的重鏈可變區序列和SEQ ID NO:42所示的輕鏈可變區序列。
一種編碼如請求項1至24中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段的核苷酸序列。
一種包含請求項25所述的核苷酸序列的表達載體，其較佳為pcDNA3.4。
一種包含請求項25所述的核苷酸序列或請求項26所述的表達載體的宿主細胞，其較佳為CHO細胞。
一種包含請求項1至24中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段的藥物組合物、檢測試劑或套裝藥盒。
一種如請求項1至24中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於維持內皮細胞完整性、增強屏障作用的藥物中的用途。
一種如請求項1至24中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於控制血管舒張、降低血壓的藥物中的用途。
一種如請求項1至24中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於治療或預防膿毒性休克或創傷性損傷，尤其是膿毒症晚期的藥物中的用途。
一種如請求項1至24中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於降低患者的慢性或者急性病或急性病症的死亡風險的藥物中的用途，該慢性或者急性病或急性病症選自重度感染，如腦膜炎、全身炎症反應綜合症(SIRS)、敗血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、動脈粥樣硬化、水腫；休克如敗血性休克和器官功能障礙如腎功能障礙、肝功能障礙、燒傷、手術、外傷、中毒。
一種如請求項1至24中任一項所述的抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段在製備用於穩定患者迴圈尤其是全身迴圈的藥物中的用途，該患者患有慢性或者急性病或急性病症，該慢性或者急性病或急性病症選自重度感染，如腦膜炎、全身炎症反應綜合症(SIRS)、敗血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、動脈粥樣硬化，水腫；休克如敗血性休克和器官功能障礙如腎功能障礙、肝功能障礙、燒傷、手術、外傷、中毒。
如請求項29至33所述的用途，其中，該抗腎上腺髓質素單克隆抗體或其片段與另一種藥劑聯合使用。
如請求項34所述的用途，其中，該藥劑選自血管加壓藥，靜脈注射液，TNF-α-抗體和抗生素。