BR122023021668A2

BR122023021668A2 - Método para determinar a estabilidade de uma proteína de interesse

Info

Publication number: BR122023021668A2
Application number: BR122023021668-7A
Authority: BR
Inventors: Yiming Zhao; Hunter Chen; Shao-Chun WANG; Timothy Riehlman; Gabriel Carreau; Ying Wang
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2024-01-09
Also published as: AU2021209866B2; IL294765B1; KR102544013B1; AU2021209866A1; JP2023166478A; IL303596A; EP4085253A1; CA3165060A1; CN115398236A; IL294765B2; WO2021150558A1; AU2023226678A1; IL294765A; BR112022014212A2; CA3165060C; MX2022008973A; KR20220121892A; US11835527B2; US20210223256A1; JP7342279B2

Abstract

método para determinar a estabilidade de uma proteína de interesse. a divulgação refere-se a métodos de análise de uma proteína de interesse modificada pós-tradução usando eletroforese, os métodos compreendendo a deglicosilação da proteína de interesse após a marcação.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de Patente Provisório dos EUA N° de Série 62/963.646 depositado em 21 de janeiro de 2020, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] A divulgação se refere aos campos da bioquímica, biologia molecular e análise de proteínas via eletroforese.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[003] O conteúdo do arquivo de texto enviado eletronicamente é aqui incorporado por referência em sua totalidade: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome do arquivo: REGE- 019-001WO_SeqList_ST25.txt, data de registro: 22 de dezembro de 2020, tamanho do arquivo de 1 kilobyte).

FUNDAMENTOS

[004] A eletroforese capilar (CE) e a eletroforese capilar baseada em microchip (MCE) são métodos analíticos comuns na indústria farmacêutica usados para caracterizar a integridade e pureza da proteína terapêutica com base no tamanho da proteína e fornecer controle de qualidade. Embora os métodos padrão de preparação de amostras recomendados pela indústria funcionem bem para muitas proteínas, proteínas fortemente glicosiladas são problemáticas devido à má separação e quantificação por CE e MCE. Além disso, picos parcialmente glicosilados e picos não glicosilados no perfil de MCE podem se sobrepor a picos de impureza e interferir na quantificação. Há, portanto, uma necessidade na técnica de métodos adicionais de preparação de amostras que possam superar os desafios de trabalhar com proteínas glicosiladas. Esta invenção fornece métodos para marcar proteínas fortemente glicosiladas que podem ser usadas para preparar proteínas para análise por métodos de eletroforese, como CE e MCE.

SUMÁRIO

[005] A divulgação fornece métodos de análise de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse, os métodos compreendendo desnaturação, marcação fluorescente, extinção e deglicosilação da amostra; em que as etapas de desnaturação, marcação e extinção ocorrem antes da deglicosilação. Os métodos de análise de uma amostra da divulgação podem reduzir ou eliminar picos de eletroferograma devido à endoglicosidase e podem reduzir a interferência de corante livre, fornecendo assim métodos rápidos, precisos e altamente reprodutíveis e de alto rendimento através dos quais as glicoproteínas podem ser analisadas.

[006] A divulgação fornece métodos de análise de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse, os métodos compreendendo: (a) desnaturar a amostra; (b) rotular a amostra com um marcador fluorescente para produzir uma amostra marcada; (c) extinção do marcador fluorescente que não reagiu na amostra marcada; (d) deglicosilar a amostra marcada com uma endoglicosidase; e (e) realizar eletroforese na amostra marcada; em que a amostra é desnaturada, marcada e extinta nas etapas (a) a (c) antes da deglicosilação na etapa (d).

[007] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a proteína de interesse compreende pelo menos um sítio de glicosilação. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína glicosilada. Em algumas modalidades, a proteína glicosilada compreende pelo menos um glicano ligado. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5% ou pelo menos 10% do peso total da proteína glicosilada compreende glicanos (10% p/p).

[008] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a proteína de interesse compreende um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um scFv. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende um domínio Fc. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende uma proteína de fusão do receptor. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor é uma proteína de fusão receptor-Fc ou uma proteína de fusão TCR-Fc solúvel. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor é uma proteína bloqueadora ou uma proteína mini bloqueadora. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína bloqueadora ou uma proteína mini bloqueadora. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína humana recombinante.

[009] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o sítio de glicosilação compreende uma sequência de consenso Asn-X-Ser/Thr. Em algumas modalidades, o pelo menos um glicano ligado é ligado a N. Em algumas modalidades, pelo menos um glicano ligado é N-ligado a uma asparagina na proteína glicosilada. Em algumas modalidades, a endoglicosidase catalisa a deglicosilação de glicanos ligados a N. Em algumas modalidades, a endoglicosidase é selecionada do grupo que consiste em Peptídeo-N-Glicosidase F (PNGase F), Endoglicosidase H (Endo H), Endoglicosidase S (Endo S), Endoglicosidase D, Endoglicosidase F1, Endoglicosidase F2 e Endoglicosidase F4. Em algumas modalidades, a endoglicosidase é PNGase F. Em algumas modalidades, a PNGase F é Rapid PNGase F. Em algumas modalidades, a Rapid PNGase F não é redutora. Em algumas modalidades, a PNGase F é redutora.

[0010] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a deglicosilação da amostra compreende o aquecimento da amostra a cerca de 35 °C por 30 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação da amostra compreende o aquecimento da amostra a cerca de 50 °C por entre 10 e 30 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação da amostra compreende o aquecimento da amostra a cerca de 50 °C por 10 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação da amostra compreende uma mistura de reação compreendendo entre 0,2 a 1,5 mg de proteína marcada de interesse e entre 1-5µL de Rapid PNGase F em um volume de reação de 10 µL, excluindo o volume de Rapid PNGase F. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende 0,2 mg de proteína marcada de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende 5 µL de Rapid PNGase F. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende um tampão.

[0011] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, pelo menos um glicano é um glicano ligado a O. Em algumas modalidades, a endoglicosidase catalisa a deglicosilação de glicanos ligados a O. Em algumas modalidades, a endoglicosidase compreende Endo-a-N- acetilgalactosamindase (O-glicosidase).

[0012] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, rotular a amostra com o rótulo fluorescente compreende aquecer a amostra a cerca de 35 °C por 10-30 minutos. Em algumas modalidades, rotular a amostra com o rótulo fluorescente compreende aquecer a amostra a cerca de 35 °C por 15 minutos.

[0013] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a amostra é desnaturada usando uma solução redutora. Em algumas modalidades, a solução redutora compreende ditiotreitol (DTT). Em algumas modalidades, a amostra é desnaturada usando uma solução não redutora. Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende iodoacetamida (IAM). Em algumas modalidades, desnaturar a amostra compreende aquecer a amostra entre 40 °C e 99 °C por entre 1 minuto e 5 horas. Em algumas modalidades, desnaturar a amostra compreende aquecer a amostra entre 50 °C e 99 °C por entre 1 a 60 minutos.

[0014] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a extinção do marcador fluorescente que não reagiu compreende a adição de uma solução de parada.

[0015] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, os métodos compreendem ainda a análise de um padrão de referência em paralelo à amostra.

[0016] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a eletroforese é selecionada do grupo que consiste em eletroforese em gel, focagem isoelétrica, eletroforese capilar (CE) ou eletroforese capilar de microchip (MCE). Em algumas modalidades, a eletroforese é MCE. Em algumas modalidades, o MCE é realizado usando um instrumento MCE.

[0017] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, os métodos resultam em interferência de corante livre reduzida na faixa inferior a 20 kDa e um pico de endoglicosidase reduzido ou ausente em um eletroferograma quando comparado a um eletroferograma gerado usando uma amostra marcada após a deglicosilação. Em algumas modalidades, o pico de endoglicosidase é reduzido em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% quando comparado a um eletroferograma gerado usando uma amostra marcada após a deglicosilação. Em algumas modalidades, o pico de endoglicosidase está ausente em um eletroferograma quando comparado a um eletroferograma gerado usando uma amostra marcada após a deglicosilação.

[0018] A divulgação fornece métodos para determinar a estabilidade de uma proteína de interesse compreendendo: (a) estressar uma amostra compreendendo a proteína de interesse; (b) desnaturar a amostra estressada e uma amostra não estressada compreendendo a proteína de interesse; (c) rotular a amostra estressada e a amostra não estressada com um marcador fluorescente para produzir uma amostra estressada marcada e uma amostra não estressada marcada; (d) extinção do marcador fluorescente que não reagiu na amostra marcada sob estresse e na amostra marcada não sob estresse; (e) deglicosilar a amostra estressada marcada e a amostra não estressada marcada com uma endoglicosidase; (f) realizar eletroforese capilar de microchip (MCE) na amostra estressada marcada e na amostra não estressada marcada para gerar eletroferogramas para a amostra estressada e a amostra não estressada; e (g) comparar os eletroferogramas da amostra estressada e da amostra não estressada, determinando assim a estabilidade da proteína de interesse; em que a amostra estressada e a amostra não estressada são desnaturadas, marcadas e extintas nas etapas (b) a (d) antes da deglicoslação na etapa (e).

[0019] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, estressar a amostra compreende estressar termicamente a amostra. Em algumas modalidades, estressar termicamente a amostra compreende manter a amostra entre cerca de 30 °C e cerca de 45 °C por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas ou pelo menos 8 semanas.

[0020] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a tensão da amostra compreende pelo menos um ciclo de congelamento/descongelamento.

[0021] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, enfatizar a amostra compreende expor a amostra a condições de armazenamento. Em algumas modalidades, as condições de armazenamento compreendem uma temperatura de cerca de -80 °C a -30 °C por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses ou pelo menos 30 meses. Em algumas modalidades, as condições de armazenamento compreendem uma temperatura de cerca de 2 °C a 8 °C por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 12 meses ou pelo menos 18 meses.

[0022] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, estressar a amostra compreende agitar mecanicamente a amostra.

[0023] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, enfatizar a amostra compreende liofilizar e reidratar a amostra.

[0024] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, enfatizar a amostra compreende expor a amostra à luz, radiação, espécies de oxigênio singlete, radicais livres, condições de pH alto ou condições de pH baixo.

[0025] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a proteína de interesse compreende pelo menos um sítio de glicosilação. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína glicosilada. Em algumas modalidades, a proteína glicosilada compreende pelo menos um glicano ligado. Em algumas modalidades, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5% ou pelo menos 10% do peso total da proteína glicosilada compreende glicanos (10% p/p). Em algumas modalidades, pelo menos 10% do peso total da proteína glicosilada compreende glicanos (10% p/p).

[0026] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a proteína de interesse compreende um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um scFv. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende um domínio Fc. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende uma proteína de fusão do receptor. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor é uma proteína de fusão receptor-Fc ou uma proteína de fusão TCR-Fc solúvel. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor é uma proteína bloqueadora ou uma proteína mini bloqueadora. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína bloqueadora ou uma proteína mini bloqueadora. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína humana recombinante.

[0027] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o sítio de glicosilação compreende uma sequência de consenso Asn-X-Ser/Thr. Em algumas modalidades, o pelo menos um glicano ligado é ligado a N. Em algumas modalidades, pelo menos um glicano ligado é N-ligado a uma asparagina na proteína glicosilada. Em algumas modalidades, a endoglicosidase catalisa a deglicosilação de glicanos ligados a N. Em algumas modalidades, a endoglicosidase é selecionada do grupo que consiste em Peptídeo-N-Glicosidase F (PNGase F), Endoglicosidase H (Endo H), Endoglicosidase S (Endo S), Endoglicosidase D, Endoglicosidase F1, Endoglicosidase F2 e Endoglicosidase F4. Em algumas modalidades, a endoglicosidase é PNGase F. Em algumas modalidades, a PNGase F é Rapid PNGase F. Em algumas modalidades, a Rapid PNGase F não é redutora. Em algumas modalidades, o Rapid PNGase F está reduzindo.

[0028] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a deglicosilação das amostras estressadas e não estressadas compreende aquecer as amostras a cerca de 35 °C por 30 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação das amostras estressadas e não estressadas compreende aquecer as amostras a cerca de 50 °C por entre 10 e 30 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação das amostras estressadas e não estressadas compreende aquecer as amostras a cerca de 50 °C por 10 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação das amostras estressadas e não estressadas compreende uma mistura de reação para cada amostra compreendendo entre 0,2-1,5 mg de proteína marcada de interesse e entre 1-5 µL Rapid PNGase F em um volume de reação de 10 µL excluindo o volume do Rapid PNGase F. Em algumas modalidades, a mistura de reação para cada uma das amostras estressadas e não estressadas compreende 5 µL de Rapid PNGase F. Em algumas modalidades, cada amostra estressada e não estressada compreende 0,2 mg de proteína marcada de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação para cada uma das amostras estressadas e não estressadas compreende um tampão.

[0029] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, pelo menos um glicano é um glicano ligado a O. Em algumas modalidades, a endoglicosidase catalisa a deglicosilação de glicanos ligados a O. Em algumas modalidades, a endoglicosidase compreende Endo-a-N- acetilgalactosamindase (O-glicosidase).

[0030] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, rotular as amostras estressadas e não estressadas com o rótulo fluorescente compreende aquecer cada amostra a cerca de 35 °C por 30 minutos.

[0031] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, as amostras estressadas e não estressadas são desnaturadas usando uma solução redutora. Em algumas modalidades, a solução redutora compreende ditiotreitol (DTT). Em algumas modalidades, as amostras estressadas e não estressadas são desnaturadas usando uma solução não redutora. Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende iodoacetamida (IAM). Em algumas modalidades, desnaturar as amostras estressadas e não estressadas compreende aquecer as amostras entre 40 °C e 99 °C por entre 1 minuto e 5 horas. Em algumas modalidades, desnaturar as amostras estressadas e não estressadas compreende aquecer as amostras entre 50 °C e 99 °C por entre 1 a 60 minutos.

[0032] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a extinção do marcador fluorescente que não reagiu compreende a adição de uma solução de parada.

[0033] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, os métodos compreendem ainda a análise de um padrão de referência em paralelo às amostras estressadas e não estressadas. Em algumas modalidades, comparar os eletroferogramas para as amostras estressadas e não estressadas compreende comparar o número de pico, altura, posição, área ou uma combinação dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0034] A FIG. 1 é um diagrama mostrando protocolos para o Método A, sem deglicosilação; Método B, deglicosilação antes da marcação; e Método C, deglicosilação após marcação. NR: não redutor, R: redutor, MC: eletroforese capilar de microchip.

[0035] A FIG. 2 é um eletroferograma gerado usando a Proteína 1 em condições não reduzidas, usando um protocolo sem deglicosilação (Método A, mostrado em vermelho) e um protocolo com deglicosilação antes da marcação da proteína (Método B, mostrado em azul). Os marcadores de pico numéricos indicam o peso molecular das proteínas conforme medido por eletroforese capilar de microchip (MCE). O pico Rapid PNGase F (PNGase) aparece no eletroferograma onde indicado.

[0036] A FIG. 3 mostra três eletroferogramas gerados usando a Proteína 1 sob condições não reduzidas usando o Método B (deglicosilação antes da marcação). As amostras de proteína 1 foram tratadas com estresse térmico antes da análise a 37 °C por nenhum tempo (0, vermelho, superior), 2 semanas (azul, meio) ou 4 semanas (preto, inferior). O pico de baixo peso molecular 1 (LMW 1) aumentou com o estresse e se fundiu com o pico PNGase.

[0037] A FIG. 4 é um eletroferograma gerado usando a Proteína 1 em condições redutoras, usando um protocolo sem deglicosilação (Método A, mostrado em vermelho) e um protocolo com deglicosilação antes da marcação da proteína (Método B, mostrado em azul). Os marcadores de pico numéricos indicam o peso molecular das proteínas conforme medido por MCE. O pico de PNGase F aparece no eletroferograma do método B, conforme indicado. A caixa sombreada cinza indica picos de corantes livres.

[0038] A FIG. 5 é um par de eletroferogramas gerados com a Proteína 1, em que a Proteína 1 foi deglicosilada após marcação (Método C). Topo: a reação de deglicosilação foi realizada com 1 µL de Rapid™ PNGase, a 50 °C, por 10, 15, 20 e 30 minutos. Base: a reação de deglicosilação foi realizada com 2 µL RapidTM PNGase, a 50 °C, por 10, 15, 20 e 30 minutos.

[0039] A FIG. 6 é um eletroferograma gerado usando o Método C e a Proteína 1, mostrando os resultados da deglicosilação com 1, 2, 3 ou 4 µL de RapidTM PNGase F em reação mantida a 50 °C, por 10 minutos. A inserção mostra o pico da proteína 1 deglicosilada incompletamente (ombro da mão direita até o pico principal), com a seta indicando uma redução na proteína glicosilada com quantidades aumentadas de RapidTM PNGase. Os picos de corantes livres são indicados pela caixa sombreada em cinza. MP, pico principal; LMW 1, pico de baixo peso molecular 1.

[0040] A FIG. 7 é uma série de quatro eletroferogramas gerados usando o Método C (deglicosilação após marcação) e Proteína 1, que foi deglicosilada com 1, 2, 3 ou 4 µL de RapidTM PNGase (de cima para baixo). São indicados picos de baixo peso molecular (LMW) 1-5, pico principal (MP) e pico de alto peso molecular (HMW).

[0041] A FIG. 8 é um eletroferograma gerado a partir do Método C (deglicosilação após marcação) usando Proteína 1 que foi estressada termicamente mantendo a proteína a 37 °C por 4 semanas (37C 4w, Preto) e Proteína 1 não estressada (t = 0, Vermelho). A deglicosilação foi realizada usando RapidTM PNGase F.

[0042] A FIG. 9 é um eletroferograma gerado usando a Proteína 2, que compara a Proteína 2 marcada com deglicosilação (Método C) e sem deglicosilação (Método A), sob condições não reduzidas. A PNGase F tem um tamanho esperado de 37 KDa, e esse pico não está presente. Os picos de corantes livres são indicados pela caixa sombreada.

[0043] A FIG. 10 é um eletroferograma gerado usando a Proteína 3, que compara a Proteína 3 tratada com deglicosilação após marcação (azul, Método C) e sem tratamento de deglicosilação (vermelho, Método A), sob condições não reduzidas. Os marcadores numéricos de pico indicam o peso molecular de proteínas e fragmentos de proteínas medidos por MCE.

[0044] A FIG. 11 é um eletroferograma comparando a Proteína 3, que foi tratada com deglicosilação após marcação (azul, Método C) e sem deglicosilação (vermelho, Método A), sob condições reduzidas. Os marcadores numéricos de pico indicam o peso molecular de proteínas e fragmentos de proteínas medidos por MCE.

[0045] A FIG. 12 é um eletroferograma comparando a Proteína 4 sem deglicosilação (Método A, vermelho) e deglicosilada após marcação (Método C, azul). A proteína 4 foi desnaturada usando condições não redutoras (NR). Os marcadores de pico numéricos indicam o peso molecular medido por MCE. LMW: baixo peso molecular; DGMP: Pico Principal Deglicosilado; BPF: Pico Principal Glicosilado. Os picos de corantes livres são indicados pela caixa sombreada.

[0046] A FIG. 13 é um eletroferograma comparando a Proteína 4 marcada sem deglicosilação (Método A, vermelho) e deglicosilada após marcação (Método C, azul). A proteína 4 foi desnaturada usando condições redutoras (R). LC: Cadeia Leve; DHC: Cadeia Pesada Deglicosilada; GHC: Cadeia Pesada Glicosilada. Os picos de corantes livres são indicados pela caixa sombreada.

[0047] A FIG. 14 mostra três eletroferogramas ensaiando o efeito do foto-estresse na estabilidade de proteínas que foram geradas sob condições não reduzidas, usando o Método C e a Proteína 1. A proteína 1 foi fotoestressada sob luz de lâmpada fluorescente branca fria (CW) com exposição acumulada de 1,2 milhão de horas lux (MLH) (azul, meio) e exposição acumulativa de 2,4 MLH (preto, inferior) e comparada à proteína 1 não estressada (topo vermelho). A deglicosilação foi realizada usando RapidTM PNGase F. LMW: baixo peso molecular; MP: pico principal; HMW: alto peso molecular.

[0048] A FIG. 15 mostra três eletroferogramas ensaiando o efeito do foto-estresse na estabilidade de proteínas que foram geradas sob condições não reduzidas, usando o Método C e a Proteína 1. A proteína 1 foi fotoestressada sob energia ultravioleta próxima (UVA) integrada de 200 watts/metro quadrado (azul, meio) e 400 watts/metro quadrado (preto, inferior) e comparada com a proteína 1 não estressada (vermelho, topo). A deglicosilação foi feita com RapidTM PNGase F.LMW: baixo peso molecular; MP: pico principal; HMW: alto peso molecular.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0049] A presente divulgação fornece novos métodos para preparar uma amostra compreendendo uma proteína de interesse para análise via eletroforese. Nos métodos fornecidos neste documento, a proteína de interesse é desnaturada, seguida de marcação covalente da proteína usando um corante fluorescente e, posteriormente, extinguindo a reação de marcação. Após a marcação, a proteína marcada é colocada em contato com uma enzima como uma endoglicosidase para remover glicanos da proteína de interesse sem purificação adicional. Ao contrário dos métodos anteriores de preparação de proteínas glicosiladas para eletroforese, que deglicosilam as proteínas antes da marcação, os métodos descritos neste documento permitem a separação clara de proteínas e espécies peptídicas com base na massa. Esses métodos também eliminam a interferência da enzima usada na deglicosilação e o corante livre da reação de marcação, em eletroferogramas de eletroforese de microchip (MCE). Os métodos são rápidos, altamente reprodutíveis e de alto rendimento, e têm sido usados com sucesso para analisar proteínas glicosiladas. Sem querer ficar limitado pela teoria, pensa-se que os métodos aqui descritos são vantajosos em relação a proteínas fortemente glicosiladas, pois a glicosilação pesada interfere na migração da proteína nas plataformas de análise de MCE ou eletroforese capilar (CE), resultando em medições incorretas de peso molecular da proteína e picos de eletroferograma imprecisos. Os métodos descritos neste documento podem ser usados em uma abordagem de plataforma que é aplicável a quaisquer proteínas glicosiladas analisadas por métodos como CE e MCE e para caracterizar as proteínas ou para fins de controle de qualidade. Por exemplo, os métodos descritos neste documento podem ser usados para medir a estabilidade de uma proteína de interesse quando submetida a várias condições, como tempos de retenção prolongados em várias temperaturas ou diferentes formulações.

[0050] Por conseguinte, a divulgação fornece métodos de preparação de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse para análise usando eletroforese, compreendendo (a) desnaturar a amostra; (b) rotular a amostra com um marcador fluorescente para produzir uma amostra marcada; (c) extinção do marcador fluorescente que não reagiu na amostra marcada; (d) deglicosilar a amostra marcada com uma endoglicosidase; e (e) realizar eletroforese na amostra marcada; em que a amostra é marcada e extinta nas etapas (b) e (c) antes da deglicosilação na etapa (d). Em algumas modalidades, a eletroforese é eletroforese capilar de microchip (MCE) e a saída é um eletroferograma.

Definições

[0051] O uso dos termos "um", "uma", "o/a" e referentes semelhantes no contexto da descrição da invenção presentemente reivindicada (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser interpretados para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contrariado pelo contexto.

[0052] A recitação de intervalos de valores neste documento destina- se apenas a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que caia dentro do intervalo, a menos que indicado de outra forma neste documento, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado neste documento.

[0053] O uso do termo “cerca de” destina-se a descrever valores acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/-10%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor indicado em uma faixa de aprox. +/-5%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor indicado em uma faixa de aprox. +/-2%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor indicado em uma faixa de aprox. +/-1%. Os intervalos anteriores se destinam a tornar-se claros através do contexto, e nenhuma outra limitação é implícita.

[0054] Conforme usado neste documento, "proteína"refere-se a uma molécula compreendendo dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos entre si por uma ligação peptídica. As proteínas incluem polipeptídeos e peptídeos, e também podem incluir modificações, tais como glicosilação, ligação lipídica, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, alquilação, hidroxilação e ADP-ribosilação. As proteínas podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo fármacos à base de proteína, e proteínas incluem, entre outras coisas, enzimas, ligantes, receptores, anticorpos e proteínas quimérica ou de fusão. As proteínas são produzidas por vários tipos de células recombinantes usando métodos de cultura de células bem conhecidos e geralmente são introduzidas na célula por técnicas de engenharia genética (por exemplo, como uma sequência que codifica uma proteína quimérica ou uma sequência otimizada por códon, uma sequência sem intron, etc.), onde pode residir como um epissoma ou ser integrado ao genoma da célula.

[0055] Todos os métodos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma neste documento ou de outra forma contradito de forma clara pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") aqui fornecido, destina-se apenas a esclarecer melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[0056] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Desnaturação

[0057] A divulgação fornece métodos de desnaturação de uma proteína de interesse em uma amostra. A desnaturação de proteínas envolve a ruptura de estruturas proteicas secundárias e terciárias em condições insuficientes para romper as ligações peptídicas, deixando a estrutura primária intacta.

[0058] Os métodos de desnaturação de uma proteína de interesse sob condições redutoras e não redutoras estão dentro do escopo da divulgação.

[0059] Um agente redutor de proteína é um agente que rompe as ligações dissulfeto. Essas ligações dissulfeto podem estar dentro de um único polipeptídeo ou entre múltiplas subunidades de uma proteína codificada em polipeptídeo separado. A ruptura de ligações dissulfeto entre subunidades permite que a análise das subunidades individuais de uma proteína multi- subunidade seja analisada individualmente. Os agentes redutores serão conhecidos dos versados na técnica. Agentes redutores exemplares incluem. mas não estão limitados a, ditiotreitol (DTT, CAS 3483-12-3), beta- mercaptoetanol (BME, 2BME, 2-ME, b-mer, CAS 60-24-2), 2-aminoetanotiol (2-MEA-HCl, também chamado de cisteamina-HCl, CAS 156-57-0), cloridrato de tris (2-carboxietil) fosfina, (TCEP, CAS 5961-85-3), cloridrato de cisteína (Cys-HCl, CAS 52-89-1), ou sal de sódio do ácido 2- mercaptoetanossulfônico (MESNA). Outros métodos para reduzir as ligações proteicas são conhecidos na técnica, tais como uma coluna redutora imobilizada que contém resina à qual um agente redutor à base de tiol foi imobilizado para permitir a redução em fase sólida de ligações peptídicas e dissulfeto de proteína. Agentes redutores, incluindo agentes oxidantes, são adequados para reduzir a interação química entre polipeptídeos.

[0060] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é desnaturada usando uma solução redutora. Em algumas modalidades, a solução redutora contém 135 a 155 mM de ditiotreitol (DTT). Em algumas modalidades, a solução redutora compreende ainda fosfato de sódio e dodecil sulfato de lítio. Em algumas modalidades, a solução redutora compreende ou consiste essencialmente em 0,69% de dodecil sulfato de lítio (LDS), 69 mM de fosfato de sódio e 142 mM de ditiotreitol. Em algumas modalidades, a solução redutora contém 40-120 mM de DTT, 40-80 mM de fosfato de sódio e 0,5% a 2,0% de LDS. Em algumas modalidades, a solução redutora contém 60-100 mM de DTT, 50-70 mM de fosfato de sódio e 0,75% a 1,5% de LDS. Em algumas modalidades, a solução redutora contém cerca de 80 mM de DTT, cerca de 60 mM de fosfato de sódio e cerca de 1,2% de LDS. Em algumas modalidades, a solução redutora é adicionada à amostra compreendendo a proteína de interesse em uma razão de cerca de 1:4 em volume.

[0061] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é desnaturada usando uma solução não redutora, ou seja, sob condições que preservam as ligações dissulfeto na proteína de interesse. Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende iodoacetamida (IAM). Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende entre 100 e 200 mM de iodoacetamida. Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende ainda fosfato de sódio e dodecil sulfato de lítio (LDS). Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende 166 mM de iodoacetamida (IAM). Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende, ou consiste essencialmente em 166 mM de iodoacetamida, 0,81% de dodecil sulfato de lítio e 81 mM de fosfato de sódio. Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende 100 a 300 mM de iodoacetamida, 40-80 mM de fosfato de sódio e 0,5% a 2,0% de LDS. Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende 150 a 250 mM de iodoacetamida, 50-70 mM de fosfato de sódio e 0,75% a 1,5% de LDS. Em algumas modalidades, a solução não redutora compreende cerca de 200 mM de iodoacetamida, cerca de 60 mM de fosfato de sódio e cerca de 1,2% de LDS. Em algumas modalidades, a solução não redutora é adicionada à amostra compreendendo a proteína de interesse em uma razão de cerca de 1:4 em volume.

[0062] Em algumas modalidades, desnaturar a amostra compreende adicionar uma solução redutora ou não redutora à amostra e aquecer a amostra combinada e a solução redutora ou não redutora. Em algumas modalidades, a amostra é desnaturada por calor. Por exemplo, a amostra combinada e a solução redutora ou não redutora podem ser aquecidas entre 30 °C e 99 °C, entre 30 °C e 90 °C, entre 30 °C e 80 °C, entre 30 °C e 70 °C, entre 30 °C e 60 °C, entre 30 °C e 50 °C, entre 30 °C e 40 °C, entre 40 °C e 99 °C, entre 40 °C e 90 °C, entre 40 °C e 80 °C, entre 40 °C e 70 °C, entre 40 °C e 60 °C, entre 40 °C e 50 °C, entre 50 °C e 99 °C, entre 50 °C e 90 °C, entre 50 °C e 80 °C, entre 50 °C e 70 °C, ou entre 50 °C e 60 °C. Em algumas modalidades, a amostra combinada e a solução redutora ou não redutora podem ser aquecidas entre 1 minuto e 12 horas, entre 1 minuto e 10 horas, entre 1 minuto e 5 horas, entre 1 minuto e 4 horas, entre 1 minuto e 3 horas, entre 1 minuto e 2 horas, entre 1 minuto e 60 minutos, entre 1 minuto e 30 minutos, entre 1 minuto e 15 minutos, entre 1 minuto e 10 minutos, entre 1 minuto e 5 minutos, entre 5 minutos e 60 minutos dócil, entre 5 minutos e 30 minutos, entre 5 minutos e 15 minutos, entre 5 minutos e 10 minutos, entre 10 minutos e 60 minutos, entre 10 e 45 minutos, entre 10 minutos e 30 minutos, ou entre 10 minutos e 15 minutos. Em algumas modalidades, a amostra combinada e a solução redutora ou não redutora podem ser aquecidas entre 40 °C e 99 °C por entre 1 minuto e 60 minutos. Em algumas modalidades, a amostra combinada e a solução redutora ou não redutora podem ser aquecidas entre 50 °C e 99 °C por entre 1 minuto e 60 minutos. Como outro exemplo, a amostra combinada e a solução redutora ou não redutora podem ser aquecidas entre 60 °C e 85 °C por entre 5 a 30 minutos. Alternativamente, a amostra combinada e a solução redutora ou não redutora podem ser aquecidas a 75 °C por 10 minutos. Em algumas modalidades, a amostra combinada e a solução redutora ou não redutora são aquecidas a 70 °C por 10 minutos.

Deglicosilação

[0063] A divulgação fornece métodos de deglicosilação de uma proteína de interesse em uma amostra. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é deglicosilada após ser marcada com um marcador fluorescente usando os métodos descritos neste documento. A deglicosilação pode ser realizada usando uma enzima como uma endoglicosidase.

[0064] As glicoproteínas são proteínas que contêm cadeias de oligossacarídeos (glicanos) ligadas covalentemente a cadeias laterais de aminoácidos. Essas cadeias de oligossacarídeos estão ligadas à proteína em uma modificação cotranslacional ou pós-translacional.

[0065] Conforme usado neste documento, o termo "glicano" às vezes usado de forma intercambiável com "polissacarídeo” e “oligossacarídeo” refere-se a um composto que compreende ou consiste em monossacarídeos ligados glicosidicamente. O termo glicano também pode ser usado para se referir a um carboidrato ligado a uma glicoproteína ou glicolipídio, mesmo que o carboidrato seja um monossacarídeo. Os glicanos podem compreender ligações O-glicosídicas de monossacarídeos. Os glicanos podem ser homo ou heteropolímeros de monossacarídeos e podem ser lineares ou ramificados. Os glicanos exemplares podem compreender monômeros de manose, N- acetilglicosamina (GlcNAc), ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc), galactose, ácido siálico e fucose, entre outros.

[0066] Os glicanos podem ser ligados a uma proteína de interesse através de ligações N ou ligações O, e uma proteína de interesse pode compreender glicanos ligados em N, glicanos ligados em O ou uma combinação de glicanos ligados em N e ligados em O. Conforme referido neste documento, "glicanos ligados a N" ou "glicosilação ligada a N" refere- se à ligação de um monômero de açúcar ou polissacarídeo a um átomo de nitrogênio, tal como o nitrogênio amida de um aminoácido asparagina (Asn) de uma proteína. Tal como aqui utilizado, "glicanos ligados a O" ou "glicosilação ligada a O" refere-se à ligação de um monômero de açúcar ou polissacarídeo ao átomo de oxigênio de um aminoácido serina (Ser) ou treonina (Thr) de uma proteína. Glicanos ligados a O exemplares incluem, mas não estão limitados a, ON-acetilgalactosamina (O-GalNAc), ON- acetilglucosamina (O-GlcNAc), O-Manose, O-Galactose, O-Fucose e O- Glucose.

[0067] As endoglicosidases são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas internas em oligossacarídeos. Quando os oligossacarídeos fazem parte de uma glicoproteína, os oligossacarídeos são assim liberados da glicoproteína.

[0068] Conforme usado neste documento, uma "endoglicosidase" refere-se a uma enzima que libera glicanos de glicoproteínas ou glicolipídios. As endoglicosidases podem clivar alterações de polissacarídeos entre resíduos que não são o resíduo terminal e, portanto, são capazes de liberar carboidratos de cadeia longa de seus conjugados de proteínas cognatas. Endoglicosidases exemplares incluem, mas não estão limitadas a, Peptídeo-N-Glicosidase F (PNGase F), Endoglicosidase H (Endo H), Endoglicosidase S (Endo S). Endoglicosidase D, Endoglicosidase F1, Endoglicosidase F2, Endoglicosidase F3, O-glicosidase e Endo-ß-Galactosidase.

[0069] Em algumas modalidades, a endoglicosidase catalisa a deglicosilação de glicanos ligados a N. Exemplos de endoglicosidases que visam glicanos ligados a N incluem, mas não estão limitados a, Peptídeo-N- Glicosidase F (PNGase F), Endoglicosidase H (Endo H), Endoglicosidase S (Endo S), Endoglicosidase D, Endoglicosidase F1, Endoglicosidase F2 e Endoglicosidase F4. Em algumas modalidades, por exemplo, aquelas modalidades em que a proteína de interesse compreende glicanos ligados a N, a endoglicosidase é PNGase F.

[0070] Em algumas modalidades, a endoglicosidase catalisa a deglicosilação de glicanos ligados a O. Exemplos de endoglicosidases que visam glicanos ligados a O incluem, mas não estão limitados a, Endo-a-N- Acetilgalactosaminidase (O-glicosidase).

[0071] Em algumas modalidades, a endoglicosidase é PNGAse F. PNGase F é uma amidase que cliva entre os resíduos mais internos de N- Acetil-D-Glucosamina (GlcNAc) e asparagina de oligossacarídeos de alta manose, híbridos e complexos em glicoproteínas ligadas a N. Em algumas modalidades, a PNGase F é recombinante. Em algumas modalidades, a PNGase F é RapidTM PNGase F. RapidTM PNGase F é conhecida na técnica e está disponível na New England Biolabs e outros fornecedores. Em algumas modalidades, a RapidTM PNGase F está em um formato não redutor que preserva as ligações dissulfeto na proteína de interesse. Em algumas modalidades, a RapidTM PNGase F está em um formato redutor que não preserva ligações dissulfeto na proteína de interesse.

[0072] Em algumas modalidades, a deglicosilação da amostra compreende uma mistura de reação compreendendo entre 0,1 e 3,0 mg de proteína marcada de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende entre 0,1 e 2,0 mg de proteína marcada de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende entre 0,1 e 1,5 mg de proteína de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende entre 0,5 e 1,5 mg de proteína de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende 0,2 mg de proteína marcada de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende entre 1 e 7 µL de Rapid™ PNGase F em um volume de reação de 10 µL, excluindo o volume da enzima. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende entre 1 e 5 µL de RapidTM PNGase F em um volume de reação de 10 µL, excluindo o volume da enzima. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende 1 µL, 2 µL, 3 µL, 4 µL, 5 µL, 6 µL ou 7 µL de RapidTM PNGase F adicionada a um volume de 10 µL compreendendo a proteína marcada de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende 5 µL de RapidTM PNGase F em um volume de reação de 10 µL, excluindo o volume da enzima. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende 5 µL de RapidTM PNGase F adicionada a um volume de 10 µL compreendendo a proteína marcada de interesse. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende um tampão adicional, por exemplo, um tampão de reação que facilita a ação da enzima PNGase F. Em algumas modalidades, a mistura de reação não compreende um tampão adicional.

[0073] Em algumas modalidades, por exemplo, aquelas modalidades em que a endoglicosidase é PNGase F, a deglicosilação da amostra compreende o aquecimento da amostra a 25 °C a 65 °C por entre 100 e 60 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação da amostra compreende o aquecimento da amostra a 30 °C a 50 °C por entre 20 e 40 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação da amostra compreende o aquecimento da amostra a 35 °C por 30 minutos.

[0074] Em algumas modalidades, por exemplo, aquelas modalidades em que a endoglicosidase é RapidTM PNGase F, a deglicosilação da amostra compreende o aquecimento da amostra a 50 °C por entre 10 e 30 minutos. Em algumas modalidades, a deglicosilação da amostra compreende o aquecimento da amostra a 50 °C por 10 minutos.

Marcação de Proteínas

[0075] A divulgação fornece métodos de marcação de proteínas de interesse. Em algumas modalidades, as proteínas de interesse são marcadas antes da deglicosilação. Em algumas modalidades, as proteínas de interesse são marcadas com um marcador fluorescente, como um corante fluorescente. Qualquer marcador adequado é considerado dentro do escopo da divulgação.

[0076] Conforme usado neste documento, "marcador detectável" ou "marcador" refere-se a um produto químico usado para facilitar a identificação e/ou quantificação de uma substância alvo, como uma proteína de interesse. Marcadores ilustrativos incluem rótulos que podem ser observados ou medidos diretamente ou observados ou medidos indiretamente. Esses marcadores incluem, mas não estão limitados a, radiomarcadores que podem ser medidos com dispositivos de contagem de radiação; pigmentos, corantes ou outros cromógenos que podem ser observados visualmente ou medidos com um espectrofotômetro; marcadores quimioluminescentes que podem ser medidos por um instrumento baseado em fotomultiplicador ou filme fotográfico, marcador de spin que podem ser medidos com um analisador de marcador de spin; e porções fluorescentes, onde o sinal de saída é gerado pela excitação de um aduto molecular adequado e que pode ser visualizado por excitação com luz que é absorvida pelo corante ou pode ser medido com fluorômetros padrão ou sistemas de imagem. O marcador pode ser uma substância luminescente, como um fósforo ou fluorogênio; uma substância bioluminescente; uma substância quimioluminescente, em que o sinal de saída é gerado por modificação química do composto sinal; uma substância contendo metal; ou uma enzima, onde ocorre uma geração secundária de sinal dependente da enzima, tal como a formação de um produto colorido a partir de um substrato incolor ou um produto quimioluminescente espontâneo a partir de um precursor adequado. O termo marcador também pode se referir a uma "etiqueta" ou hapteno que pode se ligar seletivamente a uma molécula marcada, de modo que a molécula marcada, quando adicionada posteriormente, seja usada para gerar um sinal detectável.

[0077] Numerosos marcadores são conhecidos pelos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a, micropartículas, corantes fluorescentes, haptenos, enzimas e seus substratos cromogênicos, fluorogênicos e quimioluminescentes e outros marcadores que são descritos no Molecular Probes Handbook Of Fluorescent Probes E Research Chemicals por Richard P. Haugland, 6a Ed., (1996), e suas atualizações subsequentes da 7a e 8a edição lançadas em CD Rom em novembro de 1999 e maio de 2001, respectivamente, cujos conteúdos são incorporados por referência, e em outras fontes publicadas.

[0078] Etiquetas fluorescentes exemplares incluem, mas não estão limitadas a corantes fluorescentes. Conforme usado neste documento, “corante fluorescente refere-se a moléculas não proteicas que absorvem luz e a emitem em um comprimento de onda maior. Corantes fluorescentes exemplares incluem, mas não estão limitados a corantes Alexa Fluor®, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), fluores DyLight, corantes Cy, IRDyes, corantes HiLyte, corantes cumarínicos sulfonados e/ou peguilados, corantes xantenos sulfonados e/ou peguilados, corantes cianina sulfonados ou/peguilados e corantes de pireno sulfonados e/ou peguilados.

[0079] Uma etiqueta detectável adicional inclui, mas não está limitada a Dyomics DY-631 NHS Ester. Outros marcadores detectáveis que podem ser usados incluem outros corantes, fluoróforos, cromóforos, marcadores de massa, pontos quânticos e semelhantes, e os divulgados na Patente dos EUA n° 6.924.372, que é incorporada por referência em sua totalidade.

[0080] Etiquetas fluorescentes exemplares também incluem, mas não estão limitadas a, fluoróforos biológicos, como proteína fluorescente verde, e cristais em nanoescala, como pontos quânticos.

[0081] Uma outra etiqueta fluorescente exemplar está disponível na Perkin Elmer como parte do Kit de Reagentes de Proteína Pico (também referido como Kit de Reagentes de Ensaio de Proteínas Pico, número de peça 760498). Em algumas modalidades, a etiqueta fluorescente compreende o corante de marcação Perkin Elmer Pico. Em algumas modalidades, a marcação da proteína de interesse compreende a adição de uma solução de corante Pico 4-20 µM a uma amostra compreendendo uma proteína de interesse em uma razão de cerca de 1:1 em volume. Em algumas modalidades, a marcação da proteína de interesse compreende a adição de uma solução de corante Pico 4 µM, 5 µM, 6 µM, 10 µM, 12 µM, 14 µM, 15 µM, 16 µM, 18 µM, 20 µM ou 25 µM a uma amostra compreendendo uma proteína de interesse. Em algumas modalidades, a solução de corante Pico é adicionada à amostra compreendendo a proteína de interesse em uma razão de cerca de 1:5 corante sobre amostra por volume, 1:4 corante sobre amostra por volume, 1:3 corante sobre amostra por volume, 1:2 corante sobre amostrar por volume 1:1 por volume, 2:1 corante sobre amostrar por volume, 3:1 corante sobre amostrar por volume, 4:1 corante sobre amostrar por volume ou 5:1 corante sobre amostrar por volume. Em algumas modalidades, a marcação da proteína de interesse compreende a adição de uma solução de corante Pico de 16 µM a uma amostra compreendendo uma proteína de interesse em uma razão de cerca de 1:1 em volume. Em algumas modalidades, os métodos compreendem e aquecem a amostra e o corante.

[0082] Em algumas modalidades, o marcador fluorescente, ou corante, é covalentemente ligado à proteína de interesse. Em algumas modalidades, o marcador fluorescente compreende um grupo reativo a amina e está ligado covalentemente a aminas livres na proteína de interesse. Em algumas modalidades, o marcador é ligado de forma não covalente à proteína de interesse por meio de uma interação de alta afinidade.

[0083] Kits adequados adicionais para rotulagem de proteínas serão conhecidos dos versados na técnica. Os kits exemplares incluem, mas não estão limitados ao Kit de rotulagem de anticorpos/proteínas-FITC da MedChemExpress e os kits de conjugação Alexa Fluor® (rápidos).

[0084] Qualquer marcador fluorescente ligado covalentemente e quaisquer métodos de fixação do marcador fluorescente são considerados como dentro do escopo dos presentes métodos.

[0085] Em algumas modalidades, a amostra e o corante são aquecidos entre cerca de 30 °C e 40 °C por cerca de 5 a 40 minutos. Em algumas modalidades, a amostra e o corante são aquecidos entre cerca de 30 °C e 40 °C por cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 25 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 35 minutos ou cerca de 40 minutos. Em algumas modalidades, a amostra e o corante são aquecidos a cerca de 35 °C por cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 25 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 35 minutos ou cerca de 40 minutos. Em algumas modalidades, a amostra e o rótulo são aquecidos a cerca de 35 °C por cerca de 15 minutos. Esta etapa de aquecimento pode produzir uma amostra compreendendo uma proteína de interesse marcada e desnaturada. O marcador em excesso pode ser removido opcionalmente da amostra, por exemplo, usando um filtro giratório.

[0086] Em algumas modalidades, a reação de marcação é interrompida antes da reação de deglicosilação (extinção). Por exemplo, naquelas modalidades em que o marcador fluorescente é o corante de marcação Perkin Elmer Pico, a reação de marcação pode ser interrompida pela adição de um volume igual de tampão de parada Perkin Elmer Pico à reação de marcação. Em algumas modalidades, a reação de marcação é extinta pela adição de 5 µL, 6 µL, 7 µL, 8 µL, 9 µL, 10 µL, 11 µL, 12 µL, 13 µL, 14 µL, 15 µL, 16 µL, 17 µL, 18 µL, 19 µL ou 20 µL de uma solução de parada apropriada para a reação de marcação. Em algumas modalidades, o corante é um corante de marcação Perkin Elmer Pico e a reação de marcação é extinta pela adição de 5 µL de solução de parada Perkin Elmer Pico à reação de marcação. Outros tampões de parada exemplificativos, por exemplo, quando o marcador compreende um corante fluorescente reativo a aminas, incluem hidroxilamina 1,5 M, pH 8,5. Aquele versado na técnica será capaz de selecionar um tampão de parada apropriado para várias reações de marcação de corante. Sem querer ficar limitado pela teoria, pensa-se que a extinção da reação de marcação previne a marcação da enzima endoglicosidase utilizada para os passos de deglicosilação subsequentes. Isso evita ou reduz um pico de endoglicosidase marcada no eletroferograma usado para visualizar a amostra marcada.

Proteína de Interesse

[0087] A divulgação fornece métodos de preparação de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse para análise usando eletroforese. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é glicosilada. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a marcação da proteína de interesse, seguida de deglicosilação.

[0088] Todas as proteínas de interesse compreendendo modificações pós-translacionais, como glicosilação ligada a N ou ligada a O, são consideradas dentro do escopo da divulgação. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína terapêutica, tal como um anticorpo terapêutico, que pode ser um medicamento, um medicamento formulado ou um medicamento.

[0089] Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um fragmento variável de cadeia simples (scFv). Em algumas modalidades, a proteína de interesse é um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um scFv.

[0090] Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende uma proteína humana recombinante. Por exemplo, a proteína de interesse pode compreender um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo, ou um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo.

[0091] Conforme usado neste documento, "anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina que consiste em quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada possui uma região variável de cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada contém três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve possui um domínio variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve consiste em um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo "anticorpo" inclui referência a imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse. O termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. O termo anticorpo também inclui anticorpo biespecífico, que inclui uma imunoglobulina heterotetramérica que pode se ligar a mais de um epítopo diferente. Os anticorpos biespecíficos são geralmente descritos na Patente dos EUA no 8.586.713, que é incorporada por referência neste pedido.

[0092] O termo "porção de ligação ao antígeno"de um anticorpo (ou "fragmento de anticorpo") refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo "porção de ligação ao antígeno"de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), que consiste em um domínio VH, (vi) uma CDR isolada e (vii) um scFv, que consiste nos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, unidos por um ligante sintético para formar uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpos, também estão abrangidas pelo termo "anticorpo" (ver, por exemplo, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1 121 -1 123).

[0093] Além disso, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo pode ser parte de uma molécula de imunoadesão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso da região central de estreptavidina para fazer uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e o uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e um marcador terminal C de poli-histidina para produzir moléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Porções de anticorpo, tais como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas a partir de anticorpos inteiros usando técnicas convencionais, tais como via digestão de anticorpos inteiros por papaína ou pepsina. Além disso, anticorpos, porções de anticorpos e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas padrão de DNA recombinante comumente conhecidas na técnica (ver Sambrook et al., 1989).

[0094] O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e em particular na CDR3.

[0095] O termo "anticorpo humanizado", conforme usado neste documento, inclui anticorpos nos quais as sequências CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas ou modificadas de outra forma para aumentar sua semelhança com as variantes de anticorpos produzidas naturalmente em humanos.

[0096] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-Morte Celular Programada 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD1 conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA. Pub. No US2015/0203579A1), uma célula antiprogramada Death Ligand-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA. Pub. No US2015/0203580A1), um anticorpo anti-D114, um anticorpo anti-Angiopoetina-2 (por exemplo, um anti-ANG2 como descrito na Patente dos EUA No 9.402.898), um anticorpo anti-Angiopoetina-Semelhante 3 (por exemplo, um anticorpo anti-AngPt13 como descrito na Patente dos EUA No 9.018.356), um anticorpo anti-receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (por exemplo, um anticorpo anti-PDGFR como descrito na Patente dos EUA No 9.265.827), um anticorpo anti-Erb3, um anticorpo anti-Receptor de Prolactina (por exemplo, anticorpo anti-PRLR como descrito na Patente dos EUA No 9.302.015), um anticorpo anti-Complemento 5 (por exemplo, um anticorpo anti-CS como descrito no Pedido de Patente dos EUA. Pub. No US2015/0313194A1), um anticorpo anti-TNF, um anticorpo anti-receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, uma formiga anticorpo i-EGFR como descrito na Pat. 9.132.192 ou um anticorpo anti- EGFRvIII como descrito na Patente dos EUA Aplic. Bar. US2015/0259423A1), um anticorpo anti-Proprotein Convertase Subtilisin Kexin-9 (por exemplo, um anticorpo anti-PCSK9 como descrito na Patente dos EUA No 8.062.640 ou Patente dos EUA No 9.540.449), um Fator Anti- Crescimento e Diferenciação 8 (por exemplo, um anticorpo anti-GDF8, também conhecido como anticorpo anti-miostatina, conforme descrito nas Patentes dos EUA 8.871.209 ou 9.260.515), um receptor anti-Glucagon (por exemplo, anticorpo anti-GCGR como descrito na Patente dos EUA Appln. Pub. Nos US2015/0337045A1 ou US2016/0075778A1), um anticorpo anti- VEGF, um anticorpo anti-IL1R, um anticorpo receptor de interleucina 4 (por exemplo, um anticorpo anti-IL4R como descrito no Pedido de Patente dos EUA. Pub. No US2014/0271681A1 ou Pat dos EUA Nos. 8.735.095 ou 8.945.559), um anticorpo anti-receptor de interleucina 6 (por exemplo, um anticorpo anti-IL6R como descrito nas Pat. dos EUA Nos 7.582.298, 8.043.617 ou 9.173.880), um anticorpo anti-IL1, um anticorpo anti-IL2, um anticorpo anti-IL3, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti-IL5, um anticorpo anti-IL6, um anticorpo anti-IL7, um anti-interleucina 33 (por exemplo, anticorpo anti-IL33 como descrito na Patente dos EUA 9.453.072 ou 9.637.535), um anticorpo anti-vírus sincicial respiratório (por exemplo, anticorpo anti-RSV como descrito no Pedido de Patente dos EUA. Pub. No 9.447.173), um anti-Cluster de diferenciação 3 (por exemplo, um anti-CD3 anticorpo, conforme descrito nas Patentes dos EUA Nos 9.447.173 e 9.447.173, e no Pedido dos EUA No 62/222.605), um anti-Cluster de diferenciação 20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20 como descrito na Patente dos EUA No 9.657.102 e US20150266966A1 e na Patente dos EUA No 7.879.984), um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-CD28, um antiCluster de Diferenciação-48 (por exemplo, anticorpo anti-CD48 conforme descrito na Patente dos EUA No 9.228.014), um anticorpo anti-Fel d1 (por exemplo, conforme descrito na Patente dos EUA No. 9.079.948), um vírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (por exemplo, um anticorpo anti- MERS conforme descrito na Patente dos EUA. Pub. No US2015/0337029A1), um anticorpo anti-vírus Ebola (por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA Pub. No US2016/0215040), um anticorpo anti-vírus Zika, um anticorpo anti-Ativação de Linfócitos Gene 3 (por exemplo, um anticorpo anti-LAG3, ou um anticorpo anti-CD223), um anticorpo anti-Nerve Growth Factor (por exemplo, um anticorpo anti-NGF como descrito na Patente dos EUA Aplic. Bar. No US2016/0017029 e Pat. dos EUA 8.309.088 e 9.353.176) e um anticorpo anti-Proteína Y. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD20 (conforme descrito no Pedido de Patente dos EUA. Pub. Nos US2014/0088295A1 e US20150266966A1), um anti-CD3 x anticorpo biespecífico anti-mucina 16 (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Muc16), e um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Próstata específico de membrana (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PSMA).

[0097] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é selecionada do grupo que consiste em abciximab, adalimumab, adalimumab-atto, ado- trastuzumab, alemtuzumab, alirocumab, atezolizumab, avelumab, basiliximab, belimumab, benralizumab, bevacizumab, bezlotoxumab, blinatumomab, brentuximab vedotina, brodalumab, canaquinumab, capromab pendetide, certolizumab pegol, cemiplimab, cetuximab, denosumab, dinutuximab, dupilumab, durvalumab, eculizumab, elotuzumab, emicizumab- kxwh, emtansinealirocumab, evinacumab, evolocumab, fasinumab, golimumab, guselkumab, infliximarucizumab, infliximarucumab, infliximab - abda, infliximab-dyyb, ipilimumab, ixekizumab, mepolizumab, necitumumab, nesvacumab, nivolumab, obiltoxaximab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, olaratumab, omalizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, reslizumab, rinucumab, rituximab, sarilumab, secuquinumabe, siltuximabe, tocilizumabe, tocilizumabe, trastuzumabe, trevogrumabe, ustequinumabe e ve dolizumabe.

[0098] As proteínas de interesse podem ser criadas ou isoladas por qualquer meio conhecido na técnica. Estes incluem meios recombinantes, tais como proteínas (por exemplo, anticorpos) expressas usando um vetor de expressão recombinante transfectado para uma célula hospedeira. Os anticorpos que são proteínas de interesse podem ser isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos recombinantes e combinatórios, isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res 20:6287-6295) ou preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências de genes de imunoglobulina humana com outras sequências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, os anticorpos humanos recombinantes são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig humanas é usado, mutagênese somática in vivo) e, portanto, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivados e relacionados às sequências VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[0099] Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende um domínio de fragmento cristalizável (Fc). Por exemplo, a proteína de interesse pode ser uma proteína de fusão receptor-Fc ou uma proteína de fusão TCR-Fc solúvel. Em algumas modalidades, a proteína de fusão receptor-Fc é uma proteína trap.

[00100] As proteínas de fusão compreendem duas ou mais partes da proteína que não são encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma "proteína de fusão Fc" pode compreender uma porção Fc de uma molécula de imunoglobulina, que é fundida a outro domínio heterólogo, tal como um domínio de ligação ao ligante do receptor. A preparação de proteínas de fusão compreendendo polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; e Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", em Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992. "Proteínas de fusão de receptor Fc" compreendem um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc, que em algumas modalidades compreende uma região de dobradiça seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc contém duas ou mais cadeias receptoras distintas que se ligam a um ou mais ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma armadilha, como, por exemplo, uma armadilha de interleucina 1 (IL-1) (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação do ligante IL-1 RAcP fundida com a região extracelular de IL-1 R1 fundida para Fc de hlgG1; ver Patente dos EUA No 6.927.004), ou uma armadilha de fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF) (por exemplo, aflibercept, que contém o domínio Ig 2 do receptor de VEGF Flt1 fundido ao domínio Ig 3 do VEGF receptor Flk1 fundido com Fc de hlgG1; ver Patentes dos EUA Nos 7.087.411 e 7.279.159).

[00101] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína de fusão, tal como uma proteína de fusão do receptor. As proteínas de fusão do receptor podem incluir, intera alia, proteínas trap e miniproteínas trap.

[00102] O termo "proteína de fusão"refere-se a uma molécula compreendendo duas ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas ligadas por uma ligação covalente por meio de seus esqueletos peptídicos individuais, opcionalmente gerados através da expressão genética de uma molécula de polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão.

[00103] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína bloqueadora ou uma proteína mini bloqueadora. Em algumas modalidades, as proteínas trap são proteínas terapêuticas manipuladas capazes de agir como receptores chamariz para se ligar e antagonizar ou modular a atividade de uma proteína alvo. Uma proteína trap exemplar compreende um ou mais componentes do receptor que imitam o domínio de ligação do receptor para sua proteína alvo (por exemplo, o domínio Ig do receptor VEGF 2 de Flt-1 e o domínio Ig 3) fundido a uma região constante de IgG humana, opcionalmente incluindo domínios adicionais, como ligantes, domínios de dimerização ou multimerização e sítios de clivagem. Em algumas modalidades, a proteína trap é truncada ou de tamanho reduzido (uma mini trap), por exemplo, através da clivagem de proteína, que pode auxiliar na penetração de tecido da mini trap. Exemplos não limitativos de proteínas trap incluem uma IL-1 trap (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação ao ligante de IL-lRAcP fundida com a região extracelular de IL-1R1 que por sua vez é fundida ao Fc de hlgGl) (por exemplo, SEQ ID NO: 1) (ver Patente dos EUA No 6.927.004), ou uma VEGF trap (por exemplo, aflibercept, que contém o domínio Ig 2 do receptor de VEGF Fltl fundido ao domínio Ig 3 do receptor de VEGF Flkl que por sua vez é fundido para Fc de hlgGl. Ver, por exemplo, Patentes dos EUA N° 7.087.411, 7.279.159; ver também Patente dos EUA N° 5.610.279 para etanercept (TNF trap), os conteúdos de cada uma das quais são incorporados por referência em sua totalidade neste documento.

Produção de Proteína

[00104] A proteína de interesse testada pelos métodos descritos neste documento pode ser produzida por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a proteína de interesse pode ser produzida por culturas de células. As culturas de células podem ser uma "cultura de células alimentada em lote" ou "cultura em lote alimentada" que se refere a uma cultura em lote em que as células e o meio de cultura são fornecidos ao recipiente de cultura inicialmente e nutrientes de cultura adicionais são alimentados lentamente, em incrementos discretos, à cultura durante a cultura, com ou sem colheita periódica de células e/ou produto antes do término da cultura. A cultura em lote alimentado inclui "cultura em lote alimentado semicontínua" em que a cultura inteira periodicamente (que pode incluir células e meio) é removida e substituída por meio fresco. A cultura descontínua é diferenciada da simples “cultura descontínua”, enquanto todos os componentes para a cultura celular (incluindo as células animais e todos os nutrientes da cultura) são fornecidos ao recipiente de cultura no início do processo de cultura na cultura descontínua. A cultura semidescontínua pode ser diferente da "cultura de perfusão", pelo fato de que o sobrenadante não é removido do recipiente de cultura durante um processo semidescontínuo padrão, enquanto que na cultura de perfusão, as células são restringidas na cultura por, por exemplo, filtragem, e o meio de cultura é continuamente ou intermitentemente introduzido e removido do recipiente de cultura. No entanto, a remoção das amostras para fins de teste durante a cultura de células semidescontínua é contemplada. O processo semidescontínuo continua até que seja determinado que o volume de trabalho máximo e/ou a produção de proteína foi atingida, e a proteína é posteriormente colhida.

[00105] A cultura celular pode ser uma “cultura celular contínua”, que é uma técnica usada para cultivar células continuamente, geralmente em uma fase de crescimento específica. Por exemplo, se um fornecimento constante de células for necessário ou a produção de uma proteína específica de interesse for necessária, a cultura de células pode exigir manutenção em uma fase específica de crescimento. Assim, as condições devem ser continuamente monitoradas e ajustadas de acordo para manter as células nessa fase específica.

[00106] As células são cultivadas em meio de cultura de células. Os termos "meio de cultura celular" e "meio de cultura" referem-se a uma solução nutritiva usada para o crescimento de células de mamíferos que normalmente fornece os nutrientes necessários para aumentar o crescimento das células, como uma fonte de energia de carboidratos, essencial (por exemplo, fenilalanina, valina, treonina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina, lisina e histidina) e não essenciais (por exemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, prolina, serina e tirosina) aminoácidos, oligoelementos, energia fontes, lipídios, vitaminas, etc. O meio de cultura celular pode conter extratos, por exemplo, soro ou peptonas (hidrolisados), que fornecem matérias-primas que suportam o crescimento celular. Os meios podem conter extratos derivados de leveduras ou de soja, em vez de extratos derivados de animais. O meio quimicamente definido refere-se a um meio de cultura de células em que todos os componentes químicos são conhecidos (ou seja, têm uma estrutura química conhecida). O meio quimicamente definido é inteiramente livre de componentes derivados de animais, tais como peptonas derivadas de soro ou animais. Em uma modalidade, o meio é um meio quimicamente definido.

[00107] Uma "linhagem celular" refere-se a uma célula ou células que são derivadas de uma linhagem específica por meio de passagem em série ou subcultura de células. O termo "células" é usado de forma intercambiável com "população de células". O termo "célula"inclui qualquer célula que é adequada para expressar uma sequência de ácidos nucleicos recombinantes. As células incluem aquelas de procariontes e eucariontes, tais como células bacterianas, células de mamíferos, células humanas, células animais não humanas, células aviárias, células de inseto, células de levedura ou fusões de células tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em certas modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, símio, hamster, rato ou camundongo. Em outras modalidades, a célula é selecionada a partir das seguintes células: Ovário de Hamster Chinês (CHO) (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), célula da retina, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, linfócito, por exemplo, Jurkat (linfócito T) ou Daudi (linfócito B), A431 (epidérmico), U937, 3T3, Célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, célula MMT, célula-tronco, célula tumoral e uma linha celular derivada de uma célula supracitada. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula de retina que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6®). Em algumas modalidades, a célula é uma célula CHO. Em outras modalidades, a célula é uma célula CHO K1.

[00108] As células podem ser transformadas com polinucleotídeos heterólogos que codificam uma proteína de interesse usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, transformação, transfecção, eletroporação e semelhantes.

[00109] O termo "polinucleotídeo heterólogo"refere-se a uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma sequência de nucleotídeos não encontrada na célula de tipo selvagem, que pode incluir uma sequência que codifica a proteína de interesse. Polinucleotídeos heterólogos exemplares incluem vetores compreendendo uma sequência que codifica a proteína de interesse, incluindo, mas não se limitando a, plasmídeo, fago e partículas virais. Opcionalmente, o vetor permite a transferência de uma molécula de ácido nucleico particular para uma célula. Quando introduzido em uma célula apropriada, um vetor de expressão contém os elementos genéticos necessários para direcionar a expressão da proteína de interesse. Os vetores exemplares podem incluir elementos promotores de transcrição (isto é, uma sequência de controle de expressão), que estão operativamente ligados à sequência que codifica a proteína de interesse. O vetor pode ser composto de DNA ou RNA ou uma combinação dos dois (por exemplo, uma quimera DNA-RNA). Opcionalmente, o vetor pode incluir uma sequência de poliadenilação, um ou mais sítios de restrição, bem como um ou mais marcadores selecionáveis, como fosfotransferase ou higromicina fosfotransferase. Adicionalmente, dependendo do tipo de célula escolhido e do vetor empregado, outros elementos genéticos, tais como uma origem de replicação, sítios adicionais de restrição de ácido nucleico, intensificadores e sequências que conferem indutibilidade de transcrição, também podem ser incorporados ao vetor. A seleção de vetores apropriados e métodos de transformação serão evidentes para aqueles versados na técnica.

Glicosilação

[00110] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é glicosilada. A glicosilação pode incluir glicosilação ligada a N, glicosilação ligada a O ou uma combinação das mesmas. Muitas proteínas e polipeptídeos de interesse produzidos em cultura de células são glicoproteínas que contêm estruturas de carboidratos ligadas covalentemente, incluindo cadeias de oligossacarídeos (glicanos). Essas cadeias de oligossacarídeos estão ligadas à proteína no retículo endoplasmático e no aparelho de Golgi por meio de ligações N ou O. As cadeias de oligossacarídeos podem compreender uma porção significativa da massa da glicoproteína. As cadeias de oligossacarídeos podem desempenhar papéis, incluindo facilitar o dobramento correto da glicoproteína, mediar interações proteína-proteína, conferir estabilidade, conferir propriedades farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas vantajosas, inibir a digestão proteolítica, direcionar a glicoproteína para a via secretora adequada e direcionar a glicoproteína para uma determinado órgão ou órgãos.

[00111] Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende glicosilação ligada a N. Geralmente, cadeias de oligossacarídeos N-ligadas são adicionadas à proteína nascente, translocadora no lúmen do retículo endoplasmático. O oligossacarídeo é adicionado ao grupo amino na cadeia lateral de um resíduo de asparagina contido em uma sequência de consenso alvo, como Asn-X-Ser/Thr ou, em alguns casos, Asn-X-Cys, onde X pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina. A cadeia inicial de oligossacarídeos geralmente é cortada por enzimas glicosidases específicas no retículo endoplasmático, resultando em um oligossacarídeo de núcleo curto e ramificado composto por dois N-acetilglucosamina e três resíduos de manose.

[00112] Após o processamento inicial no retículo endoplasmático, a glicoproteína pode sofrer processamento adicional antes de ser secretada para a superfície celular. As cadeias de oligossacarídeos N-ligadas podem ser modificadas pela adição de resíduos de manose, resultando em um oligossacarídeo de alta manose. Alternativamente, uma ou mais unidades de monossacarídeos de N-acetilglucosamina podem ser adicionadas às subunidades centrais de manose para formar oligossacarídeos complexos. A galactose pode ser adicionada às subunidades de N-acetilglucosamina e as subunidades de ácido siálico podem ser adicionadas às subunidades de galactose, resultando em cadeias que terminam com um resíduo de ácido siálico, galactose ou N-acetilglucosamina. Adicionalmente, um resíduo de fucose pode ser adicionado a um resíduo de N-acetilglucosamina do oligossacarídeo central. Cada uma dessas adições é catalisada por glicosil transferases específicas.

[00113] Além de serem modificadas pela via de glicosilação ligada a N, as glicoproteínas também podem ser modificadas pela adição de cadeias oligossacarídicas ligadas a O a resíduos específicos de serina ou treonina à medida que são processados no aparelho de Golgi. Os resíduos de um oligossacarídeo ligado a O são adicionados um de cada vez e a adição de cada resíduo é catalisada por uma enzima específica. Em contraste com a glicosilação ligada a N, a sequência de aminoácidos de consenso para a glicosilação ligada a O é menos bem definida. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende glicosilação ligada a O. Em algumas modalidades, a glicosilação ligada a O compreende a ligação de um açúcar molecular a um aminoácido serina (Ser) ou treonina (Thr) da proteína de interesse.

[00114] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína glicosilada. Em algumas modalidades, a proteína glicosilada compreende pelo menos um glicano ligado. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende pelo menos 1 glicano ligado, pelo menos 2 glicanos ligados, pelo menos 3 glicanos ligados, pelo menos 4 glicanos ligados, pelo menos 5 glicanos ligados, pelo menos 6 glicanos ligados, pelo menos 7 glicanos ligados, pelo menos 8 glicanos ligados, pelo menos 9 glicanos ligados, pelo menos 10 glicanos ligados, pelo menos 11 glicanos ligados, pelo menos 12 glicanos ligados, pelo menos 15 glicanos ligados, pelo menos 20 glicanos ligados ou pelo menos 25 glicanos ligados. Em algumas modalidades, a proteína de interesse tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 glicanos ligados. Em algumas modalidades, os glicanos são ligados a N. Em algumas modalidades, os glicanos são ligados a O. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende glicanos ligados a N e O.

[00115] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína glicosilada. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende pelo menos um sítio de glicosilação. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende pelo menos um sítio de glicosilação, pelo menos dois sítios de glicosilação, pelo menos 3 sítios de glicosilação, pelo menos 4 sítios de glicosilação, pelo menos 5 sítios de glicosilação, pelo menos 6 sítios de glicosilação, pelo menos 7 sítios de glicosilação, pelo menos 8 sítios de glicosilação, pelo menos 9 sítios de glicosilação, pelo menos 10 sítios de glicosilação, pelo menos 10 sítios de glicosilação, pelo menos 11 sítios de glicosilação, pelo menos 12 sítios de glicosilação, pelo menos 15 sítios de glicosilação, pelo menos 20 sítios de glicosilação ou pelo menos são adicionado 25 sítios de glicosilação. Em algumas modalidades, pelo menos o sítio de glicosilação é um sítio de glicosilação ligado a N, por exemplo, uma asparagina dentro da sequência de consenso de glicosilação ligada a N. Em algumas modalidades, o pelo menos um sítio de glicosilação é um sítio de glicosilação ligado a O, por exemplo, uma serina ou treonina. Em algumas modalidades, a proteína de interesse compreende pelo menos um sítio de glicosilação ligado a N e pelo menos um sítio de glicosilação ligado a O.

[00116] Em algumas modalidades, os glicanos compreendem pelo menos 0,5%, 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65% ou pelo menos 75% do peso total da proteína glicosilada (5% peso/peso, ou p/p). Em algumas modalidades, os glicanos compreendem pelo menos 5% do peso total da proteína glicosilada (5% p/p). Em algumas modalidades, os glicanos compreendem pelo menos 10% do peso total da proteína glicosilada (10% p/p). Os métodos para determinar a porcentagem do peso da proteína composta de glicanos serão prontamente aparentes para um versado na técnica e incluem, mas não estão limitados a, comparar o peso esperado derivado da sequência de aminoácidos com o peso real determinado pelos métodos de análise de eletroforese aqui descrito.

Padrões de Referência

[00117] Em algumas modalidades, um padrão de referência é submetido aos mesmos métodos de preparação em paralelo à amostra que compreende a proteína de interesse e analisado em paralelo à amostra que compreende a proteína de interesse. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a comparação de uma ou mais características da proteína de interesse com o padrão de referência. Por exemplo, os métodos podem incluir a comparação de eletroferogramas da proteína de interesse e o padrão de referência.

[00118] Conforme usado neste documento, um "padrão de referência"refere-se a uma amostra compreendendo uma proteína que foi previamente analisada usando os métodos conhecidos na técnica e cujas características são conhecidas. As características conhecidas podem ser determinadas a partir da sequência de aminoácidos do padrão de referência (por exemplo, peso molecular previsto), ou determinadas experimentalmente (por exemplo, perfil de eletroferograma). Essas características podem incluir, mas não estão limitadas a, peso molecular esperado e determinado experimentalmente, eletroferograma(s) gerado(s) usando os métodos descritos neste documento ou métodos conhecidos na técnica, ponto isoelétrico, coeficiente de extinção (uma medida de quão fortemente a proteína de interesse absorve luz em um determinado comprimento de onda), número de sítios de glicosilação e peso molecular dos glicanos ligados. Um padrão de referência pode ser semelhante em uma ou mais características a uma proteína de interesse. Por exemplo, tanto a proteína de interesse quanto o padrão de referência podem ser anticorpos monoclonais ou compreender um domínio Fc, ter peso molecular semelhante ou semelhantes.

[00119] Em algumas modalidades, o padrão de referência compreende a proteína de interesse. Por exemplo, o padrão de referência pode ser de um lote separado da proteína de interesse da amostra, que foi previamente caracterizada e armazenada sob condições controladas para prevenir a degradação.

[00120] Em algumas modalidades, a divulgação fornece métodos de preparação de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse e um padrão de referência para análise usando eletroforese, compreendendo (a) desnaturar a amostra e o padrão de referência; (b) rotular a proteína de interesse e o padrão de referência com um marcador fluorescente para produzir uma amostra marcada e um padrão de referência marcado; (c) extinguir as reações de marcação da proteína de interesse e o padrão de referência, (d) deglicosilar a amostra marcada e o padrão de referência marcado com uma endoglicosidase; e (e) realizar eletroforese na amostra marcada e no padrão de referência marcado; em que a amostra e o padrão de referência são marcados e extintos nas etapas (b) e (c) antes da deglicosilação na etapa (d).

[00121] Em algumas modalidades, a eletroforese é eletroforese capilar de microchip (MCE) e a saída é um eletroferograma. Em algumas modalidades, os métodos compreendem determinar uma intensidade de pico principal para a proteína de interesse e o padrão de referência e comparar os valores de intensidade do pico principal para a proteína de interesse e o pico principal para o padrão de referência. Em algumas modalidades, o pico principal da proteína de interesse ou o padrão de referência é glicosilado. Em algumas modalidades, o pico principal da proteína de interesse ou o padrão de referência não é glicosilado, ou seja, foi deglicosilado após marcação usando os métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, determinar o pico principal compreende determinar a altura do pico principal. Em algumas modalidades, determinar o pico principal compreende determinar a área do pico principal. Em algumas modalidades, determinar o pico principal compreende determinar a área corrigida no tempo do pico principal, que é a área do pico dividida pelo seu tempo de migração. Em algumas modalidades, a intensidade do pico principal da proteína de interesse está dentro de 50% a 150%, 50% a 140%, 50% a 130%, 50% a 120%, 50% a 110%, 50% a 100%, 50% a 90%, 60% a 150%, 70% a 150%, 80% a 150%, 90% a 150%, 100% a 150%, 110% a 150%, 120% a 150%, 130 % a 150%, 140% a 150%, 60% a 140%, 70% a 140%, 70% a 130%, 70% a 120%, 70% a 110%, 80% a 140%, 80% a 130%, 80% a 120%, 80% a 110%, 80% a 100%, 90% a 140%, 90% a 130%, 90% a 120%, 90% a 110% ou 90% a 100% da intensidade de pico principal do padrão de referência. Em algumas modalidades, a intensidade do pico principal da proteína de interesse está dentro de 60% a 140%, 70% a 130%, 80% a 120% ou 90% a 110% da intensidade do pico principal do padrão de referência. Em algumas modalidades, a intensidade do pico principal da proteína de interesse está dentro de 70% a 130% da intensidade do pico principal do padrão de referência. Determinar a intensidade do pico principal da proteína de interesse em relação ao padrão de referência pode garantir a separação adequada pelo instrumento CE ou MCE e a qualidade dos dados.

Eletroforese

[00122] São fornecidos neste documento métodos de análise de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse preparada usando os métodos descritos neste documento usando eletroforese.

[00123] Os métodos baseados em eletroforese para analisar proteínas incluem, mas não estão limitados a, métodos baseados em gel, como eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de dodecil (lauril) sulfato de sódio (SDS), eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de lítio, eletroforese de fluxo livre, focagem isoelétrica, eletroforese capilar em gel, eletroforese capilar (CE) e eletroforese capilar de microchip (MCE).

[00124] Em algumas modalidades, a eletroforese é CE. Em algumas modalidades, o CE compreende um tampão de dodecil sulfato de lítio (LDS).

[00125] Em algumas modalidades, a eletroforese é MCE. Os termos "MCE" ou "Eletroforese Capilar de Microchip" e "eletroforese capilar (CE)" referem-se à eletroforese capilar (CE) e sua contraparte microfluídica (MCE), que são usadas para separar analitos em uma amostra. As técnicas de MCE podem ser usadas para separar, identificar e quantificar proteínas de interesse, impurezas na amostra de proteína e analisar produtos de degradação da proteína de interesse, como fragmentos de proteína. CE e MCE separam analitos com base na mobilidade eletroforética quando uma voltagem é aplicada a uma amostra. A presença de matriz de gel (por exemplo, eletroforese em gel) separará os analitos com base no tamanho e na carga. As impurezas na amostra incluem, mas não estão limitadas a agregados de proteínas, fragmentos de proteínas, multímeros de proteínas e contaminantes de ensaio.

[00126] Em MCE, a proteína marcada desnaturada de interesse é diluída e submetida a MCE para separar a amostra de proteína diluída em um sistema de eletroforese capilar de microchip para produzir um eletroferograma. Como várias amostras podem ser executadas em paralelo no mesmo microchip, os métodos baseados em MCE são facilmente adaptáveis a abordagens de alto rendimento. Além disso, o MCE é rápido e usa um volume mínimo de amostra.

[00127] Conforme usado neste documento, um eletroferograma é um gráfico que resulta de métodos eletroforéticos, como CE ou MCE. O eletroferograma contém picos correspondentes à proteína de interesse e impurezas.

[00128] Os métodos de análise de eletroferogramas são conhecidos na técnica e incluem a comparação da posição, tamanho e áreas sob picos individuais. Os métodos de cálculo da área de pico para um eletroferograma (área sob o pico) são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, integração para estimar a área sob um pico. A área de pico pode ser calculada usando software como o Empower.

[00129] A instrumentação para a realização dos ensaios de MCE divulgados está comercialmente disponível. Em algumas modalidades, os ensaios MCE divulgados são realizados usando LabChip GXII, LabChip GXII TouchMT, LabChip GXII Touch MT HT e um ensaio Protein Express LabChip (LabChip® HT Protein Express Chip).

[00130] A instrumentação para a realização dos ensaios CE divulgados também está disponível comercialmente. Por exemplo, os ensaios de CE podem ser realizados usando um sistema de eletroforese capilar Beckman Coulter, como o PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System.

[00131] Em algumas modalidades dos métodos descritos neste documento, os métodos compreendem ainda a marcação e execução de uma escada de peso molecular padrão de proteína para avaliar o tamanho da proteína de interesse. As escadas de peso molecular de proteína serão conhecidas pelos versados na técnica e incluem PageRuler, Mark12, BenchMark, PageRuler High Range e PageRuler Low Range disponíveis na ThermoFisher, bem como a escada HT PICO Protein Express do Protein Pico Assay Reagent Kit da PerkinElmer. A seleção da escada apropriada com base no tamanho da proteína de interesse será evidente para um versado na técnica. Aplicações

[00132] A divulgação fornece métodos de caracterização de uma proteína de interesse, usando os métodos de marcação, deglicosilação e eletroforese descritos neste documento.

[00133] A análise de uma proteína de interesse pode incluir, mas não está limitada a caracterizar o número, posição, altura, largura, intensidade, tamanho ou área de um ou mais picos em um eletroferograma gerado por CE ou MCE.

[00134] Caracterizar o número e a posição dos picos em um eletroferograma pode determinar se os produtos de degradação da proteína de interesse estão presentes na amostra, por exemplo, como picos com pesos moleculares menores que o do pico principal. A comparação de picos gerados a partir de proteína de interesse não deglicosilada e proteína de interesse deglicosilada e marcada usando os métodos descritos neste documento pode determinar se as formas glicosiladas da proteína de interesse estão presentes na amostra, como um pico principal deglicosilado da proteína de interesse terá um peso molecular menor do que um pico principal glicosilado de uma proteína de interesse.

[00135] Os métodos da presente divulgação podem ser usados para testar a estabilidade de proteínas de interesse sob várias condições. Isso inclui condições de armazenamento para proteína de interesse que foi formulada como uma substância medicamentosa ou produto farmacêutico. Comparações de número de pico e área de pico, por exemplo, entre uma amostra de referência compreendendo uma proteína de interesse e uma amostra estressada da mesma, podem ser usadas para determinar a estabilidade da proteína de interesse ao longo do tempo e sob várias condições, como pH alto ou baixo, ou exposição à luz.

[00136] Consequentemente, a divulgação fornece métodos para determinar a estabilidade de uma proteína de interesse usando os métodos de marcação e deglicosilação de uma proteína de interesse aqui descritos. Em algumas modalidades, os métodos compreendem (a) estressar uma amostra compreendendo a proteína de interesse; (b) desnaturar a amostra estressada e uma amostra não estressada compreendendo a proteína de interesse; (c) rotular a proteína de interesse na amostra estressada e na amostra não estressada com um marcador fluorescente para produzir uma amostra estressada marcada e uma amostra não estressada marcada; (d) extinguir o marcador fluorescente que não reagiu na amostra marcada sob estresse e na amostra marcada não sob estresse; (e) deglicosilar a amostra estressada marcada e a amostra não estressada marcada com uma endoglicosidase; (f) realizar eletroforese capilar de microchip (MCE) na amostra estressada marcada e na amostra não estressada marcada para gerar eletroferogramas para a amostra estressada e a amostra não estressada; e (g) comparar os eletroferogramas da amostra estressada e da amostra não estressada; em que a amostra estressada e a amostra não estressada são marcadas e extintas nas etapas (c) e (d) antes da deglicosilação na etapa (e).

[00137] Quaisquer métodos de estresse de uma proteína de interesse em uma amostra são considerados como dentro dos métodos da divulgação, incluindo, mas não limitado a, produtos químicos, pH, radiação, luz, ciclos de congelamento-descongelamento, liofilização e calor.

[00138] Em algumas modalidades, estressar a amostra que compreende a proteína de interesse compreende estressar termicamente a amostra. Estressar termicamente a amostra pode incluir simular condições de armazenamento para proteína de interesse formulada como substância medicamentosa ou medicamento formulado, ou seja, a amostra estressada é mantida a cerca de -80 °C a -30 °C ou cerca de 2 °C a cerca de 8 °C, respectivamente. Em outras modalidades, estressar termicamente a amostra compreende simular condições de manuseio e transporte para a amostra. Em outras modalidades, estressar termicamente a amostra compreende induzir a degradação forçada da amostra, por exemplo, aumentando a temperatura à qual a amostra é exposta.

[00139] Em algumas modalidades, estressar a amostra que compreende a proteína de interesse compreende estressar termicamente a amostra. Em algumas modalidades, o estresse térmico compreende manter a amostra entre 25 °C e 45 °C. Em algumas modalidades, o estresse térmico compreende manter a amostra a 2 °C, 4 °C, 6 °C, 8 °C, 10 °C, 12 °C, 14 °C, 16 °C, 18 °C, 20 °C, 22 °C, 24 °C, 26 °C, 28 °C, 30 °C, 32 °C, 35 °C, 37 °C ou 40 °C. Em algumas modalidades, o estresse térmico compreende manter a amostra a 37 °C. Em algumas modalidades, o estresse térmico compreende manter a amostra a 22 °C a 26 °C. Em algumas modalidades, o estresse térmico compreende manter a amostra a 30 °C. Em algumas modalidades, o estresse térmico compreende manter a proteína entre cerca de 25 °C e 45 °C. Em algumas modalidades, o estresse térmico compreende manter a amostra estressada por pelo menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas 9 semanas, 10 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses ou um ano. Em algumas modalidades, a amostra estressada é mantida por 2 semanas. Em algumas modalidades, a amostra estressada é mantida por 4 semanas.

[00140] Em algumas modalidades, estressar termicamente a amostra compreende manter a amostra entre cerca de 25 °C e cerca de 45 °C por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas ou pelo menos 8 semanas. Em algumas modalidades, estressar termicamente a amostra compreende manter a amostra entre cerca de 30 °C e cerca de 45 °C por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas ou pelo menos 8 semanas.

[00141] Em algumas modalidades, estressar a amostra compreende pelo menos um ciclo de congelamento/descongelamento. Por exemplo, a partir de uma amostra líquida, abaixando a temperatura até que a amostra congele e, em seguida, retornando a amostra a uma temperatura em que é um líquido antes da análise.

[00142] Em algumas modalidades, estressar a amostra compreende expor a amostra a condições de armazenamento. Em algumas modalidades, as condições de armazenamento compreendem uma temperatura de cerca de -80 °C a -30 °C por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses ou pelo menos 30 meses. Em algumas modalidades, as condições de armazenamento compreendem uma temperatura de cerca de 2 °C a 8 °C por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 12 meses ou pelo menos 18 meses.

[00143] Em algumas modalidades, estressar a amostra compreende agitar mecanicamente a amostra, por exemplo, usando um vórtice ou agitador magnético.

[00144] Em algumas modalidades, estressar a amostra compreende liofilizar e reidratar a amostra. Os métodos de liofilização de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse serão conhecidos dos versados na técnica e incluem, por exemplo, liofilização e secagem por pulverização.

[00145] Em algumas modalidades, estressar a amostra compreende expor a amostra à luz, radiação, espécies de oxigênio singlete, radicais livres, condições de pH alto ou condições de pH baixo. Condições de pH baixo exemplificativas incluem, entre outros, expor a amostra a um pH inferior a 7,0, por exemplo, um pH inferior a 6,0. 5,5, 5,0. 4,5, 4,0, 3,5, 3,0., 2,0, 1,5 ou 1,0. Condições de pH alto exemplificativas incluem, entre outros, expor a amostra a um pH superior a 7,0, por exemplo, um pH superior a 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ou 10,0.

[00146] Em algumas modalidades, estressar a amostra compreende expor a amostra à luz. A exposição à luz pode incluir luz de qualquer comprimento de onda ou qualquer faixa de comprimentos de onda. Em modalidades exemplares, as amostras são expostas a luz fluorescente branca fria ou luz ultravioleta próxima. A luz fluorescente branca fria exemplar compreende luz de comprimentos de onda mistos que tem uma temperatura de cor correlacionada (CCT) de cerca de 4.100 a cerca de 4.500 kelvins (K). Em alguns aspectos, a luz fluorescente branca fria tem um CCT de 4.100K. Em alguns aspectos, expor a amostra à luz compreende expor a amostra a cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 ou 3,0 milhões de lux horas de exposição acumulada de luz branca fria. Em alguns aspectos, expor a amostra à luz compreende expor a amostra a cerca de 1,2 ou cerca de 2,4 milhões de lux horas de exposição acumulada de luz branca fria. A luz ultravioleta próxima exemplar tem um comprimento de onda de cerca de 300 nm a cerca de 400 nm. Em alguns aspectos, a luz ultravioleta próxima tem uma energia integrada entre cerca de 100 watts/metro quadrado a cerca de 600 watts/metro quadrado. Em alguns aspectos, a luz ultravioleta próxima tem uma energia integrada de cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 watt horas/metro quadrado.

[00147] Uma redução na área do pico principal entre a amostra de referência e a versão estressada da mesma pode, por exemplo, indicar uma redução da proteína de interesse no pico principal por degradação. Em algumas modalidades, a área do pico principal da proteína estressada de interesse é reduzida em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6 pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% em comparação com o principal pico da proteína não estressada de interesse. Da mesma forma, um aumento na área de picos de baixo peso molecular na amostra de referência estressada em comparação com a amostra de referência pode indicar degradação da proteína de interesse, à medida que aumenta a abundância das espécies de baixo peso molecular representando produtos de degradação da proteína de interesse. Em algumas modalidades, a área de pelo menos um pico de baixo peso molecular da proteína estressada de interesse é aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6 pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% em comparação com pelo menos um pico de baixo peso molecular da proteína não estressada de interesse.

Kits e Artigos de Fabricação

[00148] A divulgação fornece kits incluindo um ou mais dos tampões, enzimas, corantes e padrões de referência divulgados usados nos métodos de deglicosilação e rotulagem descritos neste documento. Os kits podem incluir um recipiente para os ingredientes. Os tampões podem estar em solução ou na forma liofilizada. Em algumas modalidades, os kits incluem um segundo recipiente contendo um diluente ou solução de reconstituição para a formulação liofilizada; e opcionalmente, instruções para o uso da solução ou a reconstituição e/ou uso dos tampões liofilizados ou ingredientes em pó.

[00149] Os kits aqui descritos podem incluir ainda reagentes adicionais necessários para realizar os ensaios de MCE divulgados, incluindo um ou mais de um tampão, um diluente e um filtro. O tampão e os reagentes podem estar em uma garrafa, frasco ou tubo de ensaio.

[00150] Em algumas modalidades, os kits incluem instruções de uso.

[00151] A presente descrição apresenta inúmeras configurações, métodos, parâmetros e semelhantes exemplares. Deve ser reconhecido, no entanto, que tal descrição não se destina a ser uma limitação do escopo da presente divulgação, mas é fornecida como uma descrição de modalidades exemplares. EXEMPLOS Exemplo 1: Reagentes Materiais e Equipamentos Tabela 1. Materiais (itens equivalentes também podem ser usados) Tabela 2. Produtos químicos (itens equivalentes também podem ser usados) Tabela 3. Equipamento Tabela 4. Soluções de Reagente Tabela 5. Resumo dos métodos MCE Tabela 6. Resumo das Proteínas usadas nos Exemplos

Exemplo 2: Protocolo para Eletroforese Capilar de Microchip Sem Deglicosilação (Método A)

[00152] Este protocolo descreve o método de preparação para análise de proteínas de teste por Eletroforese Capilar de Microchip não reduzido (NR) e reduzido (R) (MCE) usando o instrumento GXII para estimar os níveis de pureza e impureza. Esses métodos são usados para caracterização de proteínas ou determinação do nível de fragmentação em uma amostra de proteína. Estes métodos convencionais são realizados sem deglicosilação.

Procedimento

[00153] Ver FIG. 1 para um caminho de fluxo apenas informativo para este procedimento.

[00154] (1) Desnaturação. Diluir o padrão de referência de proteína ou artigo de teste com água para cerca de 0,2-2,0 mg/mL. Em uma placa de 96 poços, adicionar a amostra de proteína e a solução não redutora (NR)/redutora (R) em uma proporção de volume de 4:1 (o volume pode ser variado). Selar a placa com vedação de polipropileno e aquecer a placa a uma temperatura de desnaturação específica da proteína (geralmente 50 a 99 ° C) por um tempo otimizado (geralmente 1 a 60 minutos).

[00155] (2) Marcação. Preparar o corante de 5 µM conforme descrito na Tabela 4. Adicionar o corante 5 µM à solução de proteína desnaturada em uma proporção de volume de 1:1 (o volume pode ser variado). Aquecer a placa de 96 poços em um termociclador a 35 °C por 30 minutos. Para extinguir a reação de marcação, adicionar 105 µL de solução de parada diluída (preparada de acordo com a Tabela 4) e 5 µL de proteína marcada a uma nova placa de 96 poços e misturar bem.

[00156] (3) Executar em GX-IL Preparar o instrumento MCE e o microchip e realizar as medições de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 3: Protocolo para Eletroforese Capilar de Microchip Com Deglicosilação Antes da Marcação de Proteínas (Método B)

[00157] Este método se aplica a glicoproteínas que precisam ser deglicosiladas antes de serem submetidas a medições de MCE. Salvo especificação em contrário, todos os protocolos, produtos químicos, reagentes e análises são os mesmos descritos nos Exemplos 1-2. Tabela 7. Reagentes Adicionais

Procedimento

[00158] (1) Deglicosilação. Diluir um total de 100 µg da amostra de proteína com 0,1% RapiGest SF para 90 µL. O peso da proteína pode ser determinado por métodos baseados em UV. Adicionar 10 µL de estoque NEB PNGase F e fazer uma mistura de deglicosilação de 100 µL, vórtice e centrifugar e inspecionar. Incubar a mistura a 37 °C por 3 horas em um bloco de aquecimento com agitação a 400 rotações por minuto (rpm).

[00159] (2) Desnaturação. Prosseguir com a desnaturação da amostra deglicosilada acima mencionada, conforme descrito no Exemplo 2.

[00160] (3) Marcação. Prosseguir com a marcação da amostra desnaturada conforme descrito no Exemplo 2.

[00161] (4) Executar em GX-II. Preparar o instrumento MCE e o microchip e realizar as medições de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 4: Protocolo para Eletroforese Capilar de Microchip Com Deglicosilação Após Marcação de Proteínas (Método C)

[00162] Este método se aplica a glicoproteínas que precisam ser deglicosiladas antes de serem submetidas a medições de MCE. A menos que especificado de outra forma, todos os protocolos, produtos químicos, reagentes e análises são os mesmos descritos nos Exemplos 1-3.

[00163] Um diagrama do protocolo para deglicosilação após marcação de proteínas pode ser visto na FIG. 1. Tabela 8. Reagentes Adicionais

Procedimento

[00164] (1) Desnaturação. Diluir e desnaturar a amostra conforme descrito no Exemplo 2.

[00165] (2) Marcação. Preparar o corante de 5 µM conforme descrito na Tabela 4. Misturar 5 µM de corante e solução de proteína desnaturada acima mencionada em uma proporção de volume de 1:1. Por exemplo, se o volume da amostra for 10 µL, adicionar 10 µL de corante 5 µM. Selar a placa de 96 poços com uma vedação de polipropileno e aquecer no termociclador a 35 ° C por 30 minutos. Para extinguir a reação de marcação, obtenha uma placa de 96 poços não utilizada. Adicionar 2,5 µL de tampão de parada (frasco de tampa laranja do Pico Protein Reagent Kit, usar a solução original do kit) aos poços da placa vazia de acordo com a configuração de execução da amostra. Transferir 2,5 µL de amostra marcada para os poços da placa contendo a solução de parada. Pipetar a amostra da mistura em cada poço e segurar por pelo menos 3 minutos.

[00166] (3) Deglicosilação. Adicionar a cada poço 3 µL de água MilliQ e 2 µL de Tampão 5x RapidTM PNGase (formato não redutor de NEB) para fazer um volume de reação de 10 µL. Adicionar a cada poço 1-4 µL de RapidTM PNGase (formato não redutor de NEB). Selar a placa de 96 poços com uma vedação de polipropileno e aquecer no termociclador a 50 ° C por 10-30 minutos. Após a deglicosilação, adicionar a cada poço 17 µL de Tampão de Amostra (frasco de tampa branca do Pico Protein Reagent Kit) e 80 µL de água MilliQ.

[00167] (4) Executar em GX-II. Preparar o instrumento MCE e o microchip e realizar as medições de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 5: Comparando Sem Deglicosilação e Deglicosilação Antes da Marcação de Proteínas Usando uma Proteína Contendo Ácido Siálico Fortemente Glicosilada

[00168] A proteína 1 é uma proteína de fusão recombinante ligada por dissulfureto que tem 49 kDa de tamanho por massa peptídica e tem 8 sítios de N-glicosilação previstos (nota, não se espera que todos os sítios sejam glicosilados).

[00169] Um objetivo era desenvolver um método baseado em eletroforese capilar de microchip para caracterizar e monitorar fragmentos de baixo peso molecular (LMW) de uma proteína contendo ácido siálico altamente glicosilada (por exemplo, Proteína 1) para estudos de estabilidade de pesquisa e para estudos de controle de qualidade (CQ).

[00170] As características da Proteína 1 são mostradas na Tabela 9 abaixo: Tabela 9. Propriedades Moleculares da Proteína 1

[00171] Abreviações: MS intacto, espectrometria de massa de proteína intacta; SEC-MALS, espalhamento de luz laser de ângulo múltiplo por cromatografia de exclusão de tamanho.

[00172] Uma comparação de um protocolo sem deglicosilação (Método A, Exemplo 2) e um protocolo com deglicosilação antes da marcação (Método B, Exemplo 3) são mostrados na Figura 1. Uma comparação dos eletroferogramas da Proteína 1 produzida pelo Método A e Método B é mostrada na FIG. 2 para condições não reduzidas (NR), e na FIG. 4 para reduzido (R), respectivamente. Para condições NR, como resultado do Método A (sem deglicosilação), houve um pico amplo no eletroferograma sem resolução de pico (ou seja, sem separação dos picos Principal, alto peso molecular (HMW) e baixo peso molecular (LMW)). Além disso, a posição do pico apareceu em uma região de peso molecular (MW) muito mais alto (70120 kDa) do que o esperado em cerca de 64 kDa com base em um método ortogonal. O ensaio MCE pode estimar de forma imprecisa o tamanho com um erro maior quando a proteína é glicosilada (descrito por Engel et al. em Electrophoresis, 2015 Aug; 36(15):1754-8). Além disso, houve interferência de pico de corante livre em < 20 kDa que pode mascarar quaisquer picos de LMW abaixo de 20 kDa.

[00173] Em contraste, como resultado do Método B, onde a deglicosilação ocorre antes da marcação (Exemplo 3), há resolução de pico e separação de linha de base entre os picos (picos Principal, HMW, LMW). O pico principal apareceu próximo ao MW esperado (cerca de 49 kDa). O protocolo é indicativo de estabilidade e mais preciso com dimensionamento molecular. No entanto, o protocolo do Método B também requer 3 horas de deglicosilação, o que limita o rendimento geral do ensaio. Além disso, o pico PNGase (cerca de 36 kDa) interfere com os picos LMW 1 e 2 (picos de impureza dos fragmentos da Proteína 1). Especialmente para amostras de Proteína 1 estressadas termicamente, o pico de LMW 1 aumenta e se alarga, fundindo-se com o pico de PNGase (FIG. 3). Outro artefato próximo é a interferência de pico de corante livre em < 20 kDa. A combinação desses artefatos pode levar a uma integração imprecisa na quantificação de impurezas e limita a capacidade do ensaio de ser um indicador de estabilidade.

[00174] Observações semelhantes foram encontradas para condições reduzidas (FIG. 4): a deglicosilação de glicoproteínas é necessária para dimensionamento preciso, separação e resolução dos picos Main, LMW e HMW.

Exemplo 6: Deglicosilação após marcação de proteínas usando uma proteína contendo ácido siálico altamente glicosilada

[00175] Uma comparação de protocolos com deglicosilação antes da marcação (Método B) e após a marcação (Método C) é mostrada na FIG. 1.

[00176] Para desenvolver um protocolo com deglicosilação após marcação, as condições da reação de deglicosilação foram otimizadas, uma vez que a remoção não completa do pico glicosilado foi observada inicialmente com uma reação de deglicosilação de 30 minutos. As condições de temperatura, tempo, concentração e tampão foram variadas para determinar a deglicosilação ideal da Proteína 1.

[00177] A otimização para remover o pico incompletamente deglicosilado no eletroferograma NR da Proteína 1 produziu várias melhorias no protocolo. Isso inclui o uso do NEB RapidTM PNGase F e realizar a deglicosilação em temperatura elevada, 50 °C por 10 minutos (usando PNGase F convencional precisa de 3 horas de incubação a 37 °C), aumentando a concentração de endoglicosidase, e adicionando Glycoprotein Buffer do kit NEB PNGase.

[00178] Experimentos mostraram que o aumento do tempo de reação não teve melhora óbvia na deglicosilação. A FIG. 5 mostra eletroferogramas gerados usando Proteína 1, com 1 µL ou 2 µL de Rapid™ PNGase F (formato não redutor, NEB P0711), a 50 °C, com tempos de reação variando de 10 a 30 minutos. Como pode ser visto a partir da fig. 5, não houve melhora óbvia (isto é, redução do pico incompletamente deglicosilado) com tempos de reação de mais de 10 minutos.

[00179] O aumento na concentração de RapidTM PNGase F melhorou a deglicosilação. Usando o protocolo para deglicosilação após marcação, 1, 2, 3 ou 4 µL de RapidTM PNGase F foram adicionados à reação de deglicosilação e a reação foi deixada prosseguir a 50 °C por 10 minutos. Os resultados são mostrados na figura. 6 e FIG. 7. Como pode ser visto na inserção da FIG. 6, aumentar a concentração de RapidTM PNGase F diminui o pico secundário de deglicosilação incompleta da proteína 1.

[00180] Adicionar 1-4 µL de RapidTM PNGase F forneceu resultados robustos. Eletroferogramas gerados usando Proteína de Referência 1 deglicosilada usando 1, 2, 3 ou 4 µL de RapidTM PNGase F são mostrados na FIG. 7. A área sob os picos indicados foi integrada usando Empower e os resultados são fornecidos na Tabela 10 abaixo. Tabela 10. Integração de picos de Proteína 1 gerados usando diferentes quantidades de RapidTM PNGase F

[00181] Os resultados da integração mostraram que, embora houvesse um pico secundário decrescente após o pico principal (Proteína 1 incompletamente deglicosilada) que foi observado com um pico rápido mais alto na concentração de RapidTM PNGase F, a porcentagem total de integração do pico principal (MP) teve o valor mais alto em torno de 3 µL. De 1 µL a 4 µL de PNGase, o % RSD para o MP foi de 0,33%, sugerindo que o uso de concentrações de RapidTM PNGase F de 1-4 µL por reação fornecem resultados robustos. Seguindo esta tendência, usando mais RapidTM PNGase espera-se que o PNGase forneça resultados semelhantes.

[00182] O método C, onde a deglicosilação ocorre após a marcação, permite que este ensaio de MCE seja preciso e indicativo de estabilidade. A proteína 1 foi estressada mantendo a solução de proteína a 37 °C por 4 semanas (Padrão de Referência estressado, ou “SRS”, “37 °C 4w” nas Tabelas 11 e 12, em comparação com “RS” ou Padrão de Referência não estressado), e testado usando a deglicosilação seguindo o protocolo de marcação e MCE descrito aqui. Esta Proteína 1 estressada foi comparada com a Proteína 1 não estressada (tempo igual a 0, ou t0, ou seja, sem retenção de 37 °C). Os eletroferogramas foram gerados para a Proteína 1 estressada e não estressada (FIG. 8), e os picos indicados foram integrados usando Empower. As medições foram repetidas para três réplicas (S1-S3), e os resultados são mostrados nas Tabelas 11 e 12 abaixo. Tabela 11: Comparação de Proteína 1 estressada (SRS) e não estressada (RS) usando uma deglicosilação após protocolo de marcação Tabela 12. Percentual de Desvio Padrão Relativo (% RSD) da Proteína 1 Estressada e Não Estressada (N=3)

[00183] Três medições repetidas de RS e SRS mostraram que vários picos de LMW e HMW foram consistentemente identificados entre as corridas e integrados com menos de 1% de RSD para pico de LMW e MP. Todas as alterações foram significativas de RS para SRS. Uma comparação de eletroferogramas da Proteína 1 estressada e não estressada preparada pelo Método C (FIG. 8) indicou que este método é preciso e indicativo de estabilidade.

[00184] Quando a deglicosilação com PNGase F é realizada antes da marcação com corante (Método B), o pico PNGase F é visível no perfil do eletroferograma e interfere com o pico LMW 1 e LMW 2. Um longo tempo de deglicosilação (3 horas) é usado e há interferência de corante livre (<20 kDa).

[00185] Quando a deglicosilação com RapidTM PNGase F é realizada após marcação com corante (Método C), nenhum pico PNGase é visível no eletroferograma. Há deglicosilação rápida e completa (por exemplo, em 10 minutos). A resolução de picos de MP, HMW e LMW é alcançada juntamente com interferência mínima de corante livre até cerca de 10 kDa (por exemplo, na FIG. 8, o pico de LMW 5 é de 11 kDa e é resolvido na linha de base a partir do artefato de pico de corante livre).

[00186] Em resumo, os métodos de MCE usando deglicosilação após marcação de corante, como o Método C, têm boa resolução, são indicadores de estabilidade, alto rendimento, reprodutíveis e evitam artefatos de ensaio da interferência de pico de PNGase F e interferência de corante livre. Os métodos também mostram boa precisão, linearidade e robustez. Esses ensaios podem ser usados em um formato de alto rendimento baseado em placas que é adequado para fins de controle de qualidade.

Exemplo 7: Comparação de resultados de MCE gerados com e sem deglicosilação usando proteína 2

[00187] A proteína 2 é uma proteína semelhante a (Fab')2 recombinante de cadeia simples compreendendo uma proteína de fusão de cadeia simples que inclui um domínio de ligação de ligando ligado por um ligante de sequência GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1). A proteína tem um peso molecular previsto de 48 kDa (base peptídica). A proteína 2 tem 8 sítios de N-glicosilação.

[00188] Os eletroferogramas de MCE para a Proteína 2 foram gerados usando um protocolo sem deglicosilação (Método A, Exemplo 2) e com deglicosilação após marcação (Método C, Exemplo 4), sob condições não reduzidas e reduzidas. Como pode ser visto na FIG. 9, sem deglicosilação, houve apenas um pico amplo sem separação aparecendo em uma região de MW (90-140 kDa) que era muito maior que o valor teórico (cerca de 48 kDa). Pelo contrário, a deglicosilação produziu um pico principal próximo ao MW esperado (48 kDa) e picos de LMW claramente resolvidos. Além disso, um pico de PNGase (~ 36 kDa) não apareceu no eletroferograma.

Exemplo 8: Comparação de resultados de MCE gerados com e sem deglicosilação usando proteína 3

[00189] A proteína 3 é uma subunidade recombinante de IgG 1 Fc humana clivada em um local específico por uma protease de cisteína recombinante. A proteína tem um peso molecular previsto de 23 kDa. A proteína tem um sítio de N-glicosilação.

[00190] Os eletroferogramas de MCE foram gerados usando um protocolo sem deglicosilação (Método A, Exemplo 2) e com deglicosilação após marcação (Método C, Exemplo 4), sob condições não reduzidas. Os resultados podem ser vistos na FIG. 10. No perfil de não deglicosilação, foram encontrados dois picos principais (MPs) que representam a população não glicosilada (MP1, esquerda) e a população glicosilada (MP 2, direita) na amostra original. No perfil deglicosilado, apenas o pico não glicosilado foi observado e vários picos de HMW foram resolvidos. A mesma comparação também foi realizada em condições redutoras (FIG. 11).

Exemplo 9: Avaliação de Estabilidade de um Anticorpo Monoclonal

[00191] A proteína 4 é um anticorpo monoclonal baseado em IgG4 humano com um peso molecular de 145 kDa e 2 sítios de glicosilação ligados a N.

[00192] Os eletroferogramas de MCE foram gerados para amostras de Proteína 4 preparadas usando um protocolo sem deglicosilação (Método A, nas FIGS. 12 e 13), e usando um protocolo com deglicosilação após marcação (Método C, nas FIGS. 12 e 13). A proteína foi testada usando desnaturação em condições não redutoras (FIG. 12) e em condições redutoras (FIG. 13). Como pode ser visto na FIG. 13, a deglicosilação muda o Pico Principal Glicosilado (GMP) para um Pico Principal Deglicosilado (DGMP) a um peso molecular mais baixo como resultado da remoção de glicanos. Na FIG. 13, a deglicosilação reduz o tamanho do pico de Cadeia Pesada (HC), como pode ser visto comparando os picos de Cadeia Pesada Deglicosilada (DGHC) e Cadeia Pesada Glicosilada (FGHC).

Exemplo 10: Avaliação de Estabilidade da Proteína 1 Fotoestressada

[00193] A proteína 1 foi fotoestressada expondo a solução de proteína sob luz de lâmpada fluorescente branca fria (CW) com exposição acumulativa de 1,2 e 2,4 milhões de lux horas (MLH) (FIG. 14), ou sob ultravioleta próximo integrado (UVA) com uma energia de 200 e 400 watts horas/metro quadrado (FIG. 15). As amostras foram testadas usando a deglicosilação seguindo o protocolo de marcação (Método C) e MCE conforme descrito nos Exemplos 1 e 4. As amostras de Proteína 1 estressadas foram comparadas com o controle de Proteína 1 não estressado (que foi incubado nas mesmas condições, mas coberto com papel alumínio). Os eletroferogramas foram gerados para a Proteína 1 estressada e não estressada e os picos indicados foram integrados usando Empower. Os resultados são mostrados na Tabela 13. Tanto a exposição CW quanto UVA levaram a aumentos leves dos picos de LMW e aumentos significativos dos picos de HMW, o que pode ser devido à formação foto-iniciada de dímeros e multímeros ligados covalentes. Os resultados mostram que este método é indicativo de estabilidade e capaz de avaliar a fragmentação e formação de HMW de ligação covalente de proteína sob condições de estresse. Tabela. 14. Comparação da proteína 1 fotoestressada e não estressada usando um protocolo de deglicosilação após marcação (Método C).

Claims

1. Método para determinar a estabilidade de uma proteína de interesse, caracterizadopelo fato de que compreende: a. estressar uma amostra compreendendo a proteína de interesse; b. desnaturar a amostra estressada e uma amostra não estressada compreendendo a proteína de interesse; c. marcar a amostra estressada e a amostra não estressada com um marcador fluorescente para produzir uma amostra estressada marcada e uma amostra não estressada marcada; d. extinguir o marcador fluorescente que não reagiu na amostra estressada marcada e na amostra não estressada marcada; e. desglicosilar da amostra estressada marcada e da amostra não estressada marcada com uma endoglicosidase; f. realizar eletroforese capilar de microchip (MCE) na amostra estressada marcada e na amostra não estressada marcada para gerar eletroferogramas para a amostra estressada e a amostra não estressada; e g. comparar os eletroferogramas da amostra estressada e da amostra não estressada, determinando assim a estabilidade da proteína de interesse; em que a amostra estressada e a amostra não estressada são desnaturadas, marcadas e extintas nas etapas (b) a (d) antes da desglicosilação na etapa (e).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o estresse da amostra compreende o estresse térmico da amostra, pelo menos um ciclo de congelamento/descongelamento, a exposição da amostra a condições de armazenamento, a agitação mecânica da amostra, a liofilização e a reidratação da amostra ou a exposição da amostra à luz, radiação, espécies de oxigênio singleto, radicais livres, condições de pH alto ou condições de pH baixo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o estresse térmico da amostra compreende manter a amostra entre 30 °C e 45 °C por pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas ou pelo menos 8 semanas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as condições de armazenamento compreendem uma temperatura de -80 °C a -30 °C durante pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, em pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses ou pelo menos 30 meses; ou em que as condições de armazenamento compreendem uma temperatura de 2 °C a 8 °C durante pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 12 meses ou pelo menos 18 meses.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é uma proteína glicosilada compreendendo pelo menos um glicano ligado.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse compreende um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um scFv.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse compreende um domínio Fc.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse compreende uma proteína de fusão de receptor.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão do receptor é uma proteína de fusão receptor-Fc ou uma proteína de fusão TCR-Fc solúvel.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é uma proteína humana recombinante.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a endoglicosidase catalisa a desglicosilação de glicanos N-ligados.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a endoglicosidase é selecionada do grupo que consiste em Peptídeo-N-Glicosidase F (PNGase F), Endoglicosidase H (Endo H), Endoglicosidase S (Endo S), Endoglicosidase D, Endoglicosidase FI, Endoglicosidase F2 e Endoglicosidase F4.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a endoglicosidase catalisa a desglicosilação de glicanos ligados a O.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 13, caracterizado pelo fato de que a endoglicosidase compreende Endo-aN-acetilgalactosaminidase (O-glicosidase).

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as amostras estressadas e não estressadas são desnaturadas usando uma solução redutora.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a solução redutora compreende ditiotreitol (DTT).

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as amostras estressadas e não estressadas são desnaturadas usando uma solução não redutora.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a solução não redutora compreende iodoacetamida (IAM).

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a análise de um padrão de referência em paralelo às amostras estressadas e não estressadas.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a comparação dos eletroferogramas para as amostras estressadas e não estressadas compreende a comparação do número de pico, altura, posição, área ou uma combinação destes.