JPWO2004024752A1

JPWO2004024752A1 - タンパク質精製方法

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Publication number: JPWO2004024752A1
Application number: JP2004535948A
Authority: JP
Inventors: 浩三竹田; 教道越智; 公恵石井; 松橋　学; 学松橋; 暁則今村
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-09-11
Filing date: 2003-09-11
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2023-09-11
Also published as: KR101119448B1; US20200231624A1; ES2626268T3; JP5687469B2; US20060142549A1; US8420789B2; CN1681837A; EP1561756B1; EP1561756A4; US10654888B2; HUE027134T2; EP1561756A1; WO2004024752A1; SI1561756T1; CN100522989C; KR20050038042A; AU2003262087A1; HK1077836A1; SI2261230T1; ES2558303T3

Abstract

課題：より簡単な方法で、ＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を確実に除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法を提供する。解決手段：以下の段階：１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点よりも低いｐＨの低伝導度水溶液状態とし、２）生じる粒子を除去する、を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。

Description

本発明はタンパク質の精製方法に関し、さらに詳しくは抗体などの生理活性タンパク質を含有する試料中から夾雑物としてのＤＮＡといった不純物を除去する方法に関する。

遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。特に、近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、臨床試験に入っている。
このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性タンパク質を含有する製剤においては、宿主ＤＮＡやウイルスの汚染による不純物、例えばＤＮＡ夾雑物を除去する必要がある。現在、バイオ医薬品におけるＤＮＡの許容量は１００ｐｇＤＮＡ／一投与量以下であることが世界保健機構（ＷＨＯ）により示されている。この基準を満たすために、一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有する水性培地を陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せで処理することによりＤＮＡを除去している。
特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であるときには、プロテインＡもしくはプロテインＧがＩｇＧのＦｃ鎖に結合する性質を利用して、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティカラムクロマトグラフィー処理を行った後に種々のクロマトグラフィーで精製している。
例えば、特表平５−５０４５７９号では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液（濃度約０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．０−３．５）を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製している。
しかし、これらの各種クロマトグラフィー工程やその組合せは時間、労力、コストがかかり、煩雑であり、また効果も安定していない。
本発明の目的は、より簡単な方法で、確実にＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、生理活性タンパク質含有試料を、生理活性タンパク質の等電点より低いｐＨで低伝導度水溶液にし、生じた粒子をフィルター濾過することにより、煩雑なクロマトグラフィー工程を行わずにＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を効率よく除去できることを見出してして本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨの低伝導度の水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
（２）低伝導度の水溶液の伝導度が、０〜１００ｍＭのモル濃度である前記（１）記載の方法。
（３）低伝導度の水溶液のイオン強度が、０〜０．２である前記（１）又は（２）記載の方法。
（４）低伝導度の水溶液の導電率が、０〜３００ｍＳ／ｍである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）水溶液のｐＨが生理活性タンパク質の等電点以下、かつｐＨ２．０以上である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）不純物がＤＮＡ夾雑物である（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）不純物がウイルスである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（９）ＤＮＡ夾雑物除去処理後の生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物がＤＮＡ濃度２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である（７）に記載の方法。
（１０）生理活性タンパク質が抗体である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）抗体がＩｇＧ抗体である前記（１０）に記載の方法。
（１２）抗体がヒト型化モノクローナル抗体である前記（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である前記（１２）記載の方法。
（１４）抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である前記（１２）記載の方法。
（１５）抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）である前記（１２）記載の方法。
（１６）生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法
（１７）粒子をフィルター濾過によって除去する前記（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整することによって１）の工程を行う、（１）の方法。
（１９）生理活性タンパク質が抗体であって、該抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを該抗体の等電点以下のｐＨに調整することによって１）の工程を行う、（１）の方法。
（２０）緩衝液がＴｒｉｓ水溶液である前記（１８）又は（１９）記載の方法。
（２１）前記（１）〜（２０）のいずれかに記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。
（２２）前記（１）〜（２０）のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用タンパク質製剤の製造方法。

本発明の方法で精製する生理活性タンパク質含有試料に含まれる生理活性タンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、Ｇ−ＣＳＦ、モノクロナール抗体等の抗体が好ましく、さらに好ましくはモノクローナル抗体である。プロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて実施する本発明の態様では、モノクローナル抗体が好ましい。抗体はＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭに分類されるが、ＩｇＧ抗体が好ましい。
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法による生理活性タンパク質は、大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
生理活性タンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭６１−１２２８８号）により大腸菌などの細菌類、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特開平８−１５１３９８号、特表平８−５０６０２３号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
生理活性タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。
生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ＰｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍｂｙＭＡＣＭＩＬＬＡＮＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）が好ましく例示される（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１４５８０を参照）、ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）（国際特許出願公開番号ＷＯ９８−１３３８８を参照）、ヒト型化抗組織因子抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９９−５１７４３を参照）なども本発明で使用する好ましい抗体である。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列に基づいて適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
さらに、トランスジェニック動物等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
さらに、抗体にはＦａｂ，（Ｆａｂ’）_２，Ｆｃ，Ｆｃ’，Ｆｄなどの抗体断片や、１価又は２価以上の一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）などの再構成したものも含む。
本発明では、生理活性タンパク質含有試料もしくは抗体含有試料とは、好ましくは、培養により得られた生理活性タンパク質もしくは抗体を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施したものをいう。
本発明の好ましい態様では、以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨの低伝導度水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。
本発明の方法によって除去される不純物は、目的のタンパク質以外の物質であれば、いかなる物質でもよい。不純物の例としては、ＤＮＡ夾雑物、ウイルス、プロテインＡ（カラムからの溶出物）、エンドトキシン、ＨＣＰ（細胞由来蛋白質）、培地成分であるＨｙ−Ｆｉｓｈ（ＦＬ）、ＩＧＦなどを挙げることができるが、好ましくはＤＮＡ夾雑物又はウイルスである。ここでＤＮＡ夾雑物とは、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡであり、宿主由来のＤＮＡや汚染したウイルス由来のＤＮＡが含まれる。
本発明の方法によって除去されるウイルスには特に制限はなく、どのようなウイルスを除去してもよく、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが含まれる。ＲＮＡウイルスとしては、Ｘ−ＭｕＬＶといったレトロウイルス、Ｒｅｏ３といったレオウイルス、ＭＶＭといったパラボウイルスが挙げられる。本発明の方法によって除去されるウイルスの具体的な例としては、例えば、Ｘ−ＭｕＬＶ、ＰＲＶ、Ｒｅｏ３、ＭＶＭ、ＶＳＶ、ヘルペスシンプレックス、ＣＨＶ、シンドビス、ムンプス、ワクチニア、Ｍｅａｓｌｅ、Ｒｕｂｅｌｌａ、インフルエンザ、ヘルペスゾスター、サイトメガロ、パラ−インフルエンザ、ＥＢ、ＨＩＶ、ＨＡ、ＨＢ、ＮＡＮＢ、ＡＴＬ、ＥＣＨＯ、バルポなどを挙げることができるが、好ましくは、Ｘ−ＭｕＬＶ、Ｒｅｏ３、ＭＶＭ、ＰＲＶである。
本発明において、低伝導度水溶液とは、通常、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０．２、好ましくは０〜０．１２の水溶液または、導電率が０〜３００ｍＳ／ｍ、好ましくは０〜２００ｍＳ／ｍ、さらに好ましくは０〜１５０ｍＳ／ｍの水溶液をいう。
生理活性タンパク質の等電点とは、水溶液中において生理活性タンパク質の電荷が見かけ上なくなるｐＨの値である。等電点は当業者に公知に方法により測定することが可能であり、例えば、種々のｐＨの溶液中で電気泳動を行い生理活性タンパク質が移動しなくなるｐＨを求める等電点電気泳動などにより測定することが可能である。生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨは、好ましくは生理活性タンパク質の等電点未満のｐＨである。
本発明の方法において、不純物がＤＮＡである場合、生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨにすることにより生理活性タンパク質を正に帯電させ、さらにＤＮＡを負に帯電させることが好ましい。
通常、ＤＮＡはバックボーン中のリン酸基により非常に強い負イオンの電荷を有している（核酸の強酸性リン酸ジエステル結合内のリン酸基のｐＫ値は約１である）ので、ＤＮＡを負に帯電させるｐＨは特に限定されず、生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨを用いることが可能である。生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨは、生理活性タンパク質ごとに異なると考えられるので、当業者は公知の方法（例えば、実施例に記載されているように複数の異なるｐＨの試料を調製し、ＤＮＡ除去率やタンパク質回収率などを測定する、などの方法）により生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいｐＨを選択することが可能である。そのようなｐＨとしては、通常ｐＨ２．０以上、好ましくはｐＨ３．０以上、特に好ましくはｐＨ４．０以上である。
ＤＮＡが負に帯電していることを確認するには公知の方法、例えば電気泳動によるタイトレーションカーブ（ＥＴＣ）を用いた方法（ＩｏｎＥｘｃｈａｎｇｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ（現ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），ｐ５２〜ｐ５６）により調べることができる。
さらに、本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整することも可能である。
従って、本発明の別の好ましい態様では、以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、
２）得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整し、
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
本発明における低伝導度の酸性水溶液とは、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０．２、好ましくは０〜０．１２の水溶液または、導電率が０〜３００ｍＳ／ｍ、好ましくは０〜２００ｍＳ／ｍ、さらに好ましくは０〜１５０ｍＳ／ｍの水溶液であって、ｐＨ２．０〜３．９、好ましくはｐＨ２．０〜３．０の水溶液をいう。酸性水溶液は、塩酸、クエン酸、酢酸などの水溶液から選択してよい。精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、使用する低伝導度の酸性水溶液の種類、伝導度、ｐＨはそれぞれ異なっており、当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、これらの最適条件を容易に設定できる。
また、本発明の方法で使用する低伝導度のアルカリ性水溶液とは、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０．２、好ましくは０〜０．１２の水溶液または、導電率が０〜３００ｍＳ／ｍ、好ましくは０〜２００ｍＳ／ｍ、さらに好ましくは０〜１５０ｍＳ／ｍの水溶液であって、一般にはｐＨ７．５〜１３である（ｐＨは精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、それぞれ異なっている）。
本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とした後、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整する。緩衝液としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸、Ｔｒｉｓ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＯＨなどを挙げることができる。
さらに本発明では、例えば、生理活性タンパク質が抗体の場合、一般的に、抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを生理活性タンパク質の等電点以下で好ましいものに調整することが可能である。
従って、本発明のさらに別の好ましい態様では、以下の段階：
１）抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
２）得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整し、
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
この方法で使用する低伝導度の酸性水溶液は上記したものを使用することができ、また緩衝液としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸、Ｔｒｉｓ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＯＨなどを挙げることができる。
本発明の方法では、上記段階で生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨになった溶液は粒子（白濁）を生じる。この粒子をフィルター濾過によって除去することによって、ＤＮＡ夾雑物といった不純物を効率よく除去することができる。濾過に用いるフィルターは、例えば、１．０〜０．２μｍのＣｅｌｌｕｌｏｓｅＡｃｅｔａｔｅＦｉｌｔｅｒＳｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）もしくはＴＦＦなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
また、上記粒子を除去するための方法としては遠心分離操作等も考えられ、粒子を効率的に除去できる手法であればよく、フィルター濾過に限定されるものではない。
本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、不純物がＤＮＡである場合、上記粒子は生理活性タンパク質とＤＮＡとによって形成される複合体であると推定している。タンパク質が等電点より低いｐＨになることにより正に帯電し、一方、ＤＮＡが負に帯電することにより、ＤＮＡとタンパク質の複合体が形成されると推定している。さらに、低伝導度の水溶液にすることにより、より複合体が形成されやすくなると考えている。粒子をフィルター除去することによってＤＮＡ−生理活性タンパク質複合体中に含まれる生理活性タンパク質が少量ロスとなるが、生理活性タンパク質の全体からすると数％であり、後述する実施例に記載するように、生理活性タンパク質の約９０％を回収することができた。
また、このＤＮＡ−生理活性タンパク質複合体が樹脂上で生じるためにプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィー単独ではＤＮＡ夾雑物とタンパク質の分離が効果的に行えないのではないか、と推測している。本発明の方法により精製された生理活性タンパク質は、さらに陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せなどにより精製して医薬製剤に用いることができる。
ＤＮＡ定量法としてはスレッシュホールド総ＤＮＡ定量法により測定し、測定に先だってＤＮＡ抽出操作を実施するが、これらに限定されるものではない。
ウイルス定量法としては、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたＴＣＩＤ_５０（ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ（５０％）；５０％培養細胞感染量）、並びに画分中のウイルス量を定量できるＲＴ／Ｑ−ＰＣＲおよびＱ−ＰＣＲにより測定するが、これらに限定されるものではない。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。

実施例１：ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）精製におけるプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーの緩衝液組成の検討
１．１．試験方法
（１）検討材料（抗体含有試料）
ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）産生ＣＨＯ細胞培養上清液（以下ＣＭと略す）（細胞遠心除去済み：−８０℃保存）含有試料は、上記ＣＭを０．２２μｍＣｅｌｌｕｌｏｓｅＡｃｅｔａｔｅ（ＣＡと略す）ＦｉｌｔｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて濾過し、精製検討に使用した。なお、ｈＰＭ−１抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９号公報の実施例１０に記載されたヒトエロンゲーションファクターＩαプロモーターを利用し、特開平８−９９９０２号公報の参考例２に記載された方法に準じて作成した（等電点：ｐＨ９．０）。
（２）使用機器
塩酸溶出検討時
ＨＰＬＣ：Ｌ−６２００ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔＰｕｍｐ（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｌ−４２００ＵＶ−ＶＩＳＤｅｔｅｃｔｏｒ（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｄ−２５００Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ（ＨＩＴＡＣＨＩ）
カラム：ＨＲ５／２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社），５ｍｍＩ．Ｄ．×２０ｍｍＨ
Ｍｅｄｉａ：ＰＯＲＯＳ５０Ａ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社），０．４ｍｌ
Ｌｏｔ；Ａ２５０−０３９，Ｃｏｄｅ；ＳＰＥＣＩＡＬ
粒子検討時
ＨＰＬＣ：ＷａｔｅｒｓＰｒｅｐＬＣ４０００Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）
Ｗａｔｅｒｓ２０００ＳｙｓｔｅｍＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ）
Ｗａｔｅｒｓ４８６ＴｕｎａｂｌｅＡｂｓｏｒｂａｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）
Ｗａｔｅｒｓ７４１ＤａｔａＭｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ）
分光光度計：Ｕ−２０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
カラム：ＸＫ２６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社），２６ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍＨ
Ｍｅｄｉａ：ＰＯＲＯＳ５０Ａ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社），５３ｍｌ
Ｌｏｔ；Ａ２５０−０３９，Ｃｏｄｅ；ＳＰＥＣＩＡＬ
（３）分析、定量法
ｈＰＭ−１定量法：直線濃度勾配法によるＰＬＲＰ−Ｓカラム（ポリマーラボラトリーズ社）を用いる逆相ＨＰＬＣにより定量する。
ＤＮＡ量測定法：スレッシュホールド総ＤＮＡ定量法により測定する。測定に先だってＤＮＡ抽出操作（ＤＮＡエキストラクターキット＜和光純薬＞等）を実施する。また、測定にはスレッシュホールド総ＤＮＡ定量キット（モレキュラーデバイス社製）を用いる。
濁度測定法：粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計Ｕ−２０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）に供し、６６０ｎｍにおける吸収を測定する。
１．２．溶出条件の検討
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおいて溶出液として用いる緩衝液組成を変更した検討を行い、ｈＰＭ−１回収率及び溶出液によるＤＮＡ除去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表１に示す条件でカラムにかけた。表１に示す平衡化緩衝液にてプロテインＡ樹脂を平衡化し、続いて上記抗体含有試料負荷、その後、洗浄１、洗浄２、溶出と実施する。溶出プロファイルをＡ２８０ｎｍで監視し、タンパク質のピークを単離した。なお、表中Ｃ−ＰＢｕｆｆｅｒはクエン酸−リン酸緩衝液を示す。

溶出法１、２，３において、クロマトグラム上で差異は確認されなかった。
また、各溶出画分を３００ｍＭＴｒｉｓ溶液でｐＨ７．０に調整したところ、塩酸溶出画分（溶出法２、溶出法３）では粒子が生じた。更に、粒子形成とｈＰＭ−１回収率及び残存ＤＮＡ量との相関を求める検討をも行った。
粒子相関検討として、溶出法２における溶出液塩酸中にＮａＣｌを添加し、添加ＮａＣｌ濃度（０ｍＭ，５０ｍＭ，１００ｍＭ）と各種要因との相関を求めた。添加ＮａＣｌ濃度と各種要因との相関検討として、それぞれのＮａＣｌ添加によるＰｒｏｔｅｉｎＡ溶出画分を３００ｍＭＴｒｉｓ溶液でｐＨ７．０に調整したサンプルを濾過前、そのｐＨ調整後サンプルを０．２２μｍＣＡＦｉｌｔｅｒにて濾過したサンプルを濾過後とした。濾過前及び濾過後サンプルを上記測定法でｈＰＭ−１回収率（濾過後のみ）を測定し、残存ＤＮＡ量を測定した。
１．３．回収率
各溶出条件におけるｈＰＭ−１回収率を測定した。その結果、溶出法１における回収率は９８．６％と良好であった。また溶出法２における回収率では８３．８％〜９７．１％、溶出法２における回収率では８３．５％〜９３．７％とばらつきが生じたが、検討スケールが小さい要因（樹脂量：０．４ｍｌ）から生じるばらつきであると推測された。そこで、精製スケールをアップした検討（溶出法２）では安定してｈＰＭ−１回収率９０％以上を示す事を確認した。従って、塩酸溶出の場合であっても、ｈＰＭ−１の回収率は良好であることが判明した。
１．４．溶出液塩酸中の添加ＮａＣｌ濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加ＮａＣｌ濃度と各種要因相関を調べた結果を表２に示す。

濾過後のｈＰＭ−１回収率は１００ｍＭＮａＣｌ添加サンプルで８８％を示し、順に５０ｍＭＮａＣｌ添加の８６％、０ｍＭＮａＣｌ添加の８１％であった。残存ＤＮＡ量に関しては、濾過前後のサンプルでともに、０ｍＭＮａＣｌ添加サンプルが低値を示し、特に濾過後の０ｍＭＮａＣｌ添加サンプルでは１１ｐｇＤＮＡ／ｍｇｈＰＭ−１と極めて低値であった。
また、ｐＨ調整後サンプルにおいて濁度の高値なサンプル程、濾過後のｈＰＭ−１回収率及び残存ＤＮＡ量が低値を示している。この結果は、粒子形成にｈＰＭ−１及びＤＮＡが関与している可能性が高い事を示すものである。おそらくｐＨを７．０に調整する事によりｈＰＭ−１とＤＮＡが相互作用し粒子を生じると推測される。ｈＰＭ−１回収率を高くするという点からは、添加ＮａＣｌ濃度を増加させることが好ましく、逆に残存ＤＮＡ量減少を重視するという点からは、溶出液塩酸中にＮａＣｌを無添加とすることが望ましい。
実施例２：ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体の精製
ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清を０．４５＋０．２μｍＣＡＳＡＲＴＯＢＲＡＮＰフィルター（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濾過したもの）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条件により精製した。なお、ＰＴＨｒＰ抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法によって作成した（等電点：ｐＨ８．３）。
２．１．実験条件
精製装置：ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）
カラム：ＨＲ５／５，Ｃ１０，ＸＫ−２６（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）
樹脂：ｒＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ
負荷：培養上清直接負荷（ｐＨ６．６〜７．５）
溶出画分調整：１ＭＴｒｉｓ水溶液により各種ｐＨに調整し、０．２μｍＣｅｌｌｕｌｏｓｅＡｃｅｔａｔｅ（以下ＣＡと略す）フィルター濾過によりＤＮＡを除去（以下の（１）において条件を検討）。
プロテインＡカラムを１５０ｍＭＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で十分に平衡化した後、上記抗体含有ＣＭを負荷した。続いて結合していない不純物を１５０ｍＭＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄を行い、その後２０ｍＭクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをＡ２８０ｎｍで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインＡ溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
２．２．溶出後の残存ＤＮＡ除去条件検討
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、１．０ＭＴｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（未調整（２．７），４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，６．５，７．０，７．５）に調整した。その後、一定時間放置し、０．２２ｕｍＣＡフィルター濾過処理を行った。その後１．０ＭＴｒｉｓ水溶液によりｐＨ７に調整し、ＤＮＡ定量を行った。表３に各検討ｐＨ及び放置時間と残存ＤＮＡの結果示す。

表から明らかなように、ｐＨ５．５、６．０における０，６，２４時間放置すべてにおいてＤＮＡが検出限界以下となった。またＤＮＡ除去状況に関してはｐＨ５．５、６．０を中心としてｐＨが高く、又は低くなるにつれてＤＮＡ除去の効率が悪くなることが観察された。
実施例３：ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の精製
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の表４に記載の条件により精製した。なお、ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１４５８０号公報に記載の方法によって作成した（等電点：ｐＨ９．０）。
３．１．実験条件
カラム：ｒＰｒｏｔｅｉｎＡＦＦ，５ｍＬ（１６ｍｍＩＤｘ２５ｍｍＨ）
流速：５ｍＬ／ｍｉｎ（１５０ｃｍ／ｈ）
サンプル：培養上清直接負荷

プロテインＡカラムを１５０ｍＭＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で十分に平衡化した後、上記抗体含有ＣＭを負荷した。続いて結合していない不純物を１５０ｍＭＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄を行い、その後２０ｍＭクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをＡ２８０ｎｍで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインＡ溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
３．２．溶出後の残存ＤＮＡ除去条件検討
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、１．０ＭＴｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝４．５−７．５）に調整した。その後、一定時間放置し、０．２２ｕｍＣＡフィルター濾過処理を行った。その後１．０ＭＴｒｉｓ水溶液によりｐＨ７に調整し、ＤＮＡ定量及び逆相カラムによるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の定量を行った。表５にＤＮＡ量の測定結果を、また表６にヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の収量測定の結果を示す。

ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー精製した後のサンプルにおいては大量のＤＮＡが存在していたが、実験１ではｐＨ７．５，６．５，５．５とｐＨの低下に従ってＤＮＡ量が減少しており、また時間は０時間の方がＤＮＡ除去率が高い傾向があった。実験２ではｐＨ＝４．５，５．０，５．５の条件で同様の実験を行ったが、この間においてはｐＨおよび時間に関係なく十分にＤＮＡが同程度に除去されていた。更に回収量の計算からヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体はほとんど消失していないことが判明した。
実施例４：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の精製
Ｇ−ＣＳＦ含有試料（ＣＨＯ細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施した（等電点：ｐＨ５．５〜５．７）。
４．１．溶出後の残存ＤＮＡ除去条件検討
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行った。Ｇ−ＣＳＦ含有試料に低伝導度の酸性溶液（２．５ｍＭＨＣｌ水溶液）を添加し、更に２０％塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料ＤＮＡを添加した。１．０ＭＴｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝４．３又は６．６）に調整し、続いて０．２２ｕｍＣＡフィルター濾過処理を行った。その後、ろ過前後の画分のＤＮＡ定量を行った。表８にＤＮＡ量の測定結果を示す。

上記検討結果より濾過時ｐＨ４．３の場合においてＤＮＡを多量に含んだＧ−ＣＳＦ含有試料からＤＮＡ量が効率的に減少し定量限界以下であった。
実施例５：ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）精製におけるウイルス除去効果
５．１検討材料（抗体含有試料）
ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化ＩＬ−６レセプター抗体）産生ＣＨＯ細胞培養上清液（ＣＭ）（細胞遠心済み：−８０℃保存）含有試料に、それぞれＸ−ＭｕＬＶ、Ｒｅｏ３、ＭＶＭを添加後、各ＣＭを０．４５μｍフィルター（ボトルトップフィルター：ＣＯＲＮＩＮＧ社製）を用いてろ過し、精製検討用に使用した。なお、ｈＰＭ−１抗体は、実施例１と同様に作成した。なお、使用した各ウイルスはＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。
５．２ｒＰｒｏｔｅｉｎＣｏｌｕｍｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙでの精製
５．１で作製したウイルス添加試料をｒＰｒｏｔｅｉｎＣｏｌｕｍｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙで精製した。具体的な条件は以下の通りである。
樹脂：ｒＰｒｏｔｃｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｃＦａｓｔＦｌｏｗ
機器：ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ
カラム：ＸＫ１６／２０、ＸＫ１６／４０
樹脂高：１１．５ｃｍ
溶出条件
平衡化：１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／ＬＣ−ＰＢｕｆｆｅｒ，
ｐＨ７．５±０．２，Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ８．５±０．５Ｓ／ｍ
洗浄１：１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／ＬＣ−ＰＢｕｆｆｅｒ，
ｐＨ７．５±０．２，Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ８．５±０．５Ｓ／ｍ
洗浄２：１０ｍｍｏｌ／ＬＣ−ＰＢｕｆｆｅｒ，
ｐＨ７．７±０．２，Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ１６５±２０ｍＳ／ｍ
溶出：２．５ｍｍｏｌ／ＬＨＣｌ，
ｐＨ２．７±０．２，Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ１０７±１０ｍＳ／ｍ
５．３低ｐＨ処理
５．２で得られた溶出画分を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ３．２±０．１に調整し、室温１５±５℃で３０分以上保持した。その後、各溶出画分を３００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ溶液でｐＨ７．２±０．１に調整した。そのうちの４０．０ｍＬを、グラスファイバーフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）（０．２μｍ、ＰＡＬＬ社製）を一次側、バイオイナート（０．２μｍ、ＰＡＬＬ社製）（ＰＡＬＬ社製のフィルターホルダーに直径１５ｍｍのアジャスターを装着）を二次側になるよう連結したろ過ユニットを用いて０．０３±０．０１ＭＰａで加圧ろ過した。
５．４ウイルスの検出
採取したサンプルは全てＴＣＩＤ_５０で測定を行った。また、Ｘ−ＭｕＬＶおよびＭＶＭのクリアランス能試験では、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたＴＣＩＤ_５０に加え、画分中のウイルス量を定量できるＲＴ／Ｑ−ＰＣＲおよびＱ−ＰＣＲによる測定を行った。
５．５結果
５．４の測定の結果を以下の表に示す。

以上のように、本発明の精製工程により、いずれのウイルスについても非常に高いＬＲＶ（ＬｏｇａｒｉｔｈｍｉｃＲｅｄｕｃｔｉｏｎＶａｌｕｅ）が得られ、低ｐＨ処理・ろ過後では定量限界以下にまで除去されていることが確認された。

本発明の方法により、ＤＮＡ夾雑物やウイルスといった不純物を極めて簡単な方法で、効率よく除去することが可能となり、生理活性タンパク質、特に抗体の精製がはるかに効果的となった。不純物がＤＮＡである場合には、ＤＮＡ濃度を極めて低濃度に（例えば２２．５ｐｇ／ｍｌ）、不純物がウイルスである場合には、ウイルス力価を極めて低い値に（例えばＴＣＩＤ_５０法で１．０３（Ｌｏｇ_１０／ｍＬの表記による））することができた。また、本発明の方法によりコストを低減することができ、格別の技術的意義を有するものである。

Claims

以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨの低伝導度の水溶液状態とし、
２）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
低伝導度の水溶液の伝導度が、０〜１００ｍＭのモル濃度である請求項１に記載の方法。
低伝導度の水溶液のイオン強度が、０〜０．２である請求項１又は２に記載の方法。
低伝導度の水溶液の導電率が、０〜３００ｍＳ／ｍである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
水溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
水溶液のｐＨが生理活性タンパク質の等電点以下、かつｐＨ２．０以上である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
不純物がＤＮＡ夾雑物である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
不純物がウイルスである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
ＤＮＡ夾雑物除去処理後の生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物がＤＮＡ濃度２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である請求項７に記載の方法。
生理活性タンパク質が抗体である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
抗体がＩｇＧ抗体である請求項１０に記載の方法。
抗体がヒト型化モノクローナル抗体である請求項１０または１１に記載の方法。
抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である請求項１２記載の方法。
抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である請求項１２記載の方法。
抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）である請求項１２記載の方法。
生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である請求項１〜９のいずれかに記載の方法
粒子をフィルター濾過によって除去する請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを該生理活性タンパク質の等電点以下のｐＨに調整することによって１）の工程を行う、請求項１に記載の方法。
生理活性タンパク質が抗体であって、該抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを該抗体の等電点以下のｐＨに調整することによって１）の工程を行う、請求項１に記載の方法。
緩衝液がＴｒｉｓ水溶液である請求項１８又は１９記載の方法。
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用タンパク質製剤の製造方法。